特許 6185978 ヒスチジン操作された軽鎖抗体およびこれを作製するための遺伝子改変された非ヒト動物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6185978

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】ヒスチジン操作された軽鎖抗体およびこれを作製するための遺伝子改変された非ヒト動物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170814BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170814BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/46

   C12P21/08

【請求項の数】13

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2015-500639(P2015-500639)

(86)(22)【出願日】2013年3月15日

(65)【公表番号】特表2015-510767(P2015-510767A)

(43)【公表日】2015年4月13日

(86)【国際出願番号】US2013031823

(87)【国際公開番号】WO2013138680

(87)【国際公開日】20130919

【審査請求日】2016年3月15日

(31)【優先権主張番号】61/611,950

(32)【優先日】2012年3月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/736,930

(32)【優先日】2012年12月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ミクウィルター， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】マクドナルド， リン

(72)【発明者】

【氏名】マーフィー， アンドリュー ジェイ．

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１１１００７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−０２１００４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０９７６０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Tomoyuki Igawa，Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves the duration of antigen neutralization，Nature Biotechnology，２０１０年１０月１７日，Vol.28, No.11，p.1203-1207

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｃ０７Ｋ１／００−１９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞において、
（ｉ）第一の抗体の重鎖可変ドメインをコードする重鎖可変領域配列を含む第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列であって、ここで該第一の抗体が、中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合し、該重鎖可変領域配列が、その生殖系列ゲノムにおいて、単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む核酸配列を含む非ヒト動物において生成され、該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、生殖系列Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントと再構成された生殖系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、該非ヒト動物の抗原レパートリーにおいて発現される、第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含むように改変された、免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列
を共発現させるステップと、
（ｂ）該宿主細胞内で発現した第二の抗体であって、該第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列および該免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされ、中性ｐＨでは、該目的の抗原に対する該所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記第二の抗体が、完全ヒト第一の免疫グロブリン重鎖および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第二の抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも２倍の短縮を提示する、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第二の抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

目的の第一の抗原および目的の第二の抗原に対するｐＨ依存性結合を示す、二重特異性抗体を生成する方法であって、
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞において
（ｉ）第一の抗体の第一の重鎖可変ドメインをコードする第一の重鎖可変領域配列を含む第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列であって、該第一の抗体は、中性ｐＨでは、該第一の目的の抗原に所望の親和性で結合する、第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）第二の抗体の第二の重鎖可変ドメインをコードする第二の重鎖可変領域配列を含む第二の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列であって、該第二の抗体が、中性ｐＨでは、所望の親和性で該目的の第二の抗原に結合する、第二の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列、
ここで、該第一および該第二の重鎖可変領域配列は、その生殖系列ゲノムにおいて、単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む核酸配列を含む非ヒト動物において生成され、該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、生殖系列Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントと再構成された生殖系列Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、該非ヒト動物の抗原レパートリーにおいて発現され、ならびに
（ｉｉｉ）（１）該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来し、かつ（２）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含むように改変された、免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列、
を共発現させるステップと、
（ｂ）該宿主細胞において、該第一の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列および第二の免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列ならびに該免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされ、中性ｐＨでは、該目的の第一の抗原および該第二の抗原への所望の親和性を保持し、かつ酸性ｐＨでは該目的の第一の抗原および第二の抗原に対して低減した結合を提示する、発現された第三の抗体を選択するステップと
を含む方法。

【請求項6】

前記第三の抗体が、完全ヒト第一の免疫グロブリン重鎖、完全ヒト第二の免疫グロブリン重鎖、および完全ヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第三の抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも２倍の短縮を提示する、請求項５または請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第三の抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を提示する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９遺伝子配列およびＶκ３−２０遺伝子配列から選択されるヒトＶκ配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列であり、前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列における少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列における少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記非ヒト動物が、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_ＨセグメントおよびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記非ヒト動物がマウスである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引用
本願は、２０１２年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／６１１，９５０号および２０１２年１２月１３日に出願された米国仮出願第６１／７３６，９３０号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。これらの出願は、いずれも、その全体が本明細書に参考として援用される。

【0002】

ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が提供される。非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に改変を施すための方法であって、改変が、軽鎖可変領域遺伝子内の残基、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）内の１つまたは複数のアミノ酸をコードするヌクレオチドの変異生成を含んで、抗原へのｐＨ依存性結合を示す軽鎖ドメインを含む抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける発現を容易にする方法が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体を作製するための方法もまた提供される。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。

【0004】

１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ ｖｉｔｒｏで対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。

【0005】

別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異なる重鎖について試験することができる。

【0006】

別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖として選択することができる可能性がある。

【0007】

別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上記の手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件における操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への必要性が当技術分野にある。

【0009】

加えて、治療抗体、例えば、二重特異性治療抗体は、それらが、所望の有効性を達成するには、しばしば、高用量を必要とするという点で、ある限界を有する。これは、抗体−抗原複合体がエンドソームへと内部移行して、標的介在性クリアランスと呼ばれるプロセスにおけるリソソーム分解の標的とされるという事実に部分的に起因する。したがって、当技術分野には、より効率的な抗体リサイクリング、例えば、二重特異性抗体リサイクリングをもたらし、抗体の抗原に対する特異性および親和性を損なわずに、エンドソームコンパートメント内の抗体−抗原複合体の解離を促進することにより、抗体の分解を防止する方法および組成物に対する必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様では、中性ｐＨでは、標的抗原に結合するが、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜６．０）では、同じ抗原の結合の低減を示す抗体または抗体可変ドメインを生成するための生物学的系が提供される。生物学的系は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む、再構成された軽鎖配列（例えば、再構成されたＶ−Ｊ）を有する非ヒト動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）を含む。様々な態様では、１つまたは複数のヒスチジン改変は、軽鎖ＣＤＲ３コドンにおいてである。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座またはヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。様々な態様では、非ヒト動物は、内因性非ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト重鎖Ｖ_Ｈセグメント、ヒト重鎖Ｄ_Ｈセグメント、およびヒト重鎖Ｊ_Ｈセグメントによる置きかえを含み、ここで、ヒトセグメントは、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結されている。様々な態様では、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する軽鎖可変ドメインを含む、ユニバーサル軽鎖を有する非ヒト動物が提供される。様々な態様では、これらのヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウス）を、ヒスチジン−ユニバーサル軽鎖マウス、ヒスチジン−ＵＬＣマウス、またはＨＵＬＣマウスと称する。

【0011】

したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

【0012】

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

【0013】

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一態様では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含まれる、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。別の実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。

【0014】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は、約３０倍以上である。

【0015】

一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された少なくとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。一実施形態では、動物は、体細胞超変異にもかかわらず、発現するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を保持する抗体を発現する。

【0016】

一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。したがって、一態様では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスもまた本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。

【0017】

一実施形態では、マウスの生殖細胞系列内の、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。

【0018】

さらなる実施形態では、マウスはまた、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座もその生殖細胞系列内に含む。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。

【0019】

一態様では、マウスは、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、ここで、置換は、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンにある。一実施形態では、マウスの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

【0020】

別の実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。

【0021】

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０分倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるｔ_１／２の短縮は約３０倍以上である。

【0022】

一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、ここで、全ての抗体は、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来する重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。

【0023】

本明細書では、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む非ヒト遺伝子座、例えば、マウス遺伝子座であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト遺伝子座もまた提供される。一実施形態では、遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５配列に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。遺伝子座内に存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１配列に由来する別の実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための、下記で記載される方法を用いて生成することができる。

【0024】

さらに別の態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、このような方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、ゲノムに配置される、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０、例えば、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。

【0025】

別の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、（ａ）本明細書に記載されているマウス（例えば、ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、その再構成された軽鎖可変領域配列内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含むマウス）を生成するステップと、（ｂ）マウスを目的の抗原で免疫するステップと、（ｃ）中性ｐＨでは、目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体の生成を結果としてもたらす。一実施形態では、方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体の生成を結果としてもたらす。

【0026】

他の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成するさらなる方法が本明細書において提供される。１つのこのような方法は、（ａ）目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、（ｂ）第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（ｃ）第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（ｄ）細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。一実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成し、免疫グロブリン軽鎖の改変を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す。一実施形態では、第一の抗体を、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。

【0027】

一実施形態では、本明細書に記載されている、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体を結果としてもたらす。一実施形態では、抗体を生成する方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ_１／２を示す抗体を結果としてもたらす。

【0028】

本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトＶ_Ｌセグメント配列および該ヒトＪ_Ｌセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目２に記載の動物。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目３に記載の動物。
（項目５）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列である、項目６に記載の動物。
（項目８）
機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、項目１に記載の動物。
（項目９）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目１に記載の動物。
（項目１０）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目５に記載の動物。
（項目１１）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンである、項目１１に記載の動物。
（項目１３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載の動物。
（項目１４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目１３に記載の動物。
（項目１５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１７）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、項目１に記載の動物。
（項目１８）
中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）の前記短縮が、約３０倍以上の短縮である、項目１７に記載の動物。
（項目１９）
齧歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目２０）
ラットまたはマウスである、項目１９に記載の齧歯動物。
（項目２１）
マウスである、項目２０に記載の齧歯動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内の前記少なくとも１つのヒスチジンコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する、項目１に記載の動物。
（項目２３）
ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列の該ヒトＶ_Ｌセグメント配列および該ヒトＪ_Ｌセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。
（項目２４）
前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目２３に記載のマウス。
（項目２５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目２３に記載のマウス。
（項目２７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である、項目２６に記載のマウス。
（項目２８）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目２３に記載のマウス。
（項目２９）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目２６に記載のマウス。
（項目３０）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目２３に記載のマウス。
（項目３１）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンである、項目３０に記載のマウス。
（項目３２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目２３に記載のマウス。
（項目３３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目３２
に記載のマウス。
（項目３４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３５）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３６）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３８）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目３９）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目４０）
目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含むヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、項目２３に記載のマウス。
（項目４１）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目２３に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４２）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を示す、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
その生殖細胞系列内にヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物において、目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を生成するステップと、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトＶ_Ｌセグメント配列および該ヒトＪ_Ｌセグメント配列を、対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌセグメント配列およびＪ_Ｌセグメント配列によってコードされないヒスチジンコドンを含むように改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記非ヒト動物において生成された前記第一の抗体が、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５であり、前記改変が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でのＣＤＲ３コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの置換を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１であり、前記改変が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でのＣＤＲ３コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの置換を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を示す、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物
を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
対応するヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌセグメント配列およびＪ_Ｌセグメント配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含むヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲノムに配置するステップと
を含む方法。
（項目５２）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記動物が、齧歯動物である、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記動物が、マウスまたはラットである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒトのＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、ＣＤＲ３コドンである、項目５１に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、様々な抗原特異的抗体（Ａ〜Ｋ抗体）からのヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のアミノ酸アラインメントを例示する。各軽鎖配列内に位置するヒスチジン（Ｈ）残基は、太字とする。様々な軽鎖領域（フレームワークおよびＣＤＲ）を、アラインメントの上方に表示する。

【図2】図２は、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒスチジン残基の組合せおよび位置を例示する。対応する核酸配列を含める。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されており、また、www.imgt.org上でも調べることができる、固有の番号付けに基づく。

【図3】図３は、５つの（１〜５の）異なる重鎖およびＣＤＲ３内の表示される位置（Ｙ軸を参照されたい）に操作したヒスチジン残基を有するＶκ１−３９に由来する軽鎖をコードする核酸をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベルを例示する。

【図4】図４は、ＣＨＯ細胞上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖を含有する選択された抗原特異的ヒト抗体の発現を示すウェスタンブロットである。

【図5A】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

【図5B】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

【図5C】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

【図5D】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

【図5E】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、およびｔ_１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。

【図6】図６は、表示される重鎖（２、３、および６）と対合させた、親のユニバーサル軽鎖またはヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を含む抗体についての動力学的パラメータ（Ｋ_Ｄおよびｔ_１／２）を示す。ヒスチジン置換は、複数の抗体において強力なｐＨ依存性をもたらす。ＣＤＲ３内でヒスチジン置換を施して、配列_１０５ＱＱＳＹＳＴＰ_１１１（配列番号３）を_１０５ＨＨＳＹＳＴＨ_１１１（配列番号５）へと転換した。ＮＢ＝結合が検出されない（ＫＤ＞１０マイクロモル濃度）ことに注意されたい。

【図7】図７は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

【図8A】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図8B】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図8C】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図8D】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図8E】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図8F】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図9】図９は、二回目の採血における、ヒスチジンユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）についてヘテロ接合性のマウス（４カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ １９２７マウス）；３カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ １９３０マウス））および野生型動物からの、免疫原に対する抗血清力価を示す。

【図10】図１０は、ヘテロ接合性ＨＵＬＣ（１９２７対１９３０）マウスおよびＷＴマウスからのハイブリドーマ融合体から得られる、全抗原陽性クローンの数と、ｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較である。図は、各マウス種類（「マウス１」および「マウス２」）につき２匹ずつのマウスについてのデータを含む。

【図11A】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。

【図11B】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。

【図11C】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ_１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。

【図12】図１２は、ヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作したヒスチジン残基の位置を示す。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。

【図13】図１３は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。

【図14A】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図14B】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図14C】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【図14D】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

定義
本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオチド配列（複数可）、例えば、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列をそれらのゲノム内、例えば、それらの生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）；これと同じ免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を含む胚、細胞、および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを用いる方法を提供する。別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対が明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。

【0031】

本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、Ｋ_Ｄは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭによって測定され、別の実施形態では、Ｋ_ＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

【0032】

語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれ超、一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）にあってよい。例示的な二重特異性抗体は、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖、および細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。さらに、第二の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換することができる。例えば、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へと送達するように、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖および毒素に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を対合させることができる。他の例示的な二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に対して特異的な第一の重鎖および抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。細胞の活性化（例えば、アレルギーおよび喘息）と関連する治療条件のためには、このような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。

【0033】

用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

【0034】

語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列または再構成されたか再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであるか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異してもよく（例えば、動物の生殖細胞系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）であって、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤＲ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によってコードされてもよい。

【0035】

保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。

【0036】

一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。

【0037】

語句「エピトープ結合タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２ＭのＫ_Ｄ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄをしばしば必要とする。

【0038】

語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲またはピコモルの範囲のＫ_Ｄを有することが含まれる。

【0039】

免疫グロブリン核酸配列に関連する用語「生殖細胞系列」には、子孫に渡されることができる核酸配列が含まれる。

【0040】

語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列内に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する、Ｖ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントを一般に含む可変領域遺伝子配列によりコードされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、www.imgt.orgのＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。

【0041】

配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ^ＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣ_Ｈ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。Ｃ_Ｈ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣ_Ｈ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。

【0042】

語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。

【0043】

語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトカッパおよびラムダ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域が含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列内に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来する、Ｖ_ＬセグメントおよびＪ_Ｌセグメントを一般に含む軽鎖可変領域遺伝子配列によりコードされる。様々な生物体のＶ軽鎖セグメントおよびＪ軽鎖セグメントについての配列、位置、および命名法は、www.imgt.orgのＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するものを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを包含する。

【0044】

語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。

【0045】

語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインをコードするかまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含むヌクレオチド配列）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列を指す。

【0046】

核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖細胞系列に存在する核酸配列が含まれる。

【0047】

語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

【0048】

用語「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結して、免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列へと配列間の適正な組換えを可能とすることができる。

【0049】

遺伝子置きかえに関連する用語「置きかえ」は、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に配置し、これにより、内因性遺伝子の全部または一部分を、オーソロガスな核酸配列または相同な核酸配列で置きかえることを指す。

【0050】

本明細書で用いられる、例えば、機能的なポリペプチドに関連する「機能的な」は、天然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の場合には、機能的な免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含み得る。

【0051】

「中性ｐＨ」は、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間のｐＨ、例えば、生理学的ｐＨを含む。「酸性ｐＨ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨを含む。

【0052】

免疫グロブリン軽鎖遺伝子内の操作したヒスチジン残基
本発明者らは、ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を、軽鎖の配列に沿った１つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のＣＤＲ内でヒスチジンを発現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウスの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載される。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換（例えば、図１を参照されたい）を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ドメインの領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）内でもなお生じ得る。場合によって、このような変異は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性ｐＨにおける抗原結合の、中性ｐＨにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このようなｐＨ依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、エンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の抗原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ランダムｈｉｓスキャニング変異生成を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体におけるｐＨ依存性の結合特性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法が報告されている（ＵＳ２０１１／０１１１４０６Ａ１）。しかし、抗体残基のランダム変異生成は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒスチジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高親和性抗体であって、ヒスチジン改変（複数可）に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合もまた提示する高親和性抗体の生成を可能とする。

【0053】

したがって、様々な実施形態では、抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗体を発現する動物を結果としてもたらす改変を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（場合によってまた、「ヒスチジン置換」、「ヒスチジンコドン置換」などとも称し得る）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、Ｖ_Ｌセグメント配列および／またはＪ_Ｌセグメント配列）内の改変を含む。一実施形態では、動物は、ヒト免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）のヌクレオチド配列内に、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施形態では、軽鎖は、κ軽鎖である。一実施形態では、動物は、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖ＣＤＲ、例えば、軽鎖ＣＤＲ３を発現する。別の実施形態では、軽鎖は、λ軽鎖である。さらに別の実施形態では、マウスは、κ軽鎖内およびλ軽鎖内のいずれにおいても、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。

【0054】

ヒスチジン残基は、２つの異なるコドン、ＣＡＴおよびＣＡＣ（デオキシリボ核酸残基）によりコードされる。したがって、非ヒスチジンコドンは、ＣＡＴまたはＣＡＣで置換することができる。置換は、その生殖細胞系列内の立体配置（すなわち、非体細胞変異状態）では、ヒスチジン残基をコードしないコドンにおいて操作する。

【0055】

一実施形態では、軽鎖は、ユニバーサル軽鎖（また、共通軽鎖とも称する）である。米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号；全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている通り、複数の重鎖のために共通軽鎖を選択する非ヒト動物（例えば、マウス）は、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを含む、非ヒト動物で発現される抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのような動物は第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。動物（または、遺伝的に同じ動物）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、細胞中で同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖（例えば、共通軽鎖）と共に発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の重鎖成分は、同じ軽鎖成分と会合して発現するように動物によって選択される。記載される様々な実施形態では、遺伝子操作マウスの可変領域は、ヒト可変領域である。

【0056】

したがって、ヒト可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成することができるマウスが操作された。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合タンパク質への経路を可能にする。

【0057】

生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。

【0058】

米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている、操作された共通軽鎖マウスは、軽鎖選択肢の限定されたレパートリー、例えば、２つ以下のＶ_Ｌセグメントまたは単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」をコードする核酸配列を含んだ。このような限られたレパートリーを達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。１つの態様において、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成された。以前に記載されたとおり、内因性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と組み合わさることができ、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適切なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。１つの態様において、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。

【0059】

したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供された。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖領域遺伝子セグメントが欠失し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域で置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。

【0060】

ユニバーサル軽鎖マウスは、多様なＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーを含む、重鎖可変領域配列の多様なレパートリーを使用することが可能な、様々な抗原に応答する抗体を生成した。このような遺伝子操作ＵＬＣマウスにおいて生成される抗体は、二重特異性治療抗体をデザインするのに有用であるが、他の任意の抗体と同様に、各二重特異性抗体も、血漿中のその寿命の間に１つの標的だけに結合することが可能であり、その抗体は、エンドソームへと内部移行して、リソソーム分解の標的とされる。研究は、ＭＨＣクラスＩ様Ｆｃγ受容体であるＦｃＲｎが、免疫グロブリンを、ソーティングエンドソームから細胞表面へとリサイクリングして戻すことにより、リソソーム分解からレスキューすることが可能であることを示している（SimisterおよびMostov （１９８９年）、An Fc receptor structurally related to MHC class I antigens、Nature、３３７巻：１８４〜８７頁）。上記で説明した通り、抗体リサイクリングの効率を改善するには、抗体配列へのさらなる改変、例えば、酸性ｐＨ（例えば、エンドソームのｐＨ）では、抗原結合の低下を結果としてもたらすが、中性ｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）では、抗体−抗原の親和性および特異性を保持する改変が有益である。ユニバーサル軽鎖配列内の非ヒスチジン残基をヒスチジン残基で置換した、本明細書に記載されている非ヒト動物は、ｐＨ依存性結合もまた提示する、例えば、酸性ｐＨにおける抗原への結合の、中性ｐＨにおける抗原への結合と対比した低減もまた提示する、ユニバーサル軽鎖フォーマットに基づく高親和性抗体を産生することが可能であるために有益である。

【0061】

したがって、一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）であって、ヒト軽鎖可変領域（複数可）が、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物を、単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成するように再構成する、単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作し、ここで、軽鎖可変領域遺伝子（複数可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。これらのヒスチジン置換した軽鎖可変領域遺伝子（複数可）によりコードされる、再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、動物により選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合することが可能である。様々な実施形態では、少なくとも１カ所の、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換は、同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と共に発現すると、その抗原にｐＨ依存的な様式で結合する、再構成されたヒト軽鎖を結果としてもたらす。

【0062】

ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変領域遺伝子配列の限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物であって、可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子操作動物が提供される。いくつかの実施形態では、提供される動物を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する）、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作する。一態様では、可変配列を含む軽鎖は、動物によりクローン選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、その抗原（複数可）にｐＨ依存的な様式で結合する。一実施形態では、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される。一実施形態では、２つのＶ／Ｊ配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１である。一実施形態では、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列は、再構成されたＶ／Ｊ配列である。

【0063】

一態様では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントが、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。別の態様では、それらの各々が、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪ_Ｌセグメントから選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコードすることが可能な、２つ以下のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスであって、２つ以下のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび／またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を含む遺伝子改変マウスが提供される。

【0064】

本明細書では、ヒトＶ_Ｌ配列およびヒトＪ_Ｌ配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一態様では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞系列のＶ_Ｌ遺伝子配列およびＪ_Ｌ遺伝子配列に由来する。一実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊ配列またはＶκ３−２０／Ｊ配列を含む。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ遺伝子配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、ヒトＪ_Ｌ配列は、Ｊκ１およびＪκ５から選択される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される（例えば、ヒスチジン置換（複数可）を除けば）。代替的な実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒトλ鎖である。

【0065】

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。具体的な一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内にある。

【0066】

一態様では、置換は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３コドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換である。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０８および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。さらに別の実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。ヒスチジン置換したＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図２の配列アラインメントに示し、配列番号４〜３３にも示す。野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図２に示される）を、それぞれ、配列番号２および３に示す。

【0067】

単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ３−２０Ｊκ１可変領域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえは、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３領域をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。別の実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。例示的な、ヒスチジン置換したＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図１２の配列アラインメントに示し、配列番号７６〜７９に示す。野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図１２に示される）を、それぞれ、配列番号７４および７５に示す。

【0068】

アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。

【0069】

一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを、ヒトリーダー配列または非ヒトリーダー配列に作動可能に連結する。一実施形態では、リーダー配列は、非ヒトリーダー配列である。具体的な実施形態では、非ヒトリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、マウスＶκ３−７リーダー配列に作動可能に連結する。

【0070】

一実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントを、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結する。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトプロモーター配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されていないヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、ヒトＶκ３−１５プロモーターに作動可能に連結する。

【0071】

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側でヒトＪ_Ｌセグメントと共に再構成するヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκ遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκ（例えば、マウスＣκ）である。具体的な一実施形態では、可変領域配列を、非ヒト定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。

【0072】

一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（Ｖ_Ｌ遺伝子セグメントの転写方向に対して）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側で再構成されたヒト可変領域配列（Ｖ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列）と隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、再構成されたヒトＶ_Ｌ／Ｊ_Ｌ配列は、非ヒトカッパ（κ）遺伝子座にあり、非ヒトＣ_Ｌは、非ヒトＣκである。具体的な一実施形態では、再構成されたヒト可変領域配列を、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト配列である。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、Ｃκ遺伝子配列は、マウスＣκ遺伝子配列である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、内因性非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的な実施形態を、図８Ｃ、８Ｅ、１４Ｃ、および１４Ｄに提示する。

【0073】

一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、マウスであり、マウスの可変領域遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’側エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’側エンハンサーの両方を含む。

【0074】

一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）は、非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失であって、λ軽鎖遺伝子座を再構成して、軽鎖遺伝子を形成することを不可能とする１つまたは複数の欠失を含む。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶ_Ｌ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失させる。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域、例えば、内因性の、再構成されていない軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、再構成された、ヒスチジン置換したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列により、内因性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を置きかえる。

【0075】

一実施形態では、動物により、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメインを含む軽鎖を作製する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメイン、および非ヒトＣκ領域を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、λ軽鎖を発現しない。

【0076】

当業者ならば、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換（複数可）を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域へと遺伝子操作しても、体細胞超変異に起因して、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される全ての抗体が、このヒスチジン残基（複数可）を、操作された位置（複数可）において保有するわけではないことを十分に理解する。しかし、非ヒト動物における広範な抗体レパートリーの生成は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成される抗原特異的抗体であって、目的の抗原に対する高親和性を提示する一方で、生殖細胞系列へと導入され、好ましくは、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒスチジン改変を保持する抗原特異的抗体について選択することを可能とする。

【0077】

したがって、一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換により導入される、少なくとも１つのヒスチジンアミノ酸を保持する。一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子へと導入された、その体細胞変異軽鎖可変ドメイン内の全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。

【0078】

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物はまた、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列を含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域もそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む。一実施形態では、Ｖ_Ｈ遺伝子セグメント配列、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列であり、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域である。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント配列、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメント配列は、非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域配列は、内因性非ヒト重鎖定常領域配列である。一実施形態では、ヒト重鎖遺伝子セグメント配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。一実施形態では、非ヒト動物に含まれるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はまた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換も含む。

【0079】

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、非ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト軽鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。

【0080】

一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択される非ヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

【0081】

一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ_Ｈ１配列、ヒンジ配列、Ｃ_Ｈ２配列、Ｃ_Ｈ３配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。

【0082】

動物が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。具体的な実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての内因性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内因性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえる。

【0083】

一実施形態では、非ヒト動物は、内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、ここで、非ヒト動物がヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを再構成し、ヒトＶ_Ｈドメインおよび非ヒトＣ_Ｈを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現するように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトＣ_Ｈ領域遺伝子に作動可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。

【0084】

ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（例えば、Ｖκ１−３９／Ｊκ５またはＶκ３−２０／Ｊκ１）、ならびに再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの多様なレパートリーをそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物、例えば、マウスは、再構成されていないヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントの様々な順列に由来する、重鎖可変領域配列によりコードされる、抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、ここで、重鎖可変配列内に存在するＶ_Ｈセグメント、Ｄ_Ｈセグメント、およびＪ_Ｈセグメントは、動物のゲノム内に存在する、全てまたは実質的に全ての機能的なヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントに由来する。本明細書に記載されている遺伝子改変動物の細胞、例えば、Ｂ細胞内で発現させた重鎖可変ドメイン配列（すなわち、様々な、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの組合せに由来する）の様々な利用可能性は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれる。

【0085】

一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の１つのコピーを含む。別の実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方について、ホモ接合性であってもよく、ヘテロ接合性であってもよい。

【0086】

少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、軽鎖のＣＤＲ３内の）を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列）をそれらのゲノム内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、本明細書では、発現した可変ドメインが、体細胞超変異にかけられない場合は、ヒスチジンである、さらなるアミノ酸（複数可）を含むように、ヒスチジンコドン（複数可）の１つまたは複数の付加／挿入を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。

【0087】

本明細書に記載されている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、本明細書に記載されている方法とは異なる方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、核移植を用いて、改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、卵母細胞へと導入するステップと、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、非ヒト動物に懐胎させるステップとを含む。

【0088】

一態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、デバネズミ（mole rates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科由来のメンバーのマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。

【0089】

具体的な実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される、１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）、Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい; Auerbachら（２０００年）、Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesもまた参照されたい）。具体的な実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。別の具体的な実施形態では、マウスは、前述の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックスである。具体的な実施形態では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統とのミックスである。

【0090】

一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。

【0091】

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、齧歯動物である。一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。一実施形態では、動物は、マウスである。したがって、本発明の一実施形態では、ヒトＶ_Ｌ遺伝子配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く（例えば、機能的な、再構成されていないＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子セグメント配列を欠く）。一実施形態では、ヒスチジンコドンの置換（複数可）を有する、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９／Ｊκ可変領域またはＶκ３−２０／Ｊκ可変領域である。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１またはＪκ５である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。再構成された可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列である一実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。再構成された可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列である別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において発現するようにデザインする。一実施形態では、置換されたヒスチジンコドン（複数可）を有する、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性のマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、マウスは、そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントは、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、マウスの生殖細胞系列内に含まれる。

【0092】

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスを生成するためのターゲッティングベクターもまた提供される。一態様では、ベクターの５’側マウス相同性アームおよび３’側マウス相同性アームの配列に関する転写方向の５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域、および３’側マウス相同性アームを含む、ターゲッティングベクターが提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、ベクターを、５’側に存在し、マウスＣκ遺伝子に対して近位である、エンハンサー配列に対して５’側の配列へとターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクターは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット、ヒト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域に続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域（Ｃκ）配列を含む、３’側マウス相同性アームを含む。

【0093】

選択カセットとは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするために、ターゲッティング構築物へと挿入されるヌクレオチド配列である。当技術分野では、いくつかの好適な選択カセットが公知である。一般に、選択カセットは、特定の抗生剤（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下で、陽性選択を可能とする。加えて、選択カセットは、レコンビナーゼ酵素で処理したときに、選択カセットの欠失を可能とする、組換え部位で挟むことができる。一般に用いられる組換え部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素のそれぞれにより認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、当技術分野では、他の組換え部位も公知である。

【0094】

一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列は、マウスリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。ターゲッティングベクターの例示的な実施形態を、図８Ｂおよび１４Ｂに提示する。

【0095】

一態様では、ターゲッティングベクターを、上記で記載した通りに提供するが、５’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに、５’側で、部位特異的レコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）を隣接させ、３’側マウス相同性アームの代わりに、ヒトＶ_Ｌ領域に、３’側で、ＳＲＲＳを隣接させる。

【0096】

本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。一態様では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法は、実施例において記載されている通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製されるターゲッティングベクターを使用し、構築物をＥＳ細胞へと導入し（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ターゲッティングされたＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する。ヒスチジン改変は、様々な分子生物学技法、例えば、部位指向変異生成またはデノボのＤＮＡ合成を用いて、ターゲッティングベクターへと導入することができる。遺伝子ターゲッティングが完了したら、遺伝子改変された非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性ヌクレオチド配列の組込みまたは外因性ポリペプチドの発現の成功を確認する。当業者には、数多くの技法が公知であり、サザンブロット法、長鎖ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いるリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学検査、免疫組織化学検査などが挙げられる（が、これらに限定されない）。一例では、目的の遺伝子改変を保有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Valenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁において記載されている、対立遺伝子アッセイの改変型を用いて、マウス対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定することができる。当業者には、遺伝子改変動物における具体的なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同定する他のアッセイも公知である。

【0097】

したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む）で置きかえるステップを含み、ここで、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。

【0098】

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント配列およびヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列で置きかえるステップを含み、ここで、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドンにおいてである。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、ヒト生殖細胞系列の、再構成された軽鎖可変領域配列に基づく。したがって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ３−２０κ１に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現するようにデザインする。

【0099】

別の実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物（すなわち、本明細書に記載されている、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む）を生成する方法は、非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む。一実施形態では、方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、上記で記載したヒトＶ_Ｈ配列、ヒトＤ_Ｈ配列、およびヒトＪ_Ｈ配列の各々またはレパートリーのうちの少なくとも１つを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえもまた含む動物において、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子領域配列で置きかえるステップを含む。一実施形態では、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列による置きかえと、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえとを含む、非ヒト動物を生成するために、軽鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物を、重鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物と交配させる。

【0101】

発明者らは、本明細書において、１つまたは複数のヒスチジン改変を含むユニバーサル軽鎖、例えば、ヒトユニバーサル軽鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域に由来する軽鎖）を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）であって、抗原結合タンパク質が、標的抗原のｐＨ依存性の抗原結合を示す、遺伝子操作非ヒト動物を提供する。動物は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むように遺伝子操作する。様々な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、クラスター内に、２つ、３つ、または４つ以上のヒスチジン残基を含む。

【0102】

一実施形態では、野生型動物と比較して、免疫グロブリン軽鎖内、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン内、例えば、免疫グロブリンＣＤＲ内のヒスチジンの存在の増強を特徴とするＢ細胞集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒスチジンの存在の増強は、約２〜４倍である。一実施形態では、ヒスチジンの増強は、約２〜１０倍である。

【0103】

一実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子配列内のコドン改変の結果として、ヒスチジン残基（複数可）を発現して、標的抗原のｐＨ依存性結合を提示する、抗原特異的抗体の集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、これらの動物は、本明細書に記載されている免疫グロブリン軽鎖可変領域内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含まない動物において生成される抗原特異的抗体の集団と比較して、ｐＨ依存性の結合特性（例えば、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）の、中性ｐＨにおけるｔ_１／２と対比した短縮）を提示する抗体、例えば、抗原特異的抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子操作動物において生成されるｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する抗原特異的抗体の富化は、軽鎖可変領域内にヒスチジン置換を含む同様の動物と比較して、約２倍を超える、例えば、約５倍を超え、例えば、約１０倍を超える。したがって、本発明の遺伝子改変動物は、標的介在性クリアランスを低減し、ならびに、このような、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成される抗体フォーマットに基づいて開発される治療用抗原結合タンパク質の用量および／または投与頻度を低減するのに所望される、抗体リサイクリング特性の改善を有する抗体が富化されている。

【0104】

したがって、本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質であって、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、抗原特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、この場合、生殖細胞系列遺伝子配列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンは、ヒスチジンコドンで置換され、抗体は、その発現したヒト軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つのヒスチジン置換全てを保持する。一実施形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、４つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、３または４つのヒスチジン置換を保持する。

【0105】

一実施形態では、抗体の軽鎖は、非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性軽鎖定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。加えて、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される抗体、例えば、抗原特異的抗体はまた、ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントの再構成に由来する、ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖も含む。ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントは、内因性非ヒト重鎖遺伝子座、例えば、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメントに存在するヒト重鎖セグメントのレパートリー、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーから選択することができる。ヒト重鎖可変セグメントの例示的な、可能な再構成は、ＩＭＧＴデータベース内の機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの列挙、ならびに参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３０９号、および同第２０１３／００４５４９２号から収集することができる。さらに、一実施形態では、抗体の重鎖は、非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ、ＩｇＭアイソタイプ、またはＩｇＡアイソタイプである。

【0106】

したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

【0107】

別の実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

【0108】

一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変動物のＢ細胞であって、ヒスチジン改変ヒト軽鎖可変領域配列、例えば、本明細書に記載されている、ヒスチジン改変、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列をその生殖細胞系列内に含み、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞もまた本明細書において提供される。一実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。

【0109】

様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（またはヒスチジンコドンの生殖細胞系列配列への付加）を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１配列）を含む。これらの付加または置換は、それらの抗原に対するｐＨ依存性の結合特性を有する、抗原結合タンパク質が富化されたＢ細胞集団を含む、非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物において、抗原刺激に応答して生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨ、例えば、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間、例えば、生理学的ｐＨでは、抗原に対する高親和性を示して、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原結合タンパク質のその抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

【0110】

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨ（例えば、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメントのｐＨ）で、その抗原に対する結合の低減を示す。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物により生成される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍への短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

【0111】

平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）などの動力学的パラメータは、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学的速度定数から計算することができる。

【0112】

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦｃＲｎ分子への結合の増大を示す。上記で記載したＦｃＲｎとは、エンドソームコンパートメントの内部に存在する受容体であって、酸性ｐＨにおいて、免疫グロブリンに結合し、それらを表面へとリサイクリングして戻すことが可能な受容体である。本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物における抗体分子をスクリーニングすることにより、３つの有益なパラメータ：抗原に対する高親和性、ｐＨ依存性の抗原結合（酸性ｐＨでは抗原結合が弱い）、およびＦｃＲｎへの結合の増大を有する抗体について選択する固有の機会が提供される。

【0113】

一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生し、これらが富化された、抗原に応答するＢ細胞集団であって、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると、それらのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生される、同等なＢ細胞集団を凌駕する、血清半減期の延長を示すＢ細胞集団を含む。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、目的の抗原に応答して産生される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると（治療剤へと再フォーマットされ、同じ治療用量で投与されるる場合）、そのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物において同じ抗原に応答して産生された抗原結合タンパク質の血清半減期を凌駕する、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、血清半減期の延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。

【0114】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒトに由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。具体的な実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0115】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する組織が提供される。一実施形態では、組織は、本明細書に記載されている、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。

【0116】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞からの核である。

【0117】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は、リンパ球である。一実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖と；少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、またはこれらの組合せに由来し、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をさらに含む軽鎖とを発現し、重鎖可変ドメインは非ヒト重鎖定常領域またはヒト重鎖定常領域に融合し、軽鎖可変ドメインは非ヒト軽鎖定常領域またはヒト軽鎖定常領域に融合している。

【0118】

一態様では、本明細書に記載されている、非ヒト動物のＢ細胞により作製されるハイブリドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫原で免疫された、本明細書に記載されているマウスからのＢ細胞であり、Ｂ細胞は、目的のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は、体細胞変異ヒト可変重鎖ドメインおよびマウスＣ_Ｈを有し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５、または少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト可変軽鎖ドメイン、およびマウスＣ_Ｌを有し、ヒト軽鎖ドメインは、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む。

【0119】

本明細書に記載されている非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質を発現する細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６^ＴＭ細胞）から選択される。

【0120】

一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するドナーＥＳ細胞を含む非ヒト胚が提供される。

【0121】

本明細書に記載されている非ヒト動物は、ヒスチジンをＣＤＲ３内に有する抗体を発現するＢ細胞を生成するのに有用である。ヒスチジンをＣＤＲ３に配置する動物は、抗体を作製するのに一般に有用であり、中性ｐＨまたはその近くでは、標的に十分な親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する抗体を開発するのに特に有用である。

【0122】

非ヒト動物は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３内に含むヒト免疫グロブリン可変ドメインによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに用いられ得る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば、別の細胞上または同じ細胞上の）に結合し得るように、エンドソーム内で標的からより容易にまたはより迅速に解離するため、より低いｐＨにおける結合が変化すれば、状況によっては、より迅速な代謝回転が可能となる。状況によっては、これにより、結果として、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤を低頻度で投与することができる。これは、安全性または毒性の理由で、頻繁に投与することやある特定の投与量を上回って投与することが望ましくない場合に特に有用である。結果として、被験体へと投与される場合の抗体治療剤の血清半減期が延長される。

【0123】

非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットは、１つまたは複数のヒスチジンをその中に有するＣＤＲ３を有する抗体可変領域を示す動物におけるＢ細胞の数を増大させるための方法において有用である。非ヒト動物は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体配列を生成するのに有用である。非ヒト動物は、単回の免疫から、抗体がｐＨ依存性の抗原結合を示す、より多数の抗体配列を生成するのに有用である。

【0124】

抗原結合タンパク質およびこれを生成する方法
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。

【0125】

抗体を生成するための複数の技法が記載されている。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載されているマウスにおいてキメラ抗体が産生される。抗体は、免疫したマウスのＢ細胞から直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を用いて、ハイブリドーマを作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁）。本明細書に記載されている非ヒト動物からの抗体（ヒト重鎖および／またはヒト軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を用いて、容易に単離および配列決定される。本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するハイブリドーマおよび／またはＢ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、次いで、これを、他の形では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列を、非ヒト配列の代わりに置換することにより改変することもできる。したがって、所望の特徴、例えば、親和性、エピトープ、ｐＨ依存性の抗原結合などを有する抗体の核酸配列が決定されたら、非ヒト定常領域遺伝子配列を、所望のヒト定常領域配列で置きかえて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。

【0126】

したがって、一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を生成する方法であって、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、マウス）を生成するステップと、マウスを目的の抗原で免疫するステップと、非ヒト動物に抗原への免疫応答を開始させるステップと、非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す、例えば、酸性ｐＨでは、中性ｐＨにおける場合より抗原への結合が弱い抗原特異的抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供される。

【0127】

本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法もまた提供される。これらは、複数のエピトープに高親和性で結合することが可能な分子である。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げられる。加えて、本発明の利点には、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タンパク質を生成できることが挙げられる。

【0128】

二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する場合もある；例えば、Tuttら、１９９１年、J. Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁; Kuferら、２００４年、Trends Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい）のため、それらは、治療適用に有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、方向転換された細胞傷害作用（例えば、腫瘍細胞を死滅させる）のために用いることもでき、ワクチンアジュバントとして用いることもでき、血栓溶解剤をクロットへと送達するために用いることもでき、標的部位（例えば、腫瘍）において酵素活性化型プロドラッグを転換するために用いることもでき、感染性疾患を処置するために用いることもでき、免疫複合体を細胞表面受容体へとターゲッティングするために用いることもでき、免疫毒素を腫瘍細胞へと送達するために用いることもできる。

【0129】

本明細書に記載されている二重特異性抗体はまた、酵素イムノアッセイ、二部位イムノアッセイ、様々な疾患（例えば、がん）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断法、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、複数の治療的アッセイ法ならびに非治療的アッセイ法および／または診断的アッセイ法においても用いることができる。当業者には、二重特異性抗体の他の使用が明らかである。

【0130】

二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から作製するための複数の技法が報告されている。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現は、２つの異なる重鎖と会合して発現し得る好適な軽鎖の同定と関連する問題に部分的に起因し、単離の問題にも部分的に起因して、問題含みであった。様々な実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、成分の安定性／相互作用を増大させることにより、従来の免疫グロブリン構造を維持するのに特殊な改変（複数可）を必要としない完全長の二重特異性抗体の利点を提供する。様々な実施形態では、このような改変（複数可）は、煩瑣であることがわかっており、二重特異性抗体技術の開発およびヒト疾患のための処置におけるそれらの潜在的な使用に対する障害として作用した。したがって、様々な実施形態では、複数の特異性という特性を付加した、天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供することを介して、完全長の二重特異性抗体は、かつての二重特異性断片が欠いた、それらの極めて重要なエフェクター機能を維持し、半減期の延長という重要な薬物動態パラメータを明らかに示す治療剤をさらに提供する。

【0131】

本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にし、ここで、この軽鎖は、抗原結合タンパク質にそのｐＨ依存性抗原結合特性をさらに付与する。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒト重鎖および軽鎖の可変領域配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト軽鎖可変領域の１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合タンパク質とは異なるホモダイマー結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。同一な軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖を含む上記種が選択されたら、この二重特異性抗原結合タンパク質をスクリーニングして、そのｐＨ依存性の抗原結合特性の保持を確認することができる。

【0132】

一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質が提供され、ここで、ヒト軽鎖および重鎖の可変領域配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載される動物に由来する。

【0133】

一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣ_Ｈ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣ_Ｈ３領域は、プロテインＡへの第二のＣ_Ｈ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。様々なこのような改変は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１０／０３３１５２７号、および同第２０１１／０１９５４５４号において記載されている。

【0134】

複数のエピトープに結合し、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示すエピトープ結合タンパク質を作製するための１つの方法は、本発明に従い第一のマウスを、第一の目的のエピトープを含む抗原で免疫することであり、ここで、マウスは、（１）軽鎖を再構成して形成することが可能な内因性マウス軽鎖可変領域遺伝子配列を含有しない、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座であって、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座には、マウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域があり、再構成されたヒト軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と、（２）マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖が、単独でまたは実質的にヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖であるように、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで全体的または部分的に置きかえられた内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントとを含む。免疫すると、このようなマウスにより、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つ（例えば、例えば、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）だけを含むリバースキメラ抗体が作製される。一般に、生殖細胞系列配列へと導入された、置換されたヒスチジン残基の少なくとも一部は、リバースキメラ抗体内で保持される。目的のエピトープに結合する重鎖可変ドメインをコードするＢ細胞を同定し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を発現させたら、重鎖可変領域（そして、必要に応じて、軽鎖可変領域）のヌクレオチド配列を取り出し（例えば、ＰＣＲにより）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に対してインフレームで、発現構築物へとクローニングすることができる。このプロセスを繰り返して、第二のエピトープに結合する第二の重鎖可変ドメインを同定し、第二の重鎖可変領域遺伝子配列を取り出し、第二の好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列とインフレームで、発現ベクターへとクローニングすることができる。定常領域遺伝子配列によりコードされる第一の免疫グロブリン定常ドメインと、第二の免疫グロブリン定常ドメインとは、同じアイソタイプであってもよく、異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリン定常ドメインのうちの一方を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されている通りに改変することができ（しかし、他方は改変しない）、エピトープ結合タンパク質を、好適な細胞内で発現させ、そのプロテインＡに対する、例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１において記載されているホモ二量体のエピトープ結合タンパク質と比較した、示差的な親和性に基づき単離することができる。

【0135】

したがって、様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに所望の特異性／親和性を有する第一のヒト重鎖可変ドメインおよび第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一の核酸配列および第二の核酸配列、ならびにヒト軽鎖ドメインをコードし、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む第三の核酸配列（本明細書に記載されている非ヒト動物から単離された、生殖細胞系列の再構成された配列または軽鎖配列）の選択に続き、当技術分野で広範に利用可能な組換え技法を用いて、分子をコードする３つの核酸配列を発現させて、二重特異性抗体を形成する。しばしば、二重特異性抗体が、適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重特異性抗体の場合）ように、選り抜きの発現系は、哺乳動物細胞の発現ベクターおよび宿主を包含する。しかし、分子はまた、原核生物発現系において産生させることもできる。通常、宿主細胞は、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽鎖ドメインの全てを、単一のベクター上または独立のベクター上でコードするＤＮＡにより形質転換される。しかし、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の成分）を、独立の発現系において発現させ、発現させたポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてカップリングさせることも可能である。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、例えば、ＣＤＲコドンにおける、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を除けば、生殖細胞系列配列に由来する。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配列内に、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、または５カ所以下の体細胞超変異を含む。いくつかの実施形態では、体細胞超変異は、軽鎖可変領域の生殖細胞系列配列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基の存在を変化させない。

【0136】

様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンのヒスチジンによる置換を有する２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現のために、複製可能なベクターへと挿入する。多くのベクターが利用可能であり、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含むが、これらに限定されない。各成分は、個別に選択することもでき、宿主細胞の選択に基づき選択することもでき、実験により決定される他の基準に基づき選択することもできる。当技術分野では、各成分の複数の例が公知である。

【0137】

発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識されるプロモーターを含有し、二重特異性抗体の各成分または全ての成分をコードする核酸配列に作動可能に連結される。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列をベクターへと挿入することにより、二重特異性抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。

【0138】

真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から一般に入手可能であり、必要に応じて、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの３’側非翻訳領域からも入手可能である。これらの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。様々な実施形態に好適な発現ベクターは、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを含む。宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現ベクターによりコードされる高レベルの、所望のポリペプチドを合成するように、一般に、一過性発現は、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を包含する。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、第一のヒト重鎖可変ドメインまたは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比べて、クローニングされるＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便な陽性同定、ならびに所望の結合特異性／親和性または所望のゲル移動特徴を有する二重特異性抗体の迅速なスクリーニングを可能とする。

【0139】

様々な実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡが、上記で記載した所望のベクター（複数可）へとアセンブルされたら、それらを、発現および回収に好適な宿主細胞へと導入する。宿主細胞をトランスフェクトすることにより、選択された宿主細胞に適切な、当技術分野で公知の標準的な技法（例えば、エレクトロポレーション、核内マイクロインジェクション、インタクトの細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を用いて達成することができる。

【0140】

様々な実施形態では、成分を含有し、二重特異性抗体種の最も効率的で好適な産生を可能とする発現ベクターに最適な宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。種々の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。種々の実施形態では、細胞は、以下から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。種々の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

【0141】

二重特異性抗体を産生するのに用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^ＴＭなど）、微量元素（通常マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖、または同等なエネルギー供給源を補充することができる。他の任意の補充物質もまた、当業者に公知の適切な濃度で含めることができる。様々な実施形態では、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された宿主細胞で既に用いられた培養条件であり、当業者には明らかである。

【0142】

二重特異性抗体は、分泌されるポリペプチドとして、培養培地から回収することができるが、分泌シグナルを伴わずに直接産生される場合は、宿主細胞溶解物からも回収することができる。二重特異性抗体が、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を用いて、膜から放出させることができる。

【0143】

単離に続き、２つのヒト重鎖と、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０／κ１配列から選択される、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、単一のヒト軽鎖とを含む二重特異性抗体を、その抗原の一方、好ましくは両方に対する、ｐＨ依存性結合を示すその能力についてスクリーニングする。その抗原に対し、中性ｐＨと酸性ｐＨとで結合が異なる二重特異性抗体の能力（例えば、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨにおける場合と比較してｔ_１／２の短縮を明らかに示すそれらの能力）は、当技術分野で利用可能な様々な技法により決定することができ、下記の実施例、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭアッセイにおいて記載されている。

【0144】

ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗原結合タンパク質を生成するためのさらなる方法
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて生成する方法もまた提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで生成するステップと、次いで、それらを改変するステップと、生物体の外部において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞培養物中で発現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。

【0145】

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されているマウスなどの「ユニバーサル軽鎖」マウスまたは「共通軽鎖」マウス（「ＵＬＣ」マウス）である、軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメント、例えば、ヒト軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメントの限定されたレパートリーを含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列、例えば、抗体配列を使用する。一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列を使用する。一実施形態では、方法は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質を使用する。

【0146】

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）第一の抗体を選択するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、細胞内で発現させた第二の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持し（例えば、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し）、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。

【0147】

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む抗体（例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、例えば、ＵＬＣマウスから得られる）からの免疫グロブリン重鎖であって、抗体が目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）免疫グロブリン重鎖を選択するステップと；免疫グロブリン軽鎖の核酸配列を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと；選択された免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をその可変ドメイン内に含む免疫グロブリン軽鎖を発現させるステップと；中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持する（例えば、目的の抗原への所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。

【0148】

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法は、（１）単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列および再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）のレパートリーを含む非ヒト動物、例えば、マウスを、目的の抗原で免疫し、マウスに前記抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、（２）非ヒト動物において、例えば、マウスにおいて、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体を選択するステップと、（３）非ヒト動物から、例えば、マウスから、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離するステップと、（４）前記重鎖のヌクレオチド配列を決定するステップと、（５）単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、（６）目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖およびヒスチジン改変を含む免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（７）細胞内で発現した抗体が、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示するのかどうかを決定するステップとを含む。一実施形態では、細胞内で発現した抗体は、中性ｐＨにおいて、抗原への所望の親和性を示す。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。

【0149】

一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスは、例えば、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている、ユニバーサル軽鎖マウスまたは共通軽鎖マウスまたは「ＵＬＣ」マウスである。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。

【0150】

一実施形態では、目的の抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、および細胞表面受容体から選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体は、Ｆｃ受容体である。

【0151】

一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、抗原に対する抗体の所望の親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

【0152】

上記で説明した通り、一実施形態では、ＵＬＣマウスは、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、抗原に応答して抗体を発現するが、この場合、抗体の抗原への親和性は、主にそれらの抗体の重鎖によって媒介される。これらのマウスは、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖もまた含む抗体のヒト重鎖可変ドメインをコードするように再構成する、ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを含む。一実施形態では、抗原曝露により、これらのマウスは、多様なヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを使用して、抗原に対する親和性および特異性を有する抗体を生成する。したがって、抗原へと曝露したら、ＵＬＣマウスにおいて生成される抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離し、これを使用して、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列）に由来する免疫グロブリン軽鎖もまた含む、所望の結合タンパク質を生成することができる。

【0153】

ＵＬＣマウスの一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構成されていないヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および少なくとも１つの、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤ_Ｈセグメントおよび非ヒトＪ_Ｈセグメントの、全ての、再構成されていないヒトＤ_Ｈセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪ_Ｈセグメントによる置きかえを含む。したがって、ＵＬＣマウスは、ヒト可変領域遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント）の多様なレパートリーを使用して、目的の抗原に応答する抗体を生成する。

【0154】

目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の重鎖を決定したら、重鎖のヌクレオチド配列を単離および配列決定する。配列は、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト重鎖定常領域の配列を、マウスから（例えば、ＵＬＣマウスから）単離されたヒト重鎖可変領域配列の下流にクローニングする。

【0155】

一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方法は、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、特に、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップを含む。当技術分野では、ヌクレオチド配列を改変するための様々な技法、例えば、部位指向変異生成が公知である。加えて、所望のヒスチジン置換を含むヌクレオチド配列は、デノボ合成することもできる。

【0156】

一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす置換を含む。一実施形態では、置換（複数可）は、３つまたは４つのヒスチジン残基の発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換（複数可）は、免疫グロブリン軽鎖可変領域においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲコドン、例えば、ＣＤＲ１コドン、ＣＤＲ３コドン、および／またはＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。

【0157】

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０８および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ１−３９Ｊκ５のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列および核酸配列を、図２に示し、配列表にも含める。

【0158】

免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列を含み、置換（複数可）がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０７および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ３−２０Ｊκ１のＣＤＲ３領域の選択されたアミノ酸配列および核酸配列を、図１２に示し、配列表にも含める。

【0159】

免疫グロブリン軽鎖、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの配列を、ヒスチジン残基を所望の位置に含むように改変したら、軽鎖のヌクレオチド配列を、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒト軽鎖定常領域の配列を、ヒト可変領域の改変されたヌクレオチド配列の下流にクローニングする。

【0160】

一実施形態では、改変されたヒト免疫グロブリン軽鎖および選択されたヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、好適な宿主細胞、例えば、真核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞内で共発現させて、抗原結合タンパク質を生成する。当技術分野では、発現のために用い得る様々な宿主細胞が公知であり、本明細書を通して言及される。

【0161】

宿主細胞において生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、細胞上清へと分泌させることができ、これを、中性ｐＨにおける適正な発現および元の抗原に対する親和性についてスクリーニングする。抗原結合タンパク質はまた、細胞溶解物からも回収することができ、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて、膜から放出させることもできる。所望の特徴を有する抗原結合タンパク質は、精製することができる。

【0162】

一実施形態では、ヒスチジン改変（複数可）を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変（複数可）を含まない同じ（元の）抗原結合タンパク質の抗原に対する親和性と同等な、抗原に対する親和性を保持する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される、ヒスチジン改変抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する親和性は、１０^−６Ｍ未満、例えば、１０^−８Ｍ未満、例えば、１０^−９Ｍ未満、例えば、１０^−１０Ｍ未満、例えば、１０^−１１Ｍ未満、例えば、１０^−１２Ｍ未満である。

【0163】

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す。一実施形態では、ヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変を有さない同等な抗原結合タンパク質（ヒスチジン改変を除けば、同じアミノ酸配列の抗原結合タンパク質）を凌駕する、増強したｐＨ依存特性を保有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持する（例えば、中性ｐＨでは、抗原に対する所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示する。一実施形態では、本明細書に記載されている、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期（ｔ_１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ_１／２）の少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ_１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。

【0164】

一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療用量を被験体へと投与すると、同等な治療用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質（例えば、ヒスチジン改変を含まない、元の抗原結合タンパク質）を投与したときの血清半減期と比較して、血清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、ある用量の、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期の、同じ用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原結合タンパク質を投与したときの血清半減期に対する延長は、約２倍、例えば、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。一実施形態では、血清半減期は、少なくとも約１日間、例えば、少なくとも約２日間、例えば、少なくとも約７日間、例えば、少なくとも約１４日間、例えば、少なくとも約３０日間、例えば、少なくとも約６０日間である。

【0165】

上記で記載した、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法に加えて、本明細書では、前記方法により生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体もまた提供される。加えて、前記方法は、マウスにおける共通（ユニバーサル）軽鎖に結合する、２つの異なるヒト免疫グロブリン重鎖を選択し、重鎖のヌクレオチド配列を決定し、ユニバーサル軽鎖を、上記で記載したヒスチジン置換を含むように改変し、単一の、ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を有する２つのヒト重鎖を宿主細胞内で共発現させることにより、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タンパク質を生成するのにも使用することができる。上記で記載した抗原結合タンパク質を生成するための様々なステップは、二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法へも適用することができる。抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性の抗原結合特性を保有することが確認された二重特異性抗原結合タンパク質は、精製することができる。したがって、２つのヒト重鎖および、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むヒト可変領域遺伝子、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域遺伝子またはＶκ３−２０Ｊκ１可変領域遺伝子によりコードされるヒト軽鎖可変ドメイン配列を含む単一のヒト軽鎖を含む二重特異性抗体が提供される。

【0166】

ヒト免疫グロブリン重鎖と、ヒスチジン置換を含むヒト免疫グロブリン軽鎖とを含む抗原結合タンパク質の作製において使用される構築物もまた提供される。本明細書に記載されている抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する宿主細胞もまた提供される。

【実施例】

【0167】

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。実施例は、当業者に周知である、従来の方法（分子クローニング技法など）の詳細な記載を含まない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
（実施例１）
抗原特異的ヒト軽鎖内のヒスチジン残基の同定

【0168】

共通軽鎖マウス（例えば、Ｖκ１−３９共通軽鎖マウスまたはＶκ３−２０共通軽鎖マウス）の生成、およびこれらのマウスにおける抗原特異的抗体の生成は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、および同第１３／４１２，９３６号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、および同第２０１２／０１９２３００号）において記載されている。手短には、マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製され、そして、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ ＤＮＡを用いた。標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定した。

【0169】

操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＵＬＣマウス）を、内因性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウス（ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と交配させた。

【0170】

単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、ユニバーサル軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５）を含む抗体を単離および配列決定する。共通Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖マウスにおいて生成される抗原特異的ヒト抗体から選択された軽鎖（Ａ〜Ｋ）のアミノ酸配列をアラインメントした。選択された数の抗原特異的ヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ内のヒスチジン変異を同定した（図１）。生殖細胞系列のＶκ１−３９Ｊκ５可変ドメインの部分的なアミノ酸配列をアラインメントの上方に示し、配列番号１にも示し、完全な可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号８０に示す。

【0171】

（実施例２）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
（実施例２．１）
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１位に導入するように特別にデザインされた部位指向変異生成プライマーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖へと操作した。当技術分野で公知の分子技法（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、部位指向変異生成を実施した。ＣＤＲ３内の操作された残基の位置を図２に示し、図２に示された、ヒスチジン置換したＣＤＲ３の核酸配列を、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２に示す（対応するアミノ酸配列を、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に示す）。生殖細胞系列の、再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５ ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２および３に示す。

【0172】

（実施例２．２）
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例２に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト重鎖（１〜５と表示される）と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。ヒスチジン置換したＶκ１−３９に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な５つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスから得た。

【0173】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＣＨＯ細胞からの抗体の分泌は、Ｆｃ ＥＬＩＳＡを用いて、５つの異なる重鎖を有する、表示されるヒスチジン改変を有する軽鎖について検出した。軽鎖配列および重鎖配列（改変を除く）は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスにおいて生成された。捕捉抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧであり、検出抗体は、ヤギ抗ヒト（Ｆｃガンマ特異的）−ＨＲＰであった。結果を図３に示す。ＵＬＣ＋重鎖：特異的重鎖および改変されていないヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖。図３に示される通り、発現は、ほぼ全ての変異体において検出された。

【0174】

タンパク質イムノブロット：ＣＨＯ細胞の上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖と対合させた抗原特異的重鎖の発現を、ウェスタンブロットによりさらに解析した。試料を、４〜１２％のトリス−グリシンゲル上で泳動させた。選択された重鎖（重鎖３）を用いた結果を、図４に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖（上記で記載した）を指す。

【0175】

（実施例２．３）
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、解離半減期（ｔ_１／２）、および他の動力学的パラメータは、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭＴ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。キネティクスは、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５で測定した。結果を図５Ａ〜５Ｅに示す。

【0176】

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ５．７５）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合特性（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）の数値は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて得た。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップを、マウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（５０ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、２．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、８分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ）および解離動力学速度定数（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。

【0177】

図５に示される通り、抗体の細胞表面受容体への結合アッセイでは、抗原特異的ヒト重鎖と対合させた、ヒスチジン改変共通軽鎖（Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖のヒスチジン改変ＣＤＲ３）を有する５つの抗体のうちの２つが、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において、異なる親和性で、抗原へ（例えば、細胞表面受容体への）の結合を示した。ｐＨ７．４では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、低度の結合を示すか、または検出可能な結合を示さない、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２のｐＨ７．４におけるｔ_１／２と比較した短縮を示す、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。

【0178】

ヒスチジン改変共通軽鎖および３つの抗原特異的重鎖を含む３つの抗体（２、３、および６と表示される）についての、異なるｐＨにおける抗原結合データを、図６にさらにまとめる。例えば、ｐＨ５．７５におけるｔ_１／２の短縮または結合が検出されないことにより裏付けられる通り、これらの抗体は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．４における抗原結合と比較した、抗原結合の有意な低下を示した。

【0179】

（実施例３）
ヒスチジン置換したＶκ１−３９Ｊκ５ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作および特徴付け
（実施例３．１）
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベクターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティングベクターを用いて、ヒト軽鎖のＣＤＲ領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。

【0180】

手短には、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを、単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するように改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）、High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nature Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて、様々な、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖ターゲッティングベクターを作製し、内因性κ可変遺伝子セグメントおよび内因性κ接合遺伝子セグメントを欠失させるように既に改変された内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入する。再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を、軽鎖の配列内の１つまたは複数のヌクレオチド位置において、生殖細胞系列配列のそれぞれの位置には通常存在しないヒスチジン残基をコードするように改変する。ターゲッティングベクターを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へとエレクトロポレーションし、定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ^ＴＭ）を用いて確認する。

【0181】

具体的には、これらのターゲッティングベクターを構築するための戦略を、図８Ａ〜８Ｆに示す。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ１−３９Ｊκ５を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｋｉｔ）により、図７に示される部位指向変異生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１、またはＱ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図８Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１およびＨ１０６／１０８／１１１）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図８Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−Ｕｂ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図８Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図８Ｃ〜８Ｆ）。

【0182】

陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表１に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図８Ｃ〜８Ｆに示す。

【表1】

【0183】

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞に、ＦＬＰを発現するプラスミドをトランスフェクトすることにより欠失させた（図８Ｃおよび８Ｅ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

【0184】

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製した。

【0185】

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択した。３カ所の（Ｈ１０６／１０８／１１１；「１９３０」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「１９２７」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表２に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

【表2】

【0186】

（実施例３．２）
ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体（「抗原Ａ」）を、ＣＤＲ３内に４カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定の（ｐｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ）ヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ １９２７」とする）、もしくはＣＤＲ３内に３カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ１９３０」とする）のいずれか、またはホモ接合性のＷＴマウスを免疫する免疫原として用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠（ｆ．ｐ．）を介して、容量２５μｌ中に、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１０μｇと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタンパク質２．３５μｇを投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目において、合計６回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、２．３５μｇの抗原Ａを、アジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に追加免疫した。それぞれ、４および６回目の追加免疫の後の１５および２２日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Ａに対する抗体力価についてアッセイした。

【0187】

免疫原に対する抗体血清力価は、標準的なＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを実施するために、９６ウェルマイクロ滴定プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の２μｇ／ｍｌの抗原Ａにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、プレート洗浄機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、４回にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫したマウスからの血清および免疫前血清を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中に、１：３００または１：１０００で始めて３倍の系列希釈を行い、ブロッキングしたプレートへと二連で添加し、次いで、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、ブランクのまま放置して、二次抗体対照（バックグラウンド対照）として用いた。プレート洗浄機により、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、４回にわたり再度洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１：５０００／１：１０，０００の希釈率でプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２を基質として用いて発色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４；ＶＷＲ、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、カタログ番号７６６４−３８−２）で反応を停止させた。プレートは、分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで読み取った。抗体力価は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて計算した。

【0188】

マウスにおいて、注入された免疫原に対して誘導された免疫応答は、抗原結合の吸光度がバックグラウンドの２倍となる最大の血清希釈率の逆数として定義される、抗体力価として表される。したがって、抗体力価数が大きいほど、免疫原に対する体液性免疫応答が大きくなる。免疫原に対して誘導された抗体力価は、ＨＵＬＣマウスの両方の系統でも、ＷＴマウスでも、極めて大きく、系統の間で有意差は観察されなかった（図９）。

【0189】

（実施例３．３）
ｐＨ感受性モノクローナル抗体の生成
ＨＵＬＣマウス両方の系統でも、ＷＴマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成し、９６ウェルプレート内で成長させた。１０日間成長後、各ハイブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを介してスクリーニングして、陽性の抗原結合試料を同定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロ滴定プレートを、１ｕｇ／ｍＬの抗ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、番号ＮＢ６００−３４）により、４℃で一晩にわたりコーティングして、ｍｙｃタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、１μｇ／ｍＬの濃度でプレートへと添加し、室温で１時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後、ハイブリドーマ細胞からの上清を、１：５０の希釈率でウェルへと添加し、室温で１時間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。ＴＭＢ基質を、プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ／５１−２６０７ＫＣ）へと添加し、製造元により推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、Ｖｉｃｔｏｒ Ｗａｌｌａｃプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで記録した。ＯＤが０．５以上（ベースラインのＯＤは約０．１）を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００）を用いて、親和性スクリーニングにかけた。

【0190】

中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋ_ａ、ｋ_ｄ、Ｋ_Ｄ、ｔ_１／２など）を記録した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋ_ａ）および解離動力学速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ_１／２）は、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａ；およびｔ_１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋ_ｄ）として、動力学速度定数から計算した。ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４における結合と比較して結合の低下を提示する試料のセット（ｐＨ感受性）、ならびにｐＨ７．４とｐＨ６．０との間で有意な速度の変化を提示しない対照試料のセット（ｐＨ非感受性の対照）を、クローン作製するために選択した。図１０は、全抗原陽性クローンの数と、ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスからのｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較を示す。

【0191】

抗原陽性クローンのうち、２匹のヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスおよび２匹のＨＵＬＣ１９３０のそれぞれから単離された１８のクローンおよび７つのクローン、ならびにＷＴマウスからの１つのクローンは、モノクローナルとなった。モノクローナルハイブリドーマの上清を、中性ｐＨおよび低ｐＨにおける抗原解離速度（オフ速度）解析にかけ、細胞ペレットを軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。

【0192】

（実施例３．４）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのＣＤＲ３領域における配列決定および体細胞超変異
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレットを、軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。２６のクローンがモノクローナルとなり（上記の実施例３．３を参照されたい）、これらを配列決定にかけ、１５のクローンを、ＨＵＬＣマウス軽鎖またはＷＴマウス軽鎖（ＭＭおよびＮＮ；表４を参照されたい）を用いて確認した。１４のクローンは、ＨＵＬＣヘテロ接合性マウス（１９２７マウスまたは１９３０マウス）に由来し、１つのクローンは、ＷＴマウスに由来した（ＯＯ；表４を参照されたい）。

【0193】

ＨＵＬＣヘテロ接合性マウスに由来する１４の抗原陽性試料のうち、１２のモノクローナル抗体が、それらの対応するＨＵＬＣ軽鎖を使用したのに対し、２つのモノクローナル抗体は、ＷＴマウスの軽鎖を使用した。表３に示される通り、ＨＵＬＣを使用する抗体のうちの１つ（斜字体の抗体）を除く全ては、導入されたヒスチジン変異の全てを保持した。クローンＡＡを配列決定したところ、２つの異なるＨＵＬＣ配列がもたらされたが、表３では、これらを２つの項目で表す。

【表3】

【0194】

（実施例３．５）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスから単離されたモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合特徴をさらに評価するために、中性ｐＨにおいて抗体／抗原間の会合相を観察し、中性または酸性ｐＨにおいて抗体／抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。

【0195】

Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体で誘導体化した。モノクローナル抗体上清を抗マウスＦｃセンサー表面上に捕捉した。次いで、５０ｎＭ（二連で）および１６．７ｎＭという２つの濃度の免疫原を、モノクローナル抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、ｐＨ７．４で４分間にわたりモニタリングし、次いで、捕捉モノクローナル抗体からの抗原の解離を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で１５分間にわたりモニタリングした。解離速度定数（ｋ_ｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０曲線フィッティングソフトウェアを用い、データを処理してフィッティングすることにより決定し、これを、表４に示す。解離半減期（ｔ_１／２）は、ｔ_１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋ_ｄ）／６０として、解離速度定数から計算し、これを、表４に示す。表４に列挙される複数の抗体の、様々なｐＨ条件下における会合／解離特徴を示すセンサーグラムを、図１１にグラフで示す。各グラフ内の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ_１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記する。応答は、ＲＵ単位で測定する。

【表4】

【0196】

（実施例４）
ヒスチジン置換したＶκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（それぞれ、特許公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）、ならびに上記の実施例１において記載されている通りに、共通Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞系列のユニバーサルＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号５９に示す。

【0197】

Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ １９２７およびＨＵＬＣ １９３０）について、上記の実施例３で記載した戦略と同様の戦略を用いて、ヒスチジン置換を、Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖のターゲッティングベクターへと導入し、このベクターからマウスを生成した。

【0198】

手短には、ヒスチジン改変Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖ターゲッティングベクターを生成するための戦略を、図１４Ａ〜１４Ｄにまとめる。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のためのターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ３−２０Ｊκ１を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ）により、図１３に示される部位指向変異生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０７、およびＳ１０９、またはＱ１０５、Ｑ１０６、およびＳ１０９（図１２のアラインメントを参照されたい）を、ヒスチジン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図１４Ａを参照されたい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０７／１０９およびＨ１０５／１０６／１０９）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図１４Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−ＵＢ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図１４Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。

【0199】

陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ３−２０κＪ１軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを、下記の表５に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図１４Ｃ〜１４Ｄに示す。

【表5】

【0200】

ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞を、ＦＬＰを発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより欠失させる（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。

【0201】

上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses、Nature Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製する。

【0202】

仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択する。３カ所の（Ｈ１０５／１０６／１０９；「６１８３」）ヒスチジン改変または４カ所の（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「６１８１」）ヒスチジン改変を有するユニバーサル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプローブを、下記の表６に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらのユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル軽鎖マウス）と称する。

【表6】

【0203】

マウスを目的の抗原で免疫し、ｐＨ依存性結合を有する抗体を生成する能力について調べる。

【0204】

（実施例５）
ヒスチジン置換した単一の、再構成されたヒトユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ）を含むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているＨＵＬＣマウスのうちのいずれか１つと交配させて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。

【0205】

内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のＨＵＬＣ動物（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を含む）のうちの任意の１つを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例３および４に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作されたヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。

【0206】

ヒト化内因性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス（ＨＵＬＣマウス）は、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと交配させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。

【0207】

内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト重鎖可変領域遺伝子座による置きかえ、および内因性κ軽鎖遺伝子座内に、ヒスチジン置換した、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域を保有するマウスを得る。目的の抗原で免疫すると、ヒスチジン置換した単一のヒト軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｌ）を有する体細胞変異重鎖（ヒト重鎖可変ドメインおよびマウスＣ_Ｈ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。このようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまたは上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を用いて同定する。抗体、例えば、ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列を同定し、好適な発現系で、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒトＣ_Ｈヌクレオチド配列およびヒトＣ_Ｌヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させることにより、完全ヒト抗体を作製する。

【0208】

均等物
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。

【0209】

本出願を通して引用される全ての非特許文献、特許出願、および特許の全内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。

【0210】

（項目１）
ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目２に記載の動物。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目３に記載の動物。
（項目５）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列である、項目６に記載の動物。
（項目８）
機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、項目１に記載の動物。
（項目９）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目１に記載の動物。
（項目１０）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目５に記載の動物。
（項目１１）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記置換が、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンの置換である、項目１１に記載の動物。
（項目１３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載の動物。
（項目１４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目１３に記載の動物。
（項目１５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１７）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、項目１に記載の動物。
（項目１８）
中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）の前記短縮が、約３０倍以上の短縮である、項目１７に記載の動物。
（項目１９）
齧歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目２０）
ラットまたはマウスである、項目１９に記載の齧歯動物。
（項目２１）
マウスである、項目２０に記載の齧歯動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された前記少なくとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する、項目１に記載の動物。
（項目２３）
ヒトＶ_Ｌセグメント配列およびヒトＪ_Ｌセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。
（項目２４）
前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目２３に記載のマウス。
（項目２５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目２３に記載のマウス。
（項目２７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である、項目２６に記載のマウス。
（項目２８）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目２３に記載のマウス。
（項目２９）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目２６に記載のマウス。
（項目３０）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目２３に記載のマウス。
（項目３１）
前記置換が、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンの置換である、項目３０に記載のマウス。
（項目３２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目２３に記載のマウス。
（項目３３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目３２に記載のマウス。
（項目３４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３５）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３６）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３８）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目３９）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目４０）
目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、項目２３に記載のマウス。
（項目４１）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目２３に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４２）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を示す、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物において生成し、該免疫グロブリン軽鎖の前記改変を、該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
第一の抗体を、ヒトＶ_Ｈセグメント、ヒトＤ_Ｈセグメント、およびヒトＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物において生成する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ_１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ_１／２）を示す、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲノムに配置するステップと
を含む方法。
（項目５４）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記動物が、齧歯動物である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記動物が、マウスまたはラットである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、ＣＤＲ３コドンにおいてである、項目５３に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]