特許 6186576 乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理の方法及び試薬、並びに乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6186576

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理の方法及び試薬、並びに乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20170821BHJP

   G01N 33/84 20060101ALI20170821BHJP

   G01N 33/52 20060101ALI20170821BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20170821BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 A

   G01N33/84 Z

   G01N33/52 A

   G01N21/78 Z

【請求項の数】13

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2013-16172(P2013-16172)

(22)【出願日】2013年1月30日

(65)【公開番号】特開2014-145750(P2014-145750A)

(43)【公開日】2014年8月14日

【審査請求日】2016年1月28日

(73)【特許権者】

【識別番号】000131474

【氏名又は名称】株式会社シノテスト

(72)【発明者】

【氏名】日暮 和彦

(72)【発明者】

【氏名】水上 朋子

(72)【発明者】

【氏名】佐田 勇樹

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０９７４６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第９３／０１３４２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−２４３３１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２２３７２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２４０１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１１６６６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−３１０２９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００３／１０４４８６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ー３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳試料中の亜鉛イオンを比色測定する方法において、乳試料と、ＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを接触させる工程を含むことを特徴とする、乳試料中の亜鉛イオンの比色測定方法。

【請求項2】

乳試料と亜鉛イオンを接触させる工程の後に、亜鉛イオンの比色測定を行う、請求項１記載の乳試料中の亜鉛イオンの比色測定方法。

【請求項3】

乳試料がヒトの乳である、請求項１又は請求項２記載の乳試料中の亜鉛イオンの比色測定方法。

【請求項4】

乳試料と、ＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを接触させる工程が、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の乳試料中の亜鉛イオンの比色測定方法。

【請求項5】

乳試料中の亜鉛イオンの比色測定を行う前に、乳試料と、ＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを接触させる、乳試料の前処理方法。

【請求項6】

乳試料がヒトの乳である、請求項５記載の乳試料の前処理方法。

【請求項7】

乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、請求項５又は請求項６記載の乳試料の前処理方法。

【請求項8】

ＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを含有する、乳試料の前処理試薬。

【請求項9】

乳試料中の亜鉛イオンの比色測定を行う前に、乳試料と接触させて用いる、請求項８記載の乳試料の前処理試薬。

【請求項10】

乳試料がヒトの乳である、請求項８又は請求項９記載の乳試料の前処理試薬。

【請求項11】

乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、請求項８〜請求項１０のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。

【請求項12】

乳試料中の亜鉛イオンの比色測定を行うに当たり、乳試料と、ＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを接触させることを特徴とする、乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。

【請求項13】

乳試料がヒトの乳である、請求項１２記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳試料中の測定対象物質の比色測定方法であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる測定方法に関するものである。
また、本発明は、乳試料の前処理の方法及び試薬であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる試料の前処理の方法及び試薬に関するものである。
更に、本発明は、乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる方法に関するものである。

【0002】

本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。

【背景技術】

【0003】

母親から乳児に与えられる母乳には、乳児がその健康を保ち、育つのに必要な様々な成分が含まれている。
このため、母乳中に含まれる物質、例えば、栄養や免疫等に関する物質を測定し、その濃度等を把握することは、乳児の健康のため重要である。
また、母乳中に含まれる細菌、ウイルス又は毒物等を測定することも、乳児の健康のため重要である。
また、母乳中に含まれる物質を測定することにより、母親の健康状態や栄養状態を把握することもできる。
同様の理由により、粉ミルク等の人工乳に含まれる物質を測定することも重要である。
そして、哺乳動物の乳に含まれる物質を測定することも、また重要である。

【0004】

しかしながら、本発明者らが、血清又は血漿等の試料において確立された比色測定方法及び比色測定試薬により、乳試料に含まれる物質の比色測定を試みたところ、正確な測定値が得られないことに気付いた。
すなわち、乳試料中の測定対象物質の比色測定においては、正確な測定結果（測定値）を得ることができないものであった。

【0005】

これは、比色測定には一般的に、吸光度や透過率の測定のため分光光度計が用いられるが、この分光光度計は通常吸光度の値で３付近が測定上限である。
しかし、乳試料中の測定対象物質を比色測定するばあい、測定しようとする吸光度値がこの分光光度計の測定上限を超えてしまうことが多く、この場合測定不能又は測定不良となってしまうのである。
このため、乳試料中の測定対象物質を比色測定しようとしても、正確な測定結果（測定値）を得ることができないことが多々あった。

【0006】

なお、このような問題は、分光光度計を備えこの分光光度計により吸光度などの測定を行う臨床検査用の自動分析装置等においても同様であり、この自動分析装置等を用いた乳試料中の測定対象物質の比色測定においても、正確な測定結果（測定値）を得ることができないことが多いものであった。

【0007】

なお、乳中に含有される体細胞を計数するための乳試料処理方法として、ｐＨ緩衝剤、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び蛍光色素を含む試薬で、乳試料を処理する方法（特許文献１参照。）が提案されているが、体細胞の計数以外の方法に使用できる方法は知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００３−３１０２９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

従来、乳試料中の測定対象物質の比色測定は、正確な測定結果（測定値）を得ることができないものであった。
このため、例えば、医療の場における臨床検査等において、乳試料中の測定対象物質の比色測定の測定結果（測定値）を乳児の診断や育児等に利用しようとしても、それがかなわないものであった。

【0010】

これに対して、本発明の課題は、乳試料中の測定対象物質の比色測定方法であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる測定方法を提供することである。
また、本発明の課題は、乳試料の前処理の方法及び試薬であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる試料の前処理の方法及び試薬を提供することである。
更に、本発明の課題は、乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法であって、乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができる方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、乳試料中の測定対象物質の比色測定について検討を重ねたところ、界面活性物質を乳試料と接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１） 乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことを特徴とする、乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（２） 界面活性物質が非イオン性界面活性剤である、前記（１）記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（３） 界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である、前記（１）又は（２）記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（４） 界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである、前記（１）〜（３）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（５） 界面活性物質がＨＬＢ値が１２〜１６の界面活性物質である、前記（１）〜（４）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（６） 界面活性物質がポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレン化合物である、前記（１）〜（５）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（７） 乳試料と界面活性物質を接触させる工程の後に、測定対象物質の比色測定を行う、前記（１）〜（６）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（８） 測定対象物質が金属イオンである、前記（１）〜（７）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（９） 乳試料がヒトの乳である、前記（１）〜（８）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（１０） 乳試料と界面活性物質を接触させる工程が、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、前記（１）〜（９）のいずれか１項記載の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法。
（１１） 乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と界面活性物質を接触させる、乳試料の前処理方法。
（１２） 界面活性物質が非イオン性界面活性剤である、前記（１１）記載の乳試料の前処理方法。
（１３） 界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である、前記（１１）又は（１２）記載の乳試料の前処理方法。
（１４） 界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである、前記（１１）〜（１３）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（１５） 界面活性物質がＨＬＢ値が１２〜１６の界面活性物質である、前記（１１）〜（１４）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（１６） 界面活性物質がポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレン化合物である、前記（１１）〜（１５）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（１７） 測定対象物質が金属イオンである、前記（１１）〜（１６）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（１８） 乳試料がヒトの乳である、前記（１１）〜（１７）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（１９） 乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、前記（１１）〜（１８）のいずれか１項記載の乳試料の前処理方法。
（２０） 界面活性物質を含有する、乳試料の前処理試薬。
（２１） 界面活性物質が非イオン性界面活性剤である、前記（２０）記載の乳試料の前処理試薬。
（２２） 界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である、前記（２０）又は（２１）記載の乳試料の前処理試薬。
（２３） 界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである、前記（２０）〜（２２）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２４） 界面活性物質がＨＬＢ値が１２〜１６の界面活性物質である、前記（２０）〜（２３）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２５） 界面活性物質がポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレン化合物である、前記（２０）〜（２４）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２６） 乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と接触させて用いる、前記（２０）〜（２５）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２７） 測定対象物質が金属イオンである、前記（２０）〜（２６）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２８） 乳試料がヒトの乳である、前記（２０）〜（２７）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（２９） 乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、前記（２０）〜（２８）のいずれか１項記載の乳試料の前処理試薬。
（３０） 乳試料中の測定対象物質の比色測定を行うに当たり、乳試料と界面活性物質を接触させることを特徴とする、乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３１） 界面活性物質が非イオン性界面活性剤である、前記（３０）記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３２） 界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である、前記（３０）又は（３１）記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３３） 界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである、前記（３０）〜（３２）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３４） 界面活性物質がＨＬＢ値が１２〜１６の界面活性物質である、前記（３０）〜（３３）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３５） 界面活性物質がポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５のポリオキシアルキレン化合物である、前記（３０）〜（３４）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３６） 測定対象物質が金属イオンである、前記（３０）〜（３５）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３７） 乳試料がヒトの乳である、前記（３０）〜（３６）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。
（３８） 乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものである、前記（３０）〜（３７）のいずれか１項記載の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理の方法及び試薬、並びに乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法は、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制することができ、これにより乳試料においてもそれに含まれる測定対象物質を正確に比色測定することができるものである。

【0014】

すなわち、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理の方法及び試薬、並びに乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法を用いた場合は、乳試料中の測定対象物質の比色測定において、正確な測定結果（測定値）を得ることができるものである。

【0015】

これにより、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理の方法及び試薬、並びに乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法を用いることにより、例えば、医療の場における臨床検査等において、乳試料中の測定対象物質の比色測定の測定結果（測定値）を乳児の診断や育児等に利用することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0017】

【図2】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0018】

【図3】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0019】

【図4】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0020】

【図5】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0021】

【図6】乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を示した写真である。

【0022】

【図7】乳試料の前処理試薬による乳試料の前処理の効果を示した図である。

【0023】

【図8】本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法による測定値とＩＣＰ発光分析法による測定値の相関を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法
１．総論
本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法は、乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことを特徴とするものである。

【0025】

そして、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことにより、正確な測定結果（測定値）を得ることができる。

【0026】

２．界面活性物質
（１）総論
本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含む。

【0027】

（２）界面活性物質
本発明において、界面活性物質とは、親水基及び疎水基を有し、界面活性を有する物質をいう。

【0028】

なお、本発明において、界面活性物質としては、例えば、ポリオキシアルキレン化合物などの非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は陽イオン性界面活性剤などの界面活性剤等を挙げることができる。

【0029】

なお、非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、若しくはポリオキシエチレンラノリンなどのポリオキシアルキレン化合物、又は、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、フィトスタノール、若しくは硬化ヒマシ油等を挙げることができる。

【0030】

また、両性界面活性剤としては、例えば、酢酸ベタイン等を挙げることができる。

【0031】

また、陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩等を挙げることができる。

【0032】

また、陽イオン性界面活性剤としては、例えば、アミン塩又は第４級アンモニウム塩等を挙げることができる。

【0033】

なお、本発明において、界面活性物質が界面活性剤である場合、この界面活性剤としては、本発明の効果、すなわち乳試料中の測定対象物質の正確な比色測定という効果の上から、非イオン性界面活性剤が好ましい。

【0034】

そして、本発明において、界面活性物質が非イオン性界面活性剤である場合、この非イオン性界面活性剤としては、前記の本発明の効果の上から、ポリオキシアルキレン化合物が好ましい。

【0035】

なお、ポリオキシアルキレン化合物としては、例えば、ポリオキシエチレン化合物又はポリオキシプロピレン化合物等を挙げることができる。

【0036】

また、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である場合、このポリオキシアルキレン化合物としては、前記の本発明の効果の上から、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが好ましい。

【0037】

また、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテルである場合、このポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル又はポリオキシプロピレンアルキルエーテル等を挙げることができる。

【0038】

なお、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルエーテルである場合、このポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしては、前記の本発明の効果の上から、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。

【0039】

また、本発明において、界面活性物質がポリオキシエチレンアルキルエーテルである場合、このポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、前記の本発明の効果の上から、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。

【0040】

また、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである場合、このポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル又はポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル等を挙げることができる。

【0041】

例えば、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルとしてはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等を、またポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテルとしてはポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。

【0042】

なお、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルである場合、このポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルとしては、前記の本発明の効果の上から、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルが好ましい。

【0043】

そして、本発明において、界面活性物質がポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである場合、このポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルとしては、前記の本発明の効果の上から、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。

【0044】

また、本発明において、界面活性物質は、前記の本発明の効果の上から、そのＨＬＢ値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ値）が１２〜１６のものが好ましく、１２〜１４のものが更に好ましい。

【0045】

また、本発明において、界面活性物質は、ポリオキシアルキレン化合物である場合には、前記の本発明の効果の上から、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン又はポリオキシプロピレン等）の平均付加モル数が５．５〜８．５のものが好ましく、７．０〜７．５のものが更に好ましい。

【0046】

そして、本発明において、界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物である場合には、前記の本発明の効果の上から、そのＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつそのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５であるものが好ましく、そのＨＬＢ値が１２〜１４であり、かつそのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が７．０〜７．５であるものが更に好ましい。

【0047】

前記のそのＨＬＢ値が１２〜１６であり、かつそのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が５．５〜８．５であるポリオキシアルキレン化合物としては、例えば、ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル、又はポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテル等を挙げることができる。

【0048】

なお、前記のポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５〜Ｃ_１４Ｈ_２９、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：７〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、医薬部外品原料規格２００６成分名としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、化粧品表示名称が（Ｃ１２−１４）ｓ−パレス−７であり、ＩＮＣＩ名がＣ１２−１４ ＳＥＣ−ＰＡＲＥＴＨ−７であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が８４１３３−５０−６であり、そのＨＬＢ値が１２．０であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が７．０である、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0049】

このポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７〕、青木油脂工業社（日本国）〔商品名：ファインサーフ ２７０〕、又は第一工業製薬社（日本国）〔商品名：ノイゲン ＥＴ−１１５〕等より供給される。

【0050】

また、ポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_９Ｈ_１９−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：７．５〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＮｏｎｏｘｙｎｏｌ−８であり、そのＨＬＢ値が１４．０であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が７．５である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0051】

このポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５〕等より供給される。

【0052】

（３）界面活性物質の濃度
本発明においては、乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことを特徴とするものであって、この界面活性物質の濃度は、特に限定されないが、乳試料と界面活性物質を接触させる時に、０．１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。

【0053】

なお、この界面活性物質の好ましい濃度は、乳試料と界面活性物質の接触時において、より好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１．２５％（ｗ／ｖ）以上である。

【0054】

また、この界面活性物質の濃度であるが、乳試料と界面活性物質の接触時における濃度に特に上限はないが、コスト等のことを考えると、２５％（ｗ／ｖ）迄で十分である。

【0055】

なお、この界面活性物質の好ましい濃度は、乳試料と界面活性物質の接触時において、より好ましくは１５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下である。

【0056】

なお、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に界面活性物質が前記の濃度となるような濃度の界面活性物質（又は界面活性物質を含む物質）を乳試料と接触させることが好ましい。

【0057】

また、本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に界面活性物質が前記の濃度となるような濃度の界面活性物質を、乳試料と接触させることが好ましい。

【0058】

また、本発明の乳試料の前処理試薬には、この乳試料の前処理試薬と乳試料との接触時に界面活性物質が前記の濃度となるような濃度の界面活性物質を、この乳試料の前処理試薬に含有させることが好ましい。

【0059】

また、本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に界面活性物質が前記の濃度となるような濃度の界面活性物質を、乳試料と接触させることが好ましい。

【0060】

（４）希釈
本発明においては、乳試料と界面活性物質を接触させることにより、当該乳試料が希釈されることが好ましい。

【0061】

なお、界面活性物質又は界面活性物質を含む物質が液体である場合、乳試料と界面活性物質（又は界面活性物質を含む物質）を接触させることにより、当該乳試料は希釈される。

【0062】

本発明においては、この乳試料の希釈により、乳試料と界面活性物質の接触による乳試料に由来する比色測定への影響の抑制という効果を更に増すことができるので、正確な測定結果（測定値）の取得という点から好ましい。

【0063】

本発明において、乳試料と界面活性物質を接触させることにより、当該乳試料が希釈される場合の希釈倍率は、特には限定されないものの、２倍以上であることが好ましい。

【0064】

なお、この乳試料が希釈される場合の希釈倍率は、より好ましくは３倍以上であり、特に好ましくは５倍以上である。

【0065】

また、この乳試料が希釈される場合の希釈倍率であるが、特に上限はないものの、この希釈倍率が余りに高すぎると測定対象物質の測定により得られる吸光度等（シグナル）の値が低くなり、測定の再現性が悪くなるので、４０倍以下とすることが好ましい。

【0066】

なお、この乳試料が希釈される場合の希釈倍率は、より好ましくは２０倍以下であり、特に好ましくは１０倍以下である。

【0067】

なお、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に前記の希釈倍率となるような容量の界面活性物質（又は界面活性物質を含む物質）を乳試料と接触させることが好ましい。

【0068】

また、本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に前記の希釈倍率となるように、界面活性物質を乳試料と接触させることが好ましい。

【0069】

また、本発明の乳試料の前処理試薬においては、この乳試料の前処理試薬と乳試料との接触時に前記の希釈倍率となるような容量の当該前処理試薬であることが好ましい。

【0070】

また、本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に前記の希釈倍率となるように、界面活性物質を乳試料と接触させることが好ましい。

【0071】

（５）乳試料と界面活性物質の接触
本発明において、界面活性物質は、１種類のものを乳試料と接触させてもよく、又は複数種類のものを乳試料と接触させてもよい。

【0072】

本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法は、乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことを特徴とするものであるが、当該接触工程と同時又は当該接触工程の後に、当該測定対象物質の比色測定を行なえばよい。

【0073】

なお、前記の本発明の効果の上から、当該接触工程の後に、当該測定対象物質の比色測定を行うことが好ましい。

【0074】

なお、この測定対象物質の比色測定は、当該測定対象物質の比色測定方法として公知の方法等により行なえばよい。

【0075】

上述の通り、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことにより、正確な測定結果（測定値）を得ることができるものである。

【0076】

すなわち、本発明において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程は、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものであり、この工程により乳試料においても測定対象物質の正確な測定結果（測定値）を得ることが可能となる。

【0077】

３．乳試料中の測定対象物質の比色測定
（１）総論
本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法は、乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法において、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を含むことを特徴とするものである。

【0078】

この乳試料中の測定対象物質を比色測定する方法であるが、乳試料と界面活性物質を接触させる工程の他は、公知又は通常の試料中の測定対象物質を比色測定する方法のものであってよく、特に限定はない。
本発明の特徴である、乳試料と界面活性物質を接触させる工程を実施することにより、公知又は通常の試料中の測定対象物質を比色測定する方法等においても、特に限定なく、乳試料に含まれる測定対象物質を正確に測定することができる。

【0079】

なお、本発明において、比色測定とは、色の濃淡、色調、透過率又は吸光度などの光学的な測定に基づいて、物質の存在の有無又は量若しくは濃度などを測定すること等をいう。

【0080】

（２）乳試料
本発明における乳試料は、測定対象物質を含む可能性がある乳試料であって、この測定対象物質を比色測定しようとするものである。

【0081】

前記の通りのものであれば、乳試料として特に限定はないが、例えば、乳試料として、ヒト若しくはウシ等の哺乳動物の乳、この乳を処理若しくは加工したもの、液状又は粉状などのミルク、人工乳、又はこれらよりなる若しくはこれらを含む食品若しくは飲料などの物等を挙げることができる。

【0082】

本発明においては、乳試料は液体であることが好ましい。
もし、測定対象物質を含む乳試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を公知の方法に従って行ない、測定対象物質を液体中に含有させるようにしてもよい。

【0083】

（３）測定対象物質
本発明における測定対象物質は、乳試料に含まれ、乳試料中における存在の有無又は量若しくは濃度等を比色測定しようとする物質である。
このようなものであれば、測定対象物質として特に限定はない。

【0084】

この測定対象物質の例を以下記載する。
まず、錯体形成反応により測定を行うことができる測定対象物質としては、例えば、亜鉛、カルシウム、鉄、銅、アルミニウム、若しくはマグネシウムなどの金属イオン、又は不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）若しくは総鉄結合能（ＴＩＢＣ）等を挙げることができる。

【0085】

また、酵素とその酵素の基質となる物質との反応により測定を行うことができる測定対象物質のうち酵素の基質となる物質としては、例えば、無機リン（ＩＰ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、クレアチン、尿酸（ＵＡ）、尿素窒素（ＢＵＮ、ＵＮ）、グルコース、総コレステロール、遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、β−リポタンパク質、トリグリセライド（ＴＧ、中性脂肪）、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ、ＦＦＡ）、グルコース、乳酸、ピルビン酸、ガラクトース、シアル酸、クエン酸、フルクトサミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グリコーゲン、フコース、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビン、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、マグネシウム、又は胆汁酸等を挙げることができる。

【0086】

更に、酵素とその酵素の基質となる物質との反応により測定を行うことができる測定対象物質のうち酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ、ＬＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ、γ−ＧＴ）、コリンエステラーゼ（Ｃｈ−Ｅ）、リパーゼ、若しくはリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、又はこれらのアイソザイム等を挙げることができる。

【0087】

そして、抗原抗体反応（免疫学的反応）により測定を行うことができる測定対象物質としては、例えば、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体、サイトメガロウイルス抗原、抗サイトメガロウイルス抗体、若しくは抗ヘルペスウイルス抗体等のウイルス関連の抗原若しくは抗体；大腸菌Ｏ１５７抗原、抗トレポネーマ・パリダム（ＴＰ）抗体、抗マイコプラズマ抗体、若しくは抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）等の細菌関連の抗原若しくは抗体；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ(ＩｇＡ) 、免疫グロブリンＭ(ＩｇＭ) 、若しくは免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ) 等の免疫グロブリン；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ)、α１−酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、補体Ｃ３ 、補体Ｃ４ 、若しくはリウマトイド因子等の炎症マーカー；α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、若しくはＣＡ１９−９等の腫瘍マーカー；ヒト胎盤絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン；アレルゲン、若しくはアレルゲン特異ＩｇＥ抗体等のアレルギー関連の抗原若しくは抗体；抗トロンビンＩＩＩ(ＡＴＩＩＩ) 等の血液凝固系関連物質；フィブリン体分解物（ＦＤＰ）、若しくはＤダイマー等の線溶系関連物質；ＡＢＯ式血液型抗体、若しくは不規則抗体等の血液型関連の抗原若しくは抗体；フェリチン等の他の疾病に関連した物質；薬物；又は、毒物等を挙げることができる。

【0088】

また、核酸のこれに相補的な核酸との結合反応により測定を行うことができる測定対象物質としては、例えば、サイトメガロウイルス若しくはヘルペスウイルスなどの病原性ウイルスなどのウイルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、病原性細菌などの細菌のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は、ヒトなどの動物あるいは植物のＤＮＡ若しくはＲＮＡ等を挙げることができる。

【0089】

本発明において、測定対象物質としては、亜鉛、カルシウム、鉄、銅、アルミニウム、若しくはマグネシウムなどの金属イオン又は無機リンが好ましく、亜鉛、カルシウム、鉄、銅、又は無機リンがより好ましく、亜鉛が特に好ましい。

【0090】

（４）ｐＨ
本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法において、ｐＨは特に限定されないが、乳試料に含まれる測定対象物質や当該比色測定の反応に係わる成分が変性、失活、変質又は分解等をせず、かつ測定対象物質の当該比色測定の反応が進むｐＨであればよい。

【0091】

なお、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質の接触後に前記の通りのｐＨとなるようなｐＨの界面活性物質（又は界面活性物質を含む物質）を乳試料と接触させることが好ましい。

【0092】

また、本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料と界面活性物質の接触後に前記の通りのｐＨとなるように、界面活性物質を乳試料と接触させることが好ましい。

【0093】

また、本発明の乳試料の前処理試薬においては、この乳試料の前処理試薬と乳試料との接触後に前記の通りのｐＨとなるようなｐＨの当該前処理試薬であることが好ましい。

【0094】

また、本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法においては、乳試料と界面活性物質の接触後に前記の通りのｐＨとなるように、界面活性物質を乳試料と接触させることが好ましい。

【0095】

（５）他の成分
本発明においては、乳試料と界面活性物質を接触させる際に、緩衝剤、安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、試料若しくは試薬成分などに含まれる他の測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、又は活性化剤等を適宜必要に応じて存在させることができる。

【0096】

なお、これらを存在させる際の濃度は特に限定されるものではないが、乳試料と界面活性物質の接触時において、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。

【0097】

また、これらを存在させる際の濃度の下限は、乳試料と界面活性物質の接触時において、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。

【0098】

そして、これらを存在させる際の濃度に上限は特にはないが、コスト等のことを考えると１０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。

【0099】

また、これらを存在させる際の濃度の上限は、乳試料と界面活性物質の接触時において、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは２．５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0100】

なお、本発明の乳試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に前記の他の成分が前記の濃度となるような濃度で含まれる界面活性物質（又は界面活性物質を含む物質）を乳試料と接触させることが好ましい。

【0101】

また、本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料と界面活性物質の接触時に前記の他の成分が前記の濃度となるような濃度で含まれる界面活性物質を、乳試料と接触させることが好ましい。

【0102】

また、本発明の乳試料の前処理試薬には、この乳試料の前処理試薬と乳試料との接触時に前記の他の成分が前記の濃度となるような濃度で含まれるよう、この乳試料の前処理試薬に含有させることが好ましい。

【0103】

（６）比色測定
本発明により乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う場合、測定は終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して測定を行えばよい。

【0104】

また、この測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法（１試薬法）、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法（多試薬法）を適宜選択して測定を行えばよい。

【0105】

また、この測定において、吸光度等を測定する場合の測定波長は、可視部の適当な波長を適宜選択して使用することができる。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。

【0106】

また、この測定において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定対象物質又は測定反応に係わる反応成分等が変性、失活、変質又は分解等しない範囲内の温度を設定すればよい。

【0107】

また、この測定において、測定反応の開始方法は、基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよい。

【0108】

また、この測定において、その測定は、用手法により行ってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

【0109】

（７）乳試料中の測定対象物質の比色測定方法等の具体例
本発明における乳試料中の測定対象物質の比色測定方法、乳試料の前処理方法、乳試料の前処理試薬、及び乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法の具体例として、乳試料中の亜鉛の測定を例に挙げて以下記載する。

【0110】

（ａ）試薬の調製
（ｉ）乳試料の前処理試薬
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬を調製した。

【0111】

ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル ＜界面活性物質＞ ５％（ｗ／ｖ）

【0112】

（ｉｉ）亜鉛測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第１試薬を調製した。

【0113】

ビス−トリスプロパン ３０ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １％（ｗ／ｖ）

【0114】

（ｉｉｉ）亜鉛測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第２試薬を調製した。

【0115】

２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム 〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕 ＜キレート発色剤＞ ０．１３ｍＭ

【0116】

（ｂ）標準液及び精製水
（ｉ）標準液
１ｇ／Ｌの亜鉛標準液を、０．０１Ｎ塩酸で亜鉛濃度が２００μｇ／ｄＬになるように希釈したものを標準液とした。

【0117】

（ｉｉ）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。

【0118】

（ｃ）乳試料
ヒトの乳（ヒト母乳）を乳試料として用いた。

【0119】

（ｄ）比色測定
（ｉ）第１段階
前記の乳試料と前記の「乳試料の前処理試薬」（界面活性物質を含有する）を混合し、前記の乳試料と「乳試料の前処理試薬」の混合液（第１混合液）を調製し、これにより前記の乳試料と界面活性物質を接触させ、乳試料の前処理を行なう。

【0120】

なお、乳試料と「乳試料の前処理試薬」の混合比率であるが、これは乳試料が界面活性物質との接触により希釈される際の希釈倍率に基づいて定めればよい。
当該希釈倍率の好ましい範囲については、先に述べた通りである。

【0121】

なお、本発明において必須ではないものの、この乳試料と界面活性物質の接触後、インキュベートを行うことがより好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は５秒以上であることが好ましく、１０秒以上であることがより好ましく、３０秒以上であることが特に好ましい。

【0122】

また、インキュベートする際の温度は、前記の第１混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定対象物質又は界面活性物質等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、インキュベートする際の温度は、これらの物質等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、５〜５０℃が好ましく、１５〜４０℃がより好ましい。

【0123】

この乳試料と「乳試料の前処理試薬」（界面活性物質を含有する）の混合により、乳試料と界面活性物質が接触し、乳試料の前処理が行なわれるが、これにより乳試料に由来する比色測定への影響が抑制され、乳試料においても測定対象物質の正確な測定結果（測定値）を得ることが可能となる。

【0124】

（ｉｉ）第２段階
前記の第１混合液と、前記の亜鉛測定用第１試薬とを混合して、混合液（第２混合液）を調製する。

【0125】

この混合する、前記の第１混合液の量、及び前記の亜鉛測定用第１試薬の量は、それぞれ、亜鉛測定用第２試薬の量、乳試料に含まれる測定対象物質の濃度、測定反応に係わる成分の濃度、活性又は力価、吸光度等の測定を行なう物質の吸光係数など、測定波長、使用する分析装置の仕様など、並びに他の条件等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、前記の亜鉛測定用第１試薬に混合させる前記の第１混合液の量は０．５〜１００μＬ、前記の亜鉛測定用第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。

【0126】

前記の第２混合液の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。

【0127】

また、インキュベートする際の温度は、前記の第２混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定対象物質、界面活性物質又は測定反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、インキュベートする際の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる成分等が耐熱性の物であれば更に高温でもよい。

【0128】

この第２混合液の調製及びインキュベートにより、前記の第１混合液に含まれていた乳試料由来の鉄、銅及びニッケルと、前記の亜鉛測定用第１試薬に含まれるビス−トリスプロパン（鉄、銅及び／又はニッケルのマスキング剤）とが接触し、測定結果に正誤差を与える鉄、銅及びニッケルにビス−トリスプロパンが結合して、これらの鉄、銅及びニッケルをマスキングする。

【0129】

（ｉｉｉ）第３段階
前記の第２段階で調製した第２混合液に、前記の亜鉛測定用第２試薬を混合し、混合液（第３混合液）を調製する。これを最終反応液とする。

【0130】

この混合する前記の亜鉛測定用第２試薬の量は、乳試料の量、乳試料の前処理試薬の量、亜鉛測定用第１試薬の量、乳試料に含まれる測定対象物質の濃度、測定反応に係わる成分の濃度、活性又は力価、吸光度等の測定を行なう物質の吸光係数など、測定波長、使用する分析装置の仕様など、並びに他の条件等に応じて適宜決めればよい。
なお、一般的には、例えば、前記の亜鉛測定用第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。

【0131】

前記の第３混合液（最終反応液）の調製後、インキュベートを行う。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は１分以上であることが好ましく、３分以上であることがより好ましく、５分以上であることが特に好ましい。

【0132】

また、インキュベートする際の温度は、前記の第３混合液（最終反応液）が凍結する温度より上の温度であればよい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定対象物質、界面活性物質又は測定反応に係わる成分等が変性、失活、変質又は分解等してしまう可能性があるので、インキュベートする際の温度は、これらの物質又は成分等が変性、失活、変質又は分解等する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる成分等が耐熱性の物であれば更に高温でもよい。

【0133】

この第３混合液（最終反応液）の調製及びインキュベートにより、前記の第２段階における反応に引き続き、この第３段階における測定反応が開始し、前記の第２混合液に含まれていた乳試料由来の亜鉛と、前記の亜鉛測定用第２試薬に含まれる２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕＜キレート発色剤＞とが接触し、この５−Ｂｒ−ＰＡＰＳがこの亜鉛と結合し、これにより５−Ｂｒ−ＰＡＰＳが発色する。

【0134】

次に、キレート発色剤である５−Ｂｒ−ＰＡＰＳの発色に由来する、第３混合液（最終反応液）の吸光度（又は透過率）の測定を行なう。
なお、この吸光度（又は透過率）の測定は、一つの波長においてのみ行う一波長法でもよく、又は二つの波長においてそれぞれ行う二波長法でもよく、適宜選択して行えばよい。
また、吸光度（又は透過率）の測定を行う波長についても、そのキレート発色剤の発色の吸収波長に応じて、適宜選択すればよい。
そして、吸光度（若しくは透過率）の測定は、終点法（エンドポイント法）又は反応速度法（レート法）等の方法を適宜選択して行えばよい。

【0135】

なお、測定した吸光度（若しくは透過率）又は測定した吸光度（若しくは透過率）の変化量より、乳試料に含まれていた測定対象物質の濃度又は活性値等を算出することは、キレート発色剤の発色のモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又は濃度若しくは活性値等が分かっている測定対象物質（標準物質又は標準液）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。

【0136】

なお、本発明においては、乳試料中の測定対象物質を比色測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、乳試料に含まれていた測定対象物質の濃度又は活性値等を算出することが好ましい。

【0137】

なお、乳試料中の測定対象物質の比色測定の操作は、測定者自身が用手法により行ってもよいし、自動分析装置等の装置を使用して行ってもよいし、又は用手法と自動分析装置等の装置を使用する方法を組み合わせて行ってもよい。
例えば、前記（ｉ）の第１段階を用手法により行い、前記（ｉｉ）の第２段階と前記（ｉｉｉ）の第３段階を自動分析装置等の装置を使用して行ってもよい。
また、例えば、前記（ｉ）の第１段階、前記（ｉｉ）の第２段階及び前記（ｉｉｉ）の第３段階の全ての段階を自動分析装置等の装置を使用して、完全に全自動で行ってもよい。

【0138】

また、乳試料中の測定対象物質の比色測定に使用する測定試薬が、乳試料の前処理試薬、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち４以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ３段階又は４段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行えばよい。

【0139】

なお、前記の通りの乳試料の前処理試薬、亜鉛測定用第１試薬、及び亜鉛測定用第２試薬を用いて、乳試料中の亜鉛の比色測定を行なう場合には、第３混合液（最終反応液）の調製後の一定時間のインキュベート後の第３混合液（最終反応液）の吸光度より、第２混合液の調製後の一定時間のインキュベート後の第２混合液の吸光度を差し引いて、この吸光度差の値を、前記の標準液を同様に測定して得た吸光度差の値と対比して、乳試料に含まれていた亜鉛の濃度を求める方法（いわゆる、２ポイント−エンド法）により行なうことが好ましい。

【0140】

また、５−Ｂｒ−ＰＡＰＳをキレート発色剤として用い、乳試料中の亜鉛の比色測定を行なう場合には、５−Ｂｒ−ＰＡＰＳの発色に基づく吸光度の測定は、主波長５００ｎｍ〜５８０ｎｍ、副波長６００ｎｍ〜８００ｎｍにて行なうことが好ましい。

【0141】

〔２〕乳試料の前処理方法
１．総論
本発明の乳試料の前処理方法は、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と界面活性物質を接触させるものである。

【0142】

本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と界面活性物質を接触させればよい。

【0143】

そして、本発明の乳試料の前処理方法においては、乳試料と界面活性物質を接触させることにより、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行った場合に、正確な測定結果（測定値）を得ることができる。

【0144】

すなわち、本発明の乳試料の前処理方法は、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものであり、当該前処理方法により乳試料においても測定対象物質の正確な測定結果（測定値）を得ることが可能となる。

【0145】

２．界面活性物質
界面活性物質、及び乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前の乳試料と界面活性物質の接触等については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「２．界面活性物質」に記載した通りである。

【0146】

３．乳試料中の測定対象物質の比色測定
乳試料中の測定対象物質の比色測定については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「３．乳試料中の測定対象物質の比色測定」に記載した通りである。

【0147】

〔３〕乳試料の前処理試薬
１．総論
本発明の乳試料の前処理試薬は、界面活性物質を含有するものである。

【0148】

本発明の乳試料の前処理試薬においては、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と当該前処理試薬を混合し、当該前処理試薬に含まれる界面活性物質と当該乳試料を接触させればよい。

【0149】

そして、本発明の乳試料の前処理試薬においては、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と当該前処理試薬を混合し、当該前処理試薬に含まれる界面活性物質と当該乳試料を接触させることにより、正確な測定結果（測定値）を得ることができる。

【0150】

すなわち、本発明の乳試料の前処理試薬は、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制するためのものであり、当該前処理試薬を用いることにより乳試料においても測定対象物質の正確な測定結果（測定値）を得ることが可能となる。

【0151】

２．界面活性物質
界面活性物質、及び乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前の乳試料と界面活性物質の接触等については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「２．界面活性物質」に記載した通りである。

【0152】

３．乳試料中の測定対象物質の比色測定
乳試料中の測定対象物質の比色測定については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「３．乳試料中の測定対象物質の比色測定」に記載した通りである。

【0153】

４．試薬の構成等
本発明の乳試料の前処理試薬は、液状のものであってもよく、凍結乾燥されたものであってもよく、粉状や固形状などの固体状のものであってもよく、又はこれらを組み合わせたものであってよい。

【0154】

また、この本発明の乳試料の前処理試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は乳試料中の測定対象物質の比色測定に使用することができる。

【0155】

また、この本発明の乳試料の前処理試薬は、その他の試薬と組み合わせて、販売し、又は乳試料中の測定対象物質の比色測定に使用することもできる。

【0156】

前記のその他の試薬としては、例えば、乳試料中の測定対象物質の比色測定試薬、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。

【0157】

また、この本発明の乳試料の前処理試薬は、前記のその他の試薬等の複数の構成試薬からなる試薬キットであってもよい。

【0158】

〔４〕乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法
１．総論
本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法は、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行う前に、乳試料と界面活性物質を接触させることを特徴とするものである。

【0159】

本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法においては、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行うに当たり、乳試料と界面活性物質を接触させればよい。

【0160】

そして、本発明の乳試料に由来する比色測定への影響の抑制方法においては、乳試料と界面活性物質を接触させることにより、乳試料中の測定対象物質の比色測定を行った場合に、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制することができ、これにより乳試料においても測定対象物質の正確な測定結果（測定値）を得ることが可能となる。

【0161】

２．界面活性物質
界面活性物質、及び乳試料中の測定対象物質の比色測定を行うに当たっての乳試料と界面活性物質の接触等については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「２．界面活性物質」に記載した通りである。

【0162】

３．乳試料中の測定対象物質の比色測定
乳試料中の測定対象物質の比色測定については、前記の「〔１〕乳試料中の測定対象物質の比色測定方法」の「３．乳試料中の測定対象物質の比色測定」に記載した通りである。

【実施例】

【0163】

以下、本発明を実施例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等により限定されるものではない。

【0164】

〔比較例１〕（従来の測定対象物質の比色測定方法による乳試料中の測定対象物質の測定）
従来の試料中の測定対象物質の比色測定方法による乳試料中の測定対象物質の測定結果を確認するため、従来の試料中の亜鉛の比色測定方法により乳試料中の亜鉛の測定を行なった。

【0165】

１．試薬の調製
（１）亜鉛測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第１試薬を調製した。

【0166】

ビス−トリスプロパン ３０ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １％（ｗ／ｖ）

【0167】

（２）亜鉛測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第２試薬を調製した。

【0168】

２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム 〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕 ＜キレート発色剤＞ ０．１３ｍＭ

【0169】

２．標準液及び精製水
（１）標準液
１ｇ／Ｌの亜鉛標準液を、０．０１Ｎ塩酸で亜鉛濃度が２００μｇ／ｄＬになるように希釈したものを標準液とした。

【0170】

（２）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。

【0171】

３．乳試料
下記のヒトの乳（ヒト母乳）１１種類及び人工乳１種類をそれぞれ乳試料として用いた。

【0172】

（１） 乳試料ａ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（２） 乳試料ｂ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（３） 乳試料ｃ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（４） 乳試料ｄ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（５） 乳試料ｅ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（６） 乳試料ｆ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（７） 乳試料ｇ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（８） 乳試料ｈ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（９） 乳試料ｉ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（１０） 乳試料ｊ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（１１） 乳試料ｋ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（１２） 人工乳ａ 〔明治社（日本国）の粉ミルク「明治ほほえみ」をメーカー指定の方法により溶解し調製したもの〕

【0173】

４．従来の試料中の亜鉛の比色測定方法による乳試料中の亜鉛の測定
前記３の１２種類の乳試料中の亜鉛の濃度を、前記１で調製した亜鉛測定用第１試薬及び亜鉛測定用第２試薬にて測定した。

【0174】

この乳試料中の亜鉛の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置にて行い、前記３の１２種類の乳試料のそれぞれについて、この乳試料の１０μＬに前記１の（１）で調製した亜鉛測定用第１試薬１５０μＬを添加し混和した後３７℃で５分間反応させ、この後、前記１の（２）で調製した亜鉛測定用第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。

【0175】

そして、亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）及び亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、この亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）から亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）を差し引いて吸光度差を求めた。

【0176】

次に、この前記３の１２種類の乳試料について求めた吸光度差の値から、前記２の（２）の精製水について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値〔試薬盲検（試薬ブランク）〕を差し引いて、吸光度差を求めた。

【0177】

次に、この前記３の１２種類の乳試料について求めた吸光度差の値と、亜鉛の濃度が分かっている前記２の（１）の標準液について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値とを、それぞれ比較することにより、前記３の１２種類の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0178】

５．ＩＣＰ発光分析法による乳試料中の亜鉛の測定
前記３の１２種類の乳試料中の亜鉛の濃度を、ＩＣＰ発光分析法にて測定した。

【0179】

この乳試料中の亜鉛の濃度の測定は、前記３の１２種類の乳試料のそれぞれについて、この乳試料の６０μＬに、１ｐｐｍのイットリウムを含む０．１Ｍ塩酸水溶液の３．００ｍＬを添加し混和し混合液を調製した。
なお、この混合液の調製により、当該乳試料は、５１倍の希釈倍率で希釈されたことになる。
次に、前記の混合液の３．０６ｍＬについて、イットリウムを内部標準物質として、島津製作所（日本国）のＩＣＰＳ−８１００型ＩＣＰ発光分析装置により測定を行なった。

【0180】

また、亜鉛の濃度が分かっている前記２の標準液について、前記の通り測定を行い、この標準液について求めた値と、前記の１２種類の乳試料について求めた値とをそれぞれ比較することにより、前記１２種類の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0181】

６．測定結果
前記４における従来の試料中の亜鉛の比色測定方法による測定結果及び前記５におけるＩＣＰ発光分析法による測定結果の各々を表１に示した。

【0182】

なお、前記５におけるＩＣＰ発光分析法による測定結果は、容積置換補正後の値を示している。

【0183】

なお、この表において、各欄の数値はそれぞれの乳試料中の亜鉛の濃度の測定値（単位：μｇ／ｄＬ）を示す。
但し、従来の試料中の亜鉛の比色測定方法による測定結果の欄に「測定不能」と表したものは、吸光度が当該自動分析装置の分光光度計の測定上限を超えてしまい、当該自動分析装置の測定結果の出力に測定不能である旨が表示されたものを示す。
また、従来の試料中の亜鉛の比色測定方法による測定結果の欄の（カッコ）内のパーセントの値は、従来の試料中の亜鉛の比色測定方法による測定値を、同一の乳試料におけるＩＣＰ発光分析法による測定値で除したときの百分率を示す。

【0184】

【表1】

【0185】

この表から分かるように、１２種類の乳試料の内、半数に当たる６種類の乳試料においては、測定により得られた吸光度が、用いた自動分析装置の分光光度計の測定上限を超えてしまい、測定不能であった。

【0186】

また、この表より、従来の試料中の亜鉛の比色測定方法により測定不能と表示されずに測定値が得られた６種類の乳試料においても、その内４種類の乳試料においてはＩＣＰ発光分析法による測定値より５％以上測定値がかい離してしまっていることが分かる。

【0187】

本比較例の測定結果から分かるように、従来の試料中の測定対象物質の比色測定方法においては、その測定結果（測定値）が乳試料に由来する影響を受けてしまい、乳試料中の測定対象物質の比色測定において、正確な測定結果（測定値）を得ることができないものであることが確認できた。

【0188】

なお、ＩＣＰ発光分析法は、乳試料に由来する影響を受けることなく、乳試料においても正確な測定結果（測定値）を得ることができるものであるが、このＩＣＰ発光分析法に用いるＩＣＰ発光分析装置は、非常に高価であり、かつ大きいものであって、スペースを取り、容易に導入できるものではなく、これを設置、使用できる施設は限られるものである。

【0189】

〔実施例１〕（本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果の確認−１）
本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果を確かめた。

【0190】

１．試薬の調製
（１）乳試料の前処理試薬
（ａ）乳試料の前処理試薬〔精製水〕
乳試料の前処理試薬の効果を確認するための対照として、精製水を用いた。
この精製水を、乳試料の前処理試薬〔精製水〕とした。

【0191】

（ｂ）乳試料の前処理試薬〔ブリッジ−３５（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ブリッジ−３５（２．５％）〕を調製した。

【0192】

ポリオキシエチレンラウリルエーテル〔商品名：ブリッジ−３５〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0193】

なお、このポリオキシエチレンラウリルエーテルは、そのＨＬＢ値が１５．３であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が２３．０である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。
このポリオキシエチレンラウリルエーテルは、商品名ブリッジ−３５（Ｂｒｉｊ−３５）等として供給される。

【0194】

（ｃ）乳試料の前処理試薬〔トリトンＸ−１００（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔トリトンＸ−１００（２．５％）〕を調製した。

【0195】

ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル〔商品名：トリトンＸ−１００〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0196】

なお、このポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルは、ＩＮＣＩ名がＯｃｔｏｘｙｎｏｌ−９であり、そのＨＬＢ値が１３．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が１０．０である、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである。
このポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルは、商品名トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）等として供給される。

【0197】

（ｄ）乳試料の前処理試薬〔ＳＤＳ（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＳＤＳ（２．５％）〕を調製した。

【0198】

ドデシル硫酸ナトリウム〔ＳＤＳ〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0199】

なお、このドデシル硫酸ナトリウムは、そのＨＬＢ値が４０である、陰イオン性界面活性剤である。
このドデシル硫酸ナトリウムは、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、又はＳＤＳとして供給される。

【0200】

（ｅ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−１２（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−１２（２．５％）〕を調製した。

【0201】

ポリオキシエチレン（１２）２級アルキルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−１２〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0202】

なお、このポリオキシエチレン（１２）２級アルキルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５〜Ｃ_１４Ｈ_２９、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：１２〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテル（１２Ｅ．Ｏ．）と表され、医薬部外品原料規格２００６成分名としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、化粧品表示名称が（Ｃ１２−１４）ｓ−パレス−１２であり、ＩＮＣＩ名がＣ１２−１４ ＳＥＣ−ＰＡＲＥＴＨ−１２であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が８４１３３−５０−６であり、そのＨＬＢ値が１４．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が１２．０である、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0203】

このポリオキシエチレン（１２）２級アルキルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−１２〕、青木油脂工業社（日本国）〔商品名：ファインサーフ ３２０〕、又は第一工業製薬社（日本国）〔商品名：ノイゲン ＥＴ−１６５〕等より供給される。

【0204】

（ｆ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−９（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−９（２．５％）〕を調製した。

【0205】

ポリオキシエチレン（９）２級アルキルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0206】

なお、このポリオキシエチレン（９）２級アルキルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５〜Ｃ_１４Ｈ_２９、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：９〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、医薬部外品原料規格２００６成分名としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、化粧品表示名称が（Ｃ１２−１４）ｓ−パレス−９であり、ＩＮＣＩ名がＣ１２−１４ ＳＥＣ−ＰＡＲＥＴＨ−９であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が８４１３３−５０−６であり、そのＨＬＢ値が１３．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が９．０である、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0207】

このポリオキシエチレン（９）２級アルキルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９〕、青木油脂工業社（日本国）〔商品名：ファインサーフ ２９０〕、又は第一工業製薬社（日本国）〔商品名：ノイゲン ＥＴ−１３５〕等より供給される。

【0208】

（ｇ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕を調製した。

【0209】

ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0210】

なお、このポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５〜Ｃ_１４Ｈ_２９、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：７〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、医薬部外品原料規格２００６成分名としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、化粧品表示名称が（Ｃ１２−１４）ｓ−パレス−７であり、ＩＮＣＩ名がＣ１２−１４ ＳＥＣ−ＰＡＲＥＴＨ−７であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が８４１３３−５０−６であり、そのＨＬＢ値が１２．０であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が７．０である、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0211】

このポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７〕、青木油脂工業社（日本国）〔商品名：ファインサーフ ２７０〕、又は第一工業製薬社（日本国）〔商品名：ノイゲン ＥＴ−１１５〕等より供給される。

【0212】

（ｈ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（２．５％）〕を調製した。

【0213】

ポリオキシエチレン（５）２級アルキルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0214】

なお、このポリオキシエチレン（５）２級アルキルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５〜Ｃ_１４Ｈ_２９、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：５〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、医薬部外品原料規格２００６成分名としてはポリオキシエチレンアルキル（１２〜１４）エーテルと表され、化粧品表示名称が（Ｃ１２−１４）ｓ−パレス−５であり、ＩＮＣＩ名がＣ１２−１４ ＳＥＣ−ＰＡＲＥＴＨ−５であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が８４１３３−５０−６であり、そのＨＬＢ値が１０．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が５．０である、２級のポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0215】

このポリオキシエチレン（５）２級アルキルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５〕、青木油脂工業社（日本国）〔商品名：ファインサーフ ２５０〕、又は第一工業製薬社（日本国）〔商品名：ノイゲン ＥＴ−９５〕等より供給される。

【0216】

（ｉ）乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−７（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−７（２．５％）〕を調製した。

【0217】

ポリオキシエチレン（７）セチルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0218】

なお、このポリオキシエチレン（７）セチルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１６Ｈ_３３、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：７〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンセチルエーテルと表され、化粧品表示名称がセテス−７であり、ＩＮＣＩ名がＣｅｔｅｔｈ−７であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が９００４−９５−９であり、そのＨＬＢ値が１１．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が７．０である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0219】

このポリオキシエチレン（７）セチルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７〕等より供給される。

【0220】

（ｊ）乳試料の前処理試薬〔ＢＬ−４．２（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＬ−４．２（２．５％）〕を調製した。

【0221】

ポリオキシエチレン（４．２）ラウリルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0222】

なお、このポリオキシエチレン（４．２）ラウリルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１２Ｈ_２５、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：４．２〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンラウリルエーテルと表され、化粧品表示名称がラウレス−４であり、ＩＮＣＩ名がＬａｕｒｅｔｈ−４であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が５２７４−６８−０であり、そのＨＬＢ値が１１．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が４．２である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0223】

このポリオキシエチレン（４．２）ラウリルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２〕等より供給される。

【0224】

（ｋ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（２．５％）〕を調製した。

【0225】

ポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0226】

なお、このポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_９Ｈ_１９−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：５〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＮｏｎｏｘｙｎｏｌ−５であり、そのＨＬＢ値が８．０であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が５．０である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0227】

このポリオキシエチレン（５）ノニルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５〕等より供給される。

【0228】

（ｌ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（２．５％）〕を調製した。

【0229】

ポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0230】

なお、このポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_９Ｈ_１９−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：７．５〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＮｏｎｏｘｙｎｏｌ−８であり、そのＨＬＢ値が１４．０であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が７．５である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0231】

このポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５〕等より供給される。

【0232】

（ｍ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（２．５％）〕を調製した。

【0233】

ポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0234】

なお、このポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_９Ｈ_１９−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：１０〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＮｏｎｏｘｙｎｏｌ−１０であり、そのＨＬＢ値が１６．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が１０．０である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0235】

このポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０〕等より供給される。

【0236】

（ｎ）乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８〕を調製した。

【0237】

ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−８（２．５％）〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0238】

なお、このポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_８Ｈ_１７−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：８〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＯｃｔｏｘｙｎｏｌ−８であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が８．０である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0239】

このポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−８〕等より供給される。

【0240】

（ｏ）乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（２．５％）〕を調製した。

【0241】

ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0242】

なお、このポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_８Ｈ_１７−Ｃ₆Ｈ_４、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：１０〕と表され、化粧品種別許可基準収載成分名がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルであり、ＩＮＣＩ名がＯｃｔｏｘｙｎｏｌ−１０であり、そのＨＬＢ値が１６．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が１０．０である、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである。

【0243】

このポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０〕等より供給される。

【0244】

（ｐ）乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（２．５％）〕を調製した。

【0245】

ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＮＲ〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0246】

なお、このポリオキシエチレン（１０）セチルエーテルは、その構造式が「ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＨ」〔Ｒ：Ｃ_１６Ｈ_３３、ｎ（ポリオキシエチレンの平均付加モル数）：１０〕と表され、医薬部外品成分表示名称としてはポリオキシエチレンセチルエーテルと表され、化粧品表示名称がセテス−１０であり、ＩＮＣＩ名がＣｅｔｅｔｈ−１０であり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が９００４−９５−９であり、そのＨＬＢ値が１３．５であり、そのポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン）の平均付加モル数が１０．０である、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである。

【0247】

このポリオキシエチレン（１０）セチルエーテルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＮＲ〕等より供給される。

【0248】

（ｑ）乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（２．５％）〕
下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して、乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（２．５％）〕を調製した。

【0249】

モノラウリン酸ポリグリセリル〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ〕 ２．５％（ｗ／ｖ）

【0250】

なお、このモノラウリン酸ポリグリセリルは、医薬部外品成分表示名称としてはモノラウリン酸ポリグリセリルと表され、化粧品表示名称がラウリン酸ポリグリセリル−１０であり、ＩＮＣＩ名がＰｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−１０ Ｌａｕｒａｔｅであり、ケミカルアブストラクト（ＣＡＳ）の登録番号（ＲＮ）が３４４０６−６６−１であり、そのＨＬＢ値が１５．５である、ポリグリセリン脂肪酸エステルである。

【0251】

このモノラウリン酸ポリグリセリルは、日光ケミカルズ社（日本国）〔商品名：ＮＩＫＫＯＬ Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ〕等より供給される。

【0252】

（２）亜鉛測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第１試薬を調製した。

【0253】

ビス−トリスプロパン ３０ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １％（ｗ／ｖ）

【0254】

（３）亜鉛測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第２試薬を調製した。

【0255】

２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム 〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕 ＜キレート発色剤＞ ０．１３ｍＭ

【0256】

２．標準液及び精製水
（１）標準液
１ｇ／Ｌの亜鉛標準液を、０．０１Ｎ塩酸で亜鉛濃度が２００μｇ／ｄＬになるように希釈したものを標準液とした。

【0257】

（２）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。

【0258】

３．乳試料
ヒトの乳（ヒト母乳）を乳試料として用いた。

【0259】

４．乳試料中の亜鉛の比色測定
前記３の乳試料について、前記１で調製した、１７種類の乳試料の前処理試薬のそれぞれ、亜鉛測定用第１試薬及び亜鉛測定用第２試薬にて比色測定した。

【0260】

（１）乳試料の前処理
前記１の（１）の（ａ）〜（ｑ）で調製した乳試料の前処理試薬のそれぞれについて、その２００μＬを前記３の乳試料の５０μＬと混合し、乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液（計１７種類）を調製した。
これにより、乳試料と、乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質を接触させ、乳試料の前処理を行った。
なお、この乳試料の前処理により、当該乳試料は、５倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0261】

（２）亜鉛測定用第１試薬及び亜鉛測定用第２試薬の順次混合
前記（１）の乳試料と乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質の接触に続き、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を用い、前記（１）の１７種類の乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液のそれぞれについて、当該混合液の１０μＬに前記１の（２）で調製した亜鉛測定用第１試薬１５０μＬを添加し混和した後３７℃で５分間反応させ、この後、前記１の（３）で調製した亜鉛測定用第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。

【0262】

そして、亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）及び亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、この亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）から亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）を差し引いて吸光度差を求めた。

【0263】

次に、この前記３の乳試料について求めた吸光度差の値から、前記２の（２）の精製水について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値〔試薬盲検（試薬ブランク）〕を差し引いて、吸光度差を求めた。

【0264】

次に、この前記３の乳試料について求めた吸光度差の値と、亜鉛の濃度が分かっている前記２の（１）の標準液について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値とを、それぞれ比較することにより、前記３の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0265】

５．測定結果
前記４における乳試料の前処理に用いたそれぞれの乳試料の前処理試薬の効果を確認するため、前記４の（２）において測定した亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長５４６ｎｍにおける吸光度）の各々を表２に示した。

【0266】

なお、この表において、前記４における乳試料の前処理に用いたそれぞれの乳試料の前処理試薬毎に、左側より、前記４の（２）において測定した亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長５４６ｎｍにおける吸光度）、この吸光度を「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いたときの吸光度で除したときの百分率、用いた界面活性物質のＨＬＢ値、及び、用いた界面活性物質がポリオキシアルキレン化合物（ポリオキシエチレン化合物等）である場合のポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレン等）の平均付加モル数を順次示した。（なお、該当しない場合は、「＊＊＊」と示した。）

【0267】

【表2】

【0268】

この表から分かるように、「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕」を用いた場合の吸光度の値は、対照である「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いた場合の吸光度の値の３７％となっており、顕著に低減していることが分かる。

【0269】

また、この表より、「乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（２．５％）〕」を用いた場合の吸光度の値は、対照である「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いた場合の吸光度の値の７４％となっており、大きく低減していることが分かる。

【0270】

これに対して、この表より、対照である「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いたときの吸光度と比較して、他の乳試料の前処理試薬を用いた場合の吸光度は、大差ないか又は逆に増加してしまっていることが分かる。

【0271】

これらのことより、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルであって、そのＨＬＢ値が１２〜１４であり、そのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が７．０〜７．５である界面活性物質を、乳試料の前処理試薬に含有させ、乳試料の前処理を行った場合、すなわち、乳試料と前記の界面活性物質を接触させる場合には、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制することができることが確かめられた。

【0272】

〔実施例２〕（本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果の確認−２）
本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果を再度確かめた。

【0273】

１．乳試料の前処理試薬
（ａ）乳試料の前処理試薬〔精製水〕
前記の実施例１の１の（１）の（ａ）の乳試料の前処理試薬〔精製水〕を用いた。

【0274】

（ｂ）乳試料の前処理試薬〔ブリッジ−３５（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｂ）の乳試料の前処理試薬〔ブリッジ−３５（２．５％）〕を用いた。

【0275】

（ｃ）乳試料の前処理試薬〔トリトンＸ−１００（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｃ）の乳試料の前処理試薬〔トリトンＸ−１００（２．５％）〕を用いた。

【0276】

（ｄ）乳試料の前処理試薬〔ＳＤＳ（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｄ）の乳試料の前処理試薬〔ＳＤＳ（２．５％）〕を用いた。

【0277】

（ｅ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−１２（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｅ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−１２（２．５％）〕を用いた。

【0278】

（ｆ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−９（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｆ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−９（２．５％）〕を用いた。

【0279】

（ｇ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕を用いた。

【0280】

（ｈ）乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−７（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｉ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−７（２．５％）〕を用いた。

【0281】

（ｉ）乳試料の前処理試薬〔ＢＬ−４．２（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｊ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＬ−４．２（２．５％）〕を用いた。

【0282】

（ｊ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕を調製した。

【0283】

（ｋ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｋ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（５％）〕を調製した。

【0284】

（ｌ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｌ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕を調製した。

【0285】

（ｍ）乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｐ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（５％）〕を調製した。

【0286】

（ｎ）乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｍ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（５％）〕を調製した。

【0287】

（ｏ）乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｑ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（５％）〕を調製した。

【0288】

（ｐ）乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｏ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（５％）〕を調製した。

【0289】

（ｑ）乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｎ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（５％）〕を調製した。

【0290】

（ｒ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．３１２５％）〕
その濃度を０．３１２５％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．３１２５％）〕を調製した。

【0291】

（ｓ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．６２５％）〕
その濃度を０．６２５％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．６２５％）〕を調製した。

【0292】

（ｔ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１．２５％）〕
その濃度を１．２５％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１．２５％）〕を調製した。

【0293】

（ｕ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（２．５％）〕
その濃度を２．５％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（２．５％）〕を調製した。

【0294】

（ｖ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（５％）〕を調製した。

【0295】

（ｗ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１０％）〕
その濃度を１０．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｈ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１０％）〕を調製した。

【0296】

２．試料
（１） 精製水 〔対照として精製水を用いた〕
（２） 乳試料ｌ 〔ヒトの乳（ヒト母乳）〕
（３） 乳試料ｍ〔人工乳である明治社（日本国）の粉ミルク「明治ほほえみ」をメーカー指定の方法により溶解し調製した場合の１／２の濃度になるように調製したもの〕
（４） 乳試料ｎ〔人工乳である明治社（日本国）の粉ミルク「明治ほほえみ」をメーカー指定の方法により溶解し調製したもの〕

【0297】

３．乳試料の前処理
前記２の試料について、前記１で調製した２３種類の乳試料の前処理試薬のそれぞれにより前処理を行った。

【0298】

（１）乳試料の前処理
前記１の（ａ）〜（ｗ）で調製した乳試料の前処理試薬のそれぞれについて、その２００μＬを前記２の試料の５０μＬとマイクロチューブの中で混合し、乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液を調製した。
これにより、乳試料等と、乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質を接触させ、乳試料等の前処理を行った。
なお、この乳試料等の前処理により、当該乳試料等は、５倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0299】

（２）混合液の色調等の観察
前記（１）において調製した、乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を目視にて観察し、またこれを写真にて記録した。

【0300】

４．結果
前記３における乳試料等の前処理に用いたそれぞれの乳試料の前処理試薬の効果を確認するため、乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調等を観察した結果の写真を図１〜図６に示した。

【0301】

なお、図１において、付した番号が「１」のものは前記２の（２）の乳試料ｌそのものを対照として置いたものであり、「２」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔Ｂｒｉｊ−３５（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔トリトンＸ−１００（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＳＤＳ（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−１２（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−９（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「８」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「９」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−７（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「１０」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＬ−４．２（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、そして、「１１」は前記の乳試料ｌと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0302】

また、図２において、付した番号が「１」のものは前記２の（１）の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「２」は前記２の（３）の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記２の（４）の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「８」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「９」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１０」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１１」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１２」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0303】

また、図３において、付した番号が「１」のものは前記２の（１）の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「２」は前記２の（３）の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記２の（４）の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（５％）〕の組み合わせによるものであり、「８」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（５％）〕の組み合わせによるものであり、「９」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＣ−１０ＮＲ（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0304】

また、図４において、付した番号が「１」のものは前記２の（１）の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「２」は前記２の（３）の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記２の（４）の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「８」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「９」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１０」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１１」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１２」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔Ｄｅｃａｇｌｙｎ １−ＬＶ ＥＸ（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0305】

また、図５において、付した番号が「１」のものは前記２の（１）の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「２」は前記２の（３）の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記２の（４）の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「８」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「９」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−１０（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１０」は前記の精製水と前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１１」は前記の乳試料ｍと前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（５％）〕の組み合わせによるものであり、「１２」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＯＰ−８（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0306】

また、図６において、付した番号が「１」のものは前記２の（４）の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕の組み合わせによるものであり、「２」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．３１２５％）〕の組み合わせによるものであり、「３」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（０．６２５％）〕の組み合わせによるものであり、「４」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１．２５％）〕の組み合わせによるものであり、「５」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（２．５％）〕の組み合わせによるものであり、「６」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（５％）〕の組み合わせによるものであり、「７」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−５（１０％）〕の組み合わせによるものであり、そして、「８」は前記の乳試料ｎと前記の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の組み合わせによるものである。

【0307】

これらの図から分かるように、対照である「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いたときに比べて、乳試料の前処理試薬として、「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕」、「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕」及び「乳試料の前処理試薬〔ＮＰ−７．５（５％）〕」をそれぞれ用いた場合は、乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調が澄明になっていることが分かる。

【0308】

これに対して、これらの図より、他の乳試料の前処理試薬を用いた場合は、乳試料等と乳試料の前処理試薬の混合液の色調において、対照である「乳試料の前処理試薬（精製水）」を用いたときに比べて、その混濁度が大差ないか又は逆に増加してしまっていることが分かる。

【0309】

これらのことより、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル又はポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルであって、そのＨＬＢ値が１２〜１４であり、そのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が７．０〜７．５である界面活性物質を、乳試料の前処理試薬に含有させ、乳試料の前処理を行った場合、すなわち、乳試料と前記の界面活性物質を接触させる場合には、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制することができることが、この検討においても確かめられた。

【0310】

〔実施例３〕（本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果の確認−３）
本発明の乳試料の前処理方法及び前処理試薬等の効果を更に確かめた。

【0311】

１．試薬の調製
（１）乳試料の前処理試薬
（ａ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（０％）〕
乳試料の前処理試薬の効果を確認するための対照として、精製水を用いた。
この精製水を、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（０％）〕とした。
なお、この乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（０％）〕は、前記の乳試料の前処理試薬〔精製水〕と同一内容のものである。

【0312】

（ｂ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕
前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕を用いた。

【0313】

（ｃ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕を調製した。

【0314】

（ｄ）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（１０％）〕
その濃度を１０．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（１０％）〕を調製した。

【0315】

（２）亜鉛測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第１試薬を調製した。

【0316】

ビス−トリスプロパン ３０ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １％（ｗ／ｖ）

【0317】

（３）亜鉛測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第２試薬を調製した。

【0318】

２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム 〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕 ＜キレート発色剤＞ ０．１３ｍＭ

【0319】

２．標準液及び精製水
（１）標準液
１ｇ／Ｌの亜鉛標準液を、０．０１Ｎ塩酸で亜鉛濃度が２００μｇ／ｄＬになるように希釈したものを標準液とした。

【0320】

（２）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。

【0321】

３．乳試料
ヒトの乳（ヒト母乳）を乳試料として用いた。

【0322】

４．乳試料中の亜鉛の比色測定
前記３の乳試料について、前記１で調製した、４種類の乳試料の前処理試薬のそれぞれ、亜鉛測定用第１試薬、及び亜鉛測定用第２試薬にて比色測定した。

【0323】

（１）乳試料の前処理
前記１の（１）の（ａ）〜（ｄ）で調製した乳試料の前処理試薬のそれぞれについて、その５０μＬを前記３の乳試料の５０μＬと混合し、乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液（計４種類）を調製した。
これにより、乳試料と、乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質を接触させ、乳試料の前処理を行った。
なお、この乳試料の前処理により、当該乳試料は、２倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0324】

（２）亜鉛測定用第１試薬及び亜鉛測定用第２試薬の順次混合
前記（１）の乳試料と乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質の接触に続き、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を用い、前記（１）の１７種類の乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液のそれぞれについて、当該混合液の１０μＬに前記１の（２）で調製した亜鉛測定用第１試薬１５０μＬを添加し混和した後３７℃で５分間反応させ、この後、前記１の（３）で調製した亜鉛測定用第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。

【0325】

そして、亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）及び亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、この亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）から亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）を差し引いて吸光度差を求めた。

【0326】

次に、この前記３の乳試料について求めた吸光度差の値から、前記２の（２）の精製水について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値〔試薬盲検（試薬ブランク）〕を差し引いて、吸光度差を求めた。

【0327】

次に、この前記３の乳試料について求めた吸光度差の値と、亜鉛の濃度が分かっている前記２の（１）の標準液について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値とを、それぞれ比較することにより、前記３の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0328】

（３） また、前記（１）において前記１の（１）の（ａ）〜（ｄ）で調製した乳試料の前処理試薬のそれぞれについて、その１００μＬを前記３の乳試料の５０μＬと混合し、乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液（計４種類）を調製すること以外は、前記（１）〜（２）の記載の通りに操作を行い、前記３の乳試料中の亜鉛の濃度の測定を行った。
なお、この場合、当該混合液の調製により、前記の乳試料は、３倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0329】

（４） 更に、前記（１）において前記１の（１）の（ａ）〜（ｄ）で調製した乳試料の前処理試薬のそれぞれについて、その２００μＬを前記３の乳試料の５０μＬと混合し、乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液（計４種類）を調製すること以外は、前記（１）〜（２）の記載の通りに操作を行い、前記３の乳試料中の亜鉛の濃度の測定を行った。
なお、この場合、当該混合液の調製により、前記の乳試料は、５倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0330】

５．測定結果
前記４における乳試料の前処理試薬による乳試料の前処理の効果を確認するため、前記４において測定した亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長５４６ｎｍにおける吸光度）を図７に示した。

【0331】

なお、この図において、横軸は、乳試料と乳試料の前処理試薬を混合して混合液を調製した際に希釈された乳試料の希釈倍率を示す。

【0332】

また、この図において、縦軸は、前記４において測定した亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長５４６ｎｍにおける吸光度）を示す。

【0333】

そして、この図において、「◆」は乳試料の前処理試薬として乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（０％）〕を用いた場合の吸光度の値を、「□」は乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕を用いた場合の吸光度の値を、「△」は乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕を用いた場合の吸光度の値を、そして、「×」は乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（１０％）〕を用いた場合の吸光度の値を示す。

【0334】

この図から分かるように、対照である「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（０％）〕」を用いた場合の吸光度に対して、「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（２．５％）〕」を用いた場合の吸光度の値は、低減していることが分かる。
これは、用いる乳試料の前処理試薬が「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕」、そして「乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（１０％）〕」となるに従い顕著である。

【0335】

また、この図より、前記の乳試料の希釈倍率が、２倍、３倍、そして５倍となるに従い、吸光度の値の低減度が顕著であることが分かる。

【0336】

これらのことより、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルであって、そのＨＬＢ値が１２〜１４であり、そのポリオキシアルキレンの平均付加モル数が７．０〜７．５である界面活性物質を、乳試料の前処理試薬に含有させ、乳試料の前処理を行った場合、すなわち、乳試料と前記の界面活性物質を接触させる場合には、乳試料に由来する比色測定への影響を抑制することができることが再度確かめられた。

【0337】

〔実施例４〕（本発明の乳試料中の測定対象物質の測定方法とＩＣＰ発光分析法との相関）
ＩＣＰ発光分析法との相関により、本発明の乳試料中の測定対象物質の測定方法の正確性を確かめた。

【0338】

１．試薬の調製
（１）乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕
その濃度を５．０％（ｗ／ｖ）になるように純水に溶解すること以外は、前記の実施例１の１の（１）の（ｇ）の記載の通りに行い、乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕を調製した。

【0339】

（２）亜鉛測定用第１試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第１試薬を調製した。

【0340】

ビス−トリスプロパン ３０ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １％（ｗ／ｖ）

【0341】

（３）亜鉛測定用第２試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、亜鉛測定用第２試薬を調製した。

【0342】

２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フェノールナトリウム 〔５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ〕 ＜キレート発色剤＞ ０．１３ｍＭ

【0343】

２．標準液及び精製水
（１）標準液
１ｇ／Ｌの亜鉛標準液を、０．０１Ｎ塩酸で亜鉛濃度が２００μｇ／ｄＬになるように希釈したものを標準液とした。

【0344】

（２）精製水
試薬盲検（試薬ブランク）を測定するため、対照として精製水を用いた。

【0345】

３．乳試料
２４種類のヒトの乳（ヒト母乳）をそれぞれ乳試料として用いた。

【0346】

４．乳試料中の亜鉛の比色測定
前記３の乳試料について、前記１で調製した、乳試料の前処理試〔ＢＴ−７（５％）〕、亜鉛測定用第１試薬、及び亜鉛測定用第２試薬にて比色測定した。

【0347】

（１）乳試料の前処理
前記３の２４種類の乳試料のそれぞれについて、その５０μＬを、前記１の（１）の乳試料の前処理試薬〔ＢＴ−７（５％）〕の２００μＬと混合し、乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液（計２４種類）を調製した。
これにより、乳試料と、乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質を接触させ、乳試料の前処理を行った。
なお、この乳試料の前処理により、当該乳試料は、５倍の希釈倍率で希釈されたことになる。

【0348】

（２）亜鉛測定用第１試薬及び亜鉛測定用第２試薬の順次混合
前記（１）の乳試料と乳試料の前処理試薬に含まれていた界面活性物質の接触に続き、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１８０形自動分析装置を用い、前記（１）の２４種類の乳試料と乳試料の前処理試薬の混合液のそれぞれについて、当該混合液の１０μＬに前記１の（２）で調製した亜鉛測定用第１試薬１５０μＬを添加し混和した後３７℃で５分間反応させ、この後、前記１の（３）で調製した亜鉛測定用第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。

【0349】

そして、亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）及び亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の主波長５４６ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定し、この亜鉛測定用第２試薬の添加後５分８秒目（３４ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）から亜鉛測定用第１試薬の添加後４分３０秒目（１６ポイント目）の吸光度（主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いたもの）を差し引いて吸光度差を求めた。

【0350】

次に、この前記３の２４種類の乳試料について求めた吸光度差の値から、前記２の（２）の精製水について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値〔試薬盲検（試薬ブランク）〕を差し引いて、吸光度差を求めた。

【0351】

次に、この前記３の２４種類の乳試料について求めた吸光度差の値と、亜鉛の濃度が分かっている前記２の（１）の標準液について前記の通り測定を行って求めた吸光度差の値とを、それぞれ比較することにより、前記３の２４種類の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0352】

５．ＩＣＰ発光分析法による乳試料中の亜鉛の測定
前記３の２４種類の乳試料中の亜鉛の濃度を、ＩＣＰ発光分析法にて測定した。

【0353】

この乳試料中の亜鉛の濃度の測定は、前記３の２４種類の乳試料のそれぞれについて、この乳試料の６０μＬに、１ｐｐｍのイットリウムを含む０．１Ｍ塩酸水溶液の３．００ｍＬを添加し混和し混合液を調製した。
なお、この混合液の調製により、当該乳試料は、５１倍の希釈倍率で希釈されたことになる。
次に、前記の混合液の３．０６ｍＬについて、イットリウムを内部標準物質として、島津製作所（日本国）のＩＣＰＳ−８１００型ＩＣＰ発光分析装置により測定を行なった。

【0354】

また、亜鉛の濃度が分かっている前記２の（１）の標準液について、前記の通り測定を行い、この標準液について求めた値と、前記３の２４種類の乳試料について求めた値とをそれぞれ比較することにより、前記３の２４種類の乳試料中の亜鉛の濃度を算出した。

【0355】

６．測定結果
前記４における本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法による測定結果（測定値）と前記５におけるＩＣＰ発光分析法による測定結果（測定値）の相関のグラフを図８に示した。

【0356】

なお、この図において、横軸は、前記５におけるＩＣＰ発光分析法による乳試料中の亜鉛の測定値（単位：μｇ／ｄＬ）を示す。

【0357】

また、この図において、縦軸は、前記４における本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法による乳試料中の亜鉛の測定値（単位：μｇ／ｄＬ）を示す。

【0358】

なお、この相関の回帰式は、本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法による測定値をｙ、ＩＣＰ発光分析法による測定値をｘとした場合、ｙ＝１．００ｘ−０．３で示される。
また、この相関の相関係数であるが、ｒ＝０．９９９である。

【0359】

これらのことから、乳試料中の亜鉛の測定において、本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法とＩＣＰ発光分析法とは、相関の回帰式及び相関係数とも非常に良好なものであることが分かる。

【0360】

ところで、ＩＣＰ発光分析法は、乳試料に由来する影響を受けることなく、乳試料においても正確な測定結果（測定値）を得ることができるものである。

【0361】

従って、前記の相関の結果より、本発明の乳試料中の亜鉛の比色測定方法は、乳試料に由来する影響を受けることなく、乳試料においても正確な測定結果（測定値）を得ることができるものであることが確かめられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】