特許 6187777 Ｇ−ＣＳＦＲに対する抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6187777

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】Ｇ−ＣＳＦＲに対する抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20170821BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20170821BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170821BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20170821BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   A61P37/06

   A61P29/00

   A61P35/00

   A61P19/02

   A61P25/00

   A61P11/00

   !C12N15/00 A

   !C12P21/08

【請求項の数】10

【全頁数】60

(21)【出願番号】特願2014-515000(P2014-515000)

(86)(22)【出願日】2012年6月13日

(65)【公表番号】特表2014-519517(P2014-519517A)

(43)【公表日】2014年8月14日

(86)【国際出願番号】AU2012000675

(87)【国際公開番号】WO2012171057

(87)【国際公開日】20121220

【審査請求日】2015年6月3日

(31)【優先権主張番号】61/496,351

(32)【優先日】2011年6月13日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500021413

【氏名又は名称】シーエスエル、リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100165526

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛

(72)【発明者】

【氏名】ナッシュ， アンドリュー， ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュース， アルナ エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】バカ， マニュエル

(72)【発明者】

【氏名】エドワーズ， カーステン メイ

(72)【発明者】

【氏名】ハーディー， マシュー フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】パノウシス， コン

(72)【発明者】

【氏名】ダンロップ， フェリシティ メレディス

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第９５／０２１８６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０３２２０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Growth Factors, 1997, vol.14, no.2-3, p.117-130

【文献】 J Biol Chem, 1997, vol.272, no.47, p.29735-29741

【文献】 Frontiers Bioscience, 2006, vol.11, p.3181-3189

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容体（ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合して顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のシグナル伝達を中和する抗体であって、
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｉｉ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｘ）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘ）配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉ）配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、あるいは
（ｘｘｘｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ
を含む抗体。

【請求項2】

ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容体（ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合して顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のシグナル伝達を中和する抗体であって、
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）
を含む抗体。

【請求項3】

ヒト顆粒球コロニー刺激因子受容体（ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合して顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のシグナル伝達を中和する抗体であって、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）
を含む抗体。

【請求項4】

（ｉ）配列番号６４もしくは６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖、あるいは
（ｉｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖および配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖、ならびに配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む抗体。

【請求項5】

（１）請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含むか、あるいは
（２）（ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体、あるいは
（ｉｉ）（ａ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体、および
（ｂ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、を含む抗体
を含み、薬学的に許容される担体を任意選択で含む、
組成物。

【請求項6】

対象において顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）によって媒介される状態を治療または予防するための医薬であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または請求項５に記載の組成物を含む医薬。

【請求項7】

前記Ｇ−ＣＳＦによって媒介される状態は自己免疫性疾患、炎症性疾患または癌である、請求項６に記載の医薬。

【請求項8】

前記自己免疫性疾患または前記炎症性疾患は関節炎、多発性硬化症、肺炎症または慢性閉塞性肺疾患である、請求項７に記載の医薬。

【請求項9】

好中球減少症を誘発することなく対象において好中球の数を減少させるのに十分な量の前記抗体を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項10】

前記抗体の前記量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである、請求項９に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

本出願は、２０１１年６月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／４９６，３５１号、表題「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｇ−ＣＳＦＲ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」からの優先権を主張するものであり、参照により、その内容全体が本発明に組み込まれる。

【配列表の組込み】

【0002】

本出願は、電子形態の「配列表」とともに出願される。参照により、「配列表」の内容全体が本発明に組み込まれる。

【技術分野】

【0003】

本開示は、顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）受容体に結合する抗体と、例えば治療における、その使用と、に関する。

【背景技術】

【0004】

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、顆粒球産生の主要な調節因子である。Ｇ−ＣＳＦは、骨髄間質細胞、内皮細胞、マクロファージ、および線維芽細胞によって産生され、炎症刺激によって産生が誘導される。Ｇ−ＣＳＦは、初期骨髄前駆細胞、成熟好中球、単球／マクロファージ、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、ならびに内皮細胞に発現されるＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）を介して作用する。Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦＲを欠損するマウスは、著しい好中球減少を示すことから、定常状態の顆粒球生成におけるＧ−ＣＳＦの重要性が実証されている。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦは、緊急時の（例えば、感染に反応した）顆粒球生成には不要であると考えられる。Ｇ−ＣＳＦは、好中球の産生および放出を増加させ、造血幹細胞および前駆細胞を動員し、成熟好中球の分化、寿命、およびエフェクター機能を調整する。Ｇ−ＣＳＦはまた、単球／マクロファージの数の拡大、作用機能の亢進、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカイン産生の制御を含む、マクロファージへの効果を発揮し得る。Ｇ−ＣＳＦはまた、内皮前駆細胞を動員し、血管新生を誘導または促進することも示されている。

【0005】

Ｇ−ＣＳＦは、治療的に、例えば、好中球減少症を治療するためおよび／または造血幹細胞を動員するために使用される一方で、ある状態、例えば、炎症性状態および／または癌においては負の作用も有する。例えば、Ｇ−ＣＳＦの投与は、ラットにおいて関節リウマチ（ＲＡ）、マウスコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）、およびＣＩＡの受身伝達モデルを悪化させる。Ｇ−ＣＳＦは、ＲＡ患者の血清および関節液中に発見されている。さらに、ＲＡに罹患する患者において高いレベルで発見されるインターロイキン（ＩＬ）−１および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、ヒト滑膜線維芽細胞および軟骨細胞によるＧ−ＣＳＦの産生を誘導する。Ｇ−ＣＳＦを欠損するマウスは、急性および慢性の炎症性関節炎の誘発に抵抗性を示す。

【0006】

Ｇ−ＣＳＦはまた、多発性硬化症（ＭＳ）に関与することが示されている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、ＭＳの症状を悪化させることが分かっているインターフェロンγおよびＴＮＦαと同じくらい効果的に、ＭＳの自己反応性Ｔ細胞株モデルの細胞外マトリックスへの接着を高める。また、Ｇ−ＣＳＦ欠損マウスは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症に抵抗性を示す。

【0007】

Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦＲは癌にも関係しており、研究により、このシグナル伝達経路が、種々の癌の化学療法耐性、増殖、生存、侵襲性、および転移に寄与することが示されている。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、固形腫瘍の発生における重要なプロセスである血管新生を誘導することが示されている。

【0008】

上記から、当業者には、Ｇ−ＣＳＦＲを介したＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を減少させる試薬の必要性が当該技術分野に存在することは明白であろう。例示的な薬剤は、例えば、Ｇ−ＣＳＦによって媒介される状態を治療または予防するための治療薬としての使用に好適である。

【発明の概要】

【0009】

本発明者は、ヒトＧ−ＣＳＦＲ（ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合し、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を強力に中和する、例えば、ＣＤ３４^＋骨髄細胞からの顆粒球形成を予防する、および／またはＧ−ＣＳＦに応答した細胞増殖を予防する、および／またはＧ−ＣＳＦの投与によって誘導される好中球増加を低減もしくは予防する、抗体結合部位（例えば、Ｆａｂおよび抗体）を含むあるクラスのタンパク質を生成した。本発明者によって同定されたクラスのタンパク質はまた、カニクイザルＧ−ＣＳＦＲ（ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ）と交差反応するため、該タンパク質を用いた前臨床試験を容易にする。本発明者によって同定されたクラスのタンパク質は、高い親和性でｈＧ−ＣＳＦＲに結合する。本発明者によって同定されたクラスのタンパク質は、様々な状態の治療に好適なヒト抗体である。

【0010】

本開示は、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、抗原結合部位は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和し、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの存在下で増殖させたＣＤ３４^＋骨髄細胞からのコロニー形成単位−顆粒球（ＣＦＵ−Ｇ）の増殖を少なくとも約０．２ｎＭのＩＣ_５０で阻害する、タンパク質を提供する。例えば、ＩＣ_５０は０．１ｎＭ以下、例えば、０．０９ｎＭ以下、または０．０８ｎＭ以下、または０．０７ｎＭ以下、または０．０６ｎＭ以下、または０．０５ｎＭ以下である。一例において、ＩＣ_５０は０．０４ｎＭ以下である。別の例において、ＩＣ_５０は０．０２ｎＭ以下である。そのようなアッセイにおいてタンパク質のＩＣ_５０を評価するための方法を本明細書に記載する。例えば、ＩＣ_５０は、１０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦの存在下で決定される。

【0011】

一例において、ＩＣ_５０は、１０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子および１０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦの存在下でＣＤ３４^＋骨髄細胞を培養することにより決定される。例えば、細胞は、半固体細胞培養培地で増殖される。一例において、ＣＦＵ−Ｇは、１４日の培養後に数えられる。

【0012】

本開示は、付加的または代替的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、抗原結合部位は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＧ−ＣＳＦＲに同様の親和性で結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する、タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、非ヒト哺乳動物における前臨床試験を容易にするため、有利である。

【0013】

一例において、タンパク質の親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサを使用して決定される。例えば、リガンド結合領域または可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲまたは可溶性ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲまたはｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃまたはｃｙｎｏ−Ｇ−ＣＳＦＲ−Ｆｃが固定化され、本開示のタンパク質の親和性が決定される。

【0014】

本開示は、付加的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、抗原結合部位は、Ｃ１．２（配列番号２に記載の配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および配列番号３に記載の配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む）またはＣ１．２Ｇ（配列番号４に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）によって結合されるものと同じｈＧ−ＣＳＦＲのエピトープに特異的に結合する、タンパク質を提供する。

【0015】

本開示は、付加的または代替的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、（ｉ）タンパク質は、Ｃ１．２（配列番号２に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）またはＣ１．２Ｇ（配列番号４に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）のｈＧ−ＣＳＦＲへの結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和し、（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１の２８７位のアルギニン、
（ｂ）配列番号１の２３７位のヒスチジン、
（ｃ）配列番号１の１９８位のメチオニン、
（ｄ）配列番号１の１７２位のチロシン、
（ｅ）配列番号１の１７１位のロイシン、または
（ｆ）配列番号１の１１１位のロイシン
のうちのいずれか１つがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルは、配列番号１のポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルよりも低い、タンパク質を提供する。

【0016】

本開示は、付加的または代替的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、（ｉ）タンパク質は、Ｃ１．２（配列番号２に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）またはＣ１．２Ｇ（配列番号４に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）のｈＧ−ＣＳＦＲへの結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和し、（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１の２８７位のアルギニン、
（ｂ）配列番号１の２３７位のヒスチジン、
（ｃ）配列番号１の１９８位のメチオニン、
（ｄ）配列番号１の１７２位のチロシン、
（ｅ）配列番号１の１７１位のロイシン、または
（ｆ）配列番号１の１１１位のロイシン
のうちのいずれか１つがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに結合する能力と比較して優先的に配列番号１のポリペプチドに結合する、タンパク質を提供する。

【0017】

本開示は、付加的または代替的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、（ｉ）タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合し、（ｉｉ）タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和し、（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１の２８７位のアルギニン、
（ｂ）配列番号１の２３７位のヒスチジン、
（ｃ）配列番号１の１９８位のメチオニン、
（ｄ）配列番号１の１７２位のチロシン、
（ｅ）配列番号１の１７１位のロイシン、または
（ｆ）配列番号１の１１１位のロイシン
のうちのいずれか１つがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルは、配列番号１のポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルよりも低い、タンパク質を提供する。

【0018】

本開示は、付加的または代替的に、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質であって、（ｉ）タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合し、（ｉｉ）タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和し、（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１の２８７位のアルギニン、
（ｂ）配列番号１の２３７位のヒスチジン、
（ｃ）配列番号１の１９８位のメチオニン、
（ｄ）配列番号１の１７２位のチロシン、
（ｅ）配列番号１の１７１位のロイシン、または
（ｆ）配列番号１の１１１位のロイシン
のうちのいずれか１つがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに結合する能力と比較して優先的に配列番号１のポリペプチドに結合する、タンパク質を提供する。

【0019】

一例において、アラニン置換を含むポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルは、配列番号１のポリペプチドへのタンパク質の結合と比較して、少なくとも約１０倍、または２０倍、または５０倍、または１００倍、または１５０倍、または２００倍減少する。好ましくは、アラニン置換を含むポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルは、少なくとも約５０倍減少する。好ましくは、アラニン置換を含むポリペプチドへのタンパク質の結合のレベルは、少なくとも約６０倍減少する。

【0020】

一例において、タンパク質の抗原結合部位は、配列番号１の２８７位のアルギニンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに検出可能に結合しない。

【0021】

一例において、結合のレベルは、例えば、表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサを使用して評価される。例えば、タンパク質が固定化され、配列番号１のポリペプチドまたはアラニン置換を含むポリペプチドの形態への結合のレベルが決定される。

【0022】

本開示のタンパク質によって結合される、または有意に結合されない、または検出可能に結合されない他の置換を含むまたは含まない、配列番号１のアミノ酸を含むポリペプチドの付加的形態が本明細書に記載され、それらは、必要があれば変更を加えて、本開示の本発明の実施例に適用されると解釈されたい。

【0023】

一例において、抗原結合部位は、
（ｉ）配列番号１の１６７位のリジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチド、および／または
（ｉｉ）配列番号１の１６８位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチド
と交差反応する。

【0024】

一例において、抗原結合部位は、付加的に、配列番号１の１６９位のロイシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドと交差反応する。

【0025】

一例において、タンパク質は、Ｃ１．２（配列番号２に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）またはＣ１．２Ｇ（配列番号４に記載の配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載の配列を含むＶ_Ｌを含む）の、
（ｉ）配列番号１の１６７位のリジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチド、および／または
（ｉｉ）配列番号１の１６８位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチド
のうちの１つ以上への結合を競合的に阻害する。

【0026】

一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質は、配列番号１の１１１〜１１５、１７０〜１７６、２１８〜２３４、および／または２８６〜３００から選択される、１つ、または２つ、または３つ、または４つの領域内の残基を含むエピトープに結合する。

【0027】

一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質が配列番号１のポリペプチドに結合してから、タンパク質分解酵素を用いて切断すると、タンパク質は、配列番号１のアミノ酸１１１〜１１５、または配列番号１のアミノ酸１７０〜１７６、または配列番号１のアミノ酸２１８〜２３４、または配列番号１のアミノ酸２８６〜３００を含む、またはそれらから構成される、１つ、または２つ、または３つ、または４つのペプチドに結合した状態に留まる。

【0028】

一例において、タンパク質は、立体構造エピトープに結合する。

【0029】

本開示は、付加的または代替的に、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和するタンパク質であって、
（ｉ）配列番号６に記載の配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７に記載の配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８に記載の配列と少なくとも約５５％の同一性の配列を含むＣＤＲ３を含むＶ_Ｈ、
（ｉｉ）配列番号２および／または４に記載の配列と少なくとも約８０％、例えば、８５％、または９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％同一の配列を含むＶ_Ｈ、
（ｉｉｉ）配列番号９に記載の配列を含むＣＤＲ１、配列番号１０に記載の配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１１に記載の配列と少なくとも約３３％の同一性の配列を含むＣＤＲ３を含むＶ_Ｌ、ならびに
（ｉｖ）配列番号３および／または５に記載の配列と少なくとも約８０％、例えば、８５％、または９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％同一の配列を含むＶ_Ｌ
のうちの少なくとも１つを含むタンパク質を提供する。

【0030】

そのようなタンパク質は、例えば、
（ａ）配列番号１の２８７位のアルギニン、
（ｂ）配列番号１の２３７位のヒスチジン、
（ｃ）配列番号１の１９８位のメチオニン、
（ｄ）配列番号１の１７２位のチロシン、
（ｅ）配列番号１の１７１位のロイシン、または
（ｆ）配列番号１の１１１位のロイシン
のうちのいずれか１つがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチド結合のレベルと比較して優先的な配列番号１のポリペプチドへの結合等の、本明細書に記載される機能活性のうちのいずれか１つ以上を含むことができる。

【0031】

一例において、（ｉｉ）のパーセント同一性は、少なくとも約９５％である。

【0032】

一例において、（ｉｖ）のパーセント同一性は、少なくとも約９４％である。

【0033】

一例において、列挙される配列およびタンパク質の間の違いは置換である。

【0034】

当業者は、例えば、可変領域含有タンパク質のフレームワーク領域内で、本開示のタンパク質に対する突然変異のための部位を決定することができるであろう。さらに、本発明者は、変異させることができるＶ_ＨのＣＤＲ３およびＶ_ＬのＣＤＲ３内の多数の部位、ならびに本開示のタンパク質の活性を維持する多数の突然変異を同定した。例えば、突然変異（例えば、置換）は、ＨＣＤＲ３の４つのＣ末端残基のうちの１つ以上の（例えば、２つ、または３つ、または４つ）、および／またはＬＣＤＲ３のＮ末端もしくはＣ末端残基のうちの１つ以上（例えば、２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ）に存在する。一例において、Ｖ_ＨのＣＤＲ３のＮ末端の５つのアミノ酸は、ＬＧＥＬＧである。一例において、Ｖ_ＬのＣＤＲ３の３つのＮ末端アミノ酸は、ＱＱＳであり、かつ／または、Ｖ_ＬのＣＤＲ３の３つのＣ末端アミノ酸は、ＰＬＴである。

【0035】

一例において、Ｖ_Ｈは、配列ＬＧＥＬＧＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４を含むＣＤＲ３を含み、
Ｘ_１は、トリプトファン、グルタミン、メチオニン、セリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、およびヒスチジンからなる群から選択され、かつ／または、中性アミノ酸、例えば、トリプトファン、グルタミン、もしくはメチオニンであり、例えば、アミノ酸はトリプトファンであり、
Ｘ_２は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、グリシン、およびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、またはセリンであり、例えば、アミノ酸はフェニルアラニンであり、
Ｘ_３は、アスパラギン酸、メチオニン、グルタミン、セリン、ロイシン、バリン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、プロリン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、またはチロシンであり、例えば、アミノ酸はアスパラギン酸であり、
Ｘ_４は、任意のアミノ酸であるか、またはプロリン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、グリシン、アルギニン、およびリジンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はプロリンである。

【0036】

一例において、Ｖ_Ｌは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９を含むＣＤＲ３を含み、
Ｘ_１は、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アラニン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、かつ／または、親水性アミノ酸、例えば、グルタミンもしくはグルタミン酸であり、例えば、アミノ酸はグルタミンであり、
Ｘ_２は、グルタミン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン、およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はグルタミンであり、
Ｘ_３は、セリンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はセリンであり、
Ｘ_４は、トリプトファン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、およびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸は、トリプトファンまたはチロシンであり、
Ｘ_５は、任意のアミノ酸であるか、またはグルタミン酸、メチオニン、グルタミン、トリプトファン、セリン、バリン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アルガニン（ａｒｇａｎｉｎｅ）、ヒスチジン、チロシン，リジン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はセリンであり、
Ｘ_６は、チロシン、メチオニン、イソロイシン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸は、メチオニン、チロシン、またはスレオニンであり、
Ｘ_７は、プロリン、アラニン、ヒスチジン、グリシン、およびリジンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はプロリンであり、
Ｘ_８は、ロイシン、グルタミン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、リジン、ヒスチジン、およびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はロイシンであり、
Ｘ_９は、任意のアミノ酸であるか、またはスレオニン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、リジン、セリン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、イソロイシン、グルタミン、グリシン、およびバリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、例えば、アミノ酸はスレオニンである。

【0037】

本開示は、付加的または代替的に、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和するタンパク質（例えば、抗体）であって、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｉｖ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｖｉｉ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｘ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｉｉ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｉｉ）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｖｉ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｘ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘ）配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｉ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｖ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｖ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｘ）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｘ）配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｘｉｖ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｖ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｖｉ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｘ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｌ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｌｉ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｌｉｉ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｌｉｉｉ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｌｉｖ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｌｖ）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｌｖｉ）配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｌｖｉｉ）配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｘｌｉｘ）配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｌ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｌｉ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｌｉｉ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、
（ｌｉｉｉ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、および
（ｌｉｖ）配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ
からなる群から選択される抗体の少なくとも１つの可変領域を含むタンパク質（例えば、抗体）を提供する。

【0038】

一例において、本明細書に記載されるタンパク質は、少なくともＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含み、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、結合して抗原結合ドメインを含むＦｖを形成する。当業者は、抗原結合ドメインが抗体結合部位を含むことを理解するであろう。

【0039】

一例において、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、単一のポリペプチド鎖に存在する。例えば、タンパク質は、
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、あるいは
（ｉｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ、または重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）２および／もしくはＣ_Ｈ３に結合した（ｉ）および／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ
である。

【0040】

一例において、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、別個のポリペプチド鎖に存在する。

【0041】

例えば、タンパク質は、
（ｉ）二重特異性抗体、
（ｉｉ）三重特異性抗体、
（ｉｉｉ）四重特異性抗体、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）_２、
（ｖｉ）Ｆｖ、または
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃ、または重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）２および／もしくはＣ_Ｈ３に結合した（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの１つ
である。

【0042】

上記タンパク質（前述の２つのリストに記載される）はまた、抗体の抗原結合ドメインと称されてもよい。

【0043】

一例において、タンパク質は抗体である。一例において、抗体は裸の抗体である。

【0044】

一例において、タンパク質は、キメラ、脱免疫化、ヒト化、ヒト、または霊長類化タンパク質である。

【0045】

一例において、タンパク質または抗体はヒトタンパク質である。

【0046】

本開示は、付加的または代替的に、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する抗体であって、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｉｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｉｉ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｖ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉ）配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｉｘ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉ）配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｖ）配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖ）配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｉｘ）配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘ）配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉ）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、ならびに
（ｘｘｘｉｘ）（ｉ）〜（ｘｘｘｉｉｉ）のうちのいずれか１つ以上に記載されるＶ_Ｈの３つのＣＤＲを含むＶ_Ｈおよび（ｉ）〜（ｘｘｘｉｉｉ）のうちのいずれか１つ以上に記載されるＶ_Ｌの３つのＣＤＲを含むＶ_Ｌ
を含む抗体を提供する。

【0047】

例示的なＶ_ＨおよびＶ_Ｌの配列は表３に記載され、本明細書に記載されるように、Ｃ１．２またはＣ１．２ＧのＶ_ＨもしくはＶ_Ｌにおける対応する配列が、列挙されるＶ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲ３配列で置換される。

【0048】

一例において、本開示は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する抗体であって、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ、または
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ
を含む抗体を提供する。

【0049】

本開示は、付加的または代替的に、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。一例において、抗体は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する。

【0050】

本開示は、付加的または代替的に、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。一例において、抗体は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する。

【0051】

本開示は、付加的または代替的に、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖および配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖、ならびに配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖を含む抗体を提供する。一例において、抗体は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合してＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和する。

【0052】

本明細書におけるｈＧ−ＣＳＦＲに「結合する」タンパク質または抗体への言及は、ｈＧ−ＣＳＦＲに「特異的に結合する」タンパク質または抗体に文字通りの支持を提供する。

【0053】

一例において、本明細書に記載されるタンパク質または抗体は、マウスＧ−ＣＳＦＲに有意に結合せず、かつ／またはマウスＧ−ＣＳＦＲに検出可能に結合しない。

【0054】

一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質または抗体は、Ｃ１．２および／またはＣ１．２Ｇの、ｈＧ−ＣＳＦＲ、またはそれを発現する細胞、または配列番号１、または可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲ（例えば、抗体のＦｃ領域に融合された配列番号１のアミノ酸１〜３１１を含む）への結合を競合的に阻害する。

【0055】

一例において、本明細書に記載されるタンパク質または抗体は、ｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合領域およびｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合領域に同様の親和性で結合する。一例において、タンパク質は、可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲおよび可溶性ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに同様の親和性で結合する。一例において、タンパク質は、配列番号１を含むポリペプチドおよび配列番号６７を含むポリペプチドに同様の親和性で結合する。一例において、タンパク質は、本明細書に記載されるようなｈＧ−ＣＳＦＲ−ＦｃおよびｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃに同様の親和性で結合する。一例において、親和性は、少なくとも約２ｎＭ、例えば、少なくとも約１．５ｎＭ、例えば、少なくとも約１．２ｎＭ、１．１ｎＭ、または１ｎＭである。一例において、０．５ｎＭ、例えば、少なくとも約０．４６ｎＭ、または０．４５ｎＭ、または０．４０ｎＭ、または０．３９ｎＭである。別の例において、親和性は、少なくとも約０．１ｎＭ、例えば、少なくとも約０．０９ｎＭ、例えば、少なくとも約０．０８ｎＭである。一例において、結合のレベルは、例えば、表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサを使用して評価される。例えば、リガンド結合領域または可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲまたは可溶性ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲまたはｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃまたはｃｙｎｏ−Ｇ−ＣＳＦＲ−Ｆｃが固定化され、本開示のタンパク質への結合のレベルが決定される。

【0056】

別の例において、本開示のタンパク質は、例えば、バイオセンサ上に固定化され、リガンド結合領域または可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲまたは可溶性ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲまたはｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃまたはｃｙｎｏ−Ｇ−ＣＳＦＲ−Ｆｃの結合のレベルが決定される。例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインへの結合のレベルが決定される。この例によれば、ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインに対するタンパク質の親和性は、少なくとも約１ｎＭ、例えば、少なくとも約０．９ｎＭ、例えば、少なくとも約０．７５ｎＭである。例えば、親和性は、少なくとも約０．７ｎＭ、例えば、少なくとも約０．６ｎＭ、例えば、少なくとも約０．５ｎＭである。一例において、親和性は約０．５ｎＭである。代替的または付加的に、ｈＧ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインに対するタンパク質の親和性は、少なくとも約７ｎＭ、または６ｎＭ、または５ｎＭ、例えば、少なくとも約４ｎＭ、例えば、少なくとも約３ｎＭ、例えば、少なくとも約２．５ｎＭである。例えば、親和性は、少なくとも約２．４または２．５ｎＭである。

【0057】

本開示はまた、上記抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合断片も提供する。

【0058】

一例において、本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体は、ＩｇＧ４抗体の定常領域またはＩｇＧ４抗体の安定化定常領域を含む。一例において、タンパク質または抗体は、２４１位にプロリンを有するＩｇＧ４定常領域を含む（Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７および／または１９９１））。

【0059】

本開示の全抗体の重鎖定常領域のＣ末端リジンは、例えば、抗体の生成もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換えによって遺伝子操作することにより、除去することができる。したがって、全抗体は、全てのＣ末端リジン残基が除去された抗体集団、Ｃ末端リジン残基が除去されていない抗体集団、およびＣ末端リジン残基を含む抗体と含まない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。いくつかの例において、抗体集団は、付加的に、重鎖定常領域のうちの１つにおいてＣ末端リジン残基が除去された抗体を含み得る。同様に、全抗体の組成物は、Ｃ末端リジン残基を含むまたは含まない抗体集団の同じかまたは類似する混合物を含み得る。

【0060】

一例において、安定化定常領域は、配列番号６４の１１９位〜４４５位の配列を含む。一例において、安定化定常領域は、配列番号６８の１１９位〜４４４位の配列を含む。一例において、本明細書に記載されるようなタンパク質もしくは抗体、または本明細書に記載されるようなタンパク質もしくは抗体の組成物は、Ｃ末端リジン残基を完全にまたは部分的に含むまたは含まない配列の混合物を含む安定化重鎖定常領域を含む重鎖定常領域を含む。

【0061】

一例において、本開示の抗体は、ＩｇＧ４定常領域または安定化ＩｇＧ４定常領域（例えば、上に開示されるような）に結合または融合された本明細書に開示されるＶ_Ｈを含み、Ｖ_Ｌは、κ軽鎖定常領域に結合または融合される。

【0062】

本開示はまた、ｈＧ−ＣＳＦＲを発現するＢａＦ３細胞のＧ−ＣＳＦによって誘導される増殖を、少なくとも約６ｎＭのＩＣ_５０で阻害するタンパク質または抗体も提供する。例えば、ＩＣ_５０は、５．９ｎＭ以下である。別の例において、ＩＣ_５０は、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．７ｎＭ以下、または０．６ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下である。一例において、ＩＣ_５０は、約０．５ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦの存在下で、例えば、約４８時間、ＢａＦ３細胞（例えば、約２×１０^４細胞）を培養することによって決定される。一例において、ＢａＦ３細胞の増殖は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の減少を測定することによって決定される。

【0063】

本開示はまた、ｈＧ−ＣＳＦＲを発現するＢａＦ３細胞のＧ−ＣＳＦによって誘導される増殖を、少なくとも約１０μｇ／ｍｌのＩＣ_５０で阻害するタンパク質または抗体も提供する。例えば、ＩＣ_５０は、５μｇ／ｍｌ以下である。別の例において、ＩＣ_５０は、３μｇ／ｍｌ以下、または２μｇ／ｍｌ以下、または１μｇ／ｍｌ以下である。一例において、ＩＣ_５０は、約０．８μｇ／ｍｌである。一例において、ＩＣ_５０は、約１０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦの存在下で、例えば、約４８時間、ＢａＦ３細胞（例えば、約１×１０^４細胞）を培養することによって決定される。一例において、ＢａＦ３細胞の増殖は、^３Ｈ−チミジンの組込みを測定することによって決定される。

【0064】

一例において、本開示のタンパク質または抗体は、抗体Ｆｃ領域との融合物として発現される配列番号１のアミノ酸１〜３１１を含む可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲ（ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ）に、少なくとも約１．５ｎＭの親和性で結合する。例えば、親和性は、少なくとも約０．５ｎＭ、または０．４ｎＭ、または０．３５ｎＭ、または０．３３ｎＭである。一例において、タンパク質の親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサを使用して決定される。例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃが固定化され、本開示のタンパク質の親和性が決定される。

【0065】

一例において、本開示のタンパク質または抗体は、少なくとも約１ｎＭ、例えば、少なくとも約０．５ｎＭ、例えば、少なくとも０．４ｎＭ、例えば、少なくとも０．３ｎＭ、例えば、少なくとも０．２ｎＭの親和性で細胞の表面上に発現されるｈＧ−ＣＳＦＲに結合する。

【0066】

一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるようなタンパク質は、カニクイザルに投与されたときまたはその場合に、循環する好中球の数を減少させることができる。例えば、タンパク質は、０．０５ｍ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇの容量でカニクイザルに投与されたときまたはその場合に、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの容量で投与されると、循環する好中球の数を減少させる。例えば、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦもしくはフィルグラスチム、またはそれらのペグ化形態の投与後に投与されたときまたはその場合に、例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはフィルグラスチム、またはそれらのペグ化形態の投与から約１２時間後にタンパク質が投与されたときまたはその場合に、循環する好中球の数を減少させる。一例において、減少は、２倍または３倍の減少である。一例において、好中球は、投与後約１０〜２４時間、例えば、約１２時間で減少する。

【0067】

一例において、本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体は、単離および／または組換え抗体である。

【0068】

一例において、本開示のタンパク質または抗体は、別の化合物、例えば、検出可能な標識、またはタンパク質もしくは抗体の半減期を延長する化合物、例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン結合タンパク質にコンジュゲートされる。

【0069】

本開示はまた、本開示のタンパク質または抗体をコードする核酸も提供する。

【0070】

一例において、そのような核酸は、核酸がプロモーターに操作可能に連結された発現コンストラクト中に含まれる。そのような発現コンストラクトは、ベクター、例えば、プラスミド中に存在し得る。

【0071】

単一のポリペプチド鎖タンパク質を対象とする本開示の例において、発現コンストラクトは、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含み得る。

【0072】

タンパク質を形成する複数のポリペプチド鎖を対象とする例において、発現コンストラクトは、例えば、プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｈを含むポリペプチドをコードする核酸と、例えば、プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｌを含むポリペプチドをコードする核酸と、を含む。

【0073】

別の例において、発現コンストラクトはバイシストロン性発現コンストラクトであり、例えば、５’から３’の順序で操作可能に連結された構成成分である、
（ｉ）プロモーター、
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸、
（ｉｉｉ）配列内リボソーム進入部位、および
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
を含み、ここで、第１のポリペプチドがＶ_Ｈを含み、第２のポリペプチドがＶ_Ｌを含むか、またはその逆である。

【0074】

本開示はまた、別個の発現コンストラクトを企図し、それらのうちの一方は、Ｖ_Ｈを含む第１のポリペプチドをコードし、もう一方は、Ｖ_Ｌを含む第２のポリペプチドをコードする。例えば、本開示はまた、
（ｉ）プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｈを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト、および
（ｉｉ）プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｌを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
を含む組成物を提供する。

【0075】

本開示はまた、本開示のタンパク質を発現する単離または組換え細胞を提供する。

【0076】

一例において、細胞は、本開示の発現コンストラクト、または
（ｉ）プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｈを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト、および
（ｉｉ）プロモーターに操作可能に連結されたＶ_Ｌを含むポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
を含む。

【0077】

本開示の細胞の例として、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞が挙げられる。

【0078】

本開示は、付加的に、本開示のタンパク質または抗体を生成するための方法を提供する。例えば、そのような方法は、タンパク質が生成されるのに十分な条件下に本開示の発現コンストラクト（複数可）を維持することを含む。

【0079】

一例において、本開示のタンパク質または抗体を生成するための方法は、タンパク質または抗体が生成されるのに十分な条件下で、および任意選択的に、分泌されるのに十分な条件下で、本開示の細胞を培養することを含む。

【0080】

一例において、本開示のタンパク質を生成するための方法は、付加的に、タンパク質または抗体を単離すること、および任意選択的に、タンパク質または抗体を薬学的組成物に配合することを含む。

【0081】

本開示は、付加的に、本開示のタンパク質または抗体、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0082】

本開示は、付加的に、
（ｉ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体、ならびに
（ｉｉ）（ａ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む抗体、および／または
（ｂ）配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖と、配列番号６８記載のアミノ酸配列を含む１つの重鎖と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、を含む抗体
を含み、薬学的に許容される担体を任意選択的に含む組成物を提供する。

【0083】

本開示はまた、本開示のタンパク質、抗体、または組成物を投与することを含む、対象においてＧ−ＣＳＦによって媒介される状態を治療または予防するための方法を提供する。この点に関して、タンパク質、抗体、または組成物は、状態の再発を予防するために使用することができ、これは、該状態を予防することであるとみなされる。

【0084】

一例において、Ｇ−ＣＳＦによって媒介される状態は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または癌である。例えば、自己免疫性疾患または炎症性疾患は、関節炎、多発性硬化症、肺炎症、または慢性閉塞性肺疾患である。

【0085】

一例において、方法は、好中球減少症を誘発することなく、対象において好中球の数を減少させるのに十分な量のタンパク質または抗体を投与することを含む。

【0086】

本開示は、代替的または付加的に、好中球減少症を誘発することなく、対象において好中球の数を減少させるための方法を提供し、該方法は、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合する（または特異的に結合する）抗体の抗原結合部位を含むタンパク質を対象に投与することを含む。例示的なタンパク質は、抗体であるか、またはその抗原結合ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈおよび／もしくはＶ_Ｌ）を含むか、またはその抗原結合断片である。例示的なタンパク質および抗体は本明細書に記載される。

【0087】

一例において、本明細書に記載される方法は、中程度の好中球減少症を誘発することなく、対象において好中球の数を減少させるのに十分な量のタンパク質または抗体を投与することを含む。

【0088】

一例において、本明細書に記載される方法は、重度の好中球減少症を誘発することなく、対象において好中球の数を減少させるのに十分な量のタンパク質または抗体を投与することを含む。

【0089】

一例において、本明細書に記載される方法は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇのタンパク質または抗体を投与することを含む。例えば、方法は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇのタンパク質または抗体を投与することを含む。一例において、方法は、約０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇのタンパク質または抗体を投与することを含む。

【0090】

本開示はまた、医薬品の任意の例における、本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体の使用を提供する。

【0091】

本開示はまた、Ｇ−ＣＳＦによって媒介される状態を治療するための薬物の製造におけるいずれかの例による本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体の使用を提供する。

【0092】

本開示はまた、Ｇ−ＣＳＦＲを発現する細胞に関連するＧ−ＣＳＦによって媒介される状態の位置を特定するおよび／または検出するおよび／または診断するおよび／または予知するための方法を提供し、該方法は、Ｇ−ＣＳＦＲを発現する細胞に結合した本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体が存在する場合、ｉｎ ｖｉｖｏ増幅で検出することを含み、タンパク質または抗体は検出可能なタグにコンジュゲートされる。

【0093】

一例において、方法は、対象にタンパク質を投与することを付加的に含む。

【0094】

本開示はまた、試料中でＧ−ＣＳＦＲまたはそれを発現する細胞を検出するための方法を提供し、該方法は、複合体が形成するように、試料をいずれかの例による本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体と接触させることと、複合体を検出することと、を含み、複合体の検出は、試料中にＧ−ＣＳＦＲまたはそれを発現する細胞が存在することを示唆する。

【0095】

本開示はまた、Ｇ−ＣＳＦによって媒介される状態を診断または予知するための方法を提供し、該方法は、Ｇ−ＣＳＦＲまたはそれを発現する細胞を検出するためにいずれかの例による本明細書に記載されるような方法を行うことを含み、Ｇ−ＣＳＦＲまたはそれを発現する細胞の検出は状態の兆候または前兆である。

【0096】

本開示はまた、本明細書に記載される方法において使用するための指示とともに梱包された、いずれかの例による本明細書に記載されるようなタンパク質または抗体を含むキットを提供する。

【配列表の記号解説】

【0097】

配列番号１： Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有するヒトＧ−ＣＳＦＲ（ｈＧ−ＣＳＦＲ）のアミノ酸２５〜３３５
配列番号２： Ｃ１．２のＶ_Ｈ
配列番号３： Ｃ１．２のＶ_Ｌ
配列番号４： Ｃ１．２ＧのＶ_Ｈ
配列番号５： Ｃ１．２ＧのＶ_Ｌ
配列番号６： Ｃ１．２のＨＣＤＲ１
配列番号７： Ｃ１．２のＨＣＤＲ２
配列番号８： Ｃ１．２のＨＣＤＲ３
配列番号９： Ｃ１．２のＬＣＤＲ１
配列番号１０： Ｃ１．２のＬＣＤＲ２
配列番号１１： Ｃ１．２のＬＣＤＲ３
配列番号１２： Ｃ１．２のＨＣＤＲ３のコンセンサス配列
配列番号１３： Ｃ１．２のＬＣＤＲ３のコンセンサス配列
配列番号１４： 抗体９８７のＶ_Ｌ
配列番号１５： 抗体９８７のＶ_Ｈ
配列番号１６： 抗体９５のＶ_Ｌ
配列番号１７： 抗体７９のＶ_Ｌ
配列番号１８： 抗体８３のＶ_Ｌ
配列番号１９： 抗体１００３のＶ_Ｌ
配列番号２０： 抗体１００３のＶ_Ｈ
配列番号２１： 抗体４４のＶ_Ｌ
配列番号２２： 抗体９７のＶ_Ｌ
配列番号２３： 抗体９８６のＶ_Ｌ
配列番号２４： 抗体９８６のＶ_Ｈ
配列番号２５： 抗体５６のＶ_Ｌ
配列番号２６： 抗体７７のＶ_Ｌ
配列番号２７： 抗体５４のＶ_Ｌ
配列番号２８： 抗体５４のＶ_Ｈ
配列番号２９： 抗体８０２のＶ_Ｌ
配列番号３０： 抗体９６７のＶ_Ｌ
配列番号３１： 抗体９６７のＶ_Ｈ
配列番号３２： 抗体９８９のＶ_Ｌ
配列番号３３： 抗体９８９のＶ_Ｈ
配列番号３４： 抗体６３のＶ_Ｌ
配列番号３５： 抗体１００２のＶ_Ｌ
配列番号３６： 抗体１００２のＶ_Ｈ
配列番号３７： 抗体９９４のＶ_Ｌ
配列番号３８： 抗体９９４のＶ_Ｈ
配列番号３９： 抗体９６９のＶ_Ｌ
配列番号４０： 抗体９６９のＶ_Ｈ
配列番号４１： 抗体１０００のＶ_Ｌ
配列番号４２： 抗体１０００のＶ_Ｈ
配列番号４３： 抗体９４のＶ_Ｌ
配列番号４４： 抗体９７５のＶ_Ｌ
配列番号４５： 抗体９７５のＶ_Ｈ
配列番号４６： 抗体７５のＶ_Ｌ
配列番号４７： 抗体８１４のＶ_Ｌ
配列番号４８： 抗体９７３のＶ_Ｌ
配列番号４９： 抗体９７３のＶ_Ｈ
配列番号５０： 抗体９７７のＶ_Ｌ
配列番号５１： 抗体９７７のＶ_Ｈ
配列番号５２： 抗体９８４のＶ_Ｌ
配列番号５３： 抗体９８４のＶ_Ｈ
配列番号５４： 抗体６１のＶ_Ｌ
配列番号５５： 抗体８５２のＶ_Ｈ
配列番号５６： 抗体９９６のＶ_Ｌ
配列番号５７： 抗体９９６のＶ_Ｈ
配列番号５８： 抗体４３のＶ_Ｌ
配列番号５９： 抗体４３のＶ_Ｈ
配列番号６０： 抗体９９９のＶ_Ｌ
配列番号６１： 抗体９９９のＶ_Ｈ
配列番号６２： 抗体８７０のＶ_Ｌ
配列番号６３： 抗体８７７のＶ_Ｌ
配列番号６４： 安定化ＩｇＧ４定常領域を有するＣ１．２Ｇの重鎖
配列番号６５： κ定常領域を有するＣ１．２Ｇの軽鎖
配列番号６６： 例示的なｈ−ＧＣＳＦＲの配列
配列番号６７： Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有するカニクイザルＧ−ＣＳＦＲ（ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ）のＩｇおよびＣＲＨドメインを含むポリペプチド
配列番号６８： 安定化ＩｇＧ４定常領域を有し、Ｃ末端リジンを欠損するＣ１．２Ｇの重鎖

【図面の簡単な説明】

【0098】

【図1】種々の抗Ｇ−ＣＳＦＲ抗体の濃度を増加させることにより、Ｇ−ＣＳＦによって媒介されるＢａＦ３細胞の増殖が阻害されることを示すグラフ表示である。各抗体の相対ＩＣ_５０値は、ｍＡｂ７１１が１０．１μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ７７４が３７．４μｇ／ｍｌ、Ｃ１．２Ｇが０．８μｇ／ｍＬであり、ｍＡｂ７４４は測定不能であった。

【図2A】配列番号１への結合と比較した、Ｃ１．２ＧおよびｍＡｂ７４４の、配列番号１の一連のアラニン点変異体への相対的な結合を示すグラフ表示である（突然変異の位置は、配列番号１を参照して示される）。配列番号１と比較した変異受容体に対する抗体のＫ_Ｄの倍数減少が示される。

【図2B】配列番号１への結合と比較した、Ｃ１．２Ｇ、ｍＡｂ７４４、およびｍＡｂ７７４の、配列番号１の一連のアラニン点変異体への相対的な結合を示すグラフ表示である（突然変異の位置は、配列番号１を参照して示される）。配列番号１と比較した変異受容体に対する抗体のＫ_Ｄの倍数減少が示される。

【図3】ペグ化Ｇ−ＣＳＦがカニクイザルに投与され、１日後にＣ１．２が投与されたアッセイの結果を示すグラフ表示である。血液１μＬ当たりの好中球の数を評価した。

【発明を実施するための形態】

【0099】

概要：
本明細書の全体を通して、別途具体的に指定のない限り、または文脈上他の意味を有する場合を除いて、単一のステップ、物質の組成物、一群のステップ、または一群の物質の組成物への言及は、１つおよび複数の（すなわち、１つ以上の）これらのステップ、物質の組成物、一群のステップ、または一群の物質の組成物を包含すると解釈されるべきである。

【0100】

当業者は、本開示が具体的に記載されるもの以外の変更および修正を受ける余地があることを認識するであろう。本開示は、全てのそのような変更および修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において言及されるまたは示される全てのステップ、特徴、組成物、および化合物を個別にまたは集合的に含み、上記ステップまたは特徴のあらゆる組み合わせまたはそれらのうちのいずれか２つ以上を含む。

【0101】

本開示は、本明細書に記載される特定の例によって範囲を限定されるものではなく、該例は、例示のみを目的とすることが意図される。機能的に均等な生成物、組成物、および方法は、明らかに本開示の範囲内に属する。

【0102】

本明細書に記載される本開示のいずれの例も、別途具体的に指定のない限り、必要があれば変更を加えて、本開示のいずれの他の例にも適用されると解釈されるべきである。

【0103】

別途具体的に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生物化学の）当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるべきである。

【0104】

別途指定のない限り、本開示において用いられる組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学の技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ａｎｄ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ａｎｄ１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂版を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、そしてＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂版を含む）等の出典において文献全体にわたって記載および説明される。

【0105】

可変領域およびその部分、免疫グロブリン、抗体およびその断片についての説明および定義は、ＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０，１９９４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７、 Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３，１９８９、および／またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３， ９２７−９４８，１９９７における考察によってさらに明確になり得る。

【0106】

用語「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸもしくはＹ」のいずれかを意味すると解釈されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提供すると解釈されるべきである。

【0107】

本明細書の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される要素、整数、もしくはステップ、または一群の要素、整数、もしくはステップの包含を暗示するものであって、いずれか他の要素、整数、もしくはステップ、または一群の要素、整数、もしくはステップの除外を暗示するものではないと理解される。

【0108】

本明細書において使用される場合、用語「〜に由来する」は、必ずしもその源から直接的にではなくても、特定の源から指定された整数を得ることができることを示唆すると解釈されるべきである。

【0109】

選択された定義：
制限ではなく命名のみを目的として、ヒトＧ−ＣＳＦＲの例示的な配列が、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００７５１．１に提示される（および配列番号６６に提示される）。カニクイザルＧ−ＣＳＦＲの配列は、本明細書および／もしくは公的に利用可能なデータベースに提供される配列を使用して決定されてもよいか、ならびに／または（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編集），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての改訂版を含む）、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるような）標準的な技術を使用して決定されてもよい。ヒトＧ−ＣＳＦＲへの言及はｈＧ−ＣＳＦＲと省略されてもよく、カニクイザルＧ−ＣＳＦＲへの言及はｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲと省略されてもよい。可溶性Ｇ−ＣＳＦＲへの言及は、Ｇ−ＣＳＦＲのリガンド結合領域を含むポリペプチドを意味する。Ｇ−ＣＳＦＲのＩｇおよびＣＲＨドメインは、リガンド結合および受容体の二量体化に関与する（Ｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７２：２９７３５−２９７４１，１９９７、およびＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８５５−２８６５，１９９１）。受容体のこれらのタンパク質を含むＧ−ＣＳＦＲの可溶性形態は、種々の受容体の研究に使用されており、受容体の７８位、１６３位、および２２８位における遊離システインの突然変異は、リガンド結合に影響を及ぼすことなく、可溶性受容体ポリペプチドの発現および単離を補助する（Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４３：２４５８−２４６４ ２００４）。本発明の研究において、突然変異Ｃ７８Ａ、Ｃ１６３Ｓ、およびＣ２２８Ｓを有するｈＧ−ＣＳＦＲのアミノ酸２５〜３３５を含む受容体の可溶性形態が使用され（例えば、配列番号１）、システイン突然変異を有するｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの対応するセグメントが、カニクイザル受容体に関する研究のために使用される（例えば、配列番号６７）。配列番号１および配列番号６７の可溶性受容体の種々の点変異も用いられている。ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃへの言及は、Ｃ末端ポリヒスチジンタグがＦｃ配列で置き換えられた配列番号１のポリペプチド（例えば、Ｆｃと融合された配列番号１のアミノ酸１〜３１１を含むポリペプチド）を意味する。ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃは、Ｆｃ配列がそのＣ末端に付着したｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの対応するセグメント（例えば、Ｆｃと融合された配列番号６７のアミノ酸１〜３１１を含むポリペプチド）を意味する。本発明者は、抗体およびその抗原結合部位を含むタンパク質（例えば、Ｆａｂ）が、野生型ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびそれらの変異タンパク質に同様の高い親和性で結合することを示した。したがって、変異タンパク質を使用する研究は、ｈＧ−ＣＳＦＲおよび／またはｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲを使用する研究のモデルである。

【0110】

本明細書におけるＧ−ＣＳＦへの言及は、Ｇ−ＣＳＦの天然形態、変異形態（例えば、フィルグラスチム）、およびＧ−ＣＳＦまたはフィルグラスチムのペグ化形態を含む。この用語は、Ｇ−ＣＳＦＲ（例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合してシグナル伝達を減少させる能力を保持するＧ−ＣＳＦの変異形態も包含する。

【0111】

用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または誘導の源のために、その天然状態においてそれに付随する自然に会合する構成成分と会合しておらず、同じ源に由来する他のタンパク質を実質的に含まない、タンパク質またはポリペプチドである。タンパク質は、自然に会合する構成成分を実質的に含まなくてもよいか、または、当該技術分野において既知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって実質的に精製することができる。「実質的に精製される」とは、タンパク質が実質的に汚染物質を含まないこと、例えば、少なくとも約７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％汚染物質を含まないことを意味する。

【0112】

用語「組換え」は、人工的な遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるべきである。したがって、抗体の抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質の文脈において、この用語は、Ｂ細胞成熟の間に発生する天然の組換えの産物である、対象の体内で自然に発生する抗体は包含しない。しかしながら、そのような抗体が単離された場合、抗体の抗原結合ドメインを含む単離されたタンパク質であるとみなされるべきである。同様に、タンパク質をコードする核酸を単離し、組換え手段を用いて発現させた場合、得られたタンパク質は、抗体の抗原結合ドメインを含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質はまた、例えば、それが発現される細胞、組織、または対象内に存在する場合、人工的な組換え手段によって発現させたタンパク質を包含する。

【0113】

用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続的なアミノ酸、または共有結合的にもしくは非共有結合的に互いと連結した一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されるべきである。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合またはジスフィルド結合を用いて共有結合的に連結することができる。非共有結合的な結合の例として、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、および疎水性相互作用が挙げられる。

【0114】

用語「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、上記段落から、ペプチド結合によって連結された一連の連続的なアミノ酸を意味することを理解されたい。

【0115】

本明細書において使用される場合、用語「抗原結合部位」は、抗原に結合するまたは特異的に結合することができるタンパク質によって形成される構造を意味すると解釈されるべきである。抗原結合部位は、一連の連続的なアミノ酸である必要はなく、または単一のポリペプチド鎖内のアミノ酸である必要さえもない。例えば、２つの異なるポリペプチド鎖から生成されるＦｖにおいて、抗原結合部位は、抗原と相互作用し、必ずではないが、一般に、各可変領域のＣＤＲのうちの１つ以上に存在するＶ_ＬおよびＶ_Ｈの一連のアミノ酸から構成される。いくつかの例において、抗原結合部位は、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬまたはＦｖである。

【0116】

当業者は、一般に、「抗体」は、複数のポリペプチド鎖、例えば、Ｖ_Ｌを含むポリペプチドおよびＶ_Ｈを含むポリペプチドから構成される可変領域を含むタンパク質であると解釈されることを認識するであろう。抗体はまた、一般に定常ドメインを含み、それらのうちのいくつかは定常領域内に配置することができ、該領域は、定常断片、または重鎖の場合には結晶化可能断片（Ｆｃ）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、相互作用して、１つまたは数個の密接に関連する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成する。一般に、哺乳動物の軽鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかであり、哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、またはμである。抗体は、いずれの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスであってもよい。用語「抗体」はまた、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、およびキメラ抗体を包含する。

【0117】

用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」は、抗体の抗原結合断片とは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体を指して交換可能に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む軽鎖および軽鎖を有する抗体を含む。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）、またはそのアミノ酸配列の変種であり得る。

【0118】

本明細書において使用される場合、「可変領域」は、抗原に特異的に結合することができ、相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるような抗体の軽鎖および／または重鎖の一部を指す。例示的な可変領域は、３つのＣＤＲとともに、３つまたは４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および任意選択的にＦＲ４）を含む。ＩｇＮＡＲに由来するタンパク質の場合、タンパク質はＣＤＲ２を欠損する可能性がある。Ｖ_Ｈは、重鎖の可変領域を指す。Ｖ_Ｌは、軽鎖の可変領域を指す。

【0119】

本明細書において使用される場合、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と同義）は、抗体可変領域のアミノ酸残基を指し、その存在は抗原の結合に必要である。各可変領域は、典型的にはＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と特定される３つのＣＤＲ領域を有する。ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、ＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７および１９９１、あるいは本開示を行う上での他のナンバリングシステム、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７の古典的なナンバリングシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３，１９８９および／もしくはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２７３：９２７−９４８，１９９７；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５−７７，２００３のＩＭＧＴナンバリングシステム、またはＨｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｋｔｈｕｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７−６７０，２００１のＡＨＯナンバリングシステムに従って規定することができる。例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、Ｖ_Ｈのフレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲは次のように配置される：残基１〜３０（ＦＲｌ）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６−４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４ （ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）、および１０３〜１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、Ｖ_ＬのＦＲおよびＣＤＲは次のように配置される：残基１〜２３（ＦＲｌ）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）、および９８〜１０７（ＦＲ４）。本開示は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによって規定されるＦＲおよびＣＤＲに限定されるものではなく、上で論じたものを含む全てのナンバリングシステムを含む。一例において、本明細書におけるＣＤＲ（またはＦＲ）への言及は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによるこれらの領域に関する。

【0120】

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの残基以外のこれらの可変領域の残基である。

【0121】

本明細書において使用される場合、用語「Ｆｖ」は、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈが会合し、抗原結合部位を有する、すなわち、抗原に特異的に結合することができる複合体を形成する、複数のポリペプチドまたは単一のポリペプチドを含む任意のタンパク質を意味すると解釈されるべきである。抗原結合部位を形成するＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、単一のポリペプチド鎖または異なるポリペプチド鎖に存在し得る。さらに、本開示のＦｖ（および本開示の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合し得るまたはし得ない複数の抗原結合部位を有してもよい。この用語は、抗体に直接由来する断片、および組換え手段を用いて生成したそのような断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるべきである。いくつかの例において、Ｖ_Ｈは、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）１に連結されておらず、かつ／または、Ｖ_Ｌは、軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）に連結されていない。例示的なＦｖ含有ポリペプチドまたはタンパク質として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体もしくはより高次の複合体、あるいは、その定常領域またはドメイン、例えば、Ｃ_Ｈ２もしくはＣ_Ｈ３ドメインに連結した上述のもののうちのいずれか、例えばミニ抗体が挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、免疫グロブリンの一価の抗原結合断片からなり、インタクトな軽鎖と重鎖の一部とからなる断片をもたらすように酵素パパインで全抗体を消化することによって生成することができるか、または組換え手段を用いて生成することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、インタクトな軽鎖と、Ｖ_Ｈおよび単一の定常ドメインを含む重鎖の一部とからなる分子をもたらすように、全抗体をペプシンで処理した後に還元することによって得ることができる。このように処理した抗体当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組換え手段によって生成することができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスフィルド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、その後に還元することなく、酵素パパインで全抗体分子を処理することにより得られる。「Ｆａｂ_２」断片は、例えば、ロイシンジッパーまたはＣ_Ｈ３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域が好適な可塑性ポリペプチドリンカーによって共有結合的に連結された抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含有する組換え分子である。

【0122】

本明細書において使用される場合、用語「結合する」は、タンパク質またはその抗原結合部位の抗原との相互作用に関連して、該相互作用が抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、一般的なタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識化「Ａ」およびタンパク質を含有する反応においてエピトープ「Ａ」（または遊離する非標識化「Ａ」）を含有する分子の存在は、抗体に結合する標識化「Ａ」の量を減少させる。

【0123】

本明細書において使用される場合、用語「特異的に結合する」は、本開示のタンパク質が、代替的な抗原または細胞に対するよりも、より高い頻度で、より迅速に、より長い期間、および／または、より高い親和性で、特定の抗原またはそれを発現する細胞と反応または会合することを意味すると解釈されるべきである。例えば、タンパク質は、多反応性の天然抗体によって（すなわち、ヒトにおいて天然に見られる様々な抗原に結合することが分かっている自然に発生する抗体によって）一般に認識される他のサイトカイン受容体または抗原に対するよりも実質的に高い親和性（例えば、２０倍、または４０倍、または６０倍、または８０倍〜１００倍、または１５０倍、または２００倍）でＧ−ＣＳＦＲ（例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲ）に結合する。本開示の一例において、タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲの変異形態、またはその領域（例えば、ｈ−ＧＣＳＦＲのリガンド結合ドメインの変異形態）を含むポリペプチド、または２８７位の天然アルギニンがアラニンで置換された配列番号１の変異形態に対するよりも、ｈＧ−ＣＳＦＲのある形態、またはその領域（例えば、ｈＧ−ＧＣＳＦＲのリガンド結合ドメイン）を含むポリペプチド、または配列番号１のアミノ酸１〜３１１を含むポリペプチドに、少なくとも２０倍、または４０倍、または６０倍、または８０倍、または１００倍、または１５０倍、または２００倍高い親和性で「特異的に結合する」。配列番号１に対するさらなる例示的な変更およびそれらが結合に与える影響は、本明細書に記載される。必ずではないが、一般に、結合への言及は特異的結合を意味し、各用語は、他の用語に明示的な支持を提供すると理解されるべきである。

【0124】

本明細書において使用される場合、用語「検出可能に結合しない」は、タンパク質、例えば、抗体が、バックグラウンドよりも１０％未満、または８％未満、または６％未満、または５％未満高いレベルで候補抗原に結合することを意味すると理解されるべきである。バックグラウンドは、タンパク質の非存在下でおよび／もしくは陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベルであり得、ならびに／または、陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合のレベルは、タンパク質を固定化して抗原と接触させるバイオセンサ分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。

【0125】

本明細書において使用される場合、用語「有意に結合しない」は、本開示のタンパク質のポリペプチドへの結合のレベルがバックグラウンドよりも統計的に有意に高くないことを意味すると理解されるべきである（例えば、タンパク質の非存在下および／もしくは陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、ならびに／または陰性対照ポリペプチドの存在下で検出される結合のレベル）。結合のレベルは、タンパク質を固定化して抗原と接触させるバイオセンサ分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。

【0126】

本明細書において使用される場合、抗原に関連して「結合の減少」または「低レベルでの結合」を指す句は、抗体が、対照エピトープまたは抗原（例えば、配列番号１）よりも少なくとも約２０倍、または４０倍、または６０倍低い親和性で、抗原（例えば、２８７位、２３７位、１９８位、１７２位、１７１位、または１１１位のいずれか１つの配列番号１のアラニン点変異体）に結合することを意味すると理解されたい。例えば、本開示のタンパク質は、配列番号１のポリペプチドに結合するよりも２０倍、または４０倍、または６０倍低いレベルで、２３７位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに結合することができる。好ましくは、タンパク質は、２０倍低いレベルで、より好ましくは４０倍低い、さらにより好ましくは６０倍低いレベルで結合する。

【0127】

タンパク質または抗体が、別のポリペプチドに対する該タンパク質または抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）よりも低いＫ_Ｄで、あるポリペプチドに結合する場合、該タンパク質または抗体は、そのポリペプチドに「優先的に結合する」と見なすことができる。一例において、タンパク質または抗体が、別のポリペプチドに対する該タンパク質または抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも約２０倍、または４０倍、または６０倍、または８０倍、または１００倍、または１２０倍、または１４０倍、または１６０倍高い親和性（すなわち、Ｋ_Ｄ）で、あるポリペプチドに結合する場合、該タンパク質または抗体は、該ポリペプチドに優先的に結合するとみなされる。

【0128】

本明細書において使用される場合、用語「同様の親和性」は、例えば、２つの抗原（例えば、ヒトおよびカニクイザル由来のＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインもしくは細胞外ドメイン）を固定化し、該固定化したタンパク質を本開示のタンパク質と接触させることによって親和性が評価される場合に、本開示のタンパク質が、互いの約５倍以下、例えば、互いの約４、３、２、もしくは１倍以内（互いの約０．５倍等）の親和性で２つの抗原（例えば、ヒトおよびカニクイザル由来のＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメイン）に結合すること、または結合のレベルが実質的に同一であることを意味すると理解されたい。

【0129】

明確にするために、また本明細書に例示される主題に基づいて当業者には明らかなように、本明細書における「親和性」への言及は、タンパク質または抗体のＫ_Ｄへの言及である。

【0130】

明確にするために、また本明細書における説明に基づいて当業者には明らかなように、「少なくとも約〜の親和性」への言及は、親和性（またはＫ_Ｄ）が、列挙される値と等しいかまたはそれよりも高い（すなわち、親和性として列挙される値のほうが低い）こと、すなわち、２ｎＭの親和性は３ｎＭの親和性よりも高いことを意味すると理解されたい。換言すると、この用語は、「Ｘ以下の親和性」（Ｘは本明細書に列挙される値である）であってもよい。

【0131】

「少なくとも約〜のＩＣ_５０」は、ＩＣ_５０が、列挙される値と等しいかまたはそれよりも高い（すなわち、ＩＣ_５０として列挙される値のほうが低い）こと、すなわち、２ｎＭのＩＣ_５０は３ｎＭのＩＣ_５０よりも高いことを意味すると理解されたい。換言すると、この用語は、「Ｘ以下の親ＩＣ_５０」（Ｘは本明細書に列挙される値である）であってもよい。

【0132】

本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」（同義語：「抗原決定基」抗原）は、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質が結合するｈＧ−ＣＳＦＲの領域を意味すると理解されるべきである。この用語は、必ずしも、タンパク質が接触する特定の残基または構造に限定されない。例えば、この用語は、タンパク質によって接触されたアミノ酸に及ぶ領域、および／またはこの領域外の５〜１０個、もしくは２〜５個、もしくは１〜３個のアミノ酸を含む。いくつかの例において、ｈＧ−ＣＳＦＲが折り畳まれている場合、すなわち「立体構造エピトープ」である場合、エピトープは、互いの近くに配置された一連の非連続的なアミノ酸を含む。例えば、立体構造エピトープは、配列番号１の１１１〜１１５、１７０〜１７６、２１８〜２３４および／または２８６〜３００に対応する領域の１つ以上または２つ以上または全てにアミノ酸を含む。当業者はまた、用語「エピトープ」は、ペプチドまたはポリペプチドに限定されるものではないことを認識するであろう。例えば、用語「エピトープ」は、糖側鎖、ホスホリル側鎖、またはスルホニル側鎖等の分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の例において、特異的な三次元構造特性および／または特異的な荷電特性を有し得る。

【0133】

用語「競合的に阻害する」は、本開示のタンパク質（またはその抗原結合部位）が、列挙される抗体またはタンパク質の、Ｇ−ＣＳＦＲ、例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲへの結合を低減させるまたは防止することを意味すると理解されるべきである。これは、タンパク質（またはその抗原結合部位）および抗体が、同じまたは重複するエピトープに結合することに起因し得る。上記から、タンパク質は、統計的に有意な量だけ、例えば、少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％だけ結合を低減させる必要があるのであって、抗体の結合を完全に阻害する必要はないことが明白であろう。好ましくは、タンパク質は、少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％もしくは８５％、またさらにより好ましくは少なくとも約９０％抗体の結合を低減させる。結合の競合的な阻害を測定するための方法は、当該技術分野において既知であり、かつ／または本明細書に記載される。例えば、抗体は、タンパク質の存在下または非存在下のいずれかでＧ−ＣＳＦＲに暴露される。タンパク質の非存在下においてタンパク質の存在下よりも少ない抗体が結合する場合、該タンパク質は、抗体の結合を競合的に阻害するとみなされる。一例において、競合的な阻害は、立体障害に起因するものではない。

【0134】

２つのエピトープに関連して「重複する」は、２つのエピトープが、一方のエピトープに結合するタンパク質（またはその抗原結合部位）が、他方のエピトープに結合するタンパク質（または抗原結合部位）の結合を競合的に阻害することを許容するのに十分な数のアミノ酸残基を共有することを意味すると解釈されるべきである。例えば、「重複する」エピトープは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または２０個のアミノ酸を共有する。

【0135】

本明細書において使用される場合、用語「中和する」は、タンパク質が、Ｇ−ＣＳＦＲを介して細胞中のＧ−ＣＳＦによって媒介されるシグナル伝達をブロック、減少、または防止することができることを意味すると解釈されるべきである。中和を測定するための方法は当該技術分野において既知であり、かつ／または本明細書に記載される。

【0136】

本明細書において使用される場合、用語「状態」は、正常な機能の崩壊または妨害を指し、いずれか特定の状態に限定されるものではなく、疾患または障害を含む。

【0137】

本明細書において使用される場合、「Ｇ−ＣＳＦに関連する状態」は、好中球、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧ−ＣＳＦＲを発現する細胞の超過、またはＧ−ＣＳＦの投与によって引き起こされる、あるいはそれに関連する任意の状態を指す。当業者は、そのような状態を容易に判定することができるであろう。この点に関して、いくつかの例において、状態は、炎症性状態、自己免疫性状態、または癌（転移を含む）である。

【0138】

本明細書において使用される場合、用語「予防すること」、「予防する」、または「予防」は、本開示のタンパク質を投与し、それによってある状態の少なくとも１つの症状の発生を停止または遅延させることを含む。この用語はまた、再発を予防するまたは遅延させるための、寛解期にある対象の治療を包含する。例えば、再発寛解型多発性硬化症に罹患する対象は寛解期の間に治療を受け、それによって再発を予防する。

【0139】

本明細書において使用される場合、用語「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、本明細書に記載されるタンパク質を投与し、それによって特定された疾患または状態の少なくとも１つの症状を減少させるまたは排除することを含む。

【0140】

本明細書において使用される場合、用語「好中球減少症」は、軽度の好中球減少症（１０００＜＝ＡＮＣ＜１５００）、中程度の好中球減少症（５００＜＝ＡＮＣ＜１０００）、および重度の好中球減少症（血液１マイクロリットル当たりの細胞中のＡＮＣ＜５００）（絶対好中球数（ＡＮＣ））を包含すると理解されたい。

【0141】

本明細書において使用される場合、用語「対象」は、ヒトを含む任意の動物、例えば、哺乳動物を意味すると解釈されるべきである。例示的な対象として、限定されないが、ヒトおよび非ヒト霊長類が挙げられる。例えば、対象はヒトである。

【0142】

抗体：
一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるようなタンパク質は、抗体である。

【0143】

抗体を生成するための方法は、当該技術分野において既知であり、かつ／またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載される。一般的に、そのような方法において、任意選択的に、任意の好適なもしくは所望の担体、アジュバント、または薬学的に許容される賦形剤とともに配合された、Ｇ−ＣＳＦＲ（例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲ）もしくはその領域（例えば、細胞外ドメイン）、またはその免疫原性断片もしくはエピトープ、またはそれらを発現および提示する細胞（すなわち、免疫原）が、非ヒト動物、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、牛、ヤギ、またはブタに投与される。免疫原は、経鼻的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、皮内に、または他の既知の経路によって投与することができる。

【0144】

ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫した動物の血液を採取することにより監視することができる。所望の抗体力価を達成することが要求される場合、１回以上の付加的な免疫が付与されてもよい。好適な力価に達するまで、追加免疫および力価測定のプロセスが繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫した動物から採血して血清を単離および保存する、ならびに／または、モノクローナル抗体（ｍａｂ）を生成するために該動物を使用する。

【0145】

モノクローナル抗体は、本開示によって企図される抗体の１つの例示的な形態である。用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、同じ抗原（複数）、例えば、抗原内の同じエピトープに結合することができる均一な抗体集団を指す。この用語は、抗体の源または抗体が作成される様式について限定されることを意図するものではない。

【0146】

ｍＡｂの生成のために、例えば、米国特許第４１９６２６５号またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）（上記参照）に例示される手順等の多くの既知の技術のうちのいずれか１つが使用されてもよい。

【0147】

例えば、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で、好適な動物が免疫原で免疫される。ウサギ、マウス、およびラット等のげっ歯類が、例示的な動物として挙げられる。ヒト抗体を発現するように、かつ、例えば、マウス抗体を発現しないように遺伝子操作されたマウスも、（例えば、国際公開公報第ＷＯ２００２／０６６６３０号に記載されるように）本開示の抗体を生成するために使用することができる。

【0148】

免疫後、抗体を産生する可能性を有する体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ生成プロトコルにおける使用するために選択される。これらの細胞は、脾臓、扁桃腺、もしくはリンパ腺の生検から、または末梢血試料から得ることができる。次に、免疫した動物のＢ細胞を、通常、免疫原で免疫された動物と同じ種に由来する、不死化骨髄腫細胞の細胞と融合する。

【0149】

組織培養培地中のヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む選択的な培地において培養することにより、ハイブリッドが増幅される。例示的な薬剤として、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンが挙げられる。

【0150】

増幅された融合細胞は、例えば、フローサイトメトリーおよび／または免疫組織化学および／または免疫測定法（例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、細胞毒性試験、プラークアッセイ、点免疫測定法等）等によって、抗体特異性および／または力価についての機能的選択に供される。

【0151】

代替的に、ＭＡｂを分泌する細胞株を生成するために、（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９７：８５−９５，１９９６に記載されるように）ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ５３７１３，ＵＳＡ）が使用される。

【0152】

抗体はまた、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリー（例えば、米国特許第６３０００６４号および／または米国特許第５８８５７９３に記載されるような）をスクリーニングすることによって生成または単離することができる。例えば、本発明者はファージディスプレイライブラリーから完全ヒト抗体を単離した。

【0153】

本明細書に記載されるように、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合するいくつかの本開示のタンパク質は、ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲと交差反応し、かつ／または、ｈＧ−ＣＳＦＲの特定の変異形態、もしくは変異されたｈＧ−ＣＳＦＲの領域を含むポリペプチドに結合し、かつ／または他には結合しない、かつ／あるいは、ｈＧ−ＣＳＦＲ内の特異的エピトープに結合する。これらの特性は、その結合部位を含む抗体またはタンパク質の生成において使用することができる。

【0154】

例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインを含むポリペプチドでファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし、それに結合するタンパク質を同定する。次に、タンパク質が検出可能に結合しないｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインの変異形態（例えば、２８７位の配列番号１のアラニン点変異体）を使用して交差反応性タンパク質を除去し、タンパク質が結合するｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインの変異形態またはその領域（例えば、１６８位の配列番号１のアラニン点変異体）を使用して正確に交差反応性であるタンパク質を単離する。上記に基づいて、非ヒト哺乳動物の免疫のためのスクリーニングプロセスも考案することができる。

【0155】

別の例において、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするか、またはｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインを含むポリペプチドで動物を免疫し、同定されたタンパク質および／または抗体をスクリーニングしてｈＧ−ＣＳＦＲおよび／またはそのリガンド結合ドメインと交差反応性であるものを同定する。

【0156】

さらなる例において、Ｇ−ＣＳＦＲまたはそのリガンド結合ドメイン（任意選択的に、Ｃ１．２もしくはＣ１．２Ｇが結合する変異形態）を、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇと接触させる。次に、ファージディスプレイライブラリーをＧ−ＣＳＦＲまたはリガンド結合ドメインと接触させ、結合についてＣ１．２またはＣ１．２Ｇと競合することができるタンパク質を発現するファージを選択する。

【0157】

さらなる例において、例えば、ｈＧ−ＣＳＦＲ由来の対象となるエピトープが対応するマウス配列で置換されたマウスＧ−ＣＳＦＲを含むキメラタンパク質。このキメラタンパク質は、次にマウス（マウスタンパク質に対する免疫応答を誘導する可能性が低い）を免疫するため、および／またはファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用される。得られた抗体／タンパク質を次いでスクリーニングし、（特に、対象となるエピトープで）ｈＧ−ＣＳＦＲに結合するが、マウスＧ−ＣＳＦＲには結合しないものを同定する。

【0158】

本開示の抗体は、合成抗体であり得る。例えば、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または脱免疫化抗体である。

【0159】

キメラ抗体：
一例において、本明細書に記載される抗体はキメラ抗体である。用語「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種（例えば、マウス等のネズミ科の動物）に由来する抗体の対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する一方で、残りの鎖（複数可）が、別の種（例えば、ヒト等の霊長目の動物）に由来する抗体の配列と同一もしくは相同であるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体を指す。典型的には、キメラ抗体は、大部分がヒトドメインである抗体を生成するために、げっ歯類またはウサギの可変領域およびヒト定常領域を用いる。キメラ抗体を生成するための方法は、例えば、米国特許第４８１６５６７号および米国特許第５８０７７１５号に記載されている。

【0160】

ヒト化抗体およびヒト抗体：
本開示の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。

【0161】

用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種からの抗体に由来する抗原結合部位または可変領域と、ヒト抗体の構造および／または配列に基づく残りの抗体構造と、を有する、キメラ抗体のサブクラスを指すと理解されたい。ヒト化抗体において、抗原結合部位は、一般に、ヒト抗体の可変領域内の適切なＦＲ上に移植された非ヒト抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体からの残りの領域と、を有する。抗原結合部位は、野生型（すなわち、非ヒト抗体のものと同一）であり得るか、または１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。特定の場合、ヒト抗体のＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。

【0162】

非ヒト抗体またはその一部（例えば、可変領域可変領域）をヒト化するための方法は、当該技術分野において既知である。ヒト化は、米国特許第５２２５５３９号または米国特許第５５８５０８９号の方法に従って行うことができる。抗体をヒト化するための他の方法も除外されない。

【0163】

本明細書において使用される場合の用語「ヒト抗体」は、可変領域（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ）と、任意選択的に、ヒトにおいて、例えば、ヒト生殖細胞または体細胞に見られる配列に由来するまたは対応する定常領域と、を有する抗体を指す。「ヒト抗体」は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム突然変異または部位特異的突然変異によって導入された突然変異（抗体の残基のうちの少数、例えば、抗体の残基のうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個における、例えば、抗体のＣＤＲのうちの１つ以上を構成する残基のうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個における、保存的置換または保存的突然変異を含む特定の突然変異）を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は、実際にヒトによって生成される必要はなく、むしろ、それらは組換え手段を用いて生成されてもよいか、ならびに／またはヒト抗体の定常領域および／もしくは可変領域（例えば、上述のような）をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離されてもよい。ヒト抗体は、（例えば、米国特許第５８８５７９３号に記載されるように）ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野において既知の種々の技術を使用して生成することができる。

【0164】

選択されたエピトープを認識するヒト抗体も、「誘導選択」と称される技術を使用して生成することができる。この手法では、（例えば、米国特許第５５６５３３２号に記載されるように）選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために使用される。

【0165】

例示的なヒト抗体は、本明細書に記載され、Ｃ１．２およびＣ１．２Ｇならびに／またはその可変領域を含む。これらのヒト抗体は、非ヒト抗体と比較して低い免疫原性という利点をヒト抗体に提供する。

【0166】

抗体結合ドメイン含有タンパク質：
単一ドメイン抗体：
いくつかの例において、本開示のタンパク質は、単一ドメイン抗体（用語「ドメイン抗体」もしくは「ｄＡｂ」と交換可能に用いられる）であるか、またはそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全てまたは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。

【0167】

二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体：
いくつかの例において、本開示のタンパク質は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、またはより高次のタンパク質複合体（国際公開公報第ＷＯ９８／０４４００１号および／または国際公開公報第ＷＯ９４／００７９２１号に記載されるもの等）であるか、またはそれを含む。

【0168】

例えば、二重特異性抗体は２つの会合するポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造Ｖ_Ｌ−Ｘ−Ｖ_ＨまたはＶ_Ｈ−Ｘ−Ｖ_Ｌを含み、Ｖ_Ｌは抗体軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖内のＶ_ＨおよびＶ_Ｌが会合する（もしくはＦｖを形成する）ことを可能にするには不十分な残基を含むリンカーであるか、または存在せず、一方のポリペプチド鎖のＶ_Ｈは他方のポリペプチド鎖のＶ_Ｌに結合して抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合することができるＦｖ分子を形成する。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、各ポリペプチド鎖において同じであってもよいか、またはＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、二重特異性抗体（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）を形成するように各ポリペプチド鎖において異なってもよい。

【0169】

一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）：
当業者は、ｓｃＦｖが、単一のポリペプチド鎖内のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域と、ｓｃＦｖが抗原結合にとって（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶ_ＨおよびＶ_Ｌが互いに会合してＦｖを形成するために）所望の構造を形成することを可能にするＶ_ＨとＶ_Ｌとの間のポリペプチドリンカーと、を含むことを認識するであろう。例えば、リンカーは、ｓｃＦｖにとってより好ましいリンカーのうちの１つである（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３を有する、１２個を超えるアミノ酸残基を含む。

【0170】

本開示はまた、Ｖ_ＨのＦＲおよびＶ_ＬのＦＲに単一のシステイン残基が導入され、システイン残基がジスフィルド結合によって連結されて安定したＦｖを生じる、ジスフィルド安定化Ｆｖ（またはｄｉＦｖもしくはｄｓＦｖ）を企図する。

【0171】

代替的に、または加えて、本開示は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、非共有結合または共有結合による連結、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓもしくはＪｕｎに由来する）によって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を包含する。代替的に、例えば、ＵＳ２００６０２６３３６７号に記載されるように、２つのｓｃＦｖｓは、両方のｓｃＦｖが抗原を形成することおよびそれに結合することを可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。

【0172】

重鎖抗体：
重鎖抗体は、重鎖を含むが軽鎖は含まないという点に限って言えば、多くの他の形態の抗体と構造的に異なる。したがって、これらの抗体は「重鎖のみ抗体」とも称される。重鎖抗体は、例えば、ラクダ類および軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも称される）に見られる。

【0173】

自然に発生する重鎖抗体に存在する可変領域は、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変領域（「Ｖ_Ｈドメイン」と称される）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（「Ｖ_Ｌドメイン」と称される）と区別するために、ラクダ類抗体では「Ｖ_ＨＨドメイン」、ＩｇＮＡＲではＶ−ＮＡＲと一般的に称される。

【0174】

ラクダ類由来の重鎖抗体およびその可変領域の概要と、それらの生成および／または単離および／または使用のための方法は、とりわけ次の参考文献中に見出だされる：国際公開公報第ＷＯ９４／０４６７８号、国際公開公報第ＷＯ９７／４９８０５号、および国際公開公報第ＷＯ９７／４９８０５号。

【0175】

軟骨魚類由来の重鎖抗体およびその可変領域の概要と、それらの生成および／または単離および／または使用のための方法は、とりわけ国際公開公報第ＷＯ２００５／１１８６２９号に見出される。

【0176】

他の抗体および抗体断片：
本開示はまた、
（ｉ）米国特許第５，７３１，１６８号に記載されるような「鍵と鍵穴」構造の二重特異性タンパク質、
（ｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるようなヘテロコンジュゲートタンパク質、
（ｉｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるような、化学的架橋剤を使用して生成されるヘテロコンジュゲートタンパク質、
（ｉｖ）Ｆａｂ_３（例えば、欧州特許第１９９３０３０２８９４号に記載されるような）
等の、他の抗体および抗体断片を企図する。

【0177】

脱免疫化抗体およびタンパク質：
本開示はまた、脱免疫化抗体またはタンパク質を企図する。脱免疫化抗体およびタンパク質は、１つ以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが除去されて（すなわち、変異されて）おり、それによって哺乳動物が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を生じる可能性を低下させる。脱免疫化抗体およびタンパク質を生成するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、国際公開公報第ＷＯ００／３４３１７号、国際公開公報第ＷＯ２００４／１０８１５８号、および国際公開公報第ＷＯ２００４／０６４７２４に記載されている。

【0178】

好適な突然変異を導入し、得られたタンパク質を発現させるおよびアッセイする方法は、本明細書の説明に基づいて当業者には明白であろう。

【0179】

タンパク質に対する突然変異：
本開示はまた、本開示のタンパク質の変異形態を企図する。この点に関して、本明細書に提示されるデータは、行われ得る例示的な変更に加えて変更することができる、本開示のタンパク質のＣＤＲ内の部位を示す。当業者は、付加的または代替的に、本開示に照らしてその機能を阻害するまたは著しく低下させることなく、可変領域含有タンパク質のＦＲ内で変更が行われてもよいことを理解するであろう。

【0180】

例えば、そのような変異タンパク質は、本明細書に記載される配列と比較して、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの例において、タンパク質は、３０個以下、または２０個以下、または１０個以下、例えば、９個、または８個、または７個、または６個、または５個、または４個、または３個、または２個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖および／または疎水性親水性指標および／または親水性を有するアミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸置換である。

【0181】

一例において、変異タンパク質は、自然に発生するタンパク質と比較して、１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、もしくは５つ、もしくは６つのみ、またはそれよりも少ない保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を次に提供する。当業者は、例えば、本明細書に記載される本開示から認識するように、そのようなわずかな変化はタンパク質の活性を変化させないと当然予測することができる。

【0182】

塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば，グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されている。

【0183】

本開示はまた、例えば、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３等における、本開示のタンパク質の非保存的アミノ酸変化（例えば、置換）を企図する。例えば、本発明者は、本開示のタンパク質の活性を保持しながら作製することができるいくつかの非保存的アミノ酸置換を同定した。一例において、タンパク質は、例えば、６個、または５個、または４個、または３個、または２個、または１個よりも少ない非保存的アミノ酸置換を、例えば、ＣＤＲ３に、例えばＣＤＲ３等に含む。

【0184】

本開示はまた、本明細書に記載される配列と比較して、１つ以上の挿入または欠失を企図する。いくつかの例において、タンパク質は、１０個以下、例えば、９個、または８個、または７個、または６個、または５個、または４個、または３個、または２個の挿入および／または欠失を含む。

【0185】

定常領域：
本開示は、抗体の定常領域を含む本明細書に記載されるタンパク質および／または抗体を包含する。これは、Ｆｃに融合された抗体の抗原結合断片を含む。

【0186】

本開示のタンパク質を生成するために有用な定常領域の配列は、多くの異なる源から得ることができる。いくつかの例において、タンパク質の定常領域またはその一部は、ヒト抗体に由来する。定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含むいずれの抗体クラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいずれの抗体アイソタイプに由来してもよい。一例において、定常領域は、ヒトアイソタイプＩｇＧ４または安定化ＩｇＧ４定常領域である。

【0187】

一例において、定常領域のＦｃ領域は、例えば、天然または野生型のヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能を誘導する能力が低い。一例において、エフェクター機能は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。Ｆｃ領域含有タンパク質のエフェクター機能のレベルを評価するための方法は、当該技術分野において既知であり、かつ／または本明細書に記載される。

【0188】

一例において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４のＦｃ領域（すなわち、ＩｇＧ４定常領域に由来する）、例えば、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である。好適なＩｇＧ４のＦｃ領域の配列は、当業者に明白であり、かつ／または公的に利用可能なデータベースにおいて入手可能である（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能）。

【0189】

一例において、定常領域は、安定化ＩｇＧ４定常領域である。用語「安定化ＩｇＧ４定常領域」は、Ｆａｂアーム交換もしくはＦａｂアーム交換を受ける傾向、または半抗体の形成もしくは半抗体を形成する傾向を低減するように修飾されたＩｇＧ４定常領域を意味すると理解されたい。「Ｆａｂアーム交換」とは、ＩｇＧ４重鎖および付着する軽鎖（半分子）が別のＩｇＧ４分子からの重鎖−軽鎖対と交換される、ヒトＩｇＧ４に対するタンパク質の修飾の一種を指す。よって、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの別個のＦａｂアームを獲得することができる（二重特異性分子が生じる）。Ｆａｂアーム交換は、ｉｎ ｖｉｖｏで自然に起こり、精製された血液細胞または還元グルタチオン等の還元剤によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することができる。ＩｇＧ４抗体が解離して、各々が単一の重鎖および単一の軽鎖を含有する２つの分子を形成する場合、「半抗体」が形成する。

【0190】

一例において、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステムによるヒンジ領域の２４１位にプロリンを含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７および／または１９９１）。この位置は、ＥＵナンバリングシステムによるヒンジ領域の２２８位に対応する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１ ａｎｄ Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５，１９６９）。ヒトＩｇＧ４において、この残基は一般にセリンである。プロリンをセリンで置換した後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣを含む。これに関して、当業者は、「ヒンジ領域」は、ＦｃおよびＦａｂ領域を結合して抗体の２本のＦａｂアームに可動性を付与する、抗体重鎖定常領域のプロリンに富んだ部分であることを認識するであろう。ヒンジ領域は、重鎖間ジスフィルド結合に関与するシステイン残基を含む。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによれば、該領域は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３に及ぶと一般に定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスフィルド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整合させることができる（例えば、国際公開公報第ＷＯ２０１０／０８０５３８号を参照）。

【0191】

安定化ＩｇＧ４抗体の付加的な例として、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の４０９位のアルギニン（ＥＵナンバリングシステムによる）が、リジン、スレオニン、メチオニン、またはロイシンで置換された抗体が挙げられる（例えば、国際公開公報第ＷＯ２００６／０３３３８６号に記載されるような）。定常領域のＦｃ領域は、付加的または代替的に、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、およびロイシンからなる群から選択される残基を（ＥＵナンバリングシステムによる）４０５に対応する位置に含み得る。任意選択的に、ヒンジ領域は、２４１位にプロリン（すなわち、ＣＰＰＣ配列）を含む（上述の通り）。

【0192】

別の例において、Ｆｃ領域は、低いエフェクター機能を有するように修飾された領域、すなわち、「非免疫賦活性Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０、および３３１からなる群から選択される１つ以上の位置に置換を含むＩｇＧ１のＦｃ領域である。別の例において、Ｆｃ領域は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３６の欠失といった変更のうちの１つ以上、ならびに／またはＡ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓといった変更のうちの１つ以上を含むＩｇＧ１のＦｃ領域である（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３−２６２４，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４，２００１）。非免疫賦活性Ｆｃ領域の付加的な例は、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１１２９−１１３８ ２００６；および／またはＨｅｚａｒｅｈ Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７５：１２１６１−１２１６８，２００１）に記載されている。

【0193】

別の例において、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４抗体由来の少なくとも１つのＣ_Ｈ２ドメインおよびＩｇＧ１抗体由来の少なくとも１つのＣ_Ｈ３ドメインを含むキメラＦｃ領域であり、Ｆｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９、および４２７（ＥＵナンバリング）（例えば、国際公開公報第ＷＯ２０１０／０８５６８２号に記載される）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置に置換を含む。例示的な置換として、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、および４２７Ｆが挙げられる。

【0194】

追加的修飾：
本開示はまた、抗体に対する追加的修飾を企図する。

【0195】

例えば、抗体は、タンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、抗体は、新生児型Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、より低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進する。一例において、Ｆｃ領域は、約ｐＨ７．４でのその親和性と比較して、約ｐＨ６でＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、これが細胞リサイクル後の血液中へのＦｃの再放出を促進する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することにより、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。

【0196】

例示的なアミノ酸置換としては、ＥＵナンバリングシステムによるＴ２５０Ｑおよび／またはＭ４２８ＬまたはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４ＳおよびＴ２６６ＦまたはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ、ならびにＮ４３４Ｆが挙げられる。付加的または代替的なアミノ酸置換は、例えば、ＵＳ２００７０１３５６２０またはＵＳ７０８３７８４に記載されている。

【0197】

タンパク質産生：
一例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質は、例えば、本明細書に記載の、および／または当該技術分野において既知であるように、タンパク質の産生に十分な条件下で融合細胞を培養することにより産生される。

【0198】

組換え発現：
別の例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質は組換え型である。

【0199】

組換えタンパク質の場合、これをコードする核酸は、発現コンストラクトまたはベクターにクローン化されてもよく、これは次いで、宿主細胞、例えば大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞、例えばシミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、または、別様にはタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。タンパク質を発現するために使用される例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞またはＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編集），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新版を含む）またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法が組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体を生成する方法もまた当該技術分野において既知であり、例えば、ＵＳ４８１６５６７またはＵＳ５５３０１０１を参照されたい。

【0200】

単離後、核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または無細胞系もしくは細胞における発現のために、発現コンストラクトまたは発現ベクターに挿入され、プロモーターに操作可能に連結される。

【0201】

本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、その最も広い文脈において解釈され、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスまたは開始要素を含むゲノム遺伝子の転写制御配列を含み、例えば、発生的および／もしくは外部刺激に応答して、または組織特異的な様式で核酸の発現を改変する、追加的な制御要素（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサー）を有する、または有さない。この文脈において、用語「プロモーター」はまた、操作可能に連結された核酸の発現をもたらす、活性化する、または促進する、組換え、合成もしくは融合核酸、または誘導体を説明するように使用される。例示的なプロモーターは、前記核酸の発現をさらに促進し、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を改変するために、１つ以上の特異的制御要素の追加の複製を含有することができる。

【0202】

本明細書において使用される場合、用語「〜に操作可能に連結された」は、核酸の発現がプロモーターにより制御されるように、核酸に対しプロモーターを位置付けることを意味する。

【0203】

細胞内の発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分は、一般に、シグナル配列、タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書に記載の情報から得られる）、エンハンサー要素、プロモーター、および転写停止配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。当業者は、タンパク質の発現のための好適な配列を認識するであろう。例示的なシグナル配列としては、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、Ｉｐｐ、もしくは耐熱性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー、もしくは酸ホスファターゼリーダー）または哺乳動物分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。

【0204】

哺乳動物細胞において活性である例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａおよびＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、またはそれらの活性断片を含むハイブリッド調整要素が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（２９３もしくは懸濁液培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞；新生ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。

【0205】

酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ． ｐｏｍｂｅを含む群から選択される酵母細胞等における発現に好適な典型的なプロモーターは、ＡＤＨ１ プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターを含むが、これらに限定されない。

【0206】

単離された核酸またはそれを含む発現コンストラクトを発現用の細胞に導入する手段は、当業者に既知である。所与の細胞に使用される技術は、既知の成功している技術に基づく。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段は、中でも、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ社、ＭＤ，ＵＳＡ）および／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ社、ＭＤ，ＵＳＡ）の使用等によるリポソームにより媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ−媒介ＤＮＡ取り込み、電気穿孔、およびＤＮＡ被覆タングステンもしくは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．、ＷＩ，ＵＳＡ）の使用等によるマイクロ粒子暴露を含む。

【0207】

タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、使用される細胞型に依存して様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ社）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）等の市販の培地が、哺乳動物細胞の培養に好適である。本明細書において議論される他の細胞型を培養するための培地は、当該技術分野において既知である。

【0208】

タンパク質の単離：
タンパク質を単離するための方法は、当該技術分野において既知であり、および／または本明細書に記載されている。

【0209】

タンパク質が培養培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、まず市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。上述のステップのいずれかにおいて、タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が含まれてもよく、また偶発的な汚染物の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。代替的または付加的に、連続遠心分離を使用して、タンパク質を発現する細胞から上清を濾過および／または分離することができる。

【0210】

細胞から調製されたタンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーもしくはタンパク質Ｇクロマトグラフィー）、または上記の任意の組み合わせを使用して精製され得る。これらの方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４またはＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。

【0211】

また、当業者は、精製または検出を促進するためのタグ、例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、例えばヘキサ−ヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ、またはシミアンウイルス５（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むようにタンパク質を修飾することができることを認識するであろう。得られたタンパク質は、次いで、親和性精製等の当該技術分野において既知の方法を使用して精製される。例えば、ヘキサ−ｈｉｓタグを含むタンパク質は、タンパク質を含む試料を、固体または半固体支持体上に固定化されたヘキサ−ｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と接触させ、試料を洗浄して未結合タンパク質を除去し、その後結合タンパク質を溶出することにより精製される。代替的に、または加えて、親和性精製方法において、タグに結合するリガンドまたは抗体が使用される。

【0212】

タンパク質活性の分析：
Ｇ−ＣＳＦＲおよびその変異体への結合：
本明細書における開示から、当業者には、本開示のいくつかのタンパク質がｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインおよびｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインの特定の変異形態（例えば、ある特定の点変異を有さない、もしくは有する配列番号１）に結合し、ならびに／またはヒトおよびカニクイザルＧ−ＣＳＦＲの両方に結合することが明らかである。タンパク質への結合を評価するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている通りである。そのような方法は、一般に、タンパク質を標識化すること、およびそれを固定化抗原に接触させることを含む。洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、標識の量、および結果として結合タンパク質が検出される。当然ながら、タンパク質が固定化され、抗原が標識化されてもよい。パニング型のアッセイが使用されてもよい。代替的または付加的に、表面プラズモン共鳴アッセイが使用されてもよい。

【0213】

また、上述のアッセイは、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはそのリガンド結合ドメイン（例えば、配列番号１）またはその変異形態に対するタンパク質の結合のレベルを検出するために使用されてもよい。

【0214】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１６７位のリジンがアラニンで置換された、および／または配列番号１の１６８位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１への結合と実質的に同じレベル（例えば、１０％または５％または１％以内）で結合する。

【0215】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の２８７位のアルギニンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約１００倍、または１５０倍、または１６０倍、または２００倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の２８７位のアルギニンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約１６０倍低いレベルで結合する。

【0216】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の２３７位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約２０倍、または４０倍、または５０倍、または６０倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の２３７位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約５０倍低いレベルで結合する。

【0217】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１９８位のメチオニンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約２０倍、または４０倍、または６０倍、または７０倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１９８位のメチオニンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約４０倍低いレベルで結合する。

【0218】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１７２位のチロシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約２０倍、または３０倍、または４０倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１７２位のチロシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約４０倍低いレベルで結合する。

【0219】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１７１位のロイシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約１００倍、または１２０倍、または１３０倍、または１４０倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１７１位のロイシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約１４０倍低いレベルで結合する。

【0220】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１１１位のロイシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約２０倍、または４０倍、または６０倍、または７０倍低いレベルで結合する。一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１１１位のロイシンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも少なくとも約６０倍低いレベルで結合する。

【0221】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１６８位のヒスチジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも多くとも５倍、または４倍、または３倍、または２倍、または１倍低いレベルで結合する。

【0222】

一例において、本開示のタンパク質は、配列番号１の１６７位のリジンがアラニンで置換された配列番号１のポリペプチドに、配列番号１のポリペプチドへの結合よりも多くとも５倍、または４倍、または３倍、または２倍、または１倍低いレベルで結合する。

【0223】

結合のレベルは、バイオセンサを使用して都合よく決定される。

【0224】

本開示は、上記特性の任意の組み合わせを企図する。一例において、本明細書に記載されるタンパク質は、前述の７つの段落に記載の結合特性の全てを有する。

【0225】

エピトープマッピング：
別の例において、本明細書に記載されるタンパク質によって結合されるエピトープがマッピングされる。エピトープマッピング方法は、当業者に明らかである。例えば、対象エピトープを含むｈＧ−ＣＳＦＲ配列またはその領域に及ぶ一連の重複ペプチド、例えば１０〜１５アミノ酸を含むペプチドが生成される。次いで、タンパク質を各ペプチドに接触させ、それが結合するペプチド（複数を含む）が決定される。これにより、タンパク質が結合するエピトープを含むペプチド（複数を含む）の決定が可能となる。複数の不連続ペプチドがタンパク質によって結合される場合、タンパク質は、立体構造エピトープに結合し得る。

【0226】

代替的に、または加えて、ｈＧ−ＣＳＦＲ内のアミノ酸残基は、例えばアラニン系統的変異導入法により変異され、タンパク質結合を低減または防止する突然変異が決定される。タンパク質の結合を低減または防止する任意の突然変異は、タンパク質によって結合されるエピトープ内に存在し得る。

【0227】

さらなる方法が本明細書において例示されるが、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはその領域を本開示の固定化タンパク質に結合させること、および得られた複合体をプロテアーゼで分解させることを含む。次いで、固定化タンパク質に結合した状態のままであるペプチドが単離され、例えば質量分析法を使用して分析され、その配列が決定される。

【0228】

さらなる方法は、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはその領域における水素を重陽子に変換すること、および得られたタンパク質を本開示の固定化タンパク質に結合させることを含む。次いで、重陽子が再び水素に変換され、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはその領域が単離され、酵素で分解され、例えば質量分析法を使用して分析され、本明細書に記載されるタンパク質の結合により水素への変換から保護されている重陽子を含むそれらの領域が同定される。

【0229】

任意選択的に、ｈＧ−ＣＳＦＲまたはそのエピトープのタンパク質の解離定数（Ｋｄ）が決定される。ｈＧ−ＣＳＦＲ結合タンパク質の「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、一例において、放射性標識化または蛍光標識化ｈＧ−ＣＳＦＲ結合アッセイにより測定される。このアッセイは、非標識化ｈＧ−ＣＳＦＲの滴定シリーズの存在下で、タンパク質を最低限の濃度の標識化Ｇ−ＣＳＦＲと平衡化させる。洗浄して未結合ｈＧ−ＣＳＦＲを除去した後、タンパク質のＫｄを示す標識の量が決定される。

【0230】

別の例によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば固定化ｈＧ−ＣＳＦＲまたはその領域を用いたＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定される。

【0231】

いくつかの例において、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇと同様のＫｄまたはそれより高いＫｄを有するタンパク質が選択されるが、これは、それらがｈＧ−ＣＳＦＲへの結合において競合し得るためである。

【0232】

競合的結合の決定：
モノクローナル抗体Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇの結合を競合的に阻害するタンパク質を決定するためのアッセイは、当業者に明らかである。例えば、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇは、検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射性標識にコンジュゲートされる。次いで、標識化抗体および試験タンパク質を、ｈＧ−ＣＳＦＲもしくはその領域（例えば、配列番号１を含むポリペプチド）、またはそれを発現する細胞と混合および接触させる。次いで、標識化Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇのレベルが決定され、タンパク質の非存在下で標識化抗体をｈＧ−ＣＳＦＲ、領域または細胞と接触させた時に決定されたレベルと比較される。タンパク質の非存在下と比較して、標識化Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇのレベルが試験タンパク質の存在下で低減した場合、タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲへのＣ１．２またはＣ１．２Ｇの結合を競合的に阻害するとみなされる。

【0233】

任意選択的に、試験タンパク質は、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇへの異なる標識にコンジュゲートされる。この代替の標識化は、ｈＧ−ＣＳＦＲもしくはその領域または細胞への試験タンパク質の結合のレベルの検出を可能とする。

【0234】

別の例において、タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲ、領域または細胞をＣ１．２またはＣ１．２Ｇと接触させる前に、ｈＧ−ＣＳＦＲもしくはその領域（例えば、配列番号１を含むポリペプチド）、またはそれを発現する細胞に結合させられる。タンパク質の非存在下と比較して、タンパク質の存在下での結合したＣ１．２またはＣ１．２Ｇの量の低減は、タンパク質が、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合するＣ１．２またはＣ１．２Ｇを競合的に阻害することを示す。また、標識化タンパク質を使用して、またＣ１．２またはＣ１．２Ｇを最初にＧ−ＣＳＦＲに結合させて、相互的なアッセイを行うこともできる。この場合、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇの非存在下と比較して、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇの存在下でのｈＧ−ＣＳＦＲに結合した標識化タンパク質の低減された量は、タンパク質がｈＧ−ＣＳＦＲへのＣ１．２またはＣ１．２Ｇの結合を競合的に阻害することを示す。

【0235】

上記アッセイのいずれも、例えば本明細書に記載のように、Ｃ１．２またはＣ１．２Ｇが結合するｈＧ−ＣＳＦＲおよび／または配列番号１および／またはｈＧ−ＣＳＦＲのリガンド結合領域の変異形態を用いて行うことができる。

【0236】

中和の決定：
本開示のいくつかの例において、タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲのシグナル伝達を中和することができる。

【0237】

種々のアッセイが、受容体を介したリガンドのシグナル伝達を中和するタンパク質の能力を評価するための分野において既知である。

【0238】

一例において、タンパク質は、ｈＧ−ＣＳＦＲへのＧ−ＣＳＦの結合を低減または防止する。これらのアッセイは、本明細書に記載のように、標識化Ｇ−ＣＳＦおよび／または標識化タンパク質を使用して競合的結合アッセイとして行うことができる。

【0239】

別の例において、タンパク質は、ＣＤ３４^＋骨髄細胞がＧ−ＣＳＦの存在下で培養される場合、ＣＦＵ−Ｇの形成を低減する。そのようなアッセイにおいて、ＣＤ３４^＋骨髄細胞は、Ｇ−ＣＳＦの存在下で半固体細胞培養培地中（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌの細胞培養培地）、また任意選択的に、試験タンパク質の存在下または非存在下で幹細胞因子（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌの細胞培養培地）中にて培養される。顆粒球クローン（ＣＦＵ−Ｇ）が形成するのに十分な時間の後、クローンまたはコロニーの数が決定される。タンパク質の非存在下と比較したタンパク質の存在下でのコロニーの数の低減は、タンパク質がＧ−ＣＳＦのシグナル伝達を低減することを示す。複数の濃度のタンパク質を試験することにより、ＩＣ_５０、すなわちＣＦＵ−Ｇ形成の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。一例において、ＩＣ_５０は、０．２ｎＭ以下、例えば０．１ｎＭ以下、例えば０．０９ｎＭ以下、または０．０８ｎＭ以下、または０．０７ｎＭ以下、または０．０６ｎＭ以下、または０．０５ｎＭ以下である。一例において、ＩＣ_５０は、０．０４ｎＭ以下である。別の例において、ＩＣ_５０は、０．０２ｎＭ以下である。上記ＩＣ_５０は、本明細書に記載の任意のＣＦＵ−Ｇアッセイに関連する。

【0240】

さらなる例において、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの存在下で培養されるｈＧ−ＣＳＦＲを発現する細胞（例えば、ＢａＦ３細胞）の増殖を低減する。細胞は、Ｇ−ＣＳＦの存在下（例えば、０．５ｎｇ／ｍｌ）、および試験タンパク質の存在下または非存在下で培養される。細胞増殖を評価するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＭＴＴ還元およびチミジン組込みを含む。タンパク質の非存在下で観察されるレベルと比較して増殖レベルを低減するタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和するとみなされる。複数の濃度のタンパク質を試験することにより、ＩＣ_５０、すなわち細胞増殖の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。一例において、ＩＣ_５０は、６ｎＭ以下、例えば５．９ｎＭ以下である。別の例において、ＩＣ_５０は、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．７ｎＭ、または細胞、または０．６ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下である。上記ＩＣ_５０は、本明細書に記載の任意の細胞増殖アッセイに関連する。

【0241】

さらなる例において、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦ投与後に造血幹細胞および／または内皮前駆細胞の動員をｉｎ ｖｉｖｏで低減し、および／または、例えばＧ−ＣＳＦ投与後に（しかしながら、これは必須ではない）好中球の数をｉｎ ｖｉｖｏで低減する。例えば、タンパク質は、任意選択的に、Ｇ−ＣＳＦまたはその修飾形態（例えば、ペグ化Ｇ−ＣＳＦもしくはフィルグラスチム）の投与前、投与時または投与後に、対象に投与される。造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４および／もしくはＴｈｙ１を発現する）ならびに／または内皮前駆細胞（例えば、ＣＤ３４およびＶＥＧＦＲ２を発現する）ならびに／または好中球（形態学的に同定され、および／または、例えば、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ３１および／もしくはＣＤ８８を発現する）の数が評価される。タンパク質の非存在下で観察されるレベルと比較して細胞（複数を含む）のレベルを低減するタンパク質は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達を中和するとみなされる。一例において、タンパク質は、好中球減少症を誘発することなく好中球を低減する。

【0242】

Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達の中和を評価するための他の方法が、本開示により企図される。

【0243】

エフェクター機能の決定：
本明細書において議論されるように、本開示のいくつかのタンパク質は、エフェクター機能を低減した。ＡＤＣＣ活性を評価するための方法は、当該技術分野において既知である。

【0244】

一例において、ＡＤＣＣ活性のレベルは、^５１Ｃｒ放出アッセイ、ユーロピウム放出アッセイまたは^３５Ｓ放出アッセイを使用して評価される。これらのアッセイのそれぞれにおいて、Ｇ−ＣＳＦＲを発現する細胞は、列挙された化合物のうちの１つ以上と共に、化合物が細胞により取り込まれるのに十分な時間および条件下で培養される。^３５Ｓ放出アッセイの場合、ｈＧ−ＣＳＦＲを発現する細胞は、^３５Ｓ標識化メチオニンおよび／またはシステインと共に、標識化アミノ酸が新たに合成されたタンパク質中に組み込まれるのに十分な時間培養される。次いで、細胞は、タンパク質の存在下または非存在下で、ならびに免疫エフェクター細胞、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはＮＫ細胞の存在下で培養される。次いで、細胞培養培地中の^５１Ｃｒ、ユーロピウムおよび／または^３５Ｓの量が検出され、タンパク質の非存在下と比較してタンパク質の存在下において変化がほとんどない、もしくは全くないこと（または、ヒトＩｇＧ１のＦｃを含む抗ｈＧ−ＣＳＦＲ抗体の存在下で観察されるレベルと比較して化合物のレベルが低減されていること）は、タンパク質がエフェクター機能を低減したことを示す。タンパク質により誘発されるＡＤＣＣのレベルの評価のためのアッセイを開示している例示的な出版物としては、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９−７０６３，１９８６およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１，１９８７が挙げられる。

【0245】

タンパク質により誘発されるＡＤＣＣのレベルを評価するための他のアッセイは、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）またはＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＷＩ，ＵＳＡ）を含む。

【0246】

タンパク質がＣ１ｑに結合することができ、またＣＤＣを誘発し得ることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが行われてもよい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが行われてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３，１９９６を参照されたい）。

【0247】

半減期の決定：
本開示により包含されるいくつかのタンパク質は、改善された半減期を有し、例えば、修飾されていないタンパク質と比較してその半減期を延長するように修飾される。改善された半減期を有するタンパク質を決定するための方法は、当業者に明らかである。例えば、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するタンパク質の能力が評価される。この点において、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性は、分子の血清半減期を増加した（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４２９，１９９４を参照されたい）。

【0248】

また、本開示のタンパク質の半減期は、例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：５４２，１９９４により説明される方法に従って、薬物動態試験により測定することができる。この方法によれば、放射性標識化タンパク質がマウスに静脈注射され、その血漿濃度が時間の関数として定期的に、例えば注射後３分〜７２時間の時点で測定される。このようにして得られたクリアランス曲線は、二相性である、すなわちアルファ相およびベータ相を有するはずである。タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の決定のために、ベータ相におけるクリアランス速度が計算され、野生型または非修飾タンパク質のクリアランス速度と比較される。

【0249】

治療有効性の評価：
治療有効性を評価するためのアッセイは、タンパク質による中和の決定に関連して上述されている。

【0250】

別の例において、状態を治療するためのタンパク質の有効性は、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して評価される。

【0251】

例えば、タンパク質は、関節炎の動物モデルにおいて試験される。例示的モデルとしては、マウスのＳＫＧ系統（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２６：４５４−４６０）、ラットＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、またはいくつかの種における抗原誘発関節炎モデル（Ｂｅｎｄｅｌｅ Ｊ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ Ｎｅｕｒｏｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔ；１（４）：３７７−３８５，２００１）が挙げられる。これらのアッセイにおいて、関節炎が誘発され、関節炎の１つ以上の症状、例えば、関節の炎症および／または関節液中の炎症のマーカーを低減するタンパク質の能力が評価される。関節炎の症状を低減するタンパク質は、この状態またはＧ−ＣＳＦによって媒介される状態（例えば、Ｇ−ＣＳＦ媒介炎症性状態）の治療に有用であるとみなされる。

【0252】

タンパク質はまた、または代替的に、例えば非ヒト哺乳動物（例えば、マウス等のげっ歯類）が煙草の煙に暴露されるＣＯＰＤのモデルにおいて試験することができる。暴露後、哺乳動物にタンパク質が投与され、肺炎症のレベルおよび／または肺中の好中球の数が、標準的技法を用いて評価または推定される。肺炎症および／または好中球の数を低減するタンパク質は、肺炎症またはＣＯＰＤまたはＧ−ＣＳＦによって媒介される状態（例えば、Ｇ−ＣＳＦ媒介炎症性肺状態等のＧ−ＣＳＦ媒介炎症性状態）の治療に有用であるとみなされる。

【0253】

本明細書に記載のタンパク質はまた、炎症性神経疾患のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験することができる。例示的なモデルとしてはＥＡＥモデルが挙げられ、マウスまたはラットが髄鞘タンパク質またはそれから得られたペプチド（例えば、ＭＯＧ、ＭＢＰまたはＰＬＰ）で免疫化され、タンパク質に対して免疫応答が生成されて、それによりＭＳのモデルが誘発される。代替的に、髄鞘タンパク質と免疫反応性であるＴ細胞をマウスまたはラットに導入して、ＥＡＥを誘発してもよい。例示的なＥＡＥモデルは、例えばＴｓｕｎｏｄａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｎａｍｉ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．５５：６７３−６８６，１９９６において検討されている。

【0254】

ＭＳの他のモデルは、髄鞘タンパク質、例えば、ＭＯＧ、ＭＢＰまたはＰＬＰに特異的なＴ細胞受容体を発現する形質転換動物を含む。例示的なモデルは、例えば、Ｂｅｔｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＥＭ １９７：１０７３−１０８１，２００３；Ｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１１７４９−１１７５４，２００４；もしくはＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１２：４８１−４８９，２００７に記載されており、または、例えばＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＵＳＡから市販されている（例えば、ＭＯＧと反応する形質転換Ｔ細胞受容体を有するマウス２Ｄ２）。

【0255】

さらなる例において、いずれかの例による本明細書に記載されるタンパク質は、ブドウ膜炎のモデルにおいて試験される。ブドウ膜炎のモデルは、非ヒト哺乳動物を、網膜アレスチン、リカバリンもしくはロドプシン等のタンパク質で免疫化することにより、または細菌内毒素を眼に投与することにより誘発されるものを含む。ブドウ膜炎の例示的なモデルは、例えば、Ｃａｓｐｉ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，３：３−９，２００６に記載されている。

【0256】

本開示のタンパク質はまた、血管新生のモデル、例えば、Ｉｒｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃの眼の血管新生のモデル、もしくはアルギン酸塩カプセル化腫瘍細胞モデルにおいて、および／または、対象における癌細胞の転移する能力を評価することにより試験することができる。

【0257】

治療される状態：
本開示は、対象においてＧ−ＣＳＦにより引き起こされる、または悪化させられる任意の条件の治療または予防を企図する。一例において、状態は、自己免疫性または炎症性状態である。

【0258】

一例において、炎症性または自己免疫性状態は、関節の炎症性状態、例えば炎症性関節炎、関節リウマチまたは特発性関節炎、例えば若年性特発性関節炎である。一例において、状態は、関節リウマチである。

【0259】

一例において、炎症性または自己免疫性状態は、眼の炎症性状態である。例えば、状態は、ブドウ膜炎である。

【0260】

一例において、炎症性または自己免疫性状態は、肺の炎症性状態、例えば好中球浸潤に関連した肺疾患、例えばＣＯＰＤである。一例において、状態は、ＣＯＰＤである。

【0261】

一例において、炎症性または自己免疫性状態は、神経の炎症性状態、例えばデビック病、脳におけるウイルス感染または多発性硬化症である。一例において、状態は、慢性進行性多発性硬化症または再発寛解型多発性硬化症．を含む多発性硬化症である。

【0262】

別の例において、状態は、癌（その血管新生を含む）またはその転移である。

【0263】

一例において、対象は、状態を治療するために使用される別の化合物による治療に耐性を有する、十分に反応しない、または不適切である。例えば、自己免疫性または炎症性状態に罹患する対象は、コルチコステロイド、および／または免疫抑制剤、および／またはシクロホスファミド、および／またはメトトレキセート、および／または抗ＴＮＦ抗体もしくは可溶性ＴＮＦ受容体、および／または抗ＣＤ２０抗体、および／または抗ＩＬ６抗体、および／または抗ＣＤ２２抗体による治療に耐性を有する、十分に反応しない、または不適切である。

【0264】

組成物：
いくつかの例において、本明細書に記載のタンパク質は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、吸着により、吸収により、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、頬内に、経膣的に、心室内に、従来の非毒性の薬学的に許容される担体を含有する投薬製剤としての埋め込み型容器から、または任意の他の従来の投薬形態により投与することができる。本明細書において使用される場合、用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、および頭蓋内注射または注入技法を含む。

【0265】

タンパク質を対象への投与に好適な形態（例えば薬学的組成物）に調製するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）およびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８４）に記載されるような方法を含む。

【0266】

本開示の薬学的組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与、あるいは体腔または器官もしくは関節の内腔への投与に特に有用である。投与用組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、例えば水性担体に溶解したタンパク質の溶液を含む。様々な水性担体、例えば緩衝生理食塩水等を使用することができる。組成物は、生理学的状態に近似するために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有してもよい。これらの製剤中の本開示のタンパク質の濃度は、広く変動することができ、選択される特定の投与形態および患者の必要性に従い、主に流体体積、粘度、体重等に基づいて選択される。例示的な担体は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含む。混合油およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルもまた使用され得る。リポソームも担体として使用され得る。ビヒクルは、等張性および化学的安定性を高める微量の添加剤、例えば、緩衝液および保存料を含有してもよい。

【0267】

製剤化後、本開示のタンパク質は、投薬製剤に適合する様式で、および治療上／予防上効果的であるような量で投与される。製剤は、上述の注射溶液の種類等の様々な投薬形態で容易に投与されるが、他の薬学的に許容される形態、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、または他の経口投与用固形物、坐剤、ペッサリー、点鼻液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態等もまた企図される。薬学的な「持続放出」カプセルまたは組成物も使用され得る。持続放出製剤は、一般に、長期間にわたり一定の薬物レベルを提供するように設計され、本開示の化合物を送達するために使用され得る。

【0268】

ＷＯ２００２／０８０９６７は、例えば喘息の治療のための、抗体を含む組成物およびエアロゾル化された組成物を投与するための方法を記載しており、これもまた本開示のタンパク質の投与に好適である。

【0269】

併用療法：
一例において、本開示のタンパク質は、組み合わされた、もしくは追加的な治療ステップとして、または治療製剤の追加的構成成分として、本明細書に記載の疾患または状態を治療するために有用な別の化合物と併用して投与される。

【0270】

例えば、他の化合物は、抗炎症化合物である。代替的または付加的に、他の化合物は免疫抑制剤である。代替的または付加的に、他の化合物はコルチコステロイド、例えばプレドニゾンおよび／またはプレドニゾロンである。代替的または付加的に、他の化合物はメトトレキセートである。代替的または付加的に、他の化合物はシクロホスファミドである。代替的または付加的に、他の化合物はミコフェノール酸モフェチルである。代替的または付加的に、他の化合物は抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブまたはオファツムマブ）である。代替的または付加的に、他の化合物は抗ＣＤ２２抗体（例えばエプラツズマブ）である。代替的または付加的に、他の化合物は抗ＴＮＦ抗体（例えば、インフリキシマブもしくはアダリムマブもしくはゴリムマブ）または可溶性ＴＮＦ受容体（例えばエタネルセプト）である。代替的または付加的に、他の化合物はＣＴＬＡ−４拮抗薬（例えば、アバタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）である。代替的または付加的に、他の化合物は抗ＩＬ−６抗体である。代替的または付加的に、他の化合物はＢＬｙｓ拮抗薬、例えば抗ＢＬｙｓ抗体（例えばベリムマブ）である。

【0271】

別の例において、他の化合物は、化学療法薬または癌治療に使用される他の薬物である。

【0272】

別の例において、本明細書に記載されるタンパク質は、癌の治療のための放射線療法の前または後に投与される。

【0273】

投与の用量およびタイミング：
本開示のタンパク質の好適な用量は、具体的なタンパク質、治療される状態および／または治療されている対象に依存して変動する。例えば、準最適用量で開始し、用量を増加的に変更して最適または有用な用量を決定することにより好適な用量を決定することは、熟練した医師の能力の範囲内である。代替的に、治療／予防に適切な用量を決定するために、細胞培養アッセイまたは動物試験からのデータが使用され、好適な用量は、毒性をほとんど、または全く有さない活性化合物のＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、使用される投薬形態、および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。治療上／予防上効果的な用量は、まず細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定されるようなＩＣ_５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように調剤され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。

【0274】

いくつかの例において、本開示の方法は、予防上または治療上有効な量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む。

【0275】

用語「治療上有効な量」は、治療を必要とする対象に投与された場合、対象の予後および／もしくは状態を改善する、ならびに／または、本明細書に記載の臨床状態の１つ以上の症状を、その状態の臨床的診断もしくは臨床的特性として観察および認められるレベルを下回るレベルまで低減もしくは阻害する量である。対象に投与される量は、治療される状態の具体的特徴、治療されている状態の種類および段階、投与形態、ならびに対象の特徴、例えば全体的な健康状態、他の疾患、年齢、性別、遺伝子型、および体重等に依存する。当業者は、これらおよび他の因子に依存して適切な用量を決定することができる。したがって、この用語は、本開示を特定の量、例えばタンパク質（複数を含む）の重さまたは量に限定するように解釈されるべきではなく、むしろ、本開示は、対象において上述の結果を達成するために十分なタンパク質（複数を含む）の任意の量を包含する。一例において、タンパク質の治療上効果的な量は、好中球減少症を誘発しない。

【0276】

本明細書において使用される場合、用語「予防上効果的な量」は、臨床状態の１つ以上の検出可能な症状の発生を予防または阻害または遅延させるために十分な量のタンパク質を意味するように解釈されるべきである。当業者は、そのような量が、例えば、投与される特定のタンパク質（複数を含む）、および／または具体的な対象、および／または状態の種類もしくは重傷度もしくはレベル、および／またはその状態になりやすい傾向（遺伝的もしくはその他）に依存して変動することを認識するであろう。したがって、この用語は、本開示を特定の量、例えばタンパク質（複数を含む）の重さまたは量に限定するように解釈されるべきではなく、むしろ、本開示は、対象において上述の結果を達成するために十分なタンパク質（複数を含む）の任意の量を包含する。一例において、タンパク質の予防上効果的な量は、好中球減少症を誘発しない。

【0277】

本明細書に記載のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ投与の場合、通常の用量は、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（個人の体重）またはそれ以上まで変動し得る。例示的な用量およびその範囲は、本明細書に記載される。数日以上にわたる反復投与の場合、治療される疾患または障害の重傷度に依存して、治療は、症状の所望の抑制が達成されるまで持続され得る。

【0278】

いくつかの例において、タンパク質は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ、または約２ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇの初期（または負荷）用量で投与される。次いで、タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇのより低い維持容量で投与され得る。維持用量は、７〜３０日毎に、例えば１０〜１５日毎に、例えば１０日、または１１日、または１２日、または１３日、または１４日、または１５日毎に投与され得る。

【0279】

いくつかの例において、タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、タンパク質は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．２ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ、または１．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、より高い負荷用量もしくはより低い維持容量なしに）の用量で投与される。いくつかの例において、複数の用量が投与され、例えば７〜３０日毎、例えば１０〜２２日毎、例えば１０〜１５日毎、例えば１０日、または１１日、または１２日、または１３日、または１４日、または１５日、または１６日、または１７日、または１８日、または１９日、または２０日、または２１日、または２２日毎に投与される。例えば、タンパク質は、７日毎、または１４日毎、または２１日毎に投与される。

【0280】

いくつかの例において、治療を開始する時点で、哺乳動物に、連続７日以内、または連続６日以内、または連続５日以内、または連続４日以内でタンパク質が投与される。

【0281】

治療に十分に反応しない哺乳動物の場合、１週間に複数の用量が投与されてもよい。代替的に、または加えて、増加する容量が投与されてもよい。

【0282】

別の例において、有害な反応を経験している哺乳動物の場合、初期（または負荷）用量を、１週間で複数の日数にわたり、または複数の連続する日数にわたり分割してもよい。

【0283】

本開示の方法によるタンパク質の投与は、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療もしくは予防であるか、または当業者に既知である他の因子に依存して、連続的または断続的であってもよい。タンパク質の投与は、事前に選択された期間にわたり実質的に連続的であってもよく、または、例えば状態の進行中もしくは進行後における一連の隔てられた用量であってもよい。

【非限定的な例】

【0284】

方法：
Ｇ−ＣＳＦＲのＩｇおよびＣＲＨドメインは、リガンド結合および受容体の二量体化に関与する（Ｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２：２９７３５−２９７４１，１９９７およびＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８５５−２８６５ １９９１）。受容体のこれらの部分を含むＧ−ＣＳＦＲの可溶性形態（Ｃ末端ポリヒスチジンタグまたはＦｃ配列のいずれかを有する）は、受容体の種々の研究において使用されており、受容体の７８位、１６３位、および２２８位における遊離システインの突然変異は、リガンド結合に影響することなく可溶性受容体ポリペプチドの発現および単離を補助する（Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４３：２４５８−２４６４，２００４）。本研究において、突然変異Ｃ７８Ａ、Ｃ１６３ＳおよびＣ２２８Ｓを有するｈＧ−ＣＳＦＲのアミノ酸２５〜３３５を含む受容体の可溶性形態が一般に使用され（例えば配列番号１）、システイン突然変異を有するｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの対応するセグメントが、カニクイザル受容体に対する研究に一般に使用された。配列番号１の可溶性受容体の種々の点変異もまた利用されている。ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃへの言及は、Ｃ末端ポリヒスチジンタグがＦｃ配列と置き換えられた配列番号１のポリペプチドを意味する。ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃは、Ｆｃ配列がそのＣ末端に結合したｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの対応するセグメントを意味する。いくつかの場合において、野生型受容体の対応する細胞外ドメインが使用されており、これらの場合においてはそのことに特に留意されたい。本発明者は、抗体およびその抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ）を含むタンパク質が、野生型ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびこれらの変異タンパク質に極めて類似した親和性で結合することを示した。したがって、変異タンパク質を使用した研究は、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲを使用した研究のモデルである。

【0285】

ファージディスプレイライブラリからのＦａｂの同定：
ファージディスプレイライブラリを、Ｇ−ＣＳＦリガンドの添加後に溶出したｈＧ−ＣＳＦＲに結合するクローンについてスクリーニングした。Ｆａｂを、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合するその能力、完全なＧ−ＣＳＦ結合、およびカニクイザルＧ−ＣＳＦＲ交差反応性について評価し、いくつかのクローンがＩｇＧ４抗体として再フォーマットされた。次いで、Ｇ−ＣＳＦの存在下でＣＦＵ−Ｇ形成を阻害するための、ｈＧ−ＣＳＦＲで安定にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞株におけるＧ−ＣＳＦ媒介増殖の中性化（以下に記載）により、効能を試験した。

【0286】

ＩｇＧ発現のための哺乳動物発現ベクター構築：
標準的分子生物学的技術を用いて、軽鎖全体（可変および定常ドメイン）ならびに重鎖の可変領域を、選択されたファージ由来Ｆａｂコンストラクトからクローニングすることにより、哺乳動物発現ベクターを構築した。

【0287】

細胞培養および一過性トランスフェクション：
無血清懸濁液適応２９３−Ｔ細胞を、Ｇｅｎｅｃｈｏｉｃｅ Ｉｎｃ．から入手した。ペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で細胞を培養した。トランスフェクションの前に、加湿したインキュベータ内で細胞を８％ＣＯ_２の雰囲気で３７℃に維持した。

【0288】

２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、製造者の指示に従い、２９３−Ｔ細胞を使用した哺乳動物発現ベクターの一過性トランスフェクションを行った。５日間のインキュベーション後、細胞培養の上清を、２５００ｒｐｍでの遠心分離により採取し、次いで０．４５μＭフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ社）に通過させてから、ＩｇＧ精製の標準的方法を用いて精製した。

【0289】

対照抗体：
マウスモノクローナル抗体７１１、７４４および７７４（Ｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１４：１１７−１３０，１９９７）を対照マウス抗体として使用した。

【0290】

Ｆａｂの親和性測定：
Ｇ−ＣＳＦＲまたはＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃに対するＦａｂの親和性を測定するために、Ｆａｂを大腸菌において発現させ、親和性をＢｉａｃｏｒｅ ２０００を使用して測定した。

【0291】

ｍＡｂの結合反応速度の測定：
抗ヒト（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ）マウス吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｈ１０５００）または抗マウスＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ｉｎｃ．カタログ番号５１５−００５−０７１）を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ−５センサ表面上に化学的に固定化した。

【0292】

次いで、固定化抗体を使用して、溶液からの抗ｈＧ−ＣＳＦＲ ｍＡｂを捕捉した。次いで、可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲタンパク質（方法の項に記載の通り）を、種々の濃度で捕捉されたｍＡｂ上に注入した。ｍＡｂｓを０．３μｇ／ｍｌで１８０秒間捕捉した。０、１．２５、２．５、５、１０、２０および４０ｎＭの可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲ（２回）を、１０分間注入し、解離を３０分間監視した。参照フローセル（ｍＡｂは捕捉されていないが、それ以外は同一に処理されている）からの反応を差し引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、得られたセンサグラムから差し引いた。

【0293】

最終的な補正された反応を、物質移動制限の項を含めて、非線形回帰を用いて１：１の反応速度を説明するモデルにフィッティングした。捕捉されたｍＡｂのレベルの若干の偏差を考慮するために、Ｒｍａｘ値を局所的にフィッティングした。平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。

【0294】

Ｆａｂ Ｃ１．２、５Ｄ１１、７１１および７４４の反応速度分析：
Ｆａｂ断片をパパイン分解により生成したが、パパイン分解キット（Ｓｉｇｍａ社、ＵＳＡ）を使用して、指示に従い、３ｍｇの抗体を事前に活性化されたパパインで４０分間分解（１：５００）させた。得られたＦａｂを、タンパク質Ａ精製（ｍＡｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ社、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、残留Ｆｃおよび未分解抗体から吸着により精製した。

【0295】

Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＧＥ社、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、Ｆａｂ抗体（０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中１００ｎＭ〜０．３９ｎＭ）の２倍希釈を用い、３０μｌ／分の流量でＦａｂの２回のバイオセンサ分析を行った。対照固定化ブランク、固定化ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ、固定化ヒトＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃおよび固定化ヒトＧ−ＣＳＦＲを含有する各フローセルに対して、結合（１００μｌ）を監視した。ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングキットを使用して、製造者の指示（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ社、Ｓｗｅｄｅｎ）に従い、受容体タンパク質（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中１ｍｌ当たり２０μｇ）をＣＭ５チップに事前に固定化した。標的固定化値は、ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ、ｈＧ−ＣＳＦＲ−ＦｃおよびｈＧ−ＣＳＦＲに対し、それぞれ７００、７００および５００共鳴単位に設定した。チップ固定化は、５０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ８．０）でクエンチした。５０ｍＭリン酸を使用した残りの複合体の脱着の前に、表面結合の解離を１０００秒間監視した。次いで、参照結合を対照チャネルから差し引き、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上でｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて反応速度を生成した。

【0296】

Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用して、抗体（０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中３１２ｎＭ〜２．４ｎＭ）の２倍希釈を用い、３０ｕｌ／分の流量でＩｇＧ４フォーマットにおける抗体ｃ１．２および５Ｄ１１の２回のバイオセンサ分析を行った。対照固定化ブランク、固定化ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ、固定化ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃおよび固定化ｈＧ−ＣＳＦＲを含有する各フローセルに対して、結合（１００μｌ）を監視した。ＮＨＳ／ＥＤＣカップリングキットを使用して、製造者の指示（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ社、Ｓｗｅｄｅｎ）に従い、受容体タンパク質（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中１ｍｌ当たり２０μｇ）をＣＭ５チップに事前に固定化した。標的固定化値は、ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ、ｈＧ−ＣＳＦＲ−ＦｃおよびｈＧ−ＣＳＦＲに対し、それぞれ７００、７００および５００共鳴単位に設定した。チップ固定化は、５０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ８．０）でクエンチした。５０ｍＭリン酸を使用した残りの複合体の脱着の前に、表面結合の解離を１０００秒間監視した。次いで、参照結合を対照チャネルから差し引き、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００上でｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて反応速度を生成した。

【0297】

親和性成熟Ｃ１．２Ｇ抗体のＢＩＡｃｏｒｅ ｍＡｂ反応速度：
抗ヒト（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ）マウス吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｈ１０５００）を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ−５センサ表面上に化学的に固定化し、次いで、１ｍｇ／ｍｌで３分間Ｃ１．２Ｇ親和性成熟抗ｈＧ−ＣＳＦＲ ｍＡｂを捕捉するために使用した。次いで、可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲを、０、１０および４０ｎＭで捕捉されたｍＡｂ上に注入した。可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲを５分間注入し、解離を３０分間監視した。参照フローセル（ｍＡｂは捕捉されていないが、それ以外は同一に処理されている）からの反応を差し引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、得られたセンサグラムから差し引いた。

【0298】

最終的な補正された反応を、物質移動制限の項を含めて、非線形回帰を用いて１：１の反応速度を説明するモデルにフィッティングした。捕捉されたｍＡｂのレベルの若干の偏差を説明するために、Ｒｍａｘ値を局所的にフィッティングした。会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。

【0299】

ｈＧ−ＣＳＦＲ／ＢａＦ３増殖バイオアッセイ−ＭＴＴ還元：
ｈＧ−ＣＳＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅから入手した。抗ｈＧ−ＣＳＦＲ抗体によるＧ−ＣＳＦ媒介増殖を評価するために、抗体の連続希釈物を、９６ウェルプレートにおいて、５％ＦＣＳおよび０．５ｎｇ／ｍｌのｈＧＣＳＦを含むＤＭＥ培地中の２×１０^４細胞／ウェルに添加し、３７℃、１０％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。細胞増殖をＭＴＴ還元により決定し、４９０ｎＭでの吸光度により測定した。

【0300】

ｈＧ−ＣＳＦＲ／ＢａＦ３増殖バイオアッセイ−３Ｈ−チミジン組込み：
ヒトＧ−ＣＳＦＲを発現するように操作され、ヒトＧ−ＣＳＦに応答して増殖するＢＡＦ／３細胞を使用して、Ｇ−ＣＳＦの活性を中和する種々のモノクローナル抗体の能力を測定した。９６ウェルプレートにおいて、ＲＰＭＩ／１０５ＦＣＳ中、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＧ−ＣＳＦおよび増加する濃度の種々の抗Ｇ−ＣＳＦＲモノクローナル抗体の存在下で、細胞を１×１０^４細胞で３７℃で４８時間播種した。培養の最後の６時間の間、細胞に^３Ｈ−チミジンをパルス注入してから、ガラス繊維フィルタ上に採取し、ＤＮＡ中に組み込まれた放射性チミジンのレベルを、液体シンチレーションカウンティングにより決定した。

【0301】

ヒトＣＦＵ−Ｇ前駆細胞バイオアッセイ：
ＣＤ３４^＋骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよび滴定濃度の試験抗体の存在下で、半固体培地中でインキュベートした。１４日間の培養後、ＣＦＵ−Ｇを計数した。

【0302】

エピトープ比較−競合結合：
本実験のこの設計は、２抗体が同時に単一分子に結合することができるためには、それらの２抗体のエピトープが異なっていなければならないということを前提に構築される。

【0303】

表面固定化抗体により、配列番号１の可溶性Ｇ−ＣＳＦＲを溶液から捕捉した。次いで、第２の抗体を複合体上に注入した。参照フローセル（可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲは捕捉されていないが、それ以外は同一に処理されている）からの反応を差し引いた。第２の抗体の結合は２抗体のエピトープが異なることを示す。

【0304】

抗体結合段階の終わりに測定された反応を、ｈＧ−ＣＳＦＲ捕捉段階の終わりの反応で除し、捕捉されたｈＧ−ＣＳＦＲの量に関して抗体結合レベルを補正した。次いで、これらの捕捉補正された反応を使用して、他の抗体の存在下における各抗体のｈＧ−ＣＳＦＲへの結合を比較した。

【0305】

抗体Ｃ１．２、５Ｄ１１、７１１および７４４を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ−５センサ表面上に化学的に固定化した。可溶性ｈＧ−ＣＳＦＲを１００ｎＭで１８０秒間捕捉した。次いで、抗体のそれぞれを、１００ｎＭで１８０秒間捕捉されたｈＧ−ＣＳＦＲ上に２回注入した。緩衝液のみのブランク注入も行った。

【0306】

Ｃ１．２Ｇ、７１１、７４４および７７４のエピトープマッピング：
配列番号１の一連のアラニン点変異を生成し、ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、次いで精製した。抗体Ｃ１．２、７４４および７７４に対するこれらの変異体の結合親和性を測定し、配列番号１の結合親和性と比較した。突然変異が配列番号１の親和性からの２倍を超える親和性の変化をもたらす場合、その残基は、結合相互作用に寄与するとみなされ、したがってエピトープの中またはその近くに存在し得る。突然変異によりもたらされた任意の大きな構造的変化を説明するために、Ｃ１．２、７４４および７７４とは別個の異なるエピトープを有する第３のｍＡｂ（７１１）が対照として含まれた。

【0307】

抗ヒト（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ）マウス吸着、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ｈ１０５００）または抗マウスＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ｉｎｃ．カタログ番号５１５−００５−０７１）を、アミンカップリング化学を使用してＣＭ−５センサ表面上に化学的に固定化した。次いで、固定化抗体を使用して、溶液からの抗ｈＧ−ＣＳＦＲ ｍＡｂを捕捉した。次いで、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲリガンド結合ドメイン（配列番号１）および各アラニン点変異体を、種々の濃度で捕捉されたｍＡｂｓ上に注入した。参照フローセル（ｍＡｂは捕捉されていないが、それ以外は同一に処理されている）からの反応を差し引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、得られたセンサグラムから差し引いた。

【0308】

最終的な補正された反応を、物質移動制限の項を含めて、非線形回帰を用いて１：１の反応速度を説明するモデルにフィッティングした。捕捉されたｍＡｂのレベルの若干の偏差を説明するために、Ｒｍａｘ値を局所的にフィッティングした。会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。

【0309】

Ｃ１．２生殖系列ｍＡｂを０．３ｕｇ／ｍｌで１８０秒間、７１１を１μｇ／ｍｌで１８０秒間、ならびに７４４および７７４を５μｇ／ｍｌで１８０秒間捕捉した。

【0310】

Ｃ１．２および７４４の反応速度においては、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲおよび各ａｌａ変異体を０、２、１０、５０および２５０ｎＭで３００秒間注入し、解離をさらに１８００秒間監視した。

【0311】

抗体７７４の反応速度においては、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲおよび各ａｌａ変異体を０、２、１０、５０および２５０ｎＭで３００秒間注入し、解離をさらに６００秒間監視した。

【0312】

抗体７１１の反応速度においては、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲおよび各ａｌａ変異体を０および１００ｎＭで１８０秒間注入し、解離をさらに１８０秒間監視した。

【0313】

実施例１（完全ヒト抗ｈＧ−ＣＳＦＲ抗体は、Ｇ−ＣＳＦのシグナル伝達の有効な阻害剤である）：
上述の親和性測定およびＢａＦ３増殖アッセイを使用して、抗体７１１および７４４を、ｈＧ−ＣＳＦＲおよびＧ−ＣＳＦ中和アッセイへの親和性について評価した。抗体７１１は、抗体７４４よりも大きい親和性でｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ融合物（方法において議論されたように配列番号１に基づく）に結合することが判明した（それぞれ０．８６ｎＭおよび８．７ｎＭのＫ_Ｄ）。上述のＭＴＴに基づくバイオアッセイを使用して、抗体７１１はまた、抗体７４４よりも有効にＧ−ＣＳＦ媒介細胞増殖を阻害することが判明した（それぞれ８．８ｎＭおよび２．４ｎＭのＩＣ_５０（ｎＭ Ｇ−ＣＳＦ））。

【0314】

^３Ｈ−チミジン組込みアッセイを使用して、抗体７１１は、１０．１μｇ／ｍｌのＩＣ_５０でＧ−ＣＳＦ媒介細胞増殖を阻害することが判明し、抗体７７４は、３７．４μｇ／ｍｌのＩＣ_５０でＧ−ＣＳＦ媒介細胞増殖を阻害することが判明し、抗体７４４のＩＣ_５０は特定不可能であった（図１を参照されたい）。

【0315】

ファージディスプレイライブラリから単離されたヒト抗体（抗体Ｃ１．２および５Ｄ１１）ならびにマウスモノクローナル抗体７１１を、上述のバイオアッセイを使用して、ＢａＦ３細胞のＧ−ＣＳＦ媒介増殖を阻害するそれらの能力について評価した。結果は、抗体Ｃ１．２が０．５ｎＭのＩＣ_５０でＢａＦ３増殖を阻害し、抗体５Ｄ１１が５．９ｎＭのＩＣ_５０で増殖を阻害し、７１１が３．４ｎＭのＩＣ_５０で増殖を阻害することを示した。

【0316】

また、抗体を、上述のようにＧ−ＣＳＦの存在下でのＣＤ３４^＋骨髄細胞によるＣＦＵ−Ｇ形成を低減または阻害するその能力について評価した。結果は、抗体Ｃ１．２が０．０１６ｎＭのＩＣ_５０でＣＦＵ−Ｇ形成を阻害し、抗体５Ｄ１１が０．０３９ｎＭのＩＣ_５０でＣＦＵ−Ｇ形成を阻害し、７１１が０．４１１ｎＭのＩＣ_５０でＣＦＵ−Ｇ形成を阻害することを示した。

【0317】

これらのアッセイに基づき、ヒト抗体Ｃ１．２および５Ｄ１１は、ＣＦＵ−Ｇ形成の阻害において７１１よりも有効であり、Ｃ１．２は両方のバイオアッセイにおいて最も有効な抗体である。

【0318】

実施例２（ヒトＧ−ＣＳＦＲおよびカニクイザルＧ−ＣＳＦＲに対する抗体の親和性）：
５Ｄ１１およびＣ１．２のＦａｂおよびＩｇＧ４形態ならびに７１１および７４４のＦａｂの親和性もまた評価し、ｈＧ−ＣＳＦＲ（配列番号１）、ｈＧ−ＣＳＦＲ−ＦｃおよびカニクイザルＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ（方法において議論されるように配列番号１に基づく）のリガンド結合ドメインに対するそれらの親和性を決定した。これらのアッセイにおいて、Ｇ−ＣＳＦＲの領域を固定化し、示された抗体または断片の固定化ポリペプチドへの結合を、一般的方法（「Ｆａｂ Ｃ１．２、５Ｄ１１、７１１および７４４の反応速度分析」という表題の項）においてより詳細に説明されるように決定した。結果を表１に示す。

【表1】

【0319】

これらのデータは、５Ｄ１１およびＣ１．２がｈＧ−ＣＳＦＲに対する高い親和性を有すること、ならびに、これらの親和性はＦａｂが完全ＩｇＧ４抗体として発現されると改善されることを示している。さらに、５Ｄ１１またはＣ１．２のｈＧ−ＣＳＦＲおよびｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対する親和性が類似している。Ｃ１．２は、ｈＧ−ＣＳＦＲに対して５Ｄ１１よりも高い親和性を有する。

【0320】

抗体７１１のＦａｂは、０．８６ｎＭのｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃに対する親和性、および１．８μＭのｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対する親和性を有することが示された。抗体７４４のＦａｂは、８．７ｎＭのｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃに対する親和性、および＞１０μＭのｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対する親和性を有することが示された。したがって、これらのＦａｂは、ｈＧ−ＣＳＦＲに対して有するものよりもはるかに低い、ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対する親和性を有する。

【0321】

また、相互的なアッセイを行った（すなわち、抗体を固定化し、野生型ｈ−ＧＣＳＦＲまたは野生型ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲの固定化抗体への結合を、一般的方法（「ｍＡｂの結合反応速度の測定」という表題の項）に従い決定した。代表的な結果を表２に示す。

【表2】

【0322】

これらのデータは、Ｃ１．２Ｇおよび５Ｄ１１が、７１１、７４４および７７４よりも高い親和性で野生型ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに結合することを示している。さらに、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲおよび野生型ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対するＣ１．２Ｇの親和性は互いの約３倍以内であり、野生型ｈＧ−ＣＳＦＲおよび野生型ｃｙｎｏＧ−ＣＳＦＲに対する５Ｄ１１の親和性は互いの約１３倍以内である。

【0323】

実施例３（Ｃ１．２の生殖系列化）：
潜在的免疫原性を最小限化するために、Ｃ１．２の可変領域フレームワークを、最も近いヒト生殖系列フレームワークと一致するように変更した。これは、重鎖のフレームワークにおける単一の変更および軽鎖における５つの変更を必要とし、配列番号４に記載の配列を有するＶ_Ｈおよび配列番号５に記載の配列を有するＶ_Ｌをもたらした。Ｇ−ＣＳＦＲに対する生殖系列化抗体（Ｃ１．２Ｇ）の親和性は、Ｃ１．２（ｋ_ａ ９．５４×１０^４±５．５×１０^３；ｋ_ｄ １．３１×１０^−４±２．６×１０^−６；Ｋ_Ｄ １．３７±０．０７（Ｎ＝８））と類似していた。ＢａＦ３細胞の細胞表面上に発現したｈＧ−ＣＳＦＲに対するＣ１．２Ｇの親和性は、２５７ｐＭであることが示された。

【0324】

上述の^３Ｈ−チミジン組込みアッセイを使用して、抗体Ｃ１．２Ｇは、０．８μｇ／ｍｌのＩＣ_５０でＧ−ＣＳＦ媒介細胞増殖を阻害することが判明した（図１）。

【0325】

この抗体の安定化ＩｇＧ４への再フォーマットは、配列番号６４に記載の配列を有する重鎖および配列番号６５に記載の配列を有する軽鎖を含む抗体を生成した。

【0326】

ＣＨＯ細胞内で発現すると、抗体のリジン変種が観察され、すなわち、重鎖の一方または両方がＣ末端リジン残基を欠失していた（すなわち、このようにして配列番号６４に記載の配列を含む）。

【0327】

実施例４（エピトープマッピング）：
競合結合：
公開されているデータは、ｍＡｂ７１１およびｍＡｂ７４４がｈＧ−ＣＳＦＲの異なるドメインに結合することを示している。競合結合実験は、ｍＡｂ７４４ではなくｍＡｂ７１１が、Ｃ１．２Ａｂの結合に続いてｈＧ−ＣＳＦＲに結合することができることを示したが、これは、Ｃ１．２が、ｍＡｂ７４４と同様の受容体の領域であるがｍＡｂ７１１の領域とは異なる領域に結合することを示唆している。

【0328】

Ｃ１．２結合に関与するペプチドを同定するためのエピトープ切断：
エピトープ切断に続く質量分析を使用して、Ｃ１．２の結合に関与するｈＧ−ＣＳＦＲの４つのペプチドを同定した。この方法において、ｈＧ−ＣＳＦＲタンパク質は、まず固定化Ｃ１．２抗体に結合し、次いで、タンパク質分解酵素により分解される。次いで、結合したペプチドがＭＡＬＤＩおよびエレクトロスプレー質量分析により同定される。この手法により同定された４つのペプチドは、ｈＧ−ＣＳＦＲ（配列番号１）の１１１〜１１５、１７０〜１７６、２１８〜２３４および／または２８６〜３００位にマッピングされる。

【0329】

ｈＧ−ＣＳＦＲ領域変異体へのＣ１．２およびｍＡｂ７４４の結合：
公開されているデータ（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：３１３５−３１４０，２００６；Ａｒｉｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ；５６：７５１−７５３ １９９９）は、ｈＧ−ＣＳＦＲ上の表面残基を同定している。エピトープ切断実験により同定された４つのペプチド内に位置する複数のこれらの残基をアラニンで置換し、ｈＧ−ＣＳＦＲの領域の得られた変異形態を発現させ精製した。これらの変異体のそれぞれに対するＣ１．２およびｍＡｂ７４４の結合を評価し、結合に関与する主要な残基を同定した。結果を図２Ａに示す。残基Ｋ１６７およびＨ１６８のアラニン置換は、ｍＡｂ７４４による結合の完全な損失をもたらし、一方Ｃ１．２の結合は影響されなかった。対照的に、残基Ｒ２８７のアラニン置換は、Ｃ１．２による結合の完全な損失をもたらし、ｍＡｂ７４４結合には影響しなかった。Ｃ１．２の結合を大幅に低減した他の残基は、Ｌ１１１、Ｌ１７１、Ｙ１７２、Ｍ１９８およびＨ２３７であった。ＭＡｂ７４４は、野生型受容体の親和性と同様の親和性でこれらの変異体に結合した。

【0330】

ｍＡｂ７７４と共に同じ抗体を用いて上記アッセイを繰り返した。図２Ｂに示されるように、残基Ｋ１６７、Ｈ１６８およびＬ１６９におけるアラニン置換は、ｍＡｂ７７４による結合の完全な損失をもたらし、一方Ｃ１．２の結合は影響されなかった。ｍＡｂ７４４と同様に、残基Ｌ１１１、Ｙ１７２、Ｈ２３７およびＲ２８７のアラニン置換は、ｍＡｂ７７４結合にほとんど、または全く影響しなかった。

【0331】

実施例５（Ｃ１．２Ｇの親和性成熟）：
Ｃ１．２ＧのＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤＲ３における残基を変異体化し、ｈＧ−ＣＳＦＲに結合したＦａｂについてスクリーニングすることにより、親和性成熟を行った。変異抗体のライブラリを、いくつかのパニングラウンドにわたり一定の濃度で、または減少する濃度で、ビオチニル化ｈＧ−ＣＳＦＲ−Ｆｃ組換えタンパク質を使用してパニングした。

【0332】

パニングの終了時に、それぞれの濃縮ライブラリから複数のファージクローンを選択し、配列決定した。次いで、配列に基づき固有のクローンを選択し、（「ｍＡｂの結合反応速度の測定」という表題の項における一般的方法に従う）Ｂｉａｃｏｒｅを使用したｈＧ−ＣＳＦＲに対する結合、およびいくつかの場合においては、ＢａＦ３細胞のＧ−ＣＳＦ媒介増殖を阻害する能力の分析のために、完全ヒトＩｇＧ４／カッパ抗体に再フォーマットした。親Ｃ１．２Ｇ ｍＡｂと比較して改善された親和性を有する再フォーマットされた抗体を表３に列挙する。

【表3】

【0333】

実施例６（Ｃ１．２Ｇは、好中球減少症を誘発することなく好中球レベルを低減する）：
カニクイザルに、ペグ化Ｇ−ＣＳＦを投与し、１２時間後にＣ１．２Ｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。図３に示されるように、Ｃ１．２は、対照動物と比較して好中球のレベルを大幅に低減したが、好中球減少症を誘発しなかった。

【0334】

Ｇ−ＣＳＦの投与の２時間前に、カニクイザルに０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのＣ１．２Ｇを投薬する同様の実験もまた、対照動物と比較して好中球のレベルを低減したが、好中球減少症を誘発しなかった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]