特許 6188880 時計遺伝子発現促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6188880

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】時計遺伝子発現促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9789 20170101AFI20170821BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 36/53 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 36/61 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 8/86 20060101ALI20170821BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20170821BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/9789

   A61P43/00 111

   A61P17/00

   A61K36/53

   A61K36/61

   A61K8/86

   A61Q19/00

【請求項の数】4

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-137430(P2016-137430)

(22)【出願日】2016年7月12日

(62)【分割の表示】特願2013-535637(P2013-535637)の分割

【原出願日】2011年9月29日

(65)【公開番号】特開2016-183189(P2016-183189A)

(43)【公開日】2016年10月20日

【審査請求日】2016年7月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001959

【氏名又は名称】株式会社 資生堂

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100090468

【弁理士】

【氏名又は名称】佐久間 剛

(72)【発明者】

【氏名】合津 陽子

(72)【発明者】

【氏名】土師 信一郎

【審査官】 石川 麻紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−１３９０９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２２０１１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２２５８３７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／９７８９

Ａ６１Ｋ ８／８６

Ａ６１Ｋ ３６／５３

Ａ６１Ｋ ３６／６１

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｑ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラベンダーオイルまたはユーカリオイルを有効成分として含む、Bmal時計遺伝子の発現を促進することにより概日リズムを調整する概日リズム調整剤であって、下記一般式（Ｉ）で示されるアルキレンオキシド誘導体をさらに含み、
Ｒ^１Ｏ−[（ＡＯ）_ｍ（ＥＯ）_ｎ]−Ｒ^２ （Ｉ）
（式中、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、ｍおよびｎはそれぞれ炭素数３〜４のオキシアルキレン基、オキシエチレン基の平均付加モル数で、１≦ｍ≦７０、１≦ｎ≦７０であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基の合計に対するオキシエチレン基の割合は２０〜８０質量％である。オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していてもよい。Ｒ^１およびＲ^２は同一もしくは異なっていてもよい炭素数１〜４の炭化水素基または水素原子であり、Ｒ^１およびＲ^２の炭化水素基数に対する水素原子数の割合が０．１５以下である）
ラベンダーオイルまたはユーカリオイルの配合量が１０〜５０ｐｐｍであり、および前記アルキレンオキシド誘導体の配合量が０．０１質量％〜０．１質量％である、概日リズム調整剤。

【請求項2】

ラベンダーオイルまたはユーカリオイルの配合量が５０ｐｐｍである、請求項１記載の概日リズム調整剤。

【請求項3】

ラベンダーオイルまたはユーカリオイルを有効成分として含む、概日リズムを調整するために使用されるBmal時計遺伝子発現促進剤であって、下記一般式（Ｉ）で示されるアルキレンオキシド誘導体をさらに含み、
Ｒ^１Ｏ−[（ＡＯ）_ｍ（ＥＯ）_ｎ]−Ｒ^２ （Ｉ）
（式中、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、ｍおよびｎはそれぞれ炭素数３〜４のオキシアルキレン基、オキシエチレン基の平均付加モル数で、１≦ｍ≦７０、１≦ｎ≦７０であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基の合計に対するオキシエチレン基の割合は２０〜８０質量％である。オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していてもよい。Ｒ^１およびＲ^２は同一もしくは異なっていてもよい炭素数１〜４の炭化水素基または水素原子であり、Ｒ^１およびＲ^２の炭化水素基数に対する水素原子数の割合が０．１５以下である）
ラベンダーオイルまたはユーカリオイルの配合量が１０〜５０ｐｐｍであり、および前記アルキレンオキシド誘導体の配合量が０．０１質量％〜０．１質量％である、Bmal時計遺伝子発現促進剤。

【請求項4】

ラベンダーオイルまたはユーカリオイルの配合量が５０ｐｐｍである、請求項３記載のBmal時計遺伝子発現促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進する剤ならびに方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

地球上の殆ど全ての生物は体内に約２４時間周期で自律振動する「生体時計」を持っている。生体時計は、概日リズム（サーカディアンリズム）という生物学的な日周変動を引き起こし、生物の睡眠・覚醒サイクルをはじめ、体温、血圧、ホルモン分泌、代謝、さらには、心身の活動、摂食などの、様々な生体現象（活動）の日周変動を支配すると考えられている。近年、概日リズムの乱れが、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、さらには欝病等の精神神経疾患など、様々な心身の症状または疾患の発症要因として指摘されている。

【0003】

生体時計は、「時計遺伝子（クロックジーン）」と呼ばれる遺伝子群を含むリズム発生システムにより制御されている。哺乳類の場合、CLOCK, BMAL, PERIOD, CRYPTOCHROMEの４つのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写の促進/抑制により形成されるフイードバックループが時計分子機構の中核（コア）をなし、これらコアループに関わる遺伝子がうまく発現しないと、欝や生活習慣病をはじめ、様々な疾病を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。

【0004】

概日リズムの制御中枢（中枢時計）は視床下部の視交叉上核に存在しているが、末梢組織においても時計遺伝子が発現し、同様のシステムで概日リズムを形成することが明らかになっている。皮膚でも時計遺伝子は発現しており、他の臓器と同様に、脳内の概日リズム中枢と同調して時計遺伝子がリズムを刻むことにより、生体恒常性が維持されている（非特許文献２）。

【0005】

例えば、ＢＭＡＬ１ノックダウン動物では、皮膚の萎縮や体毛再生の抑制が見られ、時計遺伝子が順調に働かないと、皮膚の健康が損なわれる（非特許文献３）。

【0006】

ヒアルロン酸は、グリコサミノグリカンの一種で、関節をはじめ生体内に広く存在する。皮膚にも存在し、皮膚の保湿や柔軟性に関わっている。さらに、皮膚のヒアルロン酸は約１日単位で代謝され、この素早い代謝により、有害物質の除去など、肌の健康保持に寄与することが報告されている（非特許文献４）。

【0007】

例えば、特許文献１には、イチゴ種子抽出物が、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子等の発現を促進し、保湿作用および美肌作用を有することが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００９−２９８７６５号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Akhilesh B. Reddy, John S. O’Neill, Healthy clocks, healthy body, healthy mind. Trends Cell Biol. 2010 January; 20(1): 36-44

【非特許文献2】Miki Tanioka, Molecular Clocks in Mouse Skin. Journal of Investigative Dermatology (2009), 129, 1225-1231

【非特許文献3】Roman V. Kondratov, Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core component of the circadian clock. GENES & DEVELOPMENT (2006) 20: 1868-1873

【非特許文献4】Raija Tammi, Degradation of Newly Synthesized High Molecular Mass Hyaluronan in the Epidermal and Dermal Compartments of Human Skin in Organ Culture. Invest Dermatol. 97: 126-130, 1991

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者は、特定の植物抽出物が、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進し得ることを見出した。本願発明は、そのような植物抽出物による時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現の促進をより効果的に高め得る剤ならびに方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者は、ラベンダーオイルおよびユーカリオイルが、概日リズム制御のコアループに係るBmal、Period等の時計遺伝子、ならびにヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進し、さらにそれら植物抽出物が、アルキレンオキシド誘導体と配合することにより、より効果的に上記遺伝子の発現を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、ラベンダーオイルおよびユーカリオイルから選択される１種または２種と、下記一般式（Ｉ）で示されるアルキレンオキシド誘導体とを含有することを特徴とする：
Ｒ^１Ｏ−[（ＡＯ）_ｍ（ＥＯ）_ｎ]−Ｒ^２ （Ｉ）
式中、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基、ＥＯはオキシエチレン基、ｍおよびｎはそれぞれ炭素数３〜４のオキシアルキレン基、オキシエチレン基の平均付加モル数で、１≦ｍ≦７０、１≦ｎ≦７０であり、オキシアルキレン基とオキシエチレン基の合計に対するオキシエチレン基の割合は２０〜８０質量％である。オキシアルキレン基とオキシエチレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していてもよい。Ｒ^１およびＲ^２は同一もしくは異なっていてもよい炭素数１〜４の炭化水素基または水素原子であり、Ｒ^１およびＲ^２の炭化水素基数に対する水素原子数の割合が０．１５以下である。

【0013】

また、本発明の皮膚における時計遺伝子および／またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進する方法は、ラベンダーオイルおよびユーカリオイルから選択される１種または２種と、上記一般式（Ｉ）で示されるアルキレンオキシド誘導体とを含有する組成物を皮膚に適用することを特徴とする。

【0014】

ラベンダーオイルおよびユーカリオイルは、Bmal、Period等の時計遺伝子、ならびにヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を共に促進することができ、さらに上記特定のアルキレンオキシド誘導体と組み合わせて配合することにより、その遺伝子発現促進効果を有意に高めることができる。

【発明の効果】

【0015】

本発明は、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を共に促進するラベンダーオイルおよび／またはユーカリオイルと、上記特定のアルキレンオキシド誘導体とを配合することにより、皮膚の時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素の発現を顕著に高めることができ、皮膚の概日リズムを調節して恒常性維持を促進すると共に、皮膚の保湿およびバリア機能に重要な役割を果たすヒアルロン酸の産生を高めて、肌状態を改善し、また健やかな肌状態を維持することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、ラベンダーオイルによる、Bmal1時計遺伝子（Ａ）、Period1時計遺伝子（Ｂ）、およびHAS2ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｃ）の発現促進を示すグラフ

【図2】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、ユーカリオイルによる、Bmal1時計遺伝子（Ａ）、およびHAS2ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｂ）の発現促進を示すグラフ

【図3】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、ラベンダーオイルによるBmal1時計遺伝子（Ａ）、Period1時計遺伝子（Ｂ）、およびHAS2ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｃ）の発現促進に対する、アルキレンオキシド誘導体の効果を示すグラフ

【図4】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、ユーカリオイルによるBmal1時計遺伝子（Ａ）およびHAS2ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｂ）の発現促進に対する、アルキレンオキシド誘導体の効果を示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の時計遺伝子発現促進剤およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、ラベンダーオイルおよび／またはユーカリオイルを有効成分として含有する。これら精油はいずれも市販されているが、以下に簡単に説明する。

【0018】

ラベンダーオイルは、シソ科に属する小潅木であるラベンダー(Lavandula officinalis)の刈り取った花を水蒸気蒸留して得られる精油である。

【0019】

ユーカリオイルは、フトモモ科に属する常緑喬木であるユーカリ(例えば、Eucalypus globulus)の葉や小枝などを水蒸気蒸留して得られる精油である。

【0020】

本発明において、ラベンダーオイルおよびユーカリオイルは、それぞれ1種単独で用いても、あるいは２種を組み合わせて用いてもよい。

【0021】

さらに、本発明の時計遺伝子発現促進剤等は、上記一般式（Ｉ）で示される特定のアルキレンオキシド誘導体を必須成分として含有する。

【0022】

本発明で使用する上記のアルキレンオキシド誘導体において、ＡＯは炭素数３〜４のオキシアルキレン基であり、具体的には、例えば、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシイソブチレン基、オキシトリメチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。好ましくは、ＡＯは、オキシプロピレン基、オキシブチレン基である。

【0023】

ｍは炭素数３〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、１≦ｍ≦７０、好ましくは２≦ｍ≦２０である。ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数であり、１≦ｎ≦７０、好ましくは２≦ｎ≦２０である。炭素数３〜４のオキシアルキレン基またはオキシエチレン基が７０を越えるとべたつき感がでてくる傾向がある。

【0024】

また、炭素数３〜４のオキシアルキレン基とオキシエチレン基の合計に対するオキシエチレン基の割合は、２０〜８０質量％である。オキシエチレン基の割合が２０質量％未満であると、皮膚外用剤として使用した場合に、しっとり感に劣る傾向にあり、８０質量％を超えるとすべすべ感が劣る傾向にある。

【0025】

エチレンオキシドおよび炭素数３〜４のアルキレンオキシドの付加する順序は特に指定はない。またオキシエチレン基と炭素数３〜４のオキシアルキレン基はブロック状に付加していてもランダム状に付加していてもよく、ブロック状には２段ブロックのみならず、３段以上のブロックも含まれる。尚、ブロック状に付加されたものよりも、ランダム状に付加されているものを用いた方が、特に皮膚外用剤として使用した場合に、使用感触に優れているため、ランダム状に付加されているものが好ましい。

【0026】

Ｒ^１およびＲ^２は炭素数１〜４の炭化水素基もしくは水素原子で、炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。好ましくはメチル基、エチル基である。炭素数５以上の炭化水素基では親水性が低下し、皮膚外用剤として使用した場合に、しっとり感が低下する。Ｒ^１およびＲ^２は、同一であっても異なっていてもよい。

【0027】

Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ同種のものを用いても、炭素数１〜４の炭化水素基と水素原子とが混在しても、異種の炭素数１〜４の炭化水素基が混在してもよい。ただし、Ｒ^１およびＲ^２の炭化水素基のうち、炭化水素基と水素原子の存在割合は、炭化水素基の数（Ｘ）に対する水素原子の数（Ｙ）の割合Ｙ／Ｘが０．１５以下であることが好ましく、より好ましくは０．０６以下である。Ｙ／Ｘの割合が０．１５を越えると、べたつき感がでてくる傾向がある。

【0028】

本発明で使用する上記アルキレンオキシド誘導体として、特に限定はされないが、例えばＰＯＥ（１４）ＰＯＰ（７）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（１０）ＰＯＰ（１０）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（７）ＰＯＰ（１２）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（２５）ＰＯＰ（２５）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（２７）ＰＯＰ（１３）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（５５）ＰＯＰ（２８）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（３６）ＰＯＰ（４１）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（１４）ＰＯＢ（７）ジメチルエーテル、ＰＯＥ（１０）ＰＯＰ（１０）ジエチルエーテル、ＰＯＥ（１０）ＰＯＰ（１０）ジプロピルエーテル、ＰＯＥ（１０）ＰＯＰ（１０）ジブチルエーテル等が挙げられる（尚、上記ＰＯＥ、ＰＯＰ、ＰＯＢは、それぞれポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレンの略である）。

【0029】

本発明で使用する上記のアルキレンオキシド誘導体は、公知の方法で製造することができる。例えば、水酸基を有している化合物にエチレンオキシドおよび炭素数３〜４のアルキレンオキシドを付加重合した後、ハロゲン化アルキルをアルカリ触媒の存在下にエーテル反応させることによって得ることができる。あるいは、市販されているものを用いてもよい。

【0030】

本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、本発明の効果を損なわない限り、上記の必須成分に加えて任意の他の成分を含んでいてよい。また、単独で用いてもよいが、他の時計遺伝子の発現調節作用を有する薬剤、あるいはヒアルロン酸の産生を促進する薬剤等と組み合わせて使用してもよい。

【0031】

本願発明において、ラベンダーオイルまたはユーカリオイル（精油）と、アルキレンオキシド誘導体の配合の比率は、本願発明の効果を達成できる限り限定されないが、好ましくは、精油：アルキレンオキシド誘導体の質量比で、0.001：1〜10：1、より好ましくは0.01：1〜1：1である。斯かる配合比率で、より高い遺伝子発現促進効果を得ることができる。

【0032】

本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、限定はされないが、皮膚外用剤に配合して用いることが好ましい。時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を共に促進するラベンダーオイルおよび／またはユーカリオイルと、上記特定のアルキレンオキシド誘導体とを配合した組成物を皮膚に適用することにより、皮膚の概日リズムを調節して恒常性維持を促進すると共に、皮膚の保湿およびバリア機能に重要な役割を果たすヒアルロン酸の産生を高めて、健やかな肌状態を維持することが可能である。

【0033】

皮膚外用剤に配合する場合、有効成分であるラベンダーオイルまたはユーカリオイルの配合量は、本願発明の効果を発揮できる限り限定はされないが、通常、皮膚外用剤全質量に対して０．１〜１０００ｐｐｍであり、より好ましくは、１０〜５００ｐｐｍである

【0034】

また、皮膚外用剤に配合する場合、アルキレンオキシド誘導体の配合量は、本願発明の効果を発揮できる限り限定はされないが、全質量に対して、好ましくは０．００１〜６０質量％であり、より好ましくは０．０１〜１０質量％である。０．００１質量％未満では、効果を発揮できない場合があり、また６０質量％を超えて配合するとべたつき感を生じる場合がある。

【0035】

皮膚外用剤に配合する場合、その剤形（例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、エアゾール剤、固形剤、ジェル剤、パッチ剤、坐剤等）や、製品形態（例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等）に応じて、通常そのような皮膚外用剤に含まれる任意の成分を、本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤と共に含んでいてよい。皮膚外用剤は、皮膚（頭皮、頭髪、爪も含む）に対して適用する組成物全般を包括する概念であり、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料、皮膚もしくは毛髪洗浄料等の化粧料や、軟膏剤、パッチ剤、坐剤、歯磨等の種々の医薬品ないし医薬部外品等を含む。その剤形も特に限定されず、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層など、任意の剤型を含む。皮膚外用剤が化粧料である場合、例えば、香水、オードトワレ、オーデコロン、クリーム、乳液類、化粧水、ファンデーション類、粉白粉、口紅、石鹸、シャンプー・リンス類、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ボディーパウダー類、浴剤類等が挙げられる。

【0036】

尚、本発明の使用態様を例示したが、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を達成できる限り、任意の態様で用いることができる。また、本発明の遺伝子発現促進剤の他に、具体的な態様に応じて、他の任意の薬剤等を本発明の効果を損なわない限り、配合することができる。

【0037】

本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤やそれを配合した対象物の具体的な適用は、概日リズムの調整および／またはヒアルロン酸の産生に関連するものであれば特に限定されない。特に、皮膚における概日リズムの調整および／またはヒアルロン酸の産生促進に有用であり、例えば、肌の保湿や柔軟性向上、しわの予防または改善、肌荒れなどの皮膚諸症状の予防、改善または治療等に適用できる。

【0038】

本発明において、時計遺伝子は、限定はされないが、例えば、Bmal(Bmal1, Bmal2)、Period（Period1, Period2, Period3）、Clock、Cryptochrome、albumin site D-binding protein (Dbp)、E4BP4、Npas2、Rev-erbなどを含み、中でも、生体時計のコア遺伝子であるBmal、Period、Clockおよび／またはCryptochrome、特にBmalおよび／またはPeriodを含む。

【実施例】

【0039】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。尚、評価に用いる培養細胞として、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、色素細胞、脂肪細胞、神経細胞など各種細胞を用いることができるが、本実施例ではヒト皮膚線維芽細胞を用いて評価を行なった。いずれの生物種および細胞種においても時計遺伝子のコアシステムは共通であるため、ヒト皮膚線維芽細胞での評価結果は、他の生物種および細胞種にも反映できると考えられる。

【0040】

また、時計遺伝子として、コアシステムに関わるBmal遺伝子（Bmal1で代表させた）あるいはPeriod遺伝子（Period1で代表させた）の発現量を測定した。ヒアルロン酸合成酵素遺伝子としては、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子２（HAS2）を測定した。データは示していないが、我々は、培養ヒト皮膚線維芽細胞の系において、コルチゾールまたはフォルスコリンを刺激薬剤として用いて、Bmal1とHAS2は薬剤による刺激の約１６時間後に、またPeriod1は２時間後に、発現量がピークとなる概日リズムを刻むことを確認しており、以下の実験では、それぞれ刺激の１６時間後または２時間後の遺伝子発現量を指標として、試験物質のBmal遺伝子、Period遺伝子、およびHAS2遺伝子の発現促進効果について評価した。

【0041】

ラベンダーオイルおよびユーカリオイルによる、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進効果の評価
培養ヒト皮膚線維芽細胞は、市販の正常成人皮膚由来線維芽細胞を購入し（Cell Application, Inc）、実験に用いた。10%FBS、20mM HEPES、 Glutamax、抗菌剤を添加したDMEM培地に播種し、37℃、5%CO₂にて培養した。培養６日目に、各濃度のラベンダーオイル（0、10、25、50ppm）またはユーカリオイル（0、25、50、100ppm）を含む試験用培地に交換し、交換直後を0時間とし、２時間後および１６時間後に細胞をサンプリングした。採取した細胞から、市販のRNA抽出キットを使用してRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法により、時計遺伝子（Period1、Bmal1）およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子（HAS2）の発現量を測定した。同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロール（精油の添加なし）と比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果有りと判定した。

【0042】

ラベンダーオイルの結果を図１（Ａ〜Ｃ）に、またユーカリオイルの結果を図２（Ａ，Ｂ）に示す。Bmal1およびHAS2は刺激の１６時間後、Period１は刺激の２時間後の結果をそれぞれ示す。図面中、有意差は*（P<0.05）および**（P<0.01）で示す。

【0043】

図１に示すように、ラベンダーオイルはBmal1, Period1およびHAS2の発現をいずれも有意に高め、また、図２に示すように、ユーカリオイルもBmal1およびHAS2の発現を高め、それら精油が時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を共に促進し得ることが示された。

【0044】

ラベンダーオイルおよびユーカリオイルによる時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進に対するアルキレンオキシド誘導体の効果の評価
アルキレンオキシド誘導体をラベンダーオイルまたはユーカリオイルと共に配合することによる、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進に対する効果について評価した。尚、アルキレンオキシド誘導体として、ポリオキシエチレン（１４モル）ポリオキシプロピレン（７モル）ジメチルエーテル（ランダムポリマー）を用いた。

【0045】

上記と同様の方法により、正常成人皮膚由来線維芽細胞（Cell Application, Inc）を播種し、培養６日目に、所定濃度のアルキレンオキシド誘導体（0〜0.1%）と、各濃度のラベンダーオイル（0、10、25、50ppm）またはユーカリオイル（0、25、50、100ppm）を含む試験用培地に交換し、交換直後を0時間とし、２時間後および１６時間後に細胞をサンプリングした。上記と同様に、採取した細胞から、市販のRNA抽出キットを使用してRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりBmal1、Period1、HAS2、ならびにハウスキーピング遺伝子としてのRPLP0の遺伝子発現量を測定し、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロール（各濃度の精油について、アルキレンオキシド誘導体の添加無し）と比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果有りと判定した。

【0046】

ラベンダーオイルの結果を図３（Ａ〜Ｃ）に、またユーカリオイルの結果を図４（Ａ、Ｂ）に示す。Bmal1およびHAS2は刺激の１６時間後、Period１は刺激の２時間後の結果をそれぞれ示す。図面中、有意差は*（P<0.05）および**（P<0.01）で示す。

【0047】

図３（Ａ〜Ｃ）に示すように、ラベンダーオイルと共にアルキレンオキシド誘導体を配合することにより、ラベンダーオイル単独の場合（アルキレンオキシド誘導体０％）と比較して、Bmal1、Period1およびHAS2の発現が有意に高められた。また、図４（Ａ）に示すように、ユーカリオイルと共にアルキレンオキシド誘導体を配合することにより、ユーカリオイル単独の場合（アルキレンオキシド誘導体０％）と比較して、Bmal1の発現が有意に高められた。

【0048】

上記の結果から、ラベンダーオイルまたはユーカリオイルと共にアルキレンオキシド誘導体を配合することにより、より効果的に時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進することができ、皮膚の概日リズムを調整すると共に、皮膚のヒアルロン酸産生を高めて皮膚機能を改善または向上させ得ることが示された。

【0049】

（処方例）
以下に、本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の処方例を示す。

【0050】

処方例１ 質量（％）
ユーカリオイル ０．１
ＣＨ_３Ｏ（ＥＯ）_１０（ＰＯ）_１０（ＥＯ）_１０ＣＨ_３ １．０

【0051】

処方例２ 質量（％）
ラベンダーオイル ０．４
ＣＨ_３Ｏ（ＥＯ）_１４（ＰＯ）_７ＣＨ_３ １．０

【0052】

処方例３ 質量（％）
ラベンダーオイル １．０
ＣＨ_３Ｏ［（ＥＯ）_２０／（ＰＯ）_１０］ＣＨ_３ ２０．０

【0053】

処方例４ 質量（％）
ユーカリオイル ０．２
ラベンダーオイル ０．５
ＣＨ_３Ｏ（ＥＯ）_１４（ＰＯ）_７ＣＨ_３ １０．０

【0054】

（配合例）
以下に、本発明の時計遺伝子発現促進剤またはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の配合例を適用例として示す。配合量は全て製品全量に対する質量％で表す。

【0055】

化粧水 質量％
（１）グリセリン ２．０
（２）ジプロピレングリコール ２．０
（３）ポリエチレングリコール−６０水添ヒマシ油 ０．３
（４）キシリトール ３
（５）アスコルビン酸 ０．００５
（６）エデト酸３ナトリウム ０．１
（７）染料 ０．１
（８）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例１） ０．５
（９）精製水 残量

【0056】

乳液 質量％
（１）エチルアルコール １０．０
（２）グリセリン ３．０
（３）ブチレングリコール ２．０
（４）ポリエチレングリコール ３．０
（５）カルボキシビニルポリマー ０．１
（６）アクリル酸／アクリル酸アルキルコポリマー ０．１
（７）水酸化カリウム ０．１
（８）シクロメチコン ４．０
（９）スクワラン ２．０
（１０）球状ポリエチレン ２．０
（１１）メントール ０．５
（１２）薬剤 ０．１
（１３）パラベン ０．１
（１４）エデト酸３ナトリウム ０．１
（１５）顔料 ０．１
（１６）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例２） １．０
（１７）精製水 残量

【0057】

クリーム 質量％
（１）グリセリン １０．０
（２）ブチレングリコール ５．０
（３）カルボマー ０．１
（４）水酸化カリウム ０．２
（５）ステアリン酸 ２．０
（６）ステアリン酸グリセリル ２．０
（７）イソステアリン酸グリセリル ２．０
（８）ワセリン ５．０
（９）防腐剤 ０．１
（１０）酸化防止剤 ０．１
（１１）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例３） １．０
（１２）キレート剤 １．０
（１３）顔料 ０．０１
（１４）ステアリルアルコール ２．０
（１５）ベヘニルアルコール ２．０
（１６）オレンジ油 ０．０１
（１７）パーム硬化油 ２．０
（１８）スクワラン １０．０
（１９）４−メトキシサリチル酸カリウム ３．０
（２０）精製水 残量

【0058】

クリーム 質量％
（１）グリセリン ３．０
（２）ジプロピレングリコール ７．０
（３）ポリエチレングリコール ３．０
（４）ステアリン酸グリセリル ３．０
（５）イソステアリン酸グリセリル ２．０
（６）ステアリルアルコール ２．０
（７）ベヘニルアルコール ２．０
（８）流動パラフィン ７．０
（９）シクロメチコン ３．０
（１０）ジメチコン １．０
（１１）オクチルメトキシシンナメート ０．１
（１２）ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
（１３）防腐剤 ０．１
（１４）酸化防止剤 ０．１
（１５）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例４） ０．４
（１６）キレート剤 １．０
（１７）顔料 ０．０１
（１８）精製水 残量

【0059】

ジェル 質量％
（１）エチルアルコール １０．０
（２）グリセリン ５．０
（３）ブチレングリコール ５．０
（４）カルボマー ０．５
（５）アミノメチルプロパノール ０．３
（６）ポリエチレングリコール−６０水添ヒマシ油 ０．３
（７）メントール ０．０２
（８）オレンジ油 ０．０５
（８）防腐剤 ０．０５
（９）キレート剤 １．０
（１０）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例２） １．０
（１１）精製水 残量

【0060】

マッサージ用ジェル 質量％
（１）エリスリトール ２．０
（２）カフェイン ５．０
（３）オウバク抽出物 ３．０
（４）グリセリン ５０．０
（５）カルボキシビニルポリマー ０．４
（６）ポリエチレングリコール４００ ３０．０
（７）エデト３ナトリウム ０．１
（８）ポリオキシレン（１０）メチルポリシロキサン共重合体 ２．０
（９）スクワラン １．０
（１０）水酸化カリウム ０．１５
（１１）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例１） １．０

【0061】

マッサージクリーム 質量％
（１）固形パラフィン ５．０
（２）ミツロウ １０．０
（３）ワセリン １５．０
（４）流動パラフィン ４１．０
（５）１．３−ブチレングリコール ４．０
（６）モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル ２．０
（８）ホウ砂 ０．２
（９）カフェイン ２．０
（１０）防腐剤 適量
（１１）酸化防止剤 適量
（１２）本発明の遺伝子発現促進剤（処方例２） １．０
（１３）精製水 残余

【0062】

これら配合例の製品は、それぞれの製品形態の典型的な使用態様により皮膚に適用して、時計遺伝子およびヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進し、皮膚の概日リズムを調整し、また皮膚のヒアルロン酸産生を高めて、肌状態を改善し、また健やかな肌状態を維持することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】