特許 6189281 ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6189281

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20170821BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20170821BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170821BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20170821BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20170821BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20170821BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   C07K16/32

   C12N15/00 A

   A61K39/395 N

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P19/08

   A61P37/00

   !C12P21/08

【請求項の数】11

【外国語出願】

【全頁数】154

(21)【出願番号】特願2014-254993(P2014-254993)

(22)【出願日】2014年12月17日

(62)【分割の表示】特願2010-521980(P2010-521980)の分割

【原出願日】2008年8月19日

(65)【公開番号】特開2015-107118(P2015-107118A)

(43)【公開日】2015年6月11日

【審査請求日】2015年1月15日

(31)【優先権主張番号】60/957,148

(32)【優先日】2007年8月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/084,588

(32)【優先日】2008年7月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ケネス・アラン・ブラゼル

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン・フォスター

(72)【発明者】

【氏名】ダグラス・パット・セレッティー

(72)【発明者】

【氏名】ジリン・サン

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ・エフ．・スモーザーズ

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー・メーリン

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５１９１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BLOOD，１９８９年 ５月１５日，Vol.73, No.7，p.1786-1793

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトｃ−ｆｍｓポリペプチドに特異的に結合する抗原結合性タンパク質であって、
（Ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメインであって、
ＣＤＲＨ１は、配列番号１４７で表されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＨ２は、配列番号１６３で表されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲＨ３は、配列番号１８６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び
（Ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメインであって、
ＣＤＲＬ１は、配列番号１９３で表されるアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ２は、配列番号２１４で表されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲＬ３は、配列番号２２８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
を含む、抗原結合性タンパク質。

【請求項2】

重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。

【請求項3】

２つの同一のＶＨおよび２つの同一のＶＬを含む抗体である請求項２に記載の抗原結合性タンパク質。

【請求項4】

患者においてｃ−ｆｍｓと関連する状態を治療または予防するための医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離された抗原結合性タンパク質の有効量を含む医薬組成物であって、
ｃ−ｆｍｓに関連する状態が、骨疾患、炎症性疾患、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮内膜腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、食道扁平上皮細胞癌、胃癌、星状細胞癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される、医薬組成物。

【請求項5】

ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外部分へのＣＳＦ−１の結合を阻害する医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項6】

ヒトｃ−ｆｍｓの自己リン酸化を阻害するための医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項7】

単球走化性を低減するための医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項8】

腫瘍への単球移動を阻害するための医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項9】

腫瘍関連マクロファージの腫瘍における蓄積を阻害するための医薬組成物であって、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項10】

追加の活性剤をさらに含む、請求項４から請求項９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記追加の活性剤が、放射性同位体、放射性核種、毒素からなる群、または治療薬および化学療法薬の群から選択されるいずれか１つである、請求項１０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の引用）
本願は、２００７年８月２１日に出願された米国仮出願第６０／９５７，１４８号および２００８年７月２９日に出願された米国仮出願第６１／０８４，５８８号に対する優先権を主張する。これらの出願は、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。

【背景技術】

【0002】

多くのヒトおよびマウスの腫瘍細胞系は、それに代わって受容体ｃ−ｆｍｓ（ネコ科のＭｃＤｏｎｏｕｇｈ株）を通して単球／マクロファージ細胞を誘引し、生存を促進し、活性化する、サイトカインＣＳＦ−１（コロニー刺激因子−１、別名マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦ）を分泌する。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）（別名、腫瘍浸潤性マクロファージ（ＴＩＭ））は、細胞腫瘤の５０％程を構成する腫瘍間質の主要成分であることができる。非特許文献１、非特許文献２。原発性ヒト腫瘍の調査では、ＣＳＦ−１ ｍＲＮＡの発現の広範囲にわたる証拠がある。さらに、多くの研究は、上昇した血清ＣＳＦ−１、ＴＡＭ数、または組織ＣＳＦ−１および／またはｃ−ｆｍｓの存在が、癌患者の劣る予後と関連していることを証明した。

【0003】

ＴＡＭは、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよびＥＧＦの分泌を通す腫瘍細胞に対する直接マイトジェン活性、ならびにＥＣＭ分解酵素の生成を通す転移を含む、様々な手段によって腫瘍の増殖、転移および生存を支える（非特許文献３および非特許文献４に総説されている）。ＴＡＭによる腫瘍支援の別の重要な手段は、様々な新脈管形成促進因子、例えばＣＯＸ−２、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、一酸化窒素、脈管形成因子およびＭＭＰの生成による腫瘍の新血管形成への寄与である。非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７。さらに、ＣＳＦ−１が誘導するマクロファージは、様々な因子、例えばプロスタグランジン、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ、一酸化窒素、ＩＬ−１０およびＴＧＦβの生成を通じて免疫抑制性であることができる。非特許文献６、非特許文献８。

【0004】

ＣＳＦ−１は、膜結合サイトカインおよび溶解性サイトカインの両方として発現され（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）、マクロファージおよびそれらの前駆体の生存、増殖、走化性および活性化を調節する（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。

【0005】

ｃ−ｆｍｓプロトオンコジーン（別名Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＳＦ−１ＲまたはＣＤ１１５）である同種受容体は、関連するチロシンキナーゼ活性を有する１６５ｋＤの糖タンパク質であり、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｌｔ３およびｃ−キットを含むクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼファミリーに属する。非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１。ネコ肉腫ウイルスのＭｃＤｏｎｏｕｇｈ株が保有するｃ−ｆｍｓ、ｖ−ｆｍｓの腫瘍発生形は、突然変異されて、構成的に活性化されたタンパク質キナーゼ活性を与える（非特許文献２０、非特許文献２２）。正常細胞でのｃ−ｆｍｓの発現は、骨髄単球性細胞（単球、組織マクロファージ、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、ミクログリア細胞および破骨細胞を含む）、造血前駆体およびトロホブラストに限定される。非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５。ｃ−ｆｍｓの発現は、一部の腫瘍細胞でも証明されている（非特許文献２６）。突然変異体マウスの様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ研究および分析は、ＣＳＦ−１がｃ−ｆｍｓのリガンドであることを証明する（例えば、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０を参照）。ｃ−ｆｍｓへのＣＳＦ−１の結合は、Ｐ３Ｋ／ＡＫＴおよびＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫを含むシグナル伝達経路の下流活性化をもたらす特定部位の受容体の自己リン酸化を誘導し、マクロファージ分化は主に持続的なＭＥＫ活性を通して媒介される（非特許文献３１）。非常に最近の証拠は、インターロイキン−３４（ＩＬ−３４）もｃ−ｆｍｓのリガンドであることを示す（非特許文献３２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｋｅｌｌｙら、１９８８年、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５７巻：１７４〜１７７頁

【非特許文献2】Ｌｅｅｋら、１９９４年、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ．５６巻：４２３〜４３５頁

【非特許文献3】ＬｅｅｋおよびＨａｒｒｉｓ、２００２年、Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ７巻：１７７〜１８９頁

【非特許文献4】ＬｅｗｉｓおよびＰｏｌｌａｒｄ、２００６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６巻：６０５〜６１２頁

【非特許文献5】Ｄｒａｎｏｆｆら、２００４年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ４巻：１１〜２２頁

【非特許文献6】ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇら、１９９７年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５巻：３２３〜３５０頁

【非特許文献7】Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、１９９２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １３巻：２６５〜２７０頁

【非特許文献8】Ｂｒｏｎｔｅら、２００１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４巻：４３１〜４４６頁

【非特許文献9】Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、１９８８年、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５巻：７６１〜７７０頁

【非特許文献10】Ｄｏｂｂｉｎら、２００５年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１巻：２４３０〜２４３７頁

【非特許文献11】Ｗｏｎｇら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６巻：４３２５〜４３２９頁

【非特許文献12】Ｂｏｕｒｅｔｔｅら、２０００年、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７巻：１５５〜１６６頁

【非特許文献13】Ｃｅｃｃｈｉｎｉら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０巻：１３５７〜１３７２頁

【非特許文献14】Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９９７年、Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ．６２巻：１４５〜１５５頁

【非特許文献15】Ｈｕｍｅ、１９８５年、Ｓｃｉ． Ｐｒｏｇ．６９巻：４８５〜４９４頁

【非特許文献16】ＳａｓｍｏｎｏおよびＨｕｍｅ、Ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｓ．、Ｇｏｒｄｏｎ， Ｓ．およびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ， Ｒ．編）７１〜９４頁（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００４年）

【非特許文献17】ＲｏｓｓおよびＡｕｇｅｒ、Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（Ｂｕｒｋｅ， Ｂ．およびＬｅｗｉｓ， Ｃ．編）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００２年）

【非特許文献18】Ｂｌｕｍｅ−ＪｅｎｓｅｎおよびＨｕｎｔｅｒ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ ４１１巻：３５５〜３６５頁

【非特許文献19】ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２年、Ｎｅｕｒｏｎ ９巻：３８３〜３９１頁

【非特許文献20】Ｓｈｅｒｒら、１９８５年、Ｃｅｌｌ ４１巻：６６５〜６７６頁

【非特許文献21】ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒら、１９９４年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１０巻：２５１〜３３７頁

【非特許文献22】ＲｏｕｓｓｅｌおよびＳｈｅｒｒ、２００３年、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２巻：５〜６頁

【非特許文献23】Ａｒａｉら、１９９９年、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１９０巻：１７４１〜１７５４頁

【非特許文献24】Ｄａｉら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ９９巻：１１１〜１２０頁

【非特許文献25】ＰｉｘｌｅｙおよびＳｔａｎｌｅｙ、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４巻：６２８〜６３８頁

【非特許文献26】Ｋｉｒｍａら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７巻：１９１８〜１９２６頁

【非特許文献27】ＢｏｕｒｅｔｔｅおよびＲｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、２０００年、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７巻：１５５〜１６６頁

【非特許文献28】Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋら、１９９０年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８７巻：４８２８〜４８３２頁

【非特許文献29】Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ ３４５巻：４４２〜４４４頁

【非特許文献30】ｖａｎ Ｗｅｓｅｎｂｅｅｃｋおよびｖａｎ Ｈｕｌ、２００５年、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｅｕｋａｒｙｏｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．１５巻：１３３〜１６２頁

【非特許文献31】Ｇｏｓｓｅら、２００５年、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １７巻：１３５２〜１３６２頁

【非特許文献32】Ｌｉｎら、２００８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２０巻：８０７〜８１１頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

ヒトｃ−ｆｍｓを含むｃ−ｆｍｓに結合する抗原結合性タンパク質が、本明細書で記載される。ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓに関連する生物応答の少なくとも１つを阻害、妨害または調節することが見出され、したがって、ｃ−ｆｍｓ関連の疾患または障害の影響を改善するのに有用である。したがって、ｃ−ｆｍｓへのある抗原結合性タンパク質の結合は、以下の活性の１つまたは複数を有することができる：ｃ−ｆｍｓ−ＣＳＦ−１結合またはシグナル伝達を阻害、妨害または調節すること、ｃ−ｆｍｓ−ＩＬ−３４結合またはシグナル伝達を阻害すること、腫瘍への単球移動を減少させること、および／または、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の蓄積を減少させること。

【0008】

一実施形態は、ｃ−ｆｍｓ受容体抗原結合性タンパク質の生成のための、細胞系を含む発現系、ならびに、ヒトｃ−ｆｍｓ関連の疾患を診断および治療する方法を含む。

【0009】

記載される単離された抗原結合性タンパク質のいくつかは、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；および（ｉｖ）合わせて合計４つ以下のアミノ酸となる１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される１つまたは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）；（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３；および（ｉｖ）合わせて合計４つ以下のアミノ酸となる１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択される１つまたは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）；または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含む。

【0010】

一実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、前述（Ａ）の少なくとも１つまたは２つのＣＤＲＨ、および前述（Ｂ）の少なくとも１つまたは２つのＣＤＲＬを含むことができる。さらに別の態様では、単離された抗原結合性タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。

【0011】

ある抗原結合性タンパク質では、前述（Ａ）のＣＤＲＨは、（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３；および、（ｉｖ）２つ以下のアミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群からさらに選択され；前述（Ｂ）のＣＤＲＬは、（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列；および、（ｉｖ）２つ以下のアミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択され；または、（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬ。

【0012】

さらに別の実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２；および、（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３からなる群から選択されるＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２；および、（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬ；または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含むことができる。一実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、（Ａ）配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１、配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２および配列番号１６５〜１９０のＣＤＲＨ３、ならびに（Ｂ）配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１、配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２および配列番号２２５〜２４６のＣＤＲＬ３を含むことができる。別の実施形態では、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）は配列番号７０〜１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ／または、可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）は配列番号１０２〜１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、Ｖ_Ｈは配列番号７０〜１０１からなる群から選択され、かつ／または、Ｖ_Ｌは配列番号１０２〜１３５からなる群から選択される。

【0013】

別の態様では、ヒトｃ−ｆｍｓのｃ−ｆｍｓサブドメインＩｇ様１−１およびＩｇ様１−２を含むエピトープに特異的に結合する、単離された抗原結合性タンパク質が提供される。

【0014】

さらに別の態様では、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；および、（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）；（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；および、（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）；または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含むｃ−ｆｍｓに結合する、単離された抗原結合性タンパク質が提供される。一実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２；および、（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２；および、（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３からなる群から選択される１つまたは複数のＣＤＲＬ；または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含む。

【0015】

別の実施形態は、ｃ−ｆｍｓに結合する単離された抗原結合性タンパク質であり、その抗原結合性タンパク質は、下記のコンセンサス配列を有するＣＤＲの１つまたは組合せを含む。群Ａ、ＢおよびＣは、系統学的に関連するクローンに由来する配列を指す。一態様では、様々な群からのＣＤＲを混合し、一致させることができる。別の態様では、抗原結合性タンパク質は、同じ１つの群Ａ、ＢまたはＣからの２つ以上のＣＤＲＨを含む。また別の態様では、抗原結合性タンパク質は、同じ群Ａ、ＢまたはＣからの２つ以上のＣＤＲＬを含む。また別の態様では、抗原結合性タンパク質は、同じ群Ａ、ＢまたはＣからの少なくとも２つまたは３つのＣＤＲＨおよび／または少なくとも２つまたは３つのＣＤＲＬを含む。異なる群のコンセンサス配列は、以下の通りである。

【0016】

群Ａ：（ａ）一般式ＧＹＴＸ_１ＴＳＹＧＩＳ（配列番号３０７）のＣＤＲＨ１であり、Ｘ_１は、ＦおよびＬからなる群から選択される；（ｂ）一般式ＷＩＳＡＹＮＧＮＸ_１ＮＹＡＱＫＸ_２ＱＧ（配列番号３０８）のＣＤＲＨ２であり、Ｘ_１はＴおよびＰからなる群から選択され、Ｘ_２はＬおよびＦからなる群から選択される；（ｃ）一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_４Ｘ_５ＦＧＥＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＦＤＹ（配列番号３０９）のＣＤＲＨ３であり、Ｘ_１はＥおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２はＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ_３はＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４はＬおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５はＷおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_６はＶおよびＬからなる群から選択され、Ｘ_７はＥおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８はＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_９はＦおよびＬからなる群から選択される；（ｄ）一般式ＫＳＳＸ_１ＧＶＬＸ_２ＳＳＸ_３ＮＫＮＸ_４ＬＡ（配列番号３１０）のＣＤＲＬ１であり、Ｘ_１はＱおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_２はＤおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_３はＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_４はＦおよびＹからなる群から選択される；（ｅ）一般式ＷＡＳＸ_１ＲＥＳ（配列番号３１１）のＣＤＲＬ２であり、Ｘ_１は、ＮおよびＴからなる群から選択される；ならびに、（ｆ）一般式ＱＱＹＹＸ_１Ｘ_２ＰＸ_３Ｔ（配列番号３１２）のＣＤＲＬ３であり、Ｘ_１はＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２はＤおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_３はＦおよびＰからなる群から選択される。

【0017】

群Ｂ：（ａ）一般式ＧＦＴＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＡＷＭＳ（配列番号３１３）を有するＣＤＲＨ１であり、Ｘ_１はＦおよびＶからなる群から選択され、Ｘ_２はＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３はＮおよびＴからなる群から選択される；（ｂ）一般式ＲＩＫＸ_１ＫＴＤＧＸ_２ＴＸ_３ＤＸ_４ＡＡＰＶＫＧ（配列番号３１４）を有するＣＤＲＨ２であり、Ｘ_１はＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２はＧおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_３はＴおよびＡからなる群から選択され、Ｘ_４はＹおよびＮからなる群から選択される；（ｃ）一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＹＹＧＸ_１４ＤＶ（配列番号３１５）を有するＣＤＲＨ３であり、Ｘ_１はＥ、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_２はＹ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_３はＹ、Ｒ、Ｇおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４はＨ、Ｇ、Ｓおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５はＩ、Ａ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_６はＬ、Ｖ、Ｔ、Ｐおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_７はＴ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｗおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８はＧ、Ｖ、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_９はＳ、Ｔ、Ｄ、ＮおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_１０はＧ、Ｆ、ＰおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１１はＧ、ＹおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_１２はＶおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１３はＷ、ＳおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１４はＭ、ＴおよびＶからなる群から選択される；（ｄ）一般式ＱＡＳＱＤＩＸ_１ＮＹＬＮ（配列番号３１６）を有するＣＤＲＬ１であり、Ｘ_１は、ＳおよびＮからなる群から選択される；（ｅ）一般式ＤＸ_１ＳＮＬＥＸ_２（配列番号３１７）を有するＣＤＲＬ２であり、Ｘ_１はＡおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２はＴおよびＰからなる群から選択される；ならびに、（ｆ）一般式ＱＱＹＤＸ_１ＬＸ_２Ｔ（配列番号３１８）を有するＣＤＲＬ３であり、Ｘ_１はＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２はＬおよびＩからなる群から選択される。

【0018】

群Ｃ：（ａ）一般式ＧＦＴＦＸ_１ＳＹＧＭＨ（配列番号３１９）を有するＣＤＲＨ１であり、Ｘ_１は、ＳおよびＩからなる群から選択される；（ｂ）一般式ＶＩＷＹＤＧＳＮＸ_１ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２０）を有するＣＤＲＨ２であり、Ｘ_１は、ＥおよびＫからなる群から選択される；（ｃ）一般式ＳＳＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＹＸ_４ＭＤＶ（配列番号３２１）を有するＣＤＲＨ３であり、Ｘ_１はＧ、ＳおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_２はＮ、ＤおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_３はＹおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４はＤおよびＧからなる群から選択される；（ｄ）一般式ＱＡＳＸ_１ＤＩＸ_２ＮＸ_３ＬＮ（配列番号３２２）を有するＣＤＲＬ１であり、Ｘ_１はＱおよびＨからなる群から選択され、Ｘ_２はＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３はＦおよびＹからなる群から選択される；（ｅ）一般式ＤＡＳＮＬＥＸ_１（配列番号３２３）を有するＣＤＲＬ２であり、Ｘ_１は、ＴおよびＩからなる群から選択される；ならびに、（ｆ）一般式ＱＸ_１ＹＤＸ_２Ｘ_３ＰＸ_４Ｔ（配列番号３２４）を有するＣＤＲＬ３であり、Ｘ_１はＱおよびＲからなる群から選択され、Ｘ_２はＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_３はＬおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４はＦ、ＬおよびＩからなる群から選択される。

【0019】

さらに別の実施形態では、先に記載の単離された抗原結合性タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲＨを含む第１のアミノ酸配列、および少なくとも１つのＣＤＲＬを含む第２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１および第２のアミノ酸配列は、互いに共有結合している。さらなる実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質の第１のアミノ酸配列は、配列番号１６５〜１９０のＣＤＲＨ３、配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２および配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１を含み、単離された抗原結合性タンパク質の第２のアミノ酸配列は、配列番号２２５〜２４６のＣＤＲＬ３、配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２および配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１を含む。

【0020】

一態様では、本明細書で提供される単離された抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体またはそれらの抗体断片であってよい。別の実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディまたは単鎖抗体分子であってよい。さらなる実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質はヒト抗体であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の型でよい。

【0021】

さらに別の態様では、単離された抗原結合性タンパク質は、提供される単離された抗原結合性タンパク質のうちの１つの抗原結合性タンパク質と、ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外部分への結合について競合することができる。一実施形態では、患者に投与されると、単離された抗原結合性タンパク質は、単球の走化性を減少させ、腫瘍への単球移動を阻害し、腫瘍での腫瘍関連マクロファージの蓄積を阻害し、または疾患組織でのマクロファージの蓄積を阻害することができる。

【0022】

さらなる態様では、ｃ−ｆｍｓに結合する抗原結合性タンパク質をコードする単離核酸分子も提供される。場合により、単離核酸分子は、制御配列に作動可能に連結される。

【0023】

別の態様では、ｃ−ｆｍｓに結合することができる抗原結合性タンパク質をコードする前記の単離核酸分子を含む、発現ベクターおよび該発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞も提供される。

【0024】

別の態様では、抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から抗原結合性タンパク質を調製する段階を含む、抗原結合性タンパク質を調製する方法も提供される。

【0025】

さらに別の態様では、提供される前記の抗原結合性タンパク質の少なくとも１つおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、放射性同位体、放射性核種、毒素からなる群、または治療薬および化学療法薬の群から選択される追加の活性剤を含むことができる。

【0026】

本発明の実施形態は、患者でｃ−ｆｍｓと関連する状態を治療または予防する方法であって、少なくとも１つの単離された抗原結合性タンパク質の有効量を患者に投与することを含む方法をさらに提供する。一実施形態では、状態は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮内膜腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、食道扁平上皮細胞癌、胃癌、星状細胞癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膀胱癌、肺癌および卵巣癌からなる群から選択される癌である。

【0027】

別の態様では、本発明は、患者でｃ−ｆｍｓの細胞外部分へのＣＳＦ−１の結合を阻害する方法であって、本明細書で提供される少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することを含む方法を提供する。

【0028】

さらに別の態様では、患者でヒトｃ−ｆｍｓの自己リン酸化を阻害する方法であって、本明細書で提供される少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することを含む方法も提供される。

【0029】

さらに別の態様として、患者で単球の走化性を減少させる方法であって、少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することを含む方法がさらに提供される。

【0030】

一態様では、患者で腫瘍への単球移動を阻害する方法であって、少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することを含む方法も提供される。

【0031】

別の態様では、患者で腫瘍での腫瘍関連マクロファージの蓄積を阻害する方法であって、少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することを含む方法も提供される。

【0032】

これらおよび他の態様は、本明細書でより詳細に記載される。提供される各態様は、本明細書で提供される様々な実施形態を包含することができる。したがって、１つの要素または要素の組合せを含む実施形態のそれぞれは、記載される各態様に含めることができることが予期される。開示物の他の特徴、目的および利点は、後に続く詳細な記載で明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1A-1】図１Ａは、本明細書で提供する重鎖可変領域の配列の比較を示す図である。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を示している。

【図1A-2】図１Ａは、本明細書で提供する重鎖可変領域の配列の比較を示す図である。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を示している。

【図1B-1】図１Ｂは、本明細書で提供する軽鎖可変領域の配列の比較を示す図である。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を示している。

【図1B-2】図１Ｂは、本明細書で提供する軽鎖可変領域の配列の比較を示す図である。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を示している。

【図2】２９の抗ｃ−ｆｍｓハイブリドーマの系統分析を示す図である。抗体の多様性を決定するために、すべてのクローンハイブリドーマの可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインまたは可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインのいずれかに一致するアミノ酸配列を整列させ互いに比較した。水平方向の分岐の長さが、任意の２つの配列間または配列分岐群（密接に関連する配列の群）間の置換（差異）の相対数に一致する、これらの比較アラインメントを表すデンドログラムを示す。コンセンサス配列の決定のためにグループにまとめた配列を指し示している。

【図3】様々なハイブリドーマ抗ｃ−ｆｍｓ上清によるＡＭＬ−５増殖の阻害を実証する図である。図３Ａは、ハイブリドーマ抗ｃ−ｆｍｓ上清を用いたＡＭＬ−５バイオアッセイを示す。図３Ｂは、精製組換え抗ｃ−ｆｍｓ抗体を用いたＡＭＬ−５バイオアッセイを示す。ＡＭＬ−５細胞を、抗体の濃度を減少させて存在させ、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞増殖を測定した。

【図4】ＣＳＦ−１でのｃ−ｆｍｓ抗体の滴定を用いたＣｙｎｏＢＭアッセイを示す図である。様々なハイブリドーマ抗ｃ−ｆｍｓ上清によるＣＳＦ−１濃縮カニクイザル骨髄細胞増殖の阻害を例示する。カニクイザル骨髄細胞を、抗体の濃度を減少させて存在させ、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて細胞増殖を測定した。

【図5】ＩｇＧ_２ ｍＡｂ（ＰＴ、親型）によるリガンド−誘発ｐＴｙｒ−ｃ−ｆｍｓの阻害を示す図である。２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を、１時間血清を飢餓状態にさせてから、ＩｇＧ_２ ｍＡｂ、１．１０９、１．２または２．３６０（ＰＴ）およびコントロールｍＡｂ抗ｃ−ｆｍｓ３−４Ａ４（非ブロッキング）および抗―ｈ−ＣＤ３９ Ｍ１０５（非特異的）を滴定系列（１．０〜０．０００１μｇ／ｍｌ）または１．０μｇ／ｍｌ（コントロール）で用いて処理した。次いで、細胞を、３７℃で５分間、５０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１で刺激した。全細胞溶解物を、上記したように抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０で免疫沈降させた。ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓおよび全ｃ−ｆｍｓのそれぞれの検出のために、ウエスタンブロットを、抗ｐＴｙｒ ４Ｇ１０（上側のパネル）または抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０（下側のパネル）のいずれかでプローブした。

【図6】ＩｇＧ_２ ｍＡｂ（ＰＴ対ＳＭ（体細胞突然変異が除去されている）型）によるリガンド−誘発ｐＴｙｒ−ｃ−ｆｍｓの阻害を比較する図である。２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を、１時間血清を飢餓状態にさせてから、ＩｇＧ_２ ｍＡｂ、１．１０９、１．２または２．３６０（ＰＴまたはＳＭの両方）およびコントロールｍＡｂ抗ｃ−ｆｍｓ３−４Ａ４（非ブロッキング）を１．０および０．１μｇ／ｍｌで用いて処理した。次いで、細胞を、３７℃で５分間、５０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１で刺激した。全細胞溶解物を、上記したように抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０で免疫沈降させた。ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓおよび全ｃ−ｆｍｓのそれぞれの検出のために、ウエスタンブロットを、抗ｐＴｙｒ ４Ｇ１０（上側のパネル）または抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０（下側のパネル）のいずれかでプローブした。

【図7】ＩｇＧ_２ ｍＡｂ（ＰＴ対ＳＭ型）によるｃ−ｆｍｓの免疫沈降のウエスタンブロットを示す図である。非刺激２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞の全細胞溶解物を、ＩｇＧ_２ ｍＡｂ、１．１０９、１．２、または２．３６０（ＰＴまたはＳＭの両方）および抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０を２．５μｇ／ｍｌで用いて、４℃で一晩、免疫沈降させた。ウエスタンブロットを、抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０および抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰでプローブした。

【図8】ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外ドメイン領域のアミノ配列（配列番号１）を示す図である。

【図9】ｃ−ｆｍｓ ＳＮＰの免疫沈降のウエスタンブロットを示す図である。示すｃ−ｆｍｓ ＳＮＰの発現構築物を作製し、２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞で一過性に発現させた。次いで、非刺激全細胞溶解物を各ｍＡｂおよびコントロールＡｂで免疫沈降させた。ウエスタンブロットを、ｃ−ｆｍｓ Ｈ３００および抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰでプローブした。

【図10】ヒトｃ−ｆｍｓ ＥＣＤ（細胞外ドメイン）および短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）構築物のダイアグラムを示す図である。アビジンタグが、ｃ−ｆｍｓのＮ末端のフレームに融合されている。各ｃ−ｆｍｓ構築物について、最初および最後の４個のアミノ酸を示す。

【図11】ｃ−ｆｍｓ ＥＣＤおよび短縮型アビジン融合タンパク質に対するＦＩＴＣ標識抗アビジン、１．１０９、１．２、および２．３６０ｃ−ｆｍｓ抗体の結合を実証する図である。

【図12】完全長ｃ−ｆｍｓおよびＩｇ−様ループ２（単独）融合タンパク質に対する抗アビジンＦＩＴＣ、コントロール抗体、および抗ｃ−ｆｍｓ抗体（ＦＩＴＣ標識）の結合を示す図である。

【図13】２０×未標識１．１０９、１．２、および２．３６０ｃ−ｆｍｓ抗体、これに続く１μｇ／ｍｌの濃度のＦＩＴＣ標識１．１０９を用いた競合アッセイを示す図である。

【図14】２０×未標識１．１０９、１．２、および２．３６０ｃ−ｆｍｓ抗体、これに続く１μｇ／ｍｌの濃度のＦＩＴＣ標識１．２を用いた競合アッセイを示す図である。

【図15】２０×未標識１．１０９、１．２、および２．３６０ｃ−ｆｍｓ抗体、これに続く１μｇ／ｍｌの濃度のＦＩＴＣ標識２．３６０を用いた競合アッセイを示す図である。

【図16】各腫瘍の腫瘍体積および壊死率の測定による、抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体によるＭＤＡＭＢ２３１乳房腺癌異種移植片の成長の阻害を示す図である。次いで、各腫瘍の壊死率をこれらの測定値から算出し、図１６に示した。

【図17】樹立ＮＣＩＨ１９７５肺腺癌異種移植片の成長の阻害を示す図である。腫瘍の測定値および治療日数を示し、抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体が樹立ＮＣＩＨ１９７５肺腺癌異種移植片の成長を阻害できることを実証している。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本明細書で用いられるセクションの見出しは、構成上の目的だけのためであり、記載される対象の内容を限定するものと解釈してはならない。

【0035】

本明細書で特に定義されなければ、本出願に関連して用いられる科学技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含むものとする。

【0036】

一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いる命名法、およびそれらの技術は、周知であって当技術分野で通常用いられるものである。一般に本出願の方法および技術は、特に明記しない限り、当技術分野で周知である従来の方法によって、また、本明細書全体に引用および記述される様々な一般参考文献およびより特定の参考文献に記載されている通りに実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年）、およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）を参照されたい。当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書で記載されるように、酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書で記載される分析化学、有機合成化学ならびに医化学および製薬化学に関連して用いる用語、ならびにそれらの実験手順および技術は、当業者に周知であって当技術分野で通常用いられるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、調合および送達、ならびに患者の治療のために、標準の技術を用いることができる。

【0037】

本発明は、本明細書で記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬などに限定されず、したがって変更することができることを理解するべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であって、特許請求の範囲によってだけ定義される開示物の範囲を限定するものではない。

【0038】

実施している実施例以外、または特記されている場合以外、本明細書で用いられる成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての例において用語「約」によって修飾されていると理解するべきである。用語「約」は、割合に関して用いられる場合、±１％を意味することができる。

【0039】

定義
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、一本鎖および二本鎖の両方のヌクレオチド重合体を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形でもよい。前記修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾物、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾物、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合の修飾物が含まれる。

【0040】

用語「オリゴヌクレオチド」は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが１０〜６０個の塩基である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個から４０個までのヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異体遺伝子の構築で使用するために、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。検出アッセイのために、オリゴヌクレオチドは、放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識を含む標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。

【0041】

「単離核酸分子」は、単離ポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連していないか、それが天然に連結していないポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成起源、またはそれらの組合せのＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。この開示のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、無傷の染色体を包含しないことを理解するべきである。特定の核酸配列を「含む」単離核酸分子は、特定された配列に加えて、最高１０個またはさらに最高２０個の他のタンパク質またはその一部のコード配列を、または挙げた核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結されている調節配列を、および／またはベクター配列を含むことができる。

【0042】

特に明記しない限り、本明細書で述べる任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。５’から３’の方向の生まれようとするＲＮＡ転写産物の付加は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’側であるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’側であるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。

【0043】

用語「制御配列」は、それが連結されるコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすことができる、ポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含むことができる。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子のための１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列および転写終結配列を含むことができる。「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。

【0044】

用語「ベクター」は、宿主細胞にタンパク質コード情報を伝えるのに用いられる任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。

【0045】

用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、宿主細胞の形質転換に適するベクターを指し、それに作動的に連結される１つまたは複数の異種起源のコード領域の発現を（宿主細胞と一緒に）指示および／または制御する核酸配列を含む。発現構築物は、それらに限定されないが、それに作動可能に連結されるコード領域の転写、翻訳に影響を及ぼすか制御する配列、および、イントロンが存在する場合はそれに作動可能に連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含むことができる。

【0046】

本明細書で用いるように、「作動可能に連結される」は、その用語が適用される成分が、適する条件下でそれらの固有の機能を果たすことを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性に適合する条件下で達成されるように、それに連結される。

【0047】

用語「宿主細胞」は、核酸配列によって形質転換されているか、形質転換することができ、それによって関心の遺伝子を発現する細胞を意味する。その用語は、その子孫が元の親細胞と形態または遺伝構成において同一であろうがなかろうが、関心の遺伝子が存在する限り親細胞の子孫を含む。

【0048】

用語「形質導入」は、通常バクテリオファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子移入を意味する。「形質導入」は、複製欠陥のあるレトロウイルスによる真核生物細胞の配列の獲得および移入も指す。

【0049】

用語「トランスフェクション」は、細胞による外来のまたは外因性のＤＮＡの取込みを意味し、外因性のＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、本明細書で開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２巻：４５６頁、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、前掲、Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｃｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ１３巻：１９７頁を参照されたい。１つまたは複数の外因性のＤＮＡ部分を適する宿主細胞に導入するために、そのような技術を用いることができる。

【0050】

用語「形質転換」は細胞の遺伝特性の変化を指し、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含むようにそれが修飾されている場合、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入または他の技術を通して新しい遺伝物質を導入することによって、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって細胞のそれと組み換えることができるか、または、複製されずにエピソームエレメントとして一時的に維持することができるか、または、プラスミドとして独立して複製することができる。形質転換ＤＮＡが細胞分裂に従って複製される場合、細胞は「安定して形質転換された」と考えられる。

【0051】

用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基の重合体を指す。これらの用語は、天然のアミノ酸重合体と同様に、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の類似体または模倣体であるアミノ酸重合体にも適用される。これらの用語は、例えば炭水化物残基の付加によって修飾されて糖タンパク質を形成したアミノ酸重合体、またはリン酸化されたアミノ酸重合体を包含することもできる。ポリペプチドおよびタンパク質は、天然の非組換え細胞によって生成することができ、または、それは遺伝子操作された細胞または組換え細胞によって生成され、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然の配列の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、具体的にはｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質、抗体、または、抗原結合性タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する配列を包含する。用語「ポリペプチド断片」は、完全長タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、完全長タンパク質と比較して修飾されたアミノ酸を含むこともできる。ある実施形態では、断片は長さが約５〜５００個のアミノ酸である。例えば、断片は、長さが少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０個のアミノ酸であってよい。有用なポリペプチド断片は、結合ドメインを含む抗体の免疫学的に機能的な断片を含む。ｃ−ｆｍｓ結合性抗体の場合、有用な断片には、それらに限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または単に２つのＣＤＲを含むその可変領域などが含まれる。

【0052】

言及される用語「単離タンパク質」は、対象タンパク質が、（１）それがそれと一緒に通常見出されるであろう少なくとも一部の他のタンパク質を含有せず、（２）同じ源、例えば同じ種からの他のタンパク質を基本的に含有せず、（３）異なる種からの細胞によって発現され、（４）少なくとも約５０％のポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または天然でそれが関連する他の物質から分離されており、（５）天然でそれが関連していないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）作動可能的に関連し、または、（６）天然で起こらないことを意味する。一般的に、「単離タンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはその任意の組合せが、そのような単離タンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離タンパク質は、その治療的、診断的、予防的、研究的使用または他の使用を妨害するであろう、その天然での環境で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物を実質的に含有しない。

【0053】

ポリペプチド（例えば、抗原結合性タンパク質または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入され、そこから削除され、かつ／またはそこに置換されるアミノ酸配列を含む。変異体は、融合タンパク質を含む。

【0054】

ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失または置換変異体と異なるある方法で、例えば別の化学部分へのコンジュゲーションを通して化学修飾されているポリペプチド（例えば、抗原結合性タンパク質または抗体）である。

【0055】

ポリペプチド、核酸、宿主細胞などのような生物材料に関連して明細書全体で用いられる用語「天然に存在する」は、天然で見出される物質を指す。

【0056】

本明細書で用いる「抗原結合性タンパク質」は、特定の標的抗原、例えばｃ−ｆｍｓまたはヒトｃ−ｆｍｓに特異的に結合するタンパク質を意味する。

【0057】

抗原結合性タンパク質は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１０^−８Ｍであるとき、その標的抗原に「特異的に結合」すると言われる。抗体は、Ｋ_Ｄが≦５ｘ１０^−９Ｍであるとき抗原に「高親和性」で特異的に結合し、Ｋ_Ｄが≦５ｘ１０^−１０Ｍであるとき「非常に高親和性」で結合する。一実施形態では、抗体は≦１０^−９ＭのＫ_Ｄ、および約１ｘ１０^−４／秒の解離速度を有する。一実施形態では、解離速度は約１ｘ１０^−５／秒である。他の実施形態では、抗体は、約１０^−８Ｍ〜１０^−１０Ｍの間のＫ_Ｄでｃ−ｆｍｓまたはヒトｃ−ｆｍｓに結合し、さらに別の実施形態では、Ｋ_Ｄ≦２ｘ１０^−１０で結合する。

【0058】

「抗原結合性領域」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用して、抗原結合性タンパク質に抗原に対するその特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含む抗原結合性タンパク質の部分は、「抗原結合性領域」と呼ばれる。一般的に、抗原結合性領域は、１つまたは複数の「相補的結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある抗原結合性領域は、１つまたは複数の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合性領域と抗原の間の結合を促進するために、ＣＤＲの適切な高次構造の維持を助けることができる。

【0059】

ある態様では、ｃ−ｆｍｓタンパク質またはヒトｃ−ｆｍｓに結合する組換え抗原結合性タンパク質が提供される。この文脈で、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書で記載の組換え核酸の発現を通して作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の生成のための方法および技術は、当技術分野で周知である。

【0060】

用語「抗体」は、標的抗原に対する特異的結合を巡って無傷の抗体と競合することができる、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリンまたはその断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および二重特異性抗体が含まれる。したがって、「抗体」は抗原結合性タンパク質の一種である。無傷の抗体は、一般に少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含むが、一部の例では、重鎖だけを含むことができるラクダにおいて天然に存在する抗体などのように、より少ない鎖を含むことができる。抗体は単一の源だけに由来することができ、または「キメラ」であってもよく、すなわち、下でさらに記載するように、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合性タンパク質、抗体または結合性断片は、ハイブリドーマとして、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって生成することができる。特に明記しない限り、用語「抗体」には、２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、およびその突然変異体が含まれ、その例は下に記載される。

【0061】

用語「軽鎖」には、結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有する、完全長軽鎖およびその断片が含まれる。完全長軽鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｌ、および定常領域ドメインＣ_Ｌを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。

【0062】

用語「重鎖」には、結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有する、完全長重鎖およびその断片が含まれる。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶ_Ｈ、および３つの定常領域ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。Ｖ_Ｈドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインはカルボキシル末端にあり、Ｃ_Ｈ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む任意のアイソタイプであってよい。

【0063】

抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）という用語は、本明細書で用いるように、完全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原に特異的に結合することができる抗体の部分（その部分がどのように得られるか、または合成されるかに関係なく）を含む、抗原結合性タンパク質である。それらが標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープへの特異的結合を巡って無傷の抗体を含む他の抗原結合性タンパク質と競合することができるという点で、そのような断片は生物学的に活性である。一態様では、そのような断片は完全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖またはその一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって生成することができ、または、無傷の抗体を含む抗原結合性タンパク質の酵素的または化学的切断によって生成することができる。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、それらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が含まれ、それらは、それらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギを含む任意の哺乳動物源に由来することができる。本明細書で開示される抗原結合性タンパク質の機能的部分、例えば１つまたは複数のＣＤＲを第２のタンパク質または小分子に共有結合させて、二機能性治療特性または長期血清半減期を有する、体内の特定の標的を対象にした治療剤を作製することができるであろうことがさらに企図される。

【0064】

「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

【0065】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。

【0066】

「Ｆａｂ’断片」は、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）_２分子を形成することができるように、１つの軽鎖、ならびに、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメイン、加えてＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の領域を含む１つの重鎖の部分を含む。

【0067】

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間で形成されるように、２つの軽鎖、ならびに、Ｃ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の部分を含む２つの重鎖を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖の間でジスルフィド結合によって一緒に保持される、２つのＦａｂ’断片で構成される。

【0068】

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域が欠けている。

【0069】

「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖の可変領域に柔軟なリンカーが連結して、抗原結合性領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成する、Ｆｖ分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号に詳細に述べられ、それらの開示は参照により組み込まれている。

【0070】

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域だけまたは軽鎖の可変領域だけを含んでいる、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。場合により、２つ以上のＶ_Ｈ部がペプチドリンカーにより共有結合で連結されて、二価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ部は、同じであるか異なる抗原を標的にすることができる。

【0071】

「二価の抗原結合性タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合により、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価の抗原結合性タンパク質および二価抗体は、二重特異性でもよい。下を参照されたい。

【0072】

「多重特異性抗原結合性タンパク質」または「多重特異性抗体」は、複数の抗原またはエピトープを標的にするものである。

【0073】

「二重特異性」、「二重に特異的」または「二機能性」の抗原結合性タンパク質または抗体は、それぞれ２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドの抗原結合性タンパク質または抗体である。二重特異性の抗原結合性タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合性タンパク質または多重特異性抗体の一種で、それらに限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０年、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９巻：３１５〜３２１頁、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：１５４７〜１５５３頁を参照されたい。二重特異性の抗原結合性タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じであるか異なるタンパク質標的の上に存在することができる２つの異なるエピトープに結合する。

【0074】

用語「中和抗原結合性タンパク質」または「中和抗体」は、リガンドに結合し、その結合パートナーへのリガンドの結合を阻止し、さもなければその結合パートナーに結合するリガンドがもたらすであろう生物応答を妨害する、抗原結合性タンパク質または抗体をそれぞれ指す。抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその免疫学的に機能的な断片の結合および特異性の評価において、（ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで測定して）過剰量の抗体がリガンドに結合する結合パートナーの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれを超えて減少させる場合、抗体または断片は、その結合パートナーへのリガンドの結合を実質的に阻害する。ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の場合、そのような中和分子は、ＣＳＦ−１に結合するｃ−ｆｍｓの能力を低下させる。一部の実施形態では、中和抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−３４に結合するｃ−ｆｍｓの能力を阻害する。他の実施形態では、中和抗原結合性タンパク質は、ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４に結合するｃ−ｆｍｓの能力を阻害する。

【0075】

同じエピトープについて競合する抗原結合性タンパク質（例えば、中和抗原結合性タンパク質または中和抗体）との関連で用いられる場合、用語「競合する」は、抗原結合性タンパク質間の競合が、試験下の抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片）が一般的な抗原（例えば、ｃ−ｆｍｓまたはその断片）に対する参照抗原結合性タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を阻止または阻害するアッセイによって決定されることを意味する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相の直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接もしくは間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９巻：２４２〜２５３頁を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７巻：３６１４〜３６１９頁を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８年、Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５巻：７〜１５頁を参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９０年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６巻：５４６〜５５２頁を参照）；および、直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０年、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２巻：７７〜８２頁）を用いることができる。一般的に、そのようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原、またはこれらのいずれかを含む細胞、未標識の試験用抗原結合性タンパク質、および標識参照抗原結合性タンパク質の使用を含む。競合阻害は、試験用抗原結合性タンパク質の存在下で、固体表面または細胞に結合する標識の量を決定することによって測定される。通常、試験用抗原結合性タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗原結合性タンパク質（競合する抗原結合性タンパク質）には、参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質、および、立体障害が起こるように参照抗原結合性タンパク質に結合するエピトープに十分に近い隣接したエピトープに結合する抗原結合性タンパク質が含まれる。競合的結合を測定する方法に関する追加の詳細は、本明細書の実施例で提供される。通常、競合する抗原結合性タンパク質が過剰に存在する場合、それは、一般的な抗原に対する参照抗原結合性タンパク質の特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。一部の例では、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％またはそれを超えて阻害される。

【0076】

用語「抗原」は、選択的な結合剤、例えば抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む）に結合させることができ、さらにその抗原に結合することができる抗体を生成するために動物で用いることができる、分子または分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合性タンパク質、例えば、抗体と相互作用することができる、１つまたは複数のエピトープを有することができる。

【0077】

用語「エピトープ」は、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）が結合する、分子の一部である。この用語は、抗体などの抗原結合性タンパク質、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、任意の決定因子を含む。エピトープは、連続または不連続（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中でお互いに連続していないが、分子の構成の中で抗原結合性タンパク質に結合しているアミノ酸残基）でよい。ある実施形態では、それらが抗原結合性タンパク質を生成するために用いるエピトープに類似した三次元構造を含むが、抗原結合性タンパク質を生成するために用いるエピトープで見られるアミノ酸残基を全く含まないかまたは一部しか含まないという点で、エピトープは模倣体であってよい。しばしば、エピトープはタンパク質の上に存在するが、一部の例では、核酸などの他の種類の分子の上に存在することができる。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基もしくはスルホニル基などの、分子の化学的活性表面基を含むことができ、特異的三次元構造特性および／または特異的電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

【0078】

用語「同一性」は、配列のアラインメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係を指す。「同一性割合」は、比較する分子中のアミノ酸またはヌクレオチドの間の、同一の残基の割合を意味し、比較する分子の最小サイズのものに基づいて計算される。これらの計算のために、特定の数理モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって、アラインメント中のギャップ（存在する場合）を扱わなければならない。整列させた（ａｌｉｇｎｅｄ）核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために用いることができる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編）、１９８８年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編）、１９９３年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編）１９９４年、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編）、１９９１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏら、１９８８年、ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８巻：１０７３頁に記載のものが含まれる。

【0079】

同一性割合の計算では、比較する配列を、配列間で最大の一致を与えるように整列させる。同一性割合を決定するために用いるコンピュータプログラムはＧＣＧプログラムパッケージであり、それはＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２巻：３８７頁、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性割合を決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために用いられる。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致のために整列させる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップオープンペナルティ（平均ダイアゴナルの３倍で計算され、「平均ダイアゴナル」は用いる比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによって完全なアミノ酸マッチのそれぞれに割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップオープンペナルティの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと一緒に用いられる。ある実施形態では、標準の比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら、１９７８年、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５巻：３４５〜３５２頁を、ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８９巻：１０９１５〜１０９１９頁を参照）も、アルゴリズムによって用いられる。

【0080】

ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性割合を決定するための推奨パラメータは、以下の通りである。

【0081】

アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁
比較マトリックス：上記、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２年からのＢＬＯＳＵＭ ６２
ギャップペナルティ：１２（しかし、末端ギャップについてはゼロペナルティ）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるためのあるアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域だけの一致をもたらすことができ、２つの完全長配列の間に有意な関係がないとしても、この小さなアラインメント領域は非常に高い配列同一性を有することができる。したがって、所望により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続したアミノ酸にわたるアラインメントをもたらすように、選択されるアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）を調節することができる。

【0082】

本明細書で用いるように、「実質的に純粋な」は、記載されている分子種が存在する優占種であること、すなわち、モルベースでそれが同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。ある実施形態では、実質的に純粋な分子は、目的種が、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モルベースで）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を構成する。他の実施形態では、目的種は基本的に均一に精製され、そこでは、従来の検出方法によって組成物中に汚染種を検出することができず、したがって、組成物は単一の検出可能な高分子種からなる。

【0083】

用語「治療する」は、傷害、病状または状態の治療または改善における任意の成功の証拠を指し、緩和；寛解；症状の軽減、または傷害、病状もしくは状態を患者により許容できるものにすること；変性または衰退の速度を遅くすること；変性の最終点の衰弱性を弱くすること；患者の身体的もしくは精神的な幸福を改善することなどの、任意の客観的もしくは主観的パラメータが含まれる。症状の治療または改善は、検診、神経精神医学的検査および／または精神医学的な評価の結果を含む、客観的もしくは主観的なパラメータに基づき得る。例えば、本明細書で提供されるある方法は、癌の発生率を低下させること、癌の寛解を引き起こすこと、および／または、癌または炎症性疾患と関連する症状を改善することによって、癌を首尾よく治療する。

【0084】

「有効量」は、一般に、症状の重症度および／もしくは頻度を低減させ、症状および／もしくは根本原因を除去し、症状および／もしくはそれらの根本原因の発生を予防し、ならびに／または癌から生じるか癌に関連する損傷を改善または治療するのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、治療的有効量または予防的有効量である。「治療的有効量」は、疾患の状態（例えば癌）もしくは症状、特に疾患状態に関連する状態もしくは症状を治療するのに十分な量であるか、あるいは、さもなければ、いかなる任意の方法でも疾患状態または疾患に関連する任意の他の望ましくない症状の進行を予防し、妨害し、遅らせるかまたは逆転させるのに十分な量である。「予防的有効量」は、対象に投与される場合、意図する予防効果、例えば、癌の発症（もしくは再発生）を予防するか遅らせること、または癌もしくは癌症状の発症（もしくは再発生）の可能性を低下させることをもたらす医薬組成物の量である。完全な治療的もしくは予防的効果は、必ずしも一用量の投与によって起こるわけではなく、一連の用量の投与の後だけに起きてもよい。したがって、治療的もしくは予防的有効量は、一回または複数回の投与で投与することができる。

【0085】

「アミノ酸」は、当技術分野におけるその通常の意味を含む。２０個の天然に存在するアミノ酸およびそれらの略記号は、従来の使用法に従う。任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、（Ｅ． Ｓ． ＧｏｌｕｂおよびＤ． Ｒ． Ｇｒｅｅｎ編）、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１年）を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば［α］−、［α］−二置換型アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非従来のアミノ酸もポリペプチドに適する成分であることができ、連語「アミノ酸」に含まれる。非従来のアミノ酸の例には、以下が含まれる。４−ヒドロキシプロリン、［γ］−カルボキシグルタメート、［ε］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、［ε］−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、［σ］−Ｎ−メチルアルギニンならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で用いられるポリペプチド表記法では、標準の使用法および慣例に従って、左の方向はアミノ末端方向であり、右の方向はカルボキシル末端方向である。

【0086】

全体概要
本明細書で、ヒトｃ−ｆｍｓ（ｈｃ−ｆｍｓ）タンパク質を含むｃ−ｆｍｓタンパク質に結合する抗原結合性タンパク質が提供される。提供される抗原結合性タンパク質は、本明細書で記載される１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）が埋め込まれるおよび／または付加されるポリペプチドである。一部の抗原結合性タンパク質では、ＣＤＲは「フレームワーク」領域に埋め込まれるが、それは、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるように、ＣＤＲを配向させる。一般に、提供される抗原結合性タンパク質は、ＣＳＦ−１とｃ−ｆｍｓとの相互作用を妨害、ブロック、低減または調節することができる。

【0087】

本明細書で記載されるある抗原結合性タンパク質は、抗体であるか、または抗体に由来する。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質のポリペプチド構造は、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣体」と称することもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書で「抗体複合体」と称することもある）およびそれらの断片を含む抗体に基づく。様々な構造物が、本明細書の下でさらに記載される。

【0088】

本明細書で提供される抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓ、特にヒトｃ−ｆｍｓの細胞外ドメインに結合することが証明されている。下の実施例でさらに記載されるように、ある抗原結合性タンパク質が試験され、他のいくつかの抗ｃ−ｆｍｓ抗体に結合するものと異なるエピトープに結合することが見出された。提供される抗原結合性タンパク質はＣＳＦ−１と競合し、それによって、ＣＳＦ−１がその受容体に結合することを阻止する。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質はＩＬ−３４とｃ−ｆｍｓとの結合を阻害する。他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の両方に結合するｃ−ｆｍｓの能力を阻害する。結果として、本明細書で提供される抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓ活性を阻害することができる。詳細には、これらのエピトープに結合する抗原結合性タンパク質は、以下の活性の１つまたは複数を有することができる：とりわけ、ｃ−ｆｍｓ自己リン酸化の阻害、ｃ−ｆｍｓシグナル伝達経路の誘導の阻害、ｃ−ｆｍｓ誘発性の細胞増殖の阻害、腫瘍または腫瘍間質での腫瘍関連マクロファージの単球走化性蓄積の阻害、腫瘍促進因子の生成の阻害、およびＣＳＦ−１結合の後にｃ−ｆｍｓによって誘導される他の生理作用の阻害。本明細書で開示される抗原結合性タンパク質は、様々な有用性を有する。抗原結合性タンパク質のいくつかは、例えば、特異的結合アッセイ、ｃ−ｆｍｓ、特にｈｃ−ｆｍｓもしくはそのリガンドの親和性精製、およびｃ−ｆｍｓ活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合性タンパク質のいくつかは、ｃ−ｆｍｓへのＣＳＦ−１の結合を阻害するために、またはｃ−ｆｍｓの自己リン酸化を阻害するために有用である。

【0089】

本明細書で説明するように、抗原結合性タンパク質は、様々な治療適用で用いることができる。例えば、本明細書でさらに記載されるように、あるｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓに関連する状態を治療するために、例えば患者で単球走化性を低減させるために、腫瘍への単球移動を阻害するために、腫瘍内の腫瘍関連マクロファージの蓄積を阻害するために、または新脈管形成を阻害するために有用である。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質は、腫瘍の増殖、進行および／または転移を促進するＴＡＭの能力を阻害する。さらに、腫瘍細胞自体がｃ−ｆｍｓを発現して利用する場合、ｃ−ｆｍｓに結合する抗体はそれらの増殖／生存を阻害することができよう。抗原結合性タンパク質の他の用途には、例えば、ｃ−ｆｍｓ関連の疾患または状態の診断、およびｃ−ｆｍｓの有無を判定するためのスクリーニングアッセイが含まれる。本明細書で記載される抗原結合性タンパク質のいくつかは、ｃ−ｆｍｓ活性に関連する結果、症状および／または病状の治療で有用である。これらには、様々な種類の癌および炎症性疾患、ならびに癌悪液質が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、様々な骨障害を治療するために用いることができる。

【0090】

ｃ−ｆｍｓ コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）は、単核食細胞系統の生存、増殖および分化を促進する。ＣＳＦ−１は、細胞表面ｃ−ｆｍｓ受容体に結合し、受容体ｃ−ｆｍｓキナーゼによる自己リン酸化、および以降の細胞内シグナルのカスケードをもたらすことによってその活性を発揮する。

【0091】

用語「ｃ−ｆｍｓ」、「ｃ−ｆｍｓ受容体」、「ヒトｃ−ｆｍｓ」および「ヒトｃ−ｆｍｓ受容体」は、それに限定されないがＣＳＦ−１を含むリガンドに結合し、その結果、細胞内のシグナル伝達経路を開始する、細胞表面受容体を指す。一部の実施形態では、受容体はＩＬ−３４に、またはＣＳＦ−１とＩＬ−３４の両方に結合することができる。本明細書で開示される抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓ、特にヒトｃ−ｆｍｓに結合する。ヒトｃ−ｆｍｓアミノ酸配列の例示的な細胞外ドメインを、配列番号１に表す。下記のように、ｃ−ｆｍｓタンパク質は、断片を含むこともできる。本明細書で用いるように、これらの用語は互換的に用いられ、受容体、特にＣＳＦ−１に特異的に結合するヒト受容体を意味する。

【0092】

本明細書で用いる用語ヒトｃ−ｆｍｓ（ｈ−ｃｆｍｓ）受容体は、天然に存在する対立遺伝子も含み、例には、突然変異Ａ２４５Ｓ、Ｖ２７９ＭおよびＨ３６２Ｒが含まれる。用語ｃ−ｆｍｓは、ｃ−ｆｍｓアミノ酸配列の翻訳後修飾も含む。例えば、ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（受容体の残基２０〜５１２）は、配列中に１１個の可能なＮ結合グリコシル化部位を有する。したがって、抗原結合性タンパク質は、それらの位置の１つまたは複数でグリコシル化されるタンパク質に結合すること、またはそれらから生成することができる。

【0093】

ｃ−ｆｍｓシグナル伝達経路は、組織マクロファージ集団の慢性活性化が関与するいくつかのヒト病状で、上方制御される。ＣＳＦ−１生成の増加は、炎症性腸疾患などの様々な炎症性疾患で見られる、組織マクロファージの蓄積とも関連している。さらに、いくつかの腫瘍型の増殖は、癌細胞および／または腫瘍間質でのＣＳＦ−１およびｃ−ｆｍｓ受容体の過剰発現と関連している。

【0094】

ｃ−ｆｍｓ受容体抗原結合性タンパク質
ｃ−ｆｍｓの活性を調節するのに有用な様々な選択的結合剤が、提供される。これらの剤には、例えば、抗原結合性ドメイン（例えば、抗原結合性領域を有する単鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着剤およびポリペプチド）を含み、ｃ−ｆｍｓポリペプチド、特にヒトｃ−ｆｍｓに特異的に結合する、抗原結合性タンパク質が含まれる。剤のいくつかは、例えば、ｃ−ｆｍｓへのＣＳＦ−１の結合を阻害することにおいて有用であり、したがって、ｃ−ｆｍｓシグナル伝達に関連する１つまたは複数の活性を阻害、妨害または調節するために用いることができる。ある実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ＩＬ−３４とｃ−ｆｍｓとの結合を阻害するために用いることができる。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ＣＳＦ−１およびＩＬ−３４の両方に結合するｃ−ｆｍｓの能力を妨害する。

【0095】

一般に、提供される抗原結合性タンパク質は、一般的に本明細書で記載の１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５または６個）を含む。場合により、抗原結合性タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造、および（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または結合される１つまたは複数のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形をとることができる。例えば、それは天然に存在する抗体のフレームワークまたはその断片もしくは変異体であってよいか、またはそれを含むことができ、あるいは、現実には完全に合成であってよい。様々なポリペプチド構造の例を、下でさらに記載する。

【0096】

ある実施形態では、抗原結合性タンパク質のポリペプチド構造は、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣体」と称することもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（「抗体複合体」と称することもある）およびそれぞれ各々の一部または断片を含む抗体であるか、または抗体に由来する。場合により、抗原結合性タンパク質は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２またはｓｃＦｖ）である。様々な構造を、本明細書でさらに記載し、定義する。

【0097】

本明細書で提供される抗原結合性タンパク質のあるものは、ヒトｃ−ｆｍｓに特異的に結合する。具体的な実施形態において、抗原結合性タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトｃ−ｆｍｓタンパク質に特異的に結合する。

【0098】

抗原結合性タンパク質を治療適用のために用いる実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓの１つまたは複数の生物活性を阻害、妨害または調節することができる。この場合、過剰量の抗体が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで結合を測定することによって）少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれを超えて、ｃ−ｆｍｓに結合するヒトｃ−ｆｍｓの量を減少させるか、またはその逆の場合、抗原結合性タンパク質はＣＳＦ−１に特異的に結合し、かつ／またはＣＳＦ−１へのヒトｃ−ｆｍｓの結合を実質的に阻害する。ｃ−ｆｍｓは多くの異なる生物効果を有し、それらは異なる細胞型において多くの異なるアッセイで測定することができる。そのようなアッセイの例を、本明細書で提供する。

【0099】

天然に存在する抗体構造
提供される抗原結合性タンパク質のいくつかは、一般的に天然に存在する抗体と関連する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、一般的に１つまたは複数の四量体を含み、それぞれはポリペプチド鎖の２つの同一のカプレットで構成されるが、哺乳動物の一部の種類はまた単一の重鎖だけを有する抗体を生成する。一般的な抗体では、各対またはカプレットは、１つの完全長「軽」鎖（ある実施形態では約２５ｋＤａ）および１つの完全長「重」鎖（ある実施形態では約５０〜７０ｋＤａ）を含む。各個々の免疫グロブリン鎖はいくつかの「免疫グロブリンドメイン」で構成され、それぞれおよそ９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴のある折り畳みパターンを示す。これらのドメインは、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。各鎖のアミノ末端部分は、一般的に、抗原認識の役割を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は、進化的に鎖の他方の末端部分よりも保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と呼ばれる。ヒト軽鎖は、一般的にκおよびλ軽鎖に分類され、これらのそれぞれは１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含む。重鎖は、一般的に、μ、δ、γ、αまたはε鎖に分類され、これらは抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、
それらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプは、ＩｇＭおよびＩｇＭ２を含む。ＩｇＡサブタイプは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。ヒトにおいては、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖および４つの軽鎖を含む。ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖および５つの軽鎖を含む。重鎖Ｃ領域は、一般的に、エフェクター機能の役割を担うことができる１つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメイン数は、アイソタイプによって決まる。例えばＩｇＧ重鎖は、それぞれ、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有することができる。ある実施形態では、ｃ−ｆｍｓ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプである。

【0100】

完全長の軽鎖および重鎖では、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖は、約１０個、より多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、第７章（Ｐａｕｌ， Ｗ．編）１９８９年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、一般的に抗原結合部位を形成する。

【0101】

例示的なｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体のＩｇＧ２重鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。

【0102】

【化1】

【0103】

例示的なｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体のκ軽鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。

【0104】

【化2】

【0105】

通常、免疫グロブリン鎖の可変領域は、「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれることの方が多い３つの超可変領域で連結される、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、同じ全体構造を示す。一般的に、上で指摘した各重鎖／軽鎖対の２つの鎖からのＣＤＲは、標的タンパク質（例えば、ｃ−ｆｍｓ）の上の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成するように、フレームワーク領域によって整列される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、天然に存在する軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、これらのエレメントの以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に一般的に従う。これらのドメインのそれぞれにおいて位置を占めるアミノ酸に数字を割り当てるための、付番方式が考案されている。この付番方式は、ＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７年および１９９１年、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ３４２巻：８７８〜８８３頁で規定されている。

【0106】

本明細書で提供される様々な重鎖および軽鎖可変領域を、表２に表す。これらの可変領域のそれぞれを上記の重鎖および軽鎖定常領域に結合して、それぞれ完全な抗体の重鎖および軽鎖を形成することができる。さらに、そのように生成された重鎖および軽鎖の配列のそれぞれを組み合わせて、完全な抗体構造を形成することができる。本明細書で提供される重鎖および軽鎖可変領域を、上記の例示的な配列と異なる配列を有する他の定常ドメインに結合することもできることを理解するべきである。

【0107】

提供される抗体の完全長軽鎖および重鎖のいくつかの具体的な例、およびそれらの対応するアミノ酸配列を、表１に要約する。

【0108】

【表1-1】

【0109】

【表1-2】

【0110】

【表1-3】

【0111】

【表1-4】

【0112】

【表1-5】

【0113】

【表1-6】

【0114】

【表1-7】

【0115】

【表1-8】

【0116】

【表1-9】

【0117】

【表1-10】

【0118】

【表1-11】

【0119】

また、表１に記載の例示的な重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３など）のそれぞれを表１に示す例示的な軽鎖のいずれかと組み合わせて、抗体を形成することができる。そのような組合せの例には、Ｌ１〜Ｌ３４のいずれかと組み合わせたＨ１；Ｌ１〜Ｌ３４のいずれかと組み合わせたＨ２；Ｌ１〜Ｌ３４のいずれかと組み合わせたＨ３、その他が含まれる。場合により、抗体は、表１に記載のものからの、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。場合により、抗体は、表１に記載の２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を含む。他の場合、抗体は２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含む。例えば、抗体または免疫学的に機能的な断片は、２つのＨ１重鎖および２つのＬ１軽鎖、または２つのＨ２重鎖および２つのＬ２軽鎖、または２つのＨ３重鎖および２つのＬ３軽鎖、ならびに表１に記載の軽鎖対および重鎖対の他の類似した組合せを含むことができる。

【0120】

提供される他の抗原結合性タンパク質は、表１に示す重鎖および軽鎖の組合せによって形成される抗体の変異体であって、これらの鎖のアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を有する軽鎖および／または重鎖を含む。場合により、そのような抗体は少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含み、他の場合では、変異形態は２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含む。

【0121】

抗体の可変ドメイン
以下の表２中に示すような、Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、およびＶ_Ｈ３２からなる群から選択される抗体重鎖可変領域、および／またはＶ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、およびＶ_Ｌ３４からなる群から選択される抗体軽鎖可変領域、ならびにこれらの軽鎖および重鎖可変領域の免疫機能断片、誘導体、ムテインおよび変異体を含有する抗原結合性タンパク質も提供する。

【0122】

様々な重鎖および軽鎖可変領域の配列アラインメントを、それぞれ図１Ａおよび１Ｂ中に与える。

【0123】

この型の抗原結合性タンパク質は、表２中に挙げるように「ｘ」が重鎖可変領域の数に相当し、かつ「ｙ」が軽鎖可変領域の数に相当する（一般に、ｘとｙはそれぞれ１または２である）式「Ｖ_Ｈｘ／Ｖ_Ｌｙ」によって一般に表すことができる：

【0124】

【表2-1】

【0125】

【表2-2】

【0126】

【表2-3】

【0127】

【表2-4】

【0128】

【表2-5】

【0129】

表２中に挙げる重鎖可変領域のそれぞれは、表２中に示した軽鎖可変領域のいずれかと組み合わせて抗原結合性タンパク質を形成することができる。このような組合せの例には、Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４のいずれかと組み合わせたＶ_Ｈ１、Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、またはＶ_Ｌ３０のいずれかと組み合わせたＶ_Ｈ２、またはＶ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４のいずれかと組み合わせたＶ_Ｈ３などが含まれる。

【0130】

いくつかの場合、抗原結合性タンパク質は、表２中に挙げる領域由来の少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１つの軽鎖可変領域を含む。いくつかの場合、抗原結合性タンパク質は、表２中に挙げる領域由来の少なくとも２つの異なる重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。このような抗原結合性タンパク質の例は、（ａ）１つのＶ_Ｈ１、および（ｂ）Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、またはＶ_Ｈ３２の１つを含む。別の例は（ａ）１つのＶ_Ｈ２、および（ｂ）Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、またはＶ_Ｈ３２の１つを含む。さらに別の例は（ａ）１つのＶ_Ｈ３、および（ｂ）Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、またはＶ_Ｈ３２の１つなどを含む。

【0131】

このような抗原結合性タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶ_Ｌ１、および（ｂ）Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４の１つを含む。このような抗原結合性タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶ_Ｌ２、および（ｂ）Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、およびＶ_Ｌ３４の１つを含む。このような抗原結合性タンパク質のさらに別の例は、（ａ）１つのＶ_Ｌ３、および（ｂ）Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４の１つなどを含む。

【0132】

重鎖可変領域の様々な組合せ物は、軽鎖可変領域の任意の様々な組合せ物と組み合わせることができる。

【0133】

他の場合、抗原結合性タンパク質は、２つの同一の軽鎖可変領域および／または２つの同一の重鎖可変領域を含有する。一例として、抗原結合性タンパク質は、表２中に挙げる軽鎖可変領域の対と重鎖可変領域の対の組合せで、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域を含む抗体または免疫機能断片であってよい。

【0134】

提供するいくつかの抗原結合性タンパク質は、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基で、Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、およびＶ_Ｈ３２から選択される重鎖可変ドメインの配列と異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含み、この場合それぞれのこのような配列の違いは独立に、１アミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、その欠失、挿入および／または置換によって前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗原結合性タンパク質中の重鎖可変領域は、Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、およびＶ_Ｈ３２の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。

【0135】

特定の抗原結合性タンパク質は、わずか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基で、Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４から選択される軽鎖可変ドメインの配列と異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、この場合それぞれのこのような配列の違いは独立に、１アミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかであり、その欠失、挿入および／または置換によって前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗原結合性タンパク質中の軽鎖可変領域は、Ｖ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、またはＶ_Ｌ３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。

【0136】

さらに他の抗原結合性タンパク質、例えば抗体または免疫機能断片は、ここに記載するような変異体型の変異体重鎖および変異体軽鎖を含む。

【0137】

ＣＤＲ
本明細書に開示する抗原結合性タンパク質は、その中に１つまたは複数のＣＤＲが移植、挿入および／または結合したポリペプチドである。抗原結合性タンパク質は１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを有することができる。したがって抗原結合性タンパク質は、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を例えば有することができる。いくつかの抗原結合性タンパク質は、ＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ３の両方を含む。特異的重鎖および軽鎖ＣＤＲは、それぞれ表３Ａおよび３Ｂにおいて確認する。

【0138】

所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔらによって、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、１９９１年中に記載された系を使用して同定することができる。本明細書に開示する特定の抗体は、表３Ａ（ＣＤＲＨ）および表３Ｂ（ＣＤＲＬ）中に表す１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列と同一であるかまたは相当な配列同一性を有する１つまたは複数のアミノ酸配列を含む。

【0139】

【表3A-1】

【0140】

【表3A-2】

【0141】

【表3B-1】

【0142】

【表3B-2】

【0143】

【表3B-3】

【0144】

天然に存在する抗体内のＣＤＲの構造および性質は前に記載している。簡単に言うと、従来の抗体中では、ＣＤＲが重鎖および軽鎖可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこでそれらは抗原結合および抗原認識を担う領域を構成する。可変領域は、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔら、１９９１年、上記によってフレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、１９８７年、上記も参照）内に、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む、上記参照（Ｋａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ３４２巻：８７７〜８８３頁も参照）。しかしながら、本明細書で提供するＣＤＲは、従来の抗体構造の抗原結合ドメインを定義するために使用することができるだけでなく、本明細書に記載される様々な他のポリペプチド構造に埋め込むことができる。

【0145】

一態様では、提供するＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、および（ｉｖ）わずか５、４、３、２、または１アミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択されるＣＤＲＨ、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、および（ｉｖ）わずか５、４、３、２、または１アミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択されるＣＤＲＬである。

【0146】

別の態様では、抗原結合性タンパク質は、表３Ａおよび３Ｂ中に挙げるＣＤＲの１、２、３、４、５、または６個の変異体型を含み、それぞれ表３Ａおよび３Ｂ中に挙げるＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの抗原結合性タンパク質は表３Ａおよび３Ｂ中に挙げる１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを含み、それぞれこれらの表中に挙げるＣＤＲとわずか１、２、３、４または５アミノ酸により異なる。

【0147】

さらに別の態様では、本明細書に開示するＣＤＲは、関連モノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列を含む。本明細書に記載されるように、「コンセンサス配列」は、いくつかの配列間で共通の保存アミノ酸および所与のアミノ酸配列内で変わる可変アミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。提供するＣＤＲコンセンサス配列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のそれぞれに相当するＣＤＲを含む。

【0148】

コンセンサス配列は、抗ｃ−ｆｍｓ抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌに相当するＣＤＲの標準的な系統発生分析を使用して決定した。コンセンサス配列は、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌに相当する同じ配列内に隣接するＣＤＲを維持することによって決定した。簡単に言うと、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌのいずれかの可変ドメイン全体に相当するアミノ酸配列を、比較アラインメントの処理および系統発生の推測を容易にするためにＦＡＳＴＡ形式に変換した。次に、これらの配列のフレームワーク領域を、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌに相当する同じ配列内に隣接するＣＤＲを依然として維持しながら、同時事象（例えば、共通の生殖系列フレームワーク遺伝物を偶然に共有する無関連抗体など）による偏度に重み付けし、いかなるアミノ酸位置も導入せずにＣＤＲ単独の調査を実施することができるように、人工リンカー配列（「ＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡ」（配列番号３２５））で置換した。次いでこの形式のＶ_ＨまたはＶ_Ｌ配列を、標準的なＣｌｕｔａｌＷ様アルゴリズムを利用するプログラムを使用する、配列類似性アラインメントによる照合に供した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻：４６７３〜４６８０頁を参照）。８．０のギャップクリエーションペナルティおよび２．０のギャップ伸長ペナルティを利用した。このプログラムも同様に、ＵＰＧＭＡ（算術平均を使用する非加重結合法）または近隣結合法（Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｎｅｉ、１９８７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ４巻：４０６〜４２５頁を参照）のいずれかを使用し配列類似性アラインメントに基づいて系統樹（系統樹のイラスト）を生成して、枝長の比較および分類によって配列群の類似性および相違を構築し例証した。両者の方法共に同様の結果をもたらしたが、ＵＰＧＭＡ由来系統樹法を最終的に使用した。この方法は簡潔でより中庸な推定値のセットを利用するからである。ＵＰＧＭＡ由来系統樹は図２中に示し、この場合類似の配列群は、群内の個々の配列間に１００残基当たり１５未満の置換を有するとして定義し（スケールに関しては系統樹のイラスト中の凡例を参照）、これらを使用してコンセンサス配列の集合を定義した。

【0149】

図２中に示すように、本明細書で提供する様々な抗原結合性タンパク質の系統分析は、群Ａ、Ｂ、およびＣで表す３群の密接に関連した系統発生クローンをもたらした。

【0150】

群Ａの様々なＣＤＲ領域のコンセンサス配列は以下のコンセンサス配列である：
ａ．Ｘ_１がＦおよびＬからなる群から選択される、一般式ＧＹＴＸ_１ＴＳＹＧＩＳのＣＤＲＨ１（配列番号３０７）；
ｂ．Ｘ_１がＴおよびＰからなる群から選択され、Ｘ_２がＬおよびＦからなる群から選択される、一般式ＷＩＳＡＹＮＧＮＸ_１ＮＹＡＱＫＸ_２ＱＧのＣＤＲＨ２（配列番号３０８）；
ｃ．Ｘ_１がＥおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ_３がＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４がＬおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５がＷおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_６がＶおよびＬからなる群から選択され、Ｘ_７がＥおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８がＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_９がＦおよびＬからなる群から選択される、一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＦＧＥＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＦＤＹのＣＤＲＨ３（配列番号３０９）；
ｄ．Ｘ_１がＱおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_２がＤおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_３がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_４がＦおよびＹからなる群から選択される、一般式ＫＳＳＸ_１ＧＶＬＸ_２ＳＳＸ_３ＮＫＮＸ_４ＬＡのＣＤＲＬ１（配列番号３１０）；
ｅ．Ｘ_１がＮおよびＴからなる群から選択される、一般式ＷＡＳＸ_１ＲＥＳのＣＤＲＬ２（配列番号３１１）；および
ｆ．Ｘ_１がＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＤおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_３がＦおよびＰからなる群から選択される、一般式ＱＱＹＹＸ_１Ｘ_２ＰＸ_３ＴのＣＤＲＬ３（配列番号３１２）。

【0151】

群Ｂの様々なＣＤＲ領域のコンセンサス配列は以下のコンセンサス配列である：
ａ．Ｘ_１がＦおよびＶからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３がＮおよびＴからなる群から選択される、一般式ＧＦＴＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＡＷＭＳを有するＣＤＲＨ１（配列番号３１３）；
ｂ．Ｘ_１がＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＧおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_３がＴおよびＡからなる群から選択され、Ｘ_４がＹおよびＮからなる群から選択される、一般式ＲＩＫＸ_１ＫＴＤＧＸ_２ＴＸ_３ＤＸ_４ＡＡＰＶＫＧを有するＣＤＲＨ２（配列番号３１４）；
ｃ．Ｘ_１がＥ、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_２がＹ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_３がＹ、Ｒ、Ｇおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４がＨ、Ｇ、Ｓおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５がＩ、Ａ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_６がＬ、Ｖ、Ｔ、Ｐおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_７がＴ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｗおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８がＧ、Ｖ、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_９がＳ、Ｔ、Ｄ、ＮおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_１０がＧ、Ｆ、Ｐ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ_１１がＧ、ＹおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_１２がＶおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１３がＷ、ＳおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１４がＭ、ＴおよびＶからなる群から選択される、一般式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＹＹＧＸ_１４ＤＶを有するＣＤＲＨ３（配列番号３１５）；
ｄ．Ｘ_１がＳおよびＮからなる群から選択される、一般式ＱＡＳＱＤＩＸ_１ＮＹＬＮを有するＣＤＲＬ１（配列番号３１６）；
ｅ．Ｘ_１がＡおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＴおよびＰからなる群から選択される、一般式ＤＸ_１ＳＮＬＥＸ_２を有するＣＤＲＬ２（配列番号３１７）；および ｆ．Ｘ_１がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２がＬおよびＩからなる群から選択される、一般式ＱＱＹＤＸ_１ＬＸ_２Ｔを有するＣＤＲＬ３（配列番号３１８）。

【0152】

群Ｃの様々なＣＤＲ領域のコンセンサス配列は以下のコンセンサス配列である：
ａ．Ｘ_１がＳおよびＩからなる群から選択される、一般式ＧＦＴＦＸ_１ＳＹＧＭＨを有するＣＤＲＨ１（配列番号３１９）；
ｂ．Ｘ_１がＥおよびＫからなる群から選択される、一般式ＶＩＷＹＤＧＳＮＸ_１ＹＹＡＤＳＶＫＧを有するＣＤＲＨ２（配列番号３２０）；
ｃ．Ｘ_１がＧ、ＳおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_２がＮ、ＤおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_３がＹおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４がＤおよびＧからなる群から選択される、一般式ＳＳＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＹＸ_４ＭＤＶを有するＣＤＲＨ３（配列番号３２１）；
ｄ．Ｘ_１がＱおよびＨからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３がＦおよびＹからなる群から選択される、一般式ＱＡＳＸ_１ＤＩＸ_２ＮＸ_３ＬＮを有するＣＤＲＬ１（配列番号３２２）；
ｅ．Ｘ_１がＴおよびＩからなる群から選択される、一般式ＤＡＳＮＬＥＸ_１を有するＣＤＲＬ２（配列番号３２３）；および
ｆ．Ｘ_１がＱおよびＲからなる群から選択され、Ｘ_２がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_３がＬおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４がＦ、ＬおよびＩからなる群から選択される、一般式ＱＸ_１ＹＤＸ_２Ｘ_３ＰＸ_４Ｔを有するＣＤＲＬ３（配列番号３２４）。

【0153】

いくつかの場合、抗原結合性タンパク質は、前述のコンセンサス配列の１つを有する少なくとも１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、またはＣＤＲＨ３を含む。いくつかの場合、抗原結合性タンパク質は、前述のコンセンサス配列の１つを有する少なくとも１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３を含む。他の場合、抗原結合性タンパク質は、前述のコンセンサス配列に従う少なくとも２つのＣＤＲＨ、および／または前述のコンセンサス配列に従う少なくとも２つのＣＤＲＬを含む。一態様では、ＣＤＲＨおよび／またはＣＤＲＬは異なる群Ａ、Ｂ、およびＣに由来する。他の場合、抗原結合性タンパク質は、同じ群Ａ、Ｂ、またはＣ由来の少なくとも２つのＣＤＲＨ、および／または同じ群Ａ、Ｂ、またはＣ由来の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む。他の態様では、抗原結合性タンパク質は、前述の同じ群Ａ、Ｂ、またはＣ由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列、および／または前述の同じ群Ａ、Ｂ、またはＣ由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。

【0154】

それ故、提供するいくつかの抗原結合性タンパク質は、群Ａのコンセンサス配列由来の１、２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含む。したがって、特定の抗原結合性タンパク質は、例えば、前述の群Ａのコンセンサス配列由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。提供する他の抗原結合性タンパク質は、群Ｂのコンセンサス配列由来の１、２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含む。したがって、特定の抗原結合性タンパク質は、例えば、前述の群Ｂのコンセンサス配列由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。提供するさらに他の抗原結合性タンパク質は、群Ｃのコンセンサス配列由来の１、２、３、４、５または全６個のＣＤＲを含む。したがって、特定の抗原結合性タンパク質は、例えば、前述の群Ａのコンセンサス配列由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。

【0155】

例示的な抗原結合性タンパク質
一態様によれば、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、および（ｉｖ）わずか５、４、３、２、または１アミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨからなる群から選択される１つまたは複数の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、および（ｉｖ）わずか５、４、３、２、または１アミノ酸の１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択される１つまたは複数の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含むｃ−ｆｍｓと結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供する。

【0156】

さらに別の実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１３６〜１４７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１４８〜１６４からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３からなる群から選択されるＣＤＲＨ、（Ｂ）（ｉ）配列番号１９１〜２１０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号２１１〜２２４からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３からなる群から選択されるＣＤＲＬ、または（Ｃ）（Ａ）の１つまたは複数の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲＬを含むことができる。一実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質は、（Ａ）配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１、配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２、および配列番号１６５〜１９０のＣＤＲＨ３、および（Ｂ）配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１、配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２、および配列番号２２５〜２４６のＣＤＲＬ３を含むことができる。

【0157】

別の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）は、配列番号７０〜１０１からなる群から選択されるアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有し、かつ／または可変軽鎖（ＶＬ）は、配列番号１０２〜１３５からなる群から選択されるアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、ＶＨは配列番号７０〜１０１からなる群から選択され、かつ／またはＶＬは配列番号１０２〜１３５からなる群から選択される。

【0158】

別の態様では、ｃ−ｆｍｓのｃ−ｆｍｓサブドメインＩｇ様ｌ−１およびＩｇ様１−２を含有するエピトープと特異的に結合する単離された抗原結合性タンパク質も提供する。

【0159】

さらなる態様では、ｃ−ｆｍｓと結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供するが、その抗原結合性タンパク質は、（１）配列番号１６５〜１９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、（２）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ｉ）のＣＤＲＨ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３、および（３）（ａ）Ｘ_１がＥおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＱからなる群から選択され、Ｘ_３がＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４がＬおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５がＷおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_６がＶおよびＬからなる群から選択され、Ｘ_７がＥおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８がＧおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_９がＦおよびＬからなる群から選択される、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_４Ｘ_５ＦＧＥＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＦＤＹ（配列番号３０９）（前に記載した系統発生群Ａ由来のＣＤＲＨ３コンセンサス配列）、（ｂ）Ｘ_１がＥ、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_２がＹ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_３がＹ、Ｒ、Ｇおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_４がＨ、Ｇ、Ｓおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_５がＩ、Ａ、Ｌおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_６がＬ、Ｖ、Ｔ、Ｐおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_７がＴ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｗおよび無アミノ酸からなる群から選択され、Ｘ_８がＧ、Ｖ、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_９がＳ、Ｔ、Ｄ、ＮおよびＧからなる群から選択され、Ｘ_１０がＧ、Ｆ、Ｐ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ_１１がＧ、ＹおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_１２がＶおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１３がＷ、ＳおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_１４がＭ、ＴおよびＶからなる群から選択される、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＹＹＧＸ_１４ＤＶ（配列番号３１５）（前に記載した系統発生群Ｂ由来のＣＤＲＨ３コンセンサス配列）、および（ｃ）Ｘ_１がＧ、ＳおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_２がＮ、ＤおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_３がＹおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４がＤおよびＧからなる群から選択される、ＳＳＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＹＸ_４ＭＤＶ３（配列番号３２１）（前に記載した系統発生群Ｃ由来のＣＤＲＨ３コンセンサス配列）からなる群から選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、または（Ｂ）（１）配列番号２２５〜２４６からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、（２）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ｉ）のＣＤＲＬ３とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３、および（３）（ａ）Ｘ_１がＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＤおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_３がＦおよびＰからなる群から選択される、ＱＱＹＹＸ_１Ｘ_２ＰＸ_３Ｔ（配列番号３１２）（前に記載した系統発生群Ａ由来のＣＤＲＬ３コンセンサス配列）、（ｂ）Ｘ_１がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_２がＬおよびＩからなる群から選択される、ＱＱＹＤＸ_１ＬＸ_２Ｔ（配列番号３１８）（前に記載した系統発生群Ｂ由来のＣＤＲＬ３コンセンサス配列）、および（ｃ）Ｘ_１がＱおよびＲからなる群から選択され、Ｘ_２がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_３がＬおよびＦからなる群から選択され、Ｘ_４がＦ、ＬおよびＩからなる群から選択される、ＱＸ_１ＹＤＸ_２Ｘ_３ＰＸ_４Ｔ（配列番号３２４）（前に記載した系統発生群Ｃ由来のＣＤＲＬ３コンセンサス配列）からなる群から選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。

【0160】

一実施形態では、ｃ−ｆｍｓと結合する抗原結合性タンパク質は、群Ａ、Ｂ、またはＣのコンセンサス配列に従うＣＤＲＨ３、および／または群Ａ、Ｂ、またはＣのコンセンサス配列に従うＣＤＲＬ３、および前述の群のいずれかのＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２、および／または前述の群のいずれかのＣＤＲＬ１および／またはＣＤＲＬ２を含む。

【0161】

一実施形態では、上記参照のように、ｃ−ｆｍｓと結合する単離された抗原結合性タンパク質は、群ＡのＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３、および
（１）（ａ）配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、および（ｃ）Ｘ_１がＦおよびＬからなる群から選択される、ＧＹＴＸ_１ＴＳＹＧＩＳ（配列番号３０７）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、
（２）（ａ）配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、および（ｃ）Ｘ_１がＴおよびＰからなる群から選択され、Ｘ_２がＬおよびＦからなる群から選択される、ＷＩＳＡＹＮＧＮＸ_１ＮＹＡＱＫＸ_２ＱＧ（配列番号３０８）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、
（３）（ａ）配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、および（ｃ）Ｘ_１がＱおよびＳからなる群から選択され、Ｘ_２がＤおよびＹからなる群から選択され、Ｘ_３がＮおよびＤからなる群から選択され、Ｘ_４がＦおよびＹからなる群から選択される、ＫＳＳＸ_１ＧＶＬＸ_２ＳＳＸ_３ＮＫＮＸ_４ＬＡ（配列番号３１０）からなる群から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、および
（４）（ａ）配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、および（ｃ）Ｘ_１がＮおよびＴからなる群から選択される、ＷＡＳＸ_１ＲＥＳ（配列番号３１１）からなる群から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ２からなる群から選択されるＣＤＲを含む。

【0162】

一実施形態では、上記参照のように、ｃ−ｆｍｓと結合する単離された抗原結合性タンパク質は、群ＢのＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３、および
（１）（ａ）配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、および（ｃ）Ｘ_１がＦおよびＶからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３がＮおよびＴからなる群から選択される、ＧＦＴＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＡＷＭＳ（配列番号３１３）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、
（２）（ａ）配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、および（ｃ）Ｘ_１がＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＧおよびＷからなる群から選択され、Ｘ_３がＴおよびＡからなる群から選択され、Ｘ_４がＹおよびＮからなる群から選択される、ＲＩＫＸ_１ＫＴＤＧＸ_２ＴＸ_３ＤＸ_４ＡＡＰＶＫＧ（配列番号３１４）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、
（３）（ａ）配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、および（ｃ）Ｘ_１がＳおよびＮからなる群から選択される、ＱＡＳＱＤＩＸ_１ＮＹＬＮ（配列番号３１６）からなる群から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、および
（４）（ａ）配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、および（ｃ）Ｘ_１がＡおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_２がＴおよびＰからなる群から選択される、ＤＸ_１ＳＮＬＥＸ_２（配列番号３１７）からなる群から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ２からなる群から選択されるＣＤＲを含む。

【0163】

一実施形態では、上記参照のように、ｃ−ｆｍｓと結合する単離された抗原結合性タンパク質は、群ＣのＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３、および
（１）（ａ）配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１、および（ｃ）Ｘ_１がＳおよびＩからなる群から選択される、ＧＦＴＦＸ_１ＳＹＧＭＨ（配列番号３１９）からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、
（２）（ａ）配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＨ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２、および（ｃ）Ｘ_１がＥおよびＫからなる群から選択される、ＶＩＷＹＤＧＳＮＸ_１ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２０）からなる群から選択されるＣＤＲＨ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、
（３）（ａ）配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ１とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１、および（ｃ）Ｘ_１がＱおよびＨからなる群から選択され、Ｘ_２がＳおよびＮからなる群から選択され、Ｘ_３がＦおよびＹからなる群から選択される、ＱＡＳＸ_１ＤＩＸ_２ＮＸ_３ＬＮ（配列番号３２２）からなる群から選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、
（４）（ａ）配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２、（ｂ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失または置換によって（ａ）のＣＤＲＬ２とアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２、および（ｃ）Ｘ_１がＴおよびＩからなる群から選択される、ＤＡＳＮＬＥＸ_１（配列番号３２３）からなる群から選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＬ２からなる群から選択されるＣＤＲを含む。

【0164】

さらに別の実施形態では、本明細書で前に記載した単離された抗原結合性タンパク質は、前述のＣＤＲＨコンセンサス配列の少なくとも１つを含む第１のアミノ酸配列、および前述のＣＤＲＬコンセンサス配列の少なくとも１つを含む第２のアミノ酸配列を含む。一態様では、第１のアミノ酸配列は前述のＣＤＲＨコンセンサス配列の少なくとも２つを含み、および／または第２のアミノ酸配列は、前述のコンセンサス配列の少なくとも２つを含む。さらに別の態様では、第１のアミノ酸配列は前述の群Ａ、Ｂ、またはＣの同じ群の少なくとも２つのＣＤＲＨを含み、および／または第２のアミノ酸配列は、前述の群Ａ、Ｂ、またはＣの同じ群の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む。さらに他の態様では、第１および第２のアミノ酸配列は、前述の群Ａ、Ｂ、またはＣの同じ群の、少なくとも１つのＣＤＲＨおよび１つのＣＤＲＬをそれぞれ含む。またその上さらなる態様では、第１のアミノ酸配列は前述の群Ａ、Ｂ、またはＣの同じ群のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、および／または第２のアミノ酸配列は、前述の群Ａ、Ｂ、またはＣの同じ群のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。

【0165】

特定の実施形態では、第１および第２のアミノ酸配列は互いに共有結合している。

【0166】

さらなる実施形態では、単離された抗原結合性タンパク質の第１のアミノ酸配列は配列番号１６５〜１９０のＣＤＲＨ３、配列番号１４８〜１６４のＣＤＲＨ２、および配列番号１３６〜１４７のＣＤＲＨ１を含み、および／または単離された抗原結合性タンパク質の第２のアミノ酸配列は、配列番号２２５〜２４６のＣＤＲＬ３、配列番号２１１〜２２４のＣＤＲＬ２、および配列番号１９１〜２１０のＣＤＲＬ１を含む。

【0167】

さらなる実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ａ中に示すような、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３，Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、Ｈ１９、Ｈ２０、Ｈ２１、Ｈ２２、Ｈ２３、Ｈ２４、Ｈ２５、Ｈ２６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ３１、またはＨ３２の少なくとも２つのＣＤＲＨ配列を含む。その上さらなる実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ｂ中に示すような、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｌ２７、Ｌ２８、Ｌ２９、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、またはＬ３４の少なくとも２つのＣＤＲＬ配列を含む。その上さらなる実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ａ中に示すような、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３，Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、Ｈ１９、Ｈ２０、Ｈ２１、Ｈ２２、Ｈ２３、Ｈ２４、Ｈ２５、Ｈ２６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ３１、またはＨ３２の少なくとも２つのＣＤＲＨ配列、および表４Ｂ中に示すような、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｌ２７、Ｌ２８、Ｌ２９、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、またはＬ３４の少なくとも２つのＣＤＲＬ配列を含む。

【0168】

さらに別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ａ中に示すような、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３，Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、Ｈ１９、Ｈ２０、Ｈ２１、Ｈ２２、Ｈ２３、Ｈ２４、Ｈ２５、Ｈ２６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ３１、またはＨ３２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。さらにまた別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ｂ中に示すような、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１７、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ２６、Ｌ２７、Ｌ２８、Ｌ２９、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、またはＬ３４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。

【0169】

さらにまた別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、表４Ａおよび４Ｂ中に示すような、Ｈ１およびＬ１、またはＨ１およびＬ２、またはＨ２およびＬ３１、またはＨ２およびＬ３３、またはＨ３およびＬ３、またはＨ４およびＬ４、またはＨ５およびＬ５、またはＨ６およびＬ６、またはＨ７およびＬ７、またはＨ８およびＬ８、またはＨ８およびＬ９、またはＨ９およびＬ３２、またはＨ９およびＬ３４、またはＨ１０およびＬ１０、またはＨ１１およびＬ１１、またはＨ１２およびＬ１２、またはＨ１３およびＬ１２、またはＨ１４およびＬ１３、またはＨ１５およびＬ１４、またはＨ１６およびＬ１５、またはＨ１７およびＬ１６、またはＨ１８およびＬ１７、またはＨ１９およびＬ１８、またはＨ２０およびＬ２０、またはＨ２１およびＬ１９、またはＨ２２およびＬ２１、またはＨ２４およびＬ２２、またはＨ２５およびＬ２３、またはＨ２６およびＬ２４、またはＨ２７およびＬ２５、またはＨ２８およびＬ２６、またはＨ２９およびＬ２７、またはＨ３０およびＬ２８、またはＨ３１およびＬ２９、またはＨ３２およびＬ３０の全６個のＣＤＲを含む。

【0170】

以下の実施例中に記載したように調製および同定した特異的抗体に関する配列情報は表４Ｃ中に要約する。参照しやすいように、いくつかの場合、参照値の最後の数字が欠落した短縮形の参照値を本明細書中で使用する。したがって、例えば、１．１０９．１は時折単に１．１０９として言及し、１．１０９．１ＳＭは１．１０９ＳＭとして言及し、１．２．１は１．２として言及し、１．２．１ＳＭは１．２ＳＭとして言及し、２．３６０．１は２．３６０として言及し、２．３６０．１ＳＭは２．３６０ＳＭとして言及するなどである。

【0171】

【表4A-1】

【0172】

【表4A-2】

【0173】

【表4B-1】

【0174】

【表4B-2】

【0175】

【表4C-1】

【0176】

【表4C-2】

【0177】

一態様では、本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはそれらの抗体断片であってよい。

【0178】

別の実施形態では、本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、または単鎖抗体分子であってよい。

【0179】

さらなる実施形態では、本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質はヒト抗体であり、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−ＩｇＧ３−またはＩｇＧ４−型であってよい。

【0180】

別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、まさに表４Ａ〜４Ｃ中に示す軽鎖または重鎖ポリペプチドからなる。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は、まさに表４Ａ〜４Ｃ中に挙げるドメインなどの可変軽鎖ドメインまたは可変重鎖ドメインからなる。このような抗原結合性タンパク質は、１つまたは複数のＰＥＧ分子でペグ化することができる。

【0181】

さらに別の態様では、本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質は標識基と結合させることが可能であり、ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外部分への結合について本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質の１つの抗原結合性タンパク質と競合し得る。一実施形態では、本明細書で提供する単離された抗原結合性タンパク質は、患者に投与したとき、単球走化を低減することができ、腫瘍への単球移動を阻害することができ、または腫瘍における腫瘍関連マクロファージの蓄積および機能を阻害することができる。

【0182】

当業者によって理解されるように、示した配列由来の２つ以上のＣＤＲを有する任意の抗原結合性タンパク質に関して、示した配列から独立に選択されるＣＤＲの任意の組合せが有用である。したがって、１、２、３、４、５または６個の独立に選択したＣＤＲを有する抗原結合性タンパク質を生成することができる。しかしながら、当業者によって理解されるように、特異的実施形態は非反復状態であるＣＤＲの組合せを一般に使用し、例えば、抗原結合性タンパク質は一般に２つのＣＤＲＨ２領域などで作製しない。

【0183】

提供する抗原結合性タンパク質のいくつかは、以下でさらに詳細に論じる。

【0184】

抗原結合性タンパク質および結合エピトープおよび結合ドメイン
抗原結合性タンパク質が特定残基内のエピトープ、ｃ−ｆｍｓ、またはｃ−ｆｍｓの細胞外ドメインなどと結合すると言われるとき、例えば、抗原結合性タンパク質がｃ−ｆｍｓの特定部分と特異的に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は特定残基（例えば、ｃ−ｆｍｓの特定セグメント）からなるポリペプチドと特異的に結合する。このような抗原結合性タンパク質は、典型的にはｃ−ｆｍｓ、またはｃ−ｆｍｓの細胞外ドメイン内のあらゆる残基と接触するということはない。ｃ−ｆｍｓ、またはｃ−ｆｍｓの細胞外ドメイン内のそれぞれ個々のアミノ酸の置換または欠失が、結合親和性に必ずしも有意に影響を与えるわけでもない。

【0185】

抗原結合性タンパク質のエピトープ特異性および（１つまたは複数の）結合ドメインは、様々な方法によって決定することができる。例えば、いくつかの方法は抗原の短縮型部分を使用することができる。他の方法は、１つまたは複数の特異的残基で突然変異した抗原を利用する。

【0186】

抗原の短縮型部分を使用する方法に関して、１つの例示的な手法では、重複ペプチドの集合を使用することができる。重複ペプチドは、抗原の配列に広がっておりかつ少数のアミノ酸（例えば、３アミノ酸）の増分（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）で異なる約１５アミノ酸からなる。ペプチドはマイクロタイターディッシュのウェル内または膜上の異なる場所に固定する。ペプチドの一末端のビオチン化によって固定を実施することができる。場合によっては、同じペプチドの異なるサンプルをアミノ末端およびカルボキシ末端でビオチン化することができ、比較の目的で別々のウェル中に固定することができる。これは末端特異的抗原結合性タンパク質を同定するのに有用である。場合によっては、対象とする特定のアミノ酸で終結させる追加的ペプチドを含めることができる。この手法は、ｃ−ｆｍｓの内部断片（またはｃ−ｆｍｓの細胞外ドメイン）に対する末端特異的抗原結合性タンパク質を同定するのに有用である。抗原結合性タンパク質または免疫機能性断片は、様々なペプチドのそれぞれとの特異的結合に関してスクリーニングする。抗原結合性タンパク質がそれに対する特異的結合を示す全ペプチドに共通であるアミノ酸のセグメントと共に存在するとして、エピトープを定義する。エピトープを定義するための特異的手法に関する詳細は実施例１２中に述べる。

【0187】

実施例１２中に実証するように、一実施形態では、本明細書で提供する抗原結合性タンパク質は、Ｉｇ様ドメイン１とＩｇ様ドメイン２を組合せで含むポリペプチドと結合することができる。しかしながらそれらは、元来Ｉｇ様ドメイン１のみまたは元来Ｉｇ様ドメイン２のみを含有するポリペプチドとは結合しない。このような抗原結合性タンパク質の結合エピトープは、したがってＩｇ様１ドメインとＩｇ様２ドメインを組み合わせて三次元的に構成される。図８中に強調表示するように、これら２つのドメインは、以下のアミノ酸配列を有するｃ−ｆｍｓ細胞外ドメインのアミノ酸２０〜２２３を含む：

【0188】

【化3】

【0189】

Ｉｇ様１ドメインを表すために実施例１２中で使用したアミノ酸配列は、図８中に示す配列のアミノ酸２０〜１２６に相当する（すなわち、配列番号１のアミノ酸２０〜１２６、すなわち

【0190】

【化4】

【0191】

）。Ｉｇ様２ドメインのみを表すために使用したアミノ酸配列は、図８中に示す配列のアミノ酸８５〜２２３に相当した（すなわち、配列番号１のアミノ酸８５〜２２３、すなわち

【0192】

【化5】

【0193】

）。

【0194】

したがって、一実施形態における抗原結合性タンパク質は、配列番号３２６で指定するアミノ酸配列を有するｃｆｍｓタンパク質（例えば、成熟完全長タンパク質）内の領域と結合または特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号３２６で記載するアミノ酸残基から本質的になるかまたはこれらからなるポリペプチドと結合または特異的に結合する。

【0195】

別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、図８中に示す配列のアミノ酸２０〜１２６（すなわち、配列番号１のアミノ酸２０〜１２６）からなるポリペプチドではなく、配列番号３２６からなるポリペプチドと結合または特異的に結合することができる。別の態様では、抗原結合性タンパク質は、図８中に示す配列のアミノ酸８５〜２２３（すなわち、配列番号１のアミノ酸８５〜２２３）からなるポリペプチドではなく、配列番号３２６からなるポリペプチドと結合または特異的に結合することができる。さらに別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、図８中に示す配列のアミノ酸２０〜１２６（すなわち、配列番号１のアミノ酸２０〜１２６）または図８中に示す配列のアミノ酸８５〜２２３（すなわち、配列番号１のアミノ酸８５〜２２３）からなるポリペプチドではなく、配列番号３２６からなるポリペプチドと結合または特異的に結合することができる。

【0196】

別の手法では、抗体と接触しているかまたは抗体に埋もれた残基を含有する（１つまたは複数の）ドメイン／（１つまたは複数の）領域は、抗原（例えば、野生型抗原）中の特異的残基を突然変異させること、および抗原結合性タンパク質が突然変異タンパク質と結合することができるかどうかを決定することによって同定することができる。いくつか個別の突然変異を作製することによって、結合において直接的役割を果たし、または抗原結合性タンパク質と抗原の間の結合に突然変異が影響を与え得るほど抗体と十分極めて接近した残基を同定することができる。これらのアミノ酸の知識から、抗原結合性タンパク質と接触しているかまたは抗体によって覆われた残基を含有する抗原の（１つまたは複数の）ドメインまたは（１つまたは複数の）領域を解明することができる。このようなドメインは、抗原結合性タンパク質の結合エピトープを典型的には含む。この一般的手法の１つの具体例は、アルギニン／グルタミン酸スキャニングプロトコルを使用する（例えば、Ｎａｎｅｖｉｃｚ、Ｔら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０巻：３７号、２１６１９〜２１６２５頁およびＺｕｐｎｉｃｋ、Ａら、２００６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１巻：２９号、２０４６４〜２０４７３頁を参照）。一般に、アルギニンおよびグルタミン酸は野生型ポリペプチド中のアミノ酸と（典型的には個別に）置換される。これらのアミノ酸は帯電しておりしかも大きいため、したがって突然変異を導入する抗原の領域中の抗原結合性タンパク質と抗原の間の結合を妨害する可能性があるからである。野生型抗原中に存在するアルギニンおよびリシンはグルタミン酸と交換される。様々なこのような個別の突然変異体を得て、収集した結合の結果を分析して、どの残基が結合に影響を与えるかを決定する。

【0197】

実施例１４は、本明細書で提供するｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質に関するヒトｃ−ｆｍｓのアルギニン／グルタミン酸スキャニングを記載する。それぞれの突然変異体抗原が１つの突然変異を有する、一連の９５個の突然変異体ヒトｃ−ｆｍｓ抗原を作製した。それぞれの突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原と本明細書で提供する選択したｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の結合を測定し、野生型ｃ−ｆｍｓ抗原（配列番号１）と結合するこれらの選択した結合性タンパク質の能力と比較した。本明細書で使用する抗原結合性タンパク質と突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原の間の結合の低下は、（例えば、実施例中に記載するようなＢｉａｃｏｒｅ試験などの知られている方法によって測定したように、）結合親和性の低下、および／または（例えば、抗原結合性タンパク質濃度と抗原濃度のプロット中のＢｍａｘの低下によって実証したように、）抗原結合性タンパク質の全体的結合能力の低下があることを意味する。結合の有意な低下は、突然変異した残基が抗原結合性タンパク質との結合に直接関与していること、または結合性タンパク質が抗原と結合するとき、結合性タンパク質と極めて接近していることを示す。

【0198】

いくつかの実施形態では、結合の有意な低下は、抗原結合性タンパク質と突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原の間の結合親和性および／または結合能力が、結合性タンパク質と野生型ｃ−ｆｍｓ抗原（例えば、配列番号１で示す細胞外ドメイン）の間の結合と比較して、４０％を超えて、５０％を超えて、５５％を超えて、６０％を超えて、６５％を超えて、７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えてまたは９５％を超えて低下することを意味する。特定の実施形態では、結合は検出可能な限界未満に低下する。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質と突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原の結合が、抗原結合性タンパク質と野生型ｃ−ｆｍｓ抗原（例えば、配列番号１で示す細胞外ドメイン）の間で観察した結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）であるとき、結合の有意な低下が実証される。このような結合測定は、当技術分野で知られている様々な結合アッセイを使用して実施することができる。１つのこのようなアッセイの具体例は実施例１４中に記載する。

【0199】

いくつかの実施形態では、野生型ｃ−ｆｍｓ抗原（例えば、配列番号１）中の残基がアルギニンまたはグルタミン酸で置換された突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す、抗原結合性タンパク質を提供する。１つのこのような実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と比較して、以下の突然変異体：Ｅ２９Ｒ、Ｑ１２１Ｒ、Ｔ１５２Ｒ、およびＫ１８５Ｅのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３または４個）を有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下する。ここで使用する簡単な表記では、その形式は：野生型残基：ポリペプチド中の位置：突然変異体残基、および配列番号１で示すような残基のナンバリングである。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と比較して、以下の突然変異体：Ｅ２９Ｒ、Ｑ１２１Ｒ、Ｓ１７２Ｒ、Ｇ２７４Ｒ、およびＹ２７６Ｒのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５個）を有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下する。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と比較して、以下の突然変異体：Ｒ１０６Ｅ、Ｈ１５１Ｒ、Ｔ１５２Ｒ、Ｙ１５４Ｒ、Ｓ１５５Ｒ、Ｗ１５９Ｒ、Ｑ１７１Ｒ、Ｓ１７２Ｒ、Ｑ１７３Ｒ、Ｇ１８３Ｒ、Ｒ１８４Ｅ、Ｋ１８５Ｅ、Ｅ２１８Ｒ、Ａ２２０Ｒ、Ｓ２２８Ｒ、Ｈ２３９Ｒ、Ｎ２４０Ｒ、Ｋ２５９Ｅ、Ｇ２７４Ｒ、Ｎ２７５Ｒ、Ｙ２７６Ｒ、Ｓ２７７Ｒ、およびＮ２８２Ｒのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５個など、２３個まで）を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。なおもさらなる実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）との結合と比較して、以下の突然変異体：Ｋ１０２Ｅ、Ｒ１４４Ｅ、Ｒ１４６Ｅ、Ｄ１７４Ｒ、およびＡ２２６Ｒのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５個）を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下する。さらに他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と比較して、以下の突然変異体：Ｗ５０Ｒ、Ａ７４Ｒ、Ｙ１００Ｒ、Ｄ１２２Ｒ、Ｔ１３０Ｒ、Ｇ１６１Ｒ、Ｙ１７５Ｒ、およびＡ１７９Ｒのいずれか１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個）を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。

【0200】

ここに挙げる突然変異体型は配列番号１で示す野生型細胞外ドメイン配列に対して参照するが、ｃ−ｆｍｓの対立遺伝子変異体では、示した位置におけるアミノ酸は異なる可能性があることは理解されよう。このようなｃ−ｆｍｓの対立遺伝子型に対して有意に低下した結合を示す抗原結合性タンパク質も企図する。したがって、一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と比較して、対立遺伝子ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を有する。ここでは、対立遺伝子抗原の以下の残基の１つまたは複数（例えば、１、２、３または４個）が２９Ｒ、１２１Ｒ、１５２Ｒ、および１８５Ｅで示すようにアルギニンまたはグルタミン酸と交換される（ポリペプチド中の位置：突然変異体残基、および配列番号１で示す残基のナンバリングを用いる）。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、以下の残基の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５個）を２９Ｒ、１２１Ｒ、１７２Ｒ、２７４Ｒ、および２７６Ｒで示すようにアルギニンまたはグルタミン酸と交換される対立遺伝子ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、以下の残基の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５個など、２３個まで）が、１０６Ｅ、１５１Ｒ、１５２Ｒ、１５４Ｒ、１５５Ｒ、１５９Ｒ、１７１Ｒ、１７２Ｒ、１７３Ｒ、１８３Ｒ、１８４Ｅ、１８５Ｅ、２１８Ｒ、２２０Ｒ、２２８Ｒ、２３９Ｒ、２４０Ｒ、２５９Ｅ、２７４Ｒ、２７５Ｒ、２７６Ｒ、２７７Ｒ、および２８２Ｒで示すようにアルギニンまたはグルタミン酸と交換される対立遺伝子ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。なおもさらなる他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、以下の残基の任意の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５個）が、１０２Ｅ、１４４Ｅ、１４６Ｅ、１７４Ｒ、および２２６Ｒで示すようにアルギニンまたはグルタミン酸と交換される対立遺伝子ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を有する。さらに他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、以下の残基の任意の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個）が、５０Ｒ、７４Ｒ、１００Ｒ、１２２Ｒ、１３０Ｒ、１６１Ｒ、１７５Ｒ、および１７９Ｒで示すようにアルギニンまたはグルタミン酸と交換される対立遺伝子ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。

【0201】

いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型ｃ−ｆｍｓ抗原中の選択した位置における残基が任意の他の残基に突然変異する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下する。例えば、一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、位置２９、１２１、１５２、および１８５（この場合位置は配列番号１中で示すのと同様である）の１つまたは複数（例えば、１、２、３または４箇所）に１つのアミノ酸置換を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を示す。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、配列番号１の位置２９、１２１、１７２、２７４および２７６の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５箇所）に１つのアミノ酸置換を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を有する。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、配列番号１の野生型ｃ−ｆｍｓに対する結合と比較して、配列番号１の位置１０６、１５１、１５２、１５４、１５５、１５９、１７１、１７２、１７３、１８３、１８４、１８５、２１８、２２０、２２８、２３９、２４０、２５９、２７４、２７５、２７６、２７７、および２８２の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５個など、２３箇所まで）に１つのアミノ酸置換を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下する。なおもさらなる実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、配列番号１の位置１０２、１４４、１４６、１７４、および２２６の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４または５箇所）に１つのアミノ酸置換を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を有する。さらに他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、野生型ｃ−ｆｍｓ（例えば、配列番号１）と結合するその能力と比較して、位置５０、７４、１００、１２２、１３０、１６１、１７５、および１７９の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８箇所）に１つのアミノ酸置換を含有する突然変異体ｃ−ｆｍｓ抗原に対して有意に低下した結合を有する。

【0202】

前述のように、結合に直接関与するかまたは抗原結合性タンパク質によって覆われる残基は、スキャニング結果から同定することができる。したがってこれらの残基は、抗原結合性タンパク質が結合する（１つまたは複数の）結合領域を含有する配列番号１のドメインまたは領域の指標となる可能性がある。実施例１４中に要約する結果から見ることができるように、一実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸２９〜１８５を含有するドメインと結合する。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸２９〜２７６を含有する領域と結合する。他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸１０６〜２８２を含有する領域と結合する。さらに他の実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸１０２〜２２６を含有する領域と結合する。さらに別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸５０〜１７９を含有する領域と結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号１の完全長配列の断片内の前述の領域と結合する。他の実施形態では、抗原結合性タンパク質はこれらの領域からなるポリペプチドと結合する。特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は配列番号１のアミノ酸９０〜２８２を含有する領域と結合する。別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は以下の領域：配列番号１のアミノ酸９０〜１８５およびアミノ酸２１７〜２８２の一方または両方と結合する。さらに別の実施形態では、抗原結合性タンパク質は以下の領域：配列番号１のアミノ酸１２１〜１８５およびアミノ酸２１７〜２７７の一方または両方と結合する。

【0203】

抗原結合性タンパク質の競合
別の態様では、ｃ−ｆｍｓとの特異的結合に関して前に記載したエピトープと結合する例示的な抗体または機能断片の１つと競合する、抗原結合性タンパク質を提供する。このような抗原結合性タンパク質は、本明細書中の例示的な抗原結合性タンパク質の１つと同じエピトープ、または重複エピトープと結合することもできる。例示的な抗原結合性タンパク質と同じエピトープと競合またはそれと結合する抗原結合性タンパク質および断片は、類似した機能的特性を示すと予想される。例示的な抗原結合性タンパク質および断片は、表１、２、３、および４Ａ〜Ｃ中に含まれる重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲを有する抗原結合性タンパク質および断片を含めた、前に記載した抗原結合性タンパク質および断片を含む。したがって、具体例として、提供する抗原結合性タンパク質は、
（ａ）表４Ｃ中に挙げた抗体に関して挙げたＣＤＲの全６個、
（ｂ）表４Ｃ中に挙げた抗体に関して挙げたＶＨおよびＶＬ、または
（ｃ）表４Ｃ中に挙げた抗体に関して指定した２つの軽鎖および２つの重鎖
を有する抗体と競合する抗原結合性タンパク質を含む。

【0204】

モノクローナル抗体
提供する抗原結合性タンパク質は、ｃ−ｆｍｓと結合するモノクローナル抗体を含む。当技術分野で知られている任意の技法を使用して、例えば、免疫処置スケジュールの終了後にトランスジェニック動物から採取した脾細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生することができる。脾細胞は、当技術分野で知られている任意の技法を使用して、例えば、それらとミエローマ細胞を融合してハイブリドーマを産生することによって不死化することができる。ハイブリドーマ産生融合手順中で使用するためのミエローマ細胞は、高い融合効率、および望ましい融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を助長する特定選択培地中でそれらが増殖不能となる酵素欠損を有する、非抗体産生細胞であることが好ましい。マウス融合において使用するのに適した細胞系の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ｌ、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸＯＢｕｌがあり、ラット融合において使用される細胞系の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０がある。細胞融合に有用な他の細胞系はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。

【0205】

いくつかの場合、ハイブリドーマ細胞系は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をｃ−ｆｍｓ免疫原で免疫処置し、免疫処置した動物から脾細胞を採取し、採取した脾細胞とミエローマ細胞系を融合し、それによってハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞系を樹立し、かつｃ−ｆｍｓポリペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することによって産生する。このようなハイブリドーマ細胞系、およびそれらによって産生される抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体は本出願の態様である。

【0206】

ハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体は、当技術分野で知られている任意の技法を使用して精製することができる。ハイブリドーマまたはモノクローナル抗体をさらにスクリーニングして、Ｗｎｔ誘導型活性を遮断する能力などの、特定の性質を有するモノクローナル抗体を同定することができる。このようなスクリーニングの例は以下の実施例中に与える。

【0207】

キメラ抗体およびヒト化抗体
前述の配列に基づくキメラ抗体およびヒト化抗体も提供する。治療剤として使用するためのモノクローナル抗体は、使用前に様々な方法で修飾することができる。一例は、共有結合して機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖を生成する異なる抗体由来のタンパク質セグメントまたはその免疫機能部分から構成される抗体である、キメラ抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定種由来または特定抗体クラスもしくはサブクラス所属の抗体中の相当する配列と同一または相同であり、一方その（１つまたは複数の）鎖の残り部分は、別種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラス所属の抗体中の相当する配列と同一または相同である。キメラ抗体に関する方法に関しては、例えば、参照によって本明細書に組み込んだ、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１巻：６８５１〜６８５５頁を参照されたい。例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号中にＣＤＲ移植が記載される。

【0208】

一般に、キメラ抗体を産生する目的は、目的の患者種由来のアミノ酸の数が最大であるキメラを作製することである。一例は、特定種由来または特定抗体クラスもしくはサブクラス所属であり、一方抗体の（１つまたは複数の）鎖の残り部分が、別種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラス所属の抗体中の相当する配列と同一または相同である、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を抗体がその中に含む「ＣＤＲ移植」抗体である。ヒト中で使用するために、げっ歯類抗体由来の可変領域または選択ＣＤＲをヒト抗体に移植し、ヒト抗体の天然に存在する可変領域またはＣＤＲと交換することが多い。

【0209】

１つの有用な型のキメラ抗体は「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト動物中で最初に起こされたモノクローナル抗体から産生される。典型的にはモノクローナル抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体中の特定のアミノ酸残基を、相当するアイソタイプのヒト抗体中の相当する残基と相同的であるように修飾する。例えば、げっ歯類の可変領域の少なくとも一部分でヒト抗体の相当する領域を置換することにより、様々な方法を使用してヒト化を実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ３３２巻：３２３〜２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９巻：１５３４〜１５３６頁を参照）。

【0210】

一態様では、本明細書で提供する抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ（表３参照）を、同じ、または異なる系統発生種由来の抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植する。例えば、重鎖および軽鎖可変領域Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４、Ｖ_Ｈ５、Ｖ_Ｈ６、Ｖ_Ｈ７、Ｖ_Ｈ８、Ｖ_Ｈ９、Ｖ_Ｈ１０、Ｖ_Ｈ１１、Ｖ_Ｈ１２、Ｖ_Ｈ１３、Ｖ_Ｈ１４、Ｖ_Ｈ１５、Ｖ_Ｈ１６、Ｖ_Ｈ１７、Ｖ_Ｈ１８、Ｖ_Ｈ１９、Ｖ_Ｈ２０、Ｖ_Ｈ２１、Ｖ_Ｈ２２、Ｖ_Ｈ２３、Ｖ_Ｈ２４、Ｖ_Ｈ２５、Ｖ_Ｈ２６、Ｖ_Ｈ２７、Ｖ_Ｈ２８、Ｖ_Ｈ２９、Ｖ_Ｈ３０、Ｖ_Ｈ３１、およびＶ_Ｈ３２、および／またはＶ_Ｌ１、Ｖ_Ｌ２、Ｖ_Ｌ３、Ｖ_Ｌ４、Ｖ_Ｌ５、Ｖ_Ｌ６、Ｖ_Ｌ７、Ｖ_Ｌ８、Ｖ_Ｌ９、Ｖ_Ｌ１０、Ｖ_Ｌ１１、Ｖ_Ｌ１２、Ｖ_Ｌ１３、Ｖ_Ｌ１４、Ｖ_Ｌ１５、Ｖ_Ｌ１６、Ｖ_Ｌ１７、Ｖ_Ｌ１８、Ｖ_Ｌ１９、Ｖ_Ｌ２０、Ｖ_Ｌ２１、Ｖ_Ｌ２２、Ｖ_Ｌ２３、Ｖ_Ｌ２４、Ｖ_Ｌ２５、Ｖ_Ｌ２６、Ｖ_Ｌ２７、Ｖ_Ｌ２８、Ｖ_Ｌ２９、Ｖ_Ｌ３０、Ｖ_Ｌ３１、Ｖ_Ｌ３２、Ｖ_Ｌ３３、およびＶ_Ｌ３４のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。他の実施形態では、本明細書で開示する重鎖または軽鎖のＦＲを、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲと交換する。一態様では、抗ｃ−ｆｍｓ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ中の稀なアミノ酸は交換せず、一方残りのＦＲアミノ酸を交換する。「稀なアミノ酸」は、この特定のアミノ酸がＦＲにおいて通常見られない位置に存在する特異的アミノ酸である。あるいは、１つの重鎖または軽鎖由来の移植可変領域を、本明細書で開示するその特定重鎖または軽鎖の定常領域と異なる定常領域と共に使用することができる。他の実施形態では、移植可変領域は単鎖Ｆｖ抗体の一部分である。

【0211】

特定の実施形態では、ヒト以外の種由来の定常領域を、（１つまたは複数の）ヒト可変領域と共に使用して、ハイブリッド抗体を産生することができる。

【0212】

完全ヒト抗体
完全ヒト抗体も提供する。人間を抗原に曝さずに所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体を作製するために、いくつかの方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の産生を実施するために提供する１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウス中へのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の望ましい抗原で免疫処置することができる動物であるマウスにおいて、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する１つの手段である。完全ヒト抗体を使用することによって、治療剤としてマウスモノクローナル抗体またはマウス由来モノクローナル抗体をヒトに投与することによって時折引き起こされる可能性がある、免疫応答およびアレルギー応答を最小にすることができる。

【0213】

内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常マウス）を免疫処置することによって、完全ヒト抗体を産生することができる。この目的の抗原は６個以上の隣接アミノ酸を典型的に有し、場合によってはハプテンなどの担体と結合する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻：２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ３６２巻：２５５〜２５８頁；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３年、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７巻：３３頁を参照されたい。このような方法の一例では、その中にマウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無力化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大きな断片をマウスゲノムに挿入することによって、トランスジェニック動物を生成する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の不完全部分を有する部分的に改変した動物を、次いで異種交配して望ましい免疫系改変のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるが、可変領域を含めネズミアミノ酸配列ではなくヒトアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関する他の方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第６，７１３，６１０号、同第６，６７３，９８６号、同第６，１６２，９６３号、同第５，５４５，８０７号、同第６，３００，１２９号、同第６，２５５，４５８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号および同第５，５４５，８０６号中、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６中、およびＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６０７３Ａ１中に記載されている。

【0214】

本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ぶ、前に記載したトランスジェニックマウスは、非再構成ヒト重鎖（［μ］および［γ］）および［κ］軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座を、内因性［μ］および［κ］鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異とともに含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ３６８巻：８５６〜８５９頁）。したがって、このマウスはマウスＩｇＭまたは［κ］の低減した発現を示し、かつ免疫処置に応じて、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラスの変化および体細胞突然変異を経て高親和性ヒトＩｇＧ［κ］モノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５〜９３頁；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９５年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４巻：５３６〜５４６頁）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０巻：６２８７〜６２９５頁；Ｃｈｅｎら、１９９３年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５巻：６４７〜６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２巻：２９１２〜２９２０頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ３６８巻：８５６〜８５９頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９４年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１１３巻：４９〜１０１頁；Ｔａｙｌｏｒら、１９９４年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６巻：５７９〜５９１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５〜９３頁；Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９５年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４巻：５３６〜５４６頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４巻：８４５〜８５１頁中に詳細に記載されており、前述の参照文献はあらゆる目的でその全容を参照によって本明細書に組み込む。そのすべての開示があらゆる目的でその全容を参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開ＷＯ９３／１２２７、ＷＯ９２／２２６４６、およびＷＯ９２／０３９１８をさらに参照のこと。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を産生するために使用される技術は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／２４８９３、およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５巻：１４６〜１５６頁中にも開示される。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス株を使用して抗ｃ−ｆｍｓ抗体を生成することができる。トランスジェニックマウスを使用したヒト抗体の産生に関するさらなる詳細は、以下の実施例中に与える。

【0215】

ハイブリドーマ技術を使用して、望ましい特異性を有する抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を、前に記載したトランスジェニックマウスなどのトランスジェニックマウスから産生および選択することができる。このような抗体は適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングし発現させることが可能であり、または抗体は培養したハイブリドーマ細胞から採取することができる。

【0216】

完全ヒト抗体は、（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２７巻：３８１頁；およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１頁中に開示されたのと同様に）ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる。ファージディスプレイ技法は、繊維状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーの提示による免疫選択、およびそれに続く選択した抗原とのそれらの結合によるファージの選択を模倣する。１つのこのような技法は、このような手法を使用したＭＰＬ−受容体およびｍｓｋ−受容体に対する高親和性かつ機能性アゴニスト抗体の単離を記載する、（参照によって本明細書に組み込まれる）ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１０４９４中に記載される。

【0217】

二重特異性または二重機能性抗原結合性タンパク質
提供する抗原結合性タンパク質は、前に記載した１つまたは複数のＣＤＲまたは１つまたは複数の可変領域を含む、二重特異性および二重機能性抗体も含む。二重特異性抗体または二重機能性抗体は、いくつかの場合、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結だけには限られないが、これらを含めた様々な方法によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９巻：３１５〜３２１頁；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：１５４７〜１５５３頁を参照されたい。

【0218】

様々な他の形
提供する抗原結合性タンパク質のいくつかは、前に開示した抗原結合性タンパク質（例えば、表１〜４中に挙げた配列を有するタンパク質）の変異型である。例えば、抗原結合性タンパク質のいくつかは、表１〜４中に挙げた重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲの１つまたは複数において、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する。

【0219】

天然に存在するアミノ酸は一般的な側鎖の性質に基づいていくつかのクラスに分けることができる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0220】

保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーと同じクラスの別のメンバーの交換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系中での合成によってというよりは寧ろ化学ペプチド合成によって典型的に組み込まれた、天然に存在しないアミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド模倣体および他の逆型または反転型のアミノ酸部分を含む。

【0221】

非保存的置換は、前述のクラスの１つのメンバーと別のクラス由来のメンバーの交換を含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体と相同的である抗体の領域中、または分子の非相同的領域中に導入することができる。

【0222】

このような変化を施す際に、特定の実施形態に従い、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することができる。タンパク質のハイドロパシープロファイルは、それぞれのアミノ酸に数値（「ハイドロパシーインデックス」）を割り当てること、および次いでペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均することによって計算する。その疎水性および電荷特性に基づいて、それぞれのアミノ酸にハイドロパシーインデックスを割り当てた。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（塩）（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（塩）（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

【0223】

タンパク質に相互作用的生物機能を与える際のハイドロパシープロファイルの重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７巻：１０５〜１３１頁を参照）。特定のアミノ酸を、類似したハイドロパシーインデックスまたはスコアを有し類似した生物活性を依然として保持する、他のアミノ酸で置換することができることは知られている。ハイドロパシーインデックスに基づいて変化を施す際に、特定の実施形態では、そのハイドロパシーインデックスが±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの態様では±１以内であるアミノ酸が含まれ、他の態様では±０．５以内であるアミノ酸が含まれる。

【0224】

特に、このように生成する生物機能性タンパク質またはペプチドが、本発明の場合のように免疫学的実施形態における使用を目的とする場合、親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換を効率良く施すことができることも、当技術分野で理解されている。特定の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原結合性または免疫原性、すなわちタンパク質の生物学的性質と相関関係がある。

【0225】

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（塩）（＋３．０±１）；グルタミン酸（塩）（＋３．０±１）；；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変化を施す際に、特定の実施形態では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内であるアミノ酸が含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５以内であるアミノ酸が含まれる。いくつかの場合、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。

【0226】

例示的な保存的アミノ酸置換を表５中に述べる。

【0227】

【表5-1】

【0228】

【表5-2】

【0229】

当業者は、よく知られている技法を使用して、本明細書で言及するポリペプチドの適切な変異体を決定することができるはずである。当業者は、活性に重要であると考えられない領域の標的化により活性を損なわずに変えることができる、分子の適切な領域を同定することができる。当業者は、類似したポリペプチド中で保存される残基および分子の一部分を同定することもできるはずである。さらなる実施形態では、生物活性または構造に重要である可能性がある領域さえも、生物活性を損なわずに、またはポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を施すことができる。

【0230】

さらに、当業者は構造−機能試験を概説し、活性または構造に重要である類似したポリペプチド中の残基を同定することができる。このような比較を鑑みて、類似したタンパク質中の活性または構造に重要であるアミノ酸残基に相当する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予想することができる。当業者は、このような予想される重要なアミノ酸残基と化学的に類似したアミノ酸の置換を選択することができる。

【0231】

当業者は、類似したポリペプチド中のその構造に関する３次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を鑑みて、当業者は、その三次元構造に対する抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予想することができる。このような残基は他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるので、タンパク質の表面に存在すると予想されるアミノ酸残基に根本的な変更を施さないことを、当業者は選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの望ましいアミノ酸残基に１アミノ酸置換を含有する試験用変異体を作製することができる。したがってこれらの変異体は、ｃ−ｆｍｓ中和活性に関するアッセイを使用してスクリーニングし（以下の実施例参照）、それによってどのアミノ酸を変えることができるか、およびどのアミノ酸を変えてはならないかに関する情報を得ることができる。言い換えると、このような通常の実験から集めた情報に基づいて、いずれか単独または他の突然変異と組み合わせたさらなる置換を避けるべきアミノ酸位置を、当業者は容易に決定することができる。

【0232】

いくつかの科学出版物は二次構造の予想をテーマにしている。Ｍｏｕｌｔ、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７巻：４２２〜４２７頁；Ｃｈｏｕら、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３巻：２２２〜２４５頁；Ｃｈｏｕら、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１３巻：２１１〜２２２頁；Ｃｈｏｕら、１９７８年、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７巻：４５〜１４８頁；Ｃｈｏｕら、１９７９年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７巻：２５１〜２７６頁；およびＣｈｏｕら、１９７９年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６巻：３６７〜３８４頁を参照されたい。さらに、二次構造の予想を手助けするための、いくつかのコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予想する１つの方法は相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似した構造トポロジーを有し得る。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の増大は、ポリペプチドの構造またはタンパク質の構造内の考えられるフォールディング数を含めた、二次構造の高い予測可能性をもたらしている。Ｈｏｌｍら、１９９９年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７巻：２４４〜２４７頁を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質中には限られた数のフォールディングが存在すること、および重要な数の構造を解明した後、構造の予想は劇的にさらに正確となり得ることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７巻：３６９〜３７６頁）。

【0233】

二次構造を予想するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７巻：３７７〜３８７頁；Ｓｉｐｐｌら、１９９６年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ４巻：１５〜１９頁）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３巻：１６４〜１７０頁；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３巻：１４６〜１５９頁；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４巻：４３５５〜４３５８頁）、および「進化的連鎖」（Ｈｏｌｍ、１９９９年、上記参照；およびＢｒｅｎｎｅｒ、１９９７年、上記を参照）がある。

【0234】

いくつかの実施形態では、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）タンパク質複合体形成に対する結合親和性を変える、（４）リガンド結合親和性または抗原結合親和性を変える、および／または（４）他の物理化学的性質または機能的性質をこのようなポリペプチドに与えるかまたはそれらを改変するアミノ酸置換を施す。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）を天然に存在する配列に施すことができる。分子間接触を形成する（１つまたは複数の）ドメイン外に存在する抗体のその部分に置換を施すことができる。このような実施形態では、親配列の構造特性を実質的に変えない保存的アミノ酸置換を使用することができる（例えば、親または天然の抗原結合性タンパク質を特徴付ける二次構造を損なわない１つまたは複数の置換アミノ酸）。当技術分野で理解されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、編）、１９８４年、Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ、編）、１９９１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ３５４巻：１０５頁中に記載される。

【0235】

他の好ましい抗体変異体には、親または天然アミノ酸配列中の１つまたは複数のシステイン残基が欠失しているかまたは別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されている、システイン変異体がある。特に抗体を生物活性がある高次構造にリフォールディングしなければならないとき、システイン変異体は有用である。システイン変異体は天然抗体より少ないシステイン残基を有することができ、典型的には不対システインからの相互作用を最小にするために偶数を有する。

【0236】

開示する重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲを使用して、ｃ−ｆｍｓポリペプチドと特異的に結合することができる抗原結合性領域を含有するポリペプチドを調製することができる。例えば、表３および４中に挙げた１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的に分子（例えば、ポリペプチド）中に取り込んで免疫接着をもたらすことができる。免疫接着は大きなポリペプチド鎖の一部分として（１つまたは複数の）ＣＤＲを取り込むことができ、（１つまたは複数の）ＣＤＲと別のポリペプチド鎖を共有結合させることが可能であり、あるいは（１つまたは複数の）ＣＤＲを非共有結合的に取り込むことができる。（１つまたは複数の）ＣＤＲは、対象とする特定の抗原（例えば、ｃ−ｆｍｓポリペプチドまたはそのエピトープ）と特異的に結合する免疫接着を可能にする。

【0237】

本明細書に記載される可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく、模倣体（例えば、「ペプチド 模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」）も提供する。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチドまたはペプチド領域と非ペプチド領域の組合せであってよい。任意の目的で参照によって本明細書に組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、１９８６年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５巻：２９頁；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、１９８５年、ＴＩＮＳ．３９２頁；およびＥｖａｎｓら、１９８７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０巻：１２２９頁。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、類似する治療または予防効果をもたらすことができる。このような化合物は、コンピュータによる分子モデリングの助力を受けて開発されることが多い。一般に、ペプチド模倣体は、ここでのｃ−ｆｍｓと特異的に結合する能力などの望ましい生物活性を示す抗体と構造的に類似するが、当技術分野でよく知られている方法によって、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ_２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２−、および−ＣＨ_２ＳＯ−から選択される結合により場合によっては置換された１つまたは複数のペプチド結合を有するタンパク質である。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸と同じ型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）の系統的置換を、特定の実施形態において使用して、より安定したタンパク質を生成することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変異体を含む拘束性ペプチドを、当技術分野で知られている方法、例えば、ペプチドを環状にする分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることによって生成することができる（参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ、１９９２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１巻：３８７頁））。

【0238】

本明細書で記載する抗原結合性タンパク質の誘導体も提供する。誘導体化抗原結合性タンパク質は、特定の使用における増大した半減期などの望ましい性質を抗体または断片に与える任意の分子または物質を含むことができる。誘導体化抗原結合性タンパク質は、例えば、検出可能（または標識）成分（例えば、放射活性、比色、抗原分子または酵素分子、検出可能ビーズ（磁気または高電子密度（例えば金）ビーズなど）、または別の分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン））と結合する分子、治療用成分または診断用成分（例えば、放射活性成分、細胞傷害性成分、または薬剤活性成分）、または特定の使用（例えば、ヒト対象などの対象への投与、または他のｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用）に関する抗原結合性タンパク質の適合性を増大する分子を含むことができる。抗原結合性タンパク質を誘導体化するために使用することができる分子の例には、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。抗原結合性タンパク質のアルブミン結合誘導体およびペグ化誘導体は、当技術分野でよく知られている技法を使用して調製することができる。特定の抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載されるペグ化単鎖ポリペプチドを含む。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体と結合または他の場合は連結する。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えばデキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学的に修飾することができる。

【0239】

他の誘導体は、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質のＮ末端またはＣ末端と融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質と他のタンパク質またはポリペプチドの共有結合体または凝集結合体を含む。例えば、結合ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母α因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってよい。ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質含有融合タンパク質は、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の精製または同定を容易にするために加えるペプチドを含むことができる（例えば、ポリ−ヒス）。ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、Ｈｏｐｐら、１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６巻：１２０４頁および米国特許第５，０１１，９１２号中に記載されたように、ＦＬＡＧペプチドと結合させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは高抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合したエピトープを与え、発現した組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドと融合した融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。

【0240】

１つまたは複数のｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含有するオリゴマーは、ｃ−ｆｍｓアンタゴニストとして利用することができる。オリゴマーは、共有結合または非共有結合二量体、三量体、または高次オリゴマーの形であってよい。２つ以上のｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーは使用が企図され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などがある。

【0241】

一実施形態は、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質と融合したペプチド部分間の共有結合または非共有結合相互作用によって結合した複数のｃ−ｆｍｓ結合性ポリペプチドを含むオリゴマーを対象とする。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであってよい。以下でより詳細に記載するように、抗体由来のロイシンジッパーおよび特定のポリペプチドは、それに結合したｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドである。

【0242】

特定の実施形態では、オリゴマーは２〜４個のｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む。オリゴマーのｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質部分は、前に記載した形のいずれか、例えば変異体または断片であってよい。オリゴマーは、ｃ−ｆｍｓ結合活性を有するｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含むことが好ましい。

【0243】

一実施形態では、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使用してオリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分と融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８巻：１０５３５頁；Ｂｙｒｎら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ３４４巻：６７７頁；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、１９９２年「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌ．４巻、１０．１９．１〜１０．１９．１１頁によって記載されている。

【0244】

一実施形態は、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質と抗体のＦｃ領域の融合によって作製した２つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞中で遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質が非常に類似した抗体分子を構築することを可能にすることによって作製することができ、それによって鎖間ジスルフィド結合をＦｃ部分間で形成して二量体を生成する。

【0245】

本明細書で使用する用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域由来の天然およびムテイン型のポリペプチドを含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの短縮型も含まれる。Ｆｃ部分（およびそこから形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの親和性クロマトグラフィーによる容易な精製という利点を与える。

【0246】

ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１および米国特許第５，４２６，０４８号および同第５，２６２，５２２号中に記載された１つの適切なＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端まで延長した単鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号中、およびＢａｕｍら、１９９４年、ＥＭＢＯ Ｊ．１３巻：３９９２〜４００１頁中に記載されたＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列はＷＯ９３／１０１５１中で示された天然Ｆｃ配列のそれと同一であるが、ただしアミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変わっており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変わっており、かつアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変わっている。このムテインはＦｃ受容体に対して低下した親和性を示す。

【0247】

他の実施形態では、本明細書で開示するようなｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の重鎖および／または軽鎖の可変領域分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変領域分と置換することができる。

【0248】

あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むかまたは含まない、多数のｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質である。特に適切なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号中に記載されたペプチドリンカーである。

【0249】

オリゴマーｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質誘導体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合性タンパク質において最初に同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０巻：１７５９頁）、それ以来様々な異なるタンパク質において発見されている。知られているロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８中に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーは、参照によって本明細書に組み込まれるＨｏｐｐｅら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３４４巻：１９１頁中に記載される。そこに融合した異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら、１９９４年、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６巻：２６７〜２７８頁中に記載される。一手法では、ロイシンジッパーペプチドと融合したｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞中で発現させ、形成する可溶性オリゴマーｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質断片または誘導体は培養上清から回収する。

【0250】

提供するいくつかの抗原結合性タンパク質は、例えば以下の実施例中に記載するように測定して、少なくとも１０^４／Ｍ×秒、少なくとも１０^５／Ｍ×秒、少なくとも１０^６／Ｍ×秒のｃ−ｆｍｓに関する結合速度（ｋ_ａ）を有する。提供する特定の抗原結合性タンパク質は、遅い解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）または解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。いくつかの抗原結合性タンパク質は、例えば、１×１０^−２ｓ^−１、または１×１０^−３ｓ^−１、または１×１０^−４ｓ^−１、または１×１０^−５ｓ^−１のｋ_ｄ（解離速度）を有する。特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、２５ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、５００ｐＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭまたは５０ｎＭ未満のＫ_Ｄ（平衡結合親和性）を有する。

【0251】

別の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、ヒト対象に投与したとき）少なくとも１日の半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態では、抗体またはその一部分は４日またはそれを超える半減期を有する。別の実施形態では、抗体またはその一部分は８日またはそれを超える半減期を有する。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分を、非誘導体化または非修飾抗体と比較してより長い半減期を有するように、誘導体化または修飾する。別の実施形態では、参照によって組み込まれる２０００年２月２４日に公開されたＷＯ００／０９５６０中に記載されたように、抗原結合性タンパク質は点突然変異を含有して血清中半減期が増大する。

【0252】

グリコシル化
抗原結合性タンパク質は、天然種で見られるそれと異なるかそこから改変したグリコシル化パターンを有し得る。当技術分野で知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じるような、特定のグリコシル化アミノ酸の有無）、またはタンパク質が生成される宿主細胞または生物のいずれにも依存し得る。特定の発現系は以下で論じる。

【0253】

ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖と糖質部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖と糖質部分の酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的グリコシル化部位が生成する。Ｏ−結合型グリコシル化は糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つとヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。

【0254】

抗原結合性タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、それが１つまたは複数の前に記載した（Ｎ−結合型グリコシル化部位に関する）トリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく実施する。（Ｏ−結合型グリコシル化部位に関する）開始配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、または置換によって改変を施すこともできる。簡略化のために、抗原結合性タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更によって、特に望ましいアミノ酸に翻訳されるコドンが生成するように、予め選択した塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって改変することができる。

【0255】

抗原結合性タンパク質上の糖質部分の数を増やす別の手段は、タンパク質とグリコシドの化学または酵素カップリングによるものである。これらの手順は、Ｎ−結合型およびＯ−結合型グリコシル化のグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのタンパク質の生成を必要としない点で有利である。使用するカップリング形式に応じて、（１つまたは複数の）糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基などの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基などの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基と結合させることが可能である。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０中に、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ、１９８１年、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９〜３０６頁中に記載されている。

【0256】

開始抗原結合性タンパク質上に存在する糖質部分の除去は、化学的または酵素的に実施することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等化合物へのタンパク質の露出を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分またはすべての糖の切断をもたらし、一方ポリペプチドは完全な状態に保つ。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、１９８７年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９巻：５２頁によって、およびＥｄｇｅら、１９８１年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１８巻：１３１頁によって記載される。ポリペプチド上の糖質部分の酵素による切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、１９８７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８巻：３５０頁によって記載されたように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエクソグリコシダーゼの使用によって実施することができる。潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７巻：３１０５頁によって記載されたように、化合物ツニカマイシンの使用によって妨げることができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻害する。

【0257】

したがって、いくつかの態様は、（１つまたは複数の）グリコシル化部位の数および／または型が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている、抗原結合性タンパク質のグリコシル化変異体を含む。特定の実施形態では、抗体タンパク質変異体は、天然抗体より多いかまたは少ない数のＮ−結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合型グリコシル化部位は、Ｘとして表すアミノ酸残基がプロリン以外の任意のアミノ酸残基であってよい、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられる。この配列を生成するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合型糖質鎖の付加の可能性がある新たな部位をもたらす。あるいは、この配列を除去または改変する置換は、天然ポリペプチドに存在するＮ−結合型糖質鎖の付加を妨げる。例えば、グリコシル化はＡｓｎの欠失によって、またはＡｓｎと異なるアミノ酸の置換によって低下させることができる。他の実施形態では、１つまたは複数の新たなＮ−結合型部位を生成する。抗体は典型的には、Ｆｃ領域中にＮ−結合型グリコシル化部位を有する。

【0258】

標識およびエフェクター基
いくつかの実施形態では、抗原結合性物は１つまたは複数の標識を含む。用語「標識基」または「標識」は任意の検出可能な標識を意味する。適切な標識基の例には、以下の：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープがあるが、これらだけには限られない。いくつかの実施形態では、標識基は様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質と結合させて、考えられる立体障害を減らす。タンパク質を標識するための様々な方法は当技術分野で知られており、適切であると分かる場合は使用することができる。

【0259】

用語「エフェクター基」は、細胞傷害性薬として作用する抗原結合性タンパク質と結合した任意の基を意味する。適切なエフェクター基の例は放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）である。他の適切な基には毒素、治療剤基または化学療法剤基がある。適切な基の例には、カリケアマイシン、オーリスタチン、ゲルダナマイシンおよびマイタンシンがある。いくつかの実施形態では、エフェクター基は様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質と結合させて、考えられる立体障害を減らす。

【0260】

一般に標識は、それらが検出されるアッセイに応じて様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であってよい同位体標識、ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）、ｃ）酸化還元活性成分、ｄ）光学色素、酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ｅ）ビオチン化基、およびｆ）二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）によって認識される所定のポリペプチドエピトープ。いくつかの実施形態では、標識基は様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質と結合させて、考えられる立体障害を減らす。タンパク質を標識するための様々な方法は当技術分野で知られている。

【0261】

特異的な標識には、発色団、蛍光体およびフルオロフォアだけには限られないが、これらを含めた光学色素があり、多くの場合後者が特異的である。フルオロフォアは「小分子」蛍光体、またはタンパク質性蛍光体のいずれかであってよい。

【0262】

「蛍光標識」とは、その固有の蛍光性によって検出することができる任意の分子を意味する。適切な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）があるが、これらだけには限られない。フルオロフォアを含めた適切な光学色素は、参照によって本明細書に明確に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ中に記載される。

【0263】

適切なタンパク質性蛍光体標識には、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３巻：８０２〜８０５頁）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．、Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含めた緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ；Ｓｔａｕｂｅｒ、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２４巻：４６２〜４７１頁；Ｈｅｉｍら、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６巻：１７８〜１８２頁）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．、Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻：５４０８〜５４１７頁）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５巻：２６０３〜２６０７頁）およびＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）もあるが、これらだけには限られない。

【0264】

Ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質をコードする核酸
抗体、またはその断片、誘導体、ムテイン、または変異体の片方または両方の鎖をコードする核酸、重鎖可変領域またはＣＤＲのみをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定、分析、突然変異または増幅用のハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述の相補配列を含めた、本明細書に記載される抗原結合性タンパク質、またはその一部分をコードする核酸も提供する。核酸は任意の長さであってよい。核酸は例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはより多くのヌクレオチド長であってよく、および／または１つまたは複数の追加的配列、例えば、制御配列を含むことができ、および／またはより大きな核酸の一部、例えばベクターであってよい。核酸は一本鎖または二本鎖であってよく、かつＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、およびその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含むことができる。表６は、ＩｇＧ２重鎖定常領域およびＩｇＧ２κ軽鎖定常領域をコードする例示的な核酸配列を示す。本明細書で提供する任意の可変領域をこれらの定常領域と結合させて、完全重鎖および軽鎖配列を形成することが可能である。しかしながら、これらの定常領域の配列は、単なる具体例として提供されることは理解されるべきである。いくつかの実施形態では、可変領域の配列を、当技術分野で知られている他の定常領域の配列と結合させる。重鎖および軽鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列は表７中に提供する。

【0265】

【表6】

【0266】

表７は、その中に様々なＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列が埋め込まれた重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列を示す。

【0267】

【表7-1】

【0268】

【表7-2】

【0269】

【表7-3】

【0270】

【表7-4】

【0271】

【表7-5】

【0272】

【表7-6】

【0273】

【表7-7】

【0274】

【表7-8】

【0275】

特定の抗原結合性タンパク質、またはその一部分（例えば、完全長抗体、重鎖または軽鎖、可変ドメイン、またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３）をコードする核酸は、ｃ−ｆｍｓまたはその免疫原性断片で免疫処理したマウスのＢ細胞から単離することができる。核酸はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の手順によって単離することができる。ファージディスプレイは、それによって抗体および他の抗原結合性タンパク質の誘導体を調製することができる既知の技法の別の例である。一手法では、対象となる抗原結合性タンパク質の構成要素であるポリペプチドを任意の適切な組換え発現系中で発現させ、発現したポリペプチドを構築して抗原結合性タンパク質分子を形成することができる。

【0276】

表６および７中に与える核酸は単なる例示的なものである。遺伝コードの縮重のため、表１〜４中に挙げるかまたは本明細書で他に示すそれぞれのポリペプチド配列も、提供する配列以外の多数の他の核酸配列によってコードされる。当業者は、したがって本出願は、それぞれの抗原結合性タンパク質をコードするそれぞれの縮重ヌクレオチド配列に関する、適切な文書による記載および使用可能性を与えることを理解するはずである。

【0277】

一態様は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸（例えば、表６および表７中に挙げるヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズするための方法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、６．３．１〜６３．６を参照されたい。本明細書で定義するように、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する事前洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、約５０％のホルムアミドを含有する溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液、および４２℃のハイブリダイゼーション温度）、および６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中４５℃でハイブリダイズさせ、次に０．ｌ×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中６８℃での一回または複数回の洗浄を行う。さらに当業者は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に互いにハイブリダイズした状態であるように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大または低下させることが可能である。

【0278】

ハイブリダイゼーション条件の選択および適切な条件を考案するための指針に影響を与える基本パラメータは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．上記；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５年、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、セクション２．１０および６．３〜６．４）によって述べられ、例えば核酸の長さおよび／または塩基組成に基づき、当業者により容易に決定され得る。

【0279】

核酸への突然変異によって変化を導入することができ、これによってそれがコードするポリペプチド（例えば、抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列の変化をもたらすことができる。突然変異は当技術分野で知られている任意の技法を使用して導入することができる。一実施形態では、１つまたは複数の特定のアミノ酸残基を、例えば部位特異的突然変異誘発プロトコルを使用して変える。別の実施形態では、１つまたは複数のランダムに選択した残基を、例えばランダム突然変異誘発プロトコルを使用して変える。それをどのように作製しようとも、突然変異体ポリペプチドを発現させ望ましい性質に関してスクリーニングすることが可能である。

【0280】

核酸がコードするポリペプチドの生物活性を著しく変えずに、核酸に突然変異を導入することができる。例えば、ヌクレオチド置換を施して、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を選択的に変える、１つまたは複数の突然変異を核酸に導入することができる。例えば、突然変異は生物活性を定量的または定性的に変えることができる。定量的変化の例には、活性の増大、低減または除外がある。定性的変化の例には、抗体の抗原特異性の変化がある。一実施形態では、当技術分野で十分に確立している分子生物学の技法を使用して、本明細書に記載される任意の抗原結合性タンパク質をコードする核酸を突然変異させアミノ酸配列を変えることが可能である。例えば実施例４は、どのように核酸配列（表６参照）を突然変異させて、１つまたは複数のアミノ酸置換を特定の抗原結合性タンパク質に導入し、抗原結合性タンパク質１．２ＳＭ１．１０９ＳＭおよび２．３６０ＳＭを生成したかを記載する。他の突然変異を含有する追加的抗原結合性タンパク質を、同様の方法で生成することができる。

【0281】

別の態様は、核酸配列の検出用のプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。核酸分子は、完全長ポリペプチド、例えばプローブまたはプライマーとして使用することができる断片、またはポリペプチドの活性部分（例えば、ｃ−ｆｍｓ結合部分）をコードする断片をコードする核酸配列の一部分のみを含み得る。

【0282】

核酸の配列に基づくプローブを使用して、核酸または類似の核酸、例えば、ポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターを含むことができる。このようなプローブを使用して、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。

【0283】

別の態様は、ポリペプチドまたはその一部分（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたは１つまたは複数の可変領域ドメインを含有する断片）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターがあるが、これらだけには限られない。組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適した形で核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択され発現する核酸配列と作動可能に連結した、１つまたは複数の制御配列を含む。制御配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例えば、組織特異的制御配列、その全容を参照によって本明細書に組み込んだ、Ｖｏｓｓら、１９８６年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１巻：２８７頁、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６巻：１２３７頁を参照）、および個々の処理または状態に応じてヌクレオチド配列の誘導的発現を誘導する配列（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーター、ならびに原核生物系と真核生物系の両方におけるｔｅｔ−応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（上記参照）を含む。発現ベクターの設計は、例えば形質転換する宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることは、当業者によって理解されるはずである。発現ベクターを宿主細胞中に導入して、それによって本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含めた、タンパク質またはペプチドを生成することができる。

【0284】

別の態様は、その中に組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核生物細胞（例えば、大腸菌）または真核生物細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であってよい。従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって、ベクターＤＮＡを原核生物細胞または真核生物細胞中に導入することができる。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法に応じて、一部分の細胞のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込むことができることが知られている。これらの要素を確認および選択するために、（例えば、抗生物質に対する耐性に関する）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を一般に、対象とする遺伝子を有する宿主細胞中に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるマーカーがある。導入核酸で安定してトランスフェクトした細胞は、他の方法中で薬剤選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する）。

【0285】

抗原結合性タンパク質の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または（サル（例えば、カニクイザルもしくはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー）などの）非ヒト霊長類などのどんな抗体産生動物由来でもよい。非ヒト抗体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養および細胞培養をベースとする適用において、あるいは、抗体への免疫応答が起きないもしくはわずかである、予防することができる、懸念するほどではない、または望まれる他のどんな適用においても使用することができる。ある種の実施形態では、完全長ｃ−ｆｍｓを使用して、またはｃ−ｆｍｓの細胞外ドメインを使用して免疫化することにより抗体を産生してもよい。あるいは、ある種の非ヒト抗体は、本明細書に提供されるある種の抗体が結合するエピトープの一部を形成するｃ−ｆｍｓのセグメントであるアミノ酸を使用して免疫化することにより産生してもよい（下記を参照）。抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでもよく、または組換えＤＮＡを発現することにより宿主細胞で合成してもよい。

【0286】

完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニック動物を免疫化することにより、またはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージディスプレイライブラリーを選択することにより、上記の通りに調製してもよい。

【0287】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５頁の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術によって産生することができる。あるいは、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは腫瘍形成性形質転換を用いることができる。ハイブリドーマを調製するための１つの適切な動物系は、十分に手法が確立しているマウス系である。融合のための免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび技術は、当技術分野では公知である。そのような手法のために、免疫化マウス由来のＢ細胞を、マウスミエローマ細胞系などの適切な不死化融合パートナーと融合させる。必要ならば、ラットまたはさらに他の哺乳動物をマウスに代わって免疫化することができ、そのような動物由来のＢ細胞をマウスミエローマ細胞系と融合させて、ハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の供給源由来のミエローマ細胞系を使用してもよい。ハイブリドーマを作製するための融合手法も周知である。

【0288】

重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片をアミノ酸ブリッジ（短いペプチドリンカー）を介して連結して、単一ポリペプチド鎖をもたらすことにより、提供される一本鎖抗体を形成してもよい。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより調製してもよい。こうして得られたポリペプチドは折り畳まれて抗原結合性単量体を形成することができ、または２つの可変ドメイン間の可動性リンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、もしくは四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．１０巻：４２３頁；Ｋｏｒｔｔら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８巻：９５〜１０８頁）。異なるＶ_ＬとＶ_Ｈ含有ポリペプチドを組み合わせることにより、異なったエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ． Ｅｎｇ． １８巻：３１〜４０頁）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５巻：５８７９頁；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３４巻：５５４頁、ｄｅ Ｇｒａａｆら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １７８巻：３７９〜３８７頁に記載された技術が挙げられる。本明細書に提供される抗体由来の一本鎖抗体には、表２に描かれた重鎖および軽鎖可変領域の可変ドメイン組合せを含むｓｃＦｖ、または表３および４に描かれたＣＤＲを含む軽鎖と重鎖の可変ドメインの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0289】

本明細書に提供され、１つのサブクラスである抗体は、サブクラススイッチ法を使用して、異なるサブクラス由来の抗体に変えることができる。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えば、ＩｇＭ抗体に由来してもよく、その逆でもよい。そのような技術のおかげで、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに関連する生物学的特性も示す新しい抗体を調製することができる。組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば、目的のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、そのような手法に用いてもよい。例えば、Ｌａｎｔｔｏら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １７８巻：３０３〜３１６頁を参照されたい。

【0290】

したがって、提供される抗体には、例えば、目的のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）の他にもそのＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）_２断片も有する上に記載された可変ドメイン組合せを含む抗体が挙げられる。さらに、ＩｇＧ４が望まれる場合には、Ｂｌｏｏｍら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６巻：４０７頁（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたヒンジ領域に点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体に不均一性をもたらすことができるＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和することも望ましくあり得る。

【0291】

さらに、異なった特性（すなわち、抗体が結合する抗原に対する変動する親和性）を有する抗体を引き出すための技術も公知である。１つのそのような技術は、チェインシャフリングと呼ばれ、繊維状バクテリオファージの表面に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーを表示するものであり、ファージディスプレイと呼ばれることも多い。Ｍａｒｋｓら、１９９２年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：７７９頁により記載されたように、チェインシャフリングを使用して、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体が調製されている。

【0292】

表２に記載された重鎖および軽鎖可変領域、または表３および４に記載されたＣＤＲに保存的改変（およびそのコード核酸に対応する改変）を加えて、機能的および生化学的特徴を有するｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を産生してもよい。そのような改変を実現するための方法は上に記載されている。

【0293】

Ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、種々の方法でさらに改変してもよい。例えば、治療目的に使用するつもりであれば、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質をポリエチレングリコールとコンジュゲートさせて（ペグ化させて）、血清半減期を延ばすか、またはタンパク質送達を増強してもよい。あるいは、被験者抗体のＶ領域またはその断片を異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させてもよい。この目的に使用するＦｃ領域を、それが補体に結合せず、したがって融合タンパク質が治療薬として使用されるときには患者内で細胞溶解を誘発する可能性を減らすように改変してもよい。さらに、被験者抗体またはその機能的断片をヒト血清アルブミンとコンジュゲートさせて、抗体またはその断片の血清半減期を増強してもよい。抗原結合性タンパク質またはその断片のための別の有用な融合パートナーはトランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲには四量体を形成する能力があり、したがって抗体−ＴＴＲ融合タンパク質はその結合アビディティーを増加させ得る多価抗体を形成することができる。

【0294】

あるいは、本明細書に記載された抗原結合性タンパク質の機能的および／または生化学的特徴の実質的改変は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列に、（ａ）例えば、シートもしくはらせん形高次構造としての置換体の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさばりを維持することに対するその効果が有意に異なる置換体を作り出すことにより実現してもよい。「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷への効果がほとんどないまたは全くない非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含んでもよい。上記の表３を参照されたい。さらに、アラニン系統的変異導入法ですでに記載したように、ポリペプチド中のどんな天然残基もアラニンで置換してもよい。

【0295】

被験者抗体のアミノ酸置換（保存的でも非保存的でも）は、当業者であれば常法を用いることにより実行することができる。アミノ酸置換を使用して、本明細書に提供される抗体の重要な残基を同定することができるか、または、ヒトｃ−ｆｍｓに対するこれらの抗体の親和性を増加させるもしくは減少させることができるか、もしくは本明細書に記載された他の抗原結合性タンパク質の結合親和性を改変するために用いることができる。

【0296】

抗原結合性タンパク質を発現させる方法
発現系および上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形の構築物ならびにそのような発現系または構築物を含む宿主細胞も、本明細書に提供されている。

【0297】

本明細書に提供された抗原結合性タンパク質は、いくつかの従来の技術のどれによって調製してもよい。例えば、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、当技術分野では公知の任意の技術を使用して、組換え発現系により産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｋｅｎｎｅｔら、（編）Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０年）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）を参照されたい。

【0298】

抗原結合性タンパク質は、ハイブリドーマ細胞系で（例えば、特に抗体はハイブリドーマで発現されてもよい）またはハイブリドーマ以外の細胞系で発現させることができる。抗体をコードする発現構築物を使用して、哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号、米国特許第４，９５９，４５５号に例証されるように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにパッケージングし、当技術分野で公知のトランスフェクション法により構築物で宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法を使用して実施することができる。使用される最適の形質転換法は、どのタイプの宿主細胞が形質転換されているかに依存することになる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当技術分野では周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチド（複数可）の封入、核酸と正電荷を帯びた脂質の混合、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0299】

組換え発現構築物は、典型的には、以下のもの、すなわち、本明細書に提供された１つもしくは複数のＣＤＲ；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；重鎖定常領域（例えば、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２および／もしくはＣ_Ｈ３）；ならびに／またはｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の別のスキャフォールド部分のうちの１つまたは複数を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。これらの核酸配列は、標準ライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。一実施形態では、重鎖または軽鎖の定常領域は、抗ｃ−ｆｍｓ特異的重鎖または軽鎖の可変領域のＣ末端に付加され、発現ベクターにライゲートされる。ベクターは、典型的には、用いられる特定の宿主細胞において機能的である（すなわち、ベクターは宿主細胞機構に適合性であり、増幅を可能にし、かつ／または遺伝子の発現が起こり得る）ように選択される。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、タンパク質レポーターを使用したタンパク質断片相補性アッセイを用いるベクターが使用される（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照、この文献は参照により本明細書に組み込まれている）。適切な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（以前は「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。抗体および断片をクローニングし発現させるための他の有用なベクターには、ＢｉａｎｃｈｉとＭｃＧｒｅｗ、２００３年、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８４巻：４３９〜４４頁に記載されるベクターが挙げられ、この文献は参照により本明細書に組み込まれている。追加の適切な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）、１９９０年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて考察されている。

【0300】

典型的に、宿主細胞のどれにおいて使用される発現ベクターも、プラスミド維持のための、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有することになる。そのような配列は、まとめて「隣接配列」と呼ばれるが、ある種の実施形態では、典型的に、以下のヌクレオチド配列、すなわちプロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメントのうちの１つまたは複数を含むことになる。これらの配列はそれぞれ下で考察される。

【0301】

随意に、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有していてもよく、オリゴヌクレオチド配列は、（ヘキサＨｉｓなどの）ポリＨｉｓ、またはＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードしており、それに対しては市販の抗体が存在する。このタグは、典型的には、ポリペプチドが発現されるとそのポリペプチドに融合され、宿主細胞由来のｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の親和性精製または検出のための手段としての役割を果たすことができる。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を使用したカラムクロマトグラフィーにより実現することができる。随意に、タグはその後、切断のためのある種のペプチダーゼを使用してなどの種々の手段により、精製されたｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質から除去することができる。

【0302】

隣接配列は、相同でも（すなわち、宿主細胞と同一の種および／または系統由来）、異種でも（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）、ハイブリッドでも（すなわち、２つ以上の供給源由来の隣接配列の組合せ）、合成でも、天然でもよい。したがって、隣接配列の供給源は、隣接配列が宿主細胞機構において機能的であり、それによって活性化されることができるならば、どんな原核生物でも真核生物でも、どんな脊椎動物でも無脊椎動物でも、あるいはどんな植物でもよい。

【0303】

ベクターにおいて有用な隣接配列は、当技術分野で周知のいくつかの方法のどれによって入手してもよい。典型的には、本明細書において有用な隣接配列は、地図作成によりおよび／または制限エンドヌクレオアーゼ消化によりすでに同定済みであろうし、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。いくつかの場合に、隣接配列の完全ヌクレオチド配列は既知である可能性がある。本明細書においては、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書に記載した方法を使用して合成してもよい。

【0304】

隣接配列で既知であるのがそのすべてであれ、一部分のみであれ、隣接配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してならびに／または、同一のもしくは別の種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくは隣接配列断片などの適切なプローブを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、入手してもよい。隣接配列が既知ではない場合、隣接配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列またはさらに別の遺伝子もしくは複数の遺伝子を含有し得るＤＮＡのさらに大きな部分から単離してもよい。単離は、適切なＤＮＡ断片を作製する制限エンドヌクレアーゼ消化により、続いてアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用する単離によりまたは当業者には公知の他の方法により実現してもよい。この目的を実現するための適切な酵素の選択は、当業者には容易に明らかとなるであろう。

【0305】

複製起点は、典型的には、市販のこれらの原核生物発現ベクターの一部であり、起点は宿主細胞におけるベクターの増幅に助けとなる。選択されたベクターに複製起点部位が含有されていない場合には、複製起点部位は既知の配列に基づいて化学的に合成してベクターにライゲートされてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）由来の複製起点は、大半のグラム陰性菌に適しており、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも含有しているという理由だけで使われていることが多い）。

【0306】

転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端から３’側に位置しており、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞中の転写終結配列は、Ｇ−Ｃ豊富断片であり、その後にポリＴ配列が続く。配列はライブラリーから容易にクローン化され、またはベクターの一部として市販さえされているが、本明細書に記載された方法などの核酸合成のための方法を使用して容易に合成することもできる。

【0307】

選択可能マーカー遺伝子は、選択培地で増殖された宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞ではアンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培池もしくは限定培地からは入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。特異的選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利に、ネオマイシン耐性遺伝子も原核生物と真核生物の宿主細胞の両方における選択のために使用してもよい。

【0308】

他の選択可能遺伝子を使用して、発現されることになる遺伝子を増幅させてもよい。増幅は、増殖または細胞生存にとって重要なタンパク質の産生のために必要とされる遺伝子が組換え細胞の継続的世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、ベクター中に存在する選択可能遺伝子のおかげで形質転換体だけが変わりなく生存に適応している淘汰圧下に置かれている。培地中の選択剤の濃度が連続的に増加される条件下で形質転換された細胞を培養することにより、淘汰圧は課せられ、それによって、選択可能遺伝子と、ｃ−ｆｍｓポリペプチドに結合する抗原結合性タンパク質などの別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅をもたらす。その結果、増幅されたＤＮＡから合成される抗原結合性タンパク質などのポリペプチドの量が増加する。

【0309】

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始には必要であり、シャインダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）により特徴付けられる。そのエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側および発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置している。

【0310】

真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が求められる場合などの、いくつかの場合、種々のプレ配列またはプロ配列を操作して、グリコシル化または収量を改良してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変してもよいし、グリコシル化に影響を与え得るプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の第１アミノ酸に対して）、完全には取り除かれていなかった可能性のある、発現に付随する１つまたは複数の追加のアミノ酸を有していてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、ペプチダーゼ切断部位に見出され、アミノ末端に結合している１つまたは複数のアミノ酸残基を有していてもよい。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用によって、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合には、目的のポリペプチドのわずかな短縮型をもたらしてもよい。

【0311】

発現およびクローニングは、典型的には、宿主生物により認識され、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されているプロモーターを含有することになる。プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、慣習的に２つのクラス、すなわち誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無または温度の変化などの培養条件のある変化に応じて、その制御下にあるＤＮＡからの転写レベルの増加を起こす。一方、構成的プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子を一様に、すなわち、遺伝子発現の間ほとんどまたは全く制御しないで転写する。種々の潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、目的のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

【0312】

酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーターも当技術分野では周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと一緒に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞とともに使用するのに適したプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、（アデノウイルス２などの）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。

【0313】

対象になり得る追加のプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ ２９０巻：３０４〜３１０頁）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１巻：６５９〜６６３頁）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、Ｃｅｌｌ ２２巻：７８７〜７９７頁）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８巻：１４４４〜１４４５頁）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターおよび調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ ２９６巻：３９〜４２頁）；およびβラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５巻：３７２７〜３７３１頁）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０巻：２１〜２５頁）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。組織特異性を示しトランスジェニック動物で使用されてきた以下の動物転写制御領域も対象になり、すなわち、膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ ３８巻：６３９〜６４６頁；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０巻：３９９〜４０９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７巻：４２５〜５１５頁）；膵臓β細胞で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１５巻：１１５〜１２２頁）；リンパ系細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ ３８巻：６４７〜６５８頁；Ａｄａｍｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１８巻：５３３〜５３８頁；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７巻：１４３６〜１４４４頁）；精巣、乳房、リンパ系細胞およびマスト細胞で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４５巻：４８５〜４９５頁）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １巻：２６８〜２７６頁）；肝臓で活性であるαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５巻：１６３９〜１６４８頁；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３巻：５３〜５８頁）；肝臓で活性であるα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １巻：１６１〜１７１頁）；骨髄細胞で活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１５巻：３３８〜３４０頁；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４６巻：８９〜９４頁）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ ４８巻：７０３〜７１２頁）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１４巻：２８３〜２８６頁）；および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４巻：１３７２〜１３７８頁）がある。

【0314】

エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物によるヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させてもよい。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常は約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作動性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向および位置非依存性であり、転写ユニットの５’側の位置にも３’側の位置にも見出されている。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当技術分野で公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例となる増強エレメントである。エンハンサーはベクター中のコード配列の５’側または３’側のいずれに位置していてもよいが、典型的にはプロモーターから５’の部位に位置している。適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列は、発現ベクターに組み込まれて、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生されることになる宿主細胞の種類に依存しており、異種シグナル配列は天然シグナル配列に取って代わることができる。哺乳動物宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例には、以下のものが挙げられる。すなわち、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ ３１２巻：７６８頁に記載のインターロイキン２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン１受容体シグナルペプチドがある。

【0315】

提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよい。そのようなベクターは、目的の隣接配列のすべてを含有していてもよいし、含有していなくてもよい。本明細書に記載される１つまたは複数の隣接配列がまだベクター中に存在していない場合、隣接配列は個々に入手してベクターにライゲートしてもよい。隣接配列のそれぞれを得るために使用する方法は当業者には周知である。

【0316】

ベクターが構築され、ｃ−ｆｍｓ抗原結合配列を含む軽鎖、重鎖、または軽鎖と重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入してもよい。抗原結合性タンパク質のための発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、またはその他の既知の技術を含む周知の方法により実現してもよい。選択された方法は、一部が、使用されるような種類の宿主細胞の機能になるであろう。これらの方法および他の適切な方法は当業者には周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、上記、に記載されている。

【0317】

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合性タンパク質を合成し、このタンパク質はその後（宿主細胞が抗原結合性タンパク質を培地に分泌する場合には）培地から、または（抗原結合性タンパク質が分泌されない場合には）それを産生している宿主細胞から直接回収することができる。適切な宿主細胞の選択は、目的の発現レベル、（グリコシル化もしくはリン酸化などの）活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さなどの種々の要因に依存することになる。

【0318】

発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は当技術分野では周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞系を含むが、これらに限定されることはない米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある種の実施形態では、細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有し、ｃ−ｆｍｓ結合特性のある抗原結合性タンパク質を構成的に産生するかを決定することにより選択してもよい。別の実施形態では、それ自体の抗体は作らないが異種抗体を作り分泌する能力のあるＢ細胞系統由来の細胞系を選択することができる。

【0319】

診断および治療目的のためのヒトＣ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の使用
抗原結合性タンパク質は、生体試料中のｃ−ｆｍｓを検出するのに、およびｃ−ｆｍｓを産生する細胞または組織の同定に有用である。例えば、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、診断分析、例えば、組織もしくは細胞で発現されるｃ−ｆｍｓを検出かつ／または定量するための結合アッセイに使用することができる。ｃ−ｆｍｓに特異的に結合する抗原結合性タンパク質は、それを必要とする患者のｃ−ｆｍｓに関連する疾患の治療にも使用することができる。さらに、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を使用して、ｃ−ｆｍｓがそのリガンドであるＣＳＦ−１と複合体を形成するのを阻害し、それによって細胞または組織中のｃ−ｆｍｓの生物活性を調節することができる。調節することができる活性の例には、ｃ−ｆｍｓの自己リン酸化を阻害すること、単球走化性を減少させること、単球遊走を阻害すること、腫瘍もしくは病変組織中の腫瘍関連マクロファージの蓄積を阻害することおよび／または新脈管形成を阻害することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、ｃ−ｆｍｓに結合する抗原結合性タンパク質は、他の結合化合物との相互作用を調節しかつ／または遮断することができ、したがって、ｃ−ｆｍｓ関連疾患を寛解させる治療的使用を有し得る。

【0320】

適応症
多くの腫瘍細胞がＣＳＦ−１を分泌し、このＣＳＦ−１は次に単球／マクロファージ細胞を引き寄せ、その生存を促進し、同族受容体ｃ−ｆｍｓを通じて活性化する。ヒト腫瘍におけるＣＳＦ−１のレベルは、その腫瘍中に存在するＴＡＭの数と正に相関していることが明らかにされている（Ｍｕｒｄｏｃｈら、２００４年、Ｂｌｏｏｄ １０４巻：２２２４〜２２３４頁）。いくつかの研究では、種々の形の癌について、高ＴＡＭ数と患者における患者生存の低下が関連付けられてきた。最近の研究では、腫瘍細胞におけるオートクリンループの存在が示されている。他の研究では、ｃ−ｆｍｓが種々の炎症性疾患に関与していることが示されている。したがって、本明細書に提供されるヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質によるｃ−ｆｍｓ−ＣＳＦ−１シグナル伝達の調節により、ｃ−ｆｍｓに関連する生物学的応答の少なくとも１つを阻害し、妨げ、または調節することができ、したがって、ｃ−ｆｍｓ関連疾患または状態の効果を寛解させるのに有用である。本明細書に提供されるｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質は、そのような疾患もしくは状態の診断、予防または治療のためにも使用することができる。

【0321】

ヒトｃ−ｆｍｓに関連する疾患または状態には、患者におけるその発症が、少なくとも一部が、ｃ−ｆｍｓとＣＳＦ−１リガンドおよび／またはＩＬ−３４との相互作用により引き起こされる任意の疾患または状態が挙げられる。疾患または状態の重症度も、ｃ−ｆｍｓとＣＳＦ−１リガンドおよび／またはＩＬ−３４との相互作用により増加することも減少することもできる。抗原結合性タンパク質で治療することができる疾患および状態の例には、種々の癌、炎症性疾患および骨障害が挙げられる。抗原結合性タンパク質を使用して、癌の転移および癌の骨への転移に付随する骨の骨溶解を治療するかまたは予防することもできる［０３２５］。高レベルのＴＡＭは、乳癌（Ｔｓｕｔｓｕｉら、２００５年、Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ． １４巻：４２５〜４３１頁；Ｌｅｅｋら、１９９９年、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７９巻：９９１〜９９５頁；ＬｅｅｋとＨａｒｒｉｓ、２００２年、Ｊ． Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ７巻：１７７〜１８９頁）、前立腺癌（Ｌｉｓｓｂｒａｎｔら、２０００年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １７巻：４４５〜４５１頁）、子宮内膜癌（Ｏｈｎｏら、２００４年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２４巻：３３３５〜３３４２頁）、膀胱癌（Ｈａｎａｄａら、２０００年、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｕｒｏｌ ７巻：２６３〜２６９頁）、腎臓癌（Ｈａｍａｄａら、２００２年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２２巻：４２８１〜４２８４頁）、食道癌（ＬｅｗｉｓとＰｏｌｌａｒｄ、２００６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６６巻（２号）：６０６〜６１２頁）、扁平上皮癌（Ｋｏｉｄｅら、２００４年、Ａｍ． Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ９９巻：１６６７〜１６７４頁）、ブドウ膜黒色腫（Ｍａｋｉｔｉｅら、２００１年、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４２巻：１４１４〜１４２１頁）、濾胞性リンパ種（Ｆａｒｉｎｈａら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ １０６巻：２１６９〜２１７４頁）、腎臓癌および子宮頚部癌（Ｋｉｒｍａら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７巻：１９１８〜１９２６頁）を含む種々の癌における腫瘍増殖に関連している。乳癌、前立腺癌、子宮内膜癌、膀胱癌、腎臓癌、食道癌、扁平上皮癌、ブドウ膜黒色腫、濾胞性リンパ種および卵巣癌の場合には、高レベルのＴＡＭは患者生存の低下も示している。したがって、本明細書に提供されるｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を使用して、腫瘍におけるＴＡＭの動員を阻害して生存および機能を減少させ、したがって、腫瘍増殖にマイナスの影響を与え、患者生存を増加することができる。

【0322】

治療することができる他の癌には、固形腫瘍全般、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、脳、膵臓、頭部、頚部、肝臓、白血病、リンパ腫およびホジキン病、多発性骨髄腫（Ｆａｒｉｎｈａら、２００５年、Ｂｌｏｏｄ １０６巻：２１６９〜２１７４頁）、メラノーマ、胃癌、アストロサイト癌、胃腺癌および肺腺癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｉｓｈｉｇａｍｉら、２００３年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３巻：４０７９〜４０８３頁；Ｃａｒｕｓｏら、１９９９年、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １２巻：３８６〜３９０頁；Ｗｉｔｃｈｅｒら、２００４年、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｏｒｔ １０４巻：３３３５〜３３４２頁；Ｈａｒａｎ−Ｇｈｅｒａら、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ ８９巻：２５３７〜２５４５頁；Ｈｕｓｓｅｉｎら、２００６年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８７巻：１６３〜７６頁；Ｌａｕら、２００６年、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． ９４巻：１４９６〜１５０３頁；Ｌｅｕｎｇら、１９９７年、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ． ９３巻：５１８〜５２７頁；Ｇｉｒａｕｄｏら、２００４年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１４巻：６２３〜６３３頁；Ｋｉｒｍａら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７巻：１９１８〜２６頁；ｖａｎ Ｒａｖｅｎｓｗａａｙら、１９９２年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６７巻：１６６〜１７４頁。

【0323】

抗原結合性タンパク質を使用して、腫瘍増殖、進行および／または転移を阻害することもできる。そのような阻害は、種々の方法を使用してモニターすることができる。例えば、阻害により腫瘍サイズを減らしかつ／または腫瘍内の代謝活性を減少させることができる。これらのパラメータは両方とも、例えばＭＲＩまたはＰＥＴスキャンにより測定することができる。阻害は、腫瘍内のネクローシス、腫瘍細胞死のレベル、および血管増生のレベルを確認するバイオプシーによりモニターすることもできる。転移および転移に付随する骨の骨溶解の程度は、既知の方法を使用してモニターすることができる。

【0324】

オートクリンループが存在する証拠は、ｃ−ｆｍｓ活性を阻害すれば腫瘍関連マクロファージに、しかし腫瘍細胞にも影響を及ぼすことができることを示している。したがって、一実施形態では、オートクリンループを有する腫瘍は、第１標的として標的にされる。他の実施形態では、ＴＡＭも腫瘍もともに複合効果の標的にされる。さらに他の実施形態では、パラクリンループを使用するかまたはオートクリンとパラクリンループを使用する腫瘍が標的にされる。

【0325】

本明細書に提供されるヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、ある種の実施形態では、単独で投与することができるが、例えば、化学療法、放射線療法、または手術などの１つまたは複数の他の癌治療選択肢と併用して使用することもできる。化学療法薬とともに投与される場合、抗原結合性タンパク質は、化学療法薬の前もしくは後に、または同時に（例えば、同一組成物の一部として）投与することができる。

【0326】

提供される抗原結合性タンパク質と併用して使用することができる化学療法治療には、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファランおよびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）などのニトロソウレア類；Ｔｅｍｏｄａｌ（商標）（テモゾラミド）、エチレンイミン／メチルメラミン（トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）など）；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル類；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン類を含むアルキル化剤、メトトレキサートおよびトリメトレキサートなどの葉酸類似体を含む代謝拮抗薬、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２、２’−ジフルオロデオキシシチジンなどのピリミジン類似体、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントシタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）などのプリン類似体；パクリタキセルなどの有糸分裂阻害剤、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含むビンカアルカロイド類、タキソテール、エストラムスチンならびにリン酸エストラムスチンを含む天然産物；エトポシドおよびテニポシドなどのピポドフィロトキシン類；アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシンなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；インターフェロンα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの生物学的応答修飾物質；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金錯化合物、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン類、ヒドロキシウレアなどの置換ウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ、ｐ−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬を含む種々の薬剤；プレドニゾンおよび等価物などの副腎皮質ステロイドアンタゴニスト類、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミドを含むホルモン類およびアンタゴニスト類；Ｇｅｍｚａｒ（商標）（ゲムシタビン）、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン類；フルタミド、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体およびリュープロリドなどの抗アンドロゲン類；ならびにフルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン類を含む抗悪性腫瘍薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、脱メチル化剤（例えば、ビダザ）および転写抑制（ＡＴＲＡ）治療の放出を含むが、これらに限定されるものではない後成的機構を標的にする治療薬も、抗原結合性タンパク質と組み合わせることができる。

【0327】

癌治療は、抗原結合性タンパク質と一緒に投与してもよく、標的化治療も挙げられるが、これに限定されるものではない。標的化治療の例には治療抗体の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない。例となる治療抗体には、マウス、マウス−ヒトキメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、ならびに、抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより選択される抗体が含まれるが、これに限定されるものではない合成抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例となる抗体には、腫瘍細胞上に存在する細胞表面タンパク質のＨｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、随意に、これらのタンパク質を表示する腫瘍細胞に対し細胞増殖抑制効果および／または細胞傷害性効果を誘導する抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例となる抗体には、乳癌およびその他の種類の癌を治療するのに使用してもよいＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（トラスツズマブ）、ならびに非ホジキンリンパ腫およびその他の種類の癌を治療するのに使用してもよいＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（リツキシマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（商標）（イブリツモマブチウキセタン）、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）およびＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（エプラツズマブ）も挙げられる。ある種の例となる抗体には、ＥＲＢＩＴＵＸ（商標）（ＩＭＣ−Ｃ２２５）；エルチノリブ（イレッサ）；ＢＥＸＸＡＲ（商標）（ヨウ素１３１トシツモマブ）；ＫＤＲ（キナーゼドメイン受容体）阻害剤；抗ＶＥＧＦ抗体およびアンタゴニスト（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）およびＶＥＧＡＦ−ＴＲＡＰ）；抗ＶＥＧＦ受容体抗体および抗原結合領域；抗Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２抗体および抗原結合領域；Ｔｉｅ−２に対する抗体および他のＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２受容体；Ｔｉｅ−２リガンド；Ｔｉｅ−２キナーゼ阻害剤に対する抗体；Ｈｉｆ−ｌａの阻害剤、ならびにＣａｍｐａｔｈ（商標）（アレムツズマブ）も挙げられる。ある種の実施形態では、癌治療薬は、ＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬが挙げられるが、これに限定されるものではない、腫瘍細胞に選択的にアポトーシスを誘導するポリペプチドである。

【0328】

化学療法薬の追加の特定の例には、タキソール、タキセン（例えば、ドセタキセルおよびタキソテール）、修飾パクリタキセル（例えば、アブラキサンおよびオパキシオ）ドキソルビシン、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、スーテント、ネクサバール、および他のマルチキナーゼ阻害剤、シスプラチンおよびカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、ならびにビンブラスチンが挙げられる。ＭＡＰＫ経路阻害剤（例えば、ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８の阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ阻害剤ならびにＰｉｍ阻害剤を含むが、これらに限定されるものではない他のキナーゼの特定の阻害剤も、抗原結合性タンパク質と併用して使用することができる。他の阻害剤には、Ｈｓｐ９０阻害剤、プロテアソーム阻害剤（例えば、ベルケイド）およびトリセノックスなどの多重機構のアクチン阻害剤が挙げられる。

【0329】

ある種の実施形態では、本明細書に提供される抗原結合性タンパク質は、新脈管形成を減少させる１つまたは複数の抗脈管形成薬と併用して使用される。ある種のそのような薬には、ＩＬ−８アンタゴニスト；キャンパス、Ｂ−ＦＧＦ；ＦＧＦアンタゴニスト；Ｔｅｋアンタゴニスト（Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許公開第２００３／０１６２７１２号；Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許第６，４１３，９３２号、およびＣｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許第６，５２１，４２４号、これらの文献のそれぞれがあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれているものとする）；抗ＴＷＥＡＫ薬（抗体および抗原結合領域を含むが、これらに限定されるものではない）；可溶性ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニスト（Ｗｉｌｅｙ、米国特許第６，７２７，２２５号）；インテグリンのそのリガンドへの結合に拮抗するＡＤＡＭディスインテグリンドメイン（Ｆａｎｓｌｏｗら、米国特許出願公開第２００２／００４２３６８号）；抗ｅｐｈ受容体および抗エフリン抗体；抗原結合領域またはアンタゴニスト（米国特許第５，９８１，２４５号、米国特許第５，７２８，８１３号、米国特許第５，９６９，１１０号、米国特許第６，５９６，８５２号、米国特許第６，２３２，４４７号、米国特許第６，０５７，１２４号およびその特許ファミリーメンバー）；Ａｖａｓｔｉｎ（商標）またはＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ（商標）などの抗ＶＥＧＦ薬（例えば、ＶＥＧＦ、または可溶性ＶＥＧＦ受容体またはそのリガンド結合領域に特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、および抗ＶＥＧＦ受容体薬（例えば、それに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、パニツムマブ、ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（エルロチニブ）などのＥＧＦＲ阻害剤（例えば、それに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、抗Ａｎｇ−１薬および抗Ａｎｇ−２薬（例えば、それにまたはその受容体、例えば、Ｔｉｅ−２／ＴＥＫに特異的に結合する抗体または抗原結合領域）、および抗Ｔｉｅ−２キナーゼ阻害剤（例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、Ｓｃａｔｔｅｒ Ｆａｃｔｏｒとしても知られる）のアンタゴニストなどの、増殖因子に特異的に結合しその活性を阻害する抗体または抗原結合領域、およびその受容体「ｃ−ｍｅｔ」に特異的に結合する抗体または抗原結合領域；抗ＰＤＧＦ−ＢＢアンタゴニスト；ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドに対する抗体および抗原結合領域；ならびにＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0330】

抗原結合性タンパク質と併用して使用することができる他の抗脈管形成薬には、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤、およびＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤などの薬が挙げられる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標）（セレコキシブ）、バルデコキシブ、およびロフェコキシブが挙げられる。

【0331】

ある種の実施形態では、癌治療薬は新脈管形成阻害剤である。ある種のそのような阻害剤には、ＳＤ−７７８４（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）；シレンギチド（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、 Ｇｅｒｍａｎｙ、ＥＰＯ７７０６２２）；ペガブタニブオクタソジウム、（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）；アルファスタチン、（ＢｉｏＡｃｔａ、ＵＫ）；Ｍ−ＰＧＡ、（Ｃｅｌｇｅｎｅ、ＵＳＡ、米国特許第５，７１２，２９１号）；イロマスタット、（Ａｒｒｉｖａ、ＵＳＡ、米国特許第５，８９２，１１２号）；セマキサニブ、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ、米国特許第５，７９２，７８３号）；バタラニブ、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；２−メトキシエストラジオール、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；ＴＬＣ ＥＬＬ−１２、（Ｅｌａｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）；酢酸アネコルタブ、（Ａｌｔｏｎ、ＵＳＡ）；アルファ−Ｄ１４８ Ｍａｂ、（Ａｍｇｅｎ、ＵＳＡ）；ＣＥＰ−７０５５、（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、ＵＳＡ）；抗Ｖｎ Ｍａｂ、（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＤＡＣ：脈管形成抑制薬、（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ、Ｃａｎａｄａ）；アンギオシジン、（ＩｎＫｉｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、ＵＳＡ）；ＫＭ−２５５０、（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ、Ｊａｐａｎ）；ＳＵ−０８７９、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）；ＣＧＰ−７９７８７、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、 Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ＥＰ９７００７０）；ＡＲＧＥＮＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（Ａｒｉａｄ、ＵＳＡ）；ＹＩＧＳＲ−Ｓｔｅａｌｔｈ、（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＵＳＡ）；フィブリノーゲン−Ｅ断片、（ＢｉｏＡｃｔａ、ＵＫ）；新脈管形成阻害剤、（Ｔｒｉｇｅｎ、ＵＫ）；ＴＢＣ−１６３５、（Ｅｎｃｙｓｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）；ＳＣ−２３６、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）；ＡＢＴ−５６７、（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳＡ）；メタスタチン、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；新脈管形成阻害剤、（Ｔｒｉｐｅｐ、Ｓｗｅｄｅｎ）；マスピン（Ｓｏｓｅｉ、Ｊａｐａｎ）；２−メトキシエストラジオール、（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）；ＥＲ−６８２０３−００、（ＩＶＡＸ、ＵＳＡ）；ベネフィン、（Ｌａｎｅ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）；Ｔｚ−９３、（Ｔｓｕｍｕｒａ、Ｊａｐａｎ）；ＴＡＮ−１１２０、（Ｔａｋｅｄａ、Ｊａｐａｎ）；ＦＲ−１１１１４２、（Ｆｕｊｉｓａｗａ、Ｊａｐａｎ、日本特許第０２２３３６１０号）；血小板第４因子、（ＲｅｐｌｉＧｅｎ、ＵＳＡ、欧州特許第４０７１２２号）；血管内皮増殖因子アンタゴニスト（Ｂｏｒｅａｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；癌治療（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）；ベマシズマブ（ｐＩＮＮ）、（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）；新脈管形成阻害剤、（ＳＵＧＥＮ、ＵＳＡ）；ＸＬ７８４、（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＵＳＡ）；ＸＬ６４７、（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＵＳＡ）；Ｍａｂ、α５β３インテグリン、第２世代、（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、ＵＳＡ ａｎｄ ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＵＳＡ）；遺伝子治療、網膜症、（Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ、ＵＫ）；エンザスタウリン塩酸塩（ＵＳＡＮ）、（Ｌｉｌｌｙ、ＵＳＡ）；ＣＥＰ７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、ＵＳＡとＳａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＢＣ１、（Ｇｅｎｏａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｔａｌｙ）；新脈管形成阻害剤、（Ａｌｃｈｅｍｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ＶＥＧＦアンタゴニスト、（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＵＳＡ）；ｒＢＰＩ２１およびＢＰＩ由来脈管形成抑制薬、（ＸＯＭＡ、ＵＳＡ）；ＰＩ８８、（Ｐｒｏｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；シレンギチド（ｐＩＮＮ）、（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｇｅｒｍａｎ；Ｍｕｎｉｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）；セツキシマブ（ＩＮＮ）、（Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＡＶＥ８０６２、（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）；ＡＳ１４０４、（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）；ＳＧ２９２、（Ｔｅｌｉｏｓ、ＵＳＡ）；エンドスタチン、（Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＵＳＡ）；ＡＴＮ１６１、（Ａｔｔｅｎｕｏｎ、ＵＳＡ）；アンジオスタチン、（Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＵＳＡ）；２−メトキシエストラジオール、（Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＵＳＡ）；ＺＤ６４７４、（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＵＫ）；ＺＤ６１２６、（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＵＫ）；ＰＰＩ２４５８、（Ｐｒａｅｃｉｓ、ＵＳＡ）；ＡＺＤ９９３５、（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＵＫ）；ＡＺＤ２１７１、（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＵＫ）；バタラニブ（ｐＩＮＮ）、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄとＳｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；組織因子経路阻害剤、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；ペガプタニブ（Ｐｉｎｎ）、（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）；キサントリゾール、（Ｙｏｎｓｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）；ワクチン、遺伝子ベース、ＶＥＧＦ−２、（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）；ＳＰＶ５．２、（Ｓｕｐｒａｔｅｋ、Ｃａｎａｄａ）；ＳＤＸ１０３、（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）；ＰＸ４７８、（ＰｒｏＩＸ、ＵＳＡ）；メタスタチン、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；トロポニン１（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＳＵ６６６８、（ＳＵＧＥＮ、ＵＳＡ）；ＯＸＩ４５０３、（ＯＸｉＧＥＮＥ、ＵＳＡ）；ｏ−グアニジン、（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）；モツポラミンＣ、（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、 Ｃａｎａｄａ）；ＣＤＰ７９１、（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ、ＵＫ）；アチプリモド（ＰＩＮＮ）、（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＫ）；Ｅ７８２０、（Ｅｉｓａｉ、Ｊａｐａｎ）；ＣＹＣ３８１、（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＡＥ９４１、（Ａｅｔｅｒｎａ、Ｃａｎａｄａ）；ワクチン、新脈管形成、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ、ＵＳＡ）；オグルファニド（ｐＩＮＮ）、（Ｍｅｌｍｏｔｔｅ、ＵＳＡ）；ＨＩＦ−１α阻害剤、（Ｘｅｎｏｖａ、ＵＫ）；ＣＥＰ５２１４、（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、ＵＳＡ）；ＢＡＹ ＲＥＳ２６２２、（Ｂａｙｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；アンジオシジン、（ＩｎＫｉｎｅ、ＵＳＡ）；Ａ６、（Ａｎｇｓｔｒｏｍ、ＵＳＡ）；ＫＲ３１３７２、（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）；ＧＷ２２８６、（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＫ）；ＥＨＴ０１０１、（ＥｘｏｎＨｉｔ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＣＰ８６８５９６、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）；ＣＰ５６４９５９、（ＯＳＩ、ＵＳＡ）；ＣＰ５４７６３２、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）；７８６０３４、（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、ＵＫ）；ＫＲＮ６３３、（Ｋｉｒｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ、Ｊａｐａｎ）；薬剤送達システム、眼内、２−メトキシエストラジオール、（ＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；アンギネックス、（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、とＭｉｎｎｅｓｏｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＡＢＴ５１０、（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳＡ）；ＭＬ９９３、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＶＥＧＩ、（Ｐｒｏｔｅｏｍ Ｔｅｃｈ、ＵＳＡ）；腫瘍壊死因子α阻害剤、（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ａｇｉｎｇ、ＵＳＡ）；ＳＵ１１２４８、（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡとＳＵＧＥＮ ＵＳＡ）；ＡＢＴ５１８、（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳＡ）；ＹＨ１６、（Ｙａｎｔａｉ Ｒｏｎｇｃｈａｎｇ、Ｃｈｉｎａ）；Ｓ−３ＡＰＧ、（Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＵＳＡとＥｎｔｒｅＭｅｄ、ＵＳＡ）；ＭＡｂ、ＫＤＲ、（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）；ＭＡｂ、α５ β１、（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ、ＵＳＡ）；ＫＤＲキナーゼ阻害剤、（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ、ＵＫ、とＪｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＵＳＡ）；ＧＦＢ１１６、（Ｓｏｕｔｈ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡとＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＣＳ７０６、（Ｓａｎｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）；コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ、（Ａｒｉｚｏｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；コンドロイチナーゼＡＣ、（ＩＢＥＸ、Ｃａｎａｄａ）；ＢＡＹ ＲＥＳ２６９０、（Ｂａｙｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＡＧＭ１４７０、（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ、Ｔａｋｅｄａ、Ｊａｐａｎ、およびＴＡＰ、ＵＳＡ）；ＡＧ１３９２５、（Ａｇｏｕｒｏｎ、ＵＳＡ）；テトラチオモリブデン酸塩、（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）；ＧＣＳ１００、（Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＣＶ２４７、（Ｉｖｙ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＵＫ）；ＣＫＤ７３２、（Ｃｈｏｎｇ Ｋｕｎ Ｄａｎｇ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）；ＭＡｂ、血管内皮増殖因子、（Ｘｅｎｏｖａ、ＵＫ）；イルソグラジン（ＩＮＮ）、（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｉｎｙａｋｕ、Ｊａｐａｎ）；ＲＧ１３５７７、（Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＷＸ３６０、（Ｗｉｌｅｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；スクアラミン（ｐＩＮＮ）、（Ｇｅｎａｅｒａ、ＵＳＡ）；ＲＰＩ４６１０、（Ｓｉｒｎａ、ＵＳＡ）；癌治療、（Ｍａｒｉｎｏｖａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ヘパラナーゼ阻害剤、（ＩｎＳｉｇｈｔ、Ｉｓｒａｅｌ）；ＫＬ３１０６、（Ｋｏｌｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）；ホノキオール、（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）；ＺＫ ＣＤＫ、（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＺＫ Ａｎｇｉｏ、（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＺＫ２２９５６１、（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、とＳｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＸＭＰ３００、（ＸＯＭＡ、ＵＳＡ）；ＶＧＡ１１０２、（Ｔａｉｓｈｏ、Ｊａｐａｎ）；ＶＥＧＦ受容体修飾薬、（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、ＵＳＡ）；ＶＥカドヘリン−２アンタゴニスト、（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）；バソスタチン、（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）；ワクチン、Ｆｌｋ−１（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）；ＴＺ９３、（Ｔｓｕｍｕｒａ、Ｊａｐａｎ）；タムスタチン、（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＵＳＡ）；短縮型可溶性ＦＬＴ１（血管内皮増殖因子受容体１）、（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ、ＵＳＡ）；Ｔｉｅ−２リガンド、（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＵＳＡ）；トロンボスポンジン１阻害剤、（Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ Ｈｅａｌｔｈ、Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）；２−ベンゼンスルホンアミド、４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−；Ａｒｒｉｖａ；およびＣ−Ｍｅｔ．ＡＶＥ８０６２（（２Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−［２−メトキシ−５−［（１Ｚ）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エテニル］フェニル］プロパンアミド一塩酸塩）；メテリムマブ（ｐＩＮＮ）（免疫グロブリンＧ４、抗（ヒト形質転換増殖因子β１（ヒトモノクローナルＣＡＴ１９２．ガンマ．４−鎖））、ヒトモノクローナルＣＡＴ１９２．κ．−鎖二量体を有するジスルフィド）；Ｆｌｔ３リガンド；ＣＤ４０リガンド；インターロイキン−２；
インターロイキン−１２；４−１ＢＢリガンド；抗４−１ＢＢ抗体；ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＮＦＲ／Ｆｃを含むＴＮＦ受容体アンタゴニスト、ＴＷＥＡＫアンタゴニストおよびＴＷＥＡＫ−Ｒ／Ｆｃを含むＴＷＥＡＫ−Ｒアンタゴニスト；ＴＲＡＩＬ；抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニスト；（Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１またはＫＤＲとしても知られているＶＥＧＦ−Ｒ１およびＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト；ＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰ、およびＰＴＰＲＪとも呼ばれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０巻：２１３５４５頁（１９９９年）参照、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれているものとする）アゴニスト；トロンボスポンジン１阻害剤、および（Ａｎｇ−２などの）Ｔｉｅ−２またはＴｉｅ−２リガンドのうちの１つまたは両方の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。公開された米国特許出願第２００３０１２４１２９号（ＰＣＴ出願第ＷＯ０３／０３０８３３号に一致）および米国特許第６，１６６，１８５号に記載の抗Ａｎｇ−２抗体を含む、Ａｎｇ−２のいくつかの阻害剤は当技術分野では公知であり、これらの文献の内容は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている。さらに、Ａｎｇ−２ペプチボディーも当技術分野では公知であり、例えば、公開された米国特許出願第２００３０２２９０２３号（ＰＣＴ出願第ＷＯ０３／０５７１３４号に一致）および公開された米国特許出願第２００３０２３６１９３号に見出すことができ、これらの文献の内容はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

【0332】

ある種の癌治療薬には、サリドマイドおよびサリドマイド類似物（Ｎ−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジル）フタルイミド）；テコガランナトリウム（硫酸化多糖類ペプチドグリカン）；ＴＡＮ１１２０（８−アセチル−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−１０−［［オクタヒドロ−５−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシプロピル）−４，１０−ジメチルピラノ［３，４−ｄ］−１，３，６−ジオキサゾシン−８−イル］オキシ］−５，１２−ナフタセネジオン）；スラディスタ（７，７’−［カルボニルビス［イミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ］］ビス−１，３−ナフタレンジスルホン酸四ナトリウム塩）；ＳＵ３０２；ＳＵ３０１；ＳＵ１４９８（（Ｅ）−２−シアノ−３−［４−ヒドロキシ−３，５−ビス（１−メチルエチル）フェニル］−Ｎ−（３−フェニルプロピル）−２−プロペンアミド）；ＳＵ１４３３（４−（６，７−ジメチル−２−キノキサリニル）−１−，２−ベンゼンジオール）；ＳＴ１５１４；ＳＲ２５９８９；可溶性Ｔｉｅ−２；ＳＥＲＭ誘導体、Ｐｈａｒｍｏｓ；セマキサニブ（ｐＩＮＮ）（３−［（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン）；Ｓ８３６；ＲＧ８８０３；ＲＥＳＴＩＮ；Ｒ４４０（３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（１−メチル−６−ニトロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）；Ｒ１２３９４２（１−［６−（１，２，４−チアジアゾール−５−イル）−３−ピリダジニル］−Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−ピペリジンアミン）；プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤；進行上昇遺伝子；プリノマスタット（ＩＮＮ）（（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−［［ｐ−（４−ピリジルオキシ）フェニル］サルフォニル］−３−チオモルフォリンカルボヒドロキサム酸）；ＮＶ１０３０；ＮＭ３（８−ヒドロキシ−６−メトキシ−α−メチル−１−オキソ−１Ｈ−２−ベンゾピラン−３−酢酸）；ＮＦ６８１；ＮＦ０５０；ＭＩＧ；ＭＥＴＨ２；ＭＥＴＨ１；マナサンチンＢ（α−［１−［４−［５−［４−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチルエトキシ］−３−メトキシフェニル］テトラヒドロ−３，４−ジメチル−２−フラニル］−２−メトキシフェノキシ］エチル］−１，３−ベンゾジオキソール−５−メタノール）；ＫＤＲモノクロール抗体；α５β３インテグリンモノクローナル抗体；ＬＹ２９０２９３（２−アミノ−４−（３−ピリジニル）−４Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］−ピラン−３−カルボニトリル）；ＫＰ０２０１４４８；ＫＭ２５５０；インテグリン特異的ペプチド；ＩＮＧＮ４０１；ＧＹＫＩ６６４７５；ＧＹＫＩ６６４６２；グリーンスタチン（１０１−３５４−プラスミノーゲン（ヒト））；関節リウマチ、前立腺癌、卵巣癌、グリオーマ、エンドスタチン、結腸直腸癌、ＡＴＦ ＢＴＰＩ、抗新脈管形成遺伝子、新脈管形成抑制薬、または新脈管形成に対する遺伝子治療；ゼラチナーゼ阻害剤、ＦＲ１１１１４２（４，５−ジヒドロキシ−２−ヘキセン酸５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２．５］オクト−６−イルエステル）；ホルフェニメックス（ＰＩＮＮ）（Ｓ）−α−アミノ−３−ヒドロキシ−４−（ヒドロキシメチル）ベンゼン酢酸）；フィブロネクチンアンタゴニスト（１−アセチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイニル−Ｌ−アスパルトアミド）；線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤；線維芽細胞増殖因子アンタゴニスト；ＦＣＥ２７１６４（７，７’−［カルボニルビス［イミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ］−］ビス−１，３，５−ナフタレントリスルホン酸ヘキサナトリウム塩）；ＦＣＥ２６７５２（８，８’−［カルボニルビス［イミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ（１−メチル−１Ｈ−ピロール−４，２−ジイル）カルボニルイミノ］］ビス−１，３，６−ナフタレントリスルホン酸）；内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ；ＶＥＧＦＲアンチセンスオリゴヌクレオチド；抗脈管形成因子および栄養性因子；ＡＮＣＨＯＲ脈管形成薬；エンドスタチン；Ｄｅｌ−１脈管形成タンパク質；ＣＴ３５７７；コントルトロスタチン；ＣＭ１０１；コンドロイチナーゼＡＣ；ＣＤＰ８４５；カンスタチン；ＢＳＴ２００２；ＢＳＴ２００１；ＢＬＳ０５９７；ＢＩＢＦ１０００；アレスチン；アポミグレン（１３０４−１３８８ＸＶ型コラーゲン（ヒト遺伝子ＣＯＬ１５Ａ１α１鎖前駆体））；アンジオインヒビン；ａａＡＴＩＩＩ；Ａ３６；酢酸９αフルオロメドロキシプロゲステロン（（６−α）−１７−（アセチルオキシ）−９−フルオロ−６−メチル−ｐｒｅｇｎ−４−エン−３，２０−ジオン）；２−メチル−２−フタルイミジノ−グルタル酸（２−（１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−２−メチルペンタン二酸）；イットリウム９０標識モノクローナル抗体ＢＣ−１；セマキサニブ（３−（４，５−ジメチルピロール−２−イルメチレン）インドリン−２−オン）（Ｃ１５ Ｈ１４ Ｎ２ Ｏ）；ＰＩ８８（ホスホマンノペンタオース硫酸）；アルボシディブ（４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル）−シス―（−）−）（Ｃ２１−Ｈ２０ Ｃｌ Ｎ Ｏ５）；Ｅ７８２０；ＳＵ１１２４８（５−［３−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−ジエチルアミノエチル）アミド）（Ｃ２２ Ｈ２７ Ｆ Ｎ４ Ｏ２）；スクアラミン（コレスタン−７，２４−ジオール，３−［［３−［（４−アミノブチル）アミノプロピル］アミノ］−，２４−（硫酸水素塩）、（３β、５α、７α）−）（Ｃ３４ Ｈ６５ Ｎ３ Ｏ．ｓｕｂ．５ Ｓ）；エリオクロムブラックＴ；ＡＧＭ１４７０（カルバミン酸、（クロロアセチル）−，５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクト−６−イルエステル、［３Ｒ−［３α、４α（２Ｒ，３Ｒ）、５β、６β］］）（Ｃ１９ Ｈ２８ Ｃｌ Ｎ Ｏ６）；ＡＺＤ９９３５；ＢＩＢＦ１０００；ＡＺＤ２１７１；ＡＢＴ８２８；ＫＳ−インターロイキン−２；ウテログロビン；Ａ６；ＮＳＣ６３９３６６（１−［３−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシプロピルアミノ］−４−（オキシラン−２−イルメチルアミノ）アントラキノンフマル酸塩）（Ｃ２４ Ｈ２９ Ｎ３ Ｏ４．Ｃ４ Ｈ４ Ｏ４）；ＩＳＶ６１６；抗ＥＤ−Ｂ融合タンパク質；ＨＵＩ７７；トロポニンＩ；ＢＣ−１モノクローナル抗体；ＳＰＶ５．２；ＥＲ６８２０３；ＣＫＤ７３１（３−（３，４，５−トリメトキシフェニル−１）−２（Ｅ）−プロペン酸（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−４−［２（Ｒ）メチル−３（Ｒ）−３（Ｒ）−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラン−２−イル］−５−メトキシ−１−オキサスピロ［２．５］オクト−６−イルエステル）（Ｃ２８ Ｈ３８ Ｏ８）；ＩＭＣ−１Ｃ１１；ａａＡＴＩＩＩ；ＳＣ７；ＣＭ１０１；アンギオコール；クリングル５；ＣＫＤ７３２（３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２（Ｅ）−プロペン酸）（Ｃ２９ Ｈ４１ Ｎ Ｏ６）；Ｕ９９５；カンスタチン；ＳＱ８８５；ＣＴ２５８４（１−［１１−（ドデシルアミノ）−１０−ヒドロキシウンデシル］−３，７−ジメチルキサンチン）（Ｃ３０ Ｈ５５ Ｎ５ Ｏ３）；サルモシン；ＥＭＡＰＩＩ；ＴＸ１９２０（１−（４−メチルピペラジノ）−２−（２−ニトロ−１Ｈ−１−イミダゾイル）−１−エタノン）（Ｃ１０ Ｈ１５ Ｎ５ Ｏ３）；αｖ βｘ阻害剤；ＣＨＩＲ１１５０９（Ｎ−（１−プロピニル）グリシル−［Ｎ−（２−ナフチル）］グリシル−［Ｎ−（カルバモイルメチル）］グリシンビス（４−メトキシフェニル）メチルアミド）（Ｃ３６ Ｈ３７ Ｎ５ Ｏ６）；ＢＳＴ２００２；ＢＳＴ２００１；Ｂ０８２９；ＦＲ１１１１４２；４，５−ジヒドロキシ−２（Ｅ）−ヘキセン酸（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−４−［１（Ｒ），２（Ｒ）−エポキシ−１，５−ジメチル−４−ヘキセニル］−５−メトキシ−１−オキサスピロ［２．５］オクタン−６−イルエステル（Ｃ２２ Ｈ３４ Ｏ７）；ならびにＮ−（４−クロロフェニル）−４−（４−ピリジニルメチル）−１−フタラジンアミン；４−［４−［［［［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］カルボニル］アミノ］フェノキシ］−Ｎ−メチル−２−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（５−フルオロ−１，−２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；３−［（４−ブロモ−２，６−ジフルオロフェニル）メトキシ］−５−［［［［４−（１−ピロリジニル）ブチル］アミノ］カルボニル］アミノ］−４−イソチアゾールカルボキサミド；Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［（１−メチル−４−ピペリジニル）メトキシ］−４−キナゾリンアミン；３−［５，６，７，１３−テトラヒドロ−９−［（１−メチルエトキシ）メチル］−５−オキソ−１２Ｈ−インデノ［２，１−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１２−イル］プロピルエステルＮ，Ｎ−ジメチル−グリシン；Ｎ−［５−［［［５−（１，１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル］−４−ピペリジンカルボキサミド；Ｎ−［３−クロロ−４−［（３−フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］−６−［５−［［［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］−２−フラニル］４−キナゾリンアミン；４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−フェニル］ベンズアミド；Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］−４−キナゾリンアミン；Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン；Ｎ−（３−（（（（２Ｒ）−１−メチル−２−ピロリジニル）メチル）オキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（（３−（１，３−オキサゾール−５−イル）フェニル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；２−（（（４−フルオロフェニル）メチル）アミノ）−Ｎ−（３−（（（（２Ｒ）−１−メチル−２−ピロリジニル）メチル）オキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−［３−（アゼチジン−３−イルメトキシ）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−２−（４−フルオロ−ベンジルアミノ）−ニコチンアミド；６−フルオロ−Ｎ−（４−（１−メチルエチル）フェニル）−２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−
ピリジンカルボキサミド；２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−Ｎ−（３−（（（２Ｓ− ）−２−ピロリジニルメチル）オキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−６−イル）−２−（−（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３−（（（（２Ｓ）−１−メチル−２−ピロリジニル）メチル）オキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−Ｎ−（３−（（２−（１−ピロリジニル）エチル）オキシ）−４−（トリフルオロメチル）フェニル）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（４−（ペンタフルオロエチル）−３−（（（２Ｓ）−２−ピロリジニルメチル）オキシ）フェニル）−２−（（４−ピリジニルメチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３−（（３−アゼチジニルメチル）オキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（（４−ピリジニル−メチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（３−（４−ピペリジニルオキシ）−５−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（（２−（３−ピリジニル）エチル）アミノ）−３−ピリジンカルボキサミド；Ｎ−（４，４−ジメチル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−イル）−２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ニコチンアミド；２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−Ｎ−［３−（１−メチルピロリジン−２−イルメトキシ）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−ニコチンアミド；Ｎ−［１−（２−ジメチルアミノ−アセチル）−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル］−２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ニコチンアミド；２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−Ｎ−［３−（ピロリジン−２−イルメトキシ）−５−トリフルオロメチル−フェニル］−ニコチンアミド；Ｎ−（１−アセチル−３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ニコチンアミド；Ｎ−（４，４−ジメチル−１−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−７−イル）−２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）−ニコチンアミド；Ｎ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（３−ピペリジルプロピル）フェニル］［２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）（３−ピリジル）］カルボキサミド；Ｎ−［５−（ｔｅｒｔ−ブチル）イソキサゾール−３−イル］［２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）（３−ピリジル）］カルボキサミド；およびＮ−［４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニル］［２−（１Ｈ−インダゾール−６−イルアミノ）（３−ピリジル）］カルボキサミドを含むが、これらに限定されるものではないキナーゼ阻害剤、および米国特許第６，２５８，８１２号；米国特許第６，２３５，７６４号；米国特許第６，６３０，５００号；米国特許第６，５１５，００４号；米国特許第６，７１３，４８５号；米国特許第５，５２１，１８４号；米国特許第５，７７０，５９９号；米国特許第５，７４７，４９８号；米国特許第５，９９０，１４１号；米国特許公開第２００３０１０５０９１号；および特許協力条約公開番号、国際公開第０１／３７８２０号；国際公開第０１／３２６５１号；国際公開第０２／６８４０６号；国際公開第０２／６６４７０号；国際公開第０２／５５５０１号；国際公開第０４／０５２７９号；国際公開第０４／０７４８１号；国際公開第０４／０７４５８号；国際公開第０４／０９７８４号；国際公開第０２／５９１１０号；国際公開第９９／４５００９号；国際公開第９８／３５９５８号；国際公開第００／５９５０９号；国際公開第９９／６１４２２号；国際公開第００／１２０８９号；および国際公開第００／０２８７１号に開示されたキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されるものではないキナーゼ阻害剤、が挙げられるがこれらに限定されるものではなく、これら公表文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれている。

【0333】

本明細書に提供される抗原結合性タンパク質は、増殖因子阻害剤と併用して使用することもできる。そのような薬剤の例には、ＥＧＦ−Ｒ抗体、ＥＧＦ抗体、およびＥＧＦ−Ｒ阻害剤である分子などのＥＧＦ−Ｒ（上皮増殖因子受容体）応答を阻害することができる薬剤；ＶＥＧＦ受容体およびＶＥＧＦを阻害することができる分子などのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤；ならびにｅｒｂＢ２受容体に結合する有機分子または抗体、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）などのｅｒｂＢ２受容体阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＥＧＦ−Ｒ阻害剤は、例えば、米国特許第５，７４７，４９８号、国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９５／１９９７０号、および国際公開第９８／０２４３４号に記載されている。

【0334】

併用療法の特定の例には、例えば、乳癌の治療にはｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質とタキソールまたはタキサン（例えば、ドセタキセルもしくはタキソテール）または修飾パクリタキセル（例えば、アブラキサンもしくはオパキシオ）、ドキソルビシンおよび／またはアバスチン（登録商標）；腎臓癌の治療にはヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質とマルチキナーゼ阻害剤、ＭＫＩ（スーテント、ネクサバール、もしくは７０６）および／またはドキソルビシン；扁平上皮癌の治療にはｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質とシスプラチンおよび／または放射線；肺癌の治療にはｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質とタキソールおよび／またはカルボプラチンが挙げられる。

【0335】

腫瘍学における適用に加えて、本明細書に提供される結合性タンパク質は、炎症性疾患の治療または検出に使用することができる。マクロファージが疾患の病態の一因となっている炎症性疾患では、他の細胞コンパートメントにおけるマクロファージのレベルを減少させるｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の能力は、これらの疾患の治療における有用な役割を示している。いくつかの研究により、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質が、例えば、炎症性関節炎、アテローム性動脈硬化および多発性硬化症のような炎症性疾患の調節に役割を果たし得ることが示唆されている。

【0336】

治療することができる追加の疾患には、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、関節炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、トキシックショック症候群、敗血症、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、喘息、慢性肺炎症性疾患、珪肺症、肺サルコイドーシス、骨粗鬆症、再狭窄、心臓および腎臓再灌流障害、血栓症、糸球体腎炎、糖尿病、移植片対宿主反応、同種移植片拒絶、多発性硬化症、筋変性、筋ジストロフィー、アルツハイマー病および脳卒中が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0337】

マクロファージにより産生される炎症促進性サイトカインは悪液質病態に関与していると考えられるために、抗原結合性タンパク質を使用して、悪液質を治療することもできる（Ｓｗｅｅｔら、２００２年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８巻：３９２〜３９９頁；Ｂｏｄｄａｅｒｔら、２００６年、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ８巻：３３５〜３４０頁およびＷａｎｇら、２００６年、Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９０巻：４１５〜４２３頁）。

【0338】

種々の炎症性疾患を治療するために使用される抗原結合性タンパク質の能力を考慮すると、抗原結合性タンパク質を種々の他の抗炎症薬と一緒に使用するかまたは併用することができる。そのような薬剤の例には、ＴＮＦ薬（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））および（ＥＮＢＲＥＬ（商標）などの）ＴＮＦ受容体免疫グロブリン分子などのＴＮＦα阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、受容体アンタゴニストまたは可溶性ＩＬ−１ｒａ（例えば、キネレットもしくはＩＣＥ阻害剤）、ＣＯＸ−２阻害剤および上記の阻害剤などのメタロプロテアーゼ阻害剤、ならびにα−２−δリガンド（例えば、ＰＲＥＧＡＢＡＬＩＮ（商標）およびＮＥＵＲＯＴＩＮ（商標））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0339】

ある種の実施形態では、破骨細胞の発生および活性化におけるｃ−ｆｍｓの重要な役割を考慮して、抗原結合性タンパク質を使用して種々の骨疾患も治療することができる（例えば、Ｒｏｌｆ， Ｆ．ら、（２００８年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５５巻：３４０〜３４９頁、およびＷａｔａｒｎ， Ａ．ら、（２００６年）Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２４巻：２７４〜２８２頁）。したがって、抗原結合性タンパク質は、過度の骨喪失を伴う種々の医学的障害を被っている患者、または必ずしも過度の破骨細胞活性が存在するわけではない場合でも新生骨の形成を必要とする患者を治療するのに有用となり得る。過度の破骨細胞活性は、骨減少症（ｏｓｔｏｐｅｎｉａ）、骨粗鬆症、歯周炎、パジェット病、固定化による骨喪失、溶解性骨転移、ならびに、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および骨浸食を伴う他の状態を含む関節炎を含む、提供される抗原結合性タンパク質で治療することができる多数の骨減少性障害と関連している。乳癌および前立腺癌などの一部の癌は、破骨細胞活性を増加させ、骨吸収を誘発することが知られている。骨髄で生じる多発性骨髄腫も骨喪失と関連している。

【0340】

癌の骨転移に関して、本明細書に提供される抗原結合性タンパク質の使用によりＣＳＦ−１／ｃ−ｆｍｓ軸を阻害すれば、複数の作用機序を通じて治療上有用になり得ると考えられる。これらには、ＴＡＭにより産生されるマトリックス分解酵素の喪失による浸潤および転移の阻害、破骨細胞の数および機能の喪失による骨髄内の腫瘍細胞シーディングの阻害、前述のＴＡＭの減少による転移性腫瘍増殖の阻害ならびに骨転移病変に付随する骨溶解の阻害が含まれると考えられる（Ｏｈｎｏ， Ｈ．ら、（２００８年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ５巻：２６３４〜２６４３頁）。抗原結合性タンパク質は、骨の癌である骨肉腫に対しても治療効果を有することができる。

【0341】

グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症、移植後に誘導される骨粗鬆症、化学療法に付随する骨粗鬆症（すなわち、化学療法誘導性骨粗鬆症）、固定化誘導性骨粗鬆症、機械的除去による骨粗鬆症、および抗痙攣薬使用に付随する骨粗鬆症を含むが、これらに限定されることはない種々の形の骨粗鬆症を含む種々の他の低骨質量状態も治療することができる。治療することができる追加の骨疾患には、腎不全ならびに栄養性、胃腸管系および／または肝臓関連骨疾患に付随する骨疾患が挙げられる。

【0342】

例えば、変形性関節炎および関節リウマチを含む異なる形の関節炎も治療することができる。抗原結合性タンパク質を使用して、関節炎（例えば、関節リウマチ）に付随する全身性骨喪失も治療することができる。関節炎を治療する際、被験者抗原結合性タンパク質の病巣周囲または病巣内注射により患者の利益になり得る。例えば、抗原結合性タンパク質を炎症関節の近くにまたは直接に注入し、したがってその部位の損傷した骨の修復を刺激することができる。

【0343】

本明細書に記載される抗原結合性タンパク質は、種々の骨修復適用にも使用することができる。例えば、抗原結合性タンパク質は、人工関節に付随する摩耗デブリ骨溶解を遅延させ、骨折の修復を加速し、移植骨のそれが移植された周囲の生きている骨への取込みを増強するのに有用になり得る。

【0344】

本明細書に提供される抗原結合性タンパク質は、骨障害の治療に使用するときは、単独で投与することも、他の治療薬と併用して、例えば、癌治療薬と、破骨細胞活性を阻害する薬剤と、または骨芽細胞活性を増強する他の薬剤と併用して投与することもできる。例えば、抗原結合性タンパク質は、放射線療法または化学療法を受けている癌患者に投与することができる。抗原結合性タンパク質と併用して使用される化学療法剤には、アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビン、５−フルオロウラシル、オキサロプラチン、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸）および／または癌の治療に使用される他の小分子薬を含んでもよい。

【0345】

抗原結合性タンパク質は、骨質量の喪失をもたらす上記で示す状態の治療のために単独で使用することができるか、または、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２まで命名された骨形成因子類；形質転換増殖因子―βおよびＴＧＦ−βファミリーメンバー；線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０；（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１に対する抗体およびＩＬ−１受容体に対する抗体を含む）インターロイキン−１阻害剤；（エタネルセプト、アダリブマブおよびインフリキシマブを含む）ＴＮＦα阻害剤；（可溶性ＲＡＮＫ、オステオプロテジェリンおよびＲＡＮＫもしくはＲＡＮＫリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体を含む）ＲＡＮＫリガンド阻害剤；Ｄｋｋ−１阻害剤（例えば、抗Ｄｋｋ−１抗体）副甲状腺ホルモン、Ｅシリーズプロスタグランジン、ビスホスホネートならびにフッ化物およびカルシウムなどの骨増強ミネラルを含むが、これらに限定されるものではない治療的有効量の骨成長促進（タンパク質同化）薬または骨再吸収抑制薬と併用して使用することができる。抗原結合性タンパク質およびその機能的断片と併用して使用することができるタンパク質同化薬には、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）が挙げられ、後者の薬剤は好ましくはＩＧＦ結合性タンパク質と複合体を形成する。そのような併用療法に適したＩＬ−１受容体アンタゴニストは国際公開第８９／１１５４０号に記載されており、適切な可溶性ＴＮＦ受容体−１は国際公開第９８／０１５５５号に記載されている。例となるＲＡＮＫリガンドアンタゴニストは、例えば、国際公開第０３／０８６２８９号、国際公開第０３／００２７１３号、米国特許第６，７４０，５１１号および米国特許第６，４７９，６３５号に開示されている。前述の特許および特許出願はすべて参照により本明細書に組み込まれている。

【0346】

抗原結合性タンパク質を使用して、新脈管形成（例えば、腫瘍における）を阻害することもできる。例えば、抗原結合性タンパク質を使用して、炎症性新脈管形成が主にＦＧＦ−２により推進される場合には新脈管形成を減少させることができる。いくつかの実施形態では、抗原結合性タンパク質を使用して、ＶＥＧＦレベルが低く腫瘍血管密度が高い腫瘍において新脈管形成を阻害する。

【0347】

診断法
本明細書に記載される抗原結合性タンパク質を診断目的のために使用して、ｃ−ｆｍｓ関連疾患および／または状態を検出し、診断し、またはモニターすることができる。本開示は、当業者に公知の古典的免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３年、Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， １５巻（Ｒ． Ｈ． ＢｕｒｄｏｎとＰ． Ｈ． ｖａｎ Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ、１９８７年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８５年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０１巻：９７６〜９８５頁；Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８７年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０５巻：３０８７〜３０９６頁）を使用した試料中のｃ−ｆｍｓの存在の検出を提供する。ｃ−ｆｍｓの検出はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも実施することができる。

【0348】

本明細書に提供される診断適用には、ｃ−ｆｍｓの発現およびｃ−ｆｍｓへのリガンドの結合を検出する抗原結合性タンパク質の使用が含まれる。ｃ−ｆｍｓの存在の検出に有用な方法の例には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが挙げられる。

【0349】

診断適用では、抗原結合性タンパク質は、典型的には、検出可能標識基で標識されることになる。適切な標識基には、以下のもの、すなわち、放射性同位元素または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体用の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、標識基は、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合性タンパク質に連結されて潜在的立体障害を減少させる。タンパク質を標識するための種々の方法は当技術分野では公知であり、使用してよい。

【0350】

別の態様では、抗原結合性タンパク質を使用して、ｃ−ｆｍｓを発現する１つまたは複数の細胞を同定することができる。特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は標識基で標識され、標識した抗原結合性タンパク質のｃ−ｆｍｓへの結合が検出される。さらに特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質のｃ−ｆｍｓへの結合はｉｎ ｖｉｖｏで検出される。さらに特定の実施形態では、ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、当技術分野で公知の技法を使用して単離され測定される。例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９９１年編および定期的な増補）； Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ編、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照されたい。

【0351】

本開示の別の態様は、提供される抗原結合性タンパク質とｃ−ｆｍｓへの結合について競合する試験分子の存在を検出することを提供する。１つのそのようなアッセイの例は、試験分子の存在または不在下で一定量のｃ−ｆｍｓを含有する溶液中の遊離抗原結合性タンパク質の量を検出することを含む。遊離抗原結合性タンパク質（すなわち、ｃ−ｆｍｓに結合していない抗原結合性タンパク質）の量の増加は、試験分子が抗原結合性タンパク質とｃ−ｆｍｓへの結合について競合することができることを示すと考えられる。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は標識基で標識される。あるいは、試験分子が標識され、遊離試験分子の量が、抗原結合性タンパク質の存在および不在下でモニターされる。

【0352】

治療方法：医薬調合物、投与経路
抗原結合性タンパク質を使用する方法も提供される。いくつかの方法で、抗原結合性タンパク質は患者に提供される。抗原結合性タンパク質は、ＣＳＦ−１のヒトｃ−ｆｍｓへの結合を阻害する。抗原結合性タンパク質のいくつかの方法での投与は、ＣＳＦ−１のヒトｃ−ｆｍｓへの結合を阻害することにより、ヒトｃ−ｆｍｓの自己リン酸化も阻害することができる。さらに、ある種の方法で、有効量の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を患者に投与することにより、単球走化性が減少する。有効量の抗原結合性タンパク質を投与することにより、いくつかの方法での腫瘍内への単球の遊走が阻害される。さらに、腫瘍または患部組織における腫瘍関連マクロファージの蓄積は、本明細書に提供されるような抗原結合性タンパク質を投与することにより阻害することができる。

【0353】

治療的有効量の１つまたは複数の抗原結合性タンパク質ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントを含む医薬組成物も提供される。さらに、そのような医薬組成物を投与することにより患者を治療する方法が含まれる。用語「患者」にはヒト患者が含まれる。

【0354】

許容される調合物材料は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに無毒である。特定の実施形態では、治療的有効量のヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物が提供される。

【0355】

ある種の実施形態では、許容される調合物材料は、好ましくは用いられる用量および濃度においてレシピエントに無毒である。ある種の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧重量モル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸収または透過を改変する、維持するまたは保存するための調合物材料を含有していてもよい。そのような実施形態では、適切な調合物材料には、（グルシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどの）アミノ酸；抗微生物薬；（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの）抗酸化剤；（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリスＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸などの）緩衝剤；（マンニトールもしくはグリシンなどの）増量剤；（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの）キレート剤；（カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピルβシクロデキストリンなどの）錯化剤；充填剤；単糖類；二糖類；および（グルコース、マンノースもしくはデキストリンなどの）他の炭化水素；（血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどの）タンパク質；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；（ポリビニルピロリドンなどの）親水性ポリマー；低分子量ポリペプチド；（ナトリウムなどの）塩形成対イオン；（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素などの）保存剤；（グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどの）溶剤；（マンニトールもしくはソルビトールなどの）糖アルコール；懸濁剤；（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベートなどのポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなどの）界面活性剤または湿潤剤；（ショ糖もしくはソルビトールなどの）安定性増強剤；（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなどの）張度増強剤；送達媒体；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８版（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｒｍｏ編）、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。

【0356】

ある種の実施形態では、最適の医薬組成物が、例えば、目的の投与経路、送達形式および所望の用量に応じて、当業者により決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記を参照されたい。ある種の実施形態では、そのような組成物は、開示された抗原結合性タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすことができる。ある種の実施形態では、医薬組成物中の主要媒体または担体は、本来水系でも非水系でもよい。例えば、適切な媒体または担体は、場合によっては非経口投与のための組成物でよく見られる他の材料が補充された注射用蒸留水でも、生理食塩水でも、人工脳脊髄液でもよい。中性緩衝化食塩水または血清アルブミンを混合した食塩水は、さらなる例となる媒体である。特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、ソルビトールまたは適切な代用物をさらに含んでいてもよい。ある種の実施形態では、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥させたケーキまたは水溶液の形で随意の調合薬（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記を参照）と混合することにより保存用に調製してもよい。さらに、ある種の実施形態では、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、ショ糖などの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として調合してもよい。

【0357】

医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入のために、または経口的になど消化管を通じての送達のために選択してもよい。そのような薬学的に許容される組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内である。

【0358】

調合物成分は、好ましくは投与部位に許容される濃度で存在する。ある種の実施形態では、緩衝剤を使用して、生理的ｐＨで、またはわずかに低いｐＨで、典型的には約５から約８のｐＨ範囲内で組成物を維持する。

【0359】

非経口投与が企図されている場合、治療組成物は、薬学的に許容される媒体中に目的のヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形で提供してもよい。非経口注射に特に適した媒体は、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質が適切に保存された無菌等張液として調合されている無菌蒸留水である。ある種の実施形態では、調製物は、デポー注射を介して送達することができる産物の制御放出または徐放を提供することができる注射用微粒子、生体浸食性粒子、（ポリ乳酸またはポリグリコール酸などの）高分子化合物、ビーズまたはリポソームなどの薬剤とを含む目的の分子の調合物を含むことができる。ある種の実施形態では、循環中の持続期間を促進する効果を有するヒアルロン酸を使用してもよい。ある種の実施形態では、植え込み型薬物送達装置を使用して、目的の抗原結合性タンパク質を導入してもよい。

【0360】

ある種の医薬組成物は吸引のために調合される。いくつかの実施形態では、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、乾燥した吸入可能な粉末として調合される。特定の実施形態では、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質吸入液は、エアロゾル送達用の噴霧体と一緒に調合してもよい。ある種の実施形態では、溶液を霧状にしてもよい。したがって、肺投与および調合法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、この文献は参照により組み込まれており、化学修飾タンパク質の肺送達を記載している。一部の調合物は経口的に投与することができる。このような形で投与されるヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、習慣的に錠剤およびカプセルなどの固形の剤形の調合で使用される担体と共にまたはなしで調合することができる。ある種の実施形態では、カプセルは、消化管中バイオアベイラビリティが最大になり前全身性の分解が最小である時点で、調合物の活性部分を放出するように設計してもよい。ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の吸収を促進する追加の薬剤を含むことができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤を用いてもよい。

【0361】

一部の医薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物で、有効量の１つまたは複数のヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む。無菌水または別の適切な媒体中で錠剤を溶解することにより、単位用量の形で溶液を調製してもよい。適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0362】

持続送達調合物または制御送達調合物中にヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質を含む調合物を含む追加の医薬組成物は当業者には明白であろう。リポソーム担体、生体浸食性微粒子もしくは多孔質ビーズおよびデポー注射物などの、種々の他の持続送達手段または制御送達手段を公式化するための技術も、当業者には公知である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。この文献は参照により組み込まれており、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載している。徐放調製物は、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形で半透性ポリマーマトリックスを含んでいてもよい。徐放マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されており、各々の文献は参照により組み込まれている）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２巻：５４７〜５５６頁）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−インエタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５巻：１６７〜２７７頁およびＬａｎｇｅｒ、１９８２年、Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．１２巻：９８〜１０５頁）、酢酸エチレンビニル（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、上掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）を含んでいてもよい。徐放組成物は、当技術分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれによっても調製することができるリポソームも含んでいてよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２巻：３６８８〜３６９２頁；欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号、欧州特許出願公開第ＥＰ０８８，０４６号、および欧州特許出願公開第ＥＰ１４３，９４９号を参照されたい。これらの文献は参照により組み込まれている。

【0363】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には、無菌調製品として提供される。無菌化は、無菌濾過膜を通した濾過により実現することができる。組成物が凍結乾燥されている場合は、この方法を使用した無菌化は、凍結乾燥および再構成に先立って、またはそれに続いてのいずれかで実施してよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥の形でまたは溶液中で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内注射溶液バッグまたはバイアルに入れられる。

【0364】

ある種の実施形態では、本明細書に開示された組換え抗原結合性タンパク質を発現している細胞は送達のためにカプセルに包まれる（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４３巻：３２９２〜３２９８頁、２００２年およびＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０３巻：３８９６〜３９０１頁、２００６年参照）。

【0365】

ある種の調合物において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。一部の調合物は、緩衝剤、ショ糖およびポリソルベートを含有する。調合物の例は、５０〜１００ｍｇ／ｍｌの抗原結合性タンパク質、５〜２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５〜１０％ｗ／ｖショ糖、および０．００２〜０．００８％ｗ／ｖポリソルベートを含有する調合物である。ある種の調合物は、例えば、９〜１１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、８〜１０％ｗ／ｖショ糖、および０．００５〜０．００６％ｗ／ｖポリソルベート中に６５〜７５ｍｇ／ｍｌの抗原結合性タンパク質を含有している。ある種のそのような調合物のｐＨは、４．５〜６の範囲である。他の調合物は、５．０〜５．５のｐＨ（例えば、５．０、５．２または５．４のｐＨ）を有する。

【0366】

医薬組成物が調合された後は、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中に保存してもよい。そのような調合物は、すぐに使える形で、または投与に先立って再構成される形（例えば、凍結乾燥される）のいずれで保存してもよい。単回用量投与ユニットを作製するためのキットも提供される。ある種のキットは、乾燥タンパク質を有する第１容器と水性調合物を有する第２容器を含有する。ある種の実施形態では、単室および多室のあるプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが提供される。用いられる治療的有効量のヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質含有医薬組成物は、例えば、治療状況および目標に依存することになる。治療のための適切な用量レベルは、ある程度、送達される分子、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質が使われる適応症、投与経路およびサイズ（体重、体表もしくは器官の大きさ）ならびに／または患者の状態（年齢および全体的な健康）に応じて変化することになることは、当業者であれば認識するであろう。ある種の実施形態では、臨床医は、用量の力価を測り、最適の治療効果を得るために投与経路を変更してもよい。

【0367】

典型的用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまでまたはそれを超える範囲でもよい。特定の実施形態では、用量は１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまで、随意に、０．１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇまで、あるいは、０．３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲でもよい。いくつかの適用では、用量は０．５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまでである。いくつかの例では、抗原結合性タンパク質は、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇで投薬される。いくつかの治療計画における投与計画は、０．３ｍｇ／ｋｇ ｑＷ、０．５ｍｇ／ｋｇ ｑＷ、１ｍｇ／ｋｇ ｑＷ、３ｍｇ／ｋｇ ｑＷ、１０ｍｇ／ｋｇ ｑＷ、または２０ｍｇ／ｋｇ ｑＷの用量である。

【0368】

投薬回数は、使用される調合物中の特定のヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の薬物動態パラメータに依存することになる。典型的には、臨床医が、目的の効果を達成する用量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、または経時的に２回以上投与（同量の目的の分子を含有していてもよいし、含有していなくてもよい）として、または植え込み型装置もしくはカテーテルを介して持続注入として投与してもよい。適切な用量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認してもよい。ある種の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、長時間にわたって患者に投与することができる。抗原結合性タンパク質の連続投与は、完全にはヒト型ではない抗原結合性タンパク質、例えば、非ヒト動物中のヒト抗原に対して起こした抗体、例えば、完全ではないヒト型抗体または非ヒト種中で産生された非ヒト型抗体に一般的に付随する有害な免疫反応またはアレルギー反応を最小化する。

【0369】

医薬組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射による方法；徐放システムによりまたは植え込み型装置による方法に従っている。ある種の実施形態では、組成物は、ボーラス注入によるかあるいは連続注入により、または植え込み型装置により投与してもよい。

【0370】

組成物は、目的の分子がすでに吸収されているかまたは被包されている膜、スポンジまたは別の適切な材料の植え込みを介して局所的に投与してもよい。植え込み型装置が使われているある種の実施形態では、装置はどんな適切な組織または器官に植え込まれてもよく、目的の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介していてもよい。

【0371】

本開示に従うヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質医薬組成物をｅｘ ｖｉｖｏで使用することも望ましいことであり得る。そのような例では、患者から取り出された細胞、組織または器官はヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質医薬組成物に曝露されて、その後細胞、組織および／または器官は続いて患者に植え戻される。

【0372】

特に、ヒトｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質は、ポリペプチドを発現し分泌するように、本明細書に記載される方法などの方法を使用して、遺伝子操作されたある種の細胞を植え込むことにより送達することができる。ある種の実施形態では、そのような細胞は動物細胞でもヒト細胞でもよく、自家性でも、異種性でも、異種間でもよい。ある種の実施形態では、細胞は不死化してもよい。他の実施形態では、免疫応答の機会を減らすために、細胞はカプセルに包んで周囲の組織の浸潤を回避してもよい。追加の実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質産物（複数可）を放出させるが、患者の免疫系による細胞の破壊または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防ぐ生物適合性、半透性重合体の封入体または膜である。

【0373】

実施された実験および得られた結果を含む以下の実施例は、説明目的のためだけに提供されるもので、添付の特許請求の範囲を限定すると解釈すべきではない。

【実施例】

【0374】

アッセイ
ＡＭＬ−５アッセイ
ｃ−ｆｍｓに対する抗体が、ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１軸に結合してそのブロッキングで機能的な活性を示すことができるか否かを決定するために、細胞ベースのバイオアッセイを用いた。このアッセイは、成長因子依存ヒト骨髄単球性細胞系、ＡＭＬ５（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ）のＣＳＦ−１駆動増殖を定量的に測定する。したがって、このアッセイは、この経路をブロックする作用剤を導入することによってこの増殖の阻害を測定する。このアッセイでは、ＡＭＬ−５細胞を、濃度を減少させた抗体の存在下、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、細胞の代謝活性に基づいた増殖の間接測定であるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（商標）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて細胞増殖を測定した。

【0375】

骨髄アッセイ
同様のアッセイで、抗体がカニクイザルｃ−ｆｍｓと交差反応できるか否かを決定するために、抗体を、サル１次骨髄由来の単球性細胞のＣＳＦ−１駆動増殖で試験した。ＡＭＬ−５増殖アッセイと同様に、カニクイザル骨髄細胞を、濃度を減少させた抗体の存在下、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、細胞増殖をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて測定した。

【0376】

実験に用いる抗体クローン
以下に示す実験は、すべてが２つの完全な重鎖および２つの完全な軽鎖を含む四量体である１．１０９、１．２、２．３６０と呼ぶ３種類の抗体クローンの使用を含む。クローン１．１０９は、２つの重鎖Ｈ１（配列番号４）および２つの軽鎖Ｌ１（配列番号３６）を含み、クローン１．２は、２つの重鎖Ｈ８（配列番号１１）および２つの軽鎖Ｌ８（配列番号４３）を含み、クローン２．３６０は、２つの重鎖Ｈ２４（配列番号２７）および２つの軽鎖Ｌ２２（配列番号５７）を含む。

【0377】

（実施例１）
Ｃ−ｆｍｓハイブリドーマの調製
実施形態は、ヒトｃ−ｆｍｓに対する完全ヒトモノクローナル抗体を開発するためにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を用いることができる。免疫化のために、ｃ−ｆｍｓ−Ｆｃ、すなわちＣ末端ヒトＦｃドメインを備えたヒトｃ−ｆｍｓ細胞外ドメイン（残基１〜５１２、図８の配列番号１を参照）を用いた。加えて、ｃ−ｆｍｓ−ＬＺ、すなわちＣ末端ロイシンジッパードメイン（Ａｍｇｅｎ Ｌｏｔ＃４５６４０−４３）を備えたヒトｃ−ｆｍｓ細胞外ドメイン（残基１〜５１２）および２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞系、すなわち完全長ヒトｃ−ｆｍｓでトランスフェクトしたヒトアデノウイルス５型−形質転換ヒト胚腎細胞系を用いて抗ｃ−ｆｍｓ抗体をスクリーニングした。

【0378】

コホート１（ＩｇＧ_１）およびコホート２（ＩｇＧ_２）ＸｅｎｏＭｉｃｅ（登録商標）をｃ−ｆｍｓ−Ｆｃで免疫化／追加免疫化した。血清力価を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、コホート１およびコホート２の両方のマウスからの脾臓を融合してハイブリドーマを作製した。得られたポリクローナル上清を、ｃ−ｆｍｓ−ＬＺに対する結合についてはＥＬＩＳＡによって、２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞に対する結合については蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）によってスクリーニングした。合計８２８の陽性上清を、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によってＣＳＦ−１のｃ−ｆｍｓ／２９３Ｔ細胞に対する結合の阻害について試験した。得られた１６８の陽性上清を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）−５細胞のＣＳＦ−１誘発増殖の阻害についてさらに試験した。スクリーニングに基づいて、３３のハイブリドーマを、ＣＳＦ−１活性に対して拮抗的であるとして同定し、クローニング用に選択した。

【0379】

（実施例２）
抗Ｃ−ｆｍｓハイブリドーマの特徴付け
３３の選択したハイブリドーマから、２９（１９のＩｇＧｌアイソタイプおよび１０のＩｇＧ２アイソタイプ）を首尾よくクローニングし、これらのクローンからの上清を、ＣＳＦ−１の２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞に対する結合の阻害およびＡＭＬ−５細胞のＣＳＦ−１誘発増殖の阻害について試験した。単量体ｃ−ｆｍｓタンパク質を用いた低解像度Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイは、これらの２９の抗ｃ−ｆｍｓハイブリドーマのＫ_Ｄが、０．１〜４３ｎＭの範囲であったことを示した（表８を参照）。抗ヒトＩｇＧを、アミンカップリング法でセンサチップの４つすべてのフローセルに固定した。粗製ハイブリドーマ試料を半分に希釈し、抗ＩｇＧ表面で捕捉した。単量体ｃ−ｆｍｓ（残基１〜５１２）−ｐＨｉｓを、１２５ｎＭの濃度で分析物とした。配列系統の分析も、２９のハイブリドーマに対して行った（図２を参照）。

【0380】

【表8-1】

【0381】

【表8-2】

【0382】

結合の阻害アッセイおよび増殖の阻害アッセイに基づいて、２９の上清うちの１６の上清（１１個のＩｇＧ１アイソタイプおよび５個のＩｇＧ２アイソタイプ）をさらなる特徴付けのために選択した。マウスおよびカニクイザルｃ−ｆｍｓに対する交差反応性を、マウスＤＲＭ（マウス骨髄のＤｅｘｔｅｒ型培養に由来するｒａｓ−およびｍｙｃ−不死化単球性細胞系）細胞およびカニクイザル１次骨髄細胞のそれぞれのＣＳＦ−１誘発増殖の阻害によって試験した。細胞増殖に関して、いずれの上清も、マウスＤＲＭ細胞の増殖を阻害しなかったが（データは不図示）、１６個の内の１３個の上清が、カニクイザル骨髄細胞の増殖を阻害した。上清を、ヒト末梢血由来ＣＤ１４^＋単球のＣＳＦ−１誘発増殖の阻害についても試験し、ヒトＡＭＬ−５バイオアッセイ（上記のアッセイのセクションを参照）で再試験し、この結果を表９および１０に示す。ラット抗ヒトｃ−ｆｍｓ抗体である２−４Ａ５抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を正のコントロールとして用いた。

【0383】

４個のＩｇＧ_１アイソタイプ抗体は、ＡＭＬ−５バイオアッセイで１０ｐＭ未満の力価を有しており、３個の抗体、クローンＩＤ：１．２．１、１．１０９．３、および１．１３４．１は、カニクイザル骨髄細胞の増殖を阻害した。３個の抗体の内、クローン１．２．１および１．１０９．３は、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイでｃ−ｆｍｓに対して最も高い親和性を有していた。２個のＩｇＧ_２アイソタイプ抗体、２．１０３．３および２．３６０．２は、ＡＭＬ−５バイオアッセイおよびカニクイザル骨髄バイオアッセイで高い力価を示し、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイでｃ−ｆｍｓに対して同様の親和性を示した。ＡＭＬ−５おバイオアッセイよびカニクイザル骨髄バイオアッセイで高い力価を示した５個の抗体はまた、配列における多様性も示した。力価、親和性、および多様性のこれらの因子に基づいて、クローン１．２．１、１．１０９．３、および２．３６０．２を、さらなる開発および特徴付けのために選択した。

【0384】

【表9】

【0385】

【表10-1】

【0386】

【表10-2】

【0387】

（実施例３）
抗体の発現および特徴付け
抗体クローン１．２、１．１０９、および２．３６０の重鎖および軽鎖の遺伝子を単離し、ＩｇＧ_２重鎖およびκ軽鎖として発現させるために構築物にクローニングした。抗体を、ＣＯＳ／ＰＫＢ細胞での一過性の発現によって発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。抗体の収量は、この発現系の予想範囲内である３．６〜７．４ｍｇ／ｌであった。

【0388】

クローニングした抗体およびハイブリドーマ−発現抗体の活性を、ＡＭＬ−５増殖アッセイで比較した。ＡＭＬ−５細胞を、濃度を減少させた抗体の存在下、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、細胞増殖をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて測定した（図３を参照）。組換え抗体は、ハイブリドーマ上清と同様の中和活性を示し、１．２および１．１０９のＩｇＧ１からＩｇＧ２への転換は、明確な効果がなかった。組換え抗体はまた、図４に示すように、カニクイザル増殖アッセイで良好な中和活性を実証した。ＡＭＬ−５増殖アッセイと同様に、カニクイザル骨髄細胞を、濃度を減少させた抗体の存在下、１０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共にインキュベートした。７２時間後、細胞増殖をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて測定した。

【0389】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製抗体の特徴付けにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で予想されたよりも大きく移動したクローン１．１０９の軽鎖を除き、一般的な結果が得られた。この例外は、Ｎ−結合型グリコシル化部位の配列が以前にＣＤＲ１で示されていたため予想外ではなかった。予想よりも大きい移動は、このグリコシル化部位が占有されたことを示唆した。

【0390】

抗体のＮ末端配列により、シグナルペプチドが予想通り処理され、重鎖Ｎ末端グルタミン残基が予想通りピログルタミン酸に環化する可能性が高いことが確認された。酵素的脱グリコシル化の後に個々の抗体鎖に対して質量分析を行った。重鎖の質量により、Ｎ末端グルタミン残基がピログルタミン酸に環化し、Ｃ末端リシン残基が存在しないことが確認された。他の翻訳後修飾は示されなかった。クローン１．２ＳＭおよび２．３６０の軽鎖の質量により、これらに翻訳後修飾がなく無傷であることが確認された。クローン１．１０９の軽鎖の質量が得られなかったが、これは、グリコシル化部位が、酵素除去に対して耐性があるために、正確な質量が得られなかったためであろう。

【0391】

（実施例４）
体細胞突然変異（ＳＭ）の修正
既知の生殖細胞系配列とＩｇＧ２クローン１．２、１．１０９．および２．３６０抗体との配列比較により、表１１に示すように、図１Ａおよび図１Ｂに示すような成熟配列に関するものである、当該表中で番号付けをしてある下に示す体細胞突然変異を明らかにした。

【0392】

【表11】

【0393】

体細胞突然変異を生殖細胞系残基に変換できるか否かを調べるために、適当な構築物を作製し、抗体をＣＯＳ／ＰＫＢ細胞での一過性発現により発現させて、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。これらの抗体を、ＩｇＧ_２クローン１．２ＳＭ、１．１０９ＳＭ、および２．３６０ＳＭ（ＳＭは、体細胞突然変異が除かれている）と呼ぶことにした。１．１０９ＬＣの場合、２つの構築物を作製した。第１の構築物では、Ａｓｎ−２８を、Ｎ−結合型グリコシル化部位を除去するためにＡｓｐ−２８に変換し、第２の構築物では、Ａｓｎ−２８をＡｓｐ−２８に変換し、Ａｓｎ−４５をＬｙｓ−４５に変換した。収量は、この発現系の予想範囲内である１．７〜４．５ｍｇ／ｌであった。

【0394】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製抗体の特徴付けにより、一般的な結果が得られた。ＩｇＧ_２クローン１．１０９ＳＭの２つの型のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、軽鎖が親抗体軽鎖よりも速く移動することが示され、Ｎ−結合型グリコシル化部位が除去されたことが確認された。Ｎ末端の配列決定により、抗体鎖のＮ末端が無傷であることが示され、質量分析により、体細胞突然変異が生殖細胞系残基に転換されたことが示された。

【0395】

（実施例５）
体細胞突然変異−修正抗体の特徴付け
体細胞突然変異の修正の後、精製ＩｇＧ_２抗体を、ＡＭＬ−５増殖アッセイおよびカニクイザル骨髄増殖アッセイで再試験した。ＡＭＬ−５増殖アッセイにおけるＩＣ_５０は、親ＩｇＧ_２抗体と比較して、ＩｇＧ_２クローン１．２ＳＭまたは１．１０９ＳＭ（ＳＭは、体細胞突然変異が除かれている）において変化はなかったが、ＩｇＧ_２クローン２．３６０ＳＭ抗体に対しては力価が１０分の１に低下した（表１２を参照）。

【0396】

体細胞突然変異修正抗体の単量体ｃ−ｆｍｓタンパク質に対する結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置を用いて表面プラズモン共鳴によって測定した。ＩｇＧ_２クローン１．２ＳＭ抗体の親和性は、親抗体から実質的に変化がなかったが、ＩｇＧ_２クローン１．１０９ＳＭ抗体および２．３６０ＳＭ抗体の親和性はそれぞれ、親抗体の約２分の１未満であった（表１２を参照）。

【0397】

親（ＰＴ）抗体およびＳＭ ＩｇＧ_２抗体を、^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１のＡＭＬ−５細胞に対する結合を阻害する能力についてさらに試験した。^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１のＡＭＬ−５細胞に対する見掛けの結合親和性が、初めに４６ｐＭであり、未標識ｈＣＳＦ−１のＫ_Ｉが１７．８ｐＭであることが決定された（実施例１０を参照）。表１２に示すように、抗体１．２のＫ_Ｉ値は、ＡＭＬ−５バイオアッセイにおけるＩＣ_５０値に一致し、１．２ＳＭも同様の結果であった。抗体１．１０９のＫ_Ｉ値も、ＩＣ_５０値と一致しており、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した単量体ｃ−ｆｍｓの親和性において２分の１の低下にもかかわらず、１．１０９ＳＭ抗体には変化がなかった。抗体２．３６０は、抗体１．２および抗体１．１０９と同様に阻害せず、２．３６０ＳＭは、その親抗体ほどには良好に阻害しなかった。

【0398】

【表12】

【0399】

１．２ＳＭ抗体の活性を、ヒトまたはカニクイザルの骨髄単球性細胞を用いる増殖アッセイでさらに調べた。ヒトアッセイでは、ヒト細胞を、濃度を減少させた抗体１．２ＳＭの存在下、１１．１ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＣＳＦ−１と共にインキュベートした。カニクイザルアッセイでは、カニクイザル細胞を、濃度を減少させた抗体１．２ＳＭの存在下、２９．６３ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＣＳＦ−１と共にインキュベートした。ヒトＩｇＧ２抗体をコントロール実験に用いた。７日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて細胞増殖を測定し、ＡＴＰのレベルを決定した。非線形回帰曲線フィットを行って抗体のＩＣ５０を決定した。表１３は、３セットの実験の結果を示す。

【0400】

【表13】

【0401】

（実施例６）
Ｃ−ｆｍｓチロシンリン酸化の阻害
抗ｃ−ｆｍｓ ＩｇＧ_２ ｍＡｂの、１．１０９、１．２、および２．３６０が、ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）−反応を完全にまたはほぼ完全に阻害できることを示すために、ＣＳＦ−１刺激の前に、２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を、様々な濃度のこれらのｍＡｂで、３７℃で１時間処理した。

【0402】

滴定希釈を用いた様々な濃度のＩｇＧ_２ｍＡｂは、１．０、０．１、０．０１、０．００１、および０．０００１μｇ／ｍｌであった。コントロールとして、ノンブロッキング抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体、ｍＡｂ３−４Ａ４（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｉｎｔｌ．）、および無関連の抗体、ｈＣＤ３９Ｍ１０５をそれぞれ１．０μｇ／ｍｌで用いた。血清を飢餓状態にした２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を、上記したように様々な濃度を用いてＩｇＧ_２（ＰＴ）ｍＡｂのそれぞれで処理し、各濃度は、５０ｎｇ／ｍｌでのＣＳＦ−１の５分の刺激の前に、５分間、１０倍希釈に変更した。刺激後、全細胞溶解物を収集し、抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）で、４℃で一晩、免疫沈降させ、ウエスタンブロットで試験した。このウエスタンブロットでは、ｃ−ｆｍｓのチロシンリン酸化レベルおよびｃ−ｆｍｓ自体のレベルについて、それぞれ、一般的な抗ｐＴｙｒ抗体、４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０抗体で免疫プローブした。

【0403】

３７℃、５％ＣＯ_２で、２４×１０ｃｍディッシュの上で２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を増殖させるために、１１個のＴ１７５フラスコ（約５０〜６０％コンフルエント）を、４ｍｌトリプシン／フラスコ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって収集し、７０ｍｌ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。次いで、各１０ｃｍディッシュに、培地１０ｍｌを加えて、収集した細胞２ｍｌで接種した。ＤＭＥＭ／−ＦＢＳ培地を、３７℃で１時間調製した。慎重な吸引により１０ｃｍディッシュから培地を除去し、ＦＢＳ−含有培地を可能な限り除去した。ＤＭＥＭ／−ＦＢＳ １０ｍｌを加え、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

【0404】

３７℃で１時間、血清を飢餓状態にさせた後、培地を除去した。抗体処理およびマイナス−Ａｂコントロールを、４．０ｍｌの連続希釈Ａｂ含有試料を用いるかまたはＤＭＥＭ／−ＦＢＳのみを用いるかのいずれかで調製し、３７℃で１時間さらにインキュベートして合計２時間、血清の飢餓をもたらした。抗体前処理およびリガンド刺激を表１４に例示する。

【0405】

【表14-1】

【0406】

【表14-2】

【0407】

５０ｎｇ／μｌ（２５μｇ／バイアル）ＣＳＦ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ／２１６−ＭＣ／Ｌｏｔ ＣＣ０９３０９１）の新鮮なバイアルを、５００μｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）／０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で再構成して、氷上で保存した。ＣＳＦ−１ストックの１：１０００に希釈物（６０μｌ）を、Ａｂ−処理終了の約５分前にＤＭＥＭ／−ＦＢＳ（６０ｍｌ）に調製した。２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１と共に３７℃で５分間インキュベートした。上清を取り除き、２ｍｌの冷溶解緩衝液（ＰＢＳ／１％トリトン １００ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １００μｌ、１．０Ｍ ＮａＦ １００μｌ、０．５Ｍ β−グリセロールリン酸２００μｌ、バナジン酸ナトリウム（１００×）５００μＬ、オカダ酸（１０，０００×）１０．０μＬ、およびＣｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼインヒビター４錠）を加えた。この溶解物（２．０ｍｌ）を、５０％プロテインＡ／Ｇセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）３０μｌと混合して、ロッカープラットフォーム（ｒｏｃｋｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で、４℃で１時間インキュベートし、非特異的結合性タンパク質を予め除去した。画分を回転させた後、上清を新しい１５ｍｌ管に注いだ。

【0408】

全細胞溶解物を２．５μｇ／ｍｌ抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０（２５μｌ；０．２μｇ／μｌで）で免疫沈降させた。抗体−細胞溶解混合物を、ロッカープラットフォーム上で、４℃で一晩インキュベートし、全ｃ−ｆｍｓをプローブした。ロバ抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰ（ブロッキング溶液中に１：１０，０００；Ｊａｃｋｏｎ）を加え、４℃でもう３０分間さらにインキュベートした。この免疫複合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて免疫ブロットした。ウエスタンブロットを、ｐＴｙｒ ｃ−ｆｍｓおよび全ｃ−ｆｍｓのそれぞれの検出のために抗ｐＴｙｒ ４Ｇ１０かまたは抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０のいずれかでプローブした。

【0409】

図５に示すように、ＩｇＧ_２クローン（ＰＴ）１．１０９、１．２、および２．３６０は、２９３Ｔ３／ｃ−ｆｍｓアッセイ系においてリガンド−誘発ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓを阻害する能力を示した。ＣＳＦ−１刺激前の０．１μｇ／ｍｌ（８．３ｎＭ）のＩｇＧ_２クローン（ＰＴ）１．１０９または１．２での１時間の処理により、ホスホチロシンシグナルがバックグラウンドレベルに低下した。他方、ＩｇＧ_２クローン（ＰＴ）２．３６０は、１．０μｇ／ｍｌ（８３ｎＭ）で等しく阻害した。しかしながら、０．０１μｇ／ｍｌ（０．８３ｎＭ）以下のいずれかの抗体の処理では、ｐＴｙｒ阻害が起こらなかった。対照的に、ノンブロッキング抗ｃ−ｆｍｓ ３−４Ａ４抗体および無関連のｈＣＤ３９Ｍ１０５抗体は、最も高い用量（１．０μｇ／ｍｌ）で、−ｍＡｂ／＋ＣＳＦ−１コントロールと比べて、リガンド−誘発ｐＴｙｒシグナルに対する影響がなかった。したがって、ｐＴｙｒ形成の阻害は、ＣＳＦ−１結合のブロッキングに直接つながっている。

【0410】

これらのアッセイで用いた２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓトランスフェクタントが、予め測定された約３０，０００個の受容体／細胞の細胞表面ｃ−ｆｍｓ密度を維持したと仮定すると、約３，０００，０００個の細胞が、約９０×１０^６個のｃ−ｆｍｓを保持することになり、それは、０．１μｇ／ｍｌでの前処理の４．０ｍｌ中の約５．０×１０^１１個のｍＡｂよりも著しく低い。標的について約１０，０００倍過剰に存在するｍＡｂにより、利用可能なｃ−ｆｍｓが飽和し得る。これは、８．３ｎＭのクローン（ＰＴ）１．１０９または１．２が、５０ｎｇ／ｍｌまたは１．０ｎＭのＣＳＦ−１の、または約１０：１（ｍＡｂ：ｃ−ｆｍｓ）モル比でのＣＳＦ−１のシグナル伝達を効果的にブロックしたことを示す。クローン（ＰＴ）１．１０９および１．２の有効性の閾値は、このアッセイ系において０．１〜０．０１μｇ／ｍｌ（０．８３〜８．３ｎＭ）の間に入るであろう。

【0411】

ＣＳＦ−１を添加しない１．０μｇ／ｍｌ ＩｇＧ_２（ＰＴ）ｍＡｂでの処理では、バックグラウンドレベルを超えるｐＴｙｒシグナルが得られなかった。１０μｇ／ｍｌで用いた全３種のＩｇＧ_２（ＰＴ）型を用いた前の実験でも、同一条件下でｐＴｙｒシグナルが検出されなかった。これらのｍＡｂに関連したアゴニスト活性は、一切測定されなかった。

【0412】

（実施例７）
ＩｇＧ_２のＰＴ型およびＳＭ型を用いたリガンド−誘発ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓの阻害
この研究の目的は、ＩｇＧ_２クローン１．１０９、１．２、および２．３６０の生殖細胞系−復帰変異（ＳＭ）型の、それぞれの親型（ＰＴ）と比較した任意の機能の変化が存在するか否かを決定することであった。この実験のための２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を調製するために、５個のＴ１７５（約８０〜９０％コンフルエント）からの増殖している細胞を４ｍｌトリプシン／フラスコによって収集し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ７５ｍｌに移した。各２４×１０ｃｍディッシュに対して、培地９ｍｌを加え、収集した細胞３ｍｌで接種した。ＤＭＥＭ／−ＦＢＳ培地を調製し、かつ／または３７℃で１時間暖めた。慎重な吸引により１０ｃｍディッシュから培地を除去し、ＦＢＳ含有培地を可能な限り除去した。ＤＭＥＭ／−ＦＢＳ（１０ｍｌ）を加え、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。冷溶解緩衝液を調製して、氷上で保存した。

【0413】

表１５に示すようにモノクローナル抗体滴定物を調製し、室温に保った。

【0414】

【表15-1】

【0415】

【表15-2】

【0416】

一連の連続抗体希釈物（３００μＬ＋２．７ｍｌのＤＭＥＭ／−ＦＢＳ）を、各ｍＡｂについて１．０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲で試験した。３７℃、１時間で血清を飢餓状態にした後、培地を除去し、抗体前処理およびマイナス−Ａｂコントロールを、表１３に記載したのと同様に調製した。抗体前処理およびリガンド刺激を、以下に示す表１６に記載する。

【0417】

【表16-1】

【0418】

【表16-2】

【0419】

抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂ（ＳＭ型）によるリガンド−誘発ｐＴｙｒを、実施例６に記載するようにＰＴ型に対して行った。

【0420】

１．０μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでの３種のＩｇＧ_２ ｍＡｂのＰＴ型のＳＭ型に対する効果を比較するための２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を用いた実験では、リガンド−誘発ｐＴｙｒ／Ｃ−ｆｍｓを阻害する能力における差が見られなかった（図６を参照）。クローン１．１０９および１．２（ＰＴ型およびＳＭ型の両方）は、２．３６０（ＰＴ型およびＳＭ型）を用いるよりも低い濃度で阻害を示した。

【0421】

クローン１．１０９および１．２（ＰＴまたはＳＭ）はまた、５０ｎｇ／ｍｌ（１．０ｎＭ）ＣＳＦ−１の添加の前に、２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を０．１μｇ／ｍｌ（８．３ｎＭ）以上のｍＡｂで、３７℃で１時間処理すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリガンド−誘発ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓを防止することができた。これらのモノクローナル抗体のｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓの形成を阻害する能力は、ＣＳＦ−１のシグナル伝達、単球の遊走、およびその後のＴＡＭの蓄積の阻害をもたらすであろう。アゴニスト活性は、これらのｍＡｂが非−ＣＳＦ−１依存的様式で受容体の活性化を回避することと関連していないようであった。ｍＡｂは、１．０μｇ／ｍｌの濃度および１０μｇ／ｍｌもの高い濃度で用いた場合、アゴニスト活性を全く示さなかった（データは示さない）。

【0422】

したがって、ｍＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリガンド−誘発ｐＴｙｒ／ｃ−ｆｍｓを防止することができた。

【0423】

（実施例８）
抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂによるＣ−ｆｍｓの免疫沈降
ｃ−ｆｍｓに結合して免疫沈降させるＩｇＧ_２抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂの能力は、上記したように、安定にトランスフェクトされた２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞を使用することによって達成された。非刺激細胞の全細胞溶解物を、各ｍＡｂ（ＰＴおよびＳＭ）および抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０抗体と共に一晩免疫沈降させ、ｃ−ｆｍｓの検出用プローブとしてＣ２０ Ａｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）を用いるウエスタンブロットによって試験した。ｃ−ｆｍｓを、モノクローナル抗体によって免疫沈降させた。３７℃／５％ＣＯ_２、約７５％コンフルエントで増殖させた安定にトランスフェクトされた２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓの溶解物を調製し、表１７に示すようにモノクローナル抗体と組み合わせた。

【0424】

【表17】

【0425】

安定な２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓの未処理全細胞溶解物を用いた免疫沈降実験により、ｃ−ｆｍｓに結合して沈降させる様々なｍＡｂ（２．３６０ＳＭを除く）の能力が、ポリクローナル抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０コントロール；クローン２．３６０−ＳＭと比較して同等であることが実証されたが、このアッセイでキャパシティの低下が示された（図７を参照）。

【0426】

（実施例９）
ＩｇＧ_２ ｍＡｂによるＳＮＰ−変異体の免疫沈降
一塩基多型またはＳＮＰは、ゲノム配列における１つのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣ）が変化した時に起こるＤＮＡ配列変異である。ＳＮＰは、ヒトゲノムのコード領域および非コード領域の両方で起こり得る。多くのＳＮＰは、細胞機能に影響を与えないが、科学者は、他のＳＮＰは、人々を疾患に罹りやすくする、または人々の薬物反応に影響を与え得ると考えている。ＤＮＡ配列における変異は、疾患、環境障害（例えば、細菌、ウイルス、毒素、および化学種）、薬物、および他の療法に対する個人の応答の仕方に大きな影響を与え得る。このため、ＳＮＰは、生物医学的研究、医薬品開発、および医療診断に大きな価値がある。さらに、ＳＮＰ地図により、科学者が、複雑な疾患、例えば、癌、糖尿病、および血管疾患などに関連した多数の遺伝子を同定することができる。

【0427】

ヒトｃ−ｆｍｓの細胞外領域は、５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）−様反復ドメイン（Ａ〜Ｅと呼ぶ）に分割することができる。ヒトドメインの議論については、例えば、Ｈａｍｐｅ， Ａ．ら、（１９８９年）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．、４巻、９〜１７頁を参照されたい。マウスタンパク質における対応するドメインについては、例えば、Ｗａｎｇら、（１９９３年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、５３４８〜５３５９頁を参照されたい。ドメインＡ〜Ｃは、ＣＳＦ−１結合領域を含むことが示されており、ドメインＤは、リガンド結合の際の受容体の二量体化の制御を助けることが示されている。ヒトｃ−ｆｍｓの３つの自然発生ＳＮＰ−変異体、すなわち、Ｉｇ−ドメインＣのＡ２４５Ｓ、Ｖ２７９Ｍ、およびＩｇ−ドメインＤのＨ３６２Ｒを調製した（ｃ−ｆｍｓの細胞外ドメインのアミノ酸配列については図８を参照）。これらのＳＮＰは、ＣＳＦ−１結合領域内またはその近傍で見出され、抗ｃ−ｆｍｓ Ｈ−３００（ヒトｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１ＲのＮ末端近傍にマッピングされるアミノ酸１１〜３１０に対して起こされたウサギポリクローナル抗体；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、Ｉｎｃ．、Ｃａｔ． Ｎｏ． ｓｃ−１３９４９）でプローブするウエスタンブロットによって試験した。

【0428】

ヒトｃ−ｆｍｓ ＳＮＰ変異体が、本明細書で提供する様々なｃ−ｆｍｓ Ａｂとどのように相互作用するかを研究するために、上記したように、ｃ−ｆｍｓ ＳＮＰ変異体の３つの型を発現する一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞および野生型（ＷＴ）ｃ−ｆｍｓ（ならびに無関連のベクター−一致コントロール）を用いて、免疫沈降によって各抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂのＳＮＰ−変異体に結合する能力を評価した。

【0429】

２９３Ｔ細胞を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏにおけるｃ−ｆｍｓ Ａ２４５Ｓ、Ｖ２７９Ｍ、Ｈ３６２Ｒ、ＷＴ ｃ−ｆｍｓ、および無関連のコントロール構築物を用いて１０ｃｍディッシュで２連でトランスフェクトし、３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間増殖させた。細胞溶解物を、上記したように調製した。アリコート１．０ｍｌ中で２．５μｇ／ｍｌの抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂおよびポリクローナル抗ｃ−ｆｍｓ Ｃ２０または抗ｃ−ｋｉｔ Ｃ１９を、表１８に例示するように各溶解物に加えた。

【0430】

【表18-1】

【0431】

【表18-2】

【0432】

細胞を、実施例６で記載したようにロッカー上で、４℃で一晩インキュベートした。

【0433】

抗体は、ＷＴコントロールに比べ、ＳＮＰ型に結合する能力が全く低下していないことを示した（図９）。ｍＡｂは、一定範囲の自然発生ｃ−ｆｍｓ変異体に対する結合キャパシティを有するようである。

【0434】

安定な２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓの未処理全細胞溶解物からの免疫沈降により、各種すべてのｍＡｂ（２．３６０ＳＭを除く）のｃ−ｆｍｓに結合して沈降させる能力が、ポリクローナル抗ｃ−ｆｍｓコントロールに対して等しく；クローン２．３６０ＳＭが、このアッセイでキャパシティの明らかな低下を示したことが実証された。一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ／ｃ−ｆｍｓ細胞からｃ−ｆｍｓおよびＳＮＰ変異体を免疫沈降させる様々なｍＡｂの能力の試験により、ＳＮＰ型を結合する能力が全く低下していないことが示された。様々なｍＡｂのｃ−ｆｍｓ ＳＮＰに対する結合能は、これらのｍＡｂが、ヒトに存在することが知られている多種多様の変異体の中からｃ−ｆｍｓタンパク質を認識することを示した。

【0435】

（実施例１０）
抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂによる^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１の結合の阻害
抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂの細胞表面発現ヒトｃ−ｆｍｓに対する親和性を、^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１のＡＭＬ−５細胞に対する結合の阻害を測定することによって決定した。

【0436】

組換えｈＣＳＦ−１（Ａｍｇｅｎ）を、^１２５Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてヨウ素化した。ＰＢＳ ７５μｌ、ｈＣＳＦ−１ １０μｇ、および１ｍＣｉ ^１２５Ｉを、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）プレコートヨウ素化管に入れ、１５分間、氷上で放置した。この混合物を、平衡化した２ｍｌ
Ｐ６カラムに移して、^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１をゲル濾過によって遊離^１２５Ｉから分離させた。ヨウ素化ｈＣＳＦ−１含有画分をプールし、次いで結合培地（２．５％ウシアルブミンフラクションＶ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、および０．２％アジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩ−１６４０、ｐＨ７．２）中で１００ｎＭの濃度まで希釈した。４．８×１０^１５ｃｐｍ／ｍｍｏｌの特異的活性を、ｈＣＳＦ−１の初期タンパク質濃度と、追加の^１２５Ｉを除き、ヨウ素化プロトコルを通して^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１のアリコートを用いるコントロール実験からの８０％の回収率とに基づいて計算した。

【0437】

ＡＭＬ−５細胞の表面で発現されるｃ−ｆｍｓに対するｈＣＳＦ−１の結合のＫ_ＤおよびＫ_Ｉの両方を決定するために、飽和放射性リガンド結合実験を、各阻害アッセイと共に行った。混合物を、総量１５０μｌ／ウェルの９６ウェル丸底マイクロタイタープレートにセットした。すべての試薬を、０．２％アジ化ナトリウムを含む結合培地で希釈して、受容体の内部移行および脱落の可能性を最小限にするために４℃で実験を行った。

【0438】

飽和結合アッセイでは、^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１を２倍に連続希釈し、約１．７ｎＭの濃度で開始し、約１．５ｐＭ濃度の１２ウェルをで終了した。非特異的結合を、１，０００倍モル過剰の未標識ｈＣＳＦ−１の存在下、単一濃度の^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１（約８０ｐＭ、３連）で測定し、存在する放射標識ｈＣＳＦ−１の濃度の１次関数であると推定した。

【0439】

^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１阻害アッセイでは、未標識ｈＣＳＦ−１を５ｎＭの開始濃度に設定した。抗ｃ−ｆｍｓ１．２、１．１０９、および２．３６０（それぞれに対してＰＴおよびＳＭ）の開始濃度はそれぞれ、０．３１２ｎＭ、１．２５ｎＭ、および２０ｎＭとした。各試料を、１５ウェルで２倍に連続希釈した。結合培地のみの３連のウェルおよび１，０００倍モル過剰の未標識ｈＣＳＦ−１の３連のウェルを、阻害率を決定するためのコントロールとしてアッセイの開始時、中間、終了時にセットした。単一濃度の^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１（約９ｐＭ）を各ウェルに加えた。

【0440】

ＡＭＬ−５細胞をＰＢＳで２回洗浄し、インキュベーションの直前に各アッセイプレートに１×１０^５細胞／ウェルで加えた。

【0441】

両方のアッセイは、ミニオービタルシェーカーで、時間経過実験で決定した平衡に達するまでに必要となる時間の長さである４時間かけて、４℃でインキュベートした。各インキュベーション混合物の２つの６０μｌのアリコートを、フタル酸油２００μｌを含む冷却した４００μｌポリエチレン遠心分離管に移し、細胞結合^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１を遊離^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１から分離するために、９６１５×ｇで、４℃の卓上マイクロチューブ（Ｓｏｒｖａｌｌ）で１．５分間回転させた。この油管を切断し、個々の１２×７５ｍｍガラス管に収集した各細胞ペレットおよび上清を、ｃｐｍ測定のためにＣＯＢＲＡガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）にセットした。各ウェルから取った２連のアリコートからのｃｐｍを分析のために平均した。

【0442】

飽和結合データを、Ｐｒｉｓｍバージョン３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）の非線形回帰によって単純１部位結合式にフィットさせて、細胞表面発現ヒトｃ−ｆｍｓに結合する^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１についての４６ｐＭの見掛け平均Ｋ_Ｄを得た。未標識ｈＣＳＦ−１（見掛けの平均Ｋ_Ｉ＝１７．８ｐＭ）および各抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂのＫ_Ｉ値を生成するために同時結合アッセイで得た^１２５Ｉ−ｈＣＳＦ−１のＫ_Ｄ値を用いて、阻害データを、Ｐｒｉｓｍの非線形回帰によって単一部位競合阻害式にフィットさせた。２つの実験からの平均Ｋ_Ｉ値を報告した（表１３を参照）。

【0443】

（実施例１１）
抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂに対する単量体Ｃ−ｆｍｓの結合の速度定数および結合定数の決定
ヒトｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）．ｐＨＩＳ（Ａｍｇｅｎ）の抗ｃ−ｆｍｓ ｍＡｂに対する親和性をＢｉａｃｏｒｅによって測定した。ＣＭ４センサチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて実験を２５℃で行った。センサチップ、アミンカップリング剤（ＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、およびエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖサーファクタントＰ２０）、および１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５をＢｉａｃｏｒｅ ＡＢから購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｕｍｉｎａｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｏｗｄｅｒ）をＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔ ＳｐｅｃｉｆｉｃをＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。

【0444】

抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的捕捉抗体を、泳動用緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを含む標準的なアミンカップリング化学反応を用いてＣＭ４チップに共有結合で固定した。簡単に述べると、各フローセルを、０．１Ｍ ＮＨＳと０．４Ｍ ＥＤＣの１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて、５μｌ／分の流速で７分間活性化させた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の２８μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧを約２７００ＲＵの密度で固定した。残った反応性の表面を、１Ｍエタノールアミンを５μｌ／分で７分間注入して不活化させた。１００μｌ／分での１０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ１．５の５０μｌの３回の注入で、残っている非共有結合した捕捉抗体のすべてを除去し、各表面を調整した。残りのすべてのステップに対して、泳動用緩衝液を０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰに切り替えた。

【0445】

０．２５μｇ／ｍｌ抗ｃ−ｆｍｓ１．２または抗ｃ−ｆｍｓ１．２ＳＭを１０μｌ／分で２分間、１つのフローセル中のヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγに対して注入て、約４７ＲＵの表面密度を得た。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγのみを含む別のフローセルを基準表面として用いた。各アッセイは、シグナルを安定させるための分析物として１０サイクルの緩衝液で開始した。ヒト単量体ｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）．ｐＨＩＳ試料を、３０、１０、３．３３、１．１１、０．３７、および０．１２ｎＭの濃度に３連で調製し、捕捉した抗ｃ−ｆｍｓおよび基準表面の両方に対して１００μｌ／分でランダムな順に６つの緩衝液ブランクと共に注入した。各複合体は、結合が２分間、解離が５分間できるようにした。これらの表面は、１００μｌ／分での１０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ１．５の３０秒のパルスでの各ｃ−ｆｍｓ注入または緩衝液注入、これに続く３０秒の緩衝液注入の後に再生された。

【0446】

他の抗ｃ−ｆｍｓ抗体を、同様の要領で調べたが、結合特性の差異を考慮してプロトコルを変更した。抗―ｃ−ｆｍｓ１．１０９および抗―ｃ−ｆｍｓ１．１０９ＳＭを各々、１０μｌ／分で１．５分間、０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧに対して注入して、それぞれ５９ＲＵおよび９１ＲＵの表面密度を得た。ヒトｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）．ｐＨＩＳ試料を、抗ｃ−ｆｍｓ１．１０９の結合のために１０、３．３３、１．１１、０．３７、０．１２、および０．０４１ｎＭの濃度に調製し、０．０４１ｎＭの試料を除いて同じセットを、抗ｃ−ｆｍｓ１．１０９ＳＭの結合のために調製した。ヒト単量体ｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）．ｐＨＩＳは、抗ｃ−ｆｍｓ１．１０９からは２０分間、１．１０９ＳＭからは１５分間、解離できるようにした。抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０および抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０ＳＭのそれぞれを、１０μｌ／分で１．５分間または２分間、１μｇ／ｍｌでヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγに対して注入して、約１００ＲＵの表面密度を得た。ヒトｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）／ｐＨＩＳ試料を、抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０の結合のために３０、１０、３．３３、１．１１、および０．３７ｎＭの濃度に調製し、０．１２ｎＭの試料を追加した同じセットを、抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０ＳＭの結合のために調製した。ヒト単量体ｃ−ｆｍｓ（１〜５１２）．ｐＨＩＳは、抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０からは８分間、抗ｃ−ｆｍｓ２．３６０ＳＭからは５分間、解離できるようにした。

【0447】

データは、バルク屈折率の変化を取り除くために基準表面応答を減じること、および実験のフローセルからの系統的アーチファクトを取り除くために平均した緩衝液ブランクを減じることによって二重参照した。データを処理して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（バージョン４．１、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）のローカルＲｍａｘで１：１相互作用モデルに対して全体的にフィットさせて、動力学速度定数ｋ_ａおよびｋ_ｄを得た。ｃ−ｆｍｓの各濃度の３連の試料からのデータを収集したが、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアに固有のパラメータ数の制限により、２連の試料からのデータのみを分析することができる。Ｋ_Ｄを、ｋ_ｄ／ｋ_ａの商から算出した。結果を表１９に示す。上記した種々の実施例からのデータを表２０に要約した。

【0448】

【表19】

【0449】

【表20】

【0450】

（実施例１２）
抗Ｃ−ｆｍｓ抗体ＩｇＧ_２クローン１．１０９、１．２、および２．３６のエピトープマッピング
Ｃ−ｆｍｓ−アビジン融合構築物の調製
ｃ−ｆｍｓアビジン融合発現構築物を図１０に示す。各融合タンパク質を発現させるために、ヒトｃ−ｆｍｓ細胞外ドメインのコード配列をＰＣＲ増幅し、制限酵素ＸｈｏＩを用いて、ｃ−ｆｍｓ配列がニワトリアビジン配列のＣ末端に結合されるようにｐＣＥＰ４−アビジン（Ｎ）にクローニングした。ニワトリアビジンに対するシグナル配列がｐＣＥＰ４−アビジン（Ｎ）ベクター内で無傷で残ったため、ｃ−ｆｍｓのシグナル配列は含ませなかった。

【0451】

上記したように、細胞外ドメインは、５つの異なるＩｇ−様領域を含む。ヒトｃ−ｆｍｓの異なるドメインは、例えば、Ｈａｍｐｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ、１９８９年、４巻、９〜１７頁で議論されている。マウスｃ−ｆｍｓの対応するドメインの議論については、例えば、Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３年、１３巻、５３４８〜５３５９頁を参照されたい。以下に示す異なるアビジン構築物は、示したＩｇ−様ドメインに一致するように調製した（細胞外ドメインのアミノ酸配列：配列番号１を示す図８を参照されたい）。

【0452】

シグナル：アミノ酸１〜１９
Ｉｇ様１ドメイン：アミノ酸２０〜１２６
Ｉｇ様１〜２ドメイン：アミノ酸２０〜２２３
Ｉｇ様１〜３ドメイン：アミノ酸２０〜３２０
Ｉｇ様１〜４ドメイン：アミノ酸２０〜４１８
Ｉｇ様１〜５ドメイン：アミノ酸２０〜５１２
Ｉｇ−様２ドメインのみ：アミノ酸８５〜２２３
したがって、エピトープマッピングのためにヒトｃ−ｆｍｓ（短縮型）の特定の領域を作製する際は、次のアミノ酸：Ｉｇ−様ループ１（ＩＰＶＩ−ＡＬＬＰ）、Ｉｇ−様ループ１および２（ＩＰＶＩ−ＡＱＩＶ）、Ｉｇ−様ループ１〜３（ＩＰＶＩ−ＥＧＬＮ）、Ｉｇ−様ループ１〜４（ＩＰＶＩ−ＧＴＬＬ）、およびＩｇ−様ループ１〜５（ＩＰＶＩ−ＰＰＤＥ）、ならびにＩｇ−様ループ２のみ（ＴＥＰＧ−ＡＱＩＶ）を標的としてＰＣＲ増幅を行った。カッコ内に示す配列は、各ドメインに対するそれぞれの開始配列および終了配列を示す（図８を参照）。ジスルフィド結合がドメインの自然の３次元構造の維持に重要であるため、指し示した特定の領域は、ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基を維持するように選択した。さらに、Ｉｇ−様ループ２のみについての構築物は、同じ理由からＩｇ−様ループ１からの一部の配列を含む。結果として、列記したドメインの開始アミノ酸および終了アミノ酸は、上記したＨａｍｐｅおよびＷａｎｇによる論文で特定したドメイン領域とはやや異なる。

【0453】

アビジン融合タンパク質の発現
アビジン融合タンパク質の発現は、Ｔ７５組織培養フラスコ中でのヒト２９３Ｔ接着細胞の一過性トランスフェクションによって達成した。細胞を増殖させ、１０％透析処理済ＦＢＳおよび１×Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−グルタミン（増殖培地）を含むＤＭＥＭ（高グルコース）中に３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。約３×１０^６個の２９３Ｔ細胞を、増殖培地１５ｍｌを含むＴ７５フラスコ内に接種し、一晩、約２０時間増殖させた。次いで、細胞を、ｐＣＥＰ４−アビジン（Ｎ）−ｃ−ｆｍｓ構築物でトランスフェクトした。各フラスコで、ＤＮＡ １５μｇを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７５μｌと混合し、この複合物を２０分間インキュベートした。このトランスフェクション複合物を対応するフラスコ内に接種し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で、３７℃で４〜５時間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を新しい増殖培地に交換した。トランスフェクションの約４８時間後、馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を回収し、４℃で１０分間、２０００×ｇで遠心分離して細胞および細片を除去してから、５０ｍｌ管に移した。ＤＮＡを用いない点以外は同じプロトコルにしたがってコントロールフラスコ（偽トランスフェクション）も作製し、結合実験のための負のコントロール馴化培地を用意した。

【0454】

融合タンパク質の検出
各ｃ−ｆｍｓアビジン融合タンパク質の濃度を、定量的ＦＡＣＳベースのアッセイで決定した。ｃ−ｆｍｓアビジン融合タンパク質を、６．７μｍビオチンポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ Ｉｌｌ．）に捕捉した。１×馴化培地（２０μｌおよび２００μｌ）を５μｌ（約３．５×１０^５）のビーズに加え、回転させながら室温で１時間インキュベートした。馴化培地を遠心分離によって除去し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＰＢＳ）で試料を洗浄した。アビジンビーズを、ＢＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌヤギＦＩＴＣ標識抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）溶液２００μｌを用いて、ホイルで覆って室温で４５分間染色した。インキュベーション後、ビーズを遠心分離によって再収集し、ＢＰＢＳで洗浄し、そして分析のためにＢＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁した。ＦＩＴＣ蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で検出した。このシグナルを、ｒＡｖｉｄｉｎから得た標準曲線を用いてタンパク質質量に変換した。エピトープマッピングのために、ビオチンビーズに、３．５×１０^５ビーズ当たり約１００ｎｇのｃ−ｆｍｓアビジン融合タンパク質を負加して、増殖培地で体積を増大させた。

【0455】

抗体結合ＦＡＣＳアッセイ
正規化した量のＣ−ＦＭＳサブドメイン融合タンパク質を負加したビオチン被覆ポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）を、ＢＰＢＳ ０．２ｍｌ中の１μｇのＦＩＴＣコンジュゲート抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体（１．１０９、１．２、および２．３６）と混合した。室温での１時間のインキュベーションの後、洗浄緩衝液（ＢＰＢＳ）３ｍｌを加え、抗体−ビーズ複合体を、５分間の７５０×ｇの遠心分離によって収集した。ペレットを、ＢＰＢＳ ３ｍｌ中で洗浄した。アビジン−ビーズ複合体に結合した抗体を、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）分析によって検出した。平均（Ｘ）蛍光強度を、各試料について記録した。

【0456】

抗体競合アッセイ
フルオレセインでの標識物を調製するために、モノクローナル抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で透析または再懸濁した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｆ−２１８１）からの標識（［６−フルオレセイン−５−（および６）−カルボキサミド］ヘキサン酸，スクシンイミジルエステル５（６）−ＳＦＸ）混合異性体を、ＤＭＳＯ中の５ｍｇ／ｍｌ標識ストックからのモル比９．５：１（標識物：タンパク質）となるようにタンパク質に加えた。この混合物を、暗い中で、室温で１時間インキュベートした。標識抗体を、ＰＢＳ中での透析によって遊離標識物から分離した。各競合実験では、ＢＰＢＳ中の２０倍過剰（２０μｇ／ｍｌ）の未標識競合抗体、アビジン融合タンパク質で被覆された３．５×１０^５ビオチンビーズを含む結合反応物を作製した。未標識競合抗体の３０分のプレインキュベーションの後、ＦＩＴＣ標識抗体（１μｇ／ｍｌ）を加えた。この処理に続いて、この時点から単色法（ｏｎｅ ｃｏｌｏｒ ｍｅｔｈｏｄ）を行った。

【0457】

２９３Ｔ細胞に発現したすべての融合タンパク質（図１１）を、ＦＡＣＳｃａｎによってＦＩＴＣ標識抗アビジン抗体で検出することができる。どのｃ−ｆｍｓ Ｉｇ−様ドメインが抗体結合部位であるかを決定するために、６つすべての融合タンパク質を結合アッセイで用いた。抗体クローン１．１０９、１．２、および２．３６は、ヒトｃ−ｆｍｓサブドメインＩｇ様１〜２、Ｉｇ様１〜３、Ｉｇ様１〜４、およびＩｇ様１〜５融合タンパク質に結合する。これらの抗体クローンは、単一ドメインｃ−ｆｍｓ Ｉｇ様１およびＩｇ−様２の融合タンパク質には結合しない。比較のために、ヒトｃ−ｆｍｓ ＥＣＤを、正のコントロールとして用いている（図１１および図１２）。これらの結果は、これら３つの抗体のエピトープが、ヒトｃ−ｆｍｓのＮ末端Ｉｇ−様ループ１およびＩｇ−様ループ２に主に位置し、Ｉｇ−様ループ１領域およびＩｇ−様ループ２領域の両方の存在を必要とすることを示唆する。これらの結果はまた、抗体が、Ｉｇ−様ループ３に主に位置するリガンドの高親和性結合部位を直接ブロックし得ないことも示唆している。抗体は、共にリガンド結合に極めて重要な領域であるＩｇ−様ループ１およびＩｇ−様ループ２のために、リガンド結合に間接的に影響を与え得る（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３年、１３巻、５３４８〜５３５９頁）。

【0458】

３つの抗体の内、クローン１．１０９は、１μｇ／ｍｌのもとで他の２つ抗体と比べて最も高い結合シグナルを有する。競合データは、３つの抗体が、２０倍過剰の未標識抗体を用いて互いにブロックできることを実証した（図１３、図１４、および図１５を参照）。競合データはまた、これら３つの抗体のエピトープが、Ｉｇ−様ループ１およびＩｇ−様ループ２内で同様であるかまたは近接していることも示している。

【0459】

（実施例１３）
市販の抗体に対比した抗ｃ−ｆｍｓ抗体１．２ＳＭのエピトープマッピング
この実験は、本明細書に開示する特定のヒト抗体が、いくつかの市販の抗体と同じであるかまたは異なるエピトープに結合するかを決定するために行った。

【0460】

材料および方法：試験した市販のＣ−ｆｍｓ抗体
試験したラット抗体およびマウス抗体を表２１および表２２に示す。

【0461】

【表21】

【0462】

【表22】

【0463】

ｃ−ｆｍｓアビジン融合構築物およびアビジン融合タンパク質の発現
ヒトｃ−ｆｍｓアビジン融合発現構築物を、実施例１２に記載したように調製した。アビジン融合タンパク質の発現は、１０ｃｍ組織培養プレートでのヒト２９３Ｔ接着細胞の一過性のトランスフェクションによって達成した。１×Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１×ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（増殖培地）を補充した、５％の適格な（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ） ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）中で３７℃、５％ＣＯ_２で細胞を増殖させ維持した。約２．５×１０^６個の２９３Ｔ細胞を、増殖培地１０ｍｌを含む１０ｃｍプレートに接種し、一晩、約２０時間増殖させた。次いで、細胞をｐＣＥＰ４−アビジン（Ｎ）−ｃ−ｆｍｓ構築物でトランスフェクトした。各トランスフェクションでは、ＤＮＡ ７．５μｇを、補充していないＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）４５μｌと混合し、この複合体を２０分間インキュベートした。このトランスフェクション複合体を、対応するプレートに加え、３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、細胞を１×ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、上記の補充物に加えてインスリン、トランスフェリン、およびＳｅｌｅｎｉｕｍ−Ｘ（ＩＴＳ−Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む無血清ＤＭＥＭ ５ｍｌを加えた。トランスフェクションの約４８時間後、馴化培地を回収し、４℃で１０分間、２０００×ｇで遠心分離して細胞および細片を除去してから１５ｍｌ管に移した。ＤＮＡを用いない点以外は同じプロトコルにしたがってコントロールプレート（偽トランスフェクション）も作製し、結合実験のための負のコントロール馴化培地を用意した。

【0464】

融合タンパク質の検出
各ｃ−ｆｍｓアビジン融合タンパク質の濃度を、定量的ＦＡＣＳに基づくアッセイで決定した。アビジン融合タンパク質を、６．７μｍビオチンポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ Ｉｌｌ．）に捕捉した。１×馴化培地（２、２０、および２００μｌ）を５μｌ（約３．５×１０^５）のビーズに加え、回転させながら室温で１時間インキュベートした。馴化培地を遠心分離によって除去し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ（ＦＰＢＳ）で試料を洗浄した。アビジンビーズを、ＦＰＢＳ中の１．０μｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ標識ヤギ抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）溶液５００μｌを用いて、回転させながら、室温で３０分間、染色した。インキュベーション後、ビーズを遠心分離によって再収集し、ＦＰＢＳで洗浄し、そして分析のためにＦＰＢＳ０．５ｍｌ中で再懸濁した。ＦＩＴＣ蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で検出した。このシグナルを、ｒＡｖｉｄｉｎから得た標準曲線を用いてタンパク質質量に変換した。エピトープマッピングのために、ビオチンビーズに、３．５×１０^５ビーズ当たり約２００ｎｇのｃ−ｆｍｓアビジン融合タンパク質を負加して、ＦＰＢＳで体積をあわせた。

【0465】

抗体結合ＦＡＣＳアッセイ
正規化した量のｃ−ｆｍｓサブドメイン融合タンパク質を負加したビオチン被覆ポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）を、ＦＰＢＳ ０．２ｍｌ中の１μｇのヒト抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体（１．２）、マウス抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体（ＭＡＢ３２９、ＭＡＢ３２９１、およびＭＡＢ３２９２［Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ］）、またはラット抗ｃ−ｆｍｓモノクローナル抗体（２−４Ａ５−２［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、Ｏ．Ｎ．１７８および５Ｊ１５［Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ］）いずれかと混合した。室温での１時間のインキュベーションの後、抗体−ビーズ複合体を、洗浄緩衝液（ＦＰＢＳ）１．２５ｍｌで３回洗浄し、洗浄と洗浄の間に１８，０００×ｇでの１分間の遠心分離によって収集した。次いで、抗体を、１．０μｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にコンジュゲートした種適正ヤギ２次抗体で３０分間、染色した。洗浄ステップを繰り返して、抗体−ビーズ複合体を、分析のためにＦＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁した。アビジン−ビーズ複合体に結合した抗体を、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）分析によって検出した。平均（Ｘ）蛍光強度を、各試料について記録した。

【0466】

抗体競合アッセイ
フルオレセインでの標識物を調製するために、モノクローナル抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で透析または再懸濁した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｆ−２１８１）からの標識（［６−フルオレセイン−５−（および６）−カルボキサミド］ヘキサン酸，スクシンイミジルエステル５（６）−ＳＦＸ）混合異性体を、ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍｌストックからのモル比１０：１（標識物：タンパク質）となるようにタンパク質に加えた。この混合物を、暗い中で、室温で１時間インキュベートした。標識抗体を、ＰＢＳ中でのＮＡＰ５カラムクロマトグラフィーによって遊離標識物から分離し、続いて０．２μｍ濾過を行った。各競合実験では、ＦＰＢＳ中の２５倍過剰（２５μｇ／ｍｌ）の未標識競合抗体、アビジン融合タンパク質で被覆された３．５×１０^５ビオチンビーズを含む結合反応物を作製した。１５分のプレインキュベーションの後、ＦＩＴＣ標識抗体（１μｇ／ｍｌ）を加えた。この処理に続いて、この時点から単色法を行った。

【0467】

結果および考察
２９３Ｔ細胞で発現したすべての融合タンパク質を、ＦＡＣＳｃａｎによってＦＩＴＣ標識抗アビジン抗体で検出することができる。実施例１２に記載したように、試験したいくつかの抗体が、Ｉｇ１〜２アビジン融合構築物で見られるＩｇ−様ループ１領域およびＩｇ−様ループ２領域の両方の存在を必要とする同様のエピトープに結合する。したがって、結合実験および競合実験は、本明細書で提供するヒト抗体、市販の抗ヒトｃ−ｆｍｓ抗体、およびアビジン融合構築物のパネルから選択したメンバーのうちの１つと共に行った。

【0468】

すべての市販の抗体は、予想通り、完全長ｃ−ｆｍｓ ＥＣＤ Ｉｇ１〜５構築物に首尾よく結合することができた。６つの市販の抗体の内、１つ（ＭＡＢ３２９１）が、Ｉｇ１〜２構築物に結合することができ、ヒト抗ｃ−ｆｍｓエピトープの潜在的な競合物であることを示唆した。さらなる結合実験を、Ｉｇ１構築物を用いて行った。ＭＡＢ３２９１は、Ｉｇ１構築物に結合することが示され、そのエピトープがＩｇ１−様ドメイン内に完全に位置していることを示唆した。Ｉｇ１−構築物およびＩｇ１〜２−構築物中のＭＡＢ３２９に対して見られる微弱シグナルは、抗体のビーズに対するバックグラウンド結合であることが確認された。

【0469】

競合データは、市販の抗体はいずれも、たとえ２５倍過剰の競合物抗体でも代表的なヒト抗体をブロックできないことを実証した。

【0470】

結合実験および競合実験からのデータの組合せは、市販の抗体が、ヒト抗ｃ−ｆｍｓ抗体によって使用されていないエピトープに結合することを実証する。

【0471】

（実施例１４）
ｃ−ｆｍｓのアルギニン／グルタミン酸スキャニングによる抗Ｃ−ｆｍｓ抗体のエピトープマッピング
アルギニン／グルタミン酸−スキャニング法を用いて、ｃ−ｆｍｓに対する抗体の結合をマッピングした。アルギニンおよびグルタミン酸の側鎖は、荷電していて大きく、ｃ−ｆｍｓに対する抗体の結合を妨げることがある。したがって、この方法は、残基が、突然変異すると、抗原結合性タンパク質のｃ−ｆｍｓに対する結合に負の影響を与えることを示唆し得る。これは、非突然変異抗原結合性タンパク質における対応する残基が、抗原結合性タンパク質に接触することができるかまたは抗体に近接することができるため、アルギニンまたはグルタミン酸での置換が結合に影響を与えるのに十分であることを示唆する。

【0472】

アルギニン／グルタミン酸変異物の構築、発現、および特徴付け
ｃ−ｆｍｓの初めの３つのＩｇドメイン中に分布する９５個のアミノ酸を、変異のために選択した。この選択は、荷電アミノ酸または極性アミノ酸に偏っており、変異によって誤って折り畳まれたタンパク質になる可能性を低減するためにシステインおよびプロリンを除外した。アルギニンでないアミノ酸をアルギニンに変異させ；アルギニンおよびリシンをグルタミン酸に変異させた。

【0473】

変異残基を含むセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを９６ウェルフォーマットで合成した。ｃ−ｆｍｓ細胞外ドメイン−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ−タグ化構築物（「野生型」）の変異誘発を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃２００５２３）を用いて行った。ｐＴＴ５ベクターにおけるＦｌａｇ−Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｃ−ｆｍｓのすべての変異体構築物を、９６ウェルプレート内で一過性にトランスフェクトした２９３−６Ｅ懸濁細胞（ＮＲＣＣ）で発現させた。馴化培地中の組換えタンパク質の発現レベルおよび完全性を、Ｈｉｓ−タグに対するウエスタンブロットによっておよびこれに続く抗アイソタイプＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ抗体によって特徴付けた。続いて、エピトープマッピング実験を、馴化培地中のタンパク質を用いて行った。

【0474】

変異体発現を、ｅＰａｇｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して各ウェルから上清を流すこと、ブロッティングすること、および抗Ｈｉｓ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびこれに続く抗アイソタイプＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ抗体でのプロービングによって特徴付けた。各変異体構築物を発現させた。

【0475】

高次構造エピトープの決定
抗ｃ−ｆｍｓ抗体が、ｃ−ｆｍｓ上の高次構造エピトープに結合するか否かを決定するために、３種類の抗ｃ−ｆｍｓ抗体（１．２ＳＭ、１．１０９ＳＭ、および２．３６０）およびｃ−ｆｍｓを個々に、還元および非還元の条件下でウエスタンブロットにかけた。抗体１．２ＳＭおよび抗体２．３６０は、還元条件下でのウエスタンブロットにおけるバンドの欠如によって証明されているように高次構造エピトープに結合することが示された一方で、抗体１．１０９ＳＭでは、薄いバンドが観察され、抗体１．１０９ＳＭが線形エピトープに結合し得ることを示唆した。

【0476】

ＢｉｏＰｌｅｘ結合アッセイ
ビーズを用いたマルチプレックスアッセイを用いて、９５ｃ−ｆｍｓ変異体、野生型、および陰性コントロールに結合する抗体を同時に測定した。１００セットの色分けされたストレパビジン被覆ＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を、室温（ＲＴ）で１時間、ビオチン化抗ｐｅｎｔａＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１９２２５）に結合させてから洗浄した。次いで、それぞれの色分けされたビーズセットを、上清１００μｌ中のｃ−ｆｍｓ変異体、野生型、または陰性コントロールに室温で１時間結合させてから洗浄した。

【0477】

それぞれが特定のタンパク質に結合した色分けされたビーズセットをプールした。プールしたビーズは、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＳＢＶＮ１２５０）の９６ウェルに分注した。３倍希釈物の抗ｃ−ｆｍｓ抗体（１．２ＳＭ、１．１０９ＳＭ、および２．３６０）１００μｌを３連の目的のために３つのカラムに加え、室温で１時間インキュベートしてから洗浄した。１：２００に希釈したフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９−１１６−１７０）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートしてから洗浄した。

【0478】

ビーズを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中に再懸濁し、１０分間振盪し、ＢｉｏＰｌｅｘ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。この装置は、各ビーズをその色分けによって識別し、ＰＥ染料の蛍光強度にしたがってビーズに結合した抗体の量を測定した。各変異体に結合する抗体を、同じプール内の野生型に結合する抗体と直接比較した。

【0479】

変異体ｃ−ｆｍｓに結合する抗体の同定
アッセイ系の可変性および結合における変化の有意性を経験的に決定した。ビーズとビーズおよびウェルとウェルの可変性を、１００セットすべての色分けされたビーズに対する野生型ｃ−ｆｍｓの結合によって実験に基づいて決定した。ビーズを、９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、プレートの各カラムを下ってプレートの全１２カラムにわたり３倍希釈物の抗ｃ−ｆｍｓ抗体１．２ＳＭで探査した。最大シグナル、最小シグナル、および勾配の可変性を測定することからの曲線フィットを用いてＥＣ５０を導いた。可変性測定値を用いて、ＥＣ５０における大きさの変動が有意であるか否かを決定した。

【0480】

抗体結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、重み付け４パラメータロジスティカル曲線フィット（ＳｐｌｕｓでのＶａｒＰｏｗｅｒ付き４ＰＬ）を用いてグラフにした。実験の可変性を、各プールの３つの野生型コントロールを用いて決定した。突然変異体抗原に結合する抗体を、各野生型コントロールと比較した。突然変異体と各野生型コントロールとの間のＥＣ５０倍数変化の９９％信頼区間（ＣＩ）を計算し、野生型コントロールに対する比較により、より大きいｐ値が報告された。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ（ＦＤＲ）コントロールを用いた多数回の調整を加えた。ＥＣ５０の９９％ＣＩが野生型のＥＣ５０とは有意差がある変異、すなわち０．０２以下のＦＤＲ調整ｐ値を有する変異は、タンパク質抗原と抗原結合性タンパク質との間の特異的な結合反応に重要であるとみなされた。加えて、野生型の最大ＭＦＩシグナルの３０％以下への低下によって証明されるような結合を低下させた突然変異は、タンパク質抗原と抗原結合性タンパク質との間の結合に有意に影響を与えるとみなされた。表２３は、１．２ＳＭ抗体、１．１０９抗体、および２．３６抗体のヒトｃ−ｆｍｓの細胞外ドメインに結合する能力を有意に低下させる「ヒット」または突然変異の位置をまとめている。表２３に用いた表記法は：（野生型残基：ポリペプチドにおける位置：突然変異体残基）であり、数字の付け方は、配列番号１に示す通りである。

【0481】

【表23】

【0482】

少なくとも１つの抗体の結合が、表２３に示す特定の突然変異の存在下で維持されるため、変異体タンパク質が、導入された突然変異によって著しく誤って折り畳まれるかまたは凝集する可能性は低い。これはまた、それでも抗体が抗原に結合できるため、すべての抗体に対してＥＣ５０の変動を引き起こしたそれらの突然変異に対しても当てはまる。試験した抗体のそれぞれが、ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）分析によって示されるように同様の領域に結合するが、各抗体は、抗体の突然変異体抗原に対する結合を阻害する突然変異によって区別することができる。複数の抗体に影響を及ぼす一部の突然変異は、抗体が同様のビンに属するという事実に一致している。

【0483】

（実施例１５）
ＭＤＡＭＢ２３１乳房腺癌異種移植片の成長の阻害
本明細書で提供する抗原結合性タンパク質は、ヒトｃ−ｆｍｓに結合するがマウスｃ−ｆｍｓには結合しないため、抗ｃｆｍｓ抗体が癌を治療するのに有用であること実証するためにマウスｃ−ｆｍｓに結合する抗体で一連のｉｎ ｖｉｖｏ実験を行った。

【0484】

無胸腺ヌードマウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）の存在下、１０，０００，０００個のＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳房腺癌細胞を皮下移植した。腫瘍細胞移植の１日目の内に開始し、研究の期間中、１週間に３回、ＰＢＳ １００μｌ中の抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体４００μｇまたはコントロールラット抗マウスＩｇＧ ４００μｇのいずれかをマウスに腹膜内注射した。腫瘍の測定および治療の日を図１６に示す。５１日後、マウスを安楽死させ、腫瘍を収集し、ホルマリン固定した。Ｈ＆Ｅ染色切片およびＦ４／８０（マクロファージマーカー）標的化免疫組織化学切片を評価した。すべてのスコアリングは、処理および群が見えないようにして行った。抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体で処置したマウスからの切片は、コントロールで処置したマウスよりも有意に少ない染色性を示し、腫瘍関連マクロファージの数の有意な減少を示唆した。より客観的に壊死の範囲を評価するために、ＡＦＯＧ染色切片デジタル画像を、Ｍｅｔａｖｕｅソフトウエアでキャプチャし、腫瘍の全体の断面積および壊死断面積を測定した。次いで、各腫瘍の壊死率を、これらの測定値から算出し、図１６に示す。これらの結果は、抗ｃ−ｆｍｓ抗体が、腫瘍関連マクロファージを減少させ、壊死を増大させ、そしてＭＤＡＭＢ２３１乳房腺癌異種移植片の成長を阻害できることを実証している。

【0485】

（実施例１６）
樹立ＮＣＩＨ１９７５肺腺癌異種移植片の成長の阻害
無胸腺ヌードマウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）の存在下、１０，０００，０００個のＮＣＩＨ１９７５ヒト肺腺癌細胞を皮下移植した。腫瘍を２５０〜３００ｍｍ^３になるまで成長させてから、研究の期間中、１週間に３回、ＰＢＳ １００μｌ中の抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体４００μｇまたはコントロールラット抗マウスＩｇＧ ４００μｇのいずれかをマウスに腹膜内注射した。第３群のマウスを、１週間に１回、３０ｍｇ／ｋｇ タキソテール（陽性コントロール）で処置した。腫瘍の測定値および処置の日を、抗ｃ−ｆｍｓ抗体が樹立ＮＣＩＨ１９７５肺腺癌異種移植片の成長を阻害できることを示す図１７に示す。

【0486】

上記の腫瘍モデルは、癌の治療における使用に対して、本明細書に開示するようなＣＳＦ−１／ｃｆｍｓ軸の活性を阻害する抗ｃ−ｆｍｓ抗体の有用性を実証している。病変組織内へのマクロファージの浸潤を減少させるこのような抗体の能力は、このような抗体を代謝疾患および炎症の疾患にも用いることができることを意味する。

【0487】

（実施例１７）
コントロール新脈管形成に対するＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒの相互作用の調節
ＣＳＦ−１に媒介されるマクロファージの動員、分化、および刺激が、腫瘍または他の正常組織における新脈管形成の促進に関与し得るか否かを試験するために、２つの異なる中和ラット抗マウスＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体（Ｍ２７９は内部で産生；もう一方のＦＳ９８は、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た）を、ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス角膜新脈管形成に対するこれらの抗体の影響について評価した。コントロールｍＡｂ、Ｍ２７９、またはＡＦＳ９８の１回の全身投与後の５日目に、次のパラメータ：１）マウス角膜新脈管形成応答に関連した血管密度、２）マウスＣＳＦ−１の循環濃度、および３）角膜および他の組織内へのマクロファージの浸潤レベルを測定し分析した。

【0488】

マウス角膜ポケットアッセイ
４ｍｍ ＰＶＡスポンジ（Ｍ−ＰＡＣＴ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ、Ｅｕｄｏｒａ、ＫＳ）を正確に二等分し、組換えヒトＦＧＦ−２ ２．４μｇまたは組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）４８μｇを含むＰＢＳ ８μｌに浸漬した。このスポンジを、角膜ポケット移植に適した４８個の同様の大きさのミニスポンジ片（ペレット）にさらに無菌的に（ａｓｃｅｐｔｉｃａｌｌｙ）分割した。各スポンジ片は、組換えヒトＦＧＦ−２約５０ｎｇまたは組換えヒトＶＥＧＦ １μｇを含んでいた。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜１０週齢）を全身麻酔で麻酔をかけて、それぞれの眼にプロパラカイン局所麻酔薬を１滴投与して眼を角膜切開に備えた。角膜の中間に細いスリット形成し、角膜輪部から約１ｍｍの眼の曲率にしたがった角膜実質に開口（「ポケット」）を形成した。ＰＢＳ、ＶＥＧＦ、またはＦＧＦ−２を含むペレットを、角膜ポケット内におき、動物を、発熱物質を含まないＰＢＳ ２００μｌ中の２５０μｇの用量のラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ＩＰまたは精製ラット抗マウスＣＳＦ−１Ｒ ２５０μｇのいずれかで処置した。ペレット移植後の５日目に、マウスを全身麻酔で麻酔をかけて、それぞれの眼（角膜）を、ペレットを含む経線の極軸から４５度の初期角の近距離垂直照明を取り付けたＩｎｓｉｇｈｔ Ｓｐｏｔデジタルカメラを取り付けた実体顕微鏡下で画像化した。これらの取得したデジタル画像を、減算カラーフィルター（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）で処理し、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウエア（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、ＴＮ）で分析して、可視毛細血管に一致する閾値を超えた角膜周辺の全密度の範囲内のピクセルの割合を決定した。角膜の全血管密度を、ピクセルの割合を用いて決定し、この結果を、眼全体の領域のピクセル数に対する血管領域のピクセル数の比として表した。

【0489】

マウスＣＳＦ−１ ＥＬＩＳＡ
マウスＣＳＦ−１の血清レベルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＤＵＯＳＥＴ抗体ＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の活性のバイオマーカーとして決定した。

【0490】

マウスの肝組織および角膜組織におけるマクロファージおよび血管の免疫局在性
組織におけるマクロファージおよび血管のレベルに対する抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体の影響を決定するために、Ａｌｅｘａ４８８、クローンＢＭ８にコンジュゲートしたラット抗マウスＦ４／８０（マクロファージが制限された細胞表面糖タンパク質）（１：１０００）を用いて組織マクロファージを検出した。ＰＥ、クローン３９０がコンジュゲートしたＣＤ３１、ラット抗マウスＰＥＣＡＭ−１ ＩｇＧ２ａ（１μｇ／ｍｌ使用）を用いて、内皮細胞を検出した。組織を回収した後、この組織をさらなる処理のためにＯＣＴ内で凍結させた。肝臓または角膜のいずれかの５ミクロンの切片を、冷アセトンで、室温で１５分間固定してから、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、切片をブロッキング溶液（ＢＳ）で、室温で３０分間インキュベートした。Ｆ４／８０−４８８およびＣＤ３１−ＰＥの両方を、上記濃度でＢＳに加え、切片を室温で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。スライドを封入剤の中に封入して、Ｌｅｉｃａ−Ｈａｍａｍｕｔｓｕ−Ｏｐｅｎｌａｂシステムで蛍光画像を取得した。

【0491】

結果および結論：
ラット抗ｍｕＣＳＦ−１Ｒ中和抗体、Ｍ２７９、およびＡＦＳ９８は、ＶＥＧＦではなくＦＧＦ−２誘発マウス角膜新脈管形成を約８０％、有意に阻害した（Ｐ＜０．０１）。Ｍ２７９またはＡＦＳ９８ ２５０μｇの１回投与により、ラットＩｇＧ処理マウスで観察されたレベルに比べて、ｍｕＣＳＦ−１血清レベルが有意に上昇した（４５〜８３倍の上昇）。免疫蛍光染色／局在化（ＩＭＦ）により、マウス角膜切片は、ＦＧＦ−２およびＶＥＧＦのペレット移植が、外科／ＰＢＳペレット移植のみに比べて、角膜におけるマクロファージの浸潤を増加させることを示した。Ｍ２７９処理により、コントロールラットＩｇＧ処置に比べて、刺激剤誘発（ＦＧＦ−２およびＶＥＧＦの両方）角膜マクロファージ浸潤が約８５〜９６％、大幅に減少した。ＩＭＦにより、マウス肝切片は、Ｍ２７９またはＡＦＳ９８での１回の処置が、マウス肝臓におけるＦ４／８０陽性マクロファージの数を約６０％、有意に減少させたが、ＣＤ３１ＩＭＦによる評価では血管密度を明確には変更しなかったことも示した（Ｐ＜０．０１）。マクロファージは、血管ネットワークに付随するが、一般に、血管化したマウス角膜における微小血管に共局在しない。

【0492】

両方の脈管形成刺激（ＦＧＦ−２およびＶＥＧＦ）を評価すると、ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用のブロッキングにより、組織に対するマクロファージの浸潤が減少したが、角膜血管密度画像処理に基づくとＦＧＦ−２新脈管形成のみが阻害された。これらの結果に基づき、ＣＳＦ−１応答性組織マクロファージが新脈管形成を助長／促進できる場合は炎症環境が指示するのは明らかであるが、同時に、複数の炎症部位における組織マクロファージが、炎症病変でのその存在を維持するために進行中のＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用を必要とすることを例証している。これらの結果は、炎症性新脈管形成が主にＦＧＦ−２によって駆動される場合、ＣＳＦ−１／ＣＳＦ−１Ｒ相互作用を阻害することが、特に、ＶＥＧＦレベルが高くはないが腫瘍血管密度が高い腫瘍では、新血管形成の低減に役立ち得ることを示している。

【0493】

（実施例１８）
カニクイザルでの毒性試験
カニクイザルに１．２ＳＭ抗体を投与して、薬力学的（ｐｈａｒｍｏｃｏｄｙｎａｍｉｃ）マーカーを測定した。ｃ−ｆｍｓ抗原結合性タンパク質の影響を試験するために用いたコホートを表２４に示す。４週間の間、カニクイザルに抗体１．２ＳＭを毎週静脈内投与し、続く１１週間を回復期とし、２９日目に末期剖検をし、３ヶ月で回復期剖検をした。血清ＣＳＦ−１レベル、酒石酸塩（Ｔａｒｔｒａｔｅ）耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（Ｔｒａｐ５ｂ）濃度、および結腸マクロファージの量を含む薬力学的マーカーを測定した。より詳細に後述するように、これらの各マーカーの測定は、ｃ−ｆｍｓに結合し、かつｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１軸を阻害する抗体の能力を実証した。マーカーのレベルはまた、血中の抗体のレベルに相関していた。

【0494】

【表24】

【0495】

抗体１．２ＳＭでの処置に対する血清ＣＳＦ−１レベルの応答
血清ＣＳＦ−１レベルは、抗ｃ−ｆｍｓ抗体の存在および活性のバイオマーカーとなる。これは、マウスにおける^１２５Ｉ標識ＣＳＦ−１のマクロファージによる選択的分解（Ｔｕｓｈｉｎｓｋｉ ＲＪら、Ｃｅｌｌ、（１９８２年）、２８巻、７１〜８１頁）；ｃ−ｆｍｓノックアウトマウスの血清中でＣＳＦ−１が上昇するという観察（Ｄａｉ ＸＭら、Ｂｌｏｏｄ、（２００２年）、９９巻、１１１〜１２０頁）；および抗マウスｃ−ｆｍｓ抗体で処置したマウスで血清ＣＳＦ−１レベルが上昇するという実証によって証明されている。

【0496】

カニクイザルＣＳＦ−１の相対濃度を、−７日目、８日目、２９日目、５７日目、８５日目、および９９日目に収集した血清標本に対して決定した。試料を、アッセイ製造業者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ヒトＣＳＦ−１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって提供されたプロトコルにしたがって、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。カニクイザルＣＳＦ−１濃度を、ヒトＣＳＦ−１標準曲線に対する比較によって決定した。

【0497】

血清抗体１．２ＳＭの濃度を測定するために、マウス抗１．２ＳＭ抗体を、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロプレートウェル（Ｎｕｎｃ）に受動的に吸着させた。過剰なマウス抗１．２ＳＭ抗体を除去した後、マイクロプレートウェルをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）でブロックした。標準品および品質コントロール品（ＱＣ）を、抗体１．２ＳＭを１００％カニクイザル血清プールにスパイクすることによって調製した。ブロッキング後にマイクロプレートウェルを洗浄した。標準品、基質ブランク（ＮＳＢ）、ＱＣ、および研究試料を、周囲室温で解凍し、次いでＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０を用いて１／５０の前処置してから、これらをマイクロプレートウェルに添加した。試料中の抗体１．２ＳＭを、固定化されたマウス抗１．２ＳＭ抗体によって捕捉した。結合していない抗体１．２ＳＭを、マイクロプレートウェルを洗浄することによって除去した。洗浄後、第２の西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートマウス抗１．２ＳＭ抗体をマイクロプレートウェルに加えて、捕捉した抗体１．２ＳＭと結合させた。結合していないＨＲＰコンジュゲート抗体を洗浄によって除去した。２成分３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液をウェルに加えた。ＴＭＢ基質溶液は、過酸化物と反応し、ＨＲＰの存在下、最初のステップでの捕捉試薬によって結合された抗体１．２ＳＭの量に比例した比色シグナルを生成した。色の生成を停止してから色の強度（光学密度、ＯＤ）を６５０ｎｍに対して４５０ｎｍで測定した。データを、重み付け因子が１／Ｙであるロジスティック（自動推定）（４パラメータロジスティック；４−ＰＬ）回帰モデルを用いるＷａｔｓｏｎバージョン７．０．０．０１圧縮パッケージで圧縮した。

【0498】

抗体１．２ＳＭでのサルの処置により、血清ＣＳＦ−１レベルが有意に上昇し、この上昇が、抗体血清濃度に相関していた。したがって、ＣＳＦ−１血清レベルは、抗体の投与および血清中でのその蓄積の後に上昇し、投与が完了して血清抗体レベルが低下した後に低下することが分かった。これらの観察は、ｃ−ｆｍｓ／ＣＳＦ−１軸に作用する抗体に一致している。

【0499】

抗体１．２ＳＭでの処置に対するＴｒａｐ５ｂレベルの応答
Ｔｒａｐ５ｂレベルは、抗ｃ−ｆｍｓ抗体のマーカーとなる。Ｔｒａｐ５ｂは、破骨細胞によって特異的に発現され、破骨細胞数の指標である。破骨細胞は、造血細胞の骨髄細胞系統に由来し、ｃ−ｆｍｓを発現しＣＳＦ−１を利用する。これは、ＣＳＦ−１の減少により、ＣＳＦ−１ノックアウト（ｏｐ／ｏｐ）マウス（Ｄａｉ ＸＭら、Ｂｌｏｏｄ、（２００２年）、９９巻、１１１〜１２０頁）における破骨細胞およびＴｒａｐ５ｂのレベルが低下するという観察に一致する。

【0500】

ＢｏｎｅＴＲＡＰ（登録商標）アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｈｉｌｌｓ、ＡＺ）を用いて、被検体におけるＴＲＡＰ５ｂを定量した。抗体１．２ＳＭ血清濃度を、上記したように決定した。血清中のＴＲＡＰ５ｂおよび抗体１．２ＳＭのレベルを、−７日目、８日目、２９日目、５７日目、８５日目、および９９日目に収集した血清標本について決定した。

【0501】

投薬段階の２９日目に、１．２ＳＭ抗体で処置したすべての被検体は、Ｔｒａｐ５ｂが減少していた。抗体１．２ＳＭで処置した後、血清中のＴｒａｐ５ｂ濃度は、血清中の抗体濃度が低下するにつれて上昇した。抗体１．２ＳＭでの処置は、血清中のＴｒａｐ５ｂの濃度の低下に相関していた。

【0502】

抗体１．２ＳＭでの処置に対するマクロファージの応答
カニクイザルにおける抗体１．２ＳＭの活性の別の指標として、結腸組織に存在するマクロファージの数を、ＣＤ−６８染色組織のレーザースキャニングサイトメトリー（ＬＳＣ）によって定量した。結腸試料を、２９日目の剖検で３匹の動物／性別／群から収集し、１００日目の剖検で２匹の動物／性別／群から収集した。各組織の試料を、ＯＣＴ（最適切断温度）培地（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で収集し、ドライアイス／ブタン槽中で冷凍した。マクロファージを、抗ＣＤ６８またはアイソタイプ抗体を用いる従来の免疫組織化学を用いて染色した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）陽性事象を、レーザースキャニングサイトメトリー（ＬＳＣ）を用いて計数した。レーザー光の吸収をステージの上方のフォトダイオード検出器によって定量する２スキャン法を用いた。初めの低解像度パスは、スライド上の切片の位置を特定し、続く高解像度パスは、視野画像を取得した。ＤＡＢ染色の定量分析を、ＬＳＣ関連ｉＣｙｔｅソフトウエアを用いて行った。

【0503】

表２５は、処置直後（２９日目）および続く抗体１．２ＳＭをもはや投与しない回復期（９９日目）における結腸マクロファージの数の変化を要約している。この表から分かるように、抗体１．２ＳＭを投与すると結腸マクロファージの数が減少し、処置を中止するとマクロファージの数が増加しており、従ってこれは抗体の活性を実証している。

【0504】

【表25】

【0505】

（実施例１９）
ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質を用いた患者における腫瘍の処置
ヒト患者を、悪性腫瘍について診断する。患者を、本明細書に記載される、有効量のｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質で治療する。ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与の後、腫瘍の大きさおよび／または代謝活性を（例えば、ＭＲＩまたはＰＥＴスキャンによって）測定する。腫瘍の成長、生存力、および転移の大きさおよび／または代謝活性または他の指標の有意な低下が、ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与に応じて見られる。

【0506】

（実施例２０）
ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質を用いた悪性腫瘍の患者におけるＴＡＭの減少
ヒト患者を、悪性腫瘍について診断する。患者を、本明細書に記載される、有効量のｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質で治療する。ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与の後、ＴＡＭｓの数を測定する。ＴＡＭの数の有意な低下が、ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与に応じて見られる。

【0507】

（実施例２１）
ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質を用いた悪液質の治療
ヒト患者を、癌について診断する。患者を、本明細書に記載される、有効量のｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質で治療する。ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与の後、悪液質のレベルを評価する。悪液質のレベルの有意な低下が、ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与に応じて見られる。

【0508】

（実施例２２）
ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質を用いた血管形成の減少
ヒト患者を、悪性腫瘍について診断する。患者を、本明細書に記載される、有効量のｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質で治療する。ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与の後、腫瘍の生検を行い、血管形成のレベルを評価する。腫瘍血管形成のレベルおよび／または機能の有意な低下が、ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与に応じて見られる。

【0509】

（実施例２３）
ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質を用いた炎症性関節炎の治療
ヒト患者を、炎症性関節炎について診断する。患者を、本明細書に記載される、有効量のｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質で治療する。ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与の後、炎症のレベルおよび／または骨密度のレベルを評価した。炎症のレベルおよび／または骨の骨溶解のレベルの有意な減少が、ｃ−ｆｍｓ結合性タンパク質の投与に応じて見られる。

【0510】

記載したすべての特許文献および他の刊行物は、例えば、本記載に関連して用いることができるこのような刊行物に記載されている方法論などの記載および開示のために、参照により本明細書に明らかに組み込まれる。これらの刊行物は、もっぱら本出願の出願日前のこれらの開示のために提供されたものである。これに関して、発明者が、前の発明によってまたは他のあらゆる理由によってこのような開示をそれ以前の日付に設定する権利がないことを認めるとして解釈されるべきではない。これらの文献の内容についての表現または日付についてのすべての文書は、出願者が入手できる情報に基づいたものであり、これらの文献の日付または内容の正確さについて一切保障するものではない。

【図1A-1】

【図1A-2】

【図1B-1】

【図1B-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]