特許 6189941 キシロースを代謝でき、阻害因子に耐性がある酵母菌株、その酵母菌株を得るための方法およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6189941

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】キシロースを代謝でき、阻害因子に耐性がある酵母菌株、その酵母菌株を得るための方法およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/16 20060101AFI20170821BHJP

   C12P 7/06 20060101ALI20170821BHJP

   C12P 7/10 20060101ALI20170821BHJP

   A23L 31/10 20160101ALI20170821BHJP

   C12N 1/36 20060101ALN20170821BHJP

   C12R 1/865 20060101ALN20170821BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/16 G

   C12P7/06

   C12P7/10

   A23L31/10

   !C12N1/36

   C12N1/16 G

   C12R1:865

【請求項の数】16

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2015-514555(P2015-514555)

(86)(22)【出願日】2013年5月24日

(65)【公表番号】特表2015-521043(P2015-521043A)

(43)【公表日】2015年7月27日

(86)【国際出願番号】FR2013051137

(87)【国際公開番号】WO2013178915

(87)【国際公開日】20131205

【審査請求日】2016年3月10日

(31)【優先権主張番号】1255076

(32)【優先日】2012年6月1日

(33)【優先権主張国】FR

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-4624

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-4625

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-4626

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-4627

【微生物の受託番号】CNCM  CNCM I-4538

(73)【特許権者】

【識別番号】506261567

【氏名又は名称】ルサッフル・エ・コンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳＡＦＦＲＥ ＥＴ ＣＯＭＰＡＧＮＩＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(72)【発明者】

【氏名】デスフォウゲレ トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ピグネード ジョルジュ

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０６５５３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０６３３４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１２８５５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Bioresource Technology，２０１１年 ６月，Vol. 102，pp. 7917-7924

【文献】 Microbial Cell Factories，２０１１年 １月，10:2，pp. 1/13-13/13

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／１６−１／１９

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ ７／００−７／６６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株。

【請求項2】

キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得る方法であって、
少なくとも１つのハイブリッドを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに２０１１年１０月５日に寄託された酵母菌株を、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株と交配する工程と、
キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、方法。

【請求項3】

前記交配する工程は、
少なくとも１つの分離個体Ｘを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに２０１１年１０月５日に寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程と、
少なくとも１つの分離個体Ｙを得るために、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程と、
少なくとも１つのハイブリッドを得るために、少なくとも１つの分離個体Ｘを少なくとも１つの分離個体Ｙとハイブリダイズする工程であって、前記分離個体Ｘはキシロースをエタノールに変換し、および／または前記分離個体Ｙは酢酸に対して耐性を有する、工程と、
を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記分離個体Ｘは、６０時間でキシロースの少なくとも６０％をエタノールに変換し、および／または前記分離個体Ｙは３０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程が、
１ｋｇの発酵培地当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む前記発酵培地中で６０時間、嫌気性条件下で、少なくとも１つのハイブリッドによってエタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程と、
ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中で少なくとも１つのハイブリッドのアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程と、
６０時間でキシロースの少なくとも７０％をエタノールに変換し、アルコール発酵の開始の遅延時間が３０時間未満である、少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

指向性進化させる工程をさらに含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

番号Ｉ−４６２４としてＣＮＣＭに２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株、番号Ｉ−４６２５としてＣＮＣＭに２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株および番号Ｉ−４６２６としてＣＮＣＭに２０１２年５月２４日に寄託された酵母菌株からなる群から選択される、酵母菌株。

【請求項8】

請求項７に記載の酵母菌株を培養することによって得られる酵母。

【請求項9】

発酵培地中で、請求項８に記載の酵母によって嫌気性条件下で発酵する工程を含む、少なくとも１つの発酵産物を産生する方法。

【請求項10】

前記発酵培地はキシロースおよび／または少なくとも１つの発酵阻害因子を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記発酵培地は植物物質の全てまたは一部の少なくとも１つの加水分解物を含む、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

発酵産物を産生するための請求項８に記載の酵母の使用。

【請求項13】

発酵産物の産生は、キシロースおよび／または１つの発酵阻害因子を含む発酵培地の使用を含む、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

請求項８に記載の酵母を含む培養物。

【請求項15】

前記培養物は、乾燥酵母の形態である請求項１４に記載の培養物。

【請求項16】

請求項８に記載の酵母を含むイーストケーキ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キシロースを代謝でき、また、少なくとも１つの発酵阻害因子に耐性を示す酵母菌株、その酵母菌株を得るための方法、前記酵母菌株から得られる酵母および任意に少なくとも１つの発酵阻害因子の存在下でキシロースを含む培地中で発酵産物を産生するためのその使用の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１は、ＸＩ−ＸＤＨ代謝経路の発現により、少なくとも１つのペントースを含有する培地中でアルコールを産生するための酵母を記載している。特許文献１は、初めて、過剰発現のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）活性と、過剰発現のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）活性の組み合わせを記載しており、過剰発現のキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が、キシロースイソメラーゼ活性のキシリトールによる阻害を防ぐことができることを示している。特許文献１は、例えば、２０１１年１０月５日に番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株を記載している。

【0003】

リグノセルロース加水分解物からの酵母によるアルコールの工業生産は、ペントースを代謝するための遺伝機構だけでなく、これらのリグノセルロース加水分解物に存在する発酵阻害因子に対する耐性の特性も必要とする。

【0004】

発酵阻害因子はリグノセルロースバイオマスの処理及び加水分解の間に産生される。発酵阻害因子には、フルアルデヒド（フルフラール、ＨＭＦ）、フェノール化合物および有機酸（酢酸、レブリン酸、ギ酸）がある。

【0005】

発酵阻害因子の作用に対処するための種々の手段が記載されており、それらには、発酵培地の解毒、発酵プロセスの改良、または発酵阻害因子に対する酵母の耐性の改良がある。発酵阻害因子に対する酵母の耐性は、例えば、指向性進化によって、または順化によって遺伝学的に改良されている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０７１６１６

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ａｌｍｅｉｄａ ａｎｄ Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｇａｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９，Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．１３２３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、少なくとも１つのペントースを含む発酵培地中でのアルコール産生、および少なくとも１つの発酵阻害因子に対する耐性の両方に効果的な酵母を与える工業的な酵母菌株を提供することは困難であるように見える。

【0009】

従って、酢酸などの少なくとも１つの発酵阻害因子の存在下でさえも、少なくとも１つのペントース、例えば、キシロースを代謝できる新規の酵母菌株であって、前記酵母菌株は、少なくとも１つの発酵阻害因子の存在下でさえも、アルコールを産生するのに効果的である酵母を与える、酵母菌株を提供するための実際の必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の第１の目的は、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株に関する。

【0011】

本発明の第２の目的は、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るための方法であって、少なくとも１つのハイブリッドを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株を、番号Ｉ−４６７２としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株と交配する工程と、
キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、方法に関する。

【0012】

本発明の第３の目的は、上記の方法によって得られ得る、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株に関する。

【0013】

本発明の第４の目的は、上記の酵母菌株から誘導された酵母菌株であって、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある、前記誘導された酵母菌株に関する。

【0014】

本発明の第５の目的は、上記の酵母菌株を培養することによって、または上記の誘導された酵母菌株を培養することによって得られる酵母に関する。

【0015】

本発明の第６の目的は、上記の酵母を使用して、嫌気性条件下で発酵させる工程を含む、少なくとも１つの発酵産物を産生するための方法に関する。

【0016】

本発明の第７の目的は、好ましくは、キシロースおよび／または１つの発酵阻害因子を含む発酵培地中で少なくとも１つの発酵産物を産生するための上記の酵母の使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｉ−４５３８酵母菌株（ダイヤモンド）、Ｈ１酵母菌株（正方形）、ＥＤ１酵母菌株（三角形）、ＥＤ２酵母菌株（丸）およびＥＤ３酵母菌株（クロス）による、３２℃でのＹＦＧＸ−Ａｃ発酵培地中の経時的（時間）エタノール産生（ｇ／発酵培地（ｋｇ））。

【図2】Ｉ−４５３８酵母菌株（ダイヤモンド）、ＥＤ１酵母菌株（三角形）、およびＥＤ２酵母菌株（丸）による、３２℃での培地Ａ中の経時的（時間）エタノール産生（ｇ／発酵培地（ｋｇ））。

【図3】Ｉ−４５３８酵母菌株（ダイヤモンド）、ＥＤ１酵母菌株（三角形）、ＥＤ２酵母菌株（丸）およびＥＤ３酵母菌株（クロス）による、３５℃での培地Ａ中の経時的（時間）エタノール産生（ｇ／発酵培地（ｋｇ））。

【図4】Ｉ−４５３８酵母菌株（ダイヤモンド）、ＥＤ１酵母菌株（三角形）、ＥＤ２酵母菌株（丸）およびＥＤ３酵母菌株（クロス）による、３５℃での培地Ｂ中の経時的（時間）エタノール産生（ｇ／ｋｇ発酵培地（ｋｇ））。

【発明を実施するための形態】

【0018】

「酵母菌株」という表現は、酵母細胞の比較的均質の集団を示す。酵母菌株は、単一酵母細胞から得られる細胞集団である、クローンの単離から得られる。

【0019】

「外来」遺伝子という用語は、検討中の種の酵母菌株中の天然に存在しない遺伝子を意味する。

【0020】

「内在性」遺伝子という用語は、検討中の種の酵母菌株中の天然に存在する遺伝子を意味する。

【0021】

キシロースイソメラーゼまたはＸＩは、本明細書において、単一工程において、Ｄ−キシロースをＤ−キシルロースに変換でき、クラスＥＣ５．３．１．５に対応する酵素を示す。

【0022】

キシリトールデヒドロゲナーゼまたはＸＤＨは、本明細書において、単一工程において、キシリトールをＤ−キシルロースに変換でき、クラスＥＣ１．１．１．９に対応する酵素を示す。

【0023】

キシロースレダクターゼまたはＸＲは、本明細書において、単一工程において、Ｄ−キシロースをキシリトールに変換でき、クラスＥＣ１．１．１．３０７に対応する酵素を示す。

【0024】

Ｄ−キシルロキナーゼまたはＸＫＳは、本明細書において、単一工程において、Ｄ−キシルロースをＤ−キシルロース−５−ホスフェートに変換でき、クラスＥＣ２．７．１．１７に対応する酵素を示す。

【0025】

ＧＲＥ３遺伝子は、クラスＥＣ１．１．１．２１に対応するアルドースレダクターゼ酵素をコードする。

【0026】

ＲＰＥ１遺伝子は、クラスＥＣ５．１．３．１に対応するＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ酵素をコードする。

【0027】

ＲＫＩ１遺伝子は、クラスＥＣ５．３．１．６に対応するリボース−５−ホスフェートケトール−イソメラーゼ酵素をコードする。

【0028】

ＴＫＬ１遺伝子は、クラスＥＣ２．２．１．１に対応するトランスケトラーゼ酵素をコードする。

【0029】

ＴＡＬ１遺伝子は、クラスＥＣ２．２．１．２に対応するトランスアルドラーゼ酵素をコードする。

【0030】

原栄養酵母菌株は最小培地で成長できる酵母菌株である。特に、本発明に係る原栄養酵母菌株は、その成長に必要な全てのアミノ酸および塩基を合成できる。

【0031】

最小培地は、炭素源（Ｃ_ｘＨ_ｙＯ_ｚ）、無機窒素源、カリウム源、リン源、糖源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水を含む培地である。

【0032】

最小培地の例は、炭素源（例えば糖）および無機窒素源（例えば硫酸アンモニウム）が加えられるＹＮＢ（酵母窒素ベース）培地である。

【0033】

ＹＮＢ培地は、１リットル当たり：２μｇのビオチン、４００μｇのパントテン酸カルシウム、２μｇの葉酸、２０００μｇのイノシトール、４００μｇのナイアシン、２００μｇのｐ−アミノ安息香酸、４００μｇの塩酸ピリドキシン、２００μｇのリボフラビン、４００μｇの塩酸チアミン、５００μｇのホウ酸、４０μｇの硫酸銅、１００μｇのヨウ化カリウム、２００μｇの塩化第二鉄、４００μｇの硫酸マンガン、２００μｇのモリブデン酸ナトリウム、４００μｇの硫酸亜鉛、１ｇのリン酸二水素カリウム、５００ｍｇの硫酸マグネシウム、１００ｍｇの塩化ナトリウム、１００ｍｇの塩化カルシウム、５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、最終ｐＨ５．４を含む。

【0034】

「誘導された酵母菌株」という表現は、１回以上の交配によっておよび／または変異によっておよび／または形質転換によって誘導された酵母菌株を示す。

【0035】

交配によって誘導された酵母菌株は、本発明に係る酵母菌株を、同じ酵母菌株、本発明に係る別の酵母菌株または任意の他の酵母菌株と交配することによって得られ得る。

【0036】

変異によって誘導された酵母菌株は、そのゲノムにおいて少なくとも１つの自然突然変異または突然変異誘発によって誘導される少なくとも１つの変異を受けている酵母菌株であってもよい。誘導された菌株の変異はサイレントであってもよく、なくてもよい。

【0037】

「突然変異誘発」という表現は、放射線（例えばＵＶ照射）を照射することによって、または変異原化学物質を使用すること、および挿入によって得られるランダム変異導入、あるいは外来性ＤＮＡ断片の転位または組み込みによる部位特異的突然変異誘発の両方を示す。遺伝子形質転換によって誘導される酵母菌株は、好ましくはプラスミドによって提供されるＤＮＡ配列が組み込まれるか、またはゲノム内に直接組み込まれる酵母菌株である。

【0038】

本発明の目的は、酢酸などの少なくとも１つの発酵阻害因子の存在下でさえも、少なくとも１つのペントース、特にキシロースを代謝できる酵母菌株を提供することである。

【0039】

本発明の目的に関して、キシロースを代謝できる酵母菌株は、嫌気性条件下でキシロースを含む培地中でエタノールを産生できる酵母菌株である。

【0040】

特に、キシロースを代謝できる酵母菌株は、キシロースをエタノールに変換できる、すなわちキシロースを発酵できる酵母菌株である。

【0041】

キシロースのエタノールへの変換はキシロースからキシルロースへの直接または間接の異性化により起こり、続いて、ペントースリン酸経路の非酸化部分において、得られたキシルロースが使用される。

【0042】

本発明の目的に関して、キシロースを代謝できる酵母菌株は、嫌気性条件下で５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロース／発酵培地（ｋｇ）を含む発酵培地中で、６０時間でキシロースの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％をエタノールに変換する酵母菌株である。

【0043】

エタノールに変換されるキシロースの割合を測定するために使用される酵母菌株の接種は、好ましくは０．２５ｇの乾燥物質／発酵培地（ｋｇ）である。

【0044】

６０時間は発酵培地への酵母菌株の接種から開始して計算される。

【0045】

エタノールに変換されたキシロースの割合を測定するために使用される発酵培地は、好ましくは、合成培地である。

【0046】

合成培地は、正確な化学組成が知られている培地である。

【0047】

本発明に係る合成培地は、炭素源、窒素源、リン源ならびにまた酵母菌株の成長に必須のビタミンおよびミネラルを含む。

【0048】

一つの好ましい実施形態において、エタノールに変換されたキシロースの割合を測定するために使用される発酵培地は、５５ｇ／ｋｇのグルコース、４５ｇ／ｋｇのキシロース、１０ｇ／ｋｇの酵母エキス、１０ｇ／ｋｇのペトン（ｐｅｔｏｎｅ）および２０００ｐｐｍの酢酸を含むＹＦＧＸ合成培地であり、ｐＨはＫＯＨで５に調整している。

【0049】

ＹＦＧＸ培地中で、酢酸は２０００ｐｐｍの濃度で存在し、ｐＨ５は阻害効果を有さない。

【0050】

発酵は、好ましくは３２℃で、適度に撹拌しながら（例えば９０ｒｐｍ）実施される。撹拌は酸素が入らないように穏やかである。

【0051】

培地のｐＨは、好ましくは、例えば、ＹＦＧＸ培地中の酸／塩基対の緩衝能力、例えば酢酸／酢酸塩緩衝能力によって制御される。発酵培地に存在するエタノールの量は当業者に公知の任意の適切な手段によって測定される。

【0052】

それは、産生されたエタノールの直接測定または質量損失などのエタノール産生と相関するパラメータによる間接測定を含んでもよい。例えば、アルコール産生は、クロマトグラフィーによって、特にＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、酵素キット（例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製のエタノールアッセイキット）または重クロム酸カリウムを使用したアッセイによって測定されてもよい。発酵培地に存在するキシロースの量は、当業者に公知の任意の適切な手段によって、好ましくはクロマトグラフィー、特にＨＰＬＣによって測定される。グルコースおよびキシロースの両方を含む発酵培地の使用により、評価される様々な酵母菌株に同等である量のバイオマスを使用してキシロースからエタノールへの変換を評価することが可能となる。実際に、酵母菌株は最初にグルコースとキシロース混合物のグルコースを発酵し、次いでグルコースおよびキシロースを発酵する。

【0053】

少なくとも１つの発酵阻害因子の存在下でキシロースを代謝する能力は、前記発酵阻害因子に対する耐性として記載される。

【0054】

本発明の文脈において、発酵阻害因子は、好ましくは、酢酸である。それは、毒性濃度（その毒性およびしたがってその阻害効果の原因となる）と呼ばれる特定の濃度から開始する、酢酸の非電離形態である。例えば、ｐＨ４．４における４０００ｐｐｍの酢酸の濃度は、Ｉ−４５３８酵母菌株などの酢酸に耐性がない菌株に対する毒性濃度である。

【0055】

嫌気性条件下での発酵の間、酢酸の阻害効果は、特に、糖のバイオマスおよびエタノールへの変換の開始の遅延を生じる。酢酸に対する耐性は、本明細書において、糖のエタノールへの変換の開始の遅延時間、すなわちアルコール発酵の開始の遅延時間に関して測定される。時間の関数として産生されたアルコールの量を表すアルコール発酵曲線は一般に３つの段階を含む：
潜伏期、その間、エタノール産生はない、
アルコール産生期、および
定常期、発酵の終了に対応する。

【0056】

アルコール発酵の開始の遅延時間は、本明細書において、アルコール産生率の最大導関数を表す線の起点におけるｘ軸に対応する。より簡単に言えば、アルコール発酵の開始の遅延時間は、本明細書において、アルコール産生段階の傾きに対応する線の起点におけるｘ軸に対応する。

【0057】

酢酸に耐性がある酵母菌株は、本明細書において、ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中で、３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する酵母菌株と定義される。

【0058】

酢酸に対する耐性を評価するために使用される発酵培地は、好ましくは、合成培地、より好ましくは、ＹＦＡｃ培地である。

【0059】

ＹＦＡｃ培地の組成は以下の通りである：１５０ｇ／ｋｇのグルコース、５ｇ／ｋｇの酵母エキス、４．７ｇ／ｋｇのＤＡＰ（リン酸二アンモニウム）、１１．５ｇ／ｋｇのクエン酸、４ｇ／ｋｇの酢酸、１３．５ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、１ｍｌ／ｋｇのＴｗｅｅｎ ８０、２ｍｌ／ｋｇのＺｎＳＯ_４（１０．６ｇ／ｌにて）、２．５ｍｌ／ｋｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（４００ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのチアミン（１８．２４ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのピリドキシン（５．２８ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのビオチン（１．７６ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのパントテン酸塩（３．８ｇ／ｌにて）、２．５ｍｌ／ｋｇのニコチン酸（８ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのメソイノシトール（５０ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのリボフラビン（１ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのパラ−アミノベンゾエート（１．２ｇ／ｌにて）、ｐＨはＫＯＨで４．４に調整した。

【0060】

酢酸に対する耐性を評価するために使用される酵母菌株の接種は、好ましくは、０．２５ｇの乾燥物質／発酵培地（ｋｇ）である。

【0061】

アルコール発酵曲線の時間ｔ＝０は、酵母菌株が発酵培地内に接種される時間に対応する。アルコール発酵は、好ましくは３２℃にて嫌気性条件下で、適度に撹拌しながら（例えば９０ｒｐｍ）実施される。撹拌は酸素が入らないように穏やかである。

【0062】

培地のｐＨは、好ましくは、例えば、ＹＦＡｃ培地中で、酸／塩基対の緩衝能力、例えば酢酸／酢酸塩緩衝能力によって制御される。

【0063】

ＹＦＡｃ発酵培地中で、酢酸に耐性がない酵母菌株は、少なくとも４０時間のアルコール発酵の開始の遅延時間を有し得る。

【0064】

本発明者らは、酢酸の存在下でさえ、キシロースのエタノールへの変換に関して効果的である酵母菌株から開始して、キシロースを代謝できる酵母菌株を得ることを目的としている。

【0065】

酢酸に対する耐性の特徴を与える点で改良される開始菌株として選択される、キシロースのエタノールへの変換に関して効果的であるこの酵母菌株は、２０１１年、１０月５日にブダペスト条約の下で、ＣＮＣＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），２５，ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，フランスに寄託されたＩ−４５３８酵母菌株である。

【0066】

Ｉ−４５３８酵母菌株は、５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロース／培地（ｋｇ）を含むＹＦＧＸ発酵培地中で６０時間で、キシロースの少なくとも９０％をエタノールに変換する。しかしながら、Ｉ−４５３８酵母菌株は特に酢酸に感受性があり、それは、ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含むＹＦＡｃ発酵培地中で、少なくとも４０時間のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。

【0067】

Ｉ−４５３８酵母菌株は、以下：
− ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、クロストリジウム・フィトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、
− ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、
− ｐＰＧＫ１プロモーターの制御下に置かれたＴＡＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
− ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＴＫＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
− ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＰＥ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
− ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＫＩ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
− ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下でキシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）をコードする内在性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、ならびに
− アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３内在性遺伝子のオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコピーの欠失
によって遺伝的に改変された酵母菌株から指向性進化によって得られるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。

【0068】

Ｉ−４５３８酵母菌株は任意の残存する選択可能マーカーを欠いている。Ｉ−４５３８酵母菌株は、外来性起源のＸＲをコードする遺伝子も、ａｒａＡ、ａｒａＢまたはＡｒａＤ遺伝子も含まない。クロストリジウム・フィトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする外来性遺伝子は、ＤＥ１０２００８０３１３５０に記載されている最適化された配列の配列番号３の遺伝子である。ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする外来性遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋにおける参照配列Ｘ５５３９２．１の遺伝子である。ｐＡＤＨ１、ｐＰＧＫ１およびｐＴＤＨ３プロモーターはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロモーターである。ＣＹＣ１ターミネーターはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロモーターである。Ｉ−４５３８酵母菌株は異数性である工業的酵母菌株である。Ｉ−４５３８酵母菌株は原栄養である。

【0069】

キシロースを代謝するその能力を実質的に変化させずにＩ−４５３８酵母菌株に酸性に対する耐性を与えるために、本発明者らは菌株交配技術を使用することを選択した。

【0070】

本発明者らの知る限りでは、交配技術が遺伝的に改変された異数性酵母菌株を改良するために使用されるのはこれが初めてである。実際に、当業者は、一見したところでは、酵母菌株で開始する場合、交配技術を使用することを想起せず、その酵母菌株は以下のものである：
− プリオリ（ｐｒｉｏｒｉ）が選択された分離個体に形質転換されなければならない、少なくとも８の遺伝子改変を含み、
− 異数体酵母菌株であり、完全な２倍性の非存在下で分離の問題が存在し、
− 指向性進化に関して突然変異誘発のステップを受けており、これにより特に、発芽の問題の原因となる染色体転座の場合、交配に関する困難性の原因となる。

【0071】

したがって、交配は、Ｉ−４５３８酵母菌株と、酸性に耐性があり、遺伝的に改変されていない、すなわちキシロース発酵に必要とされる遺伝機構を有さない酵母菌株との間で実施される。

【0072】

交配のために使用される酢酸に耐性がある酵母菌株はＹＦＡｃ発酵培地中で１４時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。

【0073】

交配の結果は確実ではなかった：酢酸に対する耐性の特徴は実際にハイブリッドに移されるが、後者はキシロースをエタノールに変換するための開始Ｉ−４５３８酵母菌株よりほとんど効果がなかった。よくても、得られたハイブリッドは、１ｋｇの培地当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含むＹＦＧＸ発酵培地中で、６０時間でキシロースの４０％をエタノールに変換した。本発明者らは、指向性進化によってこれらのハイブリッドのキシロース発酵を改良することを試みたが、さらに失敗に終わった。

【0074】

本発明者らは、したがって、キシロースを効果的に代謝する能力を損失させずに、交配することによって酢酸に対する耐性の特性を移すために、Ｉ−４５３８酵母菌株を、類似の遺伝的背景を有する、すなわちまた、キシロースを代謝することに関して必ずしも効果的ではないが、キシロースを代謝するための遺伝機構を有する、酢酸に耐性がある酵母菌株と交配することが必要であることを実証した。

【0075】

酢酸に耐性があり、また、キシロースを代謝するために遺伝機構を有する、使用される酵母菌株は、２０１２年５月２４日にブダペスト条約の下で番号Ｉ−４６２７として、ＣＮＣＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），２５，ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，フランスに寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株である。このように、Ｉ−４５３８酵母菌株をＩ−４６２７酵母菌株と交配することによって、本発明者らは、キシロースを代謝するのに効果的であり、酢酸に耐性がある酵母菌株を得た。

【0076】

本発明の別の目的は、したがって、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株である。

【0077】

Ｉ−４６２７菌株は、本発明に係る酵母菌株を得るための２つの開始菌株の１つである。

【0078】

Ｉ−４６２７酵母菌株は、酢酸に耐性があり、遺伝的に改変されていない異数性酵母菌株を、遺伝的に改変された異数性酵母菌株と交配するオリジナルの方法によって得られる新規酵母菌株である。

【0079】

Ｉ−４６２７酵母菌株は、したがって、以下のように得られる：
− 酢酸に耐性がある、すなわちＹＦＡｃ発酵培地中で１４時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する酵母菌株の選択、
− 以下：
○ ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、クロストリジウム・フィトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、
○ ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、
○ ｐＰＧＫ１プロモーターの制御下に置かれたＴＡＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
○ ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＴＫＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
○ ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＰＥ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
○ ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＫＩ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、
○ ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下でキシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）をコードする内在性遺伝子の少なくとも１つのコピーの挿入、ならびに
○ アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３内在性遺伝子のオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコピーの欠失
によって遺伝的に改変された酵母菌株の選択、
− ハイブリッドを得るために、酢酸に耐性がある前記酵母菌株と、前記遺伝的に改変された酵母菌株との交配、
− Ｉ−４６２７酵母菌株を得るための前記ハイブリッドの指向性進化。

【0080】

Ｉ−４６２７酵母菌株は、ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、クロストリジウム・フィトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下で、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする外来性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＰＧＫ１プロモーターの制御下に置かれたＴＡＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＴＫＬ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＰＥ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＴＤＨ３プロモーターの制御下に置かれたＲＫＩ１内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、ｐＡＤＨ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターの制御下でキシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）をコードする内在性遺伝子の少なくとも１つのコピー、欠失しているアルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３内在性遺伝子のオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコピーを含む。

【0081】

Ｉ−４５３８酵母菌株に関して、クロストリジウム・フィトファーメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）のキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする外来性遺伝子は、ＤＥ１０２００８０３１３５０に記載されている最適化された配列である配列番号３の遺伝子であり、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする外来性遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋにおける参照配列Ｘ５５３９２．１の遺伝子である。

【0082】

Ｉ−４６２７酵母菌株は任意の残存する選択可能マーカーを欠いている。Ｉ−４６２７酵母菌株は、外来性起源のＸＲをコードする遺伝子も、ａｒａＡ、ａｒａＢまたはＡｒａＤ遺伝子も含まない。Ｉ−４６２７酵母菌株は工業的酵母菌株であり、異数体ではない。Ｉ−４６２７酵母菌株は原栄養である。

【0083】

Ｉ−４６２７酵母菌株の酢酸に対する耐性は交配するために使用される開始の酢酸耐性酵母菌株のものより低いが、その酢酸に対する耐性は工業用途に広く許容可能である。このように、Ｉ−４６２７酵母菌株は、ＹＦＡｃ発酵培地中で２０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。キシロースに対する有効性に関して、Ｉ−４６２７酵母菌株は、１ｋｇの培地当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含むＹＦＧＸ発酵培地中で６０時間、嫌気性条件下で、キシロースの約６０％をエタノールに変換する。このように、Ｉ−４６２７酵母菌株は、酢酸に対する耐性を有し、キシロースを代謝するための遺伝機構を有するが、本発明の目的に関してキシロースを代謝できない、すなわちエタノール産生の点で、工業的使用に不適合であるオリジナルの酵母菌株である。

【0084】

したがって、本発明者らは、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るために、Ｉ−４５３８酵母菌株をＩ−４６２７菌株と交配した。したがって、本発明の目的は、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るための方法であって、以下の工程：
− 少なくとも１つのハイブリッドを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株を、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株と交配する工程と、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るために、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、方法である。

【0085】

上記のように、本発明に係る、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株は以下の特性を有する：
− それは、嫌気性条件下で発酵培地１ｋｇ当たり、５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含むＹＦＧＸ発酵培地中で６０時間で、キシロースの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％をエタノールに変換し、
− それは、ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含むＹＦＡｃ発酵培地中で、３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。

【0086】

交配する工程は、Ａ．Ｈ．ＲｏｓｅおよびＪ．Ｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９６９−Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓによって編集された、参考文献「Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ」，第１巻のＲ．Ｒ．Ｆｏｗｅｌｌによる、第７章「Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ」に教示されているものなどの従来の技術に従って実施される。

【0087】

本発明に係る酵母菌株を得るための方法の効率を改良するために、Ｉ−４５３８酵母菌株から誘導された分離個体および／またはＩ−４６２７酵母菌株から誘導された分離個体で選択を実施することが特に有益である。交配するために使用されるＩ−４５３８酵母菌株の分離個体は、好ましくは、キシロースを代謝するそれらの能力に基づいて選択される。交配するために使用されるＩ−４６２７酵母菌株の分離個体は、それらの酢酸に対する耐性に基づいて選択される。

【0088】

したがって、本発明の目的は上記のような方法であり、前記交配する工程は以下を含む：
− 少なくとも１つの分離個体Ｘを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程、
− 少なくとも１つの分離個体Ｘによるキシロースからエタノールへの変換を評価する任意の工程、
− 少なくとも１つの分離個体Ｙを得るために、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程、
− 少なくとも１つの分離個体Ｙの酢酸に対する耐性を評価する任意の工程、
− 少なくとも１つのハイブリッドを得るために、少なくとも１つの分離個体Ｘを少なくとも１つの分離個体Ｙとハイブリダイズする工程であって、前記分離個体Ｘはキシロースからエタノールに変換でき、および／または前記分離個体Ｙは酢酸に対する耐性を有する、工程。

【0089】

胞子を形成させる工程、キシロースからエタノールの変換を評価する工程および酢酸に対する耐性を評価する工程は、所与の酵母菌株の胞子形成が、その分離個体を評価する前に実施される限り、任意の所望の順序で実施され得る。

【0090】

例えば、本発明の目的は、上記の方法であって、前記交配する工程が、
− 少なくとも１つの分離個体Ｘを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程、
− 発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む前記発酵培地中で６０時間、嫌気性条件下で、少なくとも１つの分離個体Ｘによりエタノールに変換されたキシロースの割合を測定する任意の工程
− 少なくとも１つの分離個体Ｙを得るために、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程、
− ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中の少なくとも１つの分離個体Ｙのアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する任意の工程、
− 少なくとも１つのハイブリッドを得るために、少なくとも１つの分離個体Ｘを少なくとも１つの分離個体Ｙとハイブリダイズする工程であって、分離個体Ｘは６０時間で、キシロースの少なくとも６０％をエタノールに変換し、および／または分離個体Ｙは、３０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する、工程
を含む。

【0091】

胞子を形成させる工程、エタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程およびアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程は、この菌株の分離個体に適用される選択パラメータを測定する前に、所与の酵母菌株の胞子形成が実施される限り、任意の所望の順序で実施され得る。

【0092】

Ｉ−４５３８酵母菌株の少なくとも１つの分離個体によってエタノールに変換されたキシロースの割合を測定するために使用される接種は、好ましくは、０．２５ｇの乾燥物質／発酵培地（ｋｇ）である。

【0093】

Ｉ−４５３８酵母菌株の少なくとも１つの分離個体によってエタノールに変換されたキシロースの割合を測定するために使用される発酵培地は、好ましくは、ＹＦＧＸ発酵培地である。

【0094】

Ｉ−４５３８酵母菌株の分離個体は、キシロースを代謝することに関して、開始異数性菌株より天然に効果が低い。したがって、キシロースからエタノールへの変換に関して適用される選択基準は、開始Ｉ−４５３８酵母菌株の能力より低い要求である。

【0095】

このように、一つの有益な実施形態において、Ｉ−４５３８酵母菌株の分離個体は、嫌気性条件下で、発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む前記発酵培地中で６０時間で、キシロースの少なくとも６０％、好ましくはキシロースの少なくとも６５％、さらにより好ましくはキシロースの少なくとも７０％をエタノールに変換する場合に選択される。分離個体を選択する工程の時間を最適化するために、短時間にわたって、例えば４８時間にわたってＩ−４５３８酵母菌株の分離個体によるキシロースからエタノールへの変換を測定してもよい。したがって、別の有益な実施形態において、Ｉ−４５３８酵母菌株の分離個体は、嫌気性条件下で、発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む前記発酵培地中で４８時間で、キシロースの少なくとも６０％、好ましくはキシロースの少なくとも６５％、さらにより好ましくはキシロースの少なくとも７０％をエタノールに変換する場合に選択される。

【0096】

一つの有益な実施形態において、Ｉ−４６２７酵母菌株の分離個体は、ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中で、３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する場合に選択される。しかしながら、驚くべきことに、Ｉ−４６２７酵母菌株のほとんどの分離個体は、開始Ｉ−４６２７酵母菌株より酢酸に対して耐性がある。すなわち、それらのアルコール発酵の開始の遅延時間は開始Ｉ−４６２７酵母菌株のものより短い。酢酸に対する耐性に関して適用される選択基準は、したがって、好ましくは、要求が高い。このように、１つの特定の有益な実施形態において、Ｉ−４６２７酵母菌株の分離個体は、２５時間未満、好ましくは２０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する場合に選択される。

【0097】

Ｉ−４６２７酵母菌株の少なくとも１つの分離個体のアルコール発酵の開始の遅延時間を測定するために使用される発酵培地は、好ましくは、ＹＦＡｃ発酵培地である。Ｉ−４６２７酵母菌株の少なくとも１つの分離個体のアルコール発酵の開始の遅延時間を測定するために使用される接種は、好ましくは、０．２５ｇの乾燥物質／発酵培地（ｋｇ）である。

【0098】

Ｉ−４６２７酵母菌株の分離個体はまた、キシロースをエタノールに変換するそれらの能力で選択されてもよい。しかしながら、驚くべきことに、酢酸に対するそれらの耐性に基づいてのみ選択されるＩ−４６２７菌株の分離個体を使用して最適なハイブリッドが得られる。

【0099】

好ましくは、ハイブリダイズする工程は、
− キシロースの少なくとも６０％、好ましくはキシロースの少なくとも６５％、さらにより好ましくはキシロースの少なくとも７０％を６０時間、好ましくは４８時間でエタノールに変換する少なくとも１つの分離個体Ｘと、
− ３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満、より好ましくは２５時間未満、さらにより好ましくは２０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する少なくとも１つの分離個体Ｙと、
で実施される。

【0100】

このように得られたハイブリッドは、次いで、２つの基準：キシロースを代謝するそれらの能力および酢酸に対するそれらの耐性に基づいて選択される。本発明の目的は、より特には、上記の方法であって、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する前記工程が、
− 発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む発酵培地中で６０時間、嫌気性条件下で少なくとも１つのハイブリッドによりエタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程、
− ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中で少なくとも１つのハイブリッドのアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るために、６０時間でキシロースの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％をエタノールに変換し、アルコール発酵の開始の遅延時間が、３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満である少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程を含む、方法である。

【0101】

エタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程およびアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程の順序は重要ではなく；それらは一方の後で他方が実施されてもよく、一つの方向またはその他で実施されてもよく、あるいは同時に実施されてもよい。キシロースからエタノールへの変換の割合およびアルコール発酵の開始の遅延時間を測定するための条件は上記に定義されている通りである。

【0102】

本発明の目的は、したがって、特に、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るための方法であって、
− 番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株を、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株とを交配する工程であり、前記交配する工程は、
○ 少なくとも１つの分離個体Ｘを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程と、
○ 発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む前記発酵培地中で６０時間、好ましくは４８時間で、少なくとも１つの分離個体Ｘによりエタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程と、
○ キシロースの少なくとも６０％を６０時間、好ましくは４８時間で、エタノールに変換する少なくとも１つの分離個体Ｘを選択する工程と、
○ 少なくとも１つの分離個体Ｙを得るために、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株の胞子を形成させる工程と、
○ ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中で少なくとも１つの分離個体Ｙによるアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程と、
○ ３０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する少なくとも１つの分離個体Ｙを選択する工程と
を含む、交配する工程、
− 少なくとも１つのハイブリッドを得るために、キシロースの少なくとも６０％を６０時間、好ましくは４８時間で、エタノールに変換する少なくとも１つの分離個体を、３０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する少なくとも１つの分離個体Ｙとハイブリダイズする工程、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るために、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程であり、前記選択する工程は、
○ 発酵培地１ｋｇ当たり５５ｇのグルコースおよび４５ｇのキシロースを含む発酵培地中で６０時間、嫌気性条件下で、少なくとも１つのハイブリッドによりエタノールに変換されたキシロースの割合を測定する工程と、
○ ｐＨ４．４にて４０００ｐｐｍの酢酸を含む発酵培地中の前記少なくとも１つのハイブリッドのアルコール発酵の開始の遅延時間を測定する工程と、
○ ６０時間でキシロースの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％をエタノールに変換し、アルコール発酵の開始の遅延時間が３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満である、少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、選択する工程
を含む、方法である。

【0103】

上記に示すように、交配する工程の順序は重要ではなく、同様に、少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程の順序は重要ではない。

【0104】

好ましくは、ハイブリダイズする工程は、
− ６０時間、好ましくは４８時間で、キシロースの少なくとも６０％、好ましくはキシロースの少なくとも６５％、さらにより好ましくはキシロースの少なくとも７０％をエタノールに変換する少なくとも１つの分離個体Ｘと、
− アルコール発酵の開始の遅延時間が３０時間未満、好ましくは２９時間未満、より好ましくは２８時間未満、さらにより好ましくは２５時間未満、さらにより好ましくは２０時間未満である、少なくとも１つの分離個体Ｙと、
の間で実施される。

【0105】

本発明に係る方法は指向性進化させる工程を任意に含んでもよい。本発明の一つの有益な実施形態において、指向性進化させる工程は、キシロースからエタノールに代謝でき、および／または酢酸に耐性を与える前記ハイブリッドを与えることに関して、上記のようにキシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るための方法の選択する工程の間に選択されていないハイブリッドで実施される。

【0106】

したがってまた、本発明の目的は、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るための上記の方法であり、
− 少なくとも１つのハイブリッドを得るために、番号Ｉ−４５３８としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株を、番号Ｉ−４６２７としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株と交配する工程と、
− 少なくとも１つのハイブリッドを指向性進化させる工程と、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るために、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある少なくとも１つのハイブリッドを選択する工程と、
を含む、方法である。

【0107】

指向性進化させる工程は以下のサブ工程を含む：
− 変異体を得るために突然変異を誘発する工程と、
− キシロースおよび／または発酵阻害因子を含む培地中で、低酸素状態下で、循環培養物中で変異体を増殖させる工程。

【0108】

簡略化するために、指向性進化させる工程の終わりに得られる変異体はハイブリッドとして依然として記載している。

【0109】

「低酸素状態下」という表現は、酸素欠乏の状態下を示す。酸素欠乏は空気の２０％未満の酸素の割合として本明細書に定義される。突然変異を誘発させる工程は、好ましくは、「適度な」突然変異誘発である。すなわち、２５４ｎｍにて、１００から５００Ｊ／ｃｍ^２、例えば３００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ照射への酵母細胞の曝露によって得られる。これらの条件により、ＵＶ照射に供された細胞集団の７％〜１６％のみの致死率が生じる。

【0110】

致死率は、炭素源がグルコースである培地のディッシュ上に、突然変異誘発前後の同体積の細胞懸濁液を播種し、増殖の４８時間後のコロニーの数を比較することによって測定される。

【0111】

キシロースおよび／または阻害因子を含む培地中の低酸素状態下での循環培養物中の変異体の増幅は、例えば、
ａ）低酸素状態下、好ましくは３２℃にて撹拌しながらの培地中での、突然変異誘発に供された細胞集団の培養、
ｂ）工程ａ）で得た培養物のある体積、例えば１ｍｌのサンプリングおよびその、工程ａ）と同じ組成を有する培地中への再接種
を含み、工程ａ）およびｂ）は少なくとも３回、好ましくは少なくとも４回、例えば６回、７回または８回繰り返される。

【0112】

発酵阻害因子が、変異体の増殖の間、培地中に存在する場合、その阻害因子は好ましくは酢酸である。本発明の１つの好ましい実施形態において、低酸素状態下での循環培養物中の変異体の増殖は、キシロースを含み、酢酸の非存在下の培地中で実施される。

【0113】

変異体を増殖するための培地は、例えば、７％のキシロースを含む。変異体を増殖するための培地の例は、ＫＯＨでｐＨを４．４に調整した、以下の組成：７０ｇ／ｋｇのキシロース、５ｇ／ｋｇの酵母エキス、４．７ｇ／ｋｇのＤＡＰ（リン酸二アンモニウム）、１１．５ｇ／ｋｇのクエン酸、１３．５ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、１ｍｌ／ｋｇのＴｗｅｅｎ８０、２ｍｌ／ｋｇのＺｎＳＯ_４（１０．６ｇ／ｌにて）、２．５ｍｌ／ｋｇのＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ（４００ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのチアミン（１８．２４ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのピリドキシン（５．２８ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのビオチン（１．７６ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのパントテン酸塩（３．８ｇ／ｌにて）、２．５ｍｌ／ｋｇのニコチン酸（８ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのメソイノシトール（５０ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのリボフラビン（１ｇ／ｌにて）、１ｍｌ／ｋｇのパラ−アミノベンゾエート（１．２ｇ／ｌにて）を有するＹＦＸ培地である。

【0114】

低酸素状態は、例えば、発酵の間のＣＯ_２産生後の過圧およびエアレーションの非存在に起因して使用される装備（例えば、フラスコまたは発酵槽）における部分的過圧によって得られる。

【0115】

好ましくは、培養ａ）の期間は、培地のキシロースの全てが消費されるような期間である。培養の期間は、例えば、１週間〜４８時間である。培養の数は、例えば、５〜２０に変更可能である。

【0116】

１つの好ましい実施形態において、指向性進化させる工程は非呼吸欠損変異体の選択のサブ工程を含む。非呼吸欠損変異体は酸化的代謝の条件下で増殖できる変異体である。特に、非呼吸欠損変異体は、唯一の炭素源としてグリセロールを含有する培地、例えば、２０ｇ／ｋｇのグリセロール、５ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウムおよび１．７ｇ／ｋｇのＹＮＢ（酵母窒素ベース）培地、例えば、Ｄｉｆｃｏ製のＹＮＢ培地を含む培地中で、３０℃にて嫌気性条件下で増殖できる。

【0117】

培地が発酵阻害因子を含まない場合、酢酸を含む培地中の増殖のサブ工程が、培地が依然として酢酸に耐性がある少なくとも１つの変異体を含んでいることを検証するために、循環培養において増殖の特定または各々のサブ工程の後に実施されてもよい。酢酸を含む培地中の増殖の期間は、好ましくは、２０時間超であり、７５時間未満である。例えば、酢酸を含む培地中の増殖のサブ工程の期間には７０時間〜７５時間が含まれる。

【0118】

グルコースを含む培地、例えば２０ｇ／ｌのグルコースを含む培地中で培養することによって、適切な増殖率を有する変異体を選択する工程、および適切な増殖率を有する変異体の選択を実施することも可能である。

【0119】

指向性進化させる工程はまた、例えば、キシロースを代謝するその能力、および／または酢酸に対するその耐性をさらに改良するために、上記のようにキシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株を得るプロセスを選択する工程の終わりに選択されたハイブリッドを使用して実施されてもよい。

【0120】

本発明の目的はまた、上記の方法によって得られ得る、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株である。このように、Ｈ１酵母菌株は、上記（例えば実施例１）の酵母菌株を得るための方法によって得られた。Ｈ１酵母菌株は、ＹＦＧＸ培地中で６０時間、嫌気性条件下でキシロースの少なくとも９０％をエタノールに変換し、ＹＦＡｃ発酵培地中で２２時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。

【0121】

本発明の目的はまた、特に、上記の方法によって得られる、キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株であり、その酵母菌株は、番号Ｉ−４６２４としてＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に寄託された酵母菌株、番号Ｉ−４６２５としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株および番号Ｉ−４６２６としてＣＮＣＭに寄託された酵母菌株から選択される。Ｉ−４６２４、Ｉ−４６２５およびＩ−４６２６菌株は、ブダペスト条約の下、２０１２年５月２４日にＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］，２５，ｒｕｅ，ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４ Ｐａｒｉｓ ｃｅｄｅｘ １５，フランスに寄託されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株である。

【0122】

酵母菌株の番号Ｉ−４６２４は、ＹＦＧＸ培地中で６０時間、嫌気性条件下でキシロースの少なくとも９０％をエタノールに変換し、ＹＦＡｃ発酵培地中で２３時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。酵母菌株の番号Ｉ−４６２５は、ＹＦＧＸ培地中で６０時間、嫌気性条件下でキシロースの少なくとも９０％をエタノールに変換し、ＹＦＡｃ発酵培地中で２３時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。酵母菌株の番号Ｉ−４６２６は、ＹＦＧＸ培地中で６０時間、嫌気性条件下でキシロースの少なくとも９０％をエタノールに変換し、ＹＦＡｃ発酵培地中で２７時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有する。

【0123】

本発明の目的はまた、同じ特性を共有する本発明に係る酵母菌株から誘導された酵母菌株である。したがって、本発明の目的はまた、本発明に係る酵母菌株から誘導された酵母菌株であり、前記誘導された酵母菌株はキシロースを代謝でき、酢酸に耐性があることを特徴とする。誘導された酵母菌株は上記の定義において定義されている通りである。

【0124】

本発明の目的はまた、上記の酵母菌株を培養することによって、または上記の誘導された酵母菌株を培養することによって得られる酵母である。酵母は、特に、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８によって公開された参考文献「Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，第２版，１９９１，Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａに記載されている、本発明に係る酵母菌株または本発明に係る誘導された酵母菌株を培養することによって得られる。

【0125】

酵母の工業的スケールの増殖は、一般に、以下の工程のセットの少なくとも最初の２つの工程を含む：
− 第１の半嫌気性条件下および第２の嫌気性条件下でのいくつかの段階における酵母菌株の増殖、
− クリーム状酵母が浸透圧調節物質と混合される場合、約１２％〜２５％の乾燥物質またはさらに多くの量の乾燥物質を含有する液体クリーム状酵母を得るために、その培地から得られた酵母の遠心分離による分離、
− ２６％〜３５％の乾燥物質を含有する脱水された新鮮な酵母を得るために、一般に、真空下での回転フィルタ上での得られた液体クリーム状酵母の濾過、
− 均質な塊を得るために、前記脱水した新鮮な酵母の混合、
− 以下を得るために、得られた酵母の抽出：
○ 約３０％の乾燥物質を含有する新鮮なイーストケーキもしくは砕かれた新鮮な酵母の形状の圧縮された酵母、または
○ 酵母が乾燥されることを意図する場合、粒子、一般に顆粒の形状の酵母
− 任意に、例えば、乾燥酵母を得るために、押し出しによって得られた酵母粒子の流体化によって高温の空気のストリーム中で、保持性様式で乾燥させる工程。乾燥させる工程は、好ましくは、乳化剤の存在下で急速に乾燥させる工程である。乾燥させる工程の間に使用され得る乳化剤は、例えば、約１．０％（乾燥酵母菌株の重量に対する重量）の濃度で使用されるモノステアリン酸ソルビタンが選択されてもよい。本発明に係る酵母は任意の可能な形態で使用されてもよい。

【0126】

例えば、本発明の目的は、上記で定義される酵母であり、その酵母は、クリーム状の酵母、圧縮された酵母、乾燥酵母、急速凍結（ｄｅｅｐ−ｆｒｏｚｅｎ）酵母の形態であることを特徴とする。本発明に係る酵母は、培養することによって得られた酵母菌株と同じ特性、すなわち以下を有する：
− 本発明に係る酵母はキシロースを代謝でき、
− 本発明に係る酵母は酢酸に耐性がある。
本発明に係る酵母は、例えば、バイオ燃料または化学工業に意図される、工業的アルコールを産生するのに特に有益である。

【0127】

本発明の目的はまた、発酵培地中で上記に定義される酵母によって嫌気性条件下で発酵する工程を含む、少なくとも１つの発酵産物を産生する方法である。発酵産物は、特に、エタノール、エタノールから得られる代謝産物または二次代謝産物から選択される。本発明に係る好ましい発酵産物はエタノールである。エタノール産物はアルコール発酵によって得られる。当業者はアルコール発酵のための適切な条件を決定する方法を知っている。例として、参照が、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，ＩＳＢＮ ０−４４２−３１８９２−８によって公開された参考文献「Ｙｅａｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，第２版，１９９１，Ｇ．ＲｅｅｄおよびＴ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａに記載されるアルコール発酵条件に対してなされ得る。

【0128】

発酵培地は以下の元素を含む：少なくとも１つの発酵性炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つの硫黄源、少なくとも１つのリン源、少なくとも１つのビタミン源および／または少なくとも１つの鉱物源。炭素源は、例えば、酵母によって即座に吸収され得る糖、キシロース、グリセロール、エタノールなどのペントースおよび／またはそれらの混合物の形態で提供される。炭素源は、好ましくは、酵母によって即座に吸収され得る糖、およびキシロースによって提供される。酵母によって即座に吸収され得る糖は、例えば、グルコース、フルクトースまたはガラクトース型の単糖、スクロース型の二糖および／またはそれらの糖の混合物である。

【0129】

炭素源は、グルコースシロップ、フルクトースシロップ、糖液、低級流出（ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｒｕｎ−ｏｆｆ）２（２回目の糖の結晶化から生じる低級流出）、植物物質の全てもしくは一部の加水分解物および／またはそれらの混合物の形態で提供されてもよい。窒素源は、例えば、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、リン酸二アンモニウム、アンモニア、尿素および／またはそれらの組み合わせの形態で提供される。硫黄源は、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸および／またはそれらの組み合わせの形態で提供される。リン源は、例えば、リン酸、リン酸カリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウムおよび／またはそれらの組み合わせの形態で提供される。ビタミン源は、例えば、糖液、酵母加水分解物、純粋なビタミン溶液もしくは純水なビタミンの混合物および／またはそれらの組み合わせの形態で提供される。ビタミン源は、参考文献のハンドブックに推奨されているものと少なくとも等価の量でビタミンの全てを酵母に提供する。いくつかのビタミン源が組み合わされてもよい。鉱物源は、例えば、糖液、無機塩の混合物および／またはそれらの組み合わせの形態で提供される。鉱物源は、参考文献のハンドブックに推奨されているものと少なくとも等価の量で多量元素および微量元素の全てを酵母に提供する。いくつかの鉱物源が組み合わされてもよい。同じ物質がいくつかの異なる元素を提供してもよい。

【0130】

本発明の目的は、特に、少なくとも１つの発酵産物、好ましくはエタノールを産生するための上記に定義される方法であって、キシロースおよび／または少なくとも１つの発酵阻害因子を含む発酵培地中で上記に定義される酵母によって嫌気性条件下で発酵する工程を含む、方法である。発酵阻害因子は、例えば、有機酸、フルフラール、ＨＭＦ（ヒドロキシメチルフルフラール）、１種以上のフェノール化合物および浸透圧から選択される。有機酸は、例えば、酢酸、乳酸、ギ酸およびレブリン酸から選択される。

【0131】

１つの好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの発酵阻害因子は酢酸である。浸透圧は、例えば、植物物質の全てまたは一部の加水分解物中に存在する。次いで浸透圧は、特に、前記加水分解物を得るための方法の間に提供される生理食塩水負荷から生じる。発酵培地は上記に定義されている。発酵培地は、好ましくは、少なくとも０．２％のキシロースを含み、パーセントは重量／発酵培地の重量として表す。好ましい発酵培地は２％〜７％のキシロースを含む。

【0132】

本発明の１つの好ましい実施形態において、発酵培地はまた、酵母によって即座に吸収され得る糖、例えばグルコースを含む。発酵培地は、例えば、２％〜７％のキシロースおよび０．５％〜１５％のグルコースを含む。１つの好ましい実施形態において、発酵培地はキシロース、グルコースおよび酢酸を含む。

【0133】

本発明の目的は、特に、少なくとも１つの発酵産物、好ましくはエタノールを産生するための上記の方法であり、前記発酵培地は植物物質の全てまたは一部の少なくとも１つの加水分解物を含むことを特徴とする。植物物質の全てまたは一部の加水分解物は、例えば、高温にて、有機酸または溶媒の存在下で植物物質を前処理する工程、任意にその後、糖ポリマーの部分的または全ての酵素および／または化学および／または熱による加水分解によって得られ得る。したがって、植物物質の全てまたは一部の加水分解物は、セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンなどの糖ポリマーの加水分解から生じる糖の混合物を含む。発酵培地はまた、植物物質および源の全てまたは一部の加水分解物を含んでもよい。

【0134】

本発明の目的はまた、好ましくは、キシロースおよび／または少なくとも１つの発酵阻害因子を含む発酵培地中で少なくとも１つの発酵産物を産生するための上記に定義される酵母の使用である。発酵産物は上記に定義されている通りである。発酵産物は好ましくはエタノールである。発酵培地は上記に定義されている通りである。発酵阻害因子は上記に定義されている通りである。

【0135】

本発明の他の特徴および利点は、限定されないが、本発明を示し、添付の図面を参照して理解するための以下の例示的な実施形態を読むことでさらにより明確になるであろう。

【実施例】

【0136】

実施例１：キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株の取得
材料および方法
（ｉ）発酵培地
酵母菌株を増殖させるための使用される増殖培地は、１０ｇ／ｋｇの酵母エキス、１０ｇ／ｋｇのペントースおよび２０ｇ／ｋｇのグルコースを含む。以下に記載されるＹＦＧＸ培地はキシロースからエタノールへの変換を測定するために使用される。以下に記載されるＹＦＡｃ培地は酢酸に対する耐性を測定するために使用される。以下に記載されるＹＦＧＸ−Ａｃ培地は、同時にキシロース、グルコースおよび発酵阻害因子である酢酸を含有する培地中で酵母菌株を評価するために使用される。

【0137】

【表1】

【0138】

ＹＦＧＸ培地中で、ｐＨ５で２０００ｐｐｍの酢酸濃度は阻害効果を有さない。他方で、ＹＦＧＸ−Ａｃ培地中で、ｐＨ５で８０００ｐｐｍの酢酸濃度は阻害効果を有する。

【0139】

【表2】

【0140】

（ｉｉ）酵母菌株増殖
酵母菌株増殖は２つの工程で実施される：前培養工程後の培養工程。前培養は、上記に定義される５ｍｌの増殖培地中に酵母菌株のループを接種することによって実施される。撹拌することによって通気した培地中での３０℃における培養の２４時間後、この前培養の２ｍｌを取り除き、５０ｍｌの増殖培地中に接種する。この培養は、撹拌によって通気した培地中で３０℃にて２４時間実施される。キシロースからエタノールへの変換および酢酸に対する耐性はこの培養から生じる酵母細胞で測定される。

【0141】

（ｉｉｉ）キシロースからエタノールへの変換の測定
キシロースからエタノールへの変換を測定するために、上記のように増殖した酵母菌株の０．２５ｇの乾燥物質をＹＦＧＸ培地１ｋｇ当たりに接種した。発酵は穏やかに撹拌しながら嫌気性条件下で３２℃にて実施する。エタノールおよびまたキシロースおよびグルコース濃度をＨＰＬＣによって測定する。次いで以下の式を使用して、キシロースからエタノールへの変換の程度を得る：

【数1】

式中、［キシロース］_開始は、酵母菌株を接種した時間における培地中のキシロース濃度に対応し、［キシロース］_最終は、６０時間（接種から開始）における培地中のキシロース濃度に対応する。

【0142】

（ｉｖ）酢酸に対する耐性の測定
酵母菌株の酢酸に対する耐性はアルコール発酵の開始の遅延時間によって測定される。上記に示したように増殖した酵母菌株の０．２５ｇの乾燥物質をＹＦＡｃ培地１ｋｇ当たりに接種した。発酵は穏やかに撹拌しながら３２℃にて嫌気性条件下で実施される。エタノール産生は、発酵フラスコの質量の損失を測定することによって間接的に測定され、この質量の損失はアルコール産生と直接相関する。時間の関数として質量の損失を示すアルコール発酵曲線が作成される。ｘ軸と質量の損失の最大導関数との交差点が測定される：これは発酵の開始の遅延時間に相当する。アルコール発酵曲線が、時間の関数として質量の損失の代わりに時間の関数としてアルコール産生を示す場合、質量の損失の最大導関数は、アルコール産生率の最大導関数と同じ結果を与えることに留意すべきである。得られる期間が制限されるほど、発酵の開始の遅延時間はより短くなり、酵母菌株は酢酸に対して、より耐性になる。

【0143】

（ｖ）交配
交配するために使用される開始菌株はＩ−４５３８酵母菌株およびＩ−４６２７酵母菌株である。
工程１：酵母菌株増殖
開始菌株のループ（−８０℃で保存した）を培地Ａのペトリ皿の寒天の表面に接種する。培地Ａの組成は以下の通りである：１０ｇの酵母エキス、１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、２０ｇの寒天、ｐＨ６．２＋／−０．２、水ｑｓ１ｌ。次いでペトリ皿を３０℃にて２４時間接種する。

【0144】

工程２：培地２における胞子形成
以前の培養物のループを培地Ｂのペトリ皿の寒天の表面に接種する。培地Ｂの組成は以下の通りである：６．５ｇの酢酸ナトリウム、１５ｇの寒天、ｐＨ６．５〜７、水ｑｓ１ｌ。ペトリ皿を２５℃にて９６時間接種する。次いでディッシュの表面で得たバイオマスを５００μｌの滅菌水中で収集する。２５μｌのザイモリアーゼを１００μｌのこの懸濁液に加える。上清を３０℃にて３０分間インキュベートし、その後、培地１の寒天ディッシュ上に播種する。４つの切断を好ましくは２０分後に実施する。

【0145】

工程３：４つの切断
Ｓｉｎｇｅｒマイクロマニピュレータを用いて４つに切断し、次いでペトリ皿を３０℃にて４８時間インキュベートする。

【0146】

工程４：分離個体保存
次いで分離個体を、２０％のグリセロールを含む培地１中に−８０℃にて保存する。

【0147】

工程５：Ｉ−４５３８酵母菌株分離個体の選択
Ｉ−４５３８酵母菌株分離個体を、キシロースをエタノールに変換するそれらの能力について選択する。キシロース変換は、測定を６０時間の代わりに４８時間で実施することを除いて、酵母菌株について（ｉｉ）で増殖した分離個体を使用して（ｉｉｉ）において測定される。選択した分離個体はキシロースの少なくとも７０％を４８時間で変換した。選択した分離個体のＭａｔまたはＭａｔアルファ性別型をＰＣＲによって測定する。

【0148】

工程６：Ｉ−４６２７菌株の分離個体の選択
Ｉ−４６２７酵母菌株の分離個体を、酢酸に対するそれらの耐性に基づいて選択する。酢酸に対する耐性は、酵母菌株について（ｉｉ）で増殖した分離個体を使用して、（ｉｖ）のように評価する。選択した分離個体は、２５時間未満の発酵の開始の遅延時間を有する。選択した分離個体のＭａｔ ａまたはＭａｔアルファ性別型をＰＣＲによって測定する。

【0149】

工程７：ハイブリッドの交配および選択
Ｍａｔアルファハプロイド分離個体のループを、培地Ａのペトリ皿の寒天の表面に接種する。Ｍａｔ ａハプロイド分離個体のループを、Ｍａｔアルファ菌株の寄託と混合する。培地Ａの組成は以下の通りである：１０ｇの酵母エキス、１０ｇのペプトン、２０ｇのグルコース、２０ｇの寒天、ｐＨ６．２＋／−、水ｑｓ１ｌ。次いでペトリ皿を３０℃にて２４時間接種する。混合物のループを培地Ａのペトリ皿の寒天の表面に接種する。この工程を５回繰り返す。最後の接種の間、単離したコロニーを得るために細胞をストリークする。酵母細胞を各々の単離したコロニーから除去し、培養し、それらのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｍａｔ ａおよびＭａｔアルファ対立遺伝子が１つおよび同じ酵母細胞中に実際に存在することを検証するためにＰＣＲをこのゲノムＤＮＡで実施する。Ｍａｔ ａおよびＭａｔアルファ対立遺伝子を有する酵母細胞はハイブリッドと呼ばれる。

【0150】

次いで、ハイブリッドを２つの基準に基づいて選択する：キシロースを代謝するそれらの能力および酢酸に対するそれらの耐性。それらを（ｉｉｉ）および（ｉｖ）に示すように評価する。選択したハイブリッドは以下の通りである：
− ３０時間未満のアルコール発酵の開始の遅延時間を有するハイブリッド、
− ６０時間でキシロースの少なくとも６０％を変換するハイブリッド。

【0151】

（ｖｉ）指向性進化
指向性進化は、ＵＶ突然変異誘発、その後の、キシロースが炭素源のみを構成する発酵培地上での濃縮の工程の組み合わせである。
工程１：ＵＶ突然変異誘発の間、５％（１００ｇの懸濁液について乾燥物質（ｇ））にて酵母細胞の１５ｍｌの懸濁液を９ｃｍのペトリ皿に入れる。次いでペトリ皿を２５４ｎｍにて３００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ放射線下に置く。

【0152】

工程２：次いで、照射した酵母細胞を、１ｇの乾燥物質／ＹＦＸ培地（ｋｇ）の量で接種する。３２℃での低酸素状態下での９６時間の増殖後、１００μｌの培地を使用して、２０ｇ／ｋｇのグリセロール、５ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウムおよびＤｉｆｃｏ製の１．７ｇ／ｋｇのＹＮＢ（酵母窒素ベース）培地を含有する５０ｍｌのグリセロール培地を接種する。この第２の培養は、嫌気性条件下で、３０℃にて４８時間、実施する。次いで１ｍｌのこの培養物を取り除いて、１７０ｍｌのＹＦＸ培地に接種する。このサイクルを８回繰り返す。

【0153】

結果
Ｉ−４５３８菌株を、Ｉ−４６２７菌株と交配することによっていくつかのハイブリッドが得られ、それらの中にＨ１およびＨ２ハイブリッドがある。本発明の目的に関してキシロースを代謝できないが、酢酸に対する耐性を示すＨ２ハイブリッドを指向性進化の工程に供する：次いで、Ｉ−４６２４、Ｉ−４６２６およびＩ−４６２５酵母菌株のそれぞれに対応するＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３ハイブリッドを得る。

【0154】

表１は、種々の酵母菌株のＹＦＧＸ培地中で６０時間でエタノールに変換されたキシロースの割合およびＹＦＡｃ培地中のアルコール発酵の開始の遅延時間（時間）を示す：
− 酢酸に耐性があり、したがってキシロースを代謝できない、非遺伝的に改変された酵母菌株であるＡｃ対照、
− アルコールの産生に非常に効果的であるが、酢酸に耐性がないＩ−４５３８開始酵母菌株、
− 本発明の目的に関して、酢酸に耐性があるが、キシロースを代謝できないＩ−４６２７開始酵母菌株、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性がある酵母菌株であるＨ１ハイブリッド、
− 本発明の目的に関して、キシロースを代謝できないが、酢酸に耐性を示すＨ２ハイブリッド、
− キシロースを代謝でき、酢酸に耐性があるＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３ハイブリッド。

【0155】

【表3】

【0156】

さらに、酵母菌株のエタノール産生は、グルコース、キシロースおよび発酵阻害因子として酢酸を同時に含むＹＦＧＸ−Ａｃ発酵培地中で評価される。本発明に係るＨ１、ＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３酵母菌株は、このＹＦＧＸ−Ａｃ培地中でＩ−４５３８親酵母菌株と比較して明確に改良されたアルコール産生を生じる（図１を参照のこと）。

【0157】

実施例２：本発明に係る酵母菌株を使用した、実際の適用培地中でのアルコール産生
材料および方法
ＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３酵母菌株のアルコール産生を実際の適用培地中で評価する。Ｉ−４５３８親酵母菌株のアルコール産生もまた、比較により評価する。酵母菌株のアルコール産生の評価は２つの異なる適用培地中で実施する：
− 培地Ａは以下を含む：
○ 麦わらを前処理および熱化学的加水分解したバイオマスの固体／液体分離後に得た液相に対応し、主にキシロース（４８ｇ／ｋｇ）、少量の他の糖およびまた、リグノセルロースバイオマスの生理化学的前処理から生じる発酵阻害因子を含むヘミセルロース物質、ならびに
○ 栄養素（窒素およびリン源）、
− 培地Ｂは、リグノセルロースバイオマスの加水分解物を模倣するために、グルコースを補足した上記の培地Ａに対応し、そのヘミセルロース画分は加水分解され、そのセルロース画分は部分的に加水分解される。

【0158】

培地ＡおよびＢの初期ｐＨはｐＨ５．５に調整される。評価される酵母菌株の１．５ｇ／ｋｇの乾燥物質を発酵槽に接種する。アルコール発酵を３５℃にて実施する。発酵はまた、培地Ａで３２℃にて実施する。

【0159】

結果
３２℃および３５℃にて培地Ａで得た結果をそれぞれ図２および３に与え、３５℃にて培地Ｂで得た結果を図４に与える。図３において、Ｉ−４５３８酵母菌株について、分裂停止期に既に到達しているので、６０時間で停止していることに留意すべきである。

【0160】

ＥＤ１およびＥＤ２ハイブリッドは、Ｉ−４５３８親酵母菌株と比較して３２℃にて適用培地Ａにおいて実際の利点を示す。ＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３ハイブリッドは、Ｉ−４５３８親酵母菌株と比較して３５℃にて適用培地Ａにおいて実際の利点を示す。実際に、エタノール産生は、Ｉ−４５３８酵母菌株について最初の６０時間で良好であるが、産生される最大量のエタノールは６．３ｋｇ／培地（ｋｇ）であるのに対して、ＥＤ１、ＥＤ２およびＥＤ３ハイブリッドでは、１０ｇ／ｋｇ超の量のエタノールが得られる。ＥＤ１およびＥＤ２ハイブリッドは、再び、Ｉ−４５３８酵母菌株と比較して３５℃にて適用培地Ｂ中で実際の利点を示す。ＥＤ３ハイブリッドはこの適用培地において少し遅れをとっている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】