特許 6190844 膨潤パラミロン及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6190844

(24)【登録日】2017年8月10日

(45)【発行日】2017年8月30日

(54)【発明の名称】膨潤パラミロン及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20170821BHJP

   C13K 13/00 20060101ALI20170821BHJP

   C12P 19/04 20060101ALN20170821BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/00 C

   C13K13/00

   !C12P19/04 Z

【請求項の数】6

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2015-79526(P2015-79526)

(22)【出願日】2015年4月8日

(65)【公開番号】特開2016-199650(P2016-199650A)

(43)【公開日】2016年12月1日

【審査請求日】2017年3月27日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】506141225

【氏名又は名称】株式会社ユーグレナ

(74)【代理人】

【識別番号】100088580

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 敦

(74)【代理人】

【識別番号】100111109

【弁理士】

【氏名又は名称】城田 百合子

(72)【発明者】

【氏名】岩田 修

(72)【発明者】

【氏名】中島 綾香

(72)【発明者】

【氏名】朝山 雄太

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 健吾

【審査官】 伊藤 幸司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−２７０８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０５６４５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０５１７９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２９３１６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１１１８４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２９９０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２９５３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０８８１０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−０４７２６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０９５１５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０９１７１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ

Ｃ１３Ｋ

Ｃ１２Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パラミロンに水性の溶媒を加えた流体を、超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させる衝突工程を行うことにより、前記パラミロンが前記水性の溶媒と一体化して膨潤した粘性の膨潤パラミロンを製造することを特徴とする膨潤パラミロンの製造方法。

【請求項2】

前記衝突工程を、複数回繰り返すことを特徴とする請求項１記載の膨潤パラミロンの製造方法。

【請求項3】

前記衝突工程では、前記流体を、一定の形状を備えた物体に、該物体の面に対して角度を持って衝突させることを特徴とする請求項１記載の膨潤パラミロンの製造方法。

【請求項4】

前記衝突工程では、前記流体を第一の噴流として噴出させ、該第一の噴流を、前記パラミロンに水性の溶媒を加えた流体を他の細孔ノズルから超高圧で噴出させた第二の噴流に、角度を持って衝突させることを特徴とする請求項１記載の膨潤パラミロンの製造方法。

【請求項5】

前記膨潤パラミロンは、
レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で粒度を測定したときのメジアン径が、前記パラミロンの５倍以上であって、
光学電子顕微鏡により、粒子が、隣接する粒子と付着していることが観察され、
前記パラミロンに対して４倍以上の水と結合して膨潤していることを特徴とする請求項１記載の膨潤パラミロンの製造方法。

【請求項6】

レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で粒度を測定したときのメジアン径が、パラミロンの５倍以上であって、
光学電子顕微鏡により、粒子が、隣接する粒子と付着していることが観察され、
前記パラミロンに対して４倍以上の水と結合して膨潤していることを特徴とする膨潤パラミロン（ただし、アモルファスパラミロンを除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、パラミロンを加工した新規な膨潤パラミロン及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

β−グルカンは、β−グルコースが（１→３），（１→４）および（１→６）の結合で連なった一群の多糖類であり、植物や菌類、細菌、藻類など自然界に広く分布する。β−グルカンの機能，作用は、その由来生物によって大きく異なるが、例えば、アガリクスやメシマコブ、霊芝などのキノコ由来のβ−グルカンは強い免疫賦活作用、制癌作用を持つ機能性物質として広く利用されている。キノコ以外の由来のβ−グルカンについても、生体に対する機能性を有することが期待できる。
β−グルカンには、水に可溶性のものと不溶性、難溶性のものがあり、不溶性、難溶性のβ−グルカンは、生体内で吸収されにくいため、生体内での機能については、未知のものが多い。
例えば、ユーグレナから抽出されたパラミロンは、種々の機能，作用を備えた有用物質として期待されている。パラミロンは、水に不溶であることによって、使途及び用法の制約を受け、加工して水溶性パラミロンとすることにより、免疫賦活用活性物質や抗ガン性組成物として構成されている（例えば特許文献１及び２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第３１５６１３５号公報

【特許文献2】特許第２６０４１９６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１及び２の水溶性パラミロンでも、免疫賦活用活性物質や抗ガン性組成物としての効果は確認されているが、更に強い効果が望まれている。また、水に不溶のβ−グルカンには、免疫賦活用活性物質や抗ガン性組成物としての機能以外の機能があることが期待されており、特許文献１及び２のような化学的処理とは異なる加工を施すことにより、従来生体に対する機能が知られていなかったβ−グルカンが、新しい機能を発現する可能性もある。

【0005】

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新しい機能性を発揮し得る新規な膨潤パラミロン及びその製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

流体を、超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させる装置は、分散・破砕・微粒化・乳化・表面改質等のために一般的に用いられている。本発明者らは、パラミロンが微粒化されることを期待して、パラミロンを、このような装置で処理したところ、驚くべきことに、パラミロンは微粒化されず、パラミロンが溶媒の水と一体化して膨潤して、粘性を帯びることを見出して、本発明を完成するに至った。

【0007】

すなわち、前記課題は、本発明の膨潤パラミロンの製造方法によれば、パラミロンに水性の溶媒を加えた流体を、超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させる衝突工程を行うことにより、前記パラミロンが前記水性の溶媒と一体化して膨潤した粘性の膨潤パラミロンを製造することにより解決される。
衝突工程を、複数回繰り返してもよい。
衝突工程では、前記流体を、一定の形状を備えた物体に、該物体の面に対して角度を持って衝突させてもよい。
また、衝突工程では、前記流体を第一の噴流として噴出させ、該第一の噴流を、前記パラミロンに水性の溶媒を加えた流体を他の細孔ノズルから超高圧で噴出させた第二の噴流に、角度を持って衝突させてもよい。

【0008】

本発明によれば、水不溶性又は難溶性のパラミロンであっても、簡単な処理で水との親和性を付与することができる。生体における機能性を潜在的に有しながら、水に不溶又は難溶であるためにその機能性を発揮できなかったパラミロンであっても、生体における機能性を獲得可能となる。その結果、従来知られていなかった新規な機能性パラミロン、又は、公知のパラミロンの新規な機能の発見への途を開くことができる。
また、衝突工程という物理的方法を用いるため、従来の様に化学的反応を用いることなく、水不溶性のパラミロンを、水との親和性の高い膨潤パラミロンにすることが可能となる。従って、本発明では、人工的に官能基を付加する化学反応とは異なり、衝突工程で用いる水性の溶媒のみがパラミロンに付加されるに過ぎないため、ヒトに経口、経皮で投与等される素材に向いており、ヒト向けの医薬品、機能性食品の素材としての用途が広がる。

【0009】

また、前記課題は、本発明の膨潤パラミロンによれば、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で粒度を測定したときのメジアン径が、パラミロンの５倍以上であって、光学電子顕微鏡により、粒子が、隣接する粒子と付着していることが観察され、前記パラミロンに対して４倍以上の水と結合して膨潤していることを特徴とする膨潤パラミロン（ただし、アモルファスパラミロンを除く）により解決される。

【0010】

本発明の膨潤パラミロンは、このように、水との親和性が高いため、医薬品素材、食品素材のほか、工業的素材としても加工性、作業性が高く、種々の素材として利用可能である。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、水不溶性又は難溶性のパラミロンであっても、簡単な処理で水との親和性を付与することができる。生体における機能性を潜在的に有しながら、水に不溶又は難溶であるためにその機能性を発揮できなかったパラミロンであっても、生体における機能性を獲得可能となる。その結果、従来知られていなかった新規な機能性パラミロンの新規な機能の発見への途を開くことができる。
また、衝突工程という物理的方法を用いるため、従来の様に化学的反応を用いることなく、水不溶性のパラミロンを、水との親和性の高い膨潤パラミロンにすることが可能となる。従って、本発明では、人工的に官能基を付加する化学反応とは異なり、衝突工程で用いる水性の溶媒のみがパラミロンに付加されるに過ぎないため、ヒトに経口、経皮で投与等される素材に向いており、ヒト向けの医薬品、機能性食品の素材としての用途が広がる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の一実施形態に係る加工パラミロンの製造装置の概略構成図である。

【図2】本発明の他の実施形態に係る加工パラミロンの製造装置の概略構成図である。

【図3】本発明の実施例１に係る加工パラミロンの静置観察における静置後の写真である。

【図4】本発明の対比例１に係る加工アモルファスパラミロンの静置観察における静置後の写真である。

【図5】本発明の実施例１に係る加工パラミロンの光学電子顕微鏡写真である。

【図6】本発明の実施例１に係る加工パラミロン（超音波分散時間０分）の粒度分布を示すグラフである。

【図7】本発明の実施例１に係る加工パラミロン（超音波分散時間１分）の粒度分布を示すグラフである。

【図8】本発明の実施例２に係る加工パラミロンの関節炎スコアの測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明の膨潤パラミロンの一実施形態に係る加工β−グルカン及びその製造方法について、図１〜図８を参照しながら説明する。
本発明は、β−グルカンに水性の溶媒を加えた流体を、超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させることにより製造される加工β−グルカン及びその製造方法に関する。
＜β−グルカン＞
本明細書において、β−グルカンとは、β−グルコースが（１→３），（１→４）および（１→６）の結合で連なった多糖類の一群をいい、セルロース、ラミナラン、リケナン、穀類のβ−グルカン、カロース、ザイモザン等の酵母細胞壁由来のβ−グルカン、クレスチン、レンチナン、ジゾフィラン、グリフォラン、パキマン、マンネンタケ・アガリクス・ヤマブシタケ・カバノアナタケ・カワリハラタケ・メシマコブ由来のβ−グルカン等のキノコ由来のβ−グルカン、カードラン、ユーグレナ由来のパラミロン等を含む。
これらのβ−グルカンのうち、水不溶性又は水難溶性のβ−グルカンが、本実施形態の加工β−グルカン及びその製造方法の素材として特に適している。
これらのβ−グルカンのうち、パラミロン(paramylon)とは、ユーグレナが含有する貯蔵多糖であり、ユーグレナ由来のものをいう。

【0014】

＜ユーグレナ＞
本明細書において、「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種のすべてを含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）の微生物とは、動物学では原生動物門（Protozoa）の鞭毛虫綱（Mastigophorea）、植物鞭毛虫亜綱（Phytomastigophorea）に属するミドリムシ目（Euglenida）のユーグレノイディナ亜目（Euglenoidina）に属する微生物である。一方、ユーグレナ属の微生物は、植物学ではミドリムシ植物門（Euglenophyta）のミドリムシ藻類綱（Euglenophyceae）に属するミドリムシ目（Euglenales）に属している。

【0015】

ユーグレナ属の微生物としては、具体的には、Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridis、Euglena vermiformis、Euglena intermedia, Euglena pirideなどが挙げられる。
ユーグレナ細胞としては、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス・クレブス，ユーグレナ・グラシリス・バルバチラス等の種や、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株由来のβ−１，３−グルカナーゼ、Euglena intermedia, Euglena piride、及びその他のユーグレナ類、例えばAstaia longaであってもよい。

【0016】

ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用してもよく、また、すでに単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
本発明のユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。

【0017】

ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Cramer-Myers培地（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ，Ｆｅ_２（ＳＯ_２）_３・７Ｈ_２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ １．８ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １．５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．４ｍｇ／Ｌ，Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ_１） ０．１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ_１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４やＮＨ_３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ 生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のHutner培地，Koren-Hutner培地を用いてもよい。

【0018】

培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養，回分培養法，半回分培養法（流加培養法），連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。

【0019】

培養は、オープンポンド型，レースウェイ型，チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。ユーグレナはＣＯ_２を資化するため、独立栄養培地であるCramer-Myers培地を用いて培養する場合は１〜５％ＣＯ_２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１〜５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０〜３４℃で、特に２８〜３０℃が好適である。また、培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２〜３日で対数増殖期となり、４〜５日程度で定常期に到達する。
ユーグレナは、光照射下で培養（明培養）されてもよく、無照射で培養（暗培養）されてもよい。
ユーグレナ細胞の分離は、例えば、培養液の遠心分離または単純な沈降によって行われ得る。

【0020】

＜パラミロン＞
本明細書において、パラミロン(paramylon)とは、約７００個のグルコースが、β−１，３−結合により重合した高分子体であり、ユーグレナが含有する貯蔵多糖である。
パラミロンは、ユーグレナを、グルコースを主体とした培地上で培養することにより、その細胞内に蓄積させることができる。ユーグレナ細胞中のパラミロンは、細胞内では直径数μｍ程度の大きさの粒子状の形態をとり、細胞を破砕することにより簡単に取り出すことができると共に、アルコールやトルエン処理により精製することができる。
パラミロン(Paramylon)は、約７００個のグルコースがβ-1,3-結合により重合した高分子体（β-1,3-グルカン）であり、ユーグレナ属が含有する貯蔵多糖である。パラミロン粒子は、扁平な回転楕円体粒子であり、β-1,3-グルカン鎖がらせん状に絡まりあって形成されている。

【0021】

パラミロンは、すべての種，変種のユーグレナ細胞内に顆粒として存在し、その個数,形状，粒子の均一性は、種により特徴がある。
パラミロンは、グルコースのみからなり、E. gracilis Zの野生株と葉緑体欠損株SM-ZKから得られたパラミロンの平均重合度は、グルコース単位で約700である。
パラミロンは、水，熱水には不溶性であるが、希アルカリ，濃い酸，ジメチルスルホキシド，ホルムアルデヒド，ギ酸に溶ける。
パラミロンの平均密度は、E. gracilis Zでは、1.53、E. gracilis var. bacillaris
SM-L1では、1.63である。

【0022】

パラミロンは、粉末図形法を用いたX線解析によれば、３本の直鎖状β−グルカンが右巻きの縄のように捻じれあったゆるやかならせん構造をとっている。このグルカン分子がいくつか集まってパラミロン顆粒を形成する。パラミロン顆粒は、結晶構造部分が非常に多く約90％を占め、多糖類の中で最も結晶構造率の高い化合物である。また、パラミロンは、水を含みにくい（ユーグレナ 生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター））。
なお、パラミロン（株式会社ユーグレナ製）の粒度分布は、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で測定したときのメジアン径が、1.5〜2.5μmである。

【0023】

パラミロン粒子は、培養されたユーグレナ属から任意の適切な方法で単離および微粒子状に精製され、通常粉末体として提供されている。
例えば、パラミロン粒子は、（１）任意の適切な培地中でのユーグレナ細胞の培養；（２）当該培地からのユーグレナ細胞の分離；（３）分離されたユーグレナ細胞からのパラミロンの単離；（４）単離されたパラミロンの精製；および必要に応じて（５）冷却およびその後の凍結乾燥により得ることができる。
パラミロンの単離は、例えば、大部分が生物分解される種類の非イオン性または陰イオン性の界面活性剤を用いて行われ得る。パラミロンの精製は、実質的には単離と同時に行われ得る。

【0024】

なお、ユーグレナからのパラミロンの単離および精製は周知であり、例えば、E. Ziegler, "Die naturlichen und kunstlichen Aromen"Heidelberg, Germany, 1982, Chapter 4.3 "Gefriertrocken"、DE 43 28 329、または特表２００３−５２９５３８号公報に記載されている。

【0025】

＜加工β−グルカンの製造方法＞
本実施形態の加工β−グルカンは、β−グルカンに水を加えて得た流体を、超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させる処理により、得ることができる。
以下、本実施形態の加工β−グルカンの製造装置及び製造方法について説明する。
本実施形態の加工β−グルカンの製造装置Ｓの概略を、図１に示す。
加工β−グルカンの製造装置Ｓは、供給される高圧の流体に耐える圧力容器本体１と、圧力容器本体１内に高圧流体を吐出させるヘッド部２と、ヘッド部２に高圧流体を供給する不図示の原料タンク及び高圧ポンプと、ヘッド部２から圧力容器本体１へ吐出された高圧流体が衝突する被衝突体３と、を主要構成要素とする。

【0026】

ヘッド部２は、被衝突体３と対向する先端に、硬質で細径の細孔ノズルとしてのノズル２１と、ノズル２１へ連通する管状の流路２２を備えている。
本実施形態の被衝突体３は、焼結ダイヤモンド、ダイヤモンド単結晶、サファイア、タングステンカーバイドや、その他のセラミック等の硬質部材からなり、図１に示すような球形や、円錐形のほか、板体からなっていてもよい。
ノズル２１が、ノズル２１の吐出方向において対向する被衝突体３の面は、ヘッド部２の吐出方向に対して垂直又は傾斜し、表面が滑面又は粗面に形成されていてもよい。

【0027】

また、被衝突体３の代わりに、図２に示すように、ヘッド部２と同じ構成のヘッド部２´を、相互のノズル２１，２１´が対向するように配置し、相互のノズル２１，２１´からそれぞれ噴出する一対の噴流同士を衝突させてもよい。一対の噴流が、請求項の第一、第二の噴流に該当する。
このとき、ノズル２１，２１´の吐出方向ｄ，ｄ´が、一直線上にのるように配置してもよいし、吐出方向ｄ，ｄ´が、相互に角度を有するように配置してもよい。
吐出方向ｄ，ｄ´が、一直線上に載るように配置した場合、ノズル２１，２１´からそれぞれ吐出される流体は、正面衝突することとなり、吐出方向ｄ，ｄ´が、相互に角度を有するように配置した場合、ノズル２１，２１´からそれぞれ吐出される流体は、正面衝突することとなる。

【0028】

次いで、加工β−グルカンの製造装置Ｓを用いた加工β−グルカンの製造方法について説明する。
まず、結晶β−グルカン粉末に、β−グルカン濃度が１〜１０ｗｔ％となるように水を加えて撹拌し、スラリー化したβ−グルカンスラリーを得て、不図示の原料タンクに供給する。
次いで、図１又は図２の加工β−グルカンの製造装置Ｓの回路内をイオン交換水に置換し、加圧してヘッド部２に供給する。その後、ヘッド部２への供給を、原料タンクのβ−グルカンスラリーに切り替え、ヘッド部２の所定圧力、例えば、１００〜３００ＭＰａで、ノズル２１又は、ノズル２１，２１´から圧力容器本体１へ吐出させる。
これにより、図１の装置では、ノズル２１から噴出したβ−グルカンスラリー噴流が被衝突体３に衝突し、また、図２の装置では、ノズル２１，２１´からそれぞれ噴出したβ−グルカンスラリー噴流同士が衝突して、流出路４から回収される。流出路４から回収されたスラリー処理物は、自然冷却される。
この一連の過程を１パスとして、求められる物性に応じた回数、例えば、１〜２５パスを繰り返すことにより、加工β−グルカンが調製される。以上で、加工β−グルカンの製造方法が完了する。

【0029】

＜加工β−グルカン＞
本実施の形態に係る加工β−グルカンは、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で粒度を測定したときのメジアン径が、原料の結晶β−グルカン粉末の５倍以上である。
また、加工β−グルカン粒子は、隣接する粒子と付着し、β−グルカンに対して４倍以上の水と結合して膨潤している。原料β−グルカンと水を混合したスラリーは、さらさらした流体であるが、加工β−グルカンは、粘度が増加して粘性を有し、触ったときに手に付着するような粘着性と、もちもちした弾力性を有し、糊のような触感を備えている。
加工β−グルカンは、乳化物に類似した物性を備えている。

【実施例】

【0030】

以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。以下の実施例は、β−グルカンの一例であるパラミロンを用いた例であるが、本発明は、他のβ−グルカンにも適用可能であることは当然である。
（実験例１）
本実験例では、結晶性のパラミロン粉末、アモルファスパラミロンを、上記実施形態の加工パラミロンの製造方法に沿って処理することにより、実施例１の加工パラミロン及び対比例１の加工アモルファスパラミロンを作製し、物性の確認を行った。

【0031】

まず、結晶性のパラミロン粉末（株式会社ユーグレナ製）に、パラミロン濃度が３ｗｔ％になるよう、水を加え、パラミロンスラリーを得た。
湿式微粒化装置（スターバーストミニ，２．２ＫＷ，株式会社スギノマシン製，ボール衝突チャンバ−）の装置回路内をイオン交換水に置換した。
本実験例で用いた湿式微粒化装置は、超高圧に加圧した原料を、細孔ノズルから噴出させて被衝突物としてのセラミックスボールに衝突させることにより、分散・粉砕・乳化・表面改質等を行う装置である。
装置のノズルを加圧して、パラミロンスラリーを回路内に供給し、初期吐出液を、回路内デッドボリュームとして廃棄した。その後、パラミロンスラリーの噴流を被衝突体としてのセラミックボールに衝突させ、流出路からスラリー処理物を回収して、１パスとした。このときの処理圧力は、２４５ＭＰａ，スラリー処理量は、２４０ｍＬ，ノズル径は、０．１ｍｍとした。
この処理を２０回繰り返して２０パスの処理を行い、０，１，３，５，１０パス処理後の処理物（実施例１）をそれぞれ１６ｍＬと、２０パス処理後の処理物（実施例１）を３２ｍＬサンプリングして、静置観察及び光学電子顕微鏡観察、粒度分布の測定を行った。

【0032】

また、アモルファスパラミロン（株式会社ユーグレナ製）についても、アモルファスパラミロン濃度が１ｗｔ％になるように、１規定の水酸化ナトリウムを加え、アモルファスパラミロン水溶液を得たことを除いては、同様の処理を行い、０，１，３，５，１０，２０パス処理後の処理物（対比例１）をそれぞれ１６ｍＬサンプリングして、静置観察、粒度分布の測定を行った。

【0033】

◎ 静置観察
定量サンプリングした実施例１，対比例１の処理物（０，１，３，５，１０，２０パス）を、容器に入れて１週間静置した後、観察した。
実施例１の各パスの静置後の写真を、図３に示す。実施例１では、０，１，３パスのものは、パラミロン処理物と水とが分離して、パラミロン処理物が水中で沈殿したが、５，１０，２０パスのものは、パラミロン処理物と分離する水は観察されず、白色の処理物のみが観察された。
また、０パスの未処理のものは、サンプリング後１日の静置で沈殿したが、パス数が増えるに従い、湿式微粒化装置による処理の影響により、沈殿する傾向が見られなくなった。図３に示すように、１，３パスでは、若干沈殿したが、５パス以上では、沈殿しなかった。
サンプリング後１週間後に静置観察をした後、サンプリング後１か月が経過するまで、各サンプルを静置して放置したところ、１週間後の静置時点での状態と、変化がなかった。
対比例１の各パスの静置後の写真を、図４に示す。対比例１の各サンプルはすべて水に溶解しており、透明な液体であった。未処理のもの（０パス）は、無色透明であったが、パス数の増加に伴い黄色に着色していた。

【0034】

◎ 顕微鏡観察
光学電子顕微鏡の観察は、実施例１，対比例１について行ったが、対比例１では観察できなかった。
実施例１の光学電子顕微鏡の写真を、図５に示す。
実施例１の未処理のもの（０パス）は、独立した粒子状であった。各粒子は、表面が滑らかで、豆形を扁平にしたような形状からなっていた。各粒子の形状は、粒子間で差異がなく、ほぼ均一な形状であった。また、各粒子は、相互に付着せず、独立していた。
１パスから３パスにパス数が増えるに従い、各粒子の表面には、突起や、突起で他の粒子と付着している様子が観察された。また、５パスでは、隣接する粒子同士で付着、連結している箇所が多く見られた。隣接する粒子同士での付着、連結は、５パスから２０パスにパス数が増えるに従い、増加して、２０パスでは、単独で孤立して存在している粒子が殆ど見られなくなった。また、１パス〜２０パスのいずれにおいても、パラミロン粒子の径が、未処理のパラミロン粒子よりも細粒化しているものは観察されず、パラミロン粒子の微細化は起こらなかった。

【0035】

水不溶物と水を混合した流体を、超高圧で細孔ノズルから高圧で噴出させて被衝突物に衝突させる処理は、通常、固体の粉砕、分散や、水と油の乳化、エマルジョンの微細化等に用いられているが、パラミロンにこの処理を施した場合には、驚くべきことに、微粒化や粉砕は起こらず、かえって、パラミロン粒子同士の付着、連結が起こっていた。

【0036】

◎ 粒度分布の測定
サンプリングした実施例１，対比例１の処理物（０，１，３，５，１０，２０パス）を、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置（堀場製作所，LA-960）にて、粒度分布を測定した。
実施例１の粒度分布の測定結果を、表１及び図６に示す。

【0037】

【表1】

【0038】

図６に、超音波分散時間０分の場合の実施例１の各サンプルの粒度分布を示す。
未処理（０パス）では、2.599μmにピーク（頻度7.554%）が一つ見られたが、１パスでは、3.010μm（頻度3.010%）と11.565μm（頻度6.743%）、３パスでは、0.877μm（頻度2.131%）、19.904μm（頻度6.574%）に、それぞれ二つのピークが検出された。
また、５パス以上になると、再びピークは一つになって、５パスでは、22.797μm（頻度10.861%）、１０パスでは、26.111μm（頻度10.352%）、２０パスでは、22.797μm（頻度10.348%）であった。
このように、メジアン径及びピーク径共に、１０パス，３０パスの処理物は、未処理物の１０倍程度になっていた。

【0039】

図７に、超音波分散時間１分の場合の実施例１の各サンプルの粒度分布を示す。
未処理（０パス）では、0.259μm（頻度1.603%）と1.981μm（頻度8.967%）、１パスでは、0.296μm（頻度1.212%）と2.599μm（頻度7.620%）のそれぞれ二つのピーク、３パスでは、1.981μm（頻度5.856%）、５パスでは、1.981μm（頻度5.763%）のそれぞれ一つのピーク、１０パスでは、0.197μm（頻度3.209%）と1.981μm（頻度9.325%）、２０パスでは、0.296μm（頻度2.005%）と1.729μm（頻度7.455%）のそれぞれ二つのピークが検出された。
このように、メジアン径及びピーク径共に、未処理（０パス）から３０パスの処理物まで、粒子径に殆ど差がなかった。
超音波分散前の１〜２０パスの処理物のメジアン径が、７〜２３μｍまで大きくなっていたのに対し、その後１〜２０パスの処理物に超音波分散処理を１分施したものでは、メジアン径が１．３〜１．９μｍまで小さくなっており、未処理の超音波分散前のものよりもメジアン径が小さくなっていた。
従って、本実験例より、実施例１の１〜２０パスの処理物は、パラミロンの構造自体が変化してパラミロン同士が化学結合等しているのではなく、個々のパラミロン粒子が、超音波分散によって分離される程度の弱い力で、凝集している又は表面同士が付着していることが分かった。

【0040】

◎ 実験例１の考察
パラミロン処理物は、パス回数が高くなるのに伴い、粘性が高くなっていた。
静置観察では、５パス以上のパス数のパラミロン処理物が、水中で沈殿せず、パラミロン処理物の単相からなっていた。パラミロンに水が結合し、パラミロンが水分子中に分散していることが観察された。
また、光学電子顕微鏡による観察では、パラミロン粒子の大きさ自体は、パス数が増加しても大きな変化はないが、パラミロン粒子表面が滑面から粗面に変化し、パラミロン粒子同士が相互に付着している様子が観察された。
粒子径の測定においては、１０パス、３０パスの粒子径のメジアン径及びピーク径が、未処理のものの１０倍程度に大きくなっていたが、超音波分散処理を経たものでは、未処理から３０パスに至るまで、メジアン径及びピーク径に大きな変化はなかった。
以上より、１パス以上のパラミロン処理物は、パラミロンに水が結合して、パラミロン粒子の表面が粘性になり、パラミロン粒子が相互に付着していた。パラミロン処理物は、粘性が向上し、糊のような状態になっていた。
１パス以上ではパラミロンを構成する糖鎖の一部が変化し、クモの巣状の構造を形成し、パラミロン粒子が相互に結合する様子が観察された。また、さらに加工処理を加える事でクモの巣状の構造は消失し、２０パスでは、パラミロンの粒同士が結合した状態になった。

【0041】

（実験例２）
本実験例では、結晶性のパラミロン粉末の量を増量してスケールアップし、上記実施形態の加工パラミロンの製造方法に沿って処理することにより、実施例２の加工パラミロンを作製し、物性の確認を行った。

【0042】

まず、結晶性のパラミロン粉末（株式会社ユーグレナ製）２ｋｇに、イオン交換水１８ｋｇを加え、パラミロン濃度が１０ｗｔ％のパラミロンスラリーを得た。
湿式微粒化装置（スターバースト１８ＫＷ中型機，株式会社スギノマシン製，斜向衝突チャンバ−）の装置回路内をイオン交換水に置換した。
本実験例で用いた湿式微粒化装置は、超高圧に加圧した原料同士を、相互に角度を持って配置された細孔ノズルから噴出させて斜向衝突により噴流衝突させることにより、分散・粉砕・乳化・表面改質・劈開等を行う装置である。
装置のノズルを加圧して、パラミロンスラリーを回路内に供給し、初期吐出液を、回路内デッドボリュームとして廃棄した。その後、相互に角度を持って対向する一対のノズルからパラミロンスラリーの噴流をそれぞれ噴出させて、相互に衝突させる斜向衝突による噴流衝突を行った。流出路からスラリー処理物を回収して、１パスとした。このときの処理圧力は、２４５ＭＰａ，スラリー処理量は、２４０ｍＬ，ノズル径は、０．１７ｍｍとした。
この処理を４０回繰り返して４０パスの処理を行い、０，１，３，５，１０，１５，２０，３０，４０パス処理後の処理物（実施例２）をそれぞれ５０ｍＬサンプリングして、粒度分布の測定を行った。
処理中、５パス処理後付近から原料の増粘傾向があり、原料タンクから処理用のパラミロンスラリー原料が落ちてこなくなったため、ポンプを用いた循環処理にて処理を行った。その後７パス付近からは粘度は一定であった。

【0043】

◎ 粒度分布の測定
サンプリングした実施例２の処理物（０，１，３，５，１０，１５，２０，３０，４０パス）を、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置（堀場製作所，LA-960）にて、粒度分布を測定した。
実施例２の粒度分布の測定結果を、表２に示す。

【0044】

【表2】

【0045】

スケールアップして、噴流衝突により行った実施例２では、１パスのみでメジアン径が５倍以上に増加し、３パスでは１０倍以上のメジアン径になっていた。

【0046】

（実験例３）
実施例２の加工パラミロンの機能性を確認するために、実施例２の加工パラミロンの関節リウマチに対する作用について、マウスのコラーゲン関節炎モデルを用いて評価を行った。
実験用の動物には、マウス（DBA/1J Jms Slc（SPF），6週齢雄，日本エスエルシー株式会社）を使用した。
ニワトリII型コラーゲン（SIGMA）を0.01 M 酢酸水溶液に2mg/mLとなるように溶解し，これに等量のFreund’s complete adjuvant（Difco）を加えて作製したエマルジョン（コラーゲン1 mg/mL）を、イソフルランによる吸入麻酔下で，マウスの尾根部に0.1 mL（コラーゲン量として0.1 mg）皮内投与し、コラーゲンに感作させた。また、３週間後，同様に投与を行い、ブーストとした。また、無処置動物には、感作及びブーストは行わなかった。

【0047】

マウスを、無処置動物群、対照群、加工パラミロン群に群分けした（各群ｎ＝５）。固型飼料CE-2（日本クレア株式会社）に実施例２の加工パラミロンを２％混餌し、加工パラミロン群のマウスに、ブースト５日後から毎日経口で自由摂取させた。

【0048】

コラーゲンに感作させた日（以下、「感作日」という。）より、四肢における関節炎の症状について、肉眼観察によりスコア付を行い、四肢のスコアの合計値を算出した。
スコア付は、垣本ら（新生化学実験講座12，分子免疫学II，東京化学同人：360-372，1989．）のスコアに準じて、表３の関節炎スコアに従って、３回/週（月・水・金）の頻度で評価を行い、四肢のスコアの合計値を算出した。

【0049】

【表3】

【0050】

関節炎スコアの測定結果を図８に示す。
スコア測定最終日において、対照群と比較して加工パラミロン群は、有意に低値となり、加工パラミロンを継続摂取することによる関節炎症状の抑制が認められた。
以上より、本発明の一実施例である加工パラミロンに、関節炎症状の抑制という有用な機能があり、関節炎症状抑制剤、関節炎治療剤、関節リウマチ治療剤、関節リウマチ予防剤、関節リウマチ抑制剤として用いることができることが分かった。

【符号の説明】

【0051】

ｄ，ｄ´ 吐出方向
１ 圧力容器本体
２ ヘッド部
３ 被衝突体
４ 流出路
２１，２１´ ノズル
２２，２２´ 流路

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】