特許 6192007 マイクロデバイス及びバイオアッセイシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6192007

(24)【登録日】2017年8月18日

(45)【発行日】2017年9月6日

(54)【発明の名称】マイクロデバイス及びバイオアッセイシステム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20170828BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20170828BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20170828BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00

   C12M1/34 A

   G01N37/00 101

【請求項の数】6

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2013-157665(P2013-157665)

(22)【出願日】2013年7月30日

(65)【公開番号】特開2015-27266(P2015-27266A)

(43)【公開日】2015年2月12日

【審査請求日】2016年6月14日

(73)【特許権者】

【識別番号】502100415

【氏名又は名称】マイクロ化学技研株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】501061319

【氏名又は名称】学校法人 東洋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100101247

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 俊一

(72)【発明者】

【氏名】田澤 英克

(72)【発明者】

【氏名】金子 律子

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−１１０５２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０２３７１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１７９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０３５１１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Micromechanics and Microengineering，２００６年，Vol.16，p.419-424

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培地もしくは薬液の潅流中で細胞を培養するためのマイクロチップを有する培養部と、培地もしくは薬液に含まれる気体の少なくとも一部を捕捉するためのマイクロデバイスとを備えるバイオアッセイシステムであって、
該マイクロデバイスは、
培地もしくは薬液流入口と、
培地もしくは薬液流出口と、
該流入口と流出口との間に備えられた、疎水性表面を有する多孔質の隔壁を備え、
該マイクロデバイスは該培養部の上流に設置されることを特徴とする、バイオアッセイシステム。

【請求項2】

該隔壁の断面積が、培地もしくは薬液供給流路の断面積の１．１〜１００倍である、請求項１記載のバイオアッセイシステム。

【請求項3】

該隔壁の疎水性表面が、ポリオレフィン系樹脂、ポリエーテル系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリ（メタ）アクリレート系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリイミド系樹脂、フッ素系樹脂、及びシリコーン系樹脂からなる群より選ばれる少なくとも一種の疎水性ポリマーから成ることを特徴とする、請求項１又は２記載のバイオアッセイシステム。

【請求項4】

該隔壁が、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフロロエチレン、及びポリエーテルエーテルケトン／ポリテトラフロロエチレンアロイからなる群より選ばれる少なくとも一種から成る、請求項３記載のバイオアッセイシステム。

【請求項5】

該隔壁の細孔径が０．１μｍ〜２０μｍである、請求項１〜４のいずれか１項記載のバイオアッセイシステム。

【請求項6】

培地もしくは薬液供給用流路及び試料供給用流路のいずれか一方を培養部につなぐ流路切り替えバルブをさらに備える、請求項１〜５のいずれか１項記載のバイオアッセイシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、創薬やバイオテクノロジーの研究に使われ、特に細胞を培養しその機能や応答を評価する際に用いられる、マイクロデバイス及びバイオアッセイシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、微細加工技術を応用した、マイクロチップと呼ばれる細胞培養用のデバイスの開発が進んでいる。該デバイスは、ガラス、シリコンウェハー、PDMSもしくはその他樹脂基板内に作製されたマイクロ流路を備え、該流路内に培地をμＬ／分のオーダーの流速で流しながら細胞を培養する。サンプルや試薬および廃液の微量化が可能であるとともに、反応部の比界面積が大きいため、細胞の応答を効率よく行うことが可能である。また、培養部もしくは流路下部に測定器を設置することにより、リアルタイムでの評価を可能としている。

【0003】

マイクロチップを用いた実験で、最も大きい問題の一つが、培地中に含まれる気体の一部がマイクロ流路内において気泡となって、流路を塞いだり、培養された細胞をマイクロチップから剥がしてしまうということである。

【0004】

これを解決するために、マイクロ流路の上側に、端部が大気に開放された撥水性の表面を有する複数の孔を備える気泡分離部を設ける方法（特許文献１）、マイクロチップに液体を供給する供給部に、貯留されている液体の液面より高い位置から液体を滴下させて、液面の上側に空気を除いて脱気する脱気部を備える方法（特許文献２）、及び培地供給用流路と連通したチャンバーを設け、該チャンバー内で培地中の泡をチャンバー上方へと移動させて流路から除く方法（特許文献３、特許文献４）等が提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開2006-223118号公報

【特許文献2】特開2011-163939号公報

【特許文献3】特開2013-106595号公報

【特許文献4】特開2008-82961号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記第１の方法は、孔表面の接触角や、孔の大きさの制御が難しい。第２及び第３の方法は、共に一定量の液体を貯留する必要があり、流路の内部容積を大きく増加させるため、マイクロ流路で実験する効果が損なわれるだけでなく、該貯留部の加工も複雑である。

【0007】

そこで、本発明は流路の内部容積を大きく増加させることなく、且つ、加工も容易である、マイクロ流路での泡の発生を防止するためのマイクロデバイス及び該マイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

即ち、本発明は、マイクロチップ内での細胞培養において、培地もしくは薬液に含まれる気体の少なくとも一部を捕捉するためのマイクロデバイスであって、
培地もしくは薬液流入口と、
培地もしくは薬液流出口と、
該培地もしくは薬液流入口と流出口の間に備えられた、疎水性表面を有する多孔質の隔壁を備えることを特徴とする、マイクロデバイスである。

【0009】

また、本発明は、上記マイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムである。

【発明の効果】

【0010】

本発明は、泡を流路外へと除き、もしくは泡貯留部を別途設けることなく、隔壁に付着等させた状態で流路内に維持し続ける点で、従来技術の方法と異なる。培地供給流路内に隔壁を導入するだけなので、加工も容易であり、且つ、内部容積が大きく増えることもない。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明のマイクロデバイスの一態様を示す断面図である。

【図2】本発明のマイクロデバイスの他の態様を示す断面図である。

【図3】本発明のマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの概略図である。

【図4】本発明のマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの斜視図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。図中同一の機能又は類似の機能を有するものについては、同一又は類似の符号を付して説明を省略する。但し、図面は模式的なものであるので、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

【0013】

図１は、本発明のマイクロデバイスの一態様の、培地もしくは薬液（以下、まとめて「培地」という）流路に直角方向の断面図である。該マイクロデバイス１０は培地流入口１０ａと、培地流出口１０ｂと、疎水性表面を有する多孔質の隔壁１１とを備え、培地が図上方の矢印の方向に流れる。本態様では、培地流入口１０ａ及び流出口１０ｂの口径は培地流路の口径と略同じであり、例えばフェラルを用いて、デバイス１０を培地流路に接続することができる。或いは、培地流路に隔壁１１を接着して、デバイス１０がバイオアッセイシステムと一体化された形態としてもよい。図１において、白丸は気泡を、中黒丸は何等かの不溶性夾雑物を模式的に表す。同図は、隔壁１１の培地流入口側表面に付着されている様子を概念的に表しているが、必ずしも表面である必要はなく、内部であってもよい。驚くことに、泡を流路外へと除き、もしくは泡貯留部を別途設けずとも、培養部での気泡の発生を防止できることが確認された。

【0014】

図２は、隔壁１１の断面積が培地流路の断面積よりも大きい場合の態様を示す断面図である。このように隔壁１１の断面積を広くして、培地の流れを広げることによって、培地流体の圧力が低下し、気泡が放出され易くなる効果がある。但し、培地供給用流路の内部容積を増やさないことが好ましいので、隔壁１１の断面積は、培地供給流路の断面積の１．１〜１００倍が好ましく、１０〜７０倍であることがより好ましい。また、隔壁１１の断面形状は、必ずしも円形である必要はなく、例えば四角形等、任意の形状であってよい。また、図２において、培地流入口１０ａと隔壁１１との距離、及び、隔壁１１の距離と培地流出口１０ｂとの距離は、隔壁１１を固定することができる最も短い距離とすることが好ましい。

【0015】

隔壁１１は、疎水性表面を備え、これにより培地内に存在し、もしくは溶存されている気体の少なくとも一部を泡として捕捉して下流に流れないようにすることができる。そのような疎水性表面は、例えばポリオレフィン系樹脂、ポリエーテル系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリ（メタ）アクリレート系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリイミド系樹脂、フッ素系樹脂、及びシリコーン系樹脂からなる群より選ばれる疎水性ポリマーで構成することができる。隔壁全体が疎水性ポリマーである必要はなく、疎水化処理によって、疎水性ポリマー層が表面に形成されたステンレス、チタン等の金属、ガラスもしくはセラミックを用いることもできる。微細加工が可能で、使い捨てもできる点から、好ましくは、環状ポリオレフィン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、ポリテトラフロロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン／ポリテトラフロロエチレンアロイ（ＰＡＴ）、又はポリジメチルシロキサン等の疎水性ポリマーの多孔質体が使用される。

【0016】

隔壁１１の細孔径は０．１μｍ以上であることが好ましく、２μｍ以上であることがより好ましい。孔径が前記下限値未満であると、流体抵抗が高くなる傾向がある。細孔径の上限については特に限定はないが、培地に混入する可能性がある夾雑物を除去する点で、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましい。

【0017】

デバイス１０は、培地流路を形成する管状素材、例えばPEEK（ポリエーテルエーテルケトン）に隔壁１１を接着するか、隔壁１１を、培地流入口側と流出口側との双方側から挟んでネジ等により両側から押し付けて固定する手段を用いて作ることができる。接着には、各種接着剤、例えばＵＶ硬化性樹脂からなる接着剤を用いることができる。また、押し付けて固定する手段としては、例えば市販のフィルターホルダー、又はコネクターを用いることができる。

【0018】

本発明のマイクロデバイス１０は、例えば図３に示すバイオアッセイシステム１において好適に用いられる。同システムにおいて、ポンプ３３によって、培地が培地供給用流路Ｌ３、マイクロデバイス１０、次いで流路Ｌ２を経由して、マイクロ流路２１ａが表面に形成された基板（マイクロチップ）２１を備える培養部２０へと送られた後、廃液流路Ｌ４を通って、廃液回収部３５で回収される。培地の流速は、通常１０μＬ/分以下、好ましくは１μＬ/分以下である。

【0019】

一方、細胞等の試料は、例えばシリンジ３１から試料供給用流路Ｌ１を経由して培養部２０へと送られる。培地供給用流路Ｌ３及び試料供給用流路Ｌ１は、流路切り替えバルブ１３によって、いずれか一方が培養部２０につながれる。該流路切り替えバルブ１３は、隔壁１１を通過した培地の流入口、試料流入口、及び流出口の少なくとも３つのポートを備え、バルブを切り替えていずれかの流入口ポートと流出口ポートとをつなぐことによって、内部流路が形成されるようになっていれば、任意の形態のものを使用することができる。内部容積を少なくするため流路内径が０．０５〜０．８ｍｍ程度のバルブを使用することが好ましい。

【0020】

マイクロデバイス１０は、流路切り替えバルブ１３と一体化されていてもよく、この場合隔壁１１は流路切り替えバルブ１３と培地流入口１０ａの間に備えられ、培地流出口１０ｂが、切り替えバルブ１３の一ポートと接続される。

【0021】

図４は、隔壁１１と流路切り替えバルブ１３とが一体化されたマイクロデバイスを備えるバイオアッセイシステムの斜視図である。隔壁は流路切り替えバルブ１３と培地供給用流路Ｌ３との間の、図中１１で示す位置に内蔵されている。基台６０上に配置された培養部２０は、基板２１と、基板２１上に配置されたマイクロ流路２１ａに対応する箇所に開口部が設けられたフレーム状の固定具２３と、固定具２３を基台６０に取り付ける複数のネジ２７ａ…２７ｄとからなる。固定具２３の淵には、マイクロ流路２１ａにつながる複数の液供給口２９ａ、２９ｂ、…２９ｈを供える。なお、マイクロ流路２１ａの経路パターンは、直線状に制限されることなく用途に応じて種々のパターンを用いることができる。

【0022】

基板２１の材質については、細胞培養に悪影響を与えるものでなければ特に制限はされず種々の材料を用いることができる。一般的にはガラス、シリコンウェハー、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンポリマー、ポリスチレン等の樹脂を用いることができる。マイクロ流路２１ａの内径は細胞の大きさを考慮すると、直径１ｍｍ以下が好ましく、特に１００〜５００μｍが望ましい。

【0023】

本実施形態に使用できる細胞の種類は、マイクロ流路に接着する性能を持つ細胞であれば特に限定はされない。

【0024】

また、薬剤アッセイなどで刺激物を投与する場合、培地供給用流路Ｌ３を他のチューブに差し替え、薬剤の入っているシリンジを接続することにより溶液交換を行うことができる。

【0025】

他の態様において、バイオアッセイシステムは、並列に配置された複数の流路切り替えバルブ１３を備えても構わない。また培養部２０と流路切り替えバルブ１３の間にさらに流路切り替えバルブ１３を直列に配置しても構わない。培養部２０への通液をより確実に止めることができるからである。また培養部２０の廃液流路Ｌ４側にもマイクロデバイス１０を設けても構わない。

【0026】

［実施例］
本発明のマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムを用いて、以下の手順により、RF/6A135細胞を培養した。

【0027】

（イ）図２に示すマイクロデバイスを備える、図３に示すバイオアッセイシステムを用意した。隔壁１１は、ポリエーテルエーテルケトン製のフリット（商品名：アップチャーチ社フリット A-706）から成り、内径0.64ｍｍ、厚み0.16ｍｍであり、隔壁１１と培地供給用流路の断面積比は64:3であった。これを、培地供給用流路にコネクターによる押し付けによって固定した。
流路切り替えバルブ１３としては、フッ素樹脂を用いて製造したものを用いた。
マイクロチップ２１としては、幅０．３ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ６０ｍｍの直線状チャネルを持ち、チャネル内はコラーゲンにて予めコーティングしたものを用いた。

【0028】

（ロ）次に、試料供給用流路Ｌ１と流路Ｌ２が繋がるよう、マイクロデバイス１０の流路切り替えバルブ１３が所定の位置にあることを確認した後、試料供給用流路Ｌ１より１０^６個/ｍＬ程度の濃度の細胞懸濁液を、流路切り替えバルブ１３を介して基板２１に注入した。注入後、細胞を２時間静置することにより細胞をチャネル壁面に接着させた。

【0029】

（ハ）細胞がチャネル壁面に接着したのを確認した後、マイクロデバイス１０の流路切り替えバルブ１３が所定の位置にあることを確認して、培地供給用流路Ｌ３に繋がれているポンプ３３を用いて培地を０．１μＬ/分の流速で灌流させた。４８時間後、マイクロチップ２１を観察したところ、気泡は認められなかった。

【0030】

［比較例］
マイクロデバイス１０を備えないことを除き、実施例と同じバイオアッセイシステムを用いて、培地を０．１μＬ/分の流速で潅流して、RF/6A135細胞を培養した。約１時間後、マイクロチップ内に気泡が確認され、RF/6A135細胞の剥がれが観察された。

【産業上の利用可能性】

【0031】

本発明によれば、マイクロチップを用いた細胞培養において培地もしくは薬液を培養部に通液する際に、気泡や夾雑物の流入を防止することができるマイクロデバイス及びバイオアッセイシステムが提供される。

【符号の説明】

【0032】

１：バイオアッセイシステム
１０：マイクロデバイス
１１：隔壁
１３：流路切り替えバルブ
２０：培養部
２１：基板（マイクロチップ）
２１ａ：マイクロ流路
３１：シリンジ
３３：ポンプ
３５：廃液回収部
Ｌ１：試料・薬液供給用流路
Ｌ２：流路
Ｌ３：培地供給用流路
Ｌ４：廃液流路

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】