特許 6192018 三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6192018

(24)【登録日】2017年8月18日

(45)【発行日】2017年9月6日

(54)【発明の名称】三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方を検出するペプチドおよび抗体検査材料

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20170828BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170828BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20170828BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20170828BHJP

   C08F 220/28 20060101ALI20170828BHJP

   C08F 220/36 20060101ALI20170828BHJP

   C08F 8/32 20060101ALI20170828BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 A

   G01N33/53 N

   G01N33/545 Z

   C07K7/08ZNA

   C08F220/28

   C08F220/36

   C08F8/32

【請求項の数】7

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-545677(P2014-545677)

(86)(22)【出願日】2013年11月1日

(86)【国際出願番号】JP2013079666

(87)【国際公開番号】WO2014073464

(87)【国際公開日】20140515

【審査請求日】2016年10月28日

(31)【優先権主張番号】特願2012-244637(P2012-244637)

(32)【優先日】2012年11月6日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度 独立行政法人科学技術振興機構（現 国立研究開発法人科学技術振興機構） 研究成果展開事業 研究成果最適展開支援プログラム フィージビリティスタディステージ探索タイプ「三日熱マラリアへの感染履歴や流行地調査に有効な抗体価検査キットの開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504145364

【氏名又は名称】国立大学法人群馬大学

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(72)【発明者】

【氏名】奥 浩之

(72)【発明者】

【氏名】北村 慎也

(72)【発明者】

【氏名】山田 圭一

(72)【発明者】

【氏名】狩野 繁之

(72)【発明者】

【氏名】矢野 和彦

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 奥浩之ほか，凝集反応による抗マラリア原虫抗体検出を目的としたペプチド抗原担持ナノ微粒子の開発，日本熱帯医学会大会プログラム抄録集，２０１１年１１月 ４日，Vol.52nd，P.165

【文献】 奈良武司，感染症診断の迅速化をめざして−感染症検査のPOCTを中心に 2)迅速キットの実際【原虫】マラリア，臨床と微生物，２００７年１０月３１日，Vol.34 増刊号，P.616-618

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする、マラリア原虫の抗体検査材料。

【請求項2】

熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の抗体検査用である、請求項１に記載の抗体検査材料。

【請求項3】

ペプチドが、担体に固定化されている、請求項１又は２に記載の抗体検査材料。

【請求項4】

担体が、下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応により得られる重合体である、請求項３に記載の抗体検査材料。

【化1】

Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリ
ル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていても良い。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項の抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか一項の抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれか一項の抗体検査材料を、マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、マラリア原虫感染症の検査方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マラリア原虫を検出するペプチド、特に、三日熱マラリアと熱帯熱マラリアの双方の抗体価を測定するためのペプチド抗原及び同ペプチドを含む抗体検査材料に関する。より詳しくは、ヒトおよび他の動物の血液試料中の三日熱マラリア原虫と熱帯熱マラリア原虫の双方に対する抗体に結合することができるペプチド及び同ペプチドを含む抗体検査材料に関する。

【背景技術】

【0002】

マラリアは最新の報告WHO World Malaria Report 2011 (非特許文献１)によると、2010年に2億1600万人の、罹患者と65万5千人の死亡者数が推定されている。死亡者の内91%がアフリカ地域からの報告であり、さらに86%は5歳未満の子どもたちである。地球規模での対策が進むことで、2000年の罹患者数や死亡者数より、17%、26%とそれぞれ大きく減少した。マラリアは、発展途上国のみならず経済的に急速に新興しつつあるインド、中国、ブラジル、タイなどでも広い流行地域を抱えている。従って、流行対策の進みつつある現在でも、マラリアは世界で最も主要な感染症の一つとなっている。
わが国では、マラリアは全数届出が義務づけられている4類感染症に指定されている。1959年に土着のマラリアは制圧されたが、その後わが国の経済成長によって人の移動が盛んになり、日本人渡航者が流行地で感染する例や、流行地から日本への入国者が国内で、発症する“輸入マラリア”の症例が1980年代から急増した。そして2000年には最多の154例の報告があったが、現在は渡航者のマラリア予防知識の普及などにより、年間50-60症例に抑えられている。また隣国の韓国では、いったん制圧された“土着マラリア”が再興し、2000年には4000症例まで増加、現在でも年間1000-2000症例で推移している。韓国から日本への輸入マラリア症例も報告されている(非特許文献２)。よってマラリア対策は流行地のみならず、日本国の水際でも重要な課題となっている。

【0003】

ヒトにマラリアを引き起こすPlasmodium属の寄生原虫は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、および一部のサルマラリア（Plasmodium knowlesi）の５種類である。原虫を媒介する蚊の刺咬により体内に入ったマラリア原虫は血中から速やかに肝細胞に侵入し（一次肝臓内ステージ）、肝細胞内で分裂・増殖してから血中に放出され、赤血球内に侵入して分裂増殖を繰り返し（赤血球内サイクル）、増殖した原虫は他の蚊によってさらに伝搬されてゆく。マラリアによる発熱の症状は赤血球内サイクルによって引き起こされる。特に熱帯熱マラリアは他の４種に比較して治療が遅れると重症化と死亡の危険をもたらす。

【0004】

またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。流行地に於ける近年の感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告（1996 & 1998）によると地球温暖化の場合２℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。そのため、第二次大戦後にDDT散布と衛生対策によって根絶したはずの日本を含む温帯地域においても、マラリア再流行が懸念されている。
したがって、マラリア感染を検出したりマラリアワクチンの効果を確かめたりするための血清抗体価を簡便に測定できる試薬の開発が求められている。

【0005】

世界的に用いられている方法として、マラリア患者血清／血漿中のマラリア原虫抗原への抗体価の検出は、IFAT法やELISA法で測定される。しかし抗原の調整や作業は繁雑であり、一般の病院検査室では簡単には実施できない。ELISA法による市販検査キットもあるが非常に高価なため（米国DRG International社、１検体50ドル）普及しているとは言い難い。従ってマラリア流行地の病院であっても、非流行地のトラベルクリニックであっても、精密な測定機器を必要とせずに、安価（１検体１〜２ドル）で簡便に抗体価測定が可能な技術開発は広く望まれている。

【0006】

マラリアの感染履歴を測定するキットは、例えばフィリピン国内（パラワン島など）におけるマラリア感染のコントロールや流行の無くなりつつあることの証明のために大量に必要とされている。しかし測定キットが大変高価なために現在でもIFAT法が用いられている。この方法もおよそ１日の検査用スライドグラス作製と蛍光顕微鏡観察を要する。蛍光顕微鏡も大変高価（１台数百万円）であるため、一度の流行地調査で１００名程度の観察が行われるにすぎなかった。

【0007】

簡易検査キットを目指した研究例もあるが実用化されていない。これは培養した熱帯熱マラリア原虫の抗原を物理吸着したラテックス（ポリスチレン微粒子）と患者血清の反応を顕微鏡観察する、やや古い方法で行われている（非特許文献３）。同様の研究は群馬大学医学部寄生虫学教室と保健学科応用検査学教室において鈴木守、佐藤久美子（１９８０〜９０年代）らによって長い間に試みられてきた。しかしマラリア感染歴の無い正常血清への反応と区別が難しいために実用化されていない。すなわちこの方法は研究のみで実用化に適していない。

【0008】

これまでに、本発明者は、マラリア原虫由来の抗原を用いたマラリア感染診断材やマラリアワクチン（特許文献１）、マラリア抗原ペプチドの製造法（特許文献２）、マラリア抗原を内包させた微粒子の製造法（特許文献３）を報告している。
しかしながら、マラリア感染症の現在の感染状況及び最近の感染履歴を測定できる、すなわち、流行地調査などを目的として、簡易検査キットに用いる新しい抗原が、さらに求められていた。
マラリアに対する抗原として、マラリア原虫種内で配列がよく保存されていて抗原変異の少ない蛋白質のペプチドを用いることが知られている。抗体を生成するための抗原として、Lactate Dehydrogenase（LDH、乳酸脱水素酵素）ペプチドが知られている（非特許文献４，５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許公開2002-371098

【特許文献2】WO2006/035815

【特許文献3】特許公開2009-256324

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】World Health Organization. Impact of malaria control. World Malaria Report 2011. Geneve: WHO Press, 2011: pp.51-78.

【非特許文献2】Iwagami M，Itoda I，Hwang SY，Kho WG，Kano S. Plasmodium vivax PCR genotyping of the first malaria case imported from South Korea into Japan. J Infect Chemother. 2009; vol. 15: pp. 27-33.

【非特許文献3】Anal. Chem. 2007, 79, 4690-4695

【非特許文献4】Peptides 31 (2010) 525-532

【非特許文献5】Immunobiology 2006; 211: 797-805

【発明の概要】

【0011】

本発明は、マラリア原虫の抗体検査材料として使用できる、新規抗原ペプチドを提供することを課題とする。

【0012】

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを抗原ペプチドとすることにより、マラリア原虫の抗体価を効率よく測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0013】

すなわち、本発明は以下を提供する。
＜１＞配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする、マラリア原虫の抗体検査材料。
＜２＞熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫の抗体検査用である、＜１＞に記載の抗体検査材料。
＜３＞ペプチドが、担体に固定化されている、＜１＞又は＜２＞に記載の抗体検査材料。
＜４＞担体が、下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応により得られる重合体である、＜３＞に記載の抗体検査材料。

【0014】

【化1】

【0015】

Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていても良い。
＜５＞＜１＞〜＜４＞のいずれかの抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。
＜６＞＜１＞〜＜４＞のいずれかの抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。
＜７＞＜１＞〜＜４＞のいずれかの抗体検査材料を、マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。

【0016】

本発明の新規抗原ペプチドを用いることにより、マラリア原虫の抗体価を効率よく測定することができる。
本発明の新規抗原ペプチドは、特に感染者の多い熱帯熱マラリアと三日熱マラリアの現在の感染状況及び最近の感染履歴を測定できるタイプの抗原ペプチドである。本発明の新規抗原ペプチドは、過去の（古い）マラリアの感染履歴の影響が少なく、流行地においてもマラリア感染ではない熱発患者（マラリアの疑いがある患者）と、熱帯熱マラリアと三日熱マラリアの感染患者とを判定することが可能である。したがって、流行地調査などを目的とした、簡易検査キットに用いることも可能である。
本発明の新規抗原ペプチドは、高分子ナノ微粒子に固定化することが可能であり、マラリア原虫の抗体価を効率よく測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】熱帯熱マラリア原虫由来LDH及び三日熱マラリア原虫由来LDHの構造の模式図である。図中、実施例で用いた人工抗原ペプチド（熱帯熱マラリア固有配列部分、三日熱マラリア固有配列部分、熱帯熱マラリア及び三日熱マラリアの共通配列部分）の配列及び位置を示す。

【図2】pLDH抗原（ロット２、粗生成物）のHPLCクロマトグラムを示す図である。図中のピークはそれぞれ、7.9 minが目的物、8.9 minは目的物に脱水反応の起きた化合物と帰属される。

【図3】pLDH抗原（ロット２、SepPakによる固相抽出精製後の目的物）のHPLCクロマトグラムを示す図である。

【図4】pLDH抗原（ロット２、目的物）のESI-MSスペクトルを示す図である。（SepPakによる固相抽出精製によって、HPLC 7.9 minの目的物を単離した。）Calcd for [M+2H]²⁺, 1153.11; Found,1153.9.Calcd for [M+3H]³⁺ , 769.07; Found, 769.3.Calcd for [M+4H]⁴⁺ , 577.06; Found: 577.5.Calcd for [M+5H]⁵⁺ , 461.85; Found: 462.2.

【図5】pLDH抗原（ロット２、副生物）のESI-MSスペクトルを示す図である。（SepPakによる固相抽出精製によって、HPLC 8.9 minの目的物から水2分子が脱離した副生成物を単離した。）Calcd for [M-H₂O +2H]²⁺, 1135.78; Found, 1136.0.Calcd for [M-H₂O+3H]³⁺ , 757.57; Found, 757.6. Calcd for [M-H₂O +4H]⁴⁺ , 568.39; Found: 568.6.Calcd for [M-H₂O +5H]⁵⁺ , 454.92; Found: 454.9.

【図6】pLDH抗原のHPLCクロマトグラム（ロット１、粗生成物）を示す図である。図中のピークはそれぞれ、7.9 minが目的物、8.9 minは目的物に脱水反応の起きた化合物と帰属される。7.9 minと8.9 minより溶出時間の早い小さなピークがそれぞれ重なっている。これらは１８残基以下の欠損配列と帰属される。13-14 minのピークはArg残基の保護基が残っている生成物と帰属される。

【図7】LDHの部分ペプチド配列pLDHを抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血漿の抗体価の測定結果を示す図である。

【図8】ELISA法による、LDHの部分ペプチド配列pLDHを抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血漿の抗体価の測定結果（血清希釈率64倍）を示す図である。

【図9】ELISA法による、LDHの部分ペプチド配列pLDHを抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血漿の抗体価の測定結果（血清希釈率256倍）を示す図である。

【図10】熱帯熱マラリアLDH固有の部分ペプチド配列pfLDHを抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血漿の抗体価の測定結果を示す図である。

【図11】三日熱マラリアLDH固有の部分ペプチド配列pvLDHを抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血漿の抗体価の測定結果を示す図である。

【図12】熱帯熱マラリア原虫由来エノラーゼの部分ペプチド配列AD22を抗原として測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血清の抗体価の測定結果を示す図である。

【図13】人工抗原ペプチド（AD22）₄-MAPの分子構造を示す図である。

【図14】本発明の方法（pLDH微粒子）及び従来の方法（AD22微粒子）により、フィリピン流行地において採取された熱帯熱・三日熱マラリア混合感染患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す図である。

【図15】本発明の方法（pLDH微粒子）及び従来の方法（AD22微粒子）により、フィリピン流行地において採取された熱帯熱マラリア患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す図である。

【図16】本発明の方法（pLDH微粒子）及び従来の方法（AD22微粒子）により、フィリピン流行地において採取された、熱帯熱マラリア患者血清10例、三日熱マラリア患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す図である。

【図17】既存の診断法であるIFAT法（(a)Pf抗原、(b)Pv抗原への反応性）により測定した、フィリピンの流行地において採取されたマラリア患者及び熱発患者の血清の抗体価の測定結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の実施の形態について、説明する。
（１）マラリア原虫に対する抗体検査材料
本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする、すなわち、抗原ペプチドとする、マラリア原虫に対する抗体検査材料に関する。
本発明者らは、ヒトに感染する４種類のマラリア原虫種内では配列がよく保存されていて抗原変異の少ない蛋白質であるLactate Dehydrogenase（LDH、乳酸脱水素酵素）に着目して、抗原設計を行った。特に感染者の多い熱帯熱と三日熱マラリアの感染履歴を測定できるタイプの抗原ペプチドを探索した。その結果、三日熱マラリア原虫由来LDHと熱帯熱マラリア原虫由来LDHの共通配列部分ペプチド19残基（pLDH）（配列番号３）が得られたものである。
配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドとしては、配列番号３のペプチド並びに配列番号３のペプチドを構成するアミノ酸が置換、欠失および/また挿入することにより生成されるペプチド類縁体が含まれる。ペプチド類縁体とは、配列番号３のペプチドを構成するアミノ酸が置換、欠失および/また挿入され、免疫学的応答に関して本発明のペプチドと同様の活性を有するペプチドのことをいう。置換、欠失および/また挿入されるアミノ酸の個数は特に制限されないが、１〜３個が好ましく、１〜２個がより好ましい。
配列番号３のアミノ酸配列を含む抗原ペプチドは、好ましくは１９〜２１残基のペプチドが好ましい。
ペプチドは蛍光物質等で標識されたものでもよいし、非天然アミノ酸を含むものでもよい。

【0019】

本発明のペプチドは、本明細書によりその配列が明らかにされたため、同配列に基づいて、有機化学的方法、生化学的方法などいずれの合成方法によっても調製することができる。有機化学的方法により本発明のペプチド抗原を調製する方法としては、例えば、（1）本発明のペプチド抗原をいくつかの部分に分けて別個に合成し、それらを結合させることにより本発明のペプチド抗原を得る方法；（2）固相担体上にアミノ酸を順次結合して最後に切り出すことで本発明のペプチド抗原を得る方法；を使用することができ、これらについては本明細書の実施例中にて説明する。しかし、これらの方法に限定される訳ではなく、本発明の実施例で開示した方法以外の合成手順を用いて合成しても良い。例えば、ペプチド自動合成装置による本発明のペプチド化合物の合成など当業者が使用可能なペプチド合成法の何れを使用してもよい。

【0020】

本発明のペプチドは、生化学的方法（すなわち組換えDNA技術）によっても得ることができる。例えば大腸菌発現ベクターのプロモータ下流にマラリア原虫由来LDH遺伝子の全配列または部分配列をコードするDNAを挿入してなるLDHタンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌発現系を使用してLDHタンパク質を発現させることによって達成される。この発現ベクターは、公知の方法（例えば、Sambrook and Russel, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001)）にしたがって構築することができる。このベクターを用いて公知の方法に基づき大腸菌を形質転換させ、タンパク質を産生、回収、精製することにより、LDHの部分配列をもつペプチド化合物を得ることができる。

【0021】

また、微粒子に導入するペプチドは複数の配列が直線状または分岐鎖状に連結されたものでもよい。ペプチド配列の連結に使用し得るキャリアー分子の一例として、破傷風トキソイド、オボアルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニン等のような天然タンパク質が挙げられる。キャリアーがヘモシアニンである場合は、例えばBoquetらの方法（P. Boquet et al, Molecular Immunology (1988) vol. 19，pp. 1441-1549）によって、ペプチドおよびキャリヤーそれぞれのアミノ基同士をグルタールアルデヒドで結合させることもできる。例えばMAP（multiple antigenic peptide）またはリジンデンドリマーと呼ばれる合成高分子キャリアーも使用可能である。

【0022】

MAPまたはリジンデンドリマーと呼ばれる合成高分子キャリアーを用いた多量体ペプチドの合成は、例えばTam の方法が挙げられる（James P. Tam., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) vol. 85、 5409-5413）。公知の合成法により、βアラニン-システイン（S-アセトアミドメチル）のジペプチドを固定した樹脂にリジンをステップワイズに反応結合させることにより目的とする架橋体を調製することができる。すなわち、ジペプチドにリジンひとつの結合体は2量体の分岐ペプチドとして、さらにリジンを反応させて得られるリジン3残基の結合体は4量体の分岐ペプチドとして、さらにリジンを反応させて得られるリジン7残基の結合体は8量体の架橋体として使用することができる。また8量体はシステイン残基のアセトアミドメチル基をヨウ素で酸化的に脱保護し、ジスルフィド結合を形成させることでも得ることができる。これら架橋体に目的とするペプチドの構成アミノ酸を通常の方法により順次反応結合させることにより多量体ペプチドを合成することができる。

【0023】

抗LDH抗体と結合した本発明のペプチド抗原を、当該技術分野において既知の検出系、例えば蛍光ELISA法、凝集反応によるアッセイなど、を用いて検出できる。このことから、本発明のペプチド抗原は熱帯熱マラリア及び三日熱マラリア感染の免疫診断材料に利用することができる新規なペプチド抗原として使用できることがわかった。したがって、本発明のペプチド配列は、マラリア感染を診断するための診断材、特に、マラリア患者の血清抗体と、非常に反応しやすい人工抗原として有用である。

【0024】

本発明のペプチド抗原は、固相表面に結合させ、固定化し、若しくは吸着させることにより、免疫診断材料として提供することができる。ここで固相表面としては、例えばフィルム、ラテックス粒子、高分子微粒子、プラスチックプレートまたはマイクロビーズなどの固相表面が挙げられるが、これらには限定されない。例えば、高分子微粒子に結合した本発明の化合物は、以下に詳しく記載するように、凝集反応に使用することができる。

【0025】

（２）抗原固定化抗体検査材料
本発明は、本発明のペプチドが、下記化合物（I）と化合物（II）を重合反応により得られる重合体からなる担体に固定化されている、抗体検査材料に関する。

【0026】

【化2】

【0027】

Xはハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）または-OYを示し、ここでYは、アルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）で置換されていても良い。

【0028】

前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基及びｓｅｃ−ブチル基などの基が挙げられ；前記芳香族基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基及び２−ナフチル基などの基が挙げられ；前記ピリジル基としては、例えば、２−ピリジル基、３−ピリジル基及び４−ピリジル基などの基が挙げられ；前記キノリル基としては、例えば、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基及び８−キノリル基などの基が挙げられ；前記ベンゾオキサゾール基としては、例えば、２−ベンゾオキサゾール基などが挙げられ；前記ベンゾチアゾール基としては、例えば、２−ベンゾチアゾール基などが挙げられ；前記ベンゾトリアゾール基としては、例えば、１−ベンゾトリアゾール基などが挙げられる。これらのうち、フェニル基、３−ピリジル基、８−キノリル基、スクシンイミド基（OSu基）、２−ベンゾチアゾール基、及び１−ベンゾトリアゾール基（OBt基）が、活性エステルの活性がより高いという点で好ましい。

【0029】

重合方法は、通常のラジカル重合によって行うことができ、放射線（γ線）や重合開始剤を用いる方法が例示される。
重合開始剤としては、公知のラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)（ABCN）などを使用することができる。

【0030】

溶媒は、各化合物を溶解し、重合反応を進行させうる溶媒であればよいが、例えば、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酢酸、プロピオン酸、アセトン、メチルエチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、およびこれらの混合溶媒などが例示される。

【0031】

重合反応によって得られる微粒子の粒径は０．１〜１０μｍが好ましい。なお、化合物（I）、化合物（II）はそれぞれ複数種類重合に使用してもよい。

【0032】

微粒子表面へのペプチドの導入は微粒子の活性エステル基の-OYとペプチドのアミノ基の反応により行うことができる。ペプチドのアミノ基は末端のアミノ基でもよいし、側鎖のアミノ基でもよい。また、ペプチドの末端にリンカーやキャリアーを付加し、リンカーやキャリアーのアミノ基と結合させてもよい。
微粒子へのペプチドの導入割合は好ましくは重量比として０．０５〜２％である。

【0033】

（３）診断及び検査薬並びにキット
本発明は、本発明の抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬に関する。また、本発明は、本発明の抗体検査材料を含む、マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キットに関する。
本発明のペプチド配列は、特に熱帯熱マラリア及び三日熱マラリア感染マラリア患者の血清抗体と、非常に反応しやすい人工抗原であり、マラリア感染を検査又は診断するための検査薬又は診断薬及び検査キット又は診断キットとして有用である。
本発明の検査薬又は診断薬及び検査キット又は診断キットには、本発明の抗体検査材料以外に、緩衝液等、当業者に公知の検査薬又は診断薬及び検査キット又は診断キットに用いられている各要素によって構成することができる。

【0034】

（４）診断及び検査方法
本発明の抗体検査材料を用いることにより、試料中のマラリア原虫に対する抗体を検出することができる。
本発明の抗体検査材料により、例えば、被験者の血液試料中のマラリア原虫由来抗LDH抗体を検出でき、マラリアの診断・感染履歴の調査やワクチン投与後の抗体価維持の確認を検査する材料として利用することができる。
試料は、被験者の血液、血清、血漿等を使用することができる。

【0035】

検出方法は結合反応を検出する方法である限り特に制限されないが、ELISA法、凝集反応によるアッセイ、蛍光検出法、発光検出法、可視紫外吸光検出法、電気化学的検出法などが挙げられる。この中では、本発明のペプチド抗原を固定化した高分子微粒子を用いた凝集反応によるアッセイが好ましい。
ペプチド抗原が抗体と反応することにより微粒子が凝集し、目視により抗体の検出が可能である。

【0036】

検出できる抗体は、微粒子に導入されたペプチド配列への抗体（抗ペプチド抗体、例えば抗pLDH抗体）、またはこのペプチド配列を含む蛋白質（抗蛋白質抗体、例えばｐLDH配列を認識する抗Plasmodium falciparum LDH抗体、抗Plasmodium vivax LDH抗体）、さらにアミノ酸残基が変異した相同性のあるペプチド配列や蛋白質（近縁種の蛋白質やペプチド配列から作成された抗体）に対する抗体が挙げられる。

【0037】

アミノ酸残基が変異した相同性のあるペプチド配列の例としては、例えば近縁種の蛋白質に由来する配列、突然変異した蛋白質に由来する配列、相同性の高い（アミノ酸の相同性＞６０％）蛋白質に由来するアミノ酸配列が挙げられる。

【実施例】

【0038】

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。

【0039】

＜ポリマーの重合＞
下記化合物（i）（市販品、中村化学製）０．４ｇと化合物（ii）（メタクリル酸クロリドとHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）の反応生成物を使用）を０．１ｇを溶媒プロピオン酸エチル１０ｍＬ中、室温２５℃で３時間γ線照射下（３０ｋＧｙ）で反応させ、重合反応を行った。

【0040】

【化3】

【0041】

＜ペプチドの固定化＞
微粒子表面に結合させるペプチドは以下のものを用いた。
AD22（MAP化した分子量として1.4 kD）Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp（配列番号６）
この抗原ペプチド配列に基づき、(AD22)₄-MAP (MAP = multiple antigenic peptide)）（分子量1.4kD）（図１３）を、手動合成装置を用いて合成し、SepPack（waters社製の使い捨てＯＤＳカラム）にて精製した。

【0042】

＜ペプチドの導入＞
続いて、活性エステル基（スクシンイミド基）を介して300mgの微粒子表面に熱帯熱マラリア原虫の抗原ペプチド（比較例１：(AD22)₄-MAP）3mg）を化学結合させた検査材料を作製した。
このとき化学結合には３７℃４時間、さらに物理吸着に３７℃２０時間の条件にて反応させた。

【0043】

＜ペプチドが導入されたことの確認＞
上記ペプチドの化学結合に伴って遊離するHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）量をHPLCによってモニターすることで、反応の進行を確認した。

【0044】

＜凝集試験＞
国立国際医療研究センター研究所において保管されている熱帯熱マラリア患者血漿（Pf患者）、正常なボランティア血漿（正常）、熱発患者としてマラリア疑い採血を受けたが抗原検出迅速診断キットと顕微鏡によるスメアー観察から陰性と診断された患者血漿（熱発患者）を用いて凝集試験を行った。
９６穴プレートに、８個のウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１６〜２０４８倍希釈した被験者血清を５０μＬずつ、および１個のウェルにリン酸緩衝液のコントロールを５０μＬを加え、最後に上記微粒子を２５μＬ（0.1mg/mL）ずつ加えた。９６穴プレートを１分間振動撹拌後に、室温で８時間静置して反応させることで、凝集反応を検出した。
その結果、Pf患者と正常、Pf患者と熱発患者について一定の違いを表す陽性凝集像と陰性凝集像を得ることに成功した。

【0045】

さらに、フィリピンの流行地住民の血清（フィリピン大学公衆衛生学部寄生虫学教室において保管されている、熱帯熱三日熱マラリア原虫の混合感染患者血清、熱帯熱マラリア患者、三日熱マラリア患者血漿、発熱のためにマラリア疑い採血を受けたが抗原検出迅速診断キットと顕微鏡によるスメアー観察から陰性と診断された患者（熱発患者）の各１０検体の合計４０本の患者血清）について測定を行ったところ、マラリア患者と発熱患者（マラリアに現在感染していない患者）と抗体価の違いがやや不明瞭となり、流行地の血清ではマラリア患者と非患者間の区別のできないことが問題として明らかになった（図１２）。この理由はエノラーゼへの抗体価は過去のマラリア感染履歴を比較的長く反映するためであると考えられる。

【0046】

＜実施例１＞
本発明者らは、マラリア原虫由来の蛋白質であって、流行地患者血清の区別が可能なペプチド抗原配列を考え、（ヒトに感染する４種類の）原虫種内では配列がよく保存されていて抗原変異の少ない蛋白質であるLactate Dehydrogenase（LDH、乳酸脱水素酵素）に着目して抗原設計を行った。特に感染者の多い熱帯熱と三日熱マラリアの感染履歴を測定できるタイプの抗原ペプチドを探索した。

【0047】

抗原ペプチド配列はマラリア原虫LDHのアミノ酸配列から3種類を選択した。すなわち熱帯熱マラリア固有配列部分ペプチド18残基（pfLDH）（配列番号４）、三日熱マラリア固有配列ペプチド18残基（pvLDH）（配列番号５）、そして三日熱マラリア原虫由来LDHと熱帯熱マラリア原虫由来LDHの共通配列部分ペプチド19残基（pLDH）（配列番号３）である。

【0048】

＜pLDH抗原の合成＞
アミノ酸配列
（Gly-Phe-Thr-Lys-Ala-Pro-Gly-Lys-Ser-Asp-Lys-Glu-Trp-Asn-Arg-Asp-Asp-Leu-Leu）
（配列番号３）-Lys
組成式C₁₀₂H₁₆₁O₃₂N₂₉（mw. 2304.19）

【0049】

合成手順
pLDH抗原の合成はFmoc固相合成法によりShimadzu PSSM8自動ペプチド合成装置を用いて行った。固相合成で使用した樹脂はFmoc-Lys(Boc)-PEG-resin（0.18 mmol / g）を54 mg用いた。この樹脂を室温にて、3時間DMFで膨潤させた後（条件a）、脱Fmoc反応、保護アミノ酸の縮合反応、を繰り返して行った。合成に用いたFmoc保護アミノ酸の重量を表１に示した（各0.10 mmol、10 当量）。縮合剤は保護アミノ酸と等モルのHCTU/HOBt/DIEAを用い、各反応時間を30 minとした。脱Fmocには3 %DBU/DMF（条件b）を用いた。全アミノ酸縮合後、DMFとCH₂Cl₂によって樹脂を洗浄、trifluoroacetic acid : H₂O : triisopropylsilane = 95 : 2.5 : 2.5の混合試薬2 mLを加えて、室温で20時間静置し（条件c）、樹脂からの切り出しを行った。この溶液を回収し、CH₂Cl₂で樹脂の洗浄を行い、減圧乾燥によってペプチドを得た。得られたペプチドを冷ジエチルエーテルで洗浄を行い、減圧乾燥によって乾燥させ、粗生成物を得た（粗生成物の収量は表２に記載）。この粗生成物をHPLC（図２）、ESI-MSにより目的物を確認後、ODSカラムの固相抽出（Waters SepPack ODS-5g）によって、15, 20, 25, 30 % アセトニトリル水溶液（0.1 % trifluoroacetic acid）を各50 mLで溶出させ、10 mLずつ分取した。その後、各フラクションをHPLCとESI-MSによる測定を行い、20 %-2のフラクションで目的物を確認し、凍結乾燥によって目的物を得た（精製後の収量は表２に記載）。図３、図４にそれぞれ精製物のHPLCクロマトグラムとESI-MSスペクトルを示した。

【0050】

HPLC条件
分析装置：Shimadzu LC-2010C-HT
分析カラム： YMC-PACK ODS（4 x 100 mm、粒子径3μm）
溶媒条件： 10%-70% アセトニトリル水溶液（0.1 % trifluoroacetic acid）
分析時間： 30分、流速： 1 mL/min

ESI-MS条件
分析装置：AP-SCIEX API-2000
溶媒： 10% アセトニトリル水溶液（0.1 % trifluoroacetic acid）
流速： 10 mL/min

【0051】

合成条件の検討
表２に記載のように、３つの条件a〜cについて変更することで、目的物の収量が12 %から50 %へ大幅に向上した。HPLCクロマトグラムの比較（図２と図６）から、切り出し反応の温度と時間（条件c）によってArg残基側鎖が残ることなく目的物の収量が大幅に向上したことがわかる。さらに（条件a）膨潤時間の延長によって固相反応樹脂へ十分にDMF溶媒を親和させることで反応試薬が十分に樹脂内へ行き渡り、（条件b）脱Fmoc試薬をpiperidineからDBUへ変更することで、脱Fmoc反応収率が向上し、合成中のペプチド鎖にFmoc基が残ることがないため、結果として欠損配列の生成が抑えられたことがわかった。

【0052】

【表1】

【0053】

【表2】

【0054】

＜抗原ペプチドの高分子微粒子への修飾＞
抗原ペプチドの高分子微粒子への化学修飾は、MAP化しなかったこと以外は上記比較例１と同様にして、抗原ペプチドと高分子微粒子をそれぞれインキュベーター内37℃で24時間反応させた。その後遠心分離し反応をブロッキングした。途中、反応時間4時間、24時間に反応溶液のサンプリングを行い、生成したHOSuを逆相HPLCにより検出することで反応の進行を確認した。

【0055】

＜凝集試験＞
フィリピン大学マニラ校公衆衛生学部において保管されている、熱帯熱・三日熱マラリア混合感染患者血漿（Pf,Pv混合感染患者）、熱帯熱マラリア患者血漿（Pf 患者）、三日熱マラリア患者血漿（Pv 患者）、熱発患者としてマラリア疑い採血を受けた血漿（熱発患者）、の各試料を用いて凝集試験を行った。９６穴プレートに、１２個のウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS-0.1% tween20）で１６〜３２７６８倍希釈した血漿試料を２５μＬずつを加え、最後にpLDH抗原を修飾したナノ微粒子を２５μＬ（0.1mg/mL）ずつ加えた。９６穴プレートを１分間振動撹拌後に、室温で８時間静置して反応させることで、凝集反応を検出した。その結果、図７に示すように、マラリア患者（Pf,Pv混合感染患者、Pf 患者、Pv 患者）とマラリアではない熱発患者について有意な違いを表す抗体価を測定することに成功した。

【0056】

得られた抗体価について、従来の抗体価検査方法であるELISA法と比較を行った。ELISA法は抗原ペプチド（各10μg）を結合させたNUNC製９６穴マイクロプレート（イモビライザーアミノ）に、１次抗体の希釈血漿（希釈率1/64、1/256、各25μL）、２次抗体のHRP修飾抗ヒトIgG抗体（希釈率1/1000、100μL）、検出試薬にABTS（濃度0.7mg/mL、300μL）を用いた。ELISA法の抗体価には血漿希釈率を1/64, 1/256の場合における、マイクロプレートリーダーにおける405nmの吸光度を用いた。図８（希釈率６４倍）と図９（希釈率２５６倍）に示すように、ナノ微粒子による抗体価測定は、従来のELISA測定法と十分な相関のあることがわかった。

【0057】

同様の方法で、pfLDH抗原（図１０）とpvLDH抗原（図１１）を修飾したナノ微粒子を用いて抗体価測定を行った。図１０と図１１に示すように、今回の方法ではマラリア患者（Pf,Pv混合感染患者、Pf 患者、Pv 患者）とマラリアではない熱発患者について有意な違いを見出すことができなかった。よってpLDH抗原を修飾したナノ微粒子がマラリア感染の診断に適していることがわかった。

【0058】

本発明者らの本発明の方法（pLDH微粒子）及び従来の方法［本発明者らの既発明の方法（AD22微粒子）］について、診断法として感度と特異度等に関する有用性を比較した。上記凝集試験と同様に、それぞれの微粒子を用いて試験を行い、解析を行った。診断法として感度と特異度等に関する有用性を確認できるデータを、表３，４，５及び図１４，１５，１６に示した。すなわち表３及び図１４は、フィリピン流行地において採取された熱帯熱・三日熱マラリア混合感染患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す。表４及び図１５は、フィリピン流行地において採取された熱帯熱マラリア患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す。表５及び図１６は、フィリピン流行地において採取された、熱帯熱マラリア患者血清10例、三日熱マラリア患者血清10例、発熱患者血清10例を測定し、ＲＯＣ解析を行った場合の感度・擬陽性の相違を示す。表３及び図１４から本発明の方法は、従来の方法と比較して、感度、特異度ともにすぐれていることがわかる。表４及び図１５から本発明の方法は、従来の方法と比較して、感度、特異度ともにすぐれていることがわかる。表５及び図１６から本発明の方法は、従来の方法と比較して、感度、特異度ともにすぐれていることがわかる。

【0059】

【表3】

【0060】

【表4】

【0061】

【表5】

【0062】

比較の結果、単一の抗原を用いる本発明の方法は、原虫抗原全体を用いるIFAT法と比較して、特異性ではやや劣っていることがわかった。しかし、本発明の方法は、多検体を同時に解析できる点（IFATは一つ一つの患者試料を蛍光顕微鏡で測定）、検査材料が合成物のため室温でも安定な点（IFAT法で用いる原虫抗原は赤血球試料のため厳密な冷蔵保管が必要）に大きな優位性がある。

【0063】

さらに、本発明の方法は簡便なために、マラリア既往のない血清試料を見分けるのに特に適している。一方、IFAT法は高い抗体価の事例を見いだすのに便利である。実際に、フィリピンの様にマラリア対策が進んで患者数が減少しつつある流行地では、マラリア抗体価の低い場合が多く、結果として本発明の方法には、臨床現場における使用や流行地対策や疫学調査など、実用的にとても大きな優位性があると判断される。

【0064】

以上のとおり、本発明によって作成された抗原微粒子は、従来１検体の診断に約１日かかっていたIFAT法の代替法として大幅に多くの検査を同時に実施できると期待される。さらに本発明は3μLの血清検体があれば５時間で結果が得られるために、流行地での現地住民集団の疫学調査や集団間での流行の時間的な推移を調査することが期待される。

【0065】

IFAT法はマラリア原虫への抗体価の高さにより、現在の感染状況や最近の既往歴について診断する技術である。また、日本国内においてはIFATが実施されなくなったため、マラリア流行地滞在時や滞在後の過去の発熱について「マラリアであったのかそうでなかったのか」を確実に診断するIFAT代替法の開発が臨床現場から強く望まれている。
本発明は、このような要望に対応する技術を提供するものである。

【産業上の利用可能性】

【0066】

本発明によって作製された新規抗原ペプチドは、医療、診断、研究などの分野で有用である。特に、熱帯熱マラリア及び三日熱マラリアの感染診断、免疫状態の判定、流行の有無を判定（特に流行の終息を観測すること）に使用することができる。
より具体的には、以下の検査キットに適用が可能である。
輸送や保管に冷凍冷蔵設備を必要せず、測定時に特別な設備や電源を必要としない流行地やベッドサイドでも使用可能なマラリア検査キット。
流行地のマラリア患者や非流行地における輸入マラリア患者の診断に用いる感染検査キット。（流行地住民へのマラリア対策、流行地から帰国した海外渡航者の検査に有用である。）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]