特許 6192122 結腸直腸癌診断および予測のためのバイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6192122

(24)【登録日】2017年8月18日

(45)【発行日】2017年9月6日

(54)【発明の名称】結腸直腸癌診断および予測のためのバイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170828BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20170828BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170828BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170828BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170828BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170828BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20170828BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   G01N33/543 545A

   G01N33/53 U

   G01N33/574 A

   C12N15/00 AZNA

   C12M1/00 A

   C12M1/34 F

【請求項の数】4

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2014-550607(P2014-550607)

(86)(22)【出願日】2012年1月9日

(65)【公表番号】特表2015-503921(P2015-503921A)

(43)【公表日】2015年2月5日

(86)【国際出願番号】CN2012070149

(87)【国際公開番号】WO2013104103

(87)【国際公開日】20130718

【審査請求日】2014年12月11日

(73)【特許権者】

【識別番号】514173825

【氏名又は名称】スージョウ マイクロダイアグ バイオメディスン カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100116872

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 和子

(74)【代理人】

【識別番号】100107560

【弁理士】

【氏名又は名称】佐野 惣一郎

(72)【発明者】

【氏名】ワン タオ

(72)【発明者】

【氏名】チュー シャンユン

(72)【発明者】

【氏名】チェン フェイ

【審査官】 川口 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１９８５６５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０６４８４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０１４８１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３１５００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５２７２１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５０３９２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Parle-McDermott A et al.，Serial analysis of gene expression identifies putative metastasis-associated transcripts in colon tumour cell lines.，Br J Cancer，２０００年 ９月，Vol.83, No.6，725-728

【文献】 Isemura S et al.，Characterization of a new cysteine proteinase inhibitor of human saliva, cystatin SN, which is immunologically related to cystatin S.，FEBS Lett. ，１９８６年 ３月１７日，Vol.198, No.1，145-149

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｐ ２１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（１）〜（４）のいずれかの、結腸直腸癌転移検出用、結腸直腸癌の微小転移巣検出用、結腸直腸癌のｐＴＮＭステージ判定用、結腸直腸癌治療の間の腫瘍のリアルタイムモニタリング用又は結腸直腸癌予後予測用の診断キット。
（１）配列番号１で示されるプライマー、配列番号２で示されるプライマー及び配列番号３で示されるプローブを含み、加水分解性ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量的かつリアルタイムで検出するための診断キット
（２）配列番号２で示されるＣＳＴ４用プライマー、配列番号３２で示されるＣＳＴ４用プライマー、及び配列番号３でプローブを含み、核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または転写媒介増幅（ＴＭＡ）に基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量的かつリアルタイムで検出するための診断キット
（３）配列番号３３〜３６で示される４つのプローブを含み、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づいて前記ＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量的かつリアルタイムで検出するための診断キット
（４）配列番号３７〜４０で示されるプライマーおよび配列番号４１で示されるプローブを含み、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に基づいてＣＳＴ４のｍＲＮＡを定量的かつリアルタイムで検出するための診断キット

【請求項2】

前記ＣＳＴ４の遺伝子配列が配列番号４２で示される配列に含まれる、請求項１に記載の診断キット。

【請求項3】

陽性対照および陰性対照ならびにブランクサンプルを含む、請求項１に記載の診断キット。

【請求項4】

前記診断キットを介して測定される結腸直腸癌マーカーの発現レベルまたは含有量が健常者の結腸直腸癌マーカーの発現レベルまたは含有量と比較して、その結果が陽性であるか否かを決定し、またはその結果がカットオフ値より高ければ陽性と決定する請求項１に記載の診断キットであって、前記カットオフ値は、結腸直腸癌患者および健常者の体液または組織サンプル中の結腸直腸癌マーカー発現／レベルの比較を通して得られ、前記カットオフ値は統計的に有意であり、前記サンプルが血液、尿、骨髄、結腸直腸癌細胞株、結腸直腸癌腫瘍および腫瘍隣接組織ならびにリンパ節組織よりなる群から選択される１以上を含有する、請求項１に記載の診断キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジーおよび生物医学の発明である。特に、本発明は、結腸直腸癌用のバイオマーカーならびに結腸直腸癌の診断、動的モニタリングおよび進行予測などへの利用、検査試薬および検査キットならびにそれらの試験プロトコルを開示する。

【背景技術】

【0002】

結腸直腸癌の早期発見および治療は最近かなり改善されている。しかしながら、２００８年に、結腸直腸癌を原因として約５４００００人が亡くなったことが報告された。結腸直腸癌の国内の死亡率は、毎年３％増加している。結腸直腸癌の予防への多くの問題は、早期発見、タイムリーな医療介入、ならびに処置後の患者への高精度に癌の再発をリアルタイムに警告する治療有効性評価およびモニタリングなど、未解決のままで残っている。

【0003】

高感度および特異性を有する結腸直腸癌の診断ツールを開発することは、結腸直腸癌の早期発見割合および進行予測精度を向上するのに重要である。シスタチンスーパーファミリーは、カテプシン阻害剤として腫瘍の発生および成長において重要な役割を果たす。シスタチンスーパーファミリーに属しているタンパク質は、組織および体液中のシステインプロテアーゼと可逆的に結合し、カテプシンの過剰活性化を防止する。シスタチンＣは、今まで、カテプシンＢに対して最も強い阻害剤である。シスタチンＣの発現は、卵巣癌および頭頚部癌の患者において増加する。シスタチンスーパーファミリーの別のメンバーであるステフィンＡの発現は、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）の発生とともに増加する。しかしながら、ステフィンＢのｍＲＮＡ発現は、通常の髄膜腫患者より低い。シスタチンＦの発現の増加（またはレコシスタチン（ｌｅｋｏｃｙｓｔａｔｉｎ）およびＣＭＰＡ）は癌患者にも観測される。腫瘍の発生および成長は、腫瘍の発現が増加するが、カテプシンの関与を必要とするということが、仮定されまたは報告されている。したがって、シスタチンの発現は、フィードバックメカニズムがプロテアーゼの過剰活性化を阻害するように活性化されることに起因する結果を増加する。シスタチンの発現は必ずしも腫瘍の進行と関連するものではないことに留意されたい。例えば、神経膠腫の患者にとって、より低いシスタチンＣの発現（タンパク質およびｍＲＮＡの両方）は、より短い生存期間および再発のより高い可能性と関連している。

【0004】

本発明において、我々は、ＣＳＴ４、シスタチンスーパーファミリーのメンバーおよびスプライスとその結腸直腸癌との強い関連性を実証した。ＣＳＴ４、またはシスタチンＳは、１４１個のアミノ酸残基を有するシステインプロテアーゼ阻害剤である。それは、涙、唾液、血漿および血清などの複数の体液および分泌物に見いだされる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的の１つは、結腸直腸癌診断用の新しいツールとして、ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４スプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４特異的プライマーの増幅産物、シスタチンＳタンパク質およびそのエピトープの新規な利用方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するために、本発明の技術は以下に記載されている。ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４スプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４特異的プライマーの増幅産物、シスタチンＳタンパク質およびそのエピトープは、結腸直腸癌診断および予測のためのバイオマーカとして利用される。ＣＳＴ４遺伝子の配列は配列番号４２中に示されている。

【0007】

ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、およびＣＳＴ４スプライスのｃＤＮＡの検出用のプローブのために好ましい配列は、配列番号３中に存在している。

【0008】

好ましくは、増幅産物の特異的プライマーは、配列番号１、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０（プライマー１）および配列番号２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１（プライマー２）において示される配列を有する。配列番号１における配列は配列番号２における配列と対になる。配列番号４における配列は配列番号５における配列と対になる。配列番号６における配列は配列番号７における配列と対になる。配列番号８における配列は配列番号９における配列と対になる。配列番号１０における配列は配列番号１１における配列と対になる。配列番号１２における配列は配列番号１３における配列と対になる。配列番号１４における配列は配列番号１５における配列と対になる。配列番号１６における配列は配列番号１７における配列と対になる。配列番号１８における配列は配列番号１９における配列と対になる。配列番号２０における配列は配列番号２１における配列と対になる。

【0009】

シスタチンＳエピトープペプチド用の好ましい配列は、配列番号５０中に存在する。

【0010】

診断および予測は、結腸直腸癌の治療および進行予測の間に転移、微小転移巣、ｐＴＮＭステージ判定、動的モニタリングとして好ましく定義される。

【0011】

本発明の第二目的は、結腸直腸癌バイオマーカーへの特異親和性を有するいくつかのキャプチャーを提供することである。

【0012】

上述の目的の実現のための技術的な詳細は以下に記載されている。

【0013】

結腸直腸癌バイオマーカー用キャプチャーは、結腸直腸癌の診断用および予測用である。結腸直腸癌バイオマーカーは、ＣＳＴ４遺伝子、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、ＣＳＴ４スプライスのｃＤＮＡ、ＣＳＴ４特異的プライマーの増幅産物、ＣＳＴ４によってコードされるシスタチンＳおよびそのエピトープペプチドである。

【0014】

ＣＳＴ４特異的プライマーの配列は、配列番号１〜２に示されている。

【0015】

ＣＳＴ４、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ、およびＣＳＴ４スプライスのｃＤＮＡの検出用プローブの配列は、配列番号３中に存在している。

【0016】

上述の増幅産物の配列は、配列番号４３に示されている。

【0017】

述べられているキャプチャーは、シスタチンＳまたはそのエピトープを特異的に認識する抗体である。

【0018】

シスタチンＳエピトープペプチドの配列は、配列番号５０中に示されている。

【0019】

別の目的は、キャプチャーの新規な用途を提供することである。これらの用途に基づく検査キットおよびプロトコルも提供されるだろう。当該用途および検査キットは、高い精度での結腸直腸癌の検出、シンプルな操作および適した高度な診療のため、新しい。

【0020】

上記目的を実現するための技術的な詳細は以下に記載されている。

【0021】

このセクションは、結腸直腸癌検出用の検査試薬および検査キットにおけるキャプチャーおよび上述のキャプチャーを包含する診断キットの利用を包含する。

【0022】

検査キットは、以下に記載されている。

【0023】

１）加水分解性Ｔａｑｍａｎプローブに基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡの定量的かつリアルタイムの検出のための検査キット。プライマー配列は配列番号１〜２中に存在し、プローブの配列は、配列番号３中に存在する。

【0024】

２）蛍光色素に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡの定量的かつリアルタイム検出用の検査キット。プライマー配列は配列番号１〜２中に存在する。内部校正プライマー用の配列は、配列番号３０〜３１中に示される。

【0025】

３）核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）または転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ＴＭＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡの定量的かつリアルタイム検出用の検査キット。両方のキットは、ＣＳＴ４用のプライマーおよびプローブを包含し、その配列は、配列番号２、３２（プライマー用）および３（プローブ用）中に示されている。

【0026】

４）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡの定量的かつリアルタイム検出用の検査キット。４つのプローブは、その配列が配列番号３３〜３６中に示されて包含されている。

【0027】

５）好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡの定量的かつリアルタイム検出用の検査キット。プライマー（配列番号３７〜４０中に示される配列）およびプローブ（配列番号４１）は包含される。

【0028】

診断キットは以下のように好ましい。

【0029】

１）固体基質、固体基質に固定されたキャプチャー、ビオチン化キャプチャーおよび酵素基質（比色分析用）を包含している、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット。固定されたキャプチャーは、モノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

【0030】

２）固体基質、キャプチャー、酵素標識化二次抗体および比色検出用酵素基質を包含しているブロッティングキット。キャプチャーはモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

【0031】

３）固体基質、固定されたアンチゲン、ビオチン化キャプチャー、比色検出用酵素基質および特異的モノクローナル抗体を包含している競合ＥＬＩＳＡキット。ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

【0032】

上述の全診断キットは、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルならびに対照サンプルを包含する。

【0033】

二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットに基づく検査キットは、特異的抗体としてラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体を用いる。固体基質はＥＬＩＳＡプレートである。ビオチン化特異的ポリクローナル抗体は、ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である。

【0034】

二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットに基づく検査キットの固体基質は、ＥＬＩＳＡプレートである。固体基質に固定されたキャプチャーはラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ１２９６、５μｇ／ｍＬ）である。ビオチン化キャプチャーは、ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体（価数１：１０００）である。比色検出の基質はアルカリホスファターゼである。

【0035】

競合ＥＬＩＳＡに基づく検査キットの固体基質は、ＥＬＩＳＡプレートである。シスタチンＳの濃度は５μｇ／ｍＬである。特異的モノクローナル抗体は、ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体（価数１：２０００、ＭＡＢ１２９６（Ｒ＆Ｄ））である。酵素標識化二次抗体はＡＬＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（３％のＢＳＡを含むＴＢＳに溶解され、価数１：２０００（Ｊａｃｋｓｏｎ））である。酵素基質はＡＬＰ基質である。シスタチンＳ、酵素標識化二次抗体および酵素基質の体積比は１：２である。

【0036】

免疫プロットに基づく検査キットの固体基質はニトロセルロース膜である。キャプチャーはラット抗シスタチンＳ（価数１：１０００）抗体である。酵素標識化二次抗体はペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）である。酵素基質は市販のＴＭＢ溶液である（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ，メリーランド）、「ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液）」、カタログ番号５０−７６−０１）。

【0037】

検査キットのプロトコルは以下に詳細に記載されている。

【0038】

ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、シスタチンＳ（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１）溶液（５μｇ／ｍＬ）で被覆され、３％ＢＳＡ溶液でバックフィル（裏込め）される。ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ１２９６，（価数１：２０００）および血清（８倍希釈）は、混合され、４℃で一晩、プレートとともにインキュベートされ、その後、３７℃で１時間、プレート中の混合物からインキュベートされる。プレートの穴は、その後、ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄される。ＡＬＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、価数１：２０００、０．３％のＢＳＡを有するＴＢＳ緩衝液に溶解）は、プレートに添加され、３７℃で１時間インキュベートされる。ＡＬＰ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）、ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、カタログ番号５０８８０５、穴ごとに１００μＬ）、ＯＤ値は最後にマイクロプレートリーダーを用いて読まれる。

【0039】

第４目的は、インビトロ診断ツールならびに簡易操作、高感度および特異性を有するキットを提供することである。

【0040】

本発明の目的を実現するための技術の詳細な説明は以下のとおりである。

【0041】

結腸直腸癌は、上記の診断キットによって検出され得または予測され得る。より詳細な語において、検査キットを介して測定された結腸直腸癌マーカーの発現レベルまたは定量的な含有量は、健常者の発現レベルと比較して、その結果が陽性であるか否かを決定する。または当該結果は、含有量（カットオフ値）より高い場合に陽性と解読される。カットオフ値は結腸直腸癌患者および健常者の体液または組織サンプルにおける結腸直腸癌マーカー発現／レベルの比較を通して得られる。カットオフ値は統計的に有意である。サンプルは以下を１以上包含する：血液、尿、骨髄、結腸直腸癌細胞株、結腸直腸癌細（ｃｏｌｏｒｅｃａｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）腫瘍および腫瘍に隣接する組織およびリンパ節組織。例えば、シスタチンＳのカットオフ値は、この場合３．４３４ｎｇ／ｍＬである。

【0042】

結腸直腸癌の予測および診断のための検査キットは、シスタチンＳタンパク質発現の測定用のキットである。当該キットは、固体基質、固体基質に固定されたキャプチャー、ビオチン化キャプチャーおよび比色検出用酵素基質を包含する。固定化キャプチャーは、モノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

【0043】

または、シスタチンＳタンパク質発現測定用の検査キットは、固体基質、プレートに被覆されたシスタチンＳタンパク質、ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体、酵素標識化二次抗体および比色検出用酵素基質を包含する。

【0044】

または、シスタチンＳタンパク質発現測定用の検査キットは、固体基質、キャプチャー、酵素標識化二次抗体および比色検出用酵素基質を包含する。キャプチャーはモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーはポリクローナル抗体である。

【0045】

検査キットは、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡに基づき、アッセイの固体基質は、ＥＬＩＳＡプレートであり、固定化キャプチャーは、ラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、ビオチン化キャプチャーは、価数１：１０００を有するウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体である。酵素基質はＡＬＰである。

【0046】

または、キットは競合ＥＬＩＳＡに基づき、アッセイの固体基質はＥＬＩＳＡプレートであり、シスタチンＳの濃度は５μｇ／ｍＬであり、モノクローナル抗体は価数１：２０００を有するラット抗シスタチンＳ抗体であり、酵素標識化二次抗体は価数１：２０００を有するＡＬＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧである。酵素基質はＡＬＰである。シスタチンＳ、酵素標識化二次抗体およびその基質の体積比は１：２である。

【0047】

または、検査キットは免疫ブロット法に基づき、固体基質はニトロセルロース膜であり、キャプチャーは価数１：１０００を有するラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体であり、酵素標識化二次抗体はＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧであり、比色検出用酵素基質はＴＭＢ溶液である。

【0048】

本発明の利点は、１）結腸直腸癌の診断における発現ＣＳＴ４遺伝子およびシスタチンＳタンパク質の利用であり、癌の成長および結腸直腸癌の進行予測のリアルタイムモニタリングは、本発明の大規模試験で変動する。当該結果は、かなりの精度であり、本発明は、結腸直腸癌の予後予測だけでなく結腸直腸癌診断およびリアルタイムモニタリングの新規な方法の開発において用いられ、２）結腸直腸癌診断およびリアルタイムモニタリングに高い感度を有する検査試薬と検査キットは結腸直腸癌進行予測と同様、本発明に包含され得る。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】ＣＳＴ４を含む組み換えプラスミドＰｍｄ１８−Ｔを示す図である。

【図2】扁桃腺、後側下垂体、甲状腺、唾液腺、骨格筋、骨髄、赤血球および血小板を含まない末梢血、肺、胃、肝臓、心臓、腎臓、副腎、腸管、結腸、膵臓、脾臓、膀胱、前立腺、卵巣、子宮、胎盤、ヒト結腸直腸癌細胞株ＳＷ４８０およびｃａｃｏ２ならびにヒト腸内上皮細胞株ＨＮＩＥＣを包含している正常な組織中のＣＳＴ４遺伝子の発現（生体素子により測定）に関する図である。

【図3】プローブとして蛍光色素を含むリアルタイムｑＰＣＲを用いる結腸直腸癌腫瘍および個々の腫瘍隣接組織の２０個の場合におけるＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１、ＣＳＴ２、ＣＳＴ４の発現比較の図である。

【図4】結腸直腸癌腫瘍およびそれらの個々の腫瘍隣接組織の１００個の場合におけるリアルタイムＰＣＲにより定量化されたＣＳＴ４の発現に関する図である。

【図5】３６固の結腸直腸癌サンプルおよび２９個の腸炎を含む結腸鏡検査試料におけるリアルタイムＰＣＲにより定量化されたＣＳＴ４の発現に関する図である。

【図6】２０個の結腸直腸の癌転移を含むリンパ節サンプルおよび１５個の結腸直腸の癌転移を有さないリンパ節サンプルにおけるリアルタイムＰＣＲにより定量化されたＣＳＴ４の発現に関する図である。転移は病理学的研究において変動した。

【図7】リアルタイムＰＣＲにより定量化された末梢血における細胞学的研究およびＣＳＴ４発現を用いた結腸直腸癌診断の正確さの比較に関する図である。

【図8】リアルタイムＰＣＲにより定量化された細胞学的研究およびＣＳＴ４発現を用いた結腸直腸癌骨髄転移予測の正確さの比較に関する図である。

【図9】リアルタイムＰＣＲ（Ａ）および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（Ｂ）により定量化された５０人の結腸直腸癌患者、３０人の健常者および３０人の腸炎患者の血清無細胞ＲＮＡのＣＳＴ４発現に関する図である。ＲＯＣ曲線は、結腸直腸癌患者を腸炎患者および健常者と区別する方法の感度および特異性の評価に用いられうる。

【図10】リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）により定量化される５０人の結腸直腸癌患者、３０人の健常者および３０人の腸炎患者の血清無細胞ＲＮＡのＣＳＴ４発現に関する図である。

【図11】逆転写ストランド変位増幅（ｒｔＳＤＡ）により定量化される５０人の結腸直腸癌患者、３０人の健常者および３０人の腸炎患者の血清における無細胞ＲＮＡのＣＳＴ４発現に関する図である。

【図12】核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によって定量化される２０人の結腸直腸癌患者、１０人の健常者および１０人の腸炎患者の尿サンプル中のＣＳＴ４発現に関する図である。

【図13】種々のｐＴＮＭステージ（３０人のＩ＋ＩＩの例および５０人のＩＩＩ＋ＩＶの例）にある８０人の結腸直腸患者の転写増幅法（ＴＭＡ）によるＣＳＴ４発現に関する図である。

【図14】結腸直腸癌細胞株の培養上精と健常者の血清中のシスタチンＳ発現に関する図である。

【図15】結腸直腸癌および健常者の血清中のシスタチンＳ発現に関する図である。

【図16】３０人の結腸直腸癌患者および２０人の健常者の血清サンプル中の競合ＥＬＩＳＡによるシスタチンＳ発現に関する図である。

【図18】中央値より高いまたは中央値より低いシスタチンＳ発現を有する処置後の結腸直腸癌患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）曲線に関する図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

（パートＩ）分子検出
上記されている分子生物学的技術は、以下の実施例に記載されている。これらの実施例は本発明の利用を限定する代わりに本発明を明確にしていることに留意されたい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実習マニュアル）（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編）におけるプロトコルは、もし示されていなければ、実験手順に厳密に従った。または取扱説明書を以下に示した。記載されていない場合、百分率および割合は、重量に基づく。

【0051】

物質および方法
全臨床サンプルを、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（北京友情医院）から得、病院の厳しい検査法規と患者の同意書を有した。

【0052】

腫瘍またはその隣接組織と疑われていた生検サンプルを比較した。リンパ節サンプルと同様これらのサンプル中のＲＮＡをサンプルの必要な時にすぐに抽出し、液体窒素中に貯蔵し、またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）に保管している。

【0053】

末梢血、骨髄または尿サンプルを２０分間（４０００ｒｐｍ、４℃）遠心分離した。その上清を、別に１０分間（１３０００ｒｐｍ，４℃）遠心分離した。上清および沈殿を分離する。ＲＮＡ抽出をすぐに続いて行い、またはそのサンプルを−２０℃未満または−８０℃未満で貯蔵する。

【0054】

ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ：
サンプルから市販キットを用いて核酸を抽出した。限定を意図しない例は、フェノール−クロロホルム抽出である。サンプル中のＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより製造したトリゾールキット（Ｔｒｉｚｏｌ ｋｉｔ）を続けて用いて得られた。抽出したＲＮＡの品質を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（分子生物学実験）（Ｊ．Ｌｉによる）などの参考文献中のプロトコルに従って分析した。ｍＲＮＡの逆転写を市販キットにより行い、その指針は以下に従った。ｃＤＮＡ溶液を適切な濃度勾配で調製した。生化学反応用のプライマーを最適化した。ＣＳＴ４用のプライマーをエクソン１に基づき設計した。ＣＳＴ４増幅産物を含む組み換えプラスミドは、Ｐｅｇｍ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ（図１に示されている））から市販されている。プライマーをエクソン１および３に基づき設計した。ＰＣＲプロセスをＴａｑＭａｎプローブの加水分解により観測した。

【0055】

ＣＳＴ４のプライマー用に最適化された配列は、

【化1】

である。プローブの配列は、

【化2】

である。増幅産物の部分は１４２ｂｐである。

【0056】

ＣＳＴ４増幅産物を含有する組み換えプラスミドのプライマー用に最適化された配列は、

【化3】

である。

【0057】

典型的に試験において、サンプル、陽性対照および陰性対照ならびに組み換えプラスミド標準は同時に増幅される。組み換えプラスミド標準と濃度に対する適当な濃度勾配との交差点（ＣＰ）をプロットし、校正曲線を得る。サンプルおよび対照サンプル中の遺伝子発現のコピーを、当該校正曲線を用いて定量化する。

【0058】

プローブとして蛍光色素を用いるリアルタイムＰＣＲ：
サンプルの前処理は、ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲのセクションに記載されているものと同じである。同時に増幅されるＣＳＴ１、ＣＳＴ２およびＣＳＴ４の増幅用のプライマーの配列は、

【化4】

である。ＣＳＴ４増幅用のプライマーの配列は

【化5】

である。ＣＳＴ２増幅用のプライマーの配列は、

【化6】

である。ＣＳＴ１増幅用のプライマーの配列は、

【化7】

である。β−アクチンは内部基準として用いられる。β−アクチン増幅用のプライマーの配列は、

【化8】

である。癌性腫瘍、腫瘍隣接組織（ＴＡＴ）および内部基準遺伝子中の遺伝子を同時に増幅する。遺伝子のコピーは以下の等式によって定量化され、ここで、蛍光シグナルがバックグラウンドを超える時、ｃｔはサイクル数である。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎｋ、Ｅｖｅ Ｇｒｅｅｎ、ＬＣ Ｇｒｅｅｎなどはアプライ（付与）する蛍光色素に含まれる。

【0059】

【数1】

【0060】

核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によるインビトロでのＲＮＡ増幅：キットは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、鳥骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、「ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ」の区分に述べられていたＣＳＴ４増幅用プライマー、（Ｒｉｂｏ−Ｇｒｅｅｎ蛍光色素）を観測するＲＮＡ増幅用蛍光色素を包含する。ＲＮＡテンプレートは、４２℃で２時間のインキュベートした後、２^９〜２^１２倍に増幅される。増幅された製品の蛍光を増幅前のテンプレート濃度の定量化のために測定した。

【0061】

実施例１．ＣＳＴ４およびＣＳＴスーパーファミリーの他のメンバーの発現
１．種々のヒト組織中のＣＳＴ４
全組織サンプルを、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＦＨ）から得られる結腸組織を除いて購入した。種々のヒト組織サンプル中のＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現をＨＧ−Ｕ９５ＡＶ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｉｒｘ）上で測定し、比較した（使用マニュアルからのプロトコルは以下の通りであった）。ＣＳＴ１ ｍＲＮＡ発現の定量化を、β−アクチン蛍光校正曲線により実現した。

【0062】

図２に示されているように、ＣＳＴ４発現は、唾液腺中のものを除いて、全サンプルにおいて低い。ＣＳＴ４発現は、試験されている他の組織において全く観察されなかった。当該結果は、ＣＳＴ４発現の低いバックグラウンドシグナルのせいで、ＣＳＴ４は有望な病理診断であることを示す。ＣＳＴ４は、ＳＷ４８０およびＣａｃｏ２（結腸直腸癌細胞株である）中に過剰発現であり、ＨＮＩＥＣ（普通の結腸組織細胞株である）において発現しない。ＣＳＴ４は結腸直腸癌診断用の有望なマーカーであると結論付けられている。

【0063】

結腸直腸癌腫瘍とそれらの個々の隣接組織の２０の組み合わせ（Ｃ１、Ｃ２．．．Ｃ２０と番号づけられた）におけるＣＳＴ４、ＣＳＴ１２４、ＣＳＴ１およびＣＳＴ２のｍＲＮＡの発現を比較した。腫瘍およびそれらの隣接組織におけるＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現差異は、ＣＳＴ１を除いて全遺伝子より大きい（図３）。全サンプルを結腸直腸癌について病理学的に診断した。プローブとして蛍光色素を用いるリアルタイムＰＣＲを、遺伝子発現を定量化するために用い、そのリアルタイムＰＣＲは陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルの同時に生じる増幅により変動した。当該対照の結果は予測と合致していた。

【0064】

２．ｍＲＮＡ発現の定量化用のプローブとして蛍光色素を有するリアルタイムＰＣＲに基づく検査キットは、以下を含有する。

【0065】

１）ＣＳＴ４増幅用プライマー（その配列は以下に示される）：

【化9】

内部基準としてのβ−アクチンの増幅用プライマー

【化10】

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

【0066】

３．結腸直腸癌腫瘍および腫瘍隣接組織におけるＣＳＴ４発現
ＴａｑＭａｎプローブを有するリアルタイムＰＣＲに基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現用検査キット。当該キットは以下を含有する。

【0067】

１）プライマーおよびプローブ：

【化11】

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、ＣＳＴ４遺伝子を含む組み換えプラスミドサンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

【0068】

全サンプルは、ｃＤＮＡが得られることで、ＲＮＡ抽出および逆転写の前に結腸直腸癌と診断された。リアルタイムＰＣＲは、結腸直腸癌腫瘍およびそれらの個々の隣接組織におけるＣＳＴ４の発現の定量化に用いた。１００個のサンプルがこの試験において試験された。

【0069】

図４において示されるように、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現は、病理学上診断される悪性結腸直腸癌腫瘍において特に高く、それらは個々の隣接組織において低い。腫瘍におけるＣＳＴ４発現は、隣接組織におけるＣＳＴｔ発現よりおよそ１００倍高く、このことは、ＣＳＴ４のｍＲＮＡが結腸直腸癌のために優れたマーカーであるということを示す。１３．８９がＣＳＴ４コピーのためのカットオフ値である場合、癌性組織は正常組織と区別され得る。したがって、１３．８９は結腸直腸癌の臨床診断用の参照として提案される。

【0070】

４．結腸直腸癌患者および腸炎患者からの結腸鏡検査サンプルにおけるＣＳＴ４発現
結腸鏡検査サンプルは、腫瘍細胞の百分率が変動する外科サンプルと大きく異なる。癌性組織はときどき、結腸鏡検査サンプル全体の非常に小さな一部であり、または癌性組織は結腸鏡検査サンプル中に包含されない。発明者らは試験し、結腸直腸癌患者からの３６個の結腸鏡検査サンプルと腸炎患者からの３６個の結腸鏡検査サンプルにおけるＣＳＴ４発現を比較した。癌性サンプルにおけるＣＳＴ４発現の中央値は、腸炎サンプル中でのカットオフ値より１４．３倍大きい。もし６０．５がカットオフ値である場合、癌性腫瘍は炎症と区別され得、結腸鏡検査サンプルを用いる結腸直腸癌診断用のレファレンスを提供する。

【0071】

当該結果を、図５にまとめている。リアルタイムＰＣＲを遺伝子発現の定量化に用いた。

【0072】

５．結腸直腸癌転移を伴うまたは伴わないリンパ節サンプル中のＣＳＴ４発現
異なるサイズの薬理学的診断された結腸直腸癌転移を含むリンパ節の２０個の外科サンプルおよび初期段階の非転移性結腸直腸癌を伴う患者からの１５個のリンパ節サンプルを得た。初期段階の癌患者を、検出できないリンパ節転移および得られたアーチファクトを避けるために選択した。リアルタイムＰＣＲをＣＳＴ４の発現の定量化に用い、詳細な実験手順は実施例２に記載しているようなものと同じである。図６に示されているように、ＣＳＴ４発現は、結腸直腸癌転移を伴うサンプルにおいて高く、癌転移を伴わないサンプルにおいて比較的ひくい。転移を伴うサンプル中のＣＳＴ４発現の中央値は、乳癌の転移を伴わないサンプル中のＣＳＴ４発現の中央値より２３．６倍高い。もしカットオフ値が２３．９のコピーである場合、癌転移を区別するのは可能である。ＣＳＴ４発現の２つの陽性の場合を非転移グループにおいて報告した。これらのサンプルを、注意深く研究し、そして微小転移巣を両方において発見した。これらの２つの例を転移サンプルとして考える場合、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現試験は、検査においてすべての転移性の場合を区別することができる。伝統的な薬理学的研究の可能性を超えている微小転移巣は発見され、より高い感度を示すとわかった。

【0073】

６．リアルタイムＰＣＲと末梢血中に循環している結腸直腸癌細胞の発見のための細胞学的研究による ＣＳＴ４発現測定の精度比較

【0074】

ＲＮＡは、赤血球および血小板を含まない末梢血から抽出され、ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで定量化し、腸炎患者および健常者からのサンプルと比較して、循環する結腸直腸癌細胞の存在を決定した。得られた結果を細胞学的研究と比較した。

【0075】

図７にまとめるように、ＣＳＴ４発現方法は、細胞学的研究により診断される全ての癌の例を検出することができる。癌転移は薬理学的に転移していないと診断された結腸直腸癌患者において発見され、本発明で述べられる方法は細胞学的な方法よりも感度がよく、細胞学的な方法がし得るものを超えている微小転移巣も検出され得る。

【0076】

７．リアルタイムＰＣＲおよび細胞学的研究により検出される骨髄転移
結腸直腸癌患者からの生検骨髄サンプルのＣＳＴ４のｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより定量化した。得られた結果を検出用の健常な骨髄サンプルと比較した。これらの試験の結論を細胞学的研究と比較した。

【0077】

図８に示されるように、骨髄転移、転移または微小転移を伴う９５％のサンプル（細胞学的研究に基づく）はＣＳＴ４のｍＲＮＡ検査により検出され得る。細胞学的研究より高い陽性の割合はより高い感度を示す。

【0078】

８．結晶中のＣＳＴ４発現

【0079】

９．結腸直腸癌患者、腸炎患者および健常者の無細胞ＲＮＡ
結腸直腸癌患者（５０例）、腸炎患者（３０例）および健常者（３０例）の血漿サンプルを集めた。無細胞ＲＮＡを市販キットを通して抽出した：リアルタイムＰＣＲをＣＳＴ４発現の定量化のために用いた。

【0080】

癌性のグループのＣＳＴ４発現の中央値は、炎症グループおよび正常グループのおよそ６倍（図９Ａ）である。５９．４８のカットオフ値により、非癌性サンプルから癌性サンプルを分離することができる。乳癌診断のための方法としてＣＳＴ４発現検査の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は図９Ｂに示す。高感度および特異性をその曲線から結論付けた。ＣＳＴ４は、血漿サンプルによる非浸潤性の結腸直腸癌診断用の特異的なマーカーである。

【0081】

１０．リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）により検査された結腸直腸癌患者、腸炎患者および健常者の血漿の無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現用の検査キットは以下を含有する。

【0082】

１）ハプテン標識化したプローブ：

【化12】

２）市販の核酸抽出用試料および逆転写用試料。他の試薬は、ＬＣｘキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と同一である。

【0083】

無細胞ＲＮＡを結腸直腸癌患者（５０例）、腸炎患者（３０例）および健常者（３０例）の血漿から抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現をＬＣＲ方法により検査した。

【0084】

図１０に示されるように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症を伴うサンプルや正常サンプルのそれぞれとの９．９６倍および３２．２９倍高い。結腸直腸癌サンプルを１７．８５ ＲＬＵのカットオフ値と区別し得る。

【0085】

１０．逆転写ストランド変位増幅（ｒｔＳＤＡ）により検査された結腸直腸癌患者、腸炎患者および健常者の血清無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
ｒｔＳＤＡに基づくＣＳＴ４ｍＲＮＡ発現の定量化用の検査キットは以下を含有する：
１）

【化13】

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ ｄＴＴＰ、Ｂｓｏｂ Ｉおよびｅｘｏ−Ｂｃａ。

【0086】

無細胞ＲＮＡを、結腸直腸癌患者（５０例）、乳腺炎患者（３０例）および健常者（３０例）の血漿サンプルから抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡからの発現を好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）により検査した。図１１に示されているように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症および正常サンプルをそれぞれを含むサンプルより、２０．７３倍および２１．５１倍高い。結腸直腸癌サンプルは、２３．０９ ＲＬＵのカットオフ値と区別され得る。

【0087】

１１．結腸直腸癌患者、腸炎患者および健常者の尿無細胞ＲＮＡにおけるＣＳＴ４発現
核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現定量化用の検査キットは、以下を含有する。

【0088】

１）ＣＳＴ４用のプライマーおよびプローブ：

【化14】

２）ＲＮＡ抽出用および逆転写用試薬、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、鳥骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびＲＮＡ蛍光色素（リボグリーン蛍光色素）。

【0089】

無細胞ＲＮＡを結腸直腸癌患者（３０例）、腸炎患者（２０例）および健常者（２０例）の尿サンプルから抽出した。ＣＳＴ４のｍＲＮＡの発現をＮＡＳＢＡにより検査した。図１２に示されているように、癌性サンプルの相対発光量（ＲＬＵ）の中央値は、炎症および正常サンプルを伴うサンプルより約１３．２倍高い。結腸直腸癌サンプルは、１５．０２ ＲＬＵのカットオフ値と区別され得る。それゆえ、ＣＳＴ４は、結腸直腸癌診断用の非浸潤性の尿検査において優れたマーカーである。

【0090】

実施例２ 結腸直腸癌の予測および診断のためのＣＳＴ４の利用
転写増幅法（ＴＭＡ）に基づくＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現の定量化用検査キットは以下を含有する。

【0091】

１）増幅用のプライマーおよびプローブ：

【化15】

２）プライマーおよびプローブ以外のＧｅｎ−プローブＴＭＡアッセイに包含されている任意の試薬。

【0092】

１．ＣＳＴ４発現および結腸直腸癌ｐＴＮＭステージ判定
８０人の結腸直腸癌患者（Ｉ＋ＩＩステージの３０例およびＩＩＩ＋ＩＶステージの５０例）からの血漿サンプル中の無細胞ＲＮＡを市販キットによって抽出した。ＣＳＴ４発現を、ＴＭＡ（転写増幅）方法を用いて測定した。

【0093】

図１３に示すように、末期患者（ステージＩＩＩ＋ＩＶ）のＲＬＵの中央値は、初期患者（ステージＩ＋ＩＩ）より８．９倍高い。当該結果は、ＣＳＴ４は結腸直腸癌ステージの良好な指標であり、ステージの決定のために用いられうる。

【0094】

２．結腸直腸癌治療におけるリアルタイムモニタリングにおけるＣＳＴ４発現の利用
治療を受ける結腸直腸癌患者の血清ＣＳＴ４発現（化学療法での６人の患者および放射線療法での４人の患者）は、リアルタイムＰＣＲにより観測された。腫瘍成長を血液中のＣＳＴ４発現レベルと比較および対応させた。

【0095】

表１にまとめるように、ＣＳＴ４発現は効果的な治療をする患者で減少し、これは、腫瘍の減少した大きさからも明らかであった。ＣＳＴ４発現は、効果的でない治療をする患者の治療の継続を増加し、腫瘍の増加した大きさからも明らかであった。したがって、ＣＳＴ４を治療の有効性のリアルタイムモニタリング用のマーカーとして提案する。

【0096】

【表1】

【0097】

３．結腸直腸癌の予後予測用ＣＳＴ４発現
５人の処置後結腸直腸癌患者の血液ＣＳＴ４発現を定量的リアルタイムＰＣＲによる治療後１月後、３月後および１年後に観測した。表２に示されているように、患者は癌が再発した。ＣＳＴ４発現の増加はこれらの２人の患者で観測された。癌の再発は、ＣＳＴＴ４発現がおよそ１０００のコピーに達するまで検出されなかった。他の３人の患者は癌が再発せず、あまりＣＳＴ４発現の増加は彼らに観測されなかった。したがって、ＣＳＴ４は癌の予後予測に良好なマーカーである。

【0098】

【表2】

【0099】

実施例３ 結腸直腸癌の予測用および診断用キット
１．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のためのＴａｑｍａｎプローブに基づく検査キット

【0100】

１）プライマーおよびプローブ

【化16】

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

【0101】

２．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のための蛍光色素に基づく検査キット
１）ＣＳＴ４用プライマー

【化17】

β−アクチン用プライマー

【化18】

２）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、リボヌクレアーゼを含まない水、標準溶液、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、１０倍緩衝液および塩化マグネシウム溶液。

【0102】

３．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のための核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）に基づく検査キット
当該キットは以下を含有する。
１）プライマーおよびプローブ

【化19】

２）ＲＮＡ抽出用および逆転写用試薬、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ、鳥骨髄性白血病ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、リボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびＲＮＡ蛍光色素（リボグリーン蛍光色素）。

【0103】

４．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のための転写増幅法（ＴＭＡ）に基づく検査キット
キットは以下を含有する。
１）プライマーおよびプローブ

【化20】

２）プライマーおよびプローブ以外のＧｅｎ（ジェン）−プローブＴＭＡアッセイに包含される任意の試薬

【0104】

５．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のためのリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づく検査キット
当該キットは、以下を含有する。
１）ハプテン標識化した４つのプローブ：

【化21】

２）核酸抽出用および逆転写用の市販の試料。他の試薬はＬＣｘキット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と全く同一である。

【0105】

６．ＣＳＴ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量化のための好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に基づく検査キット
当該キットは、以下を含有する。
１）

【化22】

３）核酸抽出用試料および逆転写用試料、ｄＣＴＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｂｓｏｂ Ｉおよびｅｘｏ−Ｂｃａ。

【0106】

（パートＩＩ）タンパク検出
本発明を以下の実施例に示す。これらの実施例は、本発明の利用を制限する代わりに本発明を明確にすることに留意されたい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編）は、記載されていない場合、実験工程に厳密に続けられた。または、取扱説明書に従った。言及されない場合、百分率および割合は重量に基づく。

【0107】

このセクションにおいて、結腸直腸疾患検出用のタンパク質バイオマーカーの検出を述べる。抗体、検査キットおよびプロトコルを詳細に述べる。結腸直腸疾患診断の利用およびモニタリング、ならびに有効性評価も記載する。

【0108】

組み換えシスタチンＳタンパク質をＡｂｎｏｖａから購入した（０．０６μｇ／μＬ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１）。価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体をＲ＆Ｄから購入した（カタログ番号ＭＡＢ１２９６）。価数１：１８００であるウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した（カタログ番号ａｂ５８５１５）。

【0109】

本発明は、結腸直腸組織状態の決定および結腸直腸癌の再発および転移の予測のための方法を提供する。治療の評価は本発明に記載されている方法により実現され得る。この方法は、患者に与えられるサンプルにおける少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する。サンプル内ののシスタチンＳタンパク質およびその定量的なまたは半定量的な決定は非常に好ましい。種々の分子は、タンパク質検出のために繰り返されたが、シスタチンの特定の抗体またはそれらのフラグメントは、本発明において好ましい。方法検出プロトコルおよび検査キットは、癌の兆候のないヒトの結腸直腸癌検診に用いられうる。

【0110】

少なくとも１つの（好ましい）抗体またはシスタチンＳの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するフラグメントは本願明細書に述べられている検出において利用される。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましいモノクローナル抗体は、シスタチンＳを配列番号５０に示される配列と結合する。抗体はシスタチンＳを免疫原とともに得られる。免疫原濃度は好ましい成分である。それゆえ、本発明は、シスタチンＳの存在に対する抗体の免疫応答によるシスタチンＳの定量化方法を提供する。

【0111】

本発明における検体はヒトであり、ここで、試験における免疫応答は抗体およびヒトペプチドを特徴づける。免疫反応は任意の好ましい方法によって測定されてよく、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法または両方の組み合わせ、競合ＥＬＩＳＡおよび二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットを包含する。

【0112】

結腸直腸組織状態のモニタリングおよび診断ならびに結腸直腸疾患用の治療の有効性のモニタリングは、シスタチンＳ発現の定量化を介する免疫反応により定量化され得る。

【0113】

我々は、サンプル中のマーカー（シスタチンＳおよびその本願明細書におけるエピトープ）の検出のための全ての検査キットを本願において主張する。結腸直腸組織および結腸直腸疾患の状況は上記キットを介して診断され得る。結腸直腸疾患の治療のモニタリングならびに癌の再発および転移の予測もキットの利用の範囲内である。抗シスタチンＳ抗体またはそれらのフラグメントはキットに包含される。これらの抗体またはそれらのフラグメントは、血清のような流体サンプル中のシスタチンＳと結合する。抗体またはそのフラグメントとシスタチンＳとの結合事象はモニタリングされ、報告単位によって検出される。

【0114】

好ましいまたは最適化されたキットの報告単位は抗体またはそれらの機能を標識化したフラグメントであり得る。ここで、報告単位は、適切なＩｇＧまたはＩｇＭ抗体として好ましい。当該標識は、ペルオキシダーゼによるなど基質の色の変化を伴う反応を触媒する酵素としてあり得、好ましい。当該標識は二次抗体にコンジュゲイトしているのが好ましい。または、当該標識は蛍光色素であり得る。

【0115】

ＥＬＩＳＡに基づく検査キットは本発明において好ましい。

【0116】

述べられるＥＬＩＳＡ検査キットは、競合ＥＬＩＳＡキットまたは二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキットであり、その詳細は以下に記載されている。少なくとも１つの抗体またはそのフラグメントは、検体とインキュベートされる。抗体はモノクローナル抗体であり、上述したモノクローナル抗体として好ましい。抗シスタチンＳ抗体の製造用の免疫源であるシスタチンＳタンパク質を、マイクロプレート（本願明細書の固体基質）とコンジュゲイトさせている。事前にインキュベートした混合物をＥＬＩＳＡプレート上でアプライし、その後コンジュゲイトされていない抗体をプレート上に固定されているタンパク質にコンジュゲイトさせる。報告単位は、免疫グロブリン、とりわけＩｇＧおよびＩｇＭであり、プレート上で抗体を検出することができる。抗体は、酵素または検出用の蛍光標識とコンジュゲイトされている。

【0117】

本発明の別の方法論は免疫ブロット法またはウエスタンブロット法であり、ここで、サンプル中のタンパク質を、ＰＡＧＥなどのゲル電気泳動によって分離し、次いでニトロセルロース膜などの固体基質に移す。当該移す方法の１つは電気移動である。当該検体は、特定の抗体（モノクローナル抗体または好ましくはそのフラグメント）と関係する。免疫反応は、酵素／フルオロフォア標識化抗体などの適切な方法で観測され得る。

【0118】

本発明における別の好ましい方法論は親和性カラムに基づく検査キットである。典型的なプロセスにおいて、抗体またはそのフラグメントはカラム上で固定され、サンプル溶液はカラムをゆっくり通過する。本願明細書において、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。上述されている抗体は好ましい。

【0119】

サンプル溶液はカラムを通過する。検体のタンパク質が固定された抗体と接触するとき、そのタンパク質はカラム中に残る。その後、検体のタンパク質は、抗体用の競合アンチゲンを利用することにより、またはランニングバッファー条件を変更することにより溶出される。複数のタンパク質を分析する場合、異なるときにタンパク質を溶出するのが好ましい。タンパク質は、ＵＶ吸光度検出など、周知の種々の補法により定量化され得る。

【0120】

シスタチンＳ検査キットは本発明において提供される。２つのチャネルシスタチンＳ指標は、シスタチンＳレベルが通常より高いかどうかを正確に示す。流体サンプルは前記試験に好ましい。キットはサンプル、抗体およびそれらのフラグメントならびに指示薬のための容器を包含する。モノクローナル抗体、とりわけ、上述した抗体は好ましい。試験および操作やデータ解釈に必要な全溶液および緩衝液は、キットに包含されるだろう。キットは病院、診療所および家などの任意の場所において専門家により行われるだろう。

【0121】

本発明に用いるサンプルは、これらに限定されないが、全血液またはその画分を包含する血清、血漿、尿および血液を包含する。

【0122】

上記のように、本発明における抗体は、結腸直腸癌の診断ならびに結腸直腸癌の再発および転移の予測のために用いられうる。この出願において周知の方法は、キットと組み合され得る。例えば、蛍光方法は、血漿、血清または尿、次いで、特定の疾患の存在におけるシスタチンＳの量を試験するためのキットと組み合され得る。

【0123】

本発明の目的、利点および特徴部は、以下の限定を意図しない実施例において明らかとなる。その上、請求項および上記になされる結論を支持する実験の詳細も、以下の実施例に包含される。

【0124】

材料および方法
組み換えシスタチンＳタンパク質をＡｂｎｏｖａから購入した（０．０６μｇ／μＬ、カタログ番号Ｈ００００１４７２−Ｐ０１）。

【0125】

抗体：価数１：２０００であるラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体をＲ＆Ｄから購入した（カタログ番号ＭＡＢ１２９６）。価数１：１８００であるウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した（カタログ番号ａｂ５８５１５）。

【0126】

免疫沈澱：２ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、ブドウ球菌タンパク質Ａの固定されたアガロースゲルおよびシスタチンＳ抗体を、サンプル中に添加する。混合物を、４℃で一晩穏やかに撹拌する。ジメチルピメルイミドエステルを、アガロースゲルに抗シスタチンＳ抗体をコンジュゲイトするために用いる。その沈殿を、Ｎ−グリコシダーゼＦで洗浄かつ処理し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製する。

【0127】

要するに、Ｎ−グリコシダーゼＦの利用前に、沈殿物を１０μＬのクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０、０．５％のＳＤＳ）中で沸騰する。１０μＬのリン酸塩緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．０（４０ｍＭのＥＤＴＡを含む））およびＮ−オクチルグルコシド（３％）およびＮ−キシラナーゼを混合物（４０ｍＵ）に添加し、一晩（３７℃）培養する。加える緩衝液を、その後添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製のために沸騰させる。他に示されない限り、１５％ポリアクリルアミドゲルはＰＡＧＥに用いられる。ゲルは２０％の２，５−ジフェニルオキサゾール溶液にイメージ化する。

【0128】

タンパク質の電気移動および免疫ブロット法：タンパク質を、５％の脱脂粉乳および０．１％Ｂｒｉｊ−３５を含むＰＢＳ緩衝液中に２時間（常温）インキュベートしたニトロセルロース膜に移す。その後、当該膜をウサギ抗シスタチンＳ抗シスタチンＳポリクローナル抗体溶液中で一晩（４℃）インキュベートする。当該膜をＰＢＳ緩衝液（０．１％のＢｒｉｊ−３５を含む）で３回洗浄する。それをペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ溶液（０．２７μＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ）で１時間（３７℃）インキュベートし、続いて、ＰＢＳ緩衝液（０．１％Ｂｒｉｊ−３５）で４回、ＰＢＳの洗浄を１回行った。膜は、市販のＴＭＢ溶液（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）によりイメージ化される。または、膜が５．４ｍＭの過酸化水素溶液、２．５ｎＭのｌｕｍｉｎｏｌおよび４００ｍＭｐ−クマル酸（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに溶解され、ｐＨ８．５）溶液に浸されている間、ＥＬＣ方法によって試験し、Ａｇｆａ ＣＰ−ＢＵ−ｆｏｉｌ上にイメージ化される。

【0129】

競合ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡプレート（コーニング）をシスタチンＳ溶液（５μｇ／ｍＬ）で被覆し、３％のＢＳＡ溶液によってバックフィルする。８つの血清サンプル（２倍希釈物）およびポリクローナルラット抗シスタチンＳ抗体（価数１：１０００である）を一晩（４℃）でインキュベートし、および前処理したＥＬＩＳＡプレート上にアプライする。プレートは１時間３７℃でインキュベートする。サンプルの穴をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）によって洗浄する。添加したアルカリのホスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（価数１：２０００であるＪａｃｋｓｏｎｗｉ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）溶液を添加し、１時間（３７℃）の間インキュベートした。ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）を添加し、４０５ｎｍにおけるＯＤをマイクロプレートリーダーにより定量化する。

【0130】

二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡプレート（コーニング）をモノクローナルラット抗シスタチンＳ溶液（５μｇ／ｍＬ）により被覆し、３％ＢＳＡ溶液によりバックフィルした。８個の血清サンプル（２倍希釈）を１時間（３７℃）プレートの穴にインキュベートした。プレートをＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄する。ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体（価数：１：１０００）を穴にアプライし、１時間（３７℃）インキュベートする。当該穴をＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣコンプレックス）を加える。プレートを１時間３７℃でインキュベートし、穴をＴＢＳ緩衝液で洗浄する。ＴＭＢ溶液（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ， Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（ゲイザースバーグ、メリーランド）カタログ番号５０−７６−０１）を添加し、４０５ｎｍにおけるＯＤをマイクロプレートリーダーにより定量化する。

【0131】

実施例１ シスタチンＳの検出
１．結腸直腸癌細胞株培養上清におけるシスタチンＳ検出
ＣＳＴ４のｍＲＮＡを上で論じたように結腸直腸癌腫瘍において過剰発現する。分泌タンパク質として、シスタチンＳは種々の体液および分泌物中に見られうる。結腸直腸癌のマーカーとしてシスタチンＳを樹立するため、ＣＳＴ４のｍＲＮＡの高発現を伴うＳＷ４８０およびＣａＣＯ２の上清を１５％ポリアクリルアミドゲル（レーン５〜６、レーン７〜８のそれぞれ、図１４）に充填し、対照サンプル（健常者の血清）をゲル（レーン１〜２、レーン３〜４のそれぞれ、図１４）に充填した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ペルオキシダーゼ標識抗シスタチンＳ抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させた。ＴＭＢをタンパク質イメージ化に用いた。上記方法に従った。

【0132】

図１４に示されているように、β−アクチン（内部基準）はゲルのボトムにある。１６ｋＤａタンパク質を伴うバンドをレーン５〜８で観測し、レーン１〜４では、バンドが非常に薄かった。

【0133】

２．結腸直腸癌患者の血清におけるシスタチンＳ検出
セクション「１」に記載されているプロトコルは以下の通りであった。図１５に示されているように、β−アクチン（内部基準）は、ゲルのボトムにある。１６ｋＤａタンパク質を有するバンドはレーン３〜６（癌性サンプル）に観測され、レーン１〜２（対照サンプル）のバンドは極めてかすかであった。

【0134】

３．モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡによる血清シスタチンＳレベルの測定
実験：シスタチンＳ（５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートにアプライし、一晩（４℃）インキュベートした。血清サンプル（結腸直腸癌患者から３０個および健常者から２０個）を抗シスタチンＳモノクローナル抗体（価数１：２０００、３％のＢＳＡをＴＢＳに溶解させた）と混合し、一晩インキュベートした、当該サンプル混合物を前処理したＥＬＩＳＡプレートにアプライし、１時間（常温）インキュベートした。当該ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ウサギ抗体（０．０８μｇ／ｍＬ，ＴＢＳに溶解させた）でインキュベートした。プレートをｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ、ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と反応させた。マイクロプレートリーダーを定量化のために用いた。

【0135】

図１６に示されているように、健常な血清中のシスタチンＳレベルの中央値は１．５５ｎｇ／ｍＬであり、結腸直腸ガン血清中で３．７５ｎｇ／ｍＬである。３．１７９ｎｇ／ｍＬのカットオフ値は、癌性サンプルおよび健常サンプルを区別するのが可能である。

【0136】

４．結腸直腸癌診断および予測のためにシスタチンＳおよびＣＥＡの感度および特異性の比較
シスタチンＳをセクション「３」に記載されている方法に従って測定した。ＣＥＡを市販キット（ＤＲＧ、ドイツ，カタログ番号ＥＩＡ５０７１）を用いて測定し、取扱説明書に従っている。

【0137】

表３に示されているように、受信動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＡＵＣ）の値の下の面積は、シスタチンＳが０．６９８およびＣＥＡが０．５７３であり、前者はより感度と選択性が良いことを意味する。

【0138】

【表3】

【0139】

５．方法、検査キットおよびプロトコル
限定を意図せず、例証的な方法、検査キットおよびプロトコル

【0140】

結腸直腸癌の検出方法は以下を包含する。シスタチンＳアンチゲンを基板上に固定する。Ｒ＆Ｄ抗体（ＭＡＢ１２９６）を前処理した基板にアプライする。当該基板を洗浄し、ＡＬＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ａ２３９）などの二次抗体をアプライする。当該基板を洗浄し、直接的または間接的に標識（例におけるＡＬＰ）からの応答からタンパク質の量を測定および検出する。

【0141】

基板は、これに限定されないが、セルロースシート、プラスティックプレートおよび粒子などのセルロースベース材料である樹脂粒子を包含する。

【0142】

アンチゲンを共有結合でまたは非共有結合で固定し得る。試験用サンプルはヒト血清である。選択されまたは好ましい基板は、血清および基板中の他の成分間の非特異的相互作用を最小化するために、サンプルの添加前にＢＳＡによってバックフィルすべきである。その後、当該基板を界面活性剤を含むリン酸緩衝液などの適切な緩衝液によって洗浄する。

【0143】

標識二次抗体の限定を意図しない例は標識抗マウスポリクローナル抗体である。当該標識は、ＡＬＰ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび蛍光色素（フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ）など）などの酵素を包含するが、これらに限定されない。ビオチン、 アビジン、ストレプトアビジンおよびジギタリス配糖体などの分子は、抗体およびその標識の結合のために用いられてよい。

【0144】

酵素が標識である場合、その定性的検出および／または定量的検出は、酵素基質の添加および酵素による比色反応および／または発光反応により実現され得る。蛍光色素が標識である場合、その定性的検出および／または定量的検出は、ＵＶ露光および蛍光測定／検出により実現され得る。感光薬が必要に応じて用いられる。

【0145】

本発明の応用として、シスタチンＳまたはそのエピトープ（配列番号５０）に結合する分子は、必要に応じて、抗シスタチンＳ抗体またはそれらのフラグメント、二次抗体および固体基質、および１つまたは複数の補助供給品である。これらの必要な試薬または任意の試薬は検査キット内に供給される。上述した試薬は結腸直腸癌診断、ｐＴＮＭステージ判定、転移検出および治療の有効性の評価に用いられてよい。

【0146】

例えば、検査キットは、特異的抗体またはそのフラグメントとなる。また、検査キットは、サンプル中のターゲットタンパク質の検出のため任意にまたは好ましくは報告単位となる。報告単位は好ましくは適切な二次抗体であり、任意にまたは好ましくは（必要に応じて）検出のための標識化を含む。キットは任意にまたは好ましくは、タンパク質の基板インキュベート用およびサンプル中のタンパク質の非特異的相互作用の除去用のタンパク質のバックフィル用ならびに基板に固定されたタンパク質用の緩衝液などの１以上の緩衝液やサンプル、二次抗体および／または上述された試薬をインキュベートした後の基板の洗浄用緩衝液を包含する。

【0147】

任意に、キットは、競合方法用のコントロールタンパク質の固定化のための固体基質を提供する。この場合、抗体およびサンプルは事前にインキュベートされ、その後、その混合物は、基板にアプライされる。報告単位は抗体および基板の検出に用いられる。専門家は、抗体が血清サンプルからエピトープと結合するかどうかを決定し、血清エピトープと結合する抗体の量を定量的に測定するかもしれない。したがって、当該ターゲットタンパク質の量は決定され得る。

【0148】

任意に、キットは、二重抗体サンドイッチ法において用い得、抗シスタチンＳ抗体を基板上に固定する。シスタチンＳ標準溶液および前処理したサンプル血清を基板にアプライする。報告単位標識（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ−ｕｎｉｔ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）を有する抗シスタチンＳポリクローナル抗体を基板にアプライする。専門家は、抗体が血清サンプルからのエピトープと結合しているかどうか確かめ、血清エピトープに結合する抗体の量を定量的に測定できる。このようにして、ターゲットタンパク質の量は決定され得る。

【0149】

検査試薬および／または検査キット、ならびに／または測定器具および／またはキットおよび器具の組み合わせの必要条件の選択は検出に用いる方法に依存する。上述のように、これらの方法はタンパク質ブロッティングおよびフローサイトメトリを包含するが、これに限定されない。ＥＬＩＳＡ方法は上述されており、ブロッティングはより正しいが、さらなる設備および／または操作時間を必要とする。

【0150】

６．実証的検査キットおよびそのプロトコル
取得物をサンプリングし貯蔵する。血清について、血液サンプルを２時間室温で保存しまたは一晩４℃で保存する。当該サンプルを２０分間（１０００ｇ）遠心分離し、上清を血清として収集する。得られた血清サンプルを−２０℃または−８０℃で保存かつ繰り返して解凍し、凍結しないようにすべきである。血漿について、抗凝固薬としてＥＤＴＡまたはヘパリンを用いる。当該サンプルを、血液の収集後３０分未満の、１５分間（２〜８℃、１０００×ｇ）遠心分離する。得られた血漿サンプルを−２０℃または−８０℃で保存し、解凍を繰り返して、凍結しないようにすべきである。

【0151】

前処理物をサンプルする。血清または血漿サンプルを１０倍に薄めることを勧める。例えば、１００μＬ血清または血漿サンプルを９００μＬのＰＢＳ緩衝液と混ぜる。得られたサンプルを０．１ＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．２）で希薄する。

【0152】

検査キットは以下を包含するだろう：１）プラスチック箔で閉じたＥＬＩＳＡプレート、２）シスタチンＳ標準溶液。シスタチンＳ溶液を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液を用いて１０ｎｇ／ｍＬの濃度で調製する。当該原液を薄めて、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬおよび０．５ｎｇ／ｍＬの濃度の一連の溶液を調製する。１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液を０ｎｇ／ｍＬシスタチンＳを含む溶液として用いる。得られた溶液を試験前に１５分以内に調製すべきである。例えば、４ｎｇ／ｍＬシスタチンＳの調製を、エッペンドルフチューブ中、０．５ｍＬ（０．５ｍＬも）シスタチンＳ溶液（８ｎｇ／ｍＬ）および０．５ｍＬの希釈緩衝液を混合して行うことができる。他の濃度を同様にして実現し得る。３）バックフィル用の３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ緩衝液。４）コーティング用抗体：５μｇ／ｍＬのラット抗シスタチンＳモノクローナル抗体および希釈用緩衝液（０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ_３溶液、ｐＨ９．０）。５）ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳ（価数１：２００）および希釈緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ）。６）ＡＢＣ（ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体）。７）比色検出用ＴＭＢ溶液。８）ＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ中、０．０５％トゥイーン−２０）。９）停止液：２ＮＨ_２ＳＯ_４。

【0153】

詳細な操作プロトコルを以下に記載する。

【0154】

１）コーティング．ラット抗シスタチンＳ溶液を炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ９．０）を用いて５μｇ／ｍＬに希釈する。得られた溶液をポリスチレンプレート上の穴（０．１ｍＬ／１つの穴）にアプライする。当該プレートを一晩インキュベートする。穴の中の溶液を廃棄し、その穴を各３分間かけて３回洗浄する。

【0155】

２）バックフィル．上記穴に３％ＢＳＡを含む２００μＬＰＢＳＴ緩衝液を加える。当該プレートを１時間（３７℃）または一晩（４℃）でインキュベートする。その穴の中の溶液を廃棄し、当該穴を洗浄緩衝液を用いて３回、各回３分間洗浄する。

【0156】

３）サンプル充填．穴にブランク、標準溶液およびサンプル溶液を割り当てる。希釈緩衝液１００μＬ、標準溶液およびサンプル溶液をブランクの穴、標準穴およびサンプル穴のそれぞれに添加する。気泡をできないようにする。上記溶液を当該穴のボトムで充填し、溶液が穴の壁と接しないようにする。プレートを緩やかに振り、蓋またはプラスチック箔によって穴を閉じる。プレートを１２０分間（３７℃）インキュベートする。標準溶液を新たに調製し、結果物の精度を確かめる。

【0157】

４）穴の残留溶液を廃棄し、プレートを乾燥する。プレートを洗浄しない。ビオチン化ウサギ抗シスタチンＳポリクローナル抗体溶液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで２００倍に希釈する）を加える。蓋またはプラスチック箔によって穴を閉じる。６０分間（３７℃）、プレートをインキュベートする。

【0158】

５）６０分間、プレートをインキュベートし、穴の中の残留液体を廃棄する。当該プレートを乾燥した後に、プレートを３回、各回１〜２分間、３００μＬ洗浄緩衝液に浸して洗浄する。プレートを乾燥し、プレートをシェイクして、穴の中の残留液体を除去する。

【0159】

６）１００μＬのＡＢＣ溶液を穴に加える。箔によって穴を閉じ、６０分間（３７℃）、プレートをインキュベートする。

【0160】

７）６０分間、プレートをインキュベートし、穴の中の液体を廃棄し、プレートを乾燥する。プレートを５回、各回１〜２分間、３００μＬ洗浄緩衝液を浸して洗浄する。プレートを乾燥し、プレートを振盪して、穴の中の残留液体を除去する。

【0161】

８）続けて、穴の中に５０μＬ酵素基質溶液を加え、プレートを箔で閉じ、プレートを１５分未満、暗闇（３７℃）でインキュベートする。標準穴の中の溶液が濃度に対応して青色であり、ブランクの穴において無色であるときに反応を止める。

【0162】

９）反応を５０μＬ停止溶液を加えて止める。溶液は青から黄に変化する。停止溶液の添加の順番は、酵素基質の添加の順番と同一である。停止溶液を、反応が、終了しかけているときに、すぐに添加し、試験の精度を確認する。

【0163】

１０）酵素反応の停止後すぐに生じる穴の中の溶液のＯＤ値の測定（４０５ｎｍ）

【0164】

計算：ＯＤ値に対して個々の溶液の濃度をプロットする。校正方程式を、データ調整を通して得、Ｒ^２を計算し、それは効果的試験用の０．９５より高いはずである。検体を、サンプルおよび校正方程式のＯＤ値を用いて計算する。

【0165】

７．結腸直腸癌ｐＴＮＭステージ判定用のシスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション６と同一である。結腸直腸癌患者（２０個のＴステージの例、３０個のＮステージの例および３０個のＭステージの例）サンプルを細胞的に８０人診断する。癌の成長を表４にまとめるように、シスタチンＳ発現は増加し、シスタチンＳタンパク質発現はｐＴＮＭステージ判定のために用いられうることを示す。

【0166】

【表4】

【0167】

８．結腸直腸癌転移診断用のシスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション６と同一である。結腸直腸癌患者５０人のサンプルを細胞的に診断し、そのうち３０人の患者は癌転移している。表５にまとめるように、シスタチンＳ発現は、癌転移をしていない患者より転移する患者において高く、シスタチンＳ発現が結腸直腸癌転移診断用のマーカーであることを示している。

【0168】

【表5】

【0169】

９．結腸直腸癌の治療のために化学療法と組み合わせられる内分泌セラピーの評価用シスタチンＳ発現
実験の詳細は、セクション６と同一である。１０００人の結腸直腸癌（Ｎ０−１ステージ）を研究した。患者を５−ＦＵ／ＬＶ（レバミゾール）レジメで４回治療した。全患者は２４月続けた。シスタチンＳ発現を上記セラピーの最終サイクルの後測定した。当該研究において３６４人の場合に有効であり、シスタチンＳ発現の中央値は２．５６ｎｇ／ｍＬだった。図１８に示されているように、中央値より高いシスタチンＳ発現を有する患者の疾患を有しない生存率（ＤＦＳ）は３０％であり、中央値より低いシスタチンＳ発現を有する患者の疾患を有しない生存率（５０％）より低かった。

【0170】

全実施例は本発明のいくつかの特徴部をよりよくかつより明らかに説明することに留意されたい。それは、一つの特徴部と組み合わせられうる。全特徴部またはそれに隣接する特徴部を必要に応じて組み合わせ得る。

【0171】

本発明における方法は実施例により例示され提供された。多くの置換、改良および変更がこの分野での専門家に進められている。これらの置換、改良および変更の任意の効果は請求項およびそれらの妥当な拡張の部分である。本特許において参照されている任意の出版物、特許および特許出願は、実施工程および本発明に包含されていないプロトコルの詳細を説明するために用いられるべきである。本発明に述べられている任意の参照は本発明の技術の代替として認知されていない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]