特許 6195306 ＥＬの酵素活性を阻害するＥＬに対するモノクローナル抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6195306

(24)【登録日】2017年8月25日

(45)【発行日】2017年9月13日

(54)【発明の名称】ＥＬの酵素活性を阻害するＥＬに対するモノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/02 20060101AFI20170904BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20170904BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170904BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170904BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170904BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 CZNA

   C07K16/40

   A61P43/00 111

   A61P9/10 101

   A61K39/395 P

【請求項の数】4

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2013-538562(P2013-538562)

(86)(22)【出願日】2012年10月11日

(86)【国際出願番号】JP2012076284

(87)【国際公開番号】WO2013054830

(87)【国際公開日】20130418

【審査請求日】2015年8月6日

(31)【優先権主張番号】特願2011-224846(P2011-224846)

(32)【優先日】2011年10月12日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001926

【氏名又は名称】塩野義製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100108970

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 秀晃

(74)【代理人】

【識別番号】100113789

【弁理士】

【氏名又は名称】杉田 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100103230

【弁理士】

【氏名又は名称】高山 裕貢

(72)【発明者】

【氏名】内藤 正一

(72)【発明者】

【氏名】小野田 順二

(72)【発明者】

【氏名】塚本 輔

(72)【発明者】

【氏名】山田 勝利

(72)【発明者】

【氏名】山根 昌治

(72)【発明者】

【氏名】沼田 義人

(72)【発明者】

【氏名】前川 和彦

(72)【発明者】

【氏名】高橋 竜也

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 康彦

【審査官】 川口 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 JIN, W., et al.，Inhibition of endothelial lipase causes increased HDLcholesterol levels in vivo.，J. Clin. Invest.，２００３年 ２月 １日，vol.111, no.3，p.357-362

【文献】 GRIFFON, N., et al.，Identification of the active form of endothelial lipase,a homodimer in a head-to-tail conformation.，J. Biol. Chem.，２００９年 ８月２８日，vol.284, no.35，p.23322-23330

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ１２Ｐ ２１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）ＣＤＲ１として配列番号７、ＣＤＲ２として配列番号８およびＣＤＲ３として配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号１１、ＣＤＲ２として配列番号１２およびＣＤＲ３として配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２）ＣＤＲ１として配列番号１９、ＣＤＲ２として配列番号２０およびＣＤＲ３として配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号２３、ＣＤＲ２として配列番号２４およびＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
３）ＣＤＲ１として配列番号２７、ＣＤＲ２として配列番号２８およびＣＤＲ３として配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号３１、ＣＤＲ２として配列番号３２およびＣＤＲ３として配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
４）ＣＤＲ１として配列番号３５、ＣＤＲ２として配列番号３６およびＣＤＲ３として配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号３９、ＣＤＲ２として配列番号４０およびＣＤＲ３として配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
５）ＣＤＲ１として配列番号４３、ＣＤＲ２として配列番号４４およびＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号４７、ＣＤＲ２として配列番号４８およびＣＤＲ３として配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
６）ＣＤＲ１として配列番号５１、ＣＤＲ２として配列番号５２およびＣＤＲ３として配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号５５、ＣＤＲ２として配列番号５６およびＣＤＲ３として配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
７）ＣＤＲ１として配列番号５９、ＣＤＲ２として配列番号６０およびＣＤＲ３として配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに、
ＣＤＲ１として配列番号６３、ＣＤＲ２として配列番号６４およびＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれるＥＬに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。

【請求項2】

１）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２）配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
３）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
４）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
５）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
６）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
７）配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれるモノクローナル抗体またはその抗体断片。

【請求項3】

請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する、ＥＬが関連する疾患の治療または予防のための医薬組成物。

【請求項4】

ＥＬが関連する疾患が動脈硬化症である請求項３記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血管内皮リパーゼ（Endothelial Lipase。以下、ＥＬとする）の活性を阻害するモノクローナル抗体およびこれを含有する医薬組成物に関する。具体的には、本発明はＥＬの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体もしくはその一部またはこれを含有する医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥＬは、Triglyceride lipase（以下、ＴＧとする。）ファミリーに属するPhospholipaseである（非特許文献１）。ヒトＥＬは５００残基（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００６０２４．１、配列番号：１）のアミノ酸からなり、ウサギＥＬも５００残基（ＮＰ＿００１１８２５６７．１、配列番号：２）のアミノ酸からなる。ＴＧファミリーには、Lipoprotein lipase（以下、ＬＰＬとする。）やHepatic lipase（以下、ＨＬとする。）が含まれる。

【0003】

ＥＬは、その強いPhospholipase活性によりＨＤＬコレステロール（以下、ＨＤＬ−ｃとする。）の代謝に関与することがそのノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの解析から明らかとなり、血中ＨＤＬ−ｃ量を規定する因子として注目されている（非特許文献２）。冠動脈疾患(以下、ＣＡＤとする。)と血中ＨＤＬ−ｃ量に負の相関関係が成立することは古くから知られている。ＨＤＬ−ｃは抗酸化作用・抗炎症作用・コレステロール逆転送作用などを介して抗動脈硬化作用を示すとされ、低ＨＤＬ−ｃ血症はＣＡＤのリスクファクターの一つと認識されている。したがって、ＥＬ阻害剤はＨＤＬ−ｃの上昇を介してＣＡＤ治療薬となり、実際にＥＬをノックアウトした病態マウスではＨＤＬ−ｃ上昇と動脈硬化病変部位の減少が報告されている（非特許文献３）。
これらの知見は、ＥＬの選択的阻害剤は脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬としての有用性を示している。

【0004】

ＥＬを選択的に阻害することが、脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬として有用であるため、ＥＬの酵素活性を阻害するＥＬに対する抗体の作製は重要なアプローチの１つとなる。これまでに、ウサギから得たＥＬの酵素活性を阻害するポリクローナルの抗体を作製し、マウスにこの抗体を投与することで、血中ＨＤＬ−ｃ濃度が上昇したことが報告されている（非特許文献４）。

【0005】

しかし、ＥＬの多様な部位を認識するポリクローナル抗体では、ＥＬに対する阻害の選択性は高くない。また、ＥＬが関与する脂質代謝異常症や動脈硬化症のような慢性疾患の治療薬は、長期間に渡って投薬する必要があるので、ヒトに対して抗原性の高いウサギポリクローナル抗体を医薬品として使用することは不可能である。しかも、抗原性を改善しようにも、ポリクローナル抗体ではそのようなことは困難である。
これらの事情により、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体の作製が求められていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９年、第２１巻、４２４ページ

【非特許文献2】ＴＣＭ、第１４巻、第５号、２００４年、ｐ．２０２−２０６

【非特許文献3】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２７９， Ｎｏ．４３， ２２， ４５０８５−４５０９２， ２００４

【非特許文献4】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００３年、第１１１巻第３号、３５７ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体もしくはその抗体断片またはこれを含有する医薬組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究の結果、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害するモノクローナル抗体を見出すことによって本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３１位から４５９位の領域に結合する、モノクローナル抗体またはその抗体断片、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１１位から４５９位の領域に結合する、前記（１）に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（３）ＥＬの酵素活性を阻害する、前記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（４）１）配列番号７、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２）配列番号７、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
３）配列番号７、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
４）配列番号７、配列番号８および配列番号９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
５）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
６）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
７）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
８）配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
９）配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１０）配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１１）配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１２）配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１３）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１４）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１５）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１６）配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１７）配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１８）配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１９）配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２０）配列番号４３、配列番号４４および配列番号４５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２１）配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２２）配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２３）配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２４）配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２５）配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２６）配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２７）配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、および、
２８）配列番号５９、配列番号６０および配列番号６１のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびに、
配列番号６３、配列番号６４および配列番号６５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲのうち１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれる抗体またはその抗体断片、
（５）１）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２）配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
３）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
４）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
５）配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
６）配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号２２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
７）配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
８）配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号２２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
９）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１０）配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号３０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１１）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１２）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号３０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１３）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１４）配列番号３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号３８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１５）配列番号３４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１６）配列番号３４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号３８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１７）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１８）配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号４６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
１９）配列番号４２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２０）配列番号４２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号４６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２１）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２２）配列番号５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号５４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２３）配列番号５０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２４）配列番号５０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号５４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２５）配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、
配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２６）配列番号５８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
配列番号６２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
２７）配列番号５８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号６２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、および
２８）配列番号５８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域、および
配列番号６２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域を有し、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
からなる群より選ばれる抗体またはその抗体断片、
（６）前記（３）〜（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含有する、ＥＬが関連する疾患の治療または予防のための医薬組成物、
（７）ＥＬが関連する疾患が動脈硬化症である（６）記載の医薬組成物、
（８）ＥＬが関連する疾患の治療または予防のための、前記（３）〜（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（９）ＥＬが関連する疾患が動脈硬化症である（８）記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
（１０）前記（３）〜（５）のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を投与することを特徴とする、ＥＬが関連する疾患の予防または治療方法、
（１１）ＥＬが関連する疾患が動脈硬化症である（１０）記載の方法、
（１２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３１位から４５９位を含有してなるペプチド、または、該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド、を用いることを特徴とする、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、もしくは該モノクローナル抗体またはその抗体断片を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニング方法、
（１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４１１位から４５９位を含有してなるペプチド、または、該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド、を用いることを特徴とする、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片、もしくは該モノクローナル抗体またはその抗体断片を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニング方法、
（１４）前記（１２）または（１３）のスクリーニング方法をその工程に含む、ＥＬの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体またはその抗体断片の製造方法、
（１５）前記（１４）の製造方法により作製されたモノクローナル抗体またはその抗体断片、
に関する。

【発明の効果】

【0010】

本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害する活性を有するので、本発明のモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、医薬品、特に、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および／またはシンドロームＸの治療および／または予防のための医薬として非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ヒトおよびウサギＥＬを抗原としたＥＬＩＳＡにおける、１２Ｂ１０抗体とヒトＥＬおよびウサギＥＬの結合活性を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体は、ヒトＥＬおよびウサギＥＬと結合することが確認された。グラフの縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示す。

【図2】図２は、１２Ｂ１０抗体のヒトＥＬおよびウサギＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体の濃度依存的に、ヒトおよびウサギのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は１２Ｂ１０抗体の濃度（μg/ml）を示す。

【図3】図３は、１２Ｂ１０抗体の、ヒトおよびウサギＨＬ、ならびにヒトおよびウサギＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体がヒトおよびウサギＨＬ、ならびにヒトおよびウサギＬＰＬの酵素活性を阻害しないことが確認された。グラフの縦軸は１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図4】図４は、ヒトＥＬ断片（ヒトＥＬ＿４１１−５００およびヒトＥＬ＿４１１−４５９）を抗原としたＥＬＩＳＡにおいて、１２Ｂ１０抗体と２種類のヒトＥＬ断片との結合活性を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体は、ヒトＥＬ＿４１１−５００およびヒトＥＬ＿４１１−４５９いずれにも結合することが確認された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は各Ｌｙｓａｔｅを希釈した倍率を示す。

【図5A】図５Ａは、ヒトＥＬ、ヒトＬＰＬ及びヒトＨＬのアミノ酸配列のアラインメントを示す。２種以上で共通するアミノ酸を実線の枠で囲んでいる。★印のアミノ酸はcatalytic triad を示し、１２Ｂ１０抗体の結合領域のアミノ酸配列を破線の枠で囲んでいる。

【図5B】図５Ｂは、ヒトＥＬ、ヒトＬＰＬ及びヒトＨＬのアミノ酸配列のアラインメントを示す。２種以上で共通するアミノ酸を実線の枠で囲んでいる。★印のアミノ酸はcatalytic triad を示し、本発明の抗体の結合領域のアミノ酸配列を破線の枠で囲んでいる。

【図6A】図６Ａは、１２Ｂ１０抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6B】図６Ｂは、４７Ｂ２抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6C】図６Ｃは、２５Ｅ４抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6D】図６Ｄは、１６Ａ１１抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6E】図６Ｅは、８Ｆ５抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6F】図６Ｆは、３Ｂ１抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図6G】図６Ｇは、４１Ｈ８抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。

【図7A】図７Ａは、１２Ｂ１０抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は１２Ｂ１０抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7B】図７Ｂは、４７Ｂ２抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。４７Ｂ２抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は４７Ｂ２抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は４７Ｂ２抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7C】図７Ｃは、２５Ｅ４抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。２５Ｅ４抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は２５Ｅ４抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は２５Ｅ４抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7D】図７Ｄは、１６Ａ１１抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１６Ａ１１抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は１６Ａ１１抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は１６Ａ１１抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7E】図７Ｅは、８Ｆ５抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。８Ｆ５抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は８Ｆ５抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は８Ｆ５抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7F】図７Ｆは、３Ｂ１抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。３Ｂ１抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は３Ｂ１抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は３Ｂ１抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図7G】図７Ｇは、４１Ｈ８抗体のカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。４１Ｈ８抗体の濃度依存的に、これらのＥＬ活性が阻害されることが確認された。グラフの縦軸は４１Ｈ８抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示し、横軸は４１Ｈ８抗体の濃度（ｎＭ）を示す。

【図8A】図８Ａは、１２Ｂ１０抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8B】図８Ｂは、４７Ｂ２抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。４７Ｂ２抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は４７Ｂ２抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8C】図８Ｃは、２５Ｅ４抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。２５Ｅ４抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は２５Ｅ４抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8D】図８Ｄは、１６Ａ１１抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。１６Ａ１１抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は１６Ａ１１抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8E】図８Ｅは、８Ｆ５抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。８Ｆ５抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は８Ｆ５抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8F】図８Ｆは、３Ｂ１抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。３Ｂ１抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は３Ｂ１抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8G】図８Ｇは、４１Ｈ８抗体の、ヒトＨＬおよびヒトＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。４１Ｈ８抗体がヒトＨＬおよびヒトＬＰＬの酵素活性を阻害せず、カニクイザルＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は４１Ｈ８抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8H】図８Ｈは、８Ｆ５抗体の、ウサギＨＬおよびウサギＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。８Ｆ５抗体がウサギＨＬおよびウサギＬＰＬの酵素活性を阻害せず、ウサギＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は８Ｆ５抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図8I】図８Ｉは、４７Ｂ２抗体の、ウサギＨＬおよびウサギＬＰＬに対する酵素活性阻害能を測定した結果を示す。４７Ｂ２抗体がウサギＨＬおよびウサギＬＰＬの酵素活性を阻害せず、ウサギＥＬを阻害することが確認された。グラフの縦軸は４７Ｂ２抗体を添加しない時の酵素活性に対する比活性（％）を示す。

【図9A】図９Ａは、１２Ｂ１０抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。１２Ｂ１０抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9B】図９Ｂは、４７Ｂ２抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。４７Ｂ２抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9C】図９Ｃは、２５Ｅ４抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。２５Ｅ４抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9D】図９Ｄは、１６Ａ１１抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。１６Ａ１１抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9E】図９Ｅは、８Ｆ５抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。８Ｆ５抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9F】図９Ｆは、３Ｂ１抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。３Ｂ１抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図9G】図９Ｇは、４１Ｈ８抗体の、カニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに対する結合性を測定した結果を示す。４１Ｈ８抗体がカニクイザルＥＬ、ヒヒＥＬ、ウサギＥＬおよびヒトーマウスキメラＥＬに結合することが示された。グラフの縦軸は吸光度を示し、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

【図10A】図１０Ａは、ウサギに４７Ｂ２および８Ｆ５抗体を投与し、血中のＨＤＬ−ｃ濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸はＨＤＬ−ｃ濃度を示し、横軸は抗体投与後の日数を示す。

【図10B】図１０Ｂは、ウサギに４７Ｂ２および８Ｆ５抗体を投与し、血中のＨＤＬ−ｃ濃度を測定した結果を示す。グラフの縦軸は初日の血中ＨＤＬ−ｃ濃度に対する血中ＨＤＬ−ｃ濃度を示し、横軸は抗体投与後の日数を示す。

【図11A】図１１Ａは、７つの抗体の重鎖のアミノ酸配列のアライメントを示す。

【図11B】図１１Ｂは、７つの抗体の軽鎖のアミノ酸配列のアライメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害することを特徴とするモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、ＥＬの酵素活性を選択的に阻害する活性を有するので、動脈硬化やメタボリックシンドロームの予防・治療薬として有用である。

【0013】

本発明のモノクローナル抗体を調製するために使用される抗原としては、配列番号１の３３１位から４５９位のアミノ酸配列を含む連続したアミノ酸残基を有するものであることが重要である。長さは特に限定されないが、免疫原性を有する長さである６残基以上であることが望ましい。このような抗原の具体例として、天然に、あるいは人工的に高発現する細胞株、その膜画分、あるいはその精製物、その他のタンパク質またはペプチド（例えば、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、ＨＩＳ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｃ２タグなどのタグタンパク質、ＧＦＰ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク質など）との融合タンパク質、または化学的に合成されたペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある。）。なお、これら免疫原の調製法はいずれも当業者にとって公知である。

【0014】

本発明のモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって調製することができる。具体的には、本発明の抗原を、必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜２１日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜１０日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。

【0015】

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、ｖｏｌ．２５６、ｐ４９５〜４９７）及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えばＰ３−Ｕ１、ＮＳ−１、ＳＰ−２、６５３、Ｘ６３、ＡＰ−１などを使用することができる。

【0016】

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述のマウス免疫感作で用いた本発明の抗原に対する反応性を、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等の測定法によって測定し、当該抗原あるいはハプテンに対して特異的結合を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は抗原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、放射性物質、蛍光物質、酵素などで標識した二次抗体で検出する方法が用いられる。また、抗原の発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光で標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上の本発明の抗原に結合できるモノクローナル抗体を検出することができる。

【0017】

選択したハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。

【0018】

基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。

【0019】

モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。

【0020】

また、本発明のモノクローナル抗体として、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。

【0021】

具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９７９) １８、５２９４-５２９９)等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ファルマシア製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。

【0022】

得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥＫｉｔ (クローンテック製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８年、第８５巻、 ８９９８ページなど)を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。

【0023】

目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

【0024】

抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３参照）。

【0025】

上記以外の本発明のモノクローナル抗体の作製方法には、いわゆるファージディスプレイ技術（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５（２００５））も用いることができる。具体的には、例えばヒトや動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリー、もしくはヒトや動物のＧｅｒｍ Ｌｉｎｅ配列から選別、および改変して完全合成した抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させる。このとき、細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられる。

【0026】

こうして得たモノクローナル抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の対応領域と組替えることにより、抗体遺伝子を得ることができる。そして、このようにして得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生することができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。

【0027】

本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬの酵素活性を阻害することが特徴である。以下、ＥＬの酵素活性阻害能の測定手順の一例を記す。

【0028】

ＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ２で２日間培養する。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて
懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションし、その後、遠心により細胞を除去して得た上清をＥＬ酵素溶液として、阻害活性測定に使用する。２０mM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)、０．５％ウシ血清アルブミン、４mM 塩化カルシウム、１５０mM 塩化ナトリウム、２mg/mLヒトＨＤＬ(Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で構成される反応溶液にモノクローナル抗体を添加した後に、ＥＬ酵素溶液を添加する。３７℃で２時間反応後、ＥＬ酵素によってＨＤＬから生成される遊離脂肪酸(ＮＥＦＡ)をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量を酵素活性指標とする。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出、その阻害曲線より抗体の５０％阻害濃度(ＩＣ５０値)を求めることができる。

【0029】

ＥＬ酵素の阻害活性の阻害率が５０％を示す抗体の有効濃度（ＩＣ５０）は、しばしばＥＬ阻害活性を示す指標の一つとして用いられている。

【0030】

また、本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬ酵素を選択的に阻害することが特徴である。以下、ＥＬ酵素を選択的に阻害すること、言い換えれば、ＬＰＬおよびＨＬの酵素活性を阻害しないことの確認手順の一例を示す。

【0031】

ＨＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔａｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ２で２日間培養する。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて
懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションし、その後、遠心により細胞を除去して得た上清をＨＬ酵素溶液とする。同様の操作により、ＬＰＬ酵素溶液を調製する。２０mM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)、０．５％ウシ血清アルブミン、４mM 塩化カルシウム、１５０mM 塩化ナトリウム、０．５mg/mLヒトＶＬＤＬ(ＩＮＴＲＡＣＥＬ社製）で構成される反応溶液に、モノクローナル抗体を添加した後に、ＨＬまたはＬＰＬ酵素溶液を添加する。３７℃で２時間反応後、ＨＬまたはＬＰＬ酵素によって、ＶＬＤＬから生成される遊離脂肪酸(ＮＥＦＡ)をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量を酵素活性指標として、モノクローナル抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出する。

【0032】

ＥＬ酵素に対して選択的な阻害活性を有するとは、ＥＬに対するＩＣ５０に相当する量のモノクローナル抗体を入れた際において、ＬＰＬおよびＨＬの酵素活性を３パーセント以上阻害しない場合を意味する。本発明のモノクローナル抗体は、ＬＰＬおよびＨＬの酵素活性を阻害せず、ＥＬ酵素を選択的に阻害することが特徴なので、エピトープ部位は、ＥＬがＬＰＬやＨＬと相同性を有しない領域であることが好ましい。

【0033】

本発明のモノクローナル抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型モノクローナル抗体、例えば、キメラモノクローナル抗体、ヒト型化モノクローナル抗体や、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。

【0034】

本発明のモノクローナル抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明におけるモノクローナル抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。

【0035】

また本発明のモノクローナル抗体は、そのＮ末端あるいはＣ末端に他のタンパク質を融合してもよい（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １０， １２７４−１２８１）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。

【0036】

本発明において「モノクローナル抗体断片」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にＥＬに特異的な結合性を有する断片、または当該モノクローナル抗体と同様にＥＬに特異的な結合性を有し、かつＥＬの酵素活性を阻害する作用を有する断片を意味する。ＥＬに対して特異的結合性を有する断片とは、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｃＦｖ)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｓＦｖ)、２量化体Ｖ領域断片 (Ｄｉａｂｏｄｙ)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。

【0037】

本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、医薬組成物として有用である。したがって本発明のモノクローナル抗体およびその抗体断片を含む医薬組成物は、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＥＬに対して特異的結合性を有するので、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および／またはシンドロームＸの診断にも応用可能である。

【0038】

本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３１位から４５９位の領域に結合することを特徴とする。配列番号１で示されるアミノ酸配列の３３１位から４５９位の領域に結合するとは、当該領域内の任意のアミノ酸配列に結合することを意味し、モノクローナル抗体またはその抗体断片が当該領域全てのアミノ酸配列に結合していることを意味はしない。

【0039】

本発明の医薬組成物の対象患者は動脈硬化やメタボリックシンドロームであることが想定される。有効投与量は、一回につき体重１kgあたり０．０１mgから１００mgの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり５〜５０００mg、好ましくは１０〜５００mgの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

【0040】

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。

【実施例1】

【0041】

ヒトＥＬ発現アデノウイルス調製
ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クロンテック社製）に、ＰＣＲ法、制限酵素を用いた手法により、Ｃ２タグ（配列番号３）を付加したヒトＥＬｃＤＮＡ配列をクローニングした。このサブクローンベクターと、アデノウイルス骨格遺伝子を有するベクターを、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ酵素により消化した（Ａｄｅｎｏ−ｘ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｋｉｔ, クロンテック社製）。消化断片のライゲーション反応を１６℃、３時間行い（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ, 東洋紡社製）、ライゲーション産物を大腸菌株(ワンショットＳｔｂｌ３ケミカルコンピテントセル, インビトロジェン社製)にトランスフォームした。アンピシリン選択後、得られたクローンよりプラスミドを精製し（ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社製）、次いでＰａｃＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）処理による大腸菌生育領域の切り出しを行った。以上により、アデノウイルスベクター作製のためのプラスミドＤＮＡを得た。得られたプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００(インビトロジェン社製）を用いてトランスフェクションし、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５% ＣＯ２下で培養した。トランスフェクション後は５日おきに培地交換を行い、細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認されるまで培養を継続した。ＣＰＥの確認後、培養上清および細胞を回収した。回収した細胞は、ドライアイス・メタノール浴と温水浴を用い凍結融解を５回程度繰り返した後、３０００ｒｐｍにて１５分遠心して得られた上清を、細胞抽出液として回収した。この細胞抽出液と、培養上清を混合し、ウイルスベクター含有液とした。このウイルスベクター含有液をＨＥＫ２９３細胞に添加し、同様の操作を繰り返すことにより、ウイルスベクターの増幅を行った。増幅後、最終的に得られた細胞抽出液を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ−Ｎｏｖａｇｅｎ社製）で３７℃、３０分間処理後遠心し、得られた上清を、以下の密度勾配遠心によるウイルスベクター精製に用いた。１．５、１．３５、１．２５ｇ／ｃｍ^３の塩化セシウムを含むＰＢＳ(Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ)を遠心管内に重層し、次いで上記上清を重層した。これを３５０００ｒｐｍ, １６℃で１時間遠心し、目視によって得られたウイルスベクターを回収した。回収したウイルスベクターは、１０％グリセロール含有ＰＢＳに対して透析を行い、精製アデノウイルスベクターとした。ウイルスベクターは一部をタイター測定（Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｒａｐｉｄ ｔｉｔｅｒ ｋｉｔ, クロンテック社製）および自己増殖能獲得型出現判定に用い、異常のないもののみを以下の免疫に使用した。

【実施例2】

【0042】

ヒトＥＬ過剰発現細胞とヒトＥＬ Ｌｙｓａｔｅの調製
ヒトＥＬ−Ｃ２タグを得るために、ヒトＥＬをコードするＤＮＡ断片の３'側にＣ２タグをコードするＤＮＡ断片を付加し、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを介して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)に挿入し、ヒトＥＬ発現プラスミドを構築した。ヒトＥＬ発現ベクターとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００(インビトロジェン社製)を用いて、ＨＥＫ２９３細胞(ＡＴＣＣ社より購入)をトランスフェクションし、４８時間培養後に、細胞を回収し、ヒトＥＬ過剰発現細胞とした。この細胞を、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ(１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ Ｎａｃｌを含む２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０)にて溶解し、遠心にて可溶化画分を回収し、ヒトＥＬ Ｌｙｓａｔｅとした。同様の方法で、ウサギＥＬ Ｌｙｓａｔｅを調製した。
ヒトＥＬ−Ｃ２タグのアミノ酸配列は配列番号１に、ウサギＥＬ−Ｃ２タグのアミノ酸配列は配列番号２に記載した。

【実施例3】

【0043】

ヒトＥＬ＿４１１−５００断片Ｌｙｓａｔｅ（配列番号４）とヒトＥＬ＿４１１−４５９断片Ｌｙｓａｔｅ（配列番号５）の調製
配列番号１の４１１位から５００位のアミノ酸を含む断片をコードするｃＤＮＡの５'側にＨｉｓタグと３'側にＣ２タグをコードするｃＤＮＡを付加し、ｐｃＤＮＡ３．３(インビトロジェン社製)にクローニングして、ヒトＥＬ＿４１１−５００断片発現ベクターとした。同様の方法で、ヒトＥＬ＿４１１−４５９断片発現ベクターを調製した。
それぞれのヒトＥＬ断片発現ベクターとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００(インビトロジェン社製)を用いて、ＨＥＫ２９３細胞(ＡＴＣＣ社製)をトランスフェクションし、４８時間培養後に、細胞をＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ(１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００mM ＮａＣｌを含む２５mM トリス緩衝液ｐＨ８．０)にて溶解し、遠心にて可溶化画分を回収し、それぞれヒトＥＬ＿４１１−５００断片Ｌｙｓａｔｅ、ヒトＥＬ＿４１１−４５９断片Ｌｙｓａｔｅとした。

【実施例4】

【0044】

ヒトＥＬ発現アデノウイルスベクター免疫
精製したヒトＥＬ発現アデノウイルスベクター２×１０^９i.f.u.相当を、８週齢の雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ種、日本エスエルシーより入手）の静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。投与後は、７日毎に尾静脈より血液を採取し、これより調製した血清を用いて抗体価の測定を行った。また、初回のアデノウイルスベクター投与に加えて、追加免疫として同量のアデノウイルスベクターを静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。抗体価の上昇を認めたマウスについて、最終免疫として、尾静脈よりブースター免疫を実施した。

【実施例5】

【0045】

抗体産出ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に、ヒトＥＬに対する抗体価の上昇が認められた個体について開腹し、脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。

【実施例6】

【0046】

ヒトＥＬに結合する抗体を産出するハイブリドーマの選定
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＳＩＡは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μgの抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を1００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清を加えて２時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのヒトＥＬ ｌｙｓａｔｅを含むアッセイバッファー(４％ブロックエース、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４)を加えて、４℃で１６時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのビオチン標識抗Ｃ２タグ抗体(Ｆａｂ)とＨＲＰ標識ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で１時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、リコンビナントヒトＥＬと結合したハイブリドーマのクローン（１２Ｂ１０）を得た。１２Ｂ１０のクローンが産出する抗体を１２Ｂ１０抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、１２Ｂ１０の抗体のサブクラスを決定した結果、１２Ｂ１０抗体のサブクラスは、ＩｇＧ２ａであった。

【実施例7】

【0047】

１２Ｂ１０抗体とヒトおよびウサギＥＬとの結合能測定
抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体固相化プレートに、１５μｌの１２Ｂ１０抗体(１μg/mL)を含むアッセイバッファー加えて２時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのヒトＥＬ ｌｙｓａｔｅ、ウサギＥＬ ｌｙｓａｔｅ、またはＭｏｃｋ ｌｙｓａｔｅ（ネガティブコントロール）を含むアッセイバッファーを加えて、４℃で１６時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのビオチン標識抗Ｃ２タグ抗体(Ｆａｂ)とＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含むアッセイバッファーを加え、室温で１時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１２Ｂ１０抗体は、ヒトＥＬおよびウサギＥＬに結合することが示された(図１)。

【実施例8】

【0048】

１２Ｂ１０抗体のＥＬ酵素活性阻害能の測定
ヒトＥＬおよびウサギＥＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトＥＬ酵素溶液とした。２０mM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)、０．５％ウシ血清アルブミン、４mM 塩化カルシウム、１５０mM 塩化ナトリウム、２mg/mLヒトＨＤＬ(Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で構成される反応溶液に１２Ｂ１０抗体を添加した後に、ヒトＥＬ酵素溶液またはウサギＥＬ酵素溶液を添加した(全量で１０μl )。３７℃で２時間反応後、ＥＬ酵素によってＨＤＬから生成される遊離脂肪酸(ＮＥＦＡ)をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量を酵素活性指標とした。１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出、その阻害曲線より１２Ｂ１０抗体の５０％阻害濃度(ＩＣ５０値)を求めた(図２)。その結果、１２Ｂ１０抗体はヒトＥＬおよびウサギＥＬの酵素活性を阻害し、そのＩＣ５０は、それぞれ、４７ｎM (ヒトＥＬ)および２０１ｎM (ウサギＥＬ)であった。

【実施例9】

【0049】

１２Ｂ１０抗体のＨＬおよびＬＰＬ酵素活性阻害能の測定
ヒトＨＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔａｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトＨＬ酵素溶液とした。同様の操作によりウサギＨＬ、ならびにヒトＬＰＬおよびウサギＬＰＬ酵素溶液を調製した。２０mM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)、０．５％ウシ血清アルブミン、４mM 塩化カルシウム、１５０mM 塩化ナトリウム、０．５mg/mLヒトＶＬＤＬ(ＩＮＴＲＡＣＥＬ社製）で構成される反応溶液に１２Ｂ１０抗体溶液（終濃度 ３２μg/ml）を添加した後、ヒトもしくはウサギＨＬ、またはヒトもしくはウサギＬＰＬ酵素溶液を添加した(全量で１０μl)。３７℃で２時間反応後、ＨＬもしくはＬＰＬ酵素によって、ＶＬＤＬから生成される遊離脂肪酸(ＮＥＦＡ)をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量を酵素活性指標とした。１２Ｂ１０抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した(図３)。その結果、１２Ｂ１０抗体は、ＨＬとＬＰＬの酵素活性を阻害しないことがわかった。

【実施例10】

【0050】

１２Ｂ１０抗体のエピトープマッピング
抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体固相化プレートに、１５μｌの１２Ｂ１０抗体(５μg/mL)を含むアッセイバッファー加えて加えて２時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で３回洗浄した後、１５μlのヒトＥＬ＿４１１−５００断片ＬｙｓａｔｅまたはヒトＥＬ＿４１１−４５９断片Ｌｙｓａｔｅを含むアッセイバッファー(４％ブロックエース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０mM ＮａＣｌを含む５０mM トリス緩衝液ｐＨ７．４)加えて、４℃で一晩放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのビオチン標識抗Ｃ２タグ抗体(Ｆａｂ)とＨＰＲ標識ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で１時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１２Ｂ１０抗体は、ヒトＥＬ＿４１１−５００断片、ヒトＥＬ＿４１１−４５９断片とも結合することが確認できた(図４)。
ヒトＥＬ、ヒトＬＰＬ及びヒトＨＬのアミノ酸配列のアライメントを図５Ａに示している。２種以上で共通するアミノ酸配列を実線の枠で囲い、catalytic triadのアミノ酸残基を★印で示しているが、当該アミノ酸残基付近は上記の３種のタンパク質間でアミノ酸配列の相同性が高かった。
一方、１２Ｂ１０抗体が結合する領域のアミノ酸を破線の枠で囲んでいるが、当該領域のアミノ酸配列は、ヒトＥＬ、ヒトＬＰＬ及びヒトＨＬ間で相同性が高くないため、実施例６で検討したように、１２Ｂ１０抗体がＥＬ選択的な阻害能を有していると考えられた。

【実施例11】

【0051】

１２Ｂ１０の可変領域のアミノ酸配列決定
１２Ｂ１０抗体について、常法を用いて可変領域の配列を決定した（図６Ａ）。
１２Ｂ１０抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号６で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号７で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は８で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号９であった。１２Ｂ１０抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１１で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は１２で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１３であった。

【実施例12】

【0052】

ヒヒＥＬ発現アデノウイルス調製
ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クロンテック社製）に、ＰＣＲ法、制限酵素を用いた手法により、Ｃ２タグ（配列番号３）を付加したヒヒＥＬｃＤＮＡ配列をクローニングした。このサブクローンベクターと、アデノウイルス骨格遺伝子を有するベクターを、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ酵素により消化した（Ａｄｅｎｏ−ｘ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｋｉｔ, クロンテック社製）。消化断片のライゲーション反応を１６℃、３時間行い（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ, 東洋紡社製）、ライゲーション産物を大腸菌株(ワンショットＳｔｂｌ３ケミカルコンピテントセル, インビトロジェン社製)にトランスフォームした。アンピシリン選択後、得られたクローンよりプラスミドを精製し（ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社製）、次いでＰａｃＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）処理による大腸菌生育領域の切り出しを行った。以上により、アデノウイルスベクター作製のためのプラスミドＤＮＡを得た。得られたプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より分与）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００(インビトロジェン社製）を用いてトランスフェクションし、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５% ＣＯ２下で培養した。トランスフェクション後は５日おきに培地交換を行い、細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認されるまで培養を継続した。ＣＰＥの確認後、培養上清および細胞を回収した。回収した細胞は、ドライアイス・メタノール浴と温水浴を用い凍結融解を５回程度繰り返した後、３０００ｒｐｍにて１５分遠心して得られた上清を、細胞抽出液として回収した。この細胞抽出液と、培養上清を混合し、ウイルスベクター含有液とした。このウイルスベクター含有液をＨＥＫ２９３細胞に添加し、同様の操作を繰り返すことにより、ウイルスベクターの増幅を行った。増幅後、最終的に得られた細胞抽出液を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ−Ｎｏｖａｇｅｎ社製）で３７℃、３０分間処理後遠心し、得られた上清を、以下の密度勾配遠心によるウイルスベクター精製に用いた。１．５、１．３５、１．２５ｇ／ｃｍ^３の塩化セシウムを含むＰＢＳ(Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ)を遠心管内に重層し、次いで上記上清を重層した。これを３５０００ｒｐｍ, １６℃で１時間遠心し、目視によって得られたウイルスベクターを回収した。回収したウイルスベクターは、１０％グリセロール含有ＰＢＳに対して透析を行い、精製アデノウイルスベクターとした。ウイルスベクターは一部をタイター測定（Ａｄｅｎｏ−Ｘ ｒａｐｉｄ ｔｉｔｅｒ ｋｉｔ, クロンテック社製）および自己増殖能獲得型出現判定に用い、異常のないもののみを以下の免疫に使用した。
ヒヒＥＬ−Ｃ２タグのアミノ酸配列は、配列番号１４に記載した。

【実施例13】

【0053】

ヒヒＥＬ発現アデノウイルスベクター免疫
精製したヒヒＥＬ発現アデノウイルスベクター２×１０^９i.f.u.相当を、８週齢の雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ種、日本エスエルシーより入手）の静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。投与後は、７日毎に尾静脈より血液を採取し、これより調製した血清を用いて抗体価の測定を行った。また、初回のアデノウイルスベクター投与に加えて、追加免疫として同量のアデノウイルスベクターを静脈内、皮下または後肢筋肉内に投与した。抗体価の上昇を認めたマウスについて、最終免疫として、尾静脈よりブースター免疫を実施した。

【実施例14】

【0054】

抗体産出ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に、ヒヒＥＬに対する抗体価の上昇が認められた個体について開腹し、脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。

【実施例15】

【0055】

ＥＬヘパリン抽出液の調製
ヒヒＥＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ２で３日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒヒＥＬヘパリン抽出液とした。同様の方法で、カニクイザルＥＬ、ウサギＥＬ、マウスＥＬ−Ｃ２タグ、およびヒト[331-459]-マウスＥＬのヘパリン抽出液を調製した。
カニクイザルＥＬ−C２タグのアミノ酸配列は配列番号１５に、マウスＥＬ−Ｃ２タグのアミノ酸配列は配列番号１６に、ヒト[331-459]-マウスＥＬ−C２タグのアミノ酸配列は配列番号１７に記載した。

【実施例16】

【0056】

ヒヒＥＬに結合する抗体を産出するハイブリドーマの選定
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＳＩＡは以下の通りである。３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μgの抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を３５μｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を1００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体固相化プレート）。各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清を加えて２時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのヒトＥＬ ｌｙｓａｔｅを含むアッセイバッファー(４％ブロックエース、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４)を加えて、４℃で１６時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後、１５μｌのビオチン標識抗Ｃ２タグ抗体(Ｆａｂ)とＨＲＰ標識ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を含むアッセイバッファーを加え、室温で１時間放置した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、１５μｌのＴＭＢ＋−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、１５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、リコンビナントヒヒＥＬと結合したハイブリドーマのクローン（４７Ｂ２、２５Ｅ４、８Ｆ５、３Ｂ１、４１Ｈ８）を得た。４７Ｂ２、２５Ｅ４、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８のクローンが産出する抗体を、それぞれ４７Ｂ２、２５Ｅ４、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、４７Ｂ２抗体はＩｇＧ２ａ、２５Ｅ４抗体はＩｇＧ２ｂ、８Ｆ５抗体はＩｇＧ２ａ、３Ｂ１抗体はＩｇＧ１、４１Ｈ８抗体はＩｇＧ１であった。

【実施例17】

【0057】

ＥＬのＣ末断片の免疫
ヒトＥＬのC末領域をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸ６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア社製）にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ株（ライフテクノロジーズ社製）に形質転換した。この大腸菌の培養液にＩＰＴＧを添加し、ＥＬのＣ末断片タンパク質の発現を誘導した。一晩培養した後に菌体を回収し、ＧＳＴｒａｐカラムにてＥＬのＣ末断片を精製し、これを免疫原とした。調製したＥＬのＣ末断片タンパク質１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ａ／Ｊ Ｊｍｓ Ｓｌｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、２１日後、４２日後、６３日後にＥＬのＣ末断片タンパク質１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに８４日後にＥＬのＣ末断片タンパク質１００μｇを生理食塩水０．１ｍｌに縣濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。実施例１７と同様の方法でスクリーニングした結果から、リコンビナントヒヒＥＬと結合したハイブリドーマのクローン（１６Ａ１１）を得た。１６Ａ１１のクローンが産出する抗体を１６Ａ１１抗体と命名した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１６Ａ１１抗体はＩｇＧ１であった。

【実施例18】

【0058】

ＥＬ抗体のＥＬ酵素活性阻害能の測定
１２Ｂ１０抗体について、実施例１５で調製したカニクイザル、ヒヒおよびヒト[331-459]-マウスＥＬに対するＥＬ活性阻害能を、実施例８と同様の手法を用いて測定した。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出した（図７Ａ）。
また、４７Ｂ２、２５Ｅ４、１６Ａ１１、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８の各抗体について、実施例１５で調製したカニクイザル、ヒヒ、ウサギおよびヒト[331-459]-マウスＥＬに対するＥＬ活性阻害能を、実施例８と同様の手法を用いて測定した。抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、抗体の各濃度でのコントロール値に対する比活性を算出した（図７Ｂ〜Ｇ）。
図２および図７Ａ〜図７Ｇの阻害曲線より、各抗体の５０％阻害濃度(ＩＣ５０値)を求め、結果を後述の表１にまとめた。

【実施例19】

【0059】

各ＥＬ抗体のＨＬおよびＬＰＬ酵素活性阻害能の測定
ヒトＨＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ３．１(インビトロジェン社製)をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心し、細胞を回収して、２０U/mLのヘパリンを含むＰＢＳにて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心により細胞を除去して得た上清をヒトＨＬ酵素溶液とした。同様の操作により、ヒトＬＰＬ酵素溶液を調製した。２０mM トリス塩酸緩衝液(ｐＨ７．５)、０．５％ウシ血清アルブミン、４mM 塩化カルシウム、１５０mM 塩化ナトリウム、０．５mg/mLヒトＶＬＤＬ(ＩＮＴＲＡＣＥＬ社製）で構成される反応溶液にＥＬ抗体溶液を添加した後、ヒトＨＬ、またはヒトＬＰＬ酵素溶液を添加した(全量で１０μl)。３７℃で２時間反応後、ＨＬもしくはＬＰＬ酵素によって、ＶＬＤＬから生成される遊離脂肪酸(ＮＥＦＡ)をＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー(和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量を酵素活性指標とした。ＥＬ抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した。比較のため、結果をカニクイザルＥＬの阻害曲線と並べて記載した(図８A〜G)。
その結果、１２Ｂ１０、４７Ｂ２、２５Ｅ４、１６Ａ１１、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８のＥＬ抗体全てが、ＨＬとＬＰＬの酵素活性を阻害しないことがわかった。
同様の操作によりウサギＨＬおよびウサギＬＰＬ酵素溶液を調製し、ＥＬ抗体を添加しない時の酵素活性をコントロール値とし、コントロール値に対する比活性を算出した。比較のため、結果をウサギＥＬの阻害曲線と並べて記載した(図８Ｈ〜Ｉ)。
その結果、８Ｆ５および４７Ｂ２抗体はＨＬとＬＰＬの酵素活性を阻害しないことがわかった。

【実施例20】

【0060】

各ＥＬ抗体のエピトープマッピング
４７Ｂ２、２５Ｅ４、１６Ａ１１、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８抗体のエピトープマッピングを実施例１０と同様の手法で行った。
４７Ｂ２、１６Ａ１１、８Ｆ５および３Ｂ１抗体は、１２Ｂ１０抗体と同様に、ヒトＥＬ＿４１１−４５９断片に結合することが確認できたので、これらの抗体のエピトープは、１２Ｂ１０抗体と同様だと結論付けた。
一方、２５Ｅ４および４１Ｈ８抗体は、ヒトＥＬ＿４１１−４５９断片には結合せず、ヒトＥＬ［331-459］−マウスＥＬにのみ結合するので、これらの抗体のエピトープは、ＥＬのアミノ酸配列３３１−４５９であると結論付けた。
以上のことから、本発明の抗体は、ヒトＥＬのアミノ酸配列３３１−４５９位の領域に結合することを特徴としていることが結論付けられたので、本発明の抗体が結合するヒトＥＬの領域を図５Ｂに示した。
図５Ｂ中に、本発明の抗体が結合する領域のアミノ酸を破線の枠で囲んでいるが、この領域のアミノ酸配列は、ヒトＥＬ、ヒトＬＰＬ及びヒトＨＬ間で相同性が高くないため、実施例１９で検討したように、本発明の抗体がＥＬ選択的な阻害能を有していると考えられた。
実施例で得た抗体の特徴を表１にまとめた。

表１

【実施例21】

【0061】

ＥＬ抗体の結合親和性
ＥＬ抗体の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅを用いて測定した。抗Ｃ２タグ抗体をＳｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社製）にアミンカップリング法により固定化し、ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社製）で希釈したヒヒＥＬ‐Ｃ２ヘパリン抽出液、もしくはカニクイザルＥＬ−Ｃ２ヘパリン抽出液を添加し、Ｓｅｎｓｏｒ ＣｈｉｐにＥＬをトラップした。その後、ＨＢＳ−Ｐで希釈したＥＬ抗体を添加し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、Ｂｉｖａｌｅｎｔ ｆｉｔｔｉｎｇにより結合親和性を算出した（図９Ａ〜Ｇ）。各抗体の結合親和性についての結果を、表２および表３にまとめた。

表２ カニクイザルＥＬに対する結合親和性

表３ ヒヒＥＬに対する結合親和性

【実施例22】

【0062】

ウサギでのＨＤＬ−ｃ上昇作用
ウサギ（ニュージーランドホワイト種、北山ラベスより購入）にＰＢＳで希釈した４７Ｂ２および８Ｆ５抗体を１０ｍｇ／ｋｇの用量で耳介周囲静脈より投与した。群構成は、ＥＬ中和抗体投与群を抗体毎に３羽、コントロール抗体投与群を２羽とした。抗体投与後、1日、2日、５日、７日および９日後に採血し、コレステストＮＨＤＬ（積水メディカル社製にて血中のＨＤＬ−ｃ濃度を測定し、その結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに記載した。

【実施例23】

【0063】

ＥＬ抗体の可変領域のアミノ酸配列決定
４７Ｂ２、２５Ｅ４、１６Ａ１１、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８抗体について、実施例１１と同様の手法を用いて、可変領域の配列を決定した。
４７Ｂ２抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１９で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は２０で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２１であった。４７Ｂ２抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号２２で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２３で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は２４で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２５であった（図６Ｂ）。
２５Ｅ４抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号２６で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２７で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は２８で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９であった。２５Ｅ４抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３０で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３１で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は３２で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３３であった（図６Ｃ）。
１６Ａ１１抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３４で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３５で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は３６で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３７であった。１６Ａ１１抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３８で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３９で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は４０で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号４１であった（図６Ｄ）。
８Ｆ５抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号４２で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は４４で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号４５であった。８Ｆ５抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号４６で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４７で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は４８で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号４９であった（図６Ｅ）。
３Ｂ１抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号５０で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号５１、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は５２で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５３であった。３Ｂ１抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号５４で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号５５で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は５６で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７であった（図６Ｆ）。
４１Ｈ８抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号５８で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号５９、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は６０で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６１であった。３Ｂ１抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号６２で、可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６３で、可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列の配列番号は６４で、可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６５であった（図６Ｇ）。

【実施例24】

【0064】

ＥＬ抗体の可変領域のアミノ酸配列のアライメント
実施例１１および２３より得られた１２Ｂ１０、４７Ｂ２、２５Ｅ４、１６Ａ１１、８Ｆ５、３Ｂ１および４１Ｈ８抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をアライメントした（図１１Ａ、図１１Ｂ）。
重鎖、軽鎖のＣＤＲの配列を解析すると、以下の点が明らかになった。
重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、Ｔ（ＳｏｒＹ）（ＧｏｒＮ）（ＭｏｒＶ）ＧＶＧの７つのアミノ酸配列からなっていた。
重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＨＩＷＷ（ＮｏｒＨ）（ＤｏｒＥｏｒＧ）（ＥｏｒＮｏｒＹ）（ＫｏｒＹ）ＹＹ（ＫｏｒＮｏｒＳ）（ＰｏｒＴ）（ＡｏｒＤｏｒＧｏｒＳ）ＬＫＳの１６アミノ酸配列からなっていた。
重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、（ＳｏｒＭ）（ＡｏｒＹ）（ＤｏｒＰ）Ｇ（ＳｏｒＴ）ＰＦＰＳまたは（ＩｏｒＳ）（ＧｏｒＳｏｒＹ）（ＡｏｒＤｏｒＧｏｒＰ）Ｇ（ＴｏｒＶｏｒＹ）Ｐ（ＦｏｒＬ）ＤＹの９アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＫＡＳＱＤＩ（ＨｏｒＮ）（ＫｏｒＲｏｒＴ）（ＦｏｒＹ）Ｉ（ＡｏｒＶ）の１１アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、（ＨｏｒＹ）（ＰｏｒＴ）（ＦｏｒＳ）ＴＬＱＰの７アミノ酸配列からなっていた。
軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＬＱＹＤ（ＤｏｒＩｏｒＮｏｒＴ）Ｌ（ＬｏｒＴ）ＷＴの９アミノ酸配列からなっていた。
以上の事実から、７つの抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲには共通性があることが見出された。

【産業上の利用可能性】

【0065】

本発明のＥＬ抗体は、ＥＬに対して選択的な阻害活性を有しているので、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満および／またはシンドロームＸの治療および／または予防のための医薬として有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]