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特許6195579アフィニティークロマトグラフィーＩＶによる抗体及びＦｃ融合タンパク質精製のためのリガンド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6195579
(24)【登録日】2017年8月25日
(45)【発行日】2017年9月13日
(54)【発明の名称】アフィニティークロマトグラフィーＩＶによる抗体及びＦｃ融合タンパク質精製のためのリガンド
(51)【国際特許分類】
C07D 403/12 20060101AFI20170904BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20170904BHJP
C07D 417/14 20060101ALI20170904BHJP
C07D 417/12 20060101ALI20170904BHJP
C07D 407/14 20060101ALI20170904BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20170904BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20170904BHJP
【ＦＩ】
C07D403/12
C07K1/22
C07D417/14
C07D417/12
C07D407/14
G01N30/88 201R
G01N30/88 101S
G01N30/88 101M
G01N30/88 101T
G01N30/88 101K
G01N30/88 J
G01N30/88 201X
G01N33/50 U
【請求項の数】23
【全頁数】81
(21)【出願番号】特願2014-556076(P2014-556076)
(86)(22)【出願日】2013年2月8日
(65)【公表番号】特表2015-509486(P2015-509486A)
(43)【公表日】2015年3月30日
(86)【国際出願番号】EP2013052564
(87)【国際公開番号】WO2013117707
(87)【国際公開日】20130815
【審査請求日】2016年1月27日
(31)【優先権主張番号】12154471.2
(32)【優先日】2012年2月8日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】515086850
【氏名又は名称】ノファリクス ドイチェラント ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100074332
【弁理士】
【氏名又は名称】藤本 昇
(74)【代理人】
【識別番号】100114432
【弁理士】
【氏名又は名称】中谷 寛昭
(72)【発明者】
【氏名】ビッターマン，ホルガー
(72)【発明者】
【氏名】アルノルト，マルク
(72)【発明者】
【氏名】ノイマン，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】オット，インゲ
(72)【発明者】
【氏名】シュミット，クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】ゼクル，レナーテ
【審査官】
中村 勇介
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００１／０８３５１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１２／０１７０２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１２／０２００８０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｋ１／００−１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体または抗体フラグメントのアフィニティー精製のための、支持材料と、支持材料に共有結合している少なくとも１つのリガンドとを備え、前記抗体または前記抗体フラグメントのＦｃ部分に結合するリガンド置換マトリクスの使用であって、前記リガンドが式（Ｉ）で表される、使用。
ここで、
Ｌは、リガンドが付着している支持材料の連結点である；
Ｓｐは、スペーサ基である；
ｖは、０または１である；
Ａｍはアミド基−ＮＲ1−Ｃ（Ｏ）−であり、ここでＮＲ1がＡｒ1に付着しかつ−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ2に付着しているか、−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ1に付着しかつＮＲ1がＡｒ2に付着しているかのいずれかである；
Ｒ1は水素またはメチルである；
Ａｒ1は、イミダゾール、ベンゼン、ピリジン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール及びトリアゾールから選択される５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環であって、化学結合を介してＳｐまたはＬと接続されるものであり、さらに任意には、
（ａ）ベンゼンに化学結合を介して付着している；または、
（ｂ）多核環系の一部として、ベンゼンに縮合している；
ここで、Ａｒ1は、Ａｒ1を構成する５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環に存在する化学結合を介してＡｍと直接的に接続しているか、Ａｒ1に付着している前記ベンゼン環に存在する化学結合、またはＡｒ1に縮合している前記ベンゼン環における化学結合を介してＡｍと間接的に接続しているかのいずれかであって；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ；シクロプロピル、ヒドロキシメチル、−ＮＯ2、＝Ｏ、＝Ｓ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が付着しているかのいずれかであり；
Ａｒ2は、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される少なくとも１つの原子を含む５員環単核芳香環であって、無置換であるか、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、シクロプロピル、ヒドロキシメチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フルオロ、クロロ、カルバモイル、エチルチオ、メチルチオ、５または６員環単核芳香環及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が化学結合を介して付着したものであり；任意には、Ａｒ2は、上記のように化学結合を介して付着していてもよい前記置換基に加えて、多核環系の一部としてベンゼンまたはチアゾールと縮合している。
【化1】
Ｌは、リガンドが付着している支持材料の連結点である；
Ｓｐは、スペーサ基である；
ｖは、０または１である；
Ａｍはアミド基−ＮＲ1−Ｃ（Ｏ）−であり、ここでＮＲ1がＡｒ1に付着しかつ−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ2に付着しているか、−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ1に付着しかつＮＲ1がＡｒ2に付着しているかのいずれかである；
Ｒ1は水素またはメチルである；
Ａｒ1は、イミダゾール、ベンゼン、ピリジン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール及びトリアゾールから選択される５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環であって、化学結合を介してＳｐまたはＬと接続されるものであり、さらに任意には、
（ａ）ベンゼンに化学結合を介して付着している；または、
（ｂ）多核環系の一部として、ベンゼンに縮合している；
ここで、Ａｒ1は、Ａｒ1を構成する５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環に存在する化学結合を介してＡｍと直接的に接続しているか、Ａｒ1に付着している前記ベンゼン環に存在する化学結合、またはＡｒ1に縮合している前記ベンゼン環における化学結合を介してＡｍと間接的に接続しているかのいずれかであって；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ；シクロプロピル、ヒドロキシメチル、−ＮＯ2、＝Ｏ、＝Ｓ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が付着しているかのいずれかであり；
Ａｒ2は、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される少なくとも１つの原子を含む５員環単核芳香環であって、無置換であるか、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、シクロプロピル、ヒドロキシメチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フルオロ、クロロ、カルバモイル、エチルチオ、メチルチオ、５または６員環単核芳香環及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が化学結合を介して付着したものであり；任意には、Ａｒ2は、上記のように化学結合を介して付着していてもよい前記置換基に加えて、多核環系の一部としてベンゼンまたはチアゾールと縮合している。
【請求項2】
前記式（Ｉ）で表される前記リガンドのＲ1が水素である、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記式（Ｉ）で表される前記リガンドのＡｒ2が、Ｎ、Ｓから選択される少なくとも１つの原子を含む５員環単核芳香環である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
前記式（Ｉ）で表される前記リガンドのＡｒ2が、メチル、エチル、メトキシ、エチルチオ及びシクロプロピルから選択される少なくとも１つの置換基が化学結合を介して付着した前記５員環単核芳香環である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項5】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用であって、
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾール、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾール、ピリジン及び４−トリアゾリルベンゼンから選択され；
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの１または２位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの１位、ピリジンの２位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の１位に付着する化学結合を介して、ＳｐまたはＬに接続し；
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの５または６位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの５または６位、ピリジンの５位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の４位に付着する化学結合を介して、Ａｍに接続し；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、メトキシ、＝Ｓ及び＝Ｏ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が付着しているかのいずれかであり；
Ａｒ2は１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール及びチアゾールから選択される５員環単核芳香環であって、無置換であるか、または、メチル、エチル、メトキシ、エチルチオ、及びシクロプロピル；ピリジン、フラン、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾールから選択される５または６員環単核芳香環；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が化学結合を介して付着したものである、使用。
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾール、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾール、ピリジン及び４−トリアゾリルベンゼンから選択され；
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの１または２位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの１位、ピリジンの２位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の１位に付着する化学結合を介して、ＳｐまたはＬに接続し；
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの５または６位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの５または６位、ピリジンの５位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の４位に付着する化学結合を介して、Ａｍに接続し；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、メトキシ、＝Ｓ及び＝Ｏ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が付着しているかのいずれかであり；
Ａｒ2は１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール及びチアゾールから選択される５員環単核芳香環であって、無置換であるか、または、メチル、エチル、メトキシ、エチルチオ、及びシクロプロピル；ピリジン、フラン、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾールから選択される５または６員環単核芳香環；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基が化学結合を介して付着したものである、使用。
【請求項6】
前記支持材料が、炭水化物または架橋炭水化物、合成ポリマー、無機材料及び複合材料から選択される材料を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項7】
前記炭水化物または架橋炭水化物が、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩及びカラギーナン、セファロース、セファデックスから選択される少なくとも１つの炭水化物または架橋炭水化物である、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記合成ポリマーが、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリアクリラート、ＰＥＧ−ポリアクリラートコポリマー、ポリメタクリラート、ポリビニルアルコール、ポリアミド及びパーフルオロカーボンから選択される少なくとも１つの合成ポリマーである、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
前記無機材料が、ガラス、シリカ及び金属酸化物のような無機マトリクスから選択される少なくとも１つの無機材料である、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
前記抗体がＩｇＧタイプの抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項11】
前記Ｆｃフラグメントもしくはドメインまたは前記抗体が、ＩｇＧ抗体クラスのものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項12】
前記Ｆｃフラグメントもしくはドメインまたは前記抗体が、ヒトＩｇＧ、またはヒト由来ポリクローナルあるいはモノクローナルＩｇＧである、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記Ｆｃフラグメントもしくはドメインまたは前記抗体が、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4である、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
請求項１〜１３のいずれか１項に定義されるリガンド置換マトリクス。
【請求項15】
請求項１４に記載のリガンド置換マトリクスを合成する方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に特定される式（Ｉ）に従うリガンドを前記支持材料に付着させる方法。
【請求項16】
タンパク質のアフィニティー精製方法であって、精製されるタンパク質を、請求項１〜１５のいずれか１項に定義されるリガンド置換マトリクスと接触させる方法。
【請求項17】
前記タンパク質のアフィニティー精製方法が、アフィニティークロマトグラフィーのための方法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記タンパク質が抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
抗体または抗体フラグメントのＦｃ部分に結合する、式（ＩＩ）に示されるリガンドであって、Ａｒ1、Ａｒ2及びＡｍは請求項１〜５のいずれか１項に定義された意味を有し、ＳｐＰはスペーサ前駆体である、リガンド。
【化2】
【請求項20】
抗体または抗体フラグメントのＦｃ部分に結合する、式（ＩＩＩ）に示される構造要素を有するリガンドであって、Ａｒ1、Ａｒ2及びＡｍは請求項１〜５のいずれか１項に定義された意味を有する、リガンド。
【化3】
【請求項21】
請求項１９または２０に記載のリガンドの、抗体または抗体フラグメントのアフィニティー精製のための使用。
【請求項22】
前記アフィニティー精製が、前記リガンドを適切なマトリクスに付着させた後のアフィニティー精製である、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記マトリクスが、前記リガンドにＦｃ部分を介して結合している少なくとも１つの抗体または抗体フラグメントをさらに含む、請求項１４に記載のリガンド置換マトリクス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質の分離の分野に関し、好ましくは、アフィニティー分離技術、特に小分子リガンドを用いたクロマトグラフィーによる、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びに免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質の精製の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンは、ヒト及び他の脊椎動物の体液中に存在する可溶性タンパク質群である。これらは「抗体」とも呼ばれ、細胞の認識、結合、及び接着の過程において重要な役割を果たす。抗体は、抗原（通常は細菌やウイルス）を認識して排除することにより、免疫系において主要な役割を有するオリゴマー糖タンパク質である。
【0003】
抗体のポリマー鎖は、抗体がいわゆる重鎖及び軽鎖を含むように構成される。基本的な免疫グロブリン単位は、ジスルフィド橋で連結された２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなる。重鎖には５つのタイプ（α、γ、δ、ε、μ）があり、該タイプが免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）を決定する。軽鎖群には２つのサブタイプ（λ及びκ）がある。
【0004】
ＩｇＧは、血液及び他の体液中に確認される可溶性抗体である。これらは、細菌または他の病原体に反応して、Ｂ細胞に由来する形質細胞により構築され、該細菌または他の病原体を中和する。ＩｇＧは、約１５０ｋＤａの分子量を有するＹ字型の糖タンパク質であって、２つの重鎖及び２つの軽鎖により構成される。各鎖は、定常領域と可変領域とに区別される。重鎖の２つのカルボキシ末端領域は、Ｆｃフラグメント（「定常フラグメント」）を形成し、重鎖及び軽鎖のアミノ末端領域は抗原を認識するものであり、Ｆａｂフラグメント（「抗原結合フラグメント」）と命名されている。
【0005】
Ｆｃ融合タンパク質は、抗体Ｆｃフラグメントと、所与の薬剤標的のための特異性を提供するタンパク質またはタンパク質領域とを組み合わせることにより作製される。例として、領域抗体−Ｆｃ融合タンパク質が挙げられるが、このＦｃフラグメントの２つの重鎖は、特異抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に連結されている。他のＦｃ融合タンパク質は、任意のタイプの治療用タンパク質またはタンパク質領域と、Ｆｃフラグメントの組み合わせである。このＦｃ部分は、タンパク質薬剤に安定性及び送達性を付加すると考えられている。
【0006】
治療用抗体及びＦｃ融合タンパク質は、様々な疾病の治療に使用されるが、著名な例としては、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、及び癌の多くの形態がある。治療用抗体はモノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、単一の抗体産生細胞株に由来するものであり、単一抗原に対して同一の特異性を示す。癌について可能な治療には、腫瘍細胞特異抗原を中和する抗体が含まれる。ベバシズマブ（アバスチン、ジェネンテック社）はモノクローナル抗体であり、これは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を中和し、それによって新生血管の腫瘍組織内への成長を防止する。
【0007】
治療用融合タンパク質、たとえばエタネルセプト（エンブレル、アムジェン社、ＴＮＦ受容体領域がＦｃフラグメントに結合されている）またはアレファセプト（アメビブ、バイオジェン・アイデック社、ＬＦＡ−３がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されている）が、自己免疫疾患に対する薬剤として使用または開発されている。
【0008】
タンパク質のバイオセパレーションは、様々な生物学的供給流からのタンパク質産物の回収及び精製に関し、食品、製薬、及びバイオテクノロジー産業において重要な単位操作である。ますます多くの治療用モノクローナル抗体（Ｍａｂ）及び融合タンパク質が市場に参入してきており、または現在臨床開発中である。このようなタンパク質は、綿密な多段階精製手順により達成される極めて高い純度を必要とする。下流の処理及び精製が製造コストの約５０〜８０％を占めており、そのため、新規な精製戦略の開発、または既存の精製戦略の改良のために、相当な努力が行われている（１）。
【0009】
アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質精製のための最も有効なクロマトグラフィー法の１つである。それは非常に特異なタンパク質−リガンド相互作用に基づく。該リガンドは、供給原料溶液から標的タンパク質を捕捉するために使用される固定相に、共有結合によって固定化される。アフィニティーリガンドは、高い特異性及び選択性によりその標的と結合することができ、複雑な混合物からであっても、高い収率で１０００倍に至るまでの高濃縮を可能にする。
【0010】
典型的には、プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィーが、ほとんどのＭａｂ及びＦｃ融合タンパク質の精製工程における第１段階である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の表面に露出した細胞壁結合タンパク質である。これはナノモルの親和性で、様々な種からの免疫グロブリン、特にヒトのサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４の定常部（Ｆｃ領域）に結合する（２）。しかしながら、消毒及び定置洗浄工程に適用される過酷な条件下では、生成物中に浸出し、安定性に乏しいため、プロテインＡの使用が制限される。プロテインＡの化学的安定性は、Ｍａｂ精製のために遺伝子操作されたプロテインＡ変異体を用いることにより改善され得る。もっとも、プロテインＡ樹脂は高コストであるため、適当な代替品、特に小分子から選択される代替品が探求されている。
【0011】
Mabsorbent A2P（プロメティック・バイオサイエンス社）は、免疫グロブリン精製のための小分子リガンドである。しかしながら、該リガンドは適切な選択性を示さず（３）、プロセスクロマトグラフィーに適用されない。
【0012】
別の手法では、抗体精製の最初の捕捉段階として混合モードクロマトグラフィーが使用される。最も一般的な材料は、固定化された２−メルカプトエチルピリジン（MEP HyperCel、ポール・コーポレーション）に基づくものであり、これは発酵ブロスから効果的にＩｇＧを捕捉するが、プロテインＡと比較すると、低い宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）除去率を示す（４）。
【0013】
合成小分子アフィニティーリガンドは、通常、化学的安定性が高く、製造コストが低いので、治療用タンパク質精製にとって特に注目されている。タンパク質ベースのリガンドと比較してより利用しやすく、好ましくはより安価で、厳しい条件下においてプロテインＡより堅牢で、プロテインＡと同等またはそれ以上の選択性を有する合成アフィニティーリガンドは、抗体及びＦｃ融合タンパク質の精製において適切な解法を提供すると考えられる。このようなアフィニティーリガンドは、標的タンパク質に応じて、ＩｇＧ型免疫グロブリン及びＦｃ融合タンパク質の定常Ｆｃ領域を認識するため、好ましくはプロテインＡと同様の広範な適用可能性を提供すると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明の基礎となる課題は、抗体およびＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域に結合する小型のアフィニティーリガンド（化合物）を提供することである。好ましくは、小型のアフィニティーリガンドは、マトリクスへの結合に適用可能となる。本発明のさらに基礎となる課題は、抗体及びＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域に結合する小型のアフィニティーリガンドを備えたマトリクスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本課題は、以下に展開される本発明の実施形態により解決される。
【0016】
本発明は、タンパク質（好ましくは、抗体または抗体フラグメント）のアフィニティー精製のための、支持材料と、支持材料に共有結合している少なくとも１つのリガンドとを備えたリガンド置換マトリクスの使用に関し、本発明に従う該リガンド置換マトリクスまたは本発明に従う該リガンドは、それぞれ式（Ｉ）で表される。【化1】
Ｌは、リガンドが付着している支持材料の連結点である；
Ｓｐは、スペーサ基である；
ｖは、０または１である；
Ａｍはアミド基−ＮＲ1−Ｃ（Ｏ）−であり、ここでＮＲ1がＡｒ1に付着しかつ−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ2に付着しているか、−Ｃ（Ｏ）−がＡｒ1に付着しかつＮＲ1がＡｒ2に付着しているかのいずれかである；
Ｒ1は水素またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、より好ましくは水素またはメチルであり、最も好ましくは水素である；
Ａｒ1は５、６または７員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環であって、化学結合を介してＳｐまたはＬと接続されるものでありており、さらに任意には、
（ａ）さらなる５または６員環単核芳香環に、化学結合を介して付着している；また は、
（ｂ）多核環系の一部として、単核または２核芳香環に縮合している；
ここで、Ａｒ1は、Ａｒ1を構成する前記５、６または７員環芳香環における化学結合を介してＡｍと直接的に接続しているか、Ａｒ1に付着している前記さらなる５または６員環芳香環における化学結合、またはＡｒ1に縮合している前記さらなる５または６員環芳香環における化学結合を介してＡｍと間接的に接続しているかのいずれかであって；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、Ｃ1〜Ｃ4アルキル；Ｃ3及びＣ4シクロアルキル；Ｃ2〜Ｃ4アルケニル；Ｃ2〜Ｃ4アルキニル；ハロゲン；Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ4アルキル；Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；Ｃ1〜Ｃ4アルキルチオ；−ＮＯ2；＝Ｏ；＝Ｓ；＝ＮＨ；−ＯＨ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に付着しているかのいずれかである；
Ａｒ2は５または６員環単核芳香環であって、無置換であるか、Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル；Ｃ2〜Ｃ6アルケニル；Ｃ5及びＣ6シクロアルケニル；Ｃ2〜Ｃ6アルキニル；ａハロゲン；Ｃ1〜Ｃ6ハロアルキル；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミノ；Ｃ1〜Ｃ6アルキルチオ；カルバモイル；Ｃ1〜Ｃ4アルキレンジオキシ、好ましくはメチレンジオキシ及びエチレンジオキシ；−ＯＨ；−ＳＨ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に化学結合を介して付着しており；任意には、Ａｒ2は、上記のようにそれが化学結合を介して付着してもよい前記置換基に加えて、多核環系の一部として５または６員環単核芳香環と縮合している。
【発明を実施するための形態】
【0017】
式（Ｉ）は本発明に従うリガンドまたは本発明に従うリガンド置換マトリクスを表してもよい。Ｌが本発明の支持材料／マトリクスの一部であると見なされる場合には、式（Ｉ）はリガンド置換マトリクスを表す。Ｌが本発明の支持材料／マトリクスの一部であると見なされない場合には、式（Ｉ）はマトリクスに付着した後のリガンドを表す。本発明の文脈では、式（Ｉ）は好ましくはマトリクスへの付着後のリガンドを表す。この解釈では、本発明に従う、支持材料／マトリクスに付着する前のリガンドは、好ましくは式（ＩＩ）により表される（下記参照）。
【0018】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）に従う本発明に従う（支持材料／マトリクスに付着した後の）リガンド、または本発明のリガンド置換支持材料／マトリクスのそれぞれは、式（Ｉａ）の構造を有する。本発明のさらなる実施形態では、式（Ｉ）に従う本発明に従う（支持材料／マトリクスへの付着後の）リガンド、または本発明のリガンド置換支持材料／マトリクスのそれぞれは、式（Ｉｂ）の構造を有する。式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）のいずれにおいても、Ｌ、Ｓｐ、Ｎ、Ｒ1、Ａｒ1及びＡｒ2、並びに整数ｖは、式（Ｉ）について上記で定義された意味を有する。【化2】
【0019】
本発明に従うリガンドは、ヒト由来ポリクローナル及びモノクローナルＩｇＧ、特にヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4、並びにウサギおよびマウス免疫グロブリンのような様々な動物種由来のポリクローナル及びモノクローナルＩｇＧと結合する。
【0020】
Ｌが支持材料／マトリクス上の適切な成分である場合、該リガンド置換マトリクスは式（Ｉｃ）のようにも示されることができ、ここでＭは該マトリクス／支持材料であり、他の変数は式（Ｉ）について説明された意味を有する。【化3】
【0021】
本発明は、リガンド置換マトリクス、及び、任意にはスペーサ基Ｓｐを介して、連結ポイントＬにおいてマトリクスに付着する前及び後のリガンド（「化合物」とも称する）にも関する。該マトリクスは支持材料を備えている。すなわち、該マトリクスは完全に該支持材料により構成されているか、該支持材料がマトリクスの一部を形成し、該マトリクスは該支持材料に加えての成分を備えている。
【0022】
本発明は、本発明の文脈において特定されるリガンド置換マトリクスをも含み、ここで該マトリクスがリガンドに結合された少なくとも１つのタンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントをさらに備える。該抗体または抗体フラグメントは、好ましくは、ＩｇＧタイプの抗体またはＦｃ融合タンパク質である。さらに好ましい実施形態では、該リガンドは該抗体または該融合タンパク質のＦｃフラグメントまたはドメインに結合する。さらに好ましい実施形態では、該Ｆｃフラグメントまたはドメインまたは該抗体は、ＩｇＧ抗体クラスのものであり、より好ましくはヒトＩｇＧ、またはヒト由来ポリクローナルあるいはモノクローナルＩｇＧ、特にＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4のものである。
【0023】
したがって、本発明はリガンドすなわち化合物を備え、該化合物はタンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントを結合し、支持材料／マトリクスに付着する前の該リガンドすなわち化合物は、以下の式を有する。【化4】
【0024】
式（Ｉ）におけるｖが０の場合には、リガンドはＬに直接的に結合している、または結合することとなる。他の実施形態では、リガンドはスペーサ基Ｓｐを介して支持材料に結合されている。これは、式（Ｉ）におけるｖが０でない場合に適合する。
【0025】
上記式（Ｉ）におけるＬは連結点（linking point）であり、「付着点（point of attachment）」とも称される。当業者は、適切な連結点／付着点を把握している。
【0026】
連結点Ｌは、リガンド／化合物と直接的に接続されるか、スペーサを介して接続されるかのいずれかであることが理解される。Ｌは支持材料上の適切な成分であり、該支持材料は、本発明のリガンドを該支持材料に連結するのに適している。適切な成分は、当業者にとって既知である。通常、Ｌは、支持材料における適切な官能基と、該リガンドの前駆体化合物における対応する官能基との反応により、マトリクス結合リガンドを形成する反応の結果生じる対象の一部であるか、該対象の一部であってもよい。本発明の一実施形態では、該リガンドの前駆体化合物（支持マトリクスと反応し、リガンド置換マトリクスを形成する）は、スペーサ前駆体を備える。「スペーサ前駆体」は、該リガンド置換マトリクスが形成された後に残るスペーサ部分を形成する化学成分であり、支持材料における適切な基（前駆体基）と反応することによって連結点Ｌを形成するための適切な官能基（前駆体基）を含む（下記参照）。該リガンドの前駆体化合物がスペーサ前駆体を含まない場合（そのため、支持材料と結合を介して直接的に接続される場合）、適切な官能基（前駆体基）はリガンド自身に付着する。
【0027】
好ましい一実施家体では、Ｌは結合、好ましくは単結合を介して、式（Ｉ）に従うリガンドに直接的に接続される。Ｌが支持材料上の成分である場合には、結合されたリガンドは該支持材料にＬを介して接続する。この文脈において、用語「支持材料」は、当業者にとって既知の、市販のポリマーであって、本発明の目的に適したポリマーに関する。
【0028】
本発明に従うリガンドは、以下の構造単位を含む。【化5】
【0029】
式（Ｉ）に示される、及び／または式（ＩＩ）に示される、または式（ＩＩＩ）に示される構造単位を含むリガンドは、タンパク質に結合し、好ましくは抗体に結合し、好ましくはＩｇＧタイプの抗体及びＦｃ融合タンパク質、より好ましくは該抗体または該融合タンパク質のＦｃフラグメントまたはドメインに結合し、最も好ましくは、該Ｆｃフラグメントまたはドメインまたは該抗体は、ＩｇＧ抗体クラスのものであり、より好ましくはヒトＩｇＧ、またはヒト由来ポリクローナルあるいはモノクローナルＩｇＧ、特にＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4のものである。
【0030】
好ましい実施形態では、上記で定義されたリガンドは、支持材料／マトリクスに付着した後及び支持材料／マトリクスに付着する前に、上記で定義されたタンパク質に結合する。
【0031】
さらなる実施形態では、本発明はタンパク質、好ましくは抗体または抗体フラグメントのアフィニティー精製のための、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）を含む式（Ｉ）及び／または式（ＩＩ）に示される、及び／または式（ＩＩＩ）に示される構造単位を含むリガンドの使用に関し、ここでＬ、Ｓｐ、ＳｐＰ、Ａｍ、Ａｒ1、Ａｒ2、Ｒ1及びｖは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）（Ｉｃ）、（ＩＩ）及び／または（ＩＩＩ）について定義された、並びに／または本明細書及び実施例において、特に好ましい実施形態について定義された意味を有する。本実施形態では、タンパク質、抗体または抗体フラグメントは、好ましくは、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）について予め適した特性を有する。本実施形態では、リガンドはマトリクスに付着していても、マトリクスに付着していなくてもよいが、好ましくは、本実施形態では、リガンドはマトリクスに付着している。
【0032】
本発明の文脈における「結合（bond）」は、好ましくは共有化学結合であり、例えば単結合、二重結合または三重結合であって、好ましくは単結合である。
【0033】
好ましい実施形態では、Ｌは官能基または化学成分であり、本発明のリガンドを支持材料／マトリクスに付着させる前に支持材料それ自体上に存在しているか、本発明のリガンドを支持材料／マトリクスに付着させる過程において化学反応中に形成されるか（「新たな官能基」）のいずれかである。
【0034】
通常、支持材料は分子、好ましくは本発明のリガンドを付着させるための官能基を備えている。本発明の文脈において、官能基は支持材料の一部と見なされる。これは、本発明のリガンドが支持材料に結合を介して接続する場合（すなわち、スペーサ基Ｓｐが存在せず、Ｌがリガンドに結合を介して直接的に接続する場合。下記参照）においても適合し、前記官能基が結合に変換される際、本発明に従う各リガンドと、分子を支持材料に付着させるための前記官能基または前記支持材料自身のいずれかとの間に、結合が直接的に形成され、好ましくは単結合である。
【0035】
本発明に従うリガンドと分子を支持材料に付着させるための官能基との間に、結合が直接的に形成される場合には、前記官能基は、後で支持材料に付着する新たな官能基に相互変換されてもよい。本発明の文脈において、該新たな官能基は支持材料の一部と見なされ、リガンドをマトリクスに結合を介して連結するＬを形成し、好ましくは単結合である。
【0036】
支持材料上の適切な官能基（または「前駆体基」、すなわち、本発明に従うリガンドが付着する前に存在する基）、及び、リガンドが支持材料に直接的に結合することを可能とする本発明のリガンド上の適切な官能基は、限定されないが、互いに独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、＞ＮＨ、メタンスルホナート、トリフルオロメチルスルホナート、アリールスルホナート、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホロアミダイト、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルカルボキシラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールカルボキシラート、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールカルボキシラート、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、マレイミド、アクリラート、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドラジド、Ｏ−アルキルヒドロキシアミン、イソシアナート、イソチオシアナート、シアナート、チオシアナート、ビニルスルホンを含む。
【0037】
支持材料上に存在する官能基が、リガンドとの連結の際に相互変換してもよい官能基（「新たな官能基」）は、限定されないが、炭素−炭素単結合、炭素−窒素単結合、アリールアルキルエーテル、アリールアルキルチオエーテル、ジアリールエーテル、ジアリールチオエーテル、アリールアルキルアミン、アリールジアルキルアミン、アミド、ヒドラジド、スルホンアミド、スルホニルヒドラジド、Ｎ−アリールオキシアミド、Ｎ−アリールオキシスルホンアミド、ホスファート、リン酸アミド、リン酸ヒドラジド、Ｎ−アリールオキシリン酸アミド、ヒドラゾン、オキシム、ウレア、チオウレア、イソウレア、イミドカルボナート、イソチオウレア、イミドチオカルボナートを含む。
【0038】
本発明のさらなる実施形態では、Ｌはスペーサ基−Ｓｐ−に接続される。本実施形態では、Ｌは、支持材料上の適切な官能基の、スペーサ基Ｓｐ上の適切な官能基（または「前駆体基」）との反応により生じる結合または化学単位である。したがって、支持材料上の官能基と、スペーサ基Ｓｐ上の官能基（または「相補基」）との化学反応により、本発明に従うリガンドが、支持材料に連結点Ｌを介して接続する。
【0039】
スペーサ基Ｓｐは、好ましくは、Ｃ及びＨ原子に加えてさらなる原子を含んでいてもよい炭化水素基である。適切なさらなる原子は、当業者にとって既知である。好ましい原子は、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉを含む。該炭化水素基は、直鎖または分枝鎖または環状であってもよい。スペーサ基Ｓｐのより詳細な説明は、下記において提供される。Ｓｐは、本発明に従うリガンドのＡｒ1に、単結合、二重結合または三重結合を介して連結され、好ましくは単結合を介して連結される。さらに、Ｓｐは官能基（前駆体基）に連結されており、該官能基によって本発明のリガンドは、新たな官能基（「最終官能基」、「最終化学成分」または結合単位とも呼ばれる）が形成される際の化学反応において、マトリクス上に存在する官能基（前駆体基）と共有結合により連結され得る。このような、支持材料上及びＳｐ上に互いに独立して存在してもよい官能基（前駆体基）の例は、限定されないが、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、＞ＮＨ、メタンスルホナート、トリフルオロメチルスルホナート、アリールスルホナート、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホロアミダイト、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジルカルボキシラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールカルボキシラート、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールカルボキシラート、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、マレイミド、アクリラート、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、ヒドラジド、Ｏ−アルキルヒドロキシアミン、イソシアナート、イソチオシアナート、シアナート、チオシアナート、ビニルスルホンを含む。支持材料上の官能基と、スペーサＳｐ上に存在する官能基との反応に由来する適切な接続単位の例は、制限されないが、炭素−炭素単結合、エーテル、アリールアルキルエーテル、アリールアルキルチオエーテル、ジアリールエーテル、チオエーテル、ジアリールチオエーテル、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアルキルアミン、アリールジアルキルアミン、アミド、エステル、ヒドラジド、スルホンアミド、スルホニルヒドラジド、Ｎ−アリールオキシアミド、Ｎ−アリールオキシスルホンアミド、ホスファート、リン酸アミド、リン酸ヒドラジド、Ｎ−アリールオキシリン酸アミド、ヒドラゾン、オキシム、ウレア、チオウレア、イソウレア、イミドカルボナート、イソチオウレア、イミドチオカルボナートを含む。
【0040】
スペーサ基Ｓｐは、通常、式（Ｉ）に従うリガンドのＡｒ1と、支持材料上に存在する官能基 （前駆体基）に化学反応を受けて、前述の最終官能基（接続単位）を形成することが可能な官能基 （前駆体基）とを接続する。通常は、Ｓｐは直鎖または分枝鎖の炭化水素であり、環状のサブユニットを包含していてもよい。該炭化水素は、飽和でも不飽和でもよい。すなわち、それは二重結合または三重結合を包含していてもよい。Ｓｐが直鎖の炭化水素である場合、１つのリガンド部分が支持材料上の１つの前駆体基と接続可能になる。これに対し、Ｓｐが分枝鎖の炭化水素である場合、１つを超えるリガンド部分が支持材料上の１つの前駆体基と接続可能になる。Ｃ及びＨに加えて、該炭化水素はＮ、Ｏ、Ｐ及びＳのような他の原子を含んでいてもよく、好ましくはＮ及びＯを含んでいてもよい。該炭素鎖は、他の原子または原子群に割り込まれていてもよい。Ｓｐは、該炭化水素鎖に割り込んでいる異なる原子または原子群の組み合わせを含有していてもよい。該炭化水素の炭素鎖に割り込んでいてもよい原子または原子群の例は、−Ｏ−、＞Ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ＜、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）2である。該炭化水素が、−Ｎ＜（第三級アミノ）、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ＜（第三級アミド）または−Ｏ−（Ｐ＝Ｏ）（−Ｏ−）2（リン酸エステル）のような３価の原子または原子群により割り込まれた場合、前記原子群は、Ｓｐにおける１つを超えるリガンド接続サブユニットを、支持材料上に存在する官能基と化学反応して、最終的に前述の接続単位を形成することになる官能基を有するＳｐのサブユニットに接続する分枝点となってもよいことが理解される。Ｓｐ中に分枝点の導入を可能にしてもよい追加の適切な原子群としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アミノマロン酸、リジン、オルニチン及びジアミノプロピオン酸のような天然または非天然の３官能基アミノ酸を含む。これらの場合には、前記３価部分の官能基の１つが、支持材料上に存在する官能基と化学反応することを目的とする官能基となってもよい。通常、Ｓｐの全体の長さは１００原子未満であり、好ましくは５０原子未満であり、より好ましくは３０原子未満である。Ｓｐが分枝鎖である場合には、該長さは、支持材料上の官能基と化学反応することを目的とする官能基を備えるＳｐと接続している原子から、Ａｒ1部分に直接的に接続されている最も遠い原子までの距離により規定され、１００原子未満であり、好ましくは５０原子未満であり、より好ましくは４０原子未満である。
【0041】
支持材料上に存在する化学基に化学反応を受けることを目的とする、炭素系官能基（ＦＧ）（例えば、カルボン酸、アルデヒド、エポキシド、カルボン酸活性エステルなど）に接続された直鎖Ｓｐの適切な成分の例は、制限されないが、以下を含む：ＦＧ−（ＣＨ2）n−（アルキレン）、ここで１≦ｎ≦１００、好ましくは１≦ｎ≦５０、より好ましくは１≦ｎ≦３０；
ＦＧ−（ＣＨ2）n−Ｏ−（アルキレンオキシ）、ここで１≦ｎ≦９９、好ましくは１≦ｎ≦４９、より好ましくは１≦ｎ≦２９；
ＦＧ−（ＣＨ2）n−Ｎ（Ｈ）−（アルキレンアミノ）、ここで１≦ｎ≦９９、好ましくは１≦ｎ≦４９、より好ましくは１≦ｎ≦２９；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−（オリゴエチレングリコール）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｏ−（オリゴエチレングリコリルオキシ）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｎ（Ｈ）−（オリゴエチレングリコリルアミノ）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコール）；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｏ−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコリルオキシ）；
ＦＧ−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコリルアミノ）。
【0042】
支持材料上に存在する化学基に化学反応を受けることを目的とする、非炭素系官能基（ＦＧ）（例えば、ＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、塩素、臭素、ヨウ素、イソシアナート、イソチオシアナート）に接続された直鎖Ｓｐの適切な成分の例は、制限されないが、以下を含む：ＦＧ−（ＣＨ2）n−（アルキレン）、ここで１≦ｎ≦１００、好ましくは１≦ｎ≦５０、より好ましくは１≦ｎ≦３０；
ＦＧ−（ＣＨ2）n−Ｏ−（アルキレンオキシ）、ここで１≦ｎ≦９９、好ましくは１≦ｎ≦４９、より好ましくは１≦ｎ≦２９；
ＦＧ−（ＣＨ2）n−Ｎ（Ｈ）−（アルキレンアミノ）、ここで１≦ｎ≦９９、好ましくは１≦ｎ≦４９、より好ましくは１≦ｎ≦２９；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−（オリゴエチレングリコール）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｏ−（オリゴエチレングリコリルオキシ）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｎ（Ｈ）−（オリゴエチレングリコリルアミノ）、ここで１≦ｎ≦３０、好ましくは１≦ｎ≦１５、より好ましくは１≦ｎ≦９；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコール）；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｏ−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコリルオキシ）；
ＦＧ−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）2−Ｎ（Ｈ）−（アミドに割り込まれたオリゴエチレングリコリルアミノ）。
【0043】
１つの官能基が、支持材料上に存在する官能基と反応することを目的とする官能基性を示す３官能基原子を含む分枝鎖Ｓｐの適切な成分の例は、制限されないが、以下を含む：Ｈ2Ｎ−Ｃ（Ｈ）（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）2−）（−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ＣＨ2ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）2−）（グルタミン酸ビス（３，５−ジオキサ−１−オクチル）アミド；ＮＨ2基が、支持材料上に存在する官能基と反応することを目的とする）；
Ｈ2Ｎ−Ｃ（Ｈ）（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）（−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）グルタミン酸ビス（ｎ−プロピル）アミド；ＮＨ2基が、支持材料上に存在する官能基と反応することを目的とする）；
ＨＯ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｈ）（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）2−）（−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2）2−）（Ｎ，Ｎ’−ビス（３，５−ジオキサオクタノイル）ジアミノプロピオン酸；ｔｈｅカルボン酸基が、支持材料上に存在する官能基と反応することを目的とする）；
【0044】
本発明の実施形態では、Ｒ1は以下より選択される：水素；及びＣ1〜Ｃ4アルキル，特に直鎖及び分枝鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキルであり、シクロアルキル単位を含んでいてもよい。例えば、メチル，エチル，ｎ−プロピル，ｉ−プロピル，ｎ−ブチル，ｉ−ブチル，ｓｅｃ−ブチル，ｔｅｒｔ−ブチル，シクロプロピル，メチルシクロプロピル。
【0045】
好ましくは、Ｒ1は水素，エチル及びメチルより選択される。より好ましくは、Ｒ1は水素またはメチルである。最も好ましくは、Ｒ1は水素である。
【0046】
Ａｒ1は脂環式もしくはヘテロ環式単核芳香環、または部分的に飽和の芳香環であって、５，６または７員環を有していてよい。Ａｒ1は、ＳｐまたはＬに化学結合を介して接続される。Ａｒ1のＳｐまたはＬへの該結合は、単結合、二重結合または三重結合であり得る。好ましくは、該結合は単結合である。Ａｒ1は、ＳｐまたはＬへの化学結合に加えて、置換基への結合を有し得る。
【0047】
Ａｒ1がヘテロ環式芳香環または部分的に飽和のヘテロ環式芳香環である場合には、それはＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、好ましくはＮ及びＳからなる群より選択され、より好ましくは１つ以上のＮ原子を含む。これらすべての実施形態において、Ａｒ1は好ましくは５または６員環である。
【0048】
Ａｒ1がさらなる５または６員環単核芳香環に化学結合を介して付着していない場合、またはさらなる単核または２核芳香環系に縮合していない場合、Ａｒ1は好ましくはの脂環式６員環芳香環（例えば、ベンゼン）またはＮ原子を有するヘテロ環式６員環（例えば、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン）である。この実施形態において、Ａｒ1は好ましくはベンゼンまたはピリジンであり、ピリジンがより好ましい。
【0049】
一実施形態では、Ａｒ1はさらなる５または６員環単核芳香環に化学結合を介して付着している。Ａｒ1のさらなる５または６員環単核芳香環への該結合は、単結合または二重結合であり得る。好ましくは、該結合は単結合である。該さらなる５または６員環単核芳香環は、脂環式またはヘテロ環式であり得る。すなわち、それはＮ，Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含み得る。
【0050】
Ａｒ1が５または６員環単核芳香環に化学結合により付着している場合、Ａｒ1は、好ましくはチアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾールまたはトリアゾールであり、トリアゾール及びチアゾールがより好ましい。Ａｒ1に付着された該５または６員環は、好ましくはベンゼンまたはピリジンである。該ピリジンまたはベンゼン環は、無置換であってもよく、−ＯＨ、メチル、エチル、エトキシ、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、メトキシ、モノフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシの群より選択される少なくとも１つの成分により置換されていてもよい。５または６員環単核芳香環に付着されたＡｒ1の好ましい単位は、４−トリアゾリルベンゼン、５−トリアゾリルベンゼン、２−チアゾリルベンゼン、４−チアゾリルベンゼン、５−チアゾリルベンゼン、２−オキサゾリルベンゼン、４−オキサゾリルベンゼン、５−オキサゾリルベンゼン、３−イソチアゾリルベンゼン、４−イソチアゾリルベンゼン、５−イソチアゾリルベンゼン、３−イソオキサゾリルベンゼン、４−イソオキサゾリルベンゼン、５−イソオキサゾリルベンゼン、３−イソチアゾリルベンゼン、４−イソチアゾリルベンゼン、５−イソチアゾリルベンゼンである。５または６員環単核芳香環に付着されたＡｒ1のさらに好ましい単位は、トリアゾリルピリジン、チアゾリルピリジン、オキサゾリルピリジン、イソオキサゾリルピリジン、イソチアゾリルピリジンであり、該ピリジン単位は、Ａｒ1の異なる位置に付着していてもよく、該ピリジンの窒素原子は異なる位置にあってもよい。５または６員環単核芳香環に付着されたＡｒ1より好ましい単位は、４−トリアゾリルベンゼン、４−チアゾリルベンゼン、２−（４−チアゾリル）ピリジン及び３−（４−チアゾリル）ピリジンであり、４−トリアゾリルベンゼンが最も好ましい。
【0051】
本出願において、用語「部分的に飽和の芳香環」は、１つ以上の２重結合が単結合により置換された５、６または７員環芳香環を示す。該環は完全に飽和しておらず、すなわち、少なくとも２つのｓｐ2原子が残存していることが理解される。該部分的に飽和の環系における１つ以上の原子は、＝Ｏにより置換されていてもよい。
【0052】
他の実施形態では、Ａｒ1は、多核芳香環系または部分的に飽和の多核環系の一部として、単核または２核芳香環系に縮合している。多核環系は、２核または３核環系であり、好ましくは２核環系である。
【0053】
本出願において、用語「部分的に飽和の多核環系」は、他の単核または２核芳香環に縮合し、１つ以上の２重結合が単結合により置換された５、６または７員環芳香環を示す。該環は完全に飽和しておらず、すなわち、少なくとも２つのｓｐ2原子が残存していることが理解される。前記環が縮合している該芳香環系が不飽和である際には、該追加の環の一部でもあるＡｒ1の部分的に飽和の環の、少なくともそれらの原子はｓｐ2原子である。該部分的に飽和の環系における１つ以上の原子は、＝Ｏにより置換されていてもよい。
【0054】
Ａｒ1がさらなる単核または２核芳香環系に縮合している場合、Ａｒ1は好ましくはイミダゾール、トリアゾール、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、ピロール、イミダゾリン、オキサゾリン、テトラヒドロピラジンまたはテトラヒドロ［１Ｈ］−１、４−オキサゼピンであり、イミダゾール、イミダゾリン及びピラゾールがより好ましく、イミダゾール及びイミダゾリンが最も好ましい。該さらなる芳香環系は、好ましくは単核である。該さらなる芳香環系は、好ましくはベンゼン、チオフェン、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、フラン、チアゾールまたはオキサゾールであり、ベンゼン、チオフェン及びピリジンがより好ましく、ベンゼンが最も好ましい好ましい、より好ましい及び最も好ましい該さらなる芳香環系は、無置換であってもよく、少なくとも１つの−ＯＨ、メチル、エチル、エトキシ、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、メトキシ、モノフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシからなる群より選択される成分であってもよい。さらなる芳香環系に縮合しているＡｒ1より形成される単位は、２核または３核環系であり、好ましくは２核環系である。
【0055】
好ましい単位は、ベンゾイミダゾール、２−メチルベンゾイミダゾール、２−エチルベンゾイミダゾール、２−メトキシベンゾイミダゾール、ベンゾトリアゾール、２，３−ジヒドロ［１Ｈ］ベンゾイミダゾール−２−オン、インダゾール、１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン−２−３−オン、２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１、４］オキサゼピン−５−オン、ベンゾチアゾール及びベンゾオキサゾールであり、ベンゾイミダゾール、２−メチルベンゾイミダゾール、２−エチルベンゾイミダゾール、２−メトキシベンゾイミダゾール及び２，３−ジヒドロ［１Ｈ］ベンゾイミダゾール−２−オンがより好ましく、ベンゾイミダゾール及び２−メチルベンゾイミダゾールが最も好ましい。
【0056】
Ａｒ1は、Ａｒ1を構成している前記５、６または７員環芳香環または該部分的に飽和の芳香環上に存在する化学結合を介してＡｍに直接的に結合しているか、Ａｒ1に付着している該さらなる５または６員環芳香環またはＡｒ1に縮合している該さらなる芳香環上に存在する化学結合を介してＡｍに間接的に結合している。Ａｒ1のＡｍへの直接的な結合は、前述の３つの選択肢の全てにおいて、すなわち、Ａｒ1がさらなる５または６員環単核芳香環に付着するとき、Ａｒ1が多核環系の一部としてさらなる５または６員環に付着するとき、またはこれら２つの選択肢が適用されないときに行われる。
【0057】
本発明のさらなる実施形態では、Ａｒ1はさらなる置換がされていない。用語「さらなる置換がされていない」は、ＳｐまたはＬへの化学結合、及びＡｒ1上に任意に存在する１つ以上の化学結合（これらは、Ａｍへの任意の結合、さらなる５または６員環芳香環への結合及びＡｒ1を芳香環に縮合させる結合から選択される）を除いて、上記に特定された結合種以外には水素原子のみがＡｒ1上に存在することを意味する。
【0058】
他の実施形態では、Ａｒ1は、以下に明示する少なくとも１つの置換基に付着している。該少なくとも１つの置換基は、前述の選択肢の全てにおいて、すなわち、Ａｒ1がＡｍに直接的に接続しているとき、またはＡｒ1がさらなる５または６員環単核芳香環に付着しているとき、またはＡｒ1が多核環系の一部としてさらなる５または６員環に縮合しているとき、またはこれらの選択肢が適用されないとき（この場合、Ａｒ1はＡｍに直接的に接続している必要がある）に存在し得る。
【0059】
該少なくとも１つの置換基は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル；Ｃ3及びＣ4シクロアルキル；Ｃ2〜Ｃ4アルケニル；Ｃ2〜Ｃ4アルキニル；ハロゲン；Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキル；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ4アルキル；Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；Ｃ1〜Ｃ4アルキルチオ；−ＮＯ2；＝Ｏ；＝Ｓ；＝ＮＨ；−ＯＨ；及びそれらの組み合わせより選択される。
【0060】
Ｃ1〜Ｃ4アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルを含む。Ｃ1〜Ｃ4アルコキシは、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシを含む。Ｃ3及びＣ4シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル及びメチルシクロプロピルである。Ｃ1〜Ｃ4ハロアルキルは、以下を含む：フルオロ−、ジフルオロ−及びトリフルオロメチル、並びに１つ以上のフルオロ置換されたエチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル；クロロ−、ジクロロ−及びトリクロロメチル；並びに１つ以上のクロロ置換されたエチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル。ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシは、以下を含む：フルオロ−、ジフルオロ−及びトリフルオロメトキシ、並びに１つ以上のフルオロ置換されたエトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ；クロロ−、ジクロロ−及びトリクロロメチル；並びに１つ以上のクロロ置換されたエトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ。
【0061】
好ましい置換基は、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ；シクロプロピル、ヒドロキシメチル、−ＮＯ2、＝Ｏであり、メチル、エチル、メトキシ及び＝Ｏが最も好ましい。
【0062】
Ａｒ1の該少なくとも１つの置換基への結合は、単結合または２重結合であり得る。
【0063】
Ａｒ1、またはさらなる５または６員環芳香環のＡｒ1への付着により生じる単位、またはさらなる５または６員環芳香環のＡｒ1への縮合により生じる単位は、Ａｍだけでなく、ＳｐまたはＬにも付着する。
【0064】
Ａｍの配向性に応じて、Ａｒ1への付着またはさらなる５または６員環芳香環のＡｒ1への付着または縮合により生じる単位は、ＡｍのＣ＝Ｏ基またはＡｍのＮＲ1基を介して達成されてもよい。さらなる５または６員環芳香環に付着または縮合されないＡｒ1の適切な成分の例は、制限されないが、ベンゼン、チオフェン、ピリジン、ピリミジン、ピラジンまたはピリダジンを含む。
【0065】
好ましい実施形態では、Ａｒ1はベンゼンである。この実施形態において、Ａｍ及びＳｐのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基またはＬは、互いに対してオルト、メタまたはパラ配向性であってもよく、メタまたはパラ配向性が好ましく、パラ配向性がより好ましい。他の好ましい実施形態では、Ａｒ1はピリジンである。この実施形態において、Ａｍ及びＳｐのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基またはＬは、互いに対してオルト、メタまたはパラ配向性であってもよく、メタまたはパラ配向性が好ましく、パラ配向性がより好ましく、このとき該ピリジンのＮ原子は異なる位置にあってもよい。
【0066】
Ａｒ1がさらなる５または６員環芳香環に付着することにより生じる適切な成分の例は、制限されないが、４−トリアゾリルベンゼン、５−トリアゾリルベンゼン、２−チアゾリルベンゼン、４−チアゾリルベンゼン、５−チアゾリルベンゼン、２−オキサゾリルベンゼン、４−オキサゾリルベンゼン、５−オキサゾリルベンゼン、３−イソチアゾリルベンゼン、４−イソチアゾリルベンゼン、５−イソチアゾリルベンゼン、３−イソオキサゾリルベンゼン、４−イソオキサゾリルベンゼン、５−イソオキサゾリルベンゼン、３−イソチアゾリルベンゼン、４−イソチアゾリルベンゼン、５−イソチアゾリルベンゼンを含む。これらの場合では、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は、通常はベンゼン部分に付着しており、Ａｒ1の５員環芳香環に対してオルト、メタまたはパラ、好ましくはメタまたはパラに位置していてもよく、通常、ＳｐまたはＬは、該環におけるベンゼン部分が付着した原子に隣接していないＡｒ1の環状原子を介して、Ａｒ1の５員環芳香環に付着している。
【0067】
さらなる５または６員環芳香環をＡｒ1付に着させることにより生じる適切な成分のさらなる例は、制限されないが、トリアゾリルピリジン、チアゾリルピリジン、オキサゾリルピリジン、イソオキサゾリルピリジン、イソチアゾリルピリジンを含み、該ピリジン単位はＡｒ1の異なる位置に付着してもよく、該ピリジンの窒素原子は異なる位置にあってもよい。これらの場合では、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は、通常は該ピリジン部分に付着してもよく、Ａｒ1の５員環芳香環に対してオルト、メタまたはパラ、好ましくはメタまたはパラに位置していてもよく、通常、ＳｐまたはＬは、該環におけるベンゼン部分が付着した原子に隣接していないＡｒ1の環状原子を介して、Ａｒ1の５員環芳香環に付着している。
【0068】
さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる適切な単位の例は、制限されないが、ベンゾイミダゾール、ベンゾトリアゾール、２，３−ジヒドロ［１Ｈ］ベンゾイミダゾール、インダゾール、１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン、２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１、４］オキサゼピン、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾールを含み、、ベンゾイミダゾール及び２，３−ジヒドロ［１Ｈ］ベンゾイミダゾールがより好ましく、ベンゾイミダゾールが最も好ましい。
【0069】
さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がベンゾイミダゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常１または２位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常５または６位、好ましくは５位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がベンゾトリアゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常１位にに付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常５位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位が２，３−ジヒドロ［１Ｈ］ベンゾイミダゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常１位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常５位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がインダゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常１位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常３または５位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がテトラヒドロキノキサリンである場合には、ＬまたはＳｐは通常１位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常６または７位、好ましくは６位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位が２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ［ｆ］［１，４］オキサゼピンである場合には、ＬまたはＳｐは通常４位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常７位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がベンゾチアゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常２位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常５または６位に付着する。さらなる５または６員環芳香環に縮合したＡｒ1より生じる単位がベンゾオキサゾールである場合には、ＬまたはＳｐは通常２位に付着し、ＡｍのＮＲ1基またはＣ＝Ｏ基は通常５または６位に付着する。
【0070】
Ａｒ2 は脂環式またはヘテロ環式単核芳香環であり、５または６員環を有し得る。Ａｒ2 は、Ａｍに化学結合を介して接続している。一実施形態では、Ａｒ2はＡｍのＮ原子に接続している；他の実施形態では、Ａｒ2はＡｍのＣ原子に接続している。好ましくは、Ａｒ2はＡｍのＮ原子に接続している。Ａｒ2は、Ａｍとの化学結合に加えて、少なくとも１つのさらなる化学成分、すなわち少なくとも１つの置換基に付着し得る、または多核環系の一部として、５または６員環単核芳香環に縮合し得る。
【0071】
Ａｒ2がヘテロ環式芳香環である場合には、それはＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、好ましくはＮ及びＳからなる群より選択され、より好ましくは少なくとも１つのＮ原子及び少なくとも１つのＳ原子を含む。これらすべての実施形態において、Ａｒ2は好ましくは５または６員環であり、より好ましくは５員環である。
【0072】
Ａｒ2がさらなる単核または２核芳香環系に縮合していない場合、一実施形態では、Ａｒ2は６員環脂環式芳香環（例えば、ベンゼン）または少なくとも１つのＮ原子を有する６員環ヘテロ環（例えば、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジンまたはトリアジン）である。この実施形態では、Ａｒ2は、好ましくはベンゼン、ピリジン、ピラジン、ピリダジンまたはピリミジンであり、ベンゼン及びピリダジンがより好ましい。他の実施形態では、Ａｒ2はＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員環ヘテロ環式芳香環であり、Ｎ及びＳを含むものが好ましい。Ａｒ2の適切な例は、制限されないが、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、チオフェン、フランを含む。Ａｒ2の好ましい例は、チアゾール、１，２，４−チアジアゾール及び１，３，４−チアジアゾールであり、１，２，４−チアジアゾール及び１，３，４−チアジアゾールが最も好ましい。
【0073】
他の実施形態では、Ａｒ2は、多核環系の一部として、単核または２核芳香環系に縮合している。多核環系は２核または３核環系であり、好ましくは２核環系である。
【0074】
Ａｒ2がさらなる単核または２核芳香環系に縮合している場合には、Ａｒ2は好ましくは１Ｈ−ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、またはイミダゾールである。Ａｒ2が１Ｈ−ピラゾールである場合、該第２の芳香環系は４または５位を介してＡｒ2に縮合し、Ａｍは３位に付着している。Ａｒ2がチアゾールである場合、該第２の芳香環は４または５位を介してＡｒ2に縮合し、Ａｍは２位に付着している。Ａｒ2がオキサゾールである場合、該第２の芳香環系は４または５位を介してＡｒ2に縮合し、Ａｍは２位に付着している。Ａｒ2がイミダゾールである場合、該第２の芳香環系は１または２位を介してＡｒ2に縮合し、Ａｍは４位に付着している。あるいは、該第２の芳香環系は４または５位を介してＡｒ2に縮合し、Ａｍは２位に付着している。該さらなる芳香環系は、好ましくは単核である。該さらなる芳香環系は、好ましくはベンゼン、チオフェン、ピリジン、フラン、チアゾール、オキサゾールまたはイミダゾールである。より好ましくは、該さらなる芳香環系はベンゼンまたはチアゾールである。該さらなる芳香環系がチアゾールである場合には、それはＡｒ2に２または３位を介して縮合している。さらなる芳香環系に縮合しているＡｒ2より形成された単位は、好ましくはベンゾオキサゾール（Ａｍは２位に付着）、ベンゾチアゾール（Ａｍは２位に付着）、インダゾール（Ａｍは３位に付着）またはイミダゾ−［２，１−ｂ］チアゾール（Ａｍは６位に付着）である。
【0075】
Ａｒ2がオキサゾールまたはチアゾールである場合、それは第２の芳香環系に縮合する代わりに、４または５位を介してシクロペンテンに縮合してもよい。その結果得られる単位は、好ましい単位でもあり、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタオキサゾール（Ａｍは２位に付着）及び５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾール（Ａｍは２位に付着）が挙げられ、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−シクロペンタチアゾールがより好ましい。
【0076】
本発明のさらなる実施形態では、Ａｒ2はさらなる置換がされていない。用語「さらなる置換がされていない」は、Ａｍへの化学結合、及びＡｒ2上に任意に存在する１つ以上の化学結合を除いて、上記に特定された結合種以外には水素原子のみがＡｒ2上に存在することを意味する。
【0077】
他の実施形態では、Ａｒ2は、以下に明示する少なくとも１つの置換基に付着している。該少なくとも１つの置換基は、前述の２つの選択肢の全てにおいて、すなわち、Ａｒ2が多核環系の一部としてさらなる５または６員環に縮合しているとき、またはＡｒ2がさらなる環に縮合していないときに存在し得る。Ａｒ2の少なくとも１つの置換基への結合は、単結合または２重結合であり得る。好ましくは、該結合は単結合である。
【0078】
Ａｒ2が化学結合を介して付着し得る少なくとも１つの置換基は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル；Ｃ2〜Ｃ6アルケニル；Ｃ5及びＣ6シクロアルケニル；Ｃ2〜Ｃ6アルキニル；ハロゲン；Ｃ1〜Ｃ6ハロアルキル；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル；Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；ヒドロキシ置換Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミノ；Ｃ1〜Ｃ6アルキルチオ；−ＯＨ；ＳＨ；カルバモイル；Ｃ1〜Ｃ4アルキレンジオキシ；５または６員環単核芳香環；及びこれらの組み合わせより選択され、ここでＡｒ2は、任意には、上述の化学結合を介して付着されてもよい該置換基に加えて、多核環系の一部として５または６員環単核芳香環に縮合している。いる。
【0079】
Ｃ1〜Ｃ6アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルを含む。Ｃ1〜Ｃ6アルコキシは、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ及びヘキシルオキシを含む。Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロプロピル、ジメチルシクロプロピル、トリメチルシクロプロピル、エチルシクロプロピル、プロピルシクロプロピル、メチルエチルシクロプロピル、メチルシクロブチル、ジメチルシクロブチル、エチルシクロブチル、及びメチルシクロペンチルを含む。Ｃ1〜Ｃ6ハロアルキルは：フルオロ−、ジフルオロ−及びトリフルオロメチル、及び１つ以上のフッ素に置換されたエチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、プロピル及びヘキシル；クロロ−、ジクロロ−及びトリクロロメチル；及び１つ以上の塩素に置換されたエチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、プロピル及びヘキシルを含む。ハロゲン置換Ｃ1〜Ｃ4アルコキシは：フルオロ−、ジフルオロ−及びトリフルオロメトキシ、及び及び１つ以上のフッ素置換されたエトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ；クロロ−、ジクロロ−及びトリクロロメチル；及び及び１つ以上の塩素に置換されたエトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ；メチレンジオキシを含むＣ1〜Ｃ4アルキレンジオキシ；エチレンジオキシ、プロピレンジオキシ、ブチレンジオキを含み、好ましくは、メチレンジオキシ、エチレンジオキシを含む。
【0080】
好ましい置換基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、シクロプロピル、ヒドロキシメチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フッ素、塩素、カルバモイル、エチルチオ、メチルチオであり、メチル、エチル、カルバモイル、メトキシ、エチルチオ及びシクロプロピルが最も好ましい。
【0081】
一実施形態において、Ａｒ2に化学結合により付着する置換基は、５または６員環単核芳香環である。Ａｒ2の５または６員環芳香環への結合は、単結合または２重結合であり得る。好ましくは、該結合は単結合である。該さらなる５または６員環単核芳香環は、脂肪族環またはヘテロ環であり得る。すなわち、それはＮ、Ｓ及びＯからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み得る。
【0082】
Ａｒ2が５または６員環単核芳香環に化学結合を介して付着している場合には、Ａｒ2は好ましくはオキサゾール、イソオキサゾール、イミダゾール、ピラゾール、ピロール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、ピリジン、ピリダジンまたはピリミジンである。より好ましくは、Ａｒ2はピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾールまたはピリダジンである。最も好ましくは、Ａｒ2はピラゾール、チアゾール、１，２，４−チアジアゾールまたは１，３，４−チアジアゾールである。Ａｒ2がオキサゾールである場合、Ａｍは２位に付着し、該さらなる単核芳香環は４または５位に付着する。あるいは、Ａｍは４または５位に付着し、該さらなる単核芳香環は２位に付着する。Ａｒ2がイソオキサゾールである場合、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。あるいは、Ａｍは５位に付着し、該さらなる単核芳香環は３位に付着する。Ａｒ2がイミダゾールである場合、Ａｍは２位に付着し、該さらなる単核芳香環は４位に付着する。あるいは、Ａｍは４位に付着し、該さらなる単核芳香環は２位に付着する。Ａｒ2がピラゾールである場合、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。あるいは、Ａｍは３または４位に付着し、該さらなる単核芳香環は１位に付着する。Ａｒ2がピロールである場合、Ａｍは２位に付着し、該さらなる単核芳香環は４位に付着する。あるいは、Ａｍは４位に付着し、該さらなる単核芳香環は２位に付着する。なおあるいは、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は１位に付着する。Ａｒ2がチアゾールは２位に付着し、該さらなる単核芳香環は４または５位に付着する。あるいは、Ａｍは４または５位に付着し、該さらなる単核芳香環は２位に付着する。Ａｒ2がイソチアゾールである場合、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。あるいは、Ａｍは５位に付着し、該さらなる単核芳香環は３位に付着する。Ａｒ2が１，２，４−チアジアゾールである場合、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。あるいは、Ａｍは５位に付着し、該さらなる単核芳香環は３位に付着する。Ａｒ2が１，３，４−チアジアゾールである場合、Ａｍは２位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。Ａｒ2がピリジンである場合、Ａｍ及び該さらなる単核芳香環は互いに対してメタまたはパラに位置し、好ましくはパラに位置しており、このときピリジンコアの窒素原子は異なる位置にあってもよい。Ａｒ2がピリダジンである場合、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は６位に付着する。あるいは、Ａｍは５位に付着し、該さらなる単核芳香環は３位に付着する。なおあるいは、Ａｍは３位に付着し、該さらなる単核芳香環は５位に付着する。Ａｒ2がピリミジンである場合、Ａｍ及び該さらなる単核芳香環は互いに対してメタまたはパラに位置し、好ましくはパラに位置しており、このときピリミジンコアの窒素原子は異なる位置を有していてもよい。
【0083】
Ａｒ2に付着している該さらなる単核５または６員環芳香環は、好ましくはベンゼン、フラン、チオフェン、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、またはピリジンである。より好ましくは、Ａｒ2に付着している該さらなる単核５または６員環芳香環は、フラン、オキサゾール、イソオキサゾールまたはピリジンであり、フランが最も好ましい。該さらなる単核芳香環がフランである場合、それは２または３位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がチオフェンである場合、それは２または３位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がオキサゾールである場合、それは２、４または５位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がイソオキサゾールである場合、それは３、４または５位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がチアゾールである場合、それは２、４または５位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がイソチアゾール、それは３、４または５位を介してＡｒ2に付着している。該さらなる単核芳香環がピリジンである場合、それは２、３または４位を介してＡｒ2に付着している。
【0084】
５または６員環単核芳香環に付着しているＡｒ2の好ましい単位は、１−フェニルピラゾール（Ａｍは３位に付着）、２−（２−フリル）ピラゾール（Ａｍは５位に付着）、４−フェニルチアゾール（Ａｍは２位に付着）、５−フェニルチアゾール（Ａｍは２位に付着）、２−（２−フリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（３−フリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（２−ピリジル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（３−ピリジル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（４−ピリジル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、３−（２−フリル）−１，２，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、４−（２−フリル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、５−（２−フリル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、２−フェニル−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、３−フェニル−１，２，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、４−（２−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（３−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（４−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）５−（２−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、５−（３−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、５−（４−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、３−（２−フリル）ピリダジン（Ａｍは６位に付着）、２−（５−イソオキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（５−オキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（２−オキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）である。
【0085】
５または６員環単核芳香環に付着しているＡｒ2のより好ましい単位は、２−（２−フリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（３−フリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、３−（２−フリル）−１，２，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、４−（２−フリル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、５−（２−フリル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（２−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（３−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（４−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、３−（２−フリル）ピリダジン（Ａｍは６位に付着）、２−（５−イソオキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（５−オキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、２−（２−オキサゾリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）である。５または６員環単核芳香環に付着しているＡｒ2の最も好ましい単位は、２−（２−フリル）−１，３，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、３−（２−フリル）−１，２，４−チアジアゾール（Ａｍは５位に付着）、４−（２−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（３−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）、４−（４−ピリジル）チアゾール（Ａｍは２位に付着）である。
【0086】
さらなる５または６員環単核芳香環に付着したＡｒ2より生じる単位は、Ａｍへの付着に加えて、以下より選択される１つ以上の置換基を付着していてもよい：メチル、エチル、メトキシ、メチレンジオキシ（この場合、該置換基は、さらなる５または６員環単核芳香環に付着したＡｒ2より生じる単位において２原子に付着している）、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ。好ましい置換基は、メチル及びメチレンジオキシである。
【0087】
Ａｒ2は、Ｃ＝Ｏ基（式Ｉａ参照）またはＮＲ1基（式Ｉｂ参照）のいずれかに付着されている。
【0088】
式（Ｉ）に示される変数Ｌ、Ｓｐ、Ａｒ1、Ａｍ、Ｒ1及びＡｒ2の様々な意味についての前述の全ての定義は、本発明の実施形態に関しており、考慮している変数以外の、他の変数の任意の１つまたは全てが、通常の、好ましい、より好ましいまたはさらに好ましい実施形態に関するか否かにかかわらず、通常の実施形態、好ましい実施形態、より好ましい実施形態及びさらに好ましい実施形態における各変数を含む。したがって、１つの変数の通常の実施形態は、好ましい、より好ましい及びさらに好ましい実施形態における任意の他の変数と組み合わせることができる。
【0089】
以下、一般式（Ｉ）の好ましい定義における定義について述べる。
【0090】
下記の全ての実施形態において(すなわち、好ましい、より好ましいまたはさらに好ましい実施形態において)、Ｒ1は水素またはメチルであり、最も好ましくは水素である。
【0091】
本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）の変数は以下の意味を有する：Ａｒ1は、１、２または３個のＮ原子を含む５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環、またはベンゼンであって、前記単核環またはベンゼンは、化学結合を介してＳｐまたはＬと接続されるものであり、さらに任意には、
（ａ）ベンゼンまたはチオフェンに化学結合を介して付着している；または、
（ｂ）多核環系の一部として、ベンゼンまたはチオフェンに縮合している；
ここで、Ａｒ1は、Ａｒ1を構成する前記芳香環またはベンゼンに存在する化学結合を介してＡｍと直接的に接続しているか、Ａｒ1に付着している前記ベンゼン環またはチオフェン環に存在する化学結合、またはＡｒ1に縮合している前記ベンゼン環またはチオフェン環における化学結合を介してＡｍと間接的に接続しているかのいずれかであって；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ；シクロプロピル、ヒドロキシメチル、−ＮＯ2、＝Ｏ、＝Ｓ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に付着しているかのいずれかである；及び／または、
Ａｒ2は５員環単核芳香環であって、無置換であるか、または、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、シクロプロピル、ヒドロキシメチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フッ素、塩素、カルバモイル、エチルチオ、メチルチオ、５または６員環単核芳香環及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に化学結合を介して付着しており；任意には、Ａｒ2は、上記のようにそれが化学結合を介して付着してもよい該置換基に加えて、多核環系の一部としてベンゼンまたはチアゾールと縮合している。
【0092】
本発明のさらに好ましい実施形態では、式（Ｉ）の変数は以下の意味を有する：Ａｒ1は、イミダゾール、ベンゼン、ピリジン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール及びトリアゾールから選択される５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環であって、化学結合を介してＳｐまたはＬと接続されるものであり、さらに任意には、
（ａ）ベンゼンに化学結合を介して付着している；または、
（ｂ）多核環系の一部として、ベンゼンに縮合している；
ここで、Ａｒ1は、Ａｒ1を構成する５または６員環の単核芳香環または部分的に飽和の芳香環に存在する化学結合を介してＡｍと直接的に接続しているか、Ａｒ1に付着している該ベンゼン環に存在する化学結合、またはＡｒ1に縮合している該ベンゼン環における化学結合を介してＡｍと間接的に接続しているかのいずれかであって；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ；シクロプロピル、ヒドロキシメチル、−ＮＯ2、＝Ｏ、＝Ｓ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に付着しているかのいずれかである；及び／または、
Ａｒ2は、Ｎ、Ｓ、Ｏから、好ましくはＮ、Ｓから選択される少なくとも１つの原子を含む５員環単核芳香環であって、無置換であるか、または、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、シクロプロピル、ヒドロキシメチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、フルオロ、クロロ、カルバモイル、エチルチオ、メチルチオから、好ましくはメチル、エチル、メトキシ、エチルチオ及びシクロプロピルから；５または６員環単核芳香環及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に化学結合を介して付着しており；任意には、Ａｒ2は、上記のようにそれが化学結合を介して付着してもよい該置換基に加えて、多核環系の一部としてベンゼンまたはチアゾールと縮合している。
【0093】
本発明のさらに好ましい実施形態では、式（Ｉ）の変数は以下の意味を有する：Ａｒ1は、ベンゾイミダゾール、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾール、ピリジン及び４−トリアゾリルベンゼンから選択され；
Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの１または２位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの１位、ピリジンの２位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の１位に付着する化学結合を介して、ＳｐまたはＬに接続し；
ここで、Ａｒ1は、ベンゾイミダゾールの５または６位、２，３−ジヒドロベンゾイミダゾールの５または６位、ピリジンの５位または４−トリアゾリルベンゼンのトリアゾール部の４位に付着する化学結合を介して、Ａｍに接続し；
Ａｒ1は、さらなる置換がされていないか、または、メチル、エチル、メトキシ、＝Ｓ及び＝Ｏ；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に付着しているかのいずれかである；及び／または、
Ａｒ2は１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール及びチアゾールから選択される５員環単核芳香環であって、無置換であるか、または、メチル、エチル、メトキシ、エチルチオ、及びシクロプロピル；ピリジン、フラン、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾールから選択される５または６員環単核芳香環；及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの置換基に化学結合を介して付着している。
【0094】
本発明は、（支持材料に付着された後に、）本発明の方法で用いられるリガンド置換マトリクスを、該支持材料と共に形成する本発明のリガンドをも含む。該マトリクス／支持材料に付着する前の該リガンドは、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）に従うものであり、ここで記号Ｓｐ，Ａｒ1，Ａｒ2及びＡｍは前記好ましい意味を含む上述の意味を有する：【化6】
【0095】
本発明に従うリガンドは、以下の構造単位を含む。【化7】
【0096】
式（Ｉ）に示されるリガンド、及び／または式（ＩＩ）に示されるリガンド、及び／または式（ＩＩＩ）に示される構造単位を含むリガンドは、タンパク質に結合し、好ましくは抗体に結合し、好ましくはＩｇＧタイプの抗体及びＦｃ融合タンパク質、より好ましくは該抗体または該融合タンパク質のＦｃフラグメントまたはドメインに結合し、最も好ましくは、該Ｆｃフラグメントまたはドメインまたは該抗体は、ＩｇＧ抗体クラスのものであり、より好ましくはヒトＩｇＧ、またはヒト由来ポリクローナルあるいはモノクローナルＩｇＧ、特にＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4のものである。
【0097】
好ましい実施形態では、上記で定義されたリガンドは、支持材料／マトリクスに付着した後及び支持材料／マトリクスに付着する前に、上記で定義されたタンパク質に結合する。
【0098】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）に従うリガンドは、該リガンドに付着するスペーサ前駆体基ＳｐＰリガンドを備える。
【0099】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）に従うリガンドは、付着したスペーサ基を有さないさらなる化合物を合成するための前駆体として用いられ得る。該指定化合物は、スペーサ基の開裂の後に生成され、場合によっては、ＳｐＰに接続される該リガンドに存在している官能基を、当業者に既知である任意の他の適切な官能基に変換されてもよい。そのための適切な反応は、当業者にとって既知である。その結果生じる化合物もまた、本発明に含まれる。
【0100】
本発明に従うマトリクスの好ましいリガンドを、以下に示す。ここで、各式において、最も左側のＮ原子は、表示されていない連結点Ｌに接続される。以下の全ての式は、リガンドに付着したスペーサ前駆体基（ＳｐＰ）を表す：
【0101】
【化8】
【0102】
【化9】
【0103】
【化10】
【0104】
【化11】
【0105】
【化12】
【0106】
【化13】
【0107】
【化14】
【0108】
【化15】
【0109】
【化16】
０９）
【0110】
【化17】
アゾール−２−イル）アミド（Ｌ１０）
【0111】
【化18】
ル−１−フェニルピラゾール−３−イル）アミド（Ｌ１１）
【0112】
【化19】
【0113】
【化20】
【0114】
【化21】
【0115】
【化22】
【0116】
【化23】
【0117】
【化24】
【0118】
【化25】
【0119】
【化26】
【0120】
【化27】
【0121】
【化28】
【0122】
【化29】
【0123】
【化30】
【0124】
【化31】
【0125】
【化32】
【0126】
【化33】
【0127】
【化34】
【0128】
【化35】
【0129】
【化36】
【0130】
【化37】
【0131】
【化38】
【0132】
【化39】
【0133】
【化40】
【0134】
【化41】
【0135】
【化42】
【0136】
【化43】
【0137】
【化44】
【0138】
【化45】
【0139】
【化46】
【0140】
【化47】
【0141】
【化48】
【0142】
【化49】
【0143】
【化50】
【0144】
【化51】
【0145】
【化52】
【0146】
【化53】
【0147】
【化54】
【0148】
【化55】
【0149】
【化56】
【0150】
【化57】
【0151】
【化58】
【0152】
【化59】
【0153】
【化60】
【0154】
【化61】
【0155】
【化62】
【0156】
【化63】
【0157】
【化64】
【0158】
【化65】
【0159】
【化66】
【0160】
【化67】
【0161】
【化68】
【0162】
【化69】
【0163】
【化70】
【0164】
【化71】
【0165】
【化72】
【0166】
【化73】
【0167】
【化74】
【0168】
【化75】
【0169】
【化76】
【0170】
【化77】
【0171】
【化78】
【0172】
【化79】
【0173】
【化80】
【0174】
リガンド（ＩＩ）の合成は、例えば、液相合成においてカルボン酸成分とアミン成分とを組み合わせることにより、最終的にアミドＡｍを形成することにより行うことができる。該カップリングは、当業者にとって既知の活性化試薬を用いてカルボン酸成分を活性化し、続いて必要であれば反応混合物の通常の加熱またはマイクロ波照射により昇温させて、活性化されたカルボン酸をアミン成分と反応させることにより実施することができる。この反応中において、該アミノ基は、後で指示材料へのリガンドの付着を可能にする前駆体基として用いられるものであり、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルのような適切な保護基によって保護される必要がある。該２成分のカップリングが成功した後に、該保護基を適切な条件下にて除去する必要がある。個別の成分を構築するため、当業者にとって既知である追加の液相合成工程を適用してもよい。スペーサ基を含む脱保護された該リガンドは、これもまた当業者にとって既知であるクロマトグラフィー法により精製される。
【0175】
適切な液相合成プロトコルが、特定のリガンドに対して適用できない場合には、該合成は代わりに不溶性の支持体上において行い得る。該支持体は樹脂としても知られ、例えば、ポリスチレン樹脂であり、好ましくは、例えばヒドロキシ基のような、当業者にとって既知の反応により追加の分子が付着し得る反応基（官能基）を有する適切なスペーサがあらかじめロードされているポリスチレン樹脂である。最終的には、該スペーサ基を含む該リガンドは、当業者にとって既知の適切な開裂プロトコルにより前記不溶性の支持体／樹脂より解放され、当業者にとって既知であるクロマトグラフィー法により精製される。
【0176】
用語「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、天然のものと、全部または一部が合成により製造されたものとの両方を含み、さらに、特定の結合特性を維持しているそれらの全てのフラグメント及び誘導体を含む。典型的なフラグメントは、Ｆｃ、Ｆａｂ、重鎖、および軽鎖である。該用語はまた、アミノ酸配列を比較したときに、免疫グロブリン結合ドメインに対して相同または大部分において相同（例えば、少なくとも９５％同一）である結合ドメインを有している任意のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、天然源より得られてもよく、一部または全部が合成により製造されてもよい。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、ヒトまたは非ヒト起源であってもよく、キメラタンパク質であってもよい。該キメラタンパク質としては、ヒトＦｃ部分が、マウスＦａｂフラグメントと融合したもの（末尾に…ximab（…キシマブ）がつく治療用抗体、例えばリツキシマブ）、またはヒトマウス配列を含むＦａｂフラグメントと融合したもの（末尾に…zumab（…ズマブ）がつく治療用抗体、例えばベバシズマブ）、または異なるFａｂフラグメントに連結している（二重特異性抗体）ものが挙げられる。該抗体は、任意の免疫グロブリンクラスの構成要素であってもよく、好ましくはＩｇＧ、ヒト抗体の場合には、好ましくはＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4の構成要素であってもよい。
【0177】
本発明の最も好ましい実施形態において、本発明のリガンドが抗体のＦｃ部分に結合するとされる場合には、該抗体はＦｃフラグメントまたはドメインを含む。したがって、本発明の抗体は、免疫グロブリンクラスのＦｃフラグメントまたはドメインを含む抗体であって、好ましくはＩｇＧ、より好ましくはヒトＩｇＧ、またはヒト由来ポリクローナルあるいはモノクローナルＩｇＧ、特にＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4のものである。
【0178】
用語「Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃフラグメントと、１つ以上のタンパク質またはタンパク質ドメインとの任意の組み合わせを意味する。Ｆｃ融合タンパク質の例は、限定されないが、ヒトＩｇＧ1のＦｃドメインと可溶性受容体ドメインとのキメラ（末尾に…cept（…セプト）がつく治療用タンパク質）であって、例えば、エタネルセプト（ヒトＩｇＧ1と２つの腫瘍壊死因子受容体ドメインとの組み合わせ）またはリロナセプト（インターロイキン１受容体ドメインと融合したヒトＩｇＧ1）が挙げられる。Ｆｃ融合タンパク質は、任意の手段で製造されてもよい。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃフラグメントを適切なタンパク質またはタンパク質ドメインと結合させることにより、酵素的または化学的に製造してもよく、Ｆｃ及びタンパク質／タンパク質ドメイン配列をコードする遺伝子から、組み合え技術によって製造することもできる。あるいは、Ｆｃ融合タンパク質は、全部または一部が合成により製造することもできる。Ｆｃ融合タンパク質はまた、多分子複合体であってもよい。機能的なＦｃ融合タンパク質は、典型的には少なくとも約５０アミノ酸からなり、より典型的には少なくとも約２００アミノ酸からなる。
【0179】
本発明は、本明細書の他の箇所に記載される式（Ｉ）のアフィニティーリガンド及びそれらの好ましい実施形態を用いて、たとえば発酵上清またはヒトまたは動物由来の血漿といった複雑な混合物から、抗体またはＦｃ融合タンパク質を、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーによってアフィニティー精製することについても示す。
【0180】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、タンパク質、好ましくは免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質を、アフィニティー精製、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにより精製するための方法を含む。本発明のアフィニティーリガンドは、抗体のＦｃ領域に結合する。
【0181】
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Genentech／Roche）は、ヒト化モノクローナル抗体である。これは、新生血管形成（血管新生）を促進するタンパク質である血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）の機能を標的とし、かつ阻害することにより、新生血管の形成を防止することにより、腫瘍の増殖を停止する。
【0182】
トシリズマブ（アクテムラ（登録商標）、Genentech／Roche）は、ヒト化モノクローナル抗体である。これは、インターロイキン６受容体に対するものであって、炎症性サイトカインであるインターロイキン６の作用を妨害する。これは関節リウマチの治療のために認可されている。
【0183】
パリビズマブ（シナジス（登録商標）、Abbott）は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質のＡエピトープに対するヒト化モノクローナル抗体である。これは、ＲＳＶ感染の予防に使用される。
【0184】
セツキシマブ（アービタックス（登録商標）、Merck Serono）は、上皮成長因子受容体に対するキメラ型モノクローナル抗体である。これは、大腸癌及び頭及び首の扁平上皮癌の治療に必要である。
【0185】
ヒトポリクローナルＩｇＧは、Ｆｃ部分を介して免疫グロブリンをアフィニティー精製するための前記リガンドが、あらゆる状況で適用可能であることを実証するために調査される。
【0186】
本発明を実施する際には、一般式（Ｉ）に従うリガンドは、適切な支持材料の支持材料に付着し、それによってリガンド置換マトリクスとなり、通常はタンパク質分離のための、アフィニティー精製用、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー用のマトリクス（本発明の文脈において、アフィニティーマトリクスとも称される）となる。該一般式のリガンドは、Ｌ（任意にはスペーサ−Ｓｐ−を含む）を介して支持材料に付着している。
【0187】
したがって、本発明は、支持材料及びここまで本明細書に明記した少なくとも１つのリガンドを備え、該リガンドがＬを介してそれに付着している、タンパク質分離のためのリガンド置換マトリクス（アフィニティーマトリクス）を含む。
【0188】
該マトリクス（Ｍとして示される）は、当業者にとって既知である任意の適切な支持材料を含んでいてもよく、そのような支持材料より構成されていてもよい。該材料は、可溶性または不溶性でもよく、粒子状または非粒子状でもよく、繊維及び膜を含むモノリス構造でもよく、多孔性または非多孔性でもよい。それは、接触している溶液中の溶質から本発明のリガンドを分離する簡便な手段を提供する。支持材料の例には、アガロース、セファロース、セファデックス、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩及びカラギーナンのような炭水化物及び架橋炭水化物マトリクス；ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリアクリラート、ＰＥＧポリアクリラートコポリマー、ポリメタクリラート（例えばポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリビニルアルコール、ポリアミドまたはパーフルオロカーボンのような合成ポリマーマトリクス；ガラス、シリカまたは金属酸化物のような無機マトリクス；並びに複合材料が含まれる。
【0189】
該アフィニティーマトリクスは、適切な支持材料のマトリクスを提供し、それに式（Ｉ）（式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）、及び／または式（ＩＩ）を含む、及び／または式（ＩＩＩ）の構造要素を有する）のリガンドを付着させることによって調製される。該リガンド（Ｉ）を該支持材料に付着させるための方法は、当業者にとって既知である。
【0190】
したがって、本発明は、式（Ｉ）（式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）、及び／または式（ＩＩ）を含む、及び／または式（ＩＩＩ）の構造要素を有する）のリガンドを、リガンド置換マトリクスの調製／合成に使用することを含む。該リガンドにおいて、変数Ｌ、Ｓｐ、ＳｐＰ、Ａｍ、Ａｒ1Ａｒ2、Ｒ1及び／またはｖは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）（Ｉｃ）、（ＩＩ）、及び／または（ＩＩＩ）について定義された意味、及び／または本明細書において定義された意味を有し、特に好ましい実施例についての意味を有する。該リガンド置換マトリクスは、好ましくは式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）として定義され、より好ましくは式（ＩＩ）として定義される。
【0191】
本発明は、精製対象のタンパク質を前述のリガンド置換マトリクスと接触させるタンパク質のアフィニティー精製、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーの方法にも関する。
【0192】
用語「アフィニティー精製」（用語「アフィニティー分離」と区別なく使用される）は、式（Ｉ）のリガンドによるタンパク質の分子認識を含む任意の分離技術に関する。該リガンドは、後にリガンド−抗体複合体の分離を容易にする固体担体上に固定化されていてもよい。分離技術には、限定されないが、充填カラム、モノリス構造体または膜におけるアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。該用語にはさらに、バッチ方式での吸着またはアフィニティー沈殿が含まれる。
【0193】
特徴とは関係なく、精製技術は、リガンドが粗製抗体と接触する最初の認識段階によって構成される。第２段階では、不純物がリガンド−抗体複合体から分離されるか（例えば、カラムクロマトグラフィー）、リガンド−抗体複合体が不純物から分離される（例えば、アフィニティー沈殿）。第３段階で、該抗体は、、例えば、ｐＨ、イオン強度の変化及び／または有機溶媒、界面活性剤またはカオトロープのような改質剤の添加などの化学的及び／または物理的条件の変更により、リガンド−抗体複合体から遊離される。
【0194】
以下、本発明を下記の実施例により説明するが、これにより本発明が限定されると解釈してはならない。
【0195】
本明細書に引用された文献：1. A.Cecilia, A.Roque, C.R. Lowe, M.A. Taipa: Antibodies and Genetically Engineered Related Molecules: Production and Purification, Biotechnol. Prog. 2004, 20, 639-654
2. K.L.Carson: Flexibility-the guiding principle for antibody manufacturing, Nature Biotechnology, 2005, 23, 1054-1058; S.Hober, K.Nord, M. Linhult: Protein A chromatography for antibody purification, J. Chromatogr. B. 2007, 848, 40-47
3. T.Arakawa, Y.Kita, H.Sato, D. Ejima, Protein Expression and Purification. 2009, 63, 158-163
4. S. Ghose, B. Hubbard, S.M. Cramer, Journal of Chromatography A, 2006, 1122, 144-152
【実施例】
【0196】
材料及び方法特に指示のない限り、すべての化学成分及び溶媒は、実施例１を除いて、分析グレードとした。実施例１に使用した試薬は、粒子の必要条件及び入手しやすさに応じて、調製用から分析用のグレードとした。
平均孔径０．４５μｍの親水性メンブレンフィルタを有する９６及び３８４ウェルフィルタプレートは、Pall GmbH（ドライアイシュ／ドイツ）より購入した。平均孔径１０μｍのポリエチレン製の上部フリットは、Porex（バウツェン／ドイツ）より提供された。画分の収集及び分析アッセイ用の多目的マイクロタイタープレートは、Greiner Bio One GmbH（フリッケンハウゼン／ドイツ）に発注した。分析アッセイは、BMG Labtech GmbH（オッフェンブルク／ドイツ）製のFluostar Galaxyプレートリーダを使用して読み取った。
抗体によるカラムクロマトグラフィー及び抗体フラグメントの精製は、Waters社HPLCシステム（Waters GmbH、エシュボルン／ドイツ）で行った。カラムの充填のために、オムニフィット（Omnifit）カラムハウジング（Diba Industries Ltd、ケンブリッジ／英国）を使用した。ＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（NMS-activated Sepharose 4 FF）、組換えプロテインＡセファロースＦＦ（rProtein A Sepharose FF）及びSuperdex 70クロマトグラフィー媒体は、GE Healthcare（ウプサラ／スウェーデン）より購入した。Mabsorbent A2P HFはPrometic Life Sciences（ケンブリッジ／英国）より購入し、MEP HypercelはPall Corporation（ニューヨーク州ポートワシントン、米国）より購入した。
リガンドの分析クロマトグラフィーは、ダイオードアレイ検出器とシングル四重極型質量分析計とを含むShimazu HPLCシステム（Shimadzu Deutschland GmbH、デュースブルク／ドイツ）で行った。モノリス型Ｃ１８逆相カラムは、Merck KGaA（ダルムシュタット／ドイツ）より購入した。分析に使用した溶媒は、質量分析グレードとした。
本発明で使用した抗体は、ベバシズマブ（アバスチン、F. Hoffmann-La Roche、スイス）、トシリズマブ（ロアクテムラ、F. Hoffmann-La Roche、スイス）、パリビズマブ（シナジス、Abbott、米国）、セツキシマブ（アービタックス、Merck Serono GmbH、ドイツ）及びヒト血清由来ポリＩｇＧ（Sigma-Aldrich、米国）であった。
プロテインAクロマトグラフィーからの素通り画分（宿主細胞タンパク質に関する）は、無血清培地における抗体産生ＣＨＯ細胞培養物の上清に由来するものであった。
ブラッドフォードアッセイ用のクマシーブリリアントブルー染色試薬は、Thermo Scientific（ボン／ドイツ）より購入した。
【0197】
実施例１：リガンドの合成基本工程Ａ：マイクロ波照射下における芳香族カルボン酸と芳香族アミンとのカップリング、脱保護。Ｔｈｅ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）アルキルまたは（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）アルコキシ−アルコキシ−アルキル置換芳香族カルボン酸（０．１〜０．５ｍｍｏｌ，通常０．１ｍｍｏｌ及びＨＡＴＵ（カルボン酸に対して１当量）を、アセトニトリル（１〜５ｍＬ，通常１ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（カルボン酸に対して２当量）に溶解した。５〜１０分（通常１０分）撹拌した後に、該溶液をマイクロ波バイアル中の芳香族アミン（カルボン酸に対して１当量）に加えた。アルゴンで置換した後、該バイアルを封止し、該混合物をマイクロ波照射下にて１００〜１２０°Ｃ（通常１２０°Ｃ）に６０〜９０分間（通常９０分間）加熱した。少量のサンプルを取り出し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析にかけた。反応が完結したならば（すなわち、活性エステルがＨＰＬＣ−ＭＳで確認されなければ）、該混合物をワークアップした。活性エステル及び芳香族アミンの両方が検出された場合、加熱を最大１２時間続けた。未反応の活性エステルが検出されたが、残留芳香族アミンが検出されなかった場合には、微量のアセトニトリル（通常０．５ｍＬ）中の過剰量の芳香族アミン（カルボン酸に対して通常０．５当量）を加え、活性エステルが完全に消費されるまで加熱を続けた。
多くの場合において、該反応混合物を室温に冷却すると、生成物がほぼ定量的に沈殿する。これらの場合には、該固体を分離し、酢酸エチル（１〜２度，通常１度）またはメタノール（１度）で洗浄した後、ＴＢＭＥ（１度）で洗浄し、窒素流により慎重に乾燥させた。
生成物が沈殿しないか部分的にしか沈殿しない場合には、該溶媒を窒素流下にて除去しする。残渣をクエン酸水溶液（５％）で処理した後、酢酸エチルで複数回抽出する。有機層を組み合わせて水で洗浄し、蒸発乾固させる。
全ての場合において、該残渣をジクロロメタン（通常２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（通常１ｍＬ）で通常１時間処理することによりｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護基の脱保護を実施した後、該溶媒を蒸発させた。粗生成物を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳ（水中アセトニトリルによるグラジエント溶出）またはフラッシュカラムクロマトグラフィー（アミノ改質固定相、ジクロロメタン中メタノールによるグラジエント溶出）により精製した。
【0198】
【化81】
該残渣にパラジウム活性炭素（５％、水５０％により湿潤、Degussa社製タイプＥ１０１ ＮＯ／Ｗ、５０ｍｇ）及びメタノール（２０ｍＬ）をアルゴン下において加えた。トリエチルシラン（４ｍＬ）を１０分かけて滴加した。その後、該混合物をセライトに通過させて濾過し、濾液を蒸発乾固させ、残渣を高真空状態で乾燥させて、さらなる精製を行わずに使用した。この反応を何度も繰り返し成功させた。
【0199】
【化82】
【0200】
【化83】
【0201】
【化84】
【0202】
【化85】
【0203】
【化86】
【0204】
【化87】
【0205】
【化88】
【0206】
【化89】
【0207】
【化90】
【0208】
【化91】
【0209】
【化92】
【0210】
【化93】
【0211】
【化94】
【0212】
【化95】
【0213】
【化96】
【0214】
【化97】
【0215】
【化98】
【0216】
【化99】
【0217】
【化100】
【0218】
【化101】
【0219】
【化102】
【0220】
【化103】
【0221】
【化104】
【0222】
【化105】
【0223】
【化106】
【0224】
【化107】
【0225】
【化108】
【0226】
【化109】
【0227】
【化110】
【0228】
【化111】
【0229】
【化112】
【0230】
【化113】
【0231】
【化114】
【0232】
【化115】
【0233】
【化116】
【0234】
【化117】
【0235】
【化118】
【0236】
【化119】
【0237】
【化120】
該残渣にパラジウム活性炭素（５％、水５０％により湿潤、Degussa社製タイプＥ１０１ ＮＯ／Ｗ、５０ｍｇ）及びメタノール（２０ｍＬ）をアルゴン下において加えた。トリエチルシラン（４ｍＬ）を１０分かけて滴加した。２０分撹拌した後、追加のトリエチルシラン（１ｍＬ）を２分かけて滴加した後、１０分間撹拌を続けた。その後、該混合物をセライトに通過させて濾過し、濾液を蒸発乾固させ、残渣を高真空状態で乾燥させて、さらなる精製を行わずに使用した。この反応を何度も繰り返し成功させた。
【0238】
【化121】
【0239】
【化122】
【0240】
【化123】
【0241】
【化124】
【0242】
【化125】
【0243】
【化126】
【0244】
【化127】
【0245】
【化128】
【0246】
【化129】
【0247】
【化130】
【0248】
【化131】
【0249】
【化132】
該カルボン酸（０．１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解させた。１０分後に、該溶液を２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−チアゾール（０．１ｍｍｏｌ）に加え、該混合物をマイクロ波照射下にて１２０℃に９０分間加熱した。室温に冷却した後、沈殿を分離して、ＴＢＭＥで洗浄し、窒素流により慎重に乾燥させて、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）で処理した。該溶液をマイクロ波照射下にて１００℃に１時間加熱した。室温に冷却した後、溶媒を除去して、残渣を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製して、１−（８−アミノ−３，５−ジオキサ−１−オクチル）−２−オキソ−２，３−ジヒドロベンゾイミダゾール−５−カルボン酸Ｎ−［５−（２−フリル）−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］アミドを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：４５９（Ｍ＋１）
【0250】
【化133】
【0251】
【化134】
【0252】
【化135】
【0253】
【化136】
該固体をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）中に懸濁させ、マイクロ波チューブ内において、ビス（トリフェニルホスフィニル）パラジウム（ＩＩ）二塩化物（５μｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１５μｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（１５μｍｏｌ）を加えた。超音波を適用しながら該チューブをアルゴンで置換し、その後封止した。トリエチルアミン（０．５ｍＬ）及びエチニルトリイソプロピルシラン（０．５ｍｍｏｌ）を加えた後、該バイアルをアルゴンで再び置換し、マイクロ波照射下にて１００℃に３時間加熱した。その後、全ての揮発成分を窒素流により蒸発させた。残渣をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）、水（１０μＬ）及びフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム溶液（１Ｍ（ＴＨＦ中），０．５ｍＬ）により処理した。該混合物を１５分間撹拌し、溶媒を蒸発させ、残渣をＳｉＯ2ショートカラムに吸着及び該カラムから溶出（酢酸エチル／メタノール、約４：１により溶出）させて、主要な副生成物から分離した。溶媒を蒸発させた後、生成物を真空状態で乾燥させて、さらなる精製を行わずに使用した。
【0254】
【化137】
【0255】
【化138】
ニトロ基ｕｓｉｎｇパラジウム活性炭素及びトリエチルシランを用いたニトロ器の還元が成功しなかったため、残渣をピリジン（１ｍＬ）及び水（５０μＬ）中１００℃にて塩化スズ（ＩＩ）（１ｍｍｏｌ）で３０分間処理した。室温に冷却した後、固体を濾別し、メタノールで十分にリンスした。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチルに懸濁させた。該懸濁液を水で３度洗浄し、蒸発乾固させた。
６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサン酸（０．２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解させた。２分後に、該溶液を前述で得られた残渣に加え、室温で７５分間撹拌した後、生じた沈殿を分離し、酢酸エチルで２度洗浄して、窒素流により慎重に乾燥させた。トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を加えて、該混合物を一晩撹拌した。該混合物を蒸発乾固して、残渣を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：４１１（Ｍ＋１）
【0256】
【化139】
【0257】
【化140】
【0258】
【化141】
【0259】
【化142】
【0260】
【化143】
該樹脂をＮＭＰ中に膨潤させた。ＮＭＰ（１ｍＬ）、ＨＡＴＵ（０．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後、該混合物を１０分間撹拌し、続いて２−アミノ−４−（２−ピリジル）チアゾール（０．２ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ（１ｍＬ）中）を加えた。該バイアルをアルゴンで置換し、該混合物をマイクロ波照射下にて１２０℃に９０分間加熱した。次に、該樹脂を洗浄し（ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタン、各３度ずつ）、標的化合物をトリフルオロ酢酸、ジクロロメタン及びトリエチルシラン（４５：４５：１０）で２重に処理して該支持体より開裂させ、その後ジクロロメタンでリンスした。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：３５５（Ｍ＋１）
【0261】
【化144】
【0262】
【化145】
該樹脂をＮＭＰ中に膨潤させた。ＮＭＰ（１ｍＬ）、ＨＡＴＵ（０．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後、該混合物を１０分間撹拌し、続いて２−アミノ−５−（２−フリル）−１，３，４−チアゾール（０．２ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ（１ｍＬ）中）を加えた。該バイアルをアルゴンで置換し、該混合物をマイクロ波照射下にて１２０℃に９０分間加熱した。次に、該樹脂を洗浄し（ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタン、各３度ずつ）、標的化合物をトリフルオロ酢酸、ジクロロメタン及びトリエチルシラン（４５：４５：１０）で２重に処理して該支持体より開裂させ、その後ジクロロメタンでリンスした。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：３７５（Ｍ＋１）
【0263】
【化146】
２−フルオロ−５−ニトロ安息香酸（２００μｍｏｌ）及びＴＢＴＵ（２００μｍｏｌ）（ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中）を、ＤＩＰＥＡ（４００μｍｏｌ）で２分間処理した．その後、混合物をＮＭＰ膨潤樹脂に加え、該混合物を２５分間撹拌して、該樹脂を前述のようにして洗浄した。ＴＨＦ（２ｍＬ）、メタノール（１ｍＬ）及びＮａＯＨ水溶液（２Ｍ、１ｍＬ）を加えた後、該樹脂を３日間撹拌させ、その後メタノール及びジクロロメタンで十分に洗浄した。
該樹脂をピリジン（０．５ｍＬ）及び無水塩化スズ（ＩＩ）（１ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中）で処理して、室温で５．５時間振り混ぜ、続いて別分量の塩化スズ（ＩＩ）（０．５ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中）を加えた。該混合物を一晩振り混ぜた後、メタノールで洗浄した。不溶な反応副生成物を、メタノールを用いた慎重な浮上処理を繰り返して、樹脂より分離した。ジクロロメタンで洗浄した後、該樹脂をＮＭＰ中に膨潤させた。１−メチル−３−インダゾールカルボン酸（０．２ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（０．２ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中）を、ＤＩＰＥＡ（０．４ｍｍｏｌ）で処理し、２分後に該混合物を該樹脂に加えて、５時間撹拌した。該樹脂をＤＭＦ、メタノール及びジクロロメタンで（３度ずつ）洗浄した。標的化合物をトリフルオロ酢酸（４５％）及びトリエチルシラン（１０％）（ジクロロメタン中）で２重に処理して該支持体より開裂させ、その後該樹脂をジクロロメタンで十分に洗浄した。溶媒を蒸発させた後、粗生成物を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：３９４（Ｍ＋１）
【0264】
【化147】
インダゾール−３−カルボン酸（０．５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１．５ｍＬ）に溶解させ、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（０．５ｍｍｏｌ）で２分間処理して、該溶液を該樹脂に加え、該混合物を１時間振り混ぜた後、洗浄した（ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタン、各３度ずつ）．乾燥させた後、該樹脂をガラスバイアルに移し、１、３−ジブロモプロパン（１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１ｍｍｏｌ）（ＮＭＰ中）により６０℃で一晩処理した。該反応をもう一度１００℃で４．５ｈ繰り返し、続いて該樹脂を洗浄して（ＤＭＦ、メタノール、ジクロロメタン、各３度ずつ）、再びガラスバイアルに移した。テトラヒドロフラン（２ｍＬ）及び濃縮アンモニア水溶液（１ｍＬ）を加えた後、該バイアルを完全に密閉し、該混合物を５０℃に９０分間加熱した。追加のアンモニア水溶液（１ｍＬ）を加えた後、加熱を一晩続けた。該樹脂をＤＭＦ、メタノール及びジクロロメタンで（各３度ずつ）洗浄した後、生成物をジクロロメタン、トリフルオロ酢酸及びトリエチルシラン（８５：１０：５）で３重に処理して該樹脂より開裂させ、その後ジクロロメタンでリンスした。溶媒を蒸発させた後、残渣を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：３６８（Ｍ＋１）
【0265】
【化148】
該残渣を、ジオキサン（１ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（０．６ｍｍｏｌ）に溶解させ、炭酸ビス（トリクロロメチル）溶液（０．１ｍｍｏｌ）（ジオキサン（１ｍＬ）中）により室温で３０分間処理した。その後、３−アミノ−１−メチルインダゾール（０．３ｍｍｏｌ）（ジクロロメタン（１ｍＬ）中）を加えて、該混合物を３０分間撹拌し、続いて溶媒を蒸発させ、残渣を炭酸ナトリウム飽和水溶液（２ｍＬ）で処理して、酢酸エチルで２度抽出した。有機層を合わせてクエン酸水溶液（５％）及び炭酸ナトリウム飽和水溶液で２度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライトに通過させて濾過し、蒸発乾固させた。
該残渣を、ジクロロメタン（２ｍＬ）、トリエチルシラン（０．１ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）により室温で１５分間処理した。その後、溶媒を蒸発させて、残渣を分取逆相ＨＰＬＣ−ＭＳにより精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：３５０（Ｍ＋１）
【0266】
【化149】
【0267】
【化150】
【0268】
【化151】
【0269】
【化152】
【0270】
【化153】
【0271】
【化154】
【0272】
【化155】
【0273】
【化156】
【0274】
【化157】
【0275】
【化158】
【0276】
【化159】
【0277】
【化160】
【0278】
【化161】
【0279】
【化162】
【0280】
【化163】
【0281】
【化164】
【0282】
【化165】
【0283】
実施例１で用いられた略語ＤＩＰＥＡ＝Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン
ＴＢＭＥ＝ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸塩
ＨＰＬＣ−ＭＳ＝高速液体クロマトグラフィーと質量分析との連結
ＥＳＩ−ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
【0284】
実施例２：リガンドの固定化実施例１のリガンドを、続くクロマトグラフィー及びバッチ吸着実験のために、ＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦに固定化した。カップリングは、リガンド上のスペーサ前駆体体基のアミノ基と、あらかじめ活性化された樹脂のＮＨＳ活性化カルボン酸基との間にアミド結合を形成することにより達成された。
乾燥したリガンドを、約５０ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に再溶解した。カップリング反応では、１Ｍ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含有する、９０％ＤＭＳＯ及び１０％Ｎ−メチル−２−ピロリドン中に、約２０〜３０ｍＭの濃度に溶解したリガンドの１容量を、安定化されたＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（GE Healthcare）の１容量に加えた。激しく振り混ぜながら、反応を２５℃にて少なくとも３時間行った。反応物の上清を除去し、樹脂を適切な溶媒で２度洗浄した。該樹脂上に残存した活性基を、１Ｍエタノールアミンにより２５℃にて１〜２時間ブロックした。最後に樹脂を洗浄し、以後の実験に使用するまで３０％エタノール中で４℃にて保存した。
【0285】
実施例３：（実施例１による）リガンドのクロマトグラフィーによる評価実験
マイクロタイタープレートクロマトグラフィーにより、樹脂を充填された状態で評価した。各カラム用に約３０μＬの樹脂を３８４ウェルフィルタプレートに移し、適切なトップフリットで封止した。組換えプロテインＡセファロースＦＦ及びMabsorbent A2P HFによるカラムを対照として含めた。
サンプル導入前に、６．７カラム容積（ｃｖ）のリン酸緩衝食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３；ＰＢＳ）でカラムを平衡化した。ＰＢＳ中に溶解した０．５ｍｇ／ｍｌ-1全ＩｇＧ３．３ｃｖまたは無希釈の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）をカラム上に導入した。
結合していないタンパク質を、ＰＢＳ５ｃｖでカラムから洗い流した後、ｐＨ２．５のグリシンバッファー５ｃｖで溶出した。移動容積を、カラムに通して５０ｇで１−２分間スピンさせた。サンプル導入の間、速度を１０ｇに減らし、遠心時間を５−１０分に増やした。溶出画分を３８４ウェルプレートに収集し、タンパク質の濃度をBradfordアッセイにより分析した。タンパク質の質量ｍi、ｍft、及びｍe（下記参照）は、画分容積と測定されたタンパク質濃度との積として算出された。
【0286】
概要及び結果いくつかの抗体の結合及び溶出を示した。それらの中には、３つのヒト化治療用抗体ベバシズマブ、トシリズマブ及びパリビズマブ、キメラ型抗体セツキシマブ、並びにヒト血清から分離されたヒトpoly-IgG（h-poly-IgG）混合物があった。リガンドの抗体に対する選択性は、宿主細胞タンパク質の結合態様を調査することにより決定した。比較のために、市販の樹脂である組換えプロテインＡセファロースＦＦ（rProtein A）及びMabsorbent A2P（Ａ２Ｐ）についての結果を含めた。
結合したタンパク質の割合は、導入されたタンパク質の全質量miと、素通り画分において検出されたタンパク質の質量ｍftとの差を、導入されたタンパク質の全質量で割ったものとして算出した。
【数1】
【数2】
【数3】
実施例２より得られた樹脂及び参照樹脂についてのクロマトグラフィー結果は、以下の表に与えられる。Ｌ５５〜７３に示される値は、Ｌ０１〜Ｌ５４より得られた知見に基づく推定値である。
【0287】
【表1】
【表2】
【表3】
【0288】
対照は、全ての抗体と１００％近くまで結合した。プロテインＡは宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）と全く結合しなかったが、Ａ２Ｐはそれらに対して高い結合性能を示した。得られた選択性指数は、プロテインＡについては１０．０、Ａ２Ｐについては１．０であった。実施例２の樹脂は、それらの抗体結合性能及び選択性によって、３つのグループに分類することができる。第１グループのリガンドは、抗体結合率が少なくとも９０％であり、選択性指数が少なくとも７であることを特徴とする（例えば、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ３９、Ｌ５３及びＬ５４）。第２グループのリガンドは、試験された抗体の少なくとも１つに対する減少した抗体結合率（８０〜８９％）及び／または４〜６．９の選択性を示した（例えば、Ｌ５、Ｌ３０、Ｌ３１及びＬ５２）。第３グループのリガンドは、試験された抗体の少なくとも１つに対して８０％未満が結合し、及び／または４未満の選択性指数を有していた（例えば、Ｌ１、Ｌ１８、Ｌ３２及びＬ５０）。
【0289】
実施例４：結合の等温式及び時間尺度実験
抗体としてベバシズマブを用いて実験を行った。精製抗体についてのラングミュア等温式のパラメータは、９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるバッチ吸着実験により決定した。各ウェル内で、吸着剤スラリー（５０％ｖ／ｖ）１０μｌをタンパク質溶液１００μｌと混合した。初期濃度は、リン酸緩衝生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３；ＰＢＳ）中において、０．０５から５ｍｇ／ｍＬまで変化させた。反応物を２５℃にて少なくとも３時間の間において激しく撹拌した。その後、Bradfordアッセイにより上清中の抗体濃度を測定した。該値をラングミュア等温式に直接当てはめることにより、データを評価した（１）。
取り込み速度は、９６ウェルフィルタプレートにおけるバッチ吸着により同様に調べた。改めて、吸着剤スラリー（５０％ｖ／ｖ）１０μｌをタンパク質溶液１００μｌと混合した。しかしながら、固定初期濃度としてＰＢＳ中０．７５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブを用いた。反応物を２５℃にて最大８０分までの間において激しく撹拌した。２．５、５、１０、２０、４０及び８０分後に、フィルターを通してスピンさせることにより上清を速やかに分離し、分析用にサンプリングした。該抗体の濃度は、Bradfordアッセイにより分析した。
【0290】
概要及び結果実施例１の固定化されたリガンドのサブセットは、ベバシズマブに対するそれらの親和性及び最大容量の点より特徴付けられた。さらに、いくつかのリガンドについて、結合に必要な時間尺度を決定した。比較のために、市販の樹脂である組換えプロテインＡセファロースＦＦ（rProtein A）及びMabsorbent A2P（Ａ２Ｐ）についての結果を含めた。
ラングミュア等温式のパラメータ、すなわち解離定数Ｋd及び最大容量ｑmを、上清中において測定された濃度より決定した。パラメータは、Chase（１）によって導き出されたモデル等式に数値を当てはめることにより推定した。
取り込み速度は、樹脂の抗体との８０％の平衡飽和が起こった時間として定義される、結合の時間尺度ｔ0.8によって特徴付けられた。ｔ0.8を決定するため、上清中において測定された濃度に、二重指数関数を当てはめることにより補間し、ｔ0.8の値をグラフより読み取った（２）。実施例２の樹脂及び参照樹脂についてのラングミュア等温式のパラメータ及び結合の時間尺度を、以下の表において報告する。
【0291】
【表4】
【0292】
最も高いアフィニティーは組換えプロテインＡにおいて観測され、Ｋdは０．００５ｍｇ／ｍｌであった。Ａ２Ｐ、樹脂Ｌ０１、Ｌ０５、Ｌ０７、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ２３、Ｌ２５、Ｌ３１、Ｌ３９、Ｌ４０、Ｌ４１、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｌ５１及びＬ５４の解離定数は一桁小さく、０．０３８ｍｇ／ｍｌ〜０．０９８ｍｇ／ｍｌの範囲であった。残りの樹脂の解離定数は二桁小さく、０．１０５ｍｇ／ｍ〜０．２８２ｍｇ／ｍｌの範囲であった。最大容量に関しては、最も高い容量はＡ２Ｐにおいて測定された（樹脂１ｍｌに対し６８ｍｇ）。組換えプロテインＡの最大容量は、樹脂１ｍｌに対し４１ｍｇであった。実施例２の樹脂の最大容量は、樹脂１ｍｌに対し３４〜５３ｍｇと様々であった。結合の時間尺度は、組換えプロテインＡでは８．９分、Ａ２Ｐでは９．２分、実施例２の樹脂では５．３〜１１．８分であった。
【0293】
実施例５：動的結合容量実験
精製ベバシズマブを用いたカラムクロマトグラフィーにより、動的結合容量を決定した。長さ２５ｍｍ及び内径３ｍｍの分析カラム内に樹脂を充填した。リン酸緩衝生理食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．３）中１ｍｇ／ｍｌの抗体を、流速５０ｃｍ／時間（カラム滞留時間３分）にてカラムに供給し、その間、溶出液を２８０ｎｍの吸収により常時観測した。供給物の全量が漏出するまで抗体をロードした。動的結合容量は、その１０％が漏出した際に決定した。平衡容量は、破過曲線上部の範囲を積分することにより決定した。結合した抗体は、ｐＨ３．０のグリシンで溶出することによりカラムから脱離させた。
【0294】
概要及び結果Ｌ０５（実施例２より）及び組換えプロテインＡセファロースＦＦ（rProtein A）について、ベバシズマブの動的（結合）容量を、流速の関数として決定した。それは、１０％の漏出が生じた後の時間ｔ0.1に、流速Ｆと供給濃度ｃfとを乗じて算出した。
【数4】
【数5】
流速の関数としてのＬ０５及び組換えプロテインＡセファロースＦＦについての動的結合容量、及び供給濃度１ｍｇ／ｍｌのベバシズマブについての平衡結合容量を、以下の表に示す。
組換えプロテインＡについて、動的結合容量は樹脂１ｍｌに対して２８ｍｇと決定された。Ｌ５の動的結合容量は、樹脂１ｍｌに対して２５ｍｇであった。算出された平衡容量は、組換えプロテインＡについては樹脂１ｍｌに対して４０ｍｇであり、Ｌ０５については樹脂１ｍｌに対して３９ｍｇであった。
【0295】
【表5】
【0296】
実施例６：アルカリ安定性実施例１のリガンドのサブセットを、そのアルカリ安定性について試験した。リガンドを０．５Ｍ水酸化ナトリウムにより２５℃で８日間処理した。加水分解をＬＣ−ＭＳ分析により観測した。
【0297】
【表6】
【0298】
実施例７：細胞培養上清からの抗体の精製実験
細胞培養上清からの抗体の精製についての樹脂の適合性を、カラムクロマトグラフィーにより評価した。宿主細胞タンパク質に０．１２ｍｇ／ｍＬの濃度で添加したベバシズマブを供給材料として使用した。それに加えて、宿主細胞タンパク質及び純粋な抗体のみを用いたクロマトグラフィーを実行した。実行毎に２５カラム容積の試料を注入した。注入の前後において、カラムをＰＢＳで平衡化及び洗浄した。結合したタンパク質を、ｐＨ３．０の５０ｍＭグリシンで溶出した。３度の単一実行における溶出ピークの範囲を積分及び比較することにより、純度を決定した。収率は、平行して操作されたプロテインＡカラムから溶出された抗体の量を１００％とみなし、相対的な回収率として表した。
【0299】
概要及び結果実施例２の樹脂のサブセットにおけるクロマトグラフィーにより、細胞培養上清から抗体を精製した。比較のために、市販の樹脂である組換えプロテインＡセファロースＦＦ（rProtein A）におけるクロマトグラフィーを含めた。各樹脂において、抗体、宿主細胞タンパク質または後述の混合物のいずれかを注入し、３つのクロマトグラフィー分析を同一条件下で行った。
【0300】
クロマトグラフィー後における操作の「収率」は、純粋な抗体を用いた実行より算出した。それは、プロテインＡにおける実行ＡE,プロテインAからの溶出ピークの範囲に対する、リガンドを用いた実行ＡE,リガンドからの溶出ピークの範囲として表した。【数6】
【0301】
混合物のクロマトグラフィー後における抗体の「純度」は、添加抗体を用いた実行AE,混合物からの溶出ピークの範囲を、純粋な抗体を用いた実行、またはＨＣＰを用いた実行ＡE,Abにより補正された添加抗体を用いた実行ＡE,混合物のいずれかと比較することにより算出した。【数7】
【0302】
実施例２のいくつかの樹脂及び参照樹脂におけるクロマトグラフィー後に得られた純度及び収率を、以下の表に示す。実験精度の範囲内において、収率は、試験した全ての樹脂において１００％であった。純度は、組換えプロテインＡでのクロマトグラフィー後において最も高く、続いて、樹脂Ｌ２５（９３％）並びに樹脂Ｌ２４及びＬ３９（共に９１％）でのクロマトグラフィー後において高かった。残りの樹脂でのクロマトグラフィー後の純度は、８０％〜８９％の範囲内であった。
【0303】
【表7】
【0304】
本実施例に引用された文献：1. Chase HA. Prediction of the performance of preparative affinity chromatography. J Chromatogr 1984; 297:179-202.
2. Coffman JL, Kramarczyk JF, Kelley BD. High-throughput screening of chromatographic separations: I. Method development and column modeling. Biotechnology and Bioengineering 2008; 100(4):605-618.