特許 6196220 生体試料分析のための核磁気共鳴および近赤外線の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6196220

(24)【登録日】2017年8月25日

(45)【発行日】2017年9月13日

(54)【発明の名称】生体試料分析のための核磁気共鳴および近赤外線の使用

(51)【国際特許分類】

   G01R 33/32 20060101AFI20170904BHJP

   G01R 33/465 20060101ALI20170904BHJP

   G01N 21/359 20140101ALI20170904BHJP

【ＦＩ】

   G01N24/02 530Z

   G01N24/08 510Q

   G01N21/359

【請求項の数】18

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2014-528671(P2014-528671)

(86)(22)【出願日】2012年8月31日

(65)【公表番号】特表2014-525587(P2014-525587A)

(43)【公表日】2014年9月29日

(86)【国際出願番号】US2012053528

(87)【国際公開番号】WO2013033638

(87)【国際公開日】20130307

【審査請求日】2015年8月28日

(31)【優先権主張番号】61/581,778

(32)【優先日】2011年12月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/530,163

(32)【優先日】2011年9月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398050098

【氏名又は名称】バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(72)【発明者】

【氏名】ラナン，モーリーン

(72)【発明者】

【氏名】アリ，アムル

【審査官】 立澤 正樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５０４８２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６４２０８６９（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 J.C. Rodrigues et al.，"Calibration of near infrared spectroscopy for solid fat content of fat blends analysis using nuclear magnetic resonance data"，Analytica Chimica Acta，２００５年 ７月１５日，Vol. 544, No. 1-2，pp. 213-218

【文献】 RUTLEDGE D. N.，MAGNETIC RESONANCE IN FOOD SCIENCE: A VIEW TO THE FUTURE，THE ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY，２００１年，P179-192

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｒ ３３／３２

Ｇ０１Ｎ ２１／３５９

Ｇ０１Ｒ ３３／４６５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料を評価するために、近赤外線分光法（ＮＩＲ）スペクトルの周波数範囲の１又は複数の有用なサブセットを特定する方法であって、
生体試料の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を実行してＮＭＲスペクトルを得ることと、
前記生体試料のＮＩＲ分析を実行してＮＩＲスペクトルを得ることと、
前記ＮＩＲスペクトルと前記ＮＭＲスペクトルのデータ融合分析を実行して、前記ＮＩＲスペクトルのＮＩＲ周波数範囲の１又は複数の有用なサブセットを得ることと、
を含む、方法。

【請求項2】

生体試料を評価する方法であって、
生体試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を実行して、前記生体試料の評価に有用なＮＩＲ波長のサブセットのＮＩＲスペクトルを得ることを含み、
前記サブセットは参照ＮＭＲスペクトルと参照ＮＩＲスペクトルのデータ融合分析で特定された、
方法。

【請求項3】

生体試料を分析する方法であって、
生体試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を実行して、ＮＩＲスペクトルを得ることと、
前記ＮＩＲスペクトルのＮＩＲ周波数範囲の１又は複数の有用なサブセットを分析して、前記生体試料を評価することと、
を含み、
前記ＮＩＲ周波数範囲の１又は複数の有用なサブセットが、参照ＮＭＲスペクトルと参照ＮＩＲスペクトルのデータ融合分析を実行して特定された、
方法。

【請求項4】

前記データ融合分析が外積分析（ＯＰＡ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＯＰＡがＮＭＲスペクトルをＮＩＲスペクトルで乗じることを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ＯＰＡが回帰ベクトルと射影変数の重要度（ＶＩＰ）ベクトルを乗じることを含む、請求項４または請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記データ融合分析が部分最小二乗（ＰＬＳ）分析を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＰＬＳ分析が、ＮＩＲとＮＭＲデータのｘブロックと生体試料の１つまたは複数の成分のｙブロックを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

結果が結合ベクトルを用いて表示される、請求項７または請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記データ融合分析がコンピューターで実行されるステップである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

第２の生体試料の第２のＮＩＲ実験を実行して、第２のＮＩＲスペクトルを得ることと、
前記第２のＮＩＲスペクトルのＮＩＲ周波数範囲の１又は複数の有用なサブセットを分析して、前記第２の生体試料を評価することと、
をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記生体試料が、生物学的増殖および発現システムの試料である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記生体試料が、生物学的増殖および発現システムの出発原料である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記生体試料が、３以上の異なる栄養成分を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記生体試料が、２以上のアミノ酸、ペプチド、糖、炭水化物、ビタミン、増殖因子、塩、合成材料、抗生物質、表面活性物質、及びバッファーからなる群から選択される少なくとも一つ又は任意の組み合わせを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記生体試料が表面活性物質を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記生体試料が、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルコース、及び／又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記生体試料が、生物製剤の細胞培養培地の栄養剤の混合物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項により、２０１１年９月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５３０，１６３号および２０１１年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５８１，７７８号の利益を主張し、それらの全容を参照としてここに組み込む。

【0002】

（技術分野）
本発明の分野は生体試料の分光分析である。

【背景技術】

【0003】

生物学的生産工程における生体物質の生産は、高価な出発原料と複雑で時間のかかる合成および精製ステップをしばしば伴う。生産工程は、低品質の材料および／または１つまたは複数のステップにおける低収量により、どの段階でも失敗し得る。しかし、最終収量を評価する生産工程の後半になって初めて失敗が検出されることも多い。このことは時間と材料の高額な浪費につながり得る。

【発明の概要】

【0004】

１つの態様では、本開示は、生体分子の生産工程を評価するために出発原料および／または中間体の合成／成長および精製ステップの分析を改善するための近赤外線（ＮＩＲ）および^１Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）の使用に関する。

【0005】

いくつかの実施形態では、本開示は、データ融合分析を含む、生体試料を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、データ融合分析は、ＮＭＲスペクトルで得たデータを同じ試料のＮＩＲスペクトルを分析するのに使用する。

【0006】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行ってＮＭＲスペクトルを得ること、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、およびデータ融合分析を行ってＮＩＲスペクトルを評価することを含む。

【0007】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、および参照ＮＭＲスペクトルとＮＩＲスペクトルのデータ融合分析を行うことを含む。

【0008】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、およびＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析で特定されたＮＩＲスペクトルの一部分を分析することを含む。

【0009】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行って、ＮＩＲ波長のサブセットのＮＩＲスペクトルを得ることを含み、該サブセットはＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析で特定されたものである。

【0010】

本明細書に提供する方法のいくつかの実施形態では、データ融合分析は、外積分析（ＯＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＡは、ＮＭＲスペクトルをＮＩＲスペクトルで乗じることを含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＡは、回帰ベクトルと射影変数の重要度（ＶＩＰ）ベクトルを乗じることを含む。

【0011】

本明細書に提供する方法のいくつかの実施形態では、データ融合分析は、部分最小二乗（ＰＬＳ）分析を含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＳ分析は、ＮＩＲとＮＭＲデータのｘブロックと生体試料の１つまたは複数の成分のｙブロックを含む。いくつかの実施形態では、結果は結合ベクトルを用いて表示される。本明細書に提供する方法のいくつかの実施形態では、データ融合分析は、コンピューターで実行されるステップである。

【0012】

いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペクトル（例えば、ＮＩＲおよび／またはＮＭＲスペクトル）を前処理する（例えば、データ融合分析用に）。いくつかの実施形態では、データを標準化する（例えば、１に標準化する）。いくつかの実施形態では、データを尺度化する（例えば、強度が０から１の範囲となるように尺度化する）。

【0013】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、生体試料の成分のＮＭＲ実験を行いＮＭＲスペクトルを得ること、生体試料の成分のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、ＮＩＲスペクトルとＮＭＲスペクトルのデータ融合分析を行い割当ＮＩＲスペクトルを生成すること、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、および生体試料のＮＩＲスペクトルを割当ＮＩＲスペクトルと比較することにより、生体試料における生体試料成分の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態では、データ融合分析は、コンピューターで実行されるステップである。いくつかの実施形態では、決定ステップは、コンピューターで実行されるステップである。

【0014】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、所望の試料の第１のＮＩＲ実験を行い所望の試料と相関するＮＩＲスペクトルを得ること、非所望の試料の第２のＮＩＲ実験を行い非所望の試料と相関するＮＩＲスペクトルを得ること、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、および生体試料のＮＩＲスペクトルが所望の試料のＮＩＲスペクトルまたは非所望の試料ＮＩＲスペクトルと相関するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定ステップは、コンピューターで実行されるステップである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、１つまたは複数のＮＩＲスペクトルと同じ試料のＮＭＲスペクトルのデータ融合分析を行うことを含む。いくつかの実施形態では、データ融合分析は、コンピューターで実行されるステップである。

【0015】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ることと、該ＮＩＲスペクトルをＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析を経た参照ＮＩＲスペクトルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、比較ステップは、コンピューターで実行されるステップである。

【0016】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、生体試料中の１つまたは複数の成分のＮＩＲ実験を行い該生体試料の１つまたは複数の成分のＮＩＲスペクトルを得ること、データ融合分析を行い予測ＮＩＲスペクトルを生成すること、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、および予測ＮＩＲスペクトルに基づき生体試料のＮＩＲスペクトルを分析することを含む。

【0017】

（図面の簡単な説明）
図は単なる例示であって、本明細書に開示の本発明の実現の要件ではない。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】総面積に標準化後のＧＬＮ、グルコースおよびＰＨＥのＮＭＲスペクトルを示す。

【図1B】前処理後（Ｂ）のＧＬＮ、グルコースおよびＰＨＥのＮＭＲスペクトルを示す。

【図2】総面積に標準化後（Ａ）と前処理後（Ｂ）のＧＬＮ、グルコースおよびＰＨＥ溶液のＮＩＲスペクトルを示す。

【図3】ＮＩＲとＮＭＲスペクトルの定性的解釈の（Ａ）結合、（Ｂ）回帰、および（Ｃ）ＶＩＰベクトルの比較を示す。

【図4】ＰＨＥレベルをＹブロックとするＯＰＡ ＰＬＳの結果を示す。

【図5】ＧＬＮレベルをＹブロックとするＯＰＡ ＰＬＳの結果を示す。

【図6】グルコースレベルをＹブロックとするＯＰＡ ＰＬＳの結果を示す。

【図7】同じ試料のＮＭＲを用いての逐次ＰＬＳモデル由来の予測ＮＩＲスペクトルを示す。

【図8】１２ＤＭＥＭベンダーロット試料の３回測定（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）前処理済（Ａ）ＮＩＲスペクトルおよび（Ｂ）ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示す。

【図9】ＤＭＥＭベンダーロットのスペクトルのＮＩＲ結合バンド領域と脂肪族ＮＭＲ領域の外積分析を示す。

【図10】外積の流れ図を示す。

【図11】逐次ＰＬＳと標準ＰＬＳの差を例示する流れ図を示す。

【図12】外積前処理コードを示す。

【図13】外積分析計算を示す。

【図14】回帰ベクトルとＶＩＰ結合を示す。

【図15】逐次ＰＬＳのアルゴリズムを示す。

【図16】水とグルコースを用いての概念実証実験の概要を提供する。

【図17】グルコース／水試料のＮＭＲを示す。

【図18】液体のＮＩＲスペクトルおよびグルコースと水の主成分分析（ＰＣＡ）を示す。

【図19】ＮＭＲとＮＩＲスペクトル分析を組み合わせる戦略の概略を提供する。

【図20】逐次部分最小二乗（ＳＰＬＳ）分析の概略を提供する。

【図21】グルコースと水の逐次部分最小二乗分析の概略を提供する。

【図22】ＤＭＥＭ成分の要因組み合わせ（ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｍｉｘ）を用いての概念実証実験の概略を提供する。

【図23】部分最小二乗分析を用いてのＤＭＥＭ成分の要因調合物のＶＩＰ画像を提供する。

【図24】ＤＭＥＭ成分の調合物の逐次部分最小二乗変数重要度プロットのＮＩＲプロファイルを提供する。

【図25】外積分析の概略を提供する。

【図26】ＤＭＥＭ成分の調合物の外積ＶＩＰ画像を提供する。

【図27】ＤＭＥＭ成分調合物のＮＩＲプロファイルを提供する。

【図28】逐次ＰＬＳを用いての結合ベクトルの結果を示す。

【図29】Ｇｌｎ濃度をＹブロックとする、ＰＬＳの外積結果を示す。

【図30】グルコース濃度をＹブロックとする、ＰＬＳの外積結果を示す。

【図31】Ｐｈｅ濃度をＹブロックとする、ＰＬＳの外積結果を示す。

【図32】ＯＰＡ結果のＮＩＲプロファイルを示す。

【図33】総面積に標準化後のｇｌｎ、グルコースおよびｐｈｅのＮＭＲスペクトルを示し（図３３Ａ）、図３３Ｂは前処理後のＮＭＲスペクトルを示す。水と関連のあるＮＭＲスペクトルの領域は排除している。ＮＩＲスペクトルの結合バンド領域のみを含める。

【図34】総面積に標準化後のｇｌｎ、グルコースおよびｐｈｅ溶液の結合バンドＮＩＲスペクトルを示し（図３４Ａ）、図３４Ｂは前処理後のＮＩＲスペクトルを示す。前処理済ＮＩＲスペクトルはＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターを用いて１５ポイントで平滑化した。

【図35】逐次ＰＬＳを用いての結合ベクトルの結果を示す。

【図36】プルロニックＦ６８の分子構造を示す。

【図37】プルロニックＦ６８のＮＭＲスペクトルを示す。

【図38】前処理済プルロニックＦ６８のＮＭＲスペクトルを示す。

【図39】プルロニックＦ６８のＮＩＲスペクトルを示す。

【図40】前処理済プルロニックＦ６８のＮＩＲスペクトルを示す。

【図41】プルロニックＦ６８逐次ＰＬＳ回帰とＶＩＰ結合プロットを示す。

【図42】プルロニックＦ６８外積分析回帰とＶＩＰ３Ｄ結合プロットを示す。

【図43】波長選択なしでＮＩＲを用いる、新しいプルロニックＦ６８ロット性能予測を伴うＮＩＲオンリーモデルの検証を示す。

【図44】波長選択ありのＮＩＲオンリーモデルを用いる、新しいプルロニックＦ６８ロット性能予測を用いるＮＩＲオンリーモデルの検証を示す。

【図45】標準化または尺度化なしの前処理済ＮＩＲスペクトルを示す。

【図46】標準化または尺度化なしの前処理済ＮＭＲスペクトルを示す。

【図47】ベネチアンブラインドを用いた交差確認プレスプロットを示す。

【図48】標準化および尺度化なしの展開外積マトリックスを詳述するＰＬＳモデルを示す。

【図49】標準化および尺度化ありの前処理済ＮＩＲスペクトルを示す。

【図50】標準化および尺度化ありの前処理済ＮＭＲスペクトルを示す。

【図51】ベネチアンブラインド交差確認ＰＲＥＳＳプロットを示す。

【図52】標準化および尺度化したＮＩＲとＮＭＲスペクトルを用いる外積ＰＬＳのＰＬＳモデル詳細を示す。

【図53】本明細書に開示のある特定の方法で使用するコンピューターの１つの実施形態を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

１つの態様では、本開示は、生物学的生産工程の１つまたは複数のステップにおいて物質を評価する分析手法に関する。

【0020】

近赤外線（ＮＩＲ）分光法は、医薬業界では原材料を特定するために^{11, 12}、また生物製剤^13-21の製造において上流ステップのモニタリングをするために広く使用されている。化学および医薬業界ではＮＩＲを工程制御にも多く適用している^{20, 22, 23}。ＮＩＲは明確で堅牢な分光手法として受け入れられているが、生物由来製剤の製造と研究においてより広域で採用されるためには依然として障害がある。化学者または化学エンジニアの視点では、主たる制限は、化学的直観によりスペクトルを解釈することの困難にある。ある工程が所望通りに実施されていないことを知るだけでは多くの場合不十分であり、その理由が特定されねばならない。

【0021】

１つの態様では、本開示は、ＮＩＲの直観的欠点に対処するように、プロトンＮＭＲを使用してＮＩＲスペクトルを解釈する手法を提供する。いくつかの実施形態では、因子分析の後に外部変数を用いてＮＩＲとＮＭＲを組み合わせるか、またはＮＩＲ対ＮＭＲとして、ＮＩＲの波長を選択しＮＩＲオンリーモデル原材料モデルに含める手法を実施する。

【0022】

細胞培養系の生産は、培地と供給原料の主要な栄養素のレベルと質に敏感であり得る。最近の刊行物には、バイオ医薬製品のばらつきの有意な原因となる複雑な栄養混合物中の主要成分を正確に示す高分解能ＮＭＲとＬＣ−ＭＳの使用が記載されている^{24, 25}。類似の手法はビールの品質分析でも報告されている^{26, 27}。混合物中のどの化合物が主として生産に影響を与えているかについて詳細な情報を持っているにもかかわらず、この知識を日常的に使用できる堅牢な分析試験法に変換することは尚も困難である。具体的には、現行の規制ガイド文書の解釈を満足させるには、原材料の出荷物は、使用できるようになる前にそれぞれ確認されなくてはならない。細胞培養工程では、各製造運転につきそれぞれ試験を必要とする数百もの異なる化学物質、クロマトグラフィー樹脂および製品に接触する物品が存在し得る。試験量（volume）を管理するためには単純な機器操作と最小限の試料取扱いが必要とされる。分析方法は、生産環境における厳しい締切に合うように強力である必要もある。高分解能ＮＭＲなどの手法は、定期的なメンテナンスを必要とするので、ルーチン運転をサポートするには繊細すぎる。

【0023】

１つの態様では、本開示は、原材料に関する工程知識を効果的な操作法に変換する方法を提供する。いくつかの実施形態では、粉末原材料と溶液のＮＭＲおよびＮＩＲスペクトルにおける類似の情報内容を使用して、強力で有意味なＮＩＲオンリー試験法を得るのに必要とされる波長を予測する。原材料の品質について偽陰性率を低下させるとともに警戒を増大させる必要性により、原材料のＮＩＲオンリー原材料スクリーニング法を支持する新しい戦略が求められている。

【0024】

既知組成の生物製剤の細胞培養栄養粉末は典型的には１０から４０の物質からなる。製造に影響を及ぼし得る欠陥のある原材料バッチを見つければ、生産チェーンにおいて早期に情報が提供され、調節が可能かもしれない。第１に、供給業者と一緒に既知の問題の発生率を低下させることが可能であり得る。第２に、設計スペースの調節が可能であり得、それによって既知の原材料の問題が補正されよう。最後に、特定ロットの原材料が回避され得る。これらの対応は、最終結果としてより良い製品の品質および制御が得られるので、それぞれ価値を付加するものである。さらに、当該技術は、天候変化から生じるサプライチェーンの破損により適切に対応する、より柔軟な製造工程を創ることとの重要な結びつきをもたらす。

【0025】

原材料制御の問題は既知組成の原材料により容易になったものの、現行のＧＭＰ ＣＦＲ規定に基づき、新たに受領した原材料ロットに対しそれぞれＩＤ試験を行う必要がしばしばある。しかし、法律上の狭小な確認試験基準に加えて、原材料のばらつきが生産品質と工程の一貫性に及ぼす影響を予測する能力のある試験法も求められている。確認試験の要件を満たし、新しく入ってくる他の点では適格な原材料ロットを直接的または間接的に測定することができる方法を開発することにより、不適格な原材料を検出する確率とともに製品品質を確保する能力も向上する。

【0026】

いくつかの実施形態では、ＩＤ試験はＧＯ／ＮＯ ＧＯ試験を指す。ＩＤ試験をより情報を提供できるものにする課題は、材料の良し悪しを判断する重要な属性（複数可）を見出すことである。そのような基準および／またはスペクトルのどの部分が材料の重要な性質を反映するかを見出すために、相関法を実施して、原材料の重要な性質／化合物およびスペクトルのどの部分がその傾向を反映する兆候を示すかを特定できる。外積分析または逐次ＰＬＳの場合、どちらもスペクトルの重要な部分の特定（波長選択）に使用される。この知識を用いて分析法を実行し、予測性能に基づきＧＯ／ＮＯ ＧＯ決定を得るのを補助することができる。いくつかの実施形態では、この情報は、ベストプラクティス準拠に必要なＩＤ試験基準も支持し得る。

【0027】

近赤外線分析
ＮＩＲ（近赤外性）は、選択的であり試料調製を要しないため、製造工程のＩＤ試験にとって魅力的であり得る。定性的であれ定量的であれ、複数の波長を対象の特性と関連づける回帰モデルが開発されると、操作者は高度な訓練なしに新たなスペクトルを得ることができる。モデルは対象の何らかの変数に対し部分最小二乗法（ＰＬＳ）を使用して開発されることが多く、ＩＤを予測するかまたは値を計算する。

【0028】

ＮＩＲ吸収スペクトルは、典型的には各波長の複数の試料成分由来の信号を含む。信号は、有機化合物、温度またはイオン強度などの水素結合に影響を及ぼす要因、および粉末試料を測定する場合は光散乱から生じる。結合バンドと倍音の間のモル吸光率における大きな差に加えて、ＮＩＲ分光計は、関心のスペクトル範囲全体で限定的および可変の光源強度を有する。従って、シグナルノイズ比はスペクトル全体で大幅に変動し得る。ノイズに支配された波長が削除されるとより強力なＮＩＲモデルが得られることが広く報告されている。波長を選択する様々な戦略が記載されており、これにはマニュアル、知識ベースの方法、回帰手法、遺伝的アルゴリズムなどの自動波長領域セレクターおよび間隔選択法が含まれる^２８。このなかでは遺伝的アルゴリズムが最も高性能であるが、化学的知識に基づき容易に解釈することはできない。それよりも原材料用途に関し問題となるのは、強力な定量化と低偽陰性率に対する必要性の間のバランスである。標準的な手法は、もともと乏しい原材料用途の試料の制約を受ける。工程をしっかりと理解するために原材料のベンダーロットで十分な経験を積むには何年もかかり得る。そのような長期スパンで生じ得る原材料の全種類の変化を予測することは不可能である。

【0029】

試料が以前に見たもののどれとも違ってはいるが、個々の成分のレベルが許容可能なので許容可能である場合、エラーの危険性が大いに残る。いずれの場合も、操作上の問題は、原材料のＩＤと特徴決定にＮＩＲのような分光法を使用したことによる警戒増大と明らかにつながりがある。

【0030】

ツールの利用可能性、およびＮＩＲの情報内容とＮＭＲ（核磁気共鳴）の情報内容とを関連付ける化学的直観にもかかわらず、高分解能ＮＭＲとＮＩＲのデータ融合は報告されていない。本開示は、必要とされる独自のデータ処理戦略、および設計した実験的混合物と生物製剤の製造で原材料として使用される実際の複雑な栄養剤のスペクトルとを用いるＮＩＲとＮＭＲの組み合わせに由来する、必要かつ有益な独自のデータ処理戦略を提供する。いくつかの実施形態では、ＯＰＡ（外積分析）または逐次ＰＬＳ（部分最小二乗）モデルから得られたＶＩＰプロット（射影変数の重要度）と回帰ベクトルの情報を組み合わせることにより、ＮＩＲ波長は製品収量と明確に正または負の相関関係とされ、ＮＭＲを用いて混合物の特定成分にリンクされる。本開示はまた、ＮＩＲとＮＭＲスペクトルの組み合わせに基づく増強されたＮＩＲオンリーの波長選択も提供する。

【0031】

１つの態様では、本開示は、（生物学的）試料を分析するためにＮＩＲとＮＭＲ分光手法を組み合わせる方法を提供する。ＮＭＲは強力な技術であり、試料（例えば生体試料または製品合成試料）の定性的および定量的な組成の決定を補助することができる。しかし、洗練された機器が必要とされ、操作者の広範な訓練もあるので、ＮＭＲは生物学的生産工程の前またはその間のルーチンの材料分析に簡単に実施することができない高価な技術である。ＮＭＲに対し、ＮＩＲは試料中の１つまたは複数の成分の存在を素早く分析し、その試料の評価ができる廉価な手法である。例えば、ＮＩＲスペクトルは、試料に光ファイバーを加えることによりほぼ連続的に得ることができる。しかし、複雑な試料（例えば３または４種類以上の成分を有するもの）をＮＩＲ単独で分析する能力は、本開示以前は限られていた。

【0032】

ＮＭＲとＮＩＲデータの融合分析
１つの態様では、本開示は、データ融合分析の方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＭＲ実験で得られたデータとＮＩＲ実験で得られたデータを融合する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はＮＭＲ実験で得られたデータの分解能の向上を可能にする。いくつかの実施形態では、方法はＮＩＲ実験で得られたデータの分解能の向上を可能にする。いくつかの実施形態では、方法はＮＭＲとＮＩＲ実験の両方で得られたデータの分解能の向上を可能にする。

【0033】

ＮＩＲとＮＭＲは共通して分光特徴を有するため、データ融合には適している。いずれの手法も、同様の分析感度でプロトンの物理的および化学的環境を調査する。ＮＩＲにおける振動の時間尺度は、ＮＭＲ中に誘導される磁気相互作用よりも有意に速いが、この２つの手法に共通する物理的基礎（分子内の原子の相対的位置）により、この２つの手法を組み合わせることが可能である。いくつかの実施形態では、本開示は、プロトンＮＭＲ核スピンの遷移と分子の電磁スペクトル依存性振動運動の関係を利用する方法を提供する。ＮＭＲスペクトルを同時獲得しながら分子を特定の振動周波数で照射すると、その振動周波数と関連する特定の結合の化学シフトおよび／または線幅拡大のいずれかの変化がプロトンＮＭＲ信号に観察され得る。ＮＭＲスペクトルを獲得しながらこれらの分子特異性振動モードを刺激することにより、ＮＭＲで追加の分子特異性を与える方法が得られる。

【0034】

いくつかの実施形態では、本開示は、プロトンＮＭＲを用いてＮＩＲを解釈する分析法を提供する。該分析は、この２種類の分光法の強さ、限界、感度および選択性の多面的な類似性に基づく。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＩＲを利用してＮＭＲスペクトルを改善する（逆もまた同様）方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法により得られた改善点は、改良されたシグナルノイズ比、増強された選択的定量的ＮＩＲモデルおよび／または直観的ＮＩＲスペクトルの解釈を含む。１つの態様では、本開示は、ＮＩＲとＮＭＲの関係を利用して装置ノイズのばらつきをＮＭＲスペクトルから除去する方法を提供する。

【0035】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を行ってＮＭＲスペクトルを得ること、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、およびデータ融合分析を行ってＮＩＲスペクトルを評価することを含む。

【0036】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、および参照ＮＭＲスペクトルとのＮＩＲスペクトルのデータ融合分析を行うことを含む。

【0037】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行ってＮＩＲスペクトルを得ること、およびＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析で特定されたＮＩＲスペクトルの一部分を分析することを含む。

【0038】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、試料の近赤外線分光法（ＮＩＲ）分析を行って、ＮＩＲ波長のサブセットのＮＩＲスペクトルを得ることを含み、該サブセットはＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析で特定されたものである。

【0039】

本明細書に提供する方法のいくつかの実施形態では、データ融合分析は、外積分析（ＯＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＡは、ＮＭＲスペクトルをＮＩＲスペクトルで乗じることを含む。

【0040】

１つの態様では、ＯＰＡは、射影変数の重要度（ＶＩＰ）と回帰ベクトルの積としての結果を分析することにより使用される。回帰ベクトルとＶＩＰベクトルを乗じることにより、より理解しやすいスペクトル評価が得られる。いくつかの実施形態では、結合ベクトルが使用される。射影変数の重要度（ＶＩＰ）と回帰ベクトルの積は、積のデータおよび／または結果を表示することにより、アルゴリズムの使用を含む積のデータおよび／または結果を比較することにより、分析され得ることを理解されたい。しかし、他の分析手法も使用してよい。

【0041】

１つの態様では、本明細書で使用されるように、ＯＰＡは細胞増殖、製品収量または製品品質に重要な代謝産物の比較を可能にする。例えば、製造の列に沿った異なるバイオリアクター拡張ステージの培地試料由来のＮＭＲスペクトルおよび／またはＮＩＲスペクトル間の外積分析は、工程の特定のステップにおいて、最終収量を決定するのに関連し得る主要な生化学工程の特定（例えば視覚化による）を可能にする。

【0042】

いくつかの実施形態では、データ融合分析は、部分最小二乗（ＰＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＳ分析は、ＮＩＲとＮＭＲデータのｘブロックと生体試料の１つまたは複数の成分のｙブロックを含む。

【0043】

本明細書に開示のいずれの方法においても、データ融合分析またはその成分（例えばＯＰＡまたはＰＬＳ）、または前処理ステップは、コンピューターで実行されるステップであり得る。

【0044】

１つの態様では、本開示は、ＮＩＲスペクトルにおいてピークを割り当てる方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＩＲスペクトルにおけるピークは、ＮＩＲスペクトルのピークをＮＭＲスペクトルのピークと相関させることにより、割り当てられる。

【0045】

１つの態様では、本開示は、ＮＩＲスペクトルにおいて関心領域を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＩＲスペクトルにおける関心領域は、ＮＩＲスペクトルのピークをＮＭＲスペクトルのピークと相関させることにより、割り当てられる。いくつかの実施形態では、ＮＩＲスペクトルの関心領域は、生物学的に関連のある分子の特定を可能にする。

【0046】

１つの態様では、本開示は、ＮＭＲスペクトルにおいて得られたデータとのデータ融合分析を実行することにより、ＮＩＲスペクトルにより得られたデータを改良する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、試料のＮＭＲとＮＩＲスペクトルの外積分析（ＯＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、ＮＩＲの特定の振動信号をＮＭＲスペクトルの化学シフトと相関させることにより、該信号の割当を可能にする。

【0047】

１つの態様では、ＰＬＳは、ＮＩＲとＮＭＲスペクトルの組に対し順次使用される。予測結果は、ＮＩＲもＮＭＲスペクトルも、それぞれの元のスペクトルと比べて、工程収量などの「標識された」結果に対する良好な相関を提供する。特定の機構に制限されるものではないが、この改良は、ＮＭＲとＮＩＲそれぞれに存在する装置のまたは化学的ノイズの相対的抑制による可能性が高い。

【0048】

１つの態様では、本明細書に示す方法は、ＮＩＲ波長割当および選択を実行する戦略として、ＶＩＰと回帰ベクトルを結合して使用することを可能にする。

【0049】

いくつかの実施形態では、方法は、試料のＮＭＲスペクトルを得るステップ、同じ試料のＮＩＲスペクトルを得るステップ、およびＮＭＲとＮＩＲスペクトルの各ポイントを乗じて外積データ群を得るステップを含む。いくつかの実施形態では、該データ群を部分最小二乗（ＰＬＳ）分析のＸブロック入力として使用し、試料の既知成分の１つを（ＰＬＳ分析の）Ｙブロックとして使用してＰＬＳを実行し、回帰ベクトルと射影変数の重要度（ＶＩＰ）を得る。いくつかの実施形態では、ベネチアンブラインド交差確認を使用してＰＬＳを実行する。いくつかの実施形態では、回帰ベクトルとＶＩＰを乗じて結合アレイを得る。いくつかの実施形態では、結合アレイは、ＮＩＲの特定の振動信号とＮＭＲスペクトルの化学シフトの解析を可能にする。

【0050】

１つの態様では、本開示は、試料のＮＩＲとＮＭＲスペクトルを得るステップ、全スペクトルまたはスペクトルのある特定の領域が前処理される（例えば、標準化および／または尺度化される）ＮＩＲおよび／またはＮＭＲスペクトルを前処理するステップ、前処理されたＮＭＲとＮＩＲスペクトルを乗じるステップ、ＰＬＳまたはＯＰＡを使用して回帰ベクトルとＶＩＰを得るステップ、回帰ベクトルとＶＩＰを乗じてＮＩＲとＮＭＲスペクトルの相関を得るステップ、該相関に基づいてＮＩＲスペクトルの関心領域を特定するステップ、および所望により、該関心領域を新しい試料を評価する基準として用いるステップの１つまたは複数を含む方法を提供する。

【0051】

１つの態様では、本開示は、試料のＮＩＲとＮＭＲスペクトルを得るステップ、全スペクトルまたはスペクトルのある特定の領域が前処理されるＮＩＲおよび／またはＮＭＲスペクトルを前処理するステップ、前処理されたＮＭＲとＮＩＲスペクトルを乗じるステップ、ＰＬＳを使用して回帰およびＶＩＰを得るステップ、回帰とＶＩＰベクトルを乗じて情報を組み合わせるステップ、結合ベクトルに基づいてＮＩＲスペクトルの関心領域を特定するステップ、および所望により、選択された波長領域に基づいて新規のＮＩＲ法を創造するステップを含む方法を提供する。

【0052】

１つの態様では、本開示は、試料のＮＩＲとＮＭＲスペクトルを得るステップ、全スペクトルまたはスペクトルのある特定の領域が前処理されるＮＩＲおよび／またはＮＭＲスペクトルを前処理するステップ、ＮＭＲポイントをｙブロックとしＮＩＲスペクトルをｘブロックとするかまたはその逆としてＰＬＳを実行するステップ、ＶＩＰを乗じた回帰ベクトルのマップを分析してＮＩＲとＮＭＲの相関を強調するステップ、結合ベクトルに基づいてＮＩＲスペクトルの関心領域を特定するステップ、および所望により、選択された波長領域に基づいて新規のＮＩＲ法を創造するステップを含む方法を提供する。

【0053】

いくつかの実施形態では、分析される１つまたは複数のスペクトルのデータが（例えばデータ融合分析の前に、またはその一部として）前処理される。いくつかの実施形態では、データを標準化（例えば１に標準化）および／または尺度化する（例えば、強度が０から１の範囲となるように尺度化する）。いくつかの実施形態では、スペクトル（例えばＮＭＲスペクトル）は標準化（例えば総面積に標準化）および／またはベースライン相関（例えば加重最小二乗法（ＷＬＳ）を用いて）および／または平均中心化（mean-centered）され得る。いくつかの実施形態では、スペクトル（例えばＮＩＲスペクトル）は補正（例えば拡張多重散乱補正（ＥＭＳＣ）を用いて）および／または標準化（例えば総面積に標準化）および／または平均中心化される。いくつかの実施形態では、スペクトルを最小０、最大１となるように移動および標準化することにより、外積分析（ＯＰＡ）のデータを準備する。しかし、他の前処理ステップ（例えば他の補正、標準化、尺度化および／または中心化）手法もいくつかの実施形態では使用され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、次元乗算前のデータ前処理が便利である。

【0054】

ＮＭＲ結果はある成分を定量化するのに使用され、その結果はＮＩＲモデルの基準データとして使用されている（L. Andreade, I.A. Farhat, K. Aeberhardt, S.B. Engelsen, Food Biophysics 3, 33, 2008）。磁気共鳴画像法はＮＩＲ画像法と関連付けられ、どちらの方法も生体試料の血中酸素分布について類似の結果を提供することが示されている（Y. Chen, D.R. Tailor, X. Intes, B. Chance, Physics in Medicine & Biology 48, 2003, 417）。タイムドメインＮＭＲ（ＴＤＮ）とＮＩＲを比較すると、この２つの手法の外積が相関していることが示された（D.N. Rutledge, A.S. Barros, R. Giangiacomo, Spec. Publ. - R. Soc. Chem. Special Publication - Royal Society of Chemistry 262, 179, 2001）。

【0055】

アブイニシオ計算によると、振動性およびＮＭＲ結果を組み合わせてＮＭＲスペクトル予測計算を改善することができることが示されている（K. Ruud, P.-O. Astrand, P.R. Taylor, Journal of the American Chemical Society 123, 4826, 2001）。固体ｍｉｄ−ＩＲと固体ＮＭＲが、表面ヒドロキシル結合の異なる化合物について、振動周波数とＮＭＲ化学シフトを相関させるのに使用されている。（E. Brunner, H.G. Karge, H. Pfeifer, Z. Phys. Chem. (Munich): Zeitschrift fuer Physikalische Chemie (Muenchen, Germany) 176, 173, 1992）。

【0056】

しかし、生物学的増殖および発現システムの出発原料、または増殖および発現システムそのものの試料などのより複雑な生体試料を分析し評価するためにＮＩＲまたはＮＭＲスペクトルを処理するのにデータ融合手法は使用されていない。

【0057】

ＮＩＲスペクトルの予測
１つの態様では、本開示は、ＮＩＲスペクトルを予測する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＩＲスペクトルを予測する方法は、試料のＮＭＲスペクトルを得ること、同じ試料のＮＩＲスペクトルを得ること、および本明細書に提供される方法に従ってスペクトル前処理を実行すること、を含む。いくつかの実施形態では、前処理済ＮＭＲスペクトルを逐次ＰＬＳにおいてｘブロックとして使用し、前処理済ＮＩＲスペクトルをＰＬＳにおいてｙブロックとして使用する。いくつかの実施形態では、次のステップでＮＩＲ波長のそれぞれについて潜在変数ＰＬＳモデルを計算し、予測ＮＩＲスペクトルの組を得る。いくつかの実施形態では、予測ＮＩＲスペクトルを逐次ＰＬＳでｘブロックとして使用し、試料の既知成分の濃度を逐次ＰＬＳのｙブロックとして使用する。いくつかの実施形態では、ＰＬＳにより得られた予測ＮＩＲスペクトルにより生体試料の良好な解釈が可能になる。

【0058】

生体試料の分析
１つの態様では、本開示は、生体試料を分析する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的生産工程を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料または生物学的生産工程の分析は、生体試料中の１つまたは複数の成分の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態では、生体試料の分析は、生体試料中の１つまたは複数の成分の量を決定することを含む。本明細書に提供されるある特定の方法により多様な生体試料の分析が可能になることを理解されたい。本明細書では、生体試料とは、生物学的生産工程の１つまたは複数の成分を含む試料を意味する。例えば、生物学的工程は、細胞生産系（例えば、任意適当な細菌、酵母、哺乳類、昆虫または他の細胞株を用いる）における１つまたは複数の生体分子の生産であり得る。生体分子は、抗体または他の分子（例えば組換えポリペプチド）であり得る。生物学的生産工程の成分は、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸などを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は界面活性物質を含む。いくつかの実施形態では、界面活性物質はプルロニックＦ６８である。

【0059】

いくつかの実施形態では、分析する試料は、生物学的合成に使用される１つまたは複数の成分を含むかまたはそれらからなる（例えば、主としてそれらからなる）。成分は、細胞成長に有用な原材料、例えばアミノ酸、ペプチド、糖、炭水化物、ビタミン類、増殖因子、塩、合成材料、抗生物質、界面活性物質、バッファーまたは他の材料またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、試料は乾燥型であり得る。いくつかの実施形態では、試料は液体型（例えば水溶液または懸濁液）であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、ＮＭＲおよび／またはＮＩＲ分析前に処理され得る（例えば、追加成分の添加により、または濃縮若しくは希釈により、適切なバッファーまたは液相などの添加による）。

【0060】

生物学的製造工程における原材料ロットのロットごとのばらつきは、バイオテクノロジーと関連業界に常時製造リスクを提示する。材料（ほぼ完全に水溶液）についての情報を得るための分析法がいくつか使用されているが、これらの方法ほとんどは、このようなばらつきを理解し制御するのを助けるような実用的なルーチンの試験を提供できるほど強力ではない。

【0061】

ＮＩＲは、乾燥粉末材料および濃縮有機原材料を特定することが周知であり、それに広く使用されている。ＮＩＲ分光計は堅牢で操作が簡単であり、メンテナンスも容易である。しかし、ＮＩＲ分析では水は分析対象の化合物や成分と相互作用してＮＩＲの感受性を強力に減ずるので、ＮＩＲは典型的には水溶液には適用されない。

【0062】

ＮＩＲとは対照的に、ＮＭＲははるかに精密な分析計器を有し、ＮＭＲはルーチンの（生物学的生産工程における）原材料分析には一般的に使用されていない。

【0063】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法は、一定の時間かけて同一の原材料の液体調製物のＮＭＲおよびＮＩＲスペクトルを得ることにより、ＮＩＲスペクトルから得られたスコアに基づきＮＭＲ負荷量（loadings）プロットに投影するステップを含む。従って、原材料の未知ロットにおける特定成分のレベルの増加がＮＭＲ結果に基づき特定され得、原材料の新ロットが製造プラントで使用可能かどうか検証するのに必要な任意の追加のフォローアップ分析試験の時間を節約できる。

【0064】

ＮＩＲを品質管理および工程監視ツールとして使用する主な限界は、混合物の異なる成分のスペクトルが重複するので、試料間の化学組成の差異についての情報がＮＩＲスペクトル検査により効果的に演繹できないことである。ＮＩＲスペクトルは、何かが異なっていることは示すが、予備知識なしに何がその差をもたらすかを示すことはできない。本明細書に提供される方法によると、ＮＩＲスペクトルの差異をＮＭＲスペクトルに関連づけることにより、ＮＩＲの差異を説明する根底にある化学変化が追加の分析なしに決定された。

【0065】

いくつかの実施形態では、生体試料の評価は、生体試料中の１つまたは複数の成分の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の成分の存在は、試料の品質および／または特定の生物学的製造工程の進行と相関し得る。本明細書に提供する方法により分析され得る成分は、糖、アミノ酸、核酸などを含む。たとえば、最適な生物学的生産工程では、生物学的生産工程の開始時に特定量のグルコースが存在していることが望ましいかもしれない。するとグルコースの存在および／または量を決定することで生体試料の評価が可能になる。例えば、所望の量より少ないグルコースが存在する場合、出発原料のそのバッチは生物学的製造前に不合格とされ得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、生物学的生産工程の間、生物学的生産工程の進行を監視するのに一成分の量が用いられ得る。従って、例えば、生物学的生産工程の間グルコースが消費される場合、生物学的生産工程の進行中にその生物学的生産工程の開始時と同量のグルコースが存在していることは、その生物学的工程が所望のとおりに進行していないことを示す。さらに、新しい成分の存在は、その生物学的生産工程が計画通りに進行しているかまたは進行していないことを示し得る。従って、生物学的生産工程は、所望の生成物または所望通りに生物学的生産工程が進行しているという指標の発生について監視され得る。一方で、特定の代謝物の存在は、生物学的生産工程において細胞が所望の生成物を産出しているのではなく、例えば、単に増殖しているだけであることを示し得る。従って、生体試料中の１つまたは複数の成分の存在を決定することは、試料を評価し、生物学的生産工程成功率（例えば収量）を予測する一方法である。

【0067】

成分分析は複数の成分にも拡張され得ることを理解されたい。従って、例えば生物学的生産工程は、最適な進行のためにグルコースとフェニルアラニンの両方が３：１の比率で存在することを必要とするかもしれない。試料はこの関係について反応の前または最中に監視され得、観測比率が所望の比率である３：１から逸脱している場合に条件が調節され得る。

【0068】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、生体試料の成分のＮＭＲ実験を行いＮＭＲスペクトルを得るステップ、生体試料の成分のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得るステップ（ＮＭＲとＮＩＲ実験はどのような順序で実施してもよい）、ＮＩＲスペクトルとＮＭＲスペクトルのデータ融合分析を行い割当ＮＩＲスペクトルを生成するステップ、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得るステップ、および生体試料のＮＩＲスペクトルを割当ＮＩＲスペクトルに対し分析することにより、生体試料における生体試料成分の存在を決定するステップを含む。生体試料を評価する方法で使用されるデータ融合分析は、ＯＰＡおよびＳＰＬＳを含む本明細書に提供するデータ融合分析のどれを含んでもよい。本明細書に提供する方法のいずれにおいても、データ融合分析はコンピューターで実行されるステップであり得る。本明細書に提供する方法のいずれにおいても、決定ステップもまたコンピューターで実行されるステップであり得ることも理解されたい。成分のＮＭＲおよびＮＩＲスペクトルを得るステップとデータ融合分析は同じ時間枠で実行する必要はなく、生体試料の分析と同じ場所でなくてもよいことをさらに理解されたい。例えば、成分分析はいくつかの成分について実施され得るので成分の参照スペクトルライブラリーが生成し得、それを使用して生体試料のＮＩＲスペクトルを成分の存在について分析してもよい。

【0069】

１つの態様では、本開示は、特定の結果を有する試料と関連づけられるスペクトルの参照ライブラリーを生成することにより生体試料を評価する方法を提供する。例えば、生物学的生産工程において良好な収量が得られるとわかっている試料由来のスペクトルを回収し、低収量と関連付けられる試料から参照スペクトルを採取してもよい。次いで未知の試料由来のスペクトルを採取し、参照スペクトルのライブラリーを用いて解釈してもよい。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＮＩＲスペクトルのライブラリーは、結果が既知である生体試料のＮＭＲとＮＩＲスペクトルのデータ融合から生成される。次に新しい試料のＮＩＲスペクトルをＮＩＲスペクトルのライブラリーのスペクトルと比較して該新しい試料を用いる生物学的生産工程を予測する。従って、いくつかの実施形態では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、所望の試料の第１のＮＩＲ実験を行い所望の試料と相関するＮＩＲスペクトルを得ること、非所望の試料の第２のＮＩＲ実験を行い非所望の試料と相関するＮＩＲスペクトルを得ること、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、および生体試料のＮＩＲスペクトルが所望の試料のＮＩＲスペクトルまたは非所望の試料ＮＩＲスペクトルと相関するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、決定ステップは、コンピューターで実行されるステップである。いくつかの実施形態では、方法はさらに、１つまたは複数のＮＩＲスペクトルと同じ試料のＮＭＲスペクトルのデータ融合分析を行うことを含む。いくつかの実施形態では、データ融合分析は、コンピューターで実行されるステップである。（所望のおよび非所望の試料と相関する）ＮＩＲ参照スペクトルの生成と、その後のＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析は、生体試料のＮＩＲスペクトル生成と必ずしも同じ時／場所である必要はないことを理解されたい。さらに、いくつかの実施形態では、生体試料は、所望の試料のみまたは非所望の試料のみと比較してもよい。

【0071】

１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ることと、該ＮＩＲスペクトルをＮＭＲスペクトルとのデータ融合分析を経た参照ＮＩＲスペクトルと比較することを含む。いくつかの実施形態では、比較ステップは、コンピューターで実行されるステップである。

【0072】

本明細書に提供する予測ＮＩＲスペクトルを生成する方法は、生体試料の評価にも使用され得ることを理解されたい。１つの態様では、本開示は、生体試料を評価する方法を提供し、該方法は、生体試料中の１つまたは複数の成分のＮＩＲ実験を行い該生体試料の１つまたは複数の成分のＮＩＲスペクトルを得ること、データ融合分析を行い予測ＮＩＲスペクトルを生成すること、生体試料のＮＩＲ実験を行いＮＩＲスペクトルを得ること、および予測ＮＩＲスペクトルを用いて生体試料のＮＩＲスペクトルを評価することを含む。

【0073】

１つの態様では、本開示は、ＮＭＲスペクトルを得るステップを含む。本明細書ではＮＭＲとは、ある特定の原子核の磁気特性を利用してそれらが含有されている原子または分子の物理的および化学的性質を決定する分光法を意味する。この技術は核磁気共鳴現象に依拠し、分子の構造、力学、反応状態および化学的環境についての詳細な情報を提供することができる。典型的には、ＮＭＲでは、分析する試料を含む溶液が入った管が磁石内に配置される。適当なエネルギーの高周波を試料に照射する。試料管を取り囲んでいるレシーバーコイルが吸収されたラジオ波をモニターする。ＮＭＲスペクトルは、試料からのラジオ波信号を観察しながら小範囲にわたって磁場を変化させるまたは掃引することにより、または外部場を一定に保持しつつラジオ波照射の周波数を変化させることにより得られる。いくつかの実施形態では、ＮＭＲの全周波数範囲、すなわち全（プロトン）化学シフトを包含して調査する。いくつかの実施形態では、周波数範囲のサブセットのみが調査される。

【0074】

１つの態様では、本開示は、ＮＩＲスペクトルを得るステップを含む。近赤外線分光法（ＮＩＲ）は、電磁スペクトルの近赤外線領域（約８００ｎｍから２５００ｎｍ）を使用する分光法である。近赤外線分光法は、分子の振動の倍音と結合音を基本とする。典型的には、ＮＩＲ分光計は、光源、検出器および分光素子（プリズムさらには回折格子など）を含み、様々な波長での強度を記録することができる。いくつかの実施形態では、ＮＩＲの全周波数範囲、すなわち全ての可能な分子振動が調査される。いくつかの実施形態では、周波数範囲のサブセットのみが調査される。

【0075】

例えば、ＮＩＲおよび／またはＮＭＲの周波数範囲の有用なサブセットは本明細書に記載のように特定され得、次いで新しい試料を評価するために分析され得る。

【0076】

本明細書に記載される方法は、任意適当な液体または乾燥（例えば粉末）試料のＮＩＲおよび／またはＮＭＲスペクトルに使用され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、試料は生物学的培地の材料を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は細胞または細胞材料を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は生物由来製品（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸などまたはそれらの任意の組合せ）を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は合成化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は評価されている他の材料を含み得る。従って、ある特定の材料またな試料の文脈で本明細書に記載または例示の方法は、他のソース由来および／または他の材料または分子に関連しているデータの分析に使用され得る。

【0077】

１つの態様では、ある特定の方法は１つまたは複数のコンピューターで実行されるステップを含む。いくつかの実施形態では、ＮＭＲおよび／またはＮＩＲの情報を分析する方法が提供される。対象の組成物または調製物のＮＭＲおよび／またはＮＩＲデータは、本明細書に記載される１つまたは複数の分析手法を実行するコンピューター上で処理され得る。いくつかの実施形態では、データは１台のコンピューターに保存され得るが、データは他のソースから検索してもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の出力が表示され得る。しかし、必ずしも出力が表示されるわけではない。例えば、いくつかの実施形態では、分析している材料の特徴（例えば、製造用に許容可能または許容不可など）に基づき、出力を用いて信号またはメッセージ（例えば警告メッセージまたは肯定的なメッセージ）を作成してよい。

【0078】

図５３を参照すると、本発明の１つまたは複数の態様を実行するための例示的なシステムは、コンピューター１２１０として、汎用コンピューター装置を含む。コンピューター１２１０の構成要素としては、限定ではなく、演算処理装置１２２０、システムメモリ１２３０およびシステムメモリを含む様々なシステム構成要素を演算処理装置１２２０に連結するシステムバス１２２１が含まれ得る。システムバス１２２１は、様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用したメモリバスまたはメモリコントローラー、ペリフェラルバスおよびローカルバスを含む複数のタイプのバス構造のいずれでもあり得る。例として、限定ではなく、そのようなアーキテクチャは、産業標準構成（ＩＳＡ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ）バス、エンハンスドＩＳＡ（ＥＩＳＡ）バス、ビデオ電子装置規格化協会（ＶＥＳＡ）ローカルバスおよび周辺装置相互接続（ＰＣＩ）バス（メザニンバスとしても知られる）を含む。

【0079】

コンピューター１２１０は、典型的には様々なコンピューター可読媒体を含む。コンピューター可読媒体は、コンピューター１２１０がアクセス可能であり、揮発性と非揮発性媒体、可換型と非可換型媒体の両方を含む、任意の入手可能な媒体であり得る。例として、限定ではなく、コンピューター可読媒体は、コンピューター記憶媒体および通信媒体を含みうる。コンピューター記憶媒体は、コンピューター可読指令、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報を記憶するあらゆる方法または技術において実現される、揮発性と非揮発性、可換型と非可換型媒体の両方を含む。コンピューター記憶媒体には、限定ではなく、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または他の光学ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置または他の磁気記憶装置、または所望の情報を保存しコンピューター１２１０によりアクセス可能な任意の他の媒体が含まれる。通信媒体は典型的にはコンピューター可読指令、データ構造、プログラムモジュールまたは搬送波または他の伝達機構などの被変調データ信号中の他のデータを包含し、あらゆる情報伝送媒体を含む。「被変調データ信号」という用語は、その信号内に情報をコード化するように１つまたは複数の特徴を設定または変化させた信号を意味する。例として、限定ではなく、通信媒体は、有線ネットワークまたは直接有線接続などの有線媒体および音響、ラジオ波、赤外線および他の無線媒体などの無線媒体を含む。上記の任意の組合せも、コンピューター可読媒体の範囲内に含まなければならない。

【0080】

システムメモリ１２３０は、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）１２３１およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１２３２などの揮発性および／または非揮発性メモリの形態でコンピューター記憶媒体を含む。起動中などにコンピューター１２１０内の構成要素同士の情報伝達を補助する基本的ルーチンを格納する基本入出力システム１２３３（ＢＩＯＳ）は、典型的にはＲＯＭ１２３１に記憶されている。ＲＡＭ１２３２は典型的には演算処理装置１２２０が即アクセス可能なおよび／または現在演算中のデータおよび／またはプログラムモジュールを格納する。例として、限定ではなく、図５３は、オペレーティングシステム１２３４、アプリケーションプログラム１２３５、他のプログラムモジュール１２３６およびプログラムデータ１２３７を例示する。

【0081】

コンピューター１２１０は、他の可換型／非可換型、揮発性／非揮発性コンピューター記憶媒体も含みうる。単なる例として、図５３は、非可換型非揮発性磁気媒体から読み出すまたはそれに書き込むハードディスクドライブ１２４１、可換型非揮発性磁気ディスク１２５２から読み出すまたはそれに書き込む磁気ディスクドライブ１２５１、およびＣＤ ＲＯＭまたは他の光学媒体などの可換型非揮発性光学ディスク１２５６から読み出すまたはそれに書き込む光学ディスクドライブ１２５５を例示する。例示的な動作環境で使用され得る他の可換型／非可換型、揮発性／非揮発性コンピューター記憶媒体としては、限定ではなく、磁気テープカセット、フラッシュメモリカード、デジタル多用途ディスク、デジタルビデオテープ、固体ＲＡＭ、固体ＲＯＭなどが挙げられる。ハードディスクドライブ１２４１は典型的にはインターフェース１２４０などの非可換型メモリインターフェースを介してシステムバス１２２１に接続され、磁気ディスクドライブ１２５１および光学ディスクドライブ１２５５は典型的にはインターフェース１２５０などの可換型メモリインターフェースによりシステムバス１２２１に接続される。

【0082】

上述した、図５３に例示するドライブとそれらに関連するコンピューター記憶媒体は、コンピューター１２１０のコンピューター可読指令、データ構造、プログラムモジュールおよび他のデータを記憶する。図５３では、例えば、ハードディスクドライブ１２４１は、オペレーティングシステム１２４４、アプリケーションプログラム１２４５、他のプログラムモジュール１２４６およびプログラムデータ１２４７を記憶するものとして例示されている。これらの構成要素は、オペレーティングシステム１２３４、アプリケーションプログラム１２３５、他のプログラムモジュール１２３６およびプログラムデータ１２３７と同一であっても異なっていてもよいことに注意されたい。オペレーティングシステム１２４４、アプリケーションプログラム１２４５、他のプログラムモジュール１２４６およびプログラムデータ１２４７は、本明細書では少なくとも異なるコピーであることを示すために異なる番号を付与されている。ユーザーはキーボード１２６２および一般にはマウス、トラックボールおよびタッチパッドといわれるポインティング装置１２６１などの入力装置によりコンピューター１２１０にコマンドおよび情報を入力してよい。他の入力装置（図示せず）は、マイクロフォン、ジョイスティック、ゲームパッド、衛星放送受信用アンテナ、スキャナーなどを含み得る。これらおよび他の入力装置は、システムバスに連結しているユーザー入力インターフェース１２６０を介して演算処理装置１２２０に接続されることが多いが、パラレルポート、ゲームポートまたはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）などの他のインターフェースおよびバス構造により接続されてもよい。モニター１２９１または他のタイプの表示装置もビデオインターフェース１２９０などのインターフェースを介してシステムバス１２２１に接続されている。モニターに加えて、コンピューターは、スピーカー１２９７およびプリンター１２９６などの他の周辺出力装置も含み得、出力周辺機器インターフェース１２９５を介して接続され得る。

【0083】

コンピューター１２１０は、遠隔コンピューター１２８０などの１つまたは複数の遠隔コンピューターと論理接続を使用するネットワーク環境で動作してもよい。遠隔コンピューター１２８０は、パーソナルコンピューター、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、ピアーデバイスまたは他の共通ネットワークノードであってもよく、典型的にはコンピューター１２１０に関して上述した多くのまたは全ての構成要素を含むが、メモリ記憶装置１２８１だけを図５３に例示してある。図５３に描写する論理接続は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）１２７１とワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）１２７３を含むが、他のネットワークも含んでよい。そのようなネットワーク環境は、オフィス、企業規模のコンピューターネットワーク、イントラネットおよびインターネットでは一般的である。

【0084】

ＬＡＮネットワーク環境で使用される場合、コンピューター１２１０は、ネットワークインターフェースまたはアダプター１２７０を介してＬＡＮ１２７１に接続される。ＷＡＮネットワーク環境で使用される場合、コンピューター１２１０は、ＷＡＮ１２７３においてインターネットなどの通信を確立するために、典型的にはモデム１２７２または他の手段を含む。モデム１２７２は内部でも外部でもよいが、ユーザー入力インターフェース１２６０または他の適切な機構を介してシステムバス１２２１に接続され得る。ネットワーク環境では、コンピューター１２１０と関連して描写されるプログラムモジュールまたはその一部分は、遠隔メモリ記憶装置に記憶され得る。例として、限定ではなく、図５３は、遠隔アプリケーションプログラム１２８５がメモリ装置１２８１にあるのを例示する。図示するネットワーク接続は例示であり、コンピューター間の通信回線を確立する他の手段も使用され得ることを理解されたい。

【0085】

本発明は、以下の実施例によりさらに例示されるが、該実施例をさらなる限定と解釈してはならない。本明細書を通して引用される全参照文献の全容（参照論文、登録特許、公開特許出願および同時継続出願を含む）は、特に上記参照の教示について、参照により明白に本明細書に組み込まれる。
（実施例）

【実施例1】

【0086】

材料および方法
試料および対照
グルタミン（ｇｌｎ）、グルコースおよびフェニルアラニン（ｐｈｅ）は全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手したＡＣＳ試薬グレードであった。ｄ４−トリメチル−シリルプロピオネートをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。Ｄ_２ＯをＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｌａｂ社から入手した。ｇｌｎ、グルコースおよびｐｈｅの試料を表１の要因デザインに従い合わせた。

【0087】

【表1】

【0088】

ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）試料をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社またはＨｙｃｌｏｎｅ社から入手した。水吸着を低下させるため、大気曝露を最小限にした。水分レベルは、カールフィッシャー滴定法（Mettler Toledo）により、試料を１０５℃に加熱して測定した。

【0089】

ＮＩＲ獲得パラメーター
ＮＩＲスペクトルは、粉末試料用の積分球と硫化鉛検出器を搭載したＢｒｕｋｅｒ ＭＰＡ分光計を用いて得られた。スペクトルは、２５６スペクトルを用いて得られた参照スペクトルを用いて、分解能２ｃｍ^−１で１２８スペクトルを共付与して獲得した。参照スペクトルは、ドリフトを低下させるために毎時間再獲得した。液体試料は、光路長５ｍｍのキュベットとＩｎＧａＡｓ検出器を用いて透過セル内で測定した。試料は獲得６分前に装置内で平衡化させて温度を安定化させた。液体試料は、相分解能３２ｃｍ^−１で２５６スキャンを加えた。全てのスペクトルはＯＰＵＳソフトウェア バージョン６．５（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して獲得した。

【0090】

ＮＭＲ獲得パラメーター
ＮＭＲスペクトルは、低温プローブを搭載した５００ＭＨｚのＡｖａｎｃｅ ＩＩ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて得られた。試料は、１ｍＭのＴＳＰと共に１０％のＤ_２Ｏを含有した。

【0091】

【表2】

【0092】

収量データ
タンパク質濃度と量の測定に基づき、工程収量と他の製品品質特性を得た。各ＤＭＥＭベンダーロットを使用して、他の原材料と独自の組合せで１〜９の間の製品バッチを作った。

【0093】

データ処理
ソフトウェア
ＮＭＲ獲得をＴｏｐＳｐｉｎ バージョン３．０（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて制御した。スペクトルは、スペクトルの実数部（ｒｅａｌ）６５５３６ポイント、線の広がり０．３、自動位相ベースライン補正を用いて変換し処理した。スペクトルをＭａｔＬａｂ バージョン７（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社、マサチューセッツ州ナティック）に転送してＰＬＳＴｏｏｌｂｏｘ バージョン３．５（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ワシントン州ワナッチー）で前処理し、部分最小二乗法および主成分分析を実行した。

【0094】

データ融合手法
前処理
ＮＭＲスペクトルはまず全面積に標準化し、加重最小二乗法（ＷＬＳ）を用いてベースライン補正し、最後に平均中心化した。ＮＩＲスペクトルは拡張多重散乱補正（ＥＭＳＣ）を用いて補正し、全面積に標準化してから平均中心化した。データをスペクトル移動と標準化により外積分析（ＯＰＡ）用に準備し、最小値０最大値１とした（コードを図１２〜１５に示す）。

【0095】

回帰とＶＩＰプロットの結合
回帰ベクトルと射影変数の重要度（ＶＩＰ）は２つの異なるタイプの情報を提供する。回帰ベクトルはどの変数がＹブロックと正または負の相関があるかを示し、ＶＩＰアレイはそのような変数の重要度を示す。両タイプの情報を１つのプロットにまとめるために、２つのアレイを乗じて回帰ベクトルの符号（ｓｉｇｎ）を保ちながら、ＶＩＰアレイの振幅情報を強調する。データ融合する場合、Ｍａｔｌａｂのｉｍａｇｅｓｃグラフ化関数を用いて２次元プロットを画像として表示した。

【0096】

外積分析
図１０は外積の流れ図を示す。外積分析は記載どおりに実行した（Rutledge, D. N.; Barros, A. S.; Giangiacomo, R. Spec. Publ. - R. Soc. Chem. Special Publication - Royal Society of Chemistry 2001, 262, 179-192）。ＮＭＲとＮＩＲスペクトルの外積は、ＮＭＲとＮＩＲスペクトルの各ポイントを乗じて計算した（コードを図１２〜１３に示す）。次いでデータ群をＰＬＳのＸブロックとして使用し、ＧＬＮ、グルコースまたはＰＨＥの濃度をＹブロックとした。次いでモデルをベネチアンブラインド交差確認で計算した。回帰ベクトルと射影変数の重要度（ＶＩＰ）を乗じて結合アレイを作成した。コードを図１４に示す。さらに、視覚化および解釈のために、得られたアレイを１次元アレイから２次元マトリックスに変形した。

【0097】

逐次ＰＬＳ
逐次ＰＬＳでは、前処理済ＮＭＲスペクトルを逐次ＰＬＳにおいてｘブロックとして使用し、前処理済ＮＩＲスペクトルをＰＬＳにおいてｙブロックとして使用した（図１１Ａ）。逐次ＰＬＳモデルは３つの潜在変数（ＬＶ）を用いて計算した。回帰ベクトル、射影変数の重要度プロット（ＶＩＰ）および予測を計算モデルから抽出した。次いで回帰ベクトルを展開し、展開ＶＩＰを乗じて結合ベクトルを作成した。次いでこのベクトルを再度折り畳んでＮＭＲとＮＩＲスペクトルの相関を示す結合画像を生成した。

【0098】

図１１は、ＮＭＲスペクトルを用いてＮＩＲスペクトルの特徴を決定するための逐次ＰＬＳの使用を例示する流れ図を示す。３ＬＶ ＰＬＳモデル由来のＮＩＲ予測を各ＮＩＲ波長について計算し、それから１組の予測ＮＩＲスペクトルを得た（図１１Ｂ参照）。これらの予測を次のＰＬＳのｘブロックとして使用し、各試料のＰＨＥ、ＧＬＮおよびグルコースの濃度をｙブロックとして用いた。前処理済ＮＩＲスペクトルはＰＬＳモデルでｘブロックとしても直接使用され比較に用いられた。コードを図１５に記述する。

【0099】

結果と考察
グルタミン、グルコース、フェニルアラニンのＮＭＲとＮＩＲスペクトル
元のおよび前処理済ＮＭＲとＮＩＲスペクトルを図１と２に示す。水と関連のあるＮＭＲスペクトルは排除している。ＮＩＲスペクトルの２番目と３番目の倍音領域のみが含まれる。

【0100】

元のおよび前処理済ＮＭＲとＮＩＲスペクトルを図３３と３４にも示す。水と関連のあるＮＭＲスペクトルは排除している。ＮＩＲスペクトルの結合バンド領域のみが含まれる。前処理済ＮＩＲスペクトルはＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターを用いて１５ポイントの平滑化で平滑化した。

【0101】

回帰とＶＩＰプロットの結合結果
外積分析は、混合物の各成分について、どのＮＭＲ化学シフトがＮＩＲの特定の振動信号に対応するかを示した。別のモデルでは、３成分の混合物中の成分ごとに明瞭な定性的像が得られた。この情報にアクセスするため、３種類の図式戦略を図３で比較した。回帰ベクトルとＶＩＰの値を乗じることで、両ベクトルを個別に用いるよりも、ＮＩＲとＮＭＲのピーク関係の明瞭な割当が可能であった。この概念を説明するために、ＰＨＥモデルの結果から８７５５ｃｍ^−１のＮＭＲプロファイルのスライスを３通りに表示した：ＶＩＰプロットを乗じた結合回帰ベクトル、回帰ベクトルのみ、およびＶＩＰベクトルのみ。図３ＡはＰＨＥの結合プロットを示す。ＰＨＥの化学シフトは、ピークの正符号と高振幅のため明確に区別され得る。図３ＢはＰＨＥのみのＶＩＰプロットを示す。ピークの振幅しか見られないので、ＰＨＥのピークをグルコースとＧＬＮの化学シフトと区別することが難しい。図３ＣはＰＨＥの回帰ベクトルを示す。同様に、この表示ではＰＨＥの相関を決定することが難しいが、これはＶＩＰの振幅の情報がプロット中に欠けているからである。このことは特に、グルコース、ＧＬＮおよびＰＨＥのピークが重複し互いに近接している３〜４ｐｐｍの領域に見られる。観察すると、回帰ベクトルとＶＩＰを結合したプロットではＮＭＲとＮＩＲプロファイルがより解釈しやすいことがわかる。

【0102】

結果の視覚化
結合した回帰ベクトル−ＶＩＰマトリックスを１つの画像とみなすと、より多くの情報がアクセス可能になった。図４〜６はこのことをＰＨＥ、ＧＬＮおよびグルコースのＯＰＡ−ＰＬＳモデルについて例示する。ＯＰＡにより不同性データ群を直観的に理解できるようになる。

【0103】

図４Ａは、外積のＰＬＳ由来の回帰と変数重要度の画像を乗じて得られたＶＩＰと回帰マトリックスを結合した画像を示す。この画像は、強度の変化および完全なＯＰＡ−ＰＬＳモデル由来の符号を示す。ＶＩＰ−回帰結合画像をいかに使用するかを理解するために、図４Ｂ〜Ｅは図４Ａの特定のＮＩＲ波長とＮＭＲシフトチャネルを示す。例えば、図４Ｂは、８．１７ｐｐｍに関連するＮＩＲピークはないことを示すが、それはその化学シフトのＮＭＲピークがないためである。しかし、ＮＭＲスペクトルの７．４３ｐｐｍに対応する図４Ｃは、ＮＩＲにおいて８５００と９０００ｃｍ^−１の間に明瞭なピークを有する。７．４３の化学シフトはＰＨＥの芳香族プロトン由来のＮＩＲピークと関連がある。ＮＩＲの軸を見ていくと、異なるＮＭＲ化学シフトが異なるＮＩＲ波長で強調されている。ＮＩＲ波数８７５５．８１ｃｍ^−１に対応している図４Ｄでは、ＰＨＥに関連するＮＭＲピークは高振幅であり、ＰＬＳのＹブロックと正の相関がある。８７００’s ｃｍ^−１台の領域は芳香族の強力な吸収領域としても知られ、そのことはこの方法の信頼性を再確認するものである（Workman Jr., J.; Weyer, L. Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy, 1^st ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, 2008)。一方、図４Ｅは、ＰＨＥとは強い相関関係をもたないが、ＧＬＮとは２．１、２．４および３．７ｐｐｍの化学シフトで相関のある、ＮＩＲ波数を示す。

【0104】

図５Ｂ〜Ｆは、図５Ａの結合ＧＬＮマトリックスのＮＭＲ軸とＮＩＲ軸に沿ってのスライスを示す。図５Ｂは、既知のＰＨＥ化学シフトである７．４３ｐｐｍのＮＭＲのスライスを示し、ＰＨＥの結合マトリックスにおける発見を再確認する。波数８５００から９０００ｃｍ^−１は尚もＰＨＥにとって重要である。図５Ｃは、既知のＧＬＮ化学シフト（２．４５ｐｐｍ）のＮＩＲスライスも示し、８０００ｃｍ^−１および９７００ｃｍ^−１付近のピークがＧＬＮにとって重要であることを示す。図５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、３つの異なるＮＩＲ波数：８３１２（ＣＨ_２）、８６５５（芳香族）および９８８２ｃｍ^−１（アミン）に沿ってのＮＭＲプロファイルを示す。各図は、どの化合物がその特定の波数で重要かを示す。図５ＤはＧＬＮが、その正の符号と８３１２ｃｍ^−１の高振幅のため、明らかに重要であることを示す。

【0105】

図６Ａ〜Ｆは、グルコースの類似の結果を示す。図６Ａは、グルコース濃度をＰＬＳモデルのＹブロックとして用いた、結合マトリックスの画像である。図６Ｂと６Ｄでは、ＮＩＲプロファイルは、３．９１ｐｐｍと３．４９ｐｐｍでグルコースとの高い相関を示しているが、これらはグルコースの化学シフトとして知られる。ＮＩＲプロファイルは高い正の振幅を有するので、特に８，４００および１０，０００ｃｍ^−１のＮＭＲ化学シフトと高い相関を示す（ＣＨとＣＨ_２ＯＨ；Workman Jr., J.; Weyer, L. Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy, 1^st ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, 2008）。

【0106】

逐次ＰＬＳ
回帰ベクトルとＶＩＰをＧｌｎ、グルコースおよびＰｈｅのＮＭＲとＮＩＲを用いて得られた３ＬＶ逐次ＰＬＳモデルから抽出した。２つのアレイを展開してから乗じ、結合アレイを計算し折り畳んで図２８Ａに示すようにプロットした。結合画像は、ＮＭＲ化学シフトがＮＩＲ波数と相関する部位を示す。

【0107】

図２８−Ｂは、グルコースの化学シフトとの正の相関を示す、９３５０ｃｍ^−１のＮＭＲ軸のスライスを示す。このバンドは水素結合したＯ−Ｈのバンドとして知られるので、グルコースと相関しているのは確かである。同様に、図２８−Ｃは、Ｐｈｅの化学シフトとの正の相関を示す、８７４４ｃｍ^−１のＮＭＲ軸のスライスを示す。このバンドはＣ−Ｈ芳香族バンドとしても知られる。さらに、図２８−Ｄは、Ｇｌｎの化学シフトとの相関を示す、８３５５ｃｍ^−１のＮＭＲ軸のスライスを示す。このバンドはＣ−Ｈ_２メチレンバンドとしても知られ、Ｇｌｎはこのバンドで確かに吸収を有する。同様に、図２８−Ｅと２８−Ｆは、それぞれ２．１４ｐｐｍ（Ｇｌｎピーク）と７．４３ｐｐｍ（Ｐｈｅピーク）のＮＩＲのスライスを示す。このことは、図４ＣでＰｈｅおよび図５ＣでＧｌｎについて示したＯＰＡの結果をさらに確証する。逐次ＰＬＳとＯＰＡはいずれもＧｌｎ、グルコースおよびＰｈｅのＮＭＲスペクトルと相関のあるＮＩＲのいくつかの重要な部位を強調している。

【0108】

逐次ＰＬＳの結果は図３５にも提供されている。回帰ベクトルとＶＩＰをｇｌｎ、グルコースおよびｐｈｅの混合物のＮＭＲとＮＩＲを用いて得られた逐次ＰＬＳモデルから抽出した。２つのアレイを乗じて結合アレイを計算し、プロットして図３５−Ａに示した。結合画像は、ＮＭＲ化学シフトがＮＩＲ波数と相関する部位を示す。

【0109】

結合した回帰ベクトル−ＶＩＰマトリックスを１つの画像とみなすと、より多くの情報がアクセス可能になる。図３５−Ａは、ＮＩＲ波数と相関するＮＭＲの化学シフトを強調する逐次ＰＬＳから得られた回帰とＶＩＰの結合画像を示す。この画像のスライスを採取して図３５−Ｂおよび図３５−Ｃに示した。図３５−Ｂは、ＮＭＲ軸のスライスを示す。Ｇｌｎは特徴的ＮＭＲピークを２．１５ｐｐｍに有し、青色で示されている。同様に、グルコースは独特のＮＭＲ化学シフトを３．４９ｐｐｍに有し緑色で示されている。Ｐｈｅも芳香族領域において７．３４ｐｐｍに特徴的な化学シフトを有し、赤色で示されている。Ｇｌｎのプロファイルは４３７６ｃｍ−１で正の相関を示し、これはＣＯＮＨ_２の吸収バンドである。Ｇｌｎの構造観察から、これはアミノ酸に存在するアミン基の固有の吸収度であろう。また、gｌｎとの正の相関を強調している４２３５ｃｍ−１に存在するＮＩＲピークは、gｌｎ構造においても明らかであるＣ−Ｈメチレン基によるものとわかっている。図３５−Ｂに緑色で示したグルコースのプロファイルはまた、ＣＨ−ＣＨ_２相互作用並びにＣＨ−ＣＣ領域においてそれぞれ４３１２ｃｍ−１と４１１２ｃｍ−１で類似の正の相関を示す。さらに、図３５−Ｂに赤色で強調したＰｈｅのプロファイルは、Ｐｈｅの構造に見られＣＨ−芳香族領域として知られる４０５６ｃｍ−１と４６２３ｃｍ−１の領域において正の相関を示す。この相関は、gｌｎを青色で、グルコースを緑色で、pｈｅを赤色で表す吸収度バンドを示した図３５−ＣのＮＩＲスライスを観察しても確認できる。ＧｌｎはＮＭＲ化学シフトを２．１５、２．４５および３．７８ｐｐｍに有する。４２２７ｃｍ−１のＮＩＲスライスを分析すると、ｇｌｎの化学シフトは正の相関に見えるが他の全ての化学シフトはそうではない。グルコースの化学シフトも緑色で強調されて４１１０ｃｍ−１のＮＩＲ吸収において正の相関を有し、ｐｈｅの化学シフトは特に芳香族領域（７．３４ｐｐｍ）で４０６０ｃｍ−１で正の相関を有することが示されている。従って、この方法は、更なる化学的濃度の知識や化合物の情報なしに、どの吸収バンドがどの化合物と相関しているか、およびそれらの個々の化学シフトを強調する正確かつ特定の方法を提供する。

【0110】

逐次ＰＬＳモデルは予測ＮＩＲスペクトルも生成する。各波長の平均予測ＮＩＲスペクトルを図７に示す。図２Ｂの元ののＮＩＲスペクトルと比較すると、予測スペクトルにおいて信号対雑音比が改善され、強度パターンが大幅に再編成されていることがわかる。元のスペクトルに見出されるよりも、予測されたＮＩＲ強度の方が不同性の値でクラスター形成が多い。

【0111】

ＮＭＲをＮＩＲと組み合わせて使用してＮＩＲスペクトルを予測する影響を表３に示す。元の前処理済スペクトルの代わりに予測ＮＩＲスペクトルを用いることで、より良いピアソンの相関係数または過適合の低下、またはその両方のＰＬＳモデルが生成された。表３は、モデルＲ^２、キャリブレーション平方根平均二乗誤差（ＲＭＳＥＣ）、交差確認平方根平均二乗誤差（ＲＭＳＥＣＶ）の値を示し、潜在変数（ＬＶ）の数も含む。全３つの化合物の場合、ＲＭＳＥＣとＲＭＳＥＣＶの値が共に近かったので、予測ＮＩＲスペクトルを元のデータの代わりに使用すると高品質のより良いフィッティングモデルが示された。また、予測ＮＩＲスペクトルを使用すると、より多くの潜在変数（ＬＶ）を確保する能力が得られたので最小限の誤差でより包括的なモデルが得られた。

【0112】

【表3】

【0113】

ＤＭＥＭ例
図８は、ＤＭＥＭのＮＭＲとＮＩＲの生のおよび前処理済スペクトルの組を示す。１．７から２．６ｐｐｍのＮＭＲ領域を外積分析に使用し、４０００と５０２９ｃｍ^−１の間の領域をＮＩＲに使用した。

【0114】

図９Ａは、ＮＩＲ−ＮＭＲの外積結果のＰＬＳから得られたＤＭＥＭの回帰ベクトルとＶＩＰの結合とタンパク質収量の画像を示す。図９Ｂは、２．４４ｐｐｍのＮＭＲを示すが、これは既知のＧＬＮの化学シフトであり、４５００ｃｍ^−１と４７００ｃｍ^−１の間のＮＩＲ領域における高い正の相関を示す。図９Ｃは１．９２ｐｐｍの別のＮＭＲスライスを示し、４７９０ｃｍ^−１から４８５０ｃｍ^−１のＮＩＲ領域において高い負の相関を有する。図９Ｄと９Ｆは、それぞれ４２９６．９ｃｍ^−１と４８２４．４ｃｍ^−１のＮＩＲスライスを示し、１．９２ｐｐｍのＮＭＲピークとの高い負の相関を表している。このことは、この特定のＮＭＲシフトがそれらの２つのＮＩＲ吸収領域と負の相関関係にあることを示す。同様に、図９Ｅは４６５３．７ｃｍ^−１のＮＩＲスライスを示し、２．４４ｐｐｍと２．１ｐｐｍのＧＬＮのピークとの高い正の相関関係を表している。

【0115】

外積分析（ＯＰＡ）の結果
図２９〜３１は、Ｐhe、ＧlnおよびグルコースについてＯＰＡ−ＰＬＳモデルおよび結合した表示を使用してＮＭＲ−ＮＩＲの相関領域を特定する例示である。

【0116】

図２９Ａは、外積をＸブロックとしＧｌｎ濃度をＹブロックとするＰＬＳ由来の回帰と変数重要度の画像を乗じて得られたＶＩＰと回帰マトリックスの結合画像を示す。図２９Ａでは、強度はＮＩＲでは４０１０、４３２５、４３８０および４７６２ｃｍ^−１、ＮＭＲでは２．１５、２．４５および３．７８ｐｐｍの領域内の部位で増加する。このことは、図２９ＢのＧｌｎのスライスの高強度を観察しても明らかである。他の全てのスライスの強度はより低く、これは、それらがグルコースとＰｈｅの特徴だからである。同様に、図２９Ｃでは、Ｇｌｎの化学シフト（２．１５ｐｐｍ）に対応するＮＩＲスライスは、グルコースとＰｈｅに関する他の全てのスライスのうち最も高い強度を有する。また、特定の伸長するＮＩＲバンドがＮＩＲから観察されたが、それらはＧｌｎの構造中に示される異なる結合に対応する（図２９）。例えば、ＣＯＮＨ_２の特徴である４３８０ｃｍ^−１の吸収は、Ｇｌｎでは最高強度で明白に見られる。これはＧｌｎに特有でもあるが、それは、この混合物中それが唯一のＣＯＮＨ_２化学構造を有する化合物だからである。

【0117】

図３０Ａは、グルコース濃度をＹブロックとして得られたＯＰＡ−ＰＬＳの結合プロットを示す。相関強度は、ＮＩＲ領域４０１１、４１０８、４３２２および４４６９ｃｍ^−１並びに既知のグルコースのＮＭＲ化学シフトで最高である。図３０から、４１０８ｃｍ^−１に関連のＮＭＲスライスは、その波数とグルコースの化学シフトの高い相関を確認する最も高い強度を有する。このＮＩＲスペクトルの領域は、ＣＨ伸長の吸収バンドとして知られている。図３０Ｃは、結合プロットのＮＩＲスライスを示す。このプロットでは、最も高い相関がＣＨ２−ＣＨの伸長領域（４３２２ｃｍ^−１）並びにＣ−Ｏ−Ｃ領域（４０１１ｃｍ^−１）に存在しており、いずれも図３０に示すグルコースの構造において明らかである。

【0118】

図３１Ａは、Ｐｈｅ濃度をＹブロックとするＯＰＡ−ＰＬＳから得られた結合プロットを示す。ＮＩＲの高強度領域は、４０６５、４２６８、４６２９および４６７７ｃｍ^−１であり、ＰｈｅのＮＭＲ化学シフト信号を強調している。Ｐｈｅは特徴的なＮＭＲピークを芳香族領域（７．１５ｐｐｍ）に有することが知られている。このことは、ＣＨ芳香族ベンゼン環に特定の吸収度を有するであろうＮＩＲスペクトルにも反映される。図３１Ｂは、ＮＭＲピークが芳香族の４０６０ｃｍ^−１のＮＩＲ吸収で最高であるが、グルコースとＧｌｎ領域では強度が大幅に低いことを示す。図３１Ｃは、これらのＮＩＲ吸収がＰｈｅのＮＭＲ化学シフトに関連があるという事実も強調するが、それは最高強度が７．１５ｐｐｍのＮＩＲスライスに属するからである。このことは、ベンゼン環並びにＮＩＲスペクトルで強調されるＣＨ２−ＣＨ結合の伸長を有する（４２６８ｃｍ^−１）図３１に表示のＰｈｅの構造でも明らかであり得る。

【0119】

図３２は、各ＯＰＡ−ＰＬＳ結合グラフから得たプロファイルを示す。各ＮＩＲプロファイルは、３つの化合物のうちの１つに関連のあるＮＭＲピークを通じて採取した。Ｇｌｎは２．１５ｐｐｍで採取し、グルコースは３．４９ｐｐｍで採取し、Ｐｈｅは７．３４ｐｐｍで採取した。図３２ではＮＩＲプロファイル間の区別は明白である。例えば、ＧｌｎはＣＯＮＨ_２の高いピークを有し、グルコースはそのすぐ隣のＣＨ２−ＣＨ伸長バンドの高いピークを有する。Ｐｈｅは、図内でも明瞭に観察されるＣＨ芳香族領域に独特の信号も有する。

【0120】

結論
外積分析または逐次ＰＬＳを用いるデータ融合は、典型的には生物製剤の細胞培養培地に使用される単純な混合物と複雑な混合物の両方の栄養剤の特定の化学成分にＮＩＲ吸収バンドを割り当てる強力な手法である。回帰とＶＩＰ画像を組み合わせることにより、これらのベクトルのより典型的な単独の分析法よりも優れた選択性と直観的理解が可能になる。

【0121】

ＮＩＲとＮＭＲ間の逐次ＰＬＳは、ＮＩＲスペクトルの予測能力を改善する。ＮＭＲの水抑制と粉末ＮＩＲスペクトルを組み合わせることで、ＮＩＲにおいて水信号を強調解除し、より強力なモデルが可能になる。

【実施例2】

【0122】

プルロニックＦ６８のデータ融合
バイオリアクターでの細胞培養には高生産性を得るために酵素を要する。しかし、空気が入ったり撹拌されると、気泡が同調細胞を溶解し得るので細胞が損傷することがあり、生存細胞数が減少し収量が低下する。細胞の気泡への接着を低減するために、一般に界面活性物質がバイオリアクター工程に添加される。しかし、界面活性物質の構造の差異（例えば、ロット間のばらつき）は、界面活性物質と気泡間の結合自由エネルギーの差異をもたらし得るので、試薬が細胞を保護する能力が変更される。

【0123】

表４は、およそ５年に渡る実動運転を用いた２つの大規模製造工場の平均収量を要約している。プルロニックＦ６８のロット間には微妙な収量差が見られる。ＮＩＲまたは融合したＮＩＲとＮＭＲスペクトルと比較した収量データを評価し、プルロニックＦ６８ロットのどの特徴がこれらの差異に影響を及ぼしたかを決定した。

【0124】

【表4】

【0125】

方法:
各プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦ）ロットの一部分を１％のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有する重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）中に溶解させた。ＣＤＣｌ_３中プルロニックの最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。ＮＭＲにおける関心領域は図３７に示すように０．５〜５ｐｐｍの間で選択した。ＮＭＲスペクトルをラインナップ（Ｌｉｎｅｕｐ）を用いて前処理し、化学シフトを揃えた。さらに、スペクトルを加重最小二乗法（ＷＬＳ）を用いてベースライン補正してから図３８に示すように平均中心化した。粉末プルロニックＦ６８試料のＮＩＲスペクトルも、２ｃｍ^−１の分解能と１２８スキャンを用いて得た。図３９に示すように、結合バンドのみを選択した（４０００〜４８００ｃｍ^−１）。スペクトルは、拡張多重散乱補正アルゴリズム（ＥＭＳＣ）を用いて前処理してから図４０に示すように平均中心化した。

【0126】

逐次ＰＬＳ結合ベクトルの結果
回帰ベクトルと変数重要度プロット（ＶＩＰ）を逐次ＰＬＳモデルから抽出して図４１に示した。得られたプロットは４２００〜４４５０ｃｍ−１の間のバンドと３．６ｐｐｍの化学シフトにおいてＮＭＲとＮＩＲの高い相関を示す。ＮＭＲ分析によると、３．６ｐｐｍの化学シフトは、図３６に示すプルロニックＦ６８分子の主鎖上のメチレン基による。従って、このグラフは、４２００〜４４５０の間のＮＩＲバンドは主鎖のメチレン基の吸収に対応することを示唆している。

【0127】

プルロニックＦ６８外積分析
プルロニックＦ６８のＮＭＲとＮＩＲスペクトルについて外積分析を実行した。スペクトルは外積前処理アルゴリズム（尺度化と移動）を用いてさらに処理した。次いで２８０ｎｍの亜鉛総吸収度をＹブロックとして、展開プルロニックＮＩＲ−ＮＭＲデータ群をＸブロックとして用いＰＬＳモデルを計算した。得られた回帰ベクトルとＶＩＰベクトルを次いで結合して図４２に表示の結合プロットを生成した。該結合プロットは、３．６ｐｐｍのＮＭＲ領域とＮＩＲ軸の４２００〜４４５０ｃｍ^−１の領域でＹブロックとの強い相関があることを示す。

【0128】

ＮＩＲオンリーモデルにおける波長選択
４２００〜４４５０ｃｍ^−１のＮＩＲ吸収バンド間の高い相関についての情報は、将来的にはＮＩＲオンリーモデルで波長選択として使用され得る。ＮＩＲの重要な部分はＮＭＲによってメチレン基に関すると強調され特定されたので、ＮＩＲモデル対収量は、４２００から４４５０ｃｍ^−１の間の領域のみに縮小され得る。表５は、波長選択モデル使用間の利点を示す。第１モデルは、４０００から９５００ｃｍ^−１の間の全ＮＩＲスペクトルを使用したが、水と水蒸気の領域は削除した。第２モデルは、外積結果により推奨された領域（４２００〜４４５０ｃｍ^−１）のみ使用した。両モデルとも同じ前処理（ＥＭＳＣと平均中心化）を使用した。

【0129】

【表5】

【0130】

表５は、波長選択を用いる新規ＮＩＲオンリーモデルは、同じＲ２と誤差を含むが、少ない潜在変数を用い、使用ポイント数が９５％削減されることを示す。このことはより強力で反復可能なモデルを生成するので、ＮＭＲにまた頼ることのないＮＩＲオンリーモデルのより多くのルーチン試験への将来的有用性を保証するものである。ＮＩＲオンリーＰＬＳモデルでは、新しい確証ロットはモデルの信頼水準の外側にあるので、性能予測の結果は同様に正確でも強力でもない。図４４では、同じ組のプルロニック新ロットが９５％信頼水準の内側にあるので、該モデルは確証され、新ロットの性能について予測することができる。該モデルで使用するポイント数も９５％削減されるので、あまり計算能力または時間を必要としないがより解釈可能な結果を付加する簡易モデルを生成する。

【実施例3】

【0131】

外積融合実行前のスペクトルデータ融合
この実施例は、２つの次元の乗算前のスペクトル処理が非常に有用であり得ることを示す。第１セットは、古典的な方法を用いて前処理したが標準化や尺度化はしなかったデータ群の比較に関する。第２セットは、同じ古典的な方法を用いた同じスペクトルに関するが、さらに１に標準化し、強度範囲を０〜１の間で尺度化した。

【0132】

スペクトルデータは、濃度の異なるグルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびグルコースを含む実験のものである。近赤外線（ＮＩＲ）のほかにプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）も獲得した。次いでデータを融合に用い、２つの処理法間の大きな差異が実証された。標準化と尺度化ステップの付加により、外積から展開したデータ群のモデリングに大幅な改善がもたらされる。

【0133】

前処理の古典的な方法は平均中心化ステップを含むので、正のスペクトルデータは全て負の成分をもつようになる。このことは、スペクトルにおける主要な差異を強調し、分解に必要な主要成分の数を減少させる利点はあるが、平均中心化スペクトルの外積がノイズをもたらすのでモデルの性能が低下する。

【0134】

外積分析を実行して得られた３次元マトリックスを展開し、第１次元がスペクトル情報で第２次元が試料数のキューブを生成した。次いで表示^１のように展開データに対し主要成分分析（ＰＣＡ）と部分最小二乗法（ＰＬＳ）を実行した。

【0135】

改善度を評価するために、ＰＬＳモデルの外積マトリックスの標準化と尺度化ありとなしの結果を表示する。拡張多重散乱補正（ＥＭＳＣ）と平均中心化（ｍｎｃｎ）を用いて処理し、次いで１５ポイントの平滑化でＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いて平滑化したＮＩＲスペクトルを図４５に示す。図４６は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法の１５ポイント平滑化のほか荷重最小二乗法（ＷＬＳ）とｍｎｃｎを用いてベースライン補正した後のＮＭＲスペクトルを示す。

【0136】

最初に平均中心化しておいた外積展開マトリックスのＰＬＳ分析実行後、以下図４７に示すベネチアンブラインド交差確認から示唆されるように、２つの潜在変数のみをモデルで使用することができた。モデルは、ＲＭＳＥＣ値が０．２３１、ＲＭＳＥＣＶ値が０．２６８、Ｒ^２値が０．４７であった。

【0137】

潜在変数スコアはこのモデルでは十分に分離されていない。図４８の潜在変数スコアと予測プロットに示されるように、予測プロットは大きな誤差を含んでいる。一方、ＮＩＲとＮＭＲの標準化および尺度化スペクトルに対して実行したＰＬＳモデルをそれぞれ図４９と５０に示す。スペクトルの強度を１に標準化し、強度値の範囲が０から１の間になるように尺度化した。

【0138】

ＰＬＳモデルは、図５１に示すベネチアンブラインド交差確認ＰＲＥＳＳプロットにより正当化されるように、４成分を用いて計算した。得られたモデルはＲＭＳＥＣ値が０．０１、ＲＭＳＥＣＶ値が０．０１３、Ｒ^２値が０．９９９であった。

【0139】

モデルの詳細は図５２に明らかにされており、潜在変数スコア間の良好な分離が示され、非常に精確な予測値対実測値プロットが得られる。表６は、２つの処理のＲＭＳＥＣ、ＲＭＳＥＣＶおよびＲ２の値を示し、外積を実行する前の標準化と尺度化の利点をさらに例示する。

【0140】

【表6】

【0141】

参照文献
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(31) Workman Jr., J.; Weyer, L. Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy, 1 ed.; CRC Press: Boca Raton, FL, 2008.

【0142】

対応特許
上述の明細書は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられる。提供された例は本発明の一態様の一つの例示を意図するので、本発明の範囲はそれらの例により限定されるものではなく、他の機能的に同等の実施形態は本発明の範囲内である。本明細書に示し記載したものに加えて本発明の様々な変形が上記明細書から当業者には明らかになり、それらは添付の特許請求の範囲内に含まれよう。本発明の利点と目的は本発明の各実施形態に必ずしも包含されるわけではない。

【0143】

本願全体で引用される全ての参照文献、特許および公開特許出願の内容は、その全容が、特に本明細書に参照される使用または主題について、本明細書に参照として組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】