特許 6198199 平行線維性結合組織の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6198199

(24)【登録日】2017年9月1日

(45)【発行日】2017年9月20日

(54)【発明の名称】平行線維性結合組織の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20170911BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20170911BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170911BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170911BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20170911BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20170911BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20170911BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20170911BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20170911BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0775

   C12N5/077

   C12N5/10

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/47

   A61K35/28

   A61K38/39

   A61K31/7088

   A61P19/04

【請求項の数】20

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2015-505133(P2015-505133)

(86)(22)【出願日】2013年3月12日

(86)【国際出願番号】JP2013056867

(87)【国際公開番号】WO2014141392

(87)【国際公開日】20140918

【審査請求日】2016年3月11日

(73)【特許権者】

【識別番号】511264696

【氏名又は名称】津留 美智代

(73)【特許権者】

【識別番号】511264700

【氏名又は名称】永田 見生

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】津留 美智代

(72)【発明者】

【氏名】永田 見生

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 Matrix Biol.，２００７年，Vol.26, No.2，pp.140-3

【文献】 J. Cell Biol.，２００９年，Vol.187, No.5，pp.669-83

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養すること、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法（但し、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を３次元培養に付すこと、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む態様を除く）。

【請求項2】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養が、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を培養することにより行われる、請求項１記載の製造方法。

【請求項3】

間葉系幹細胞の培養が、３次元培養により行われる、請求項１記載の製造方法。

【請求項4】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞をＴＮＦ−αを含む培地中で培養すること、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法。

【請求項5】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を亜鉛イオンを含む培地中で培養すること、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法。

【請求項6】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞をＴＮＦ−α及び亜鉛イオンを含む培地中で培養すること、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法。

【請求項7】

ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養が、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を培養することにより行われる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項8】

間葉系幹細胞の培養が、３次元培養により行われる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項9】

ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞。

【請求項10】

（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物（但し、ＰＲＥＬＰ発現ベクター、間葉系幹細胞、及び３次元培養用担体を含む態様を除く）。

【請求項11】

更に、３次元培養用担体を含む、請求項１０記載の組み合わせ物。

【請求項12】

請求項９記載の間葉系幹細胞、或いは請求項１０又は１１記載の組み合わせ物を含む、平行線維性結合組織製造用キット（但し、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞及び３次元培養用担体を含む態様を除く）。

【請求項13】

（Ｉ）（ａ）ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞；或いは
（ｂ）（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物；並びに
（ＩＩ）ＴＮＦ−αを含む培地
を含む、平行線維性結合組織製造用キット。

【請求項14】

（Ｉ）（ａ）ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞；或いは
（ｂ）（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物；並びに
（ＩＩ）亜鉛イオンを含む培地
を含む、平行線維性結合組織製造用キット。

【請求項15】

（Ｉ）（ａ）ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞；或いは
（ｂ）（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物；並びに
（ＩＩ）ＴＮＦ−α及び亜鉛イオンを含む培地
を含む、平行線維性結合組織製造用キット。

【請求項16】

３次元培養用担体を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項17】

請求項９記載の間葉系幹細胞を含む、靭帯損傷治療剤。

【請求項18】

ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを含む、平行線維性結合組織形成促進剤。

【請求項19】

平行線維性結合組織が靭帯である、請求項１８記載の剤。

【請求項20】

ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを含む、靭帯損傷治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、平行線維性結合組織の製造方法に関し、詳しくは、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養することを含む、平行線維性結合組織の製造方法に関する。また、本発明は、平行線維性結合組織の製造に有用な、細胞、組み合わせ物、キットに関する。更に、本発明は、靭帯損傷の治療剤等を提供する。

【背景技術】

【0002】

靭帯損傷は、関節を支える靭帯へ、スポーツ外傷や交通事故等によって異常な力が加わり、靭帯が裂けたり、切断したりすることにより生じる損傷である。重度の靭帯損傷を治療する場合には、損傷した箇所へ靭帯を移植する必要があるが、靭帯を人工的に再生する技術は未だ開発されていないため、正常な他の靭帯の一部を摘出して移植に供する必要があり、結果として正常な靭帯をも傷めてしまうことになる。そのため、人工的にインビトロで靭帯を再生する技術の開発が望まれている。

【0003】

一方、Proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein（ＰＲＥＬＰ）は、結合組織細胞外マトリクスに含まれるタンパク質である。ＰＲＥＬＰは、基底膜をその下層の結合組織にアンカーする分子として機能することが知られている。ＰＲＥＬＰは、Ｉ型コラーゲンを基底膜に、ＩＩ型コラーゲンを軟骨へ結合させることが示されている。ＰＲＥＬＰは、基底膜ヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンへも結合することが報告されている。ＰＲＥＬＰは、Hutchinson-Gilford progeria (HGP)の病態に関与することが示唆されており、この疾患の患者では、基底膜及び軟骨におけるコラーゲンの結合が欠失していることが報告されている。

【0004】

ＰＲＥＬＰは、関節内の間葉系幹細胞において発現が亢進していることが報告されている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Journal of Orthopaedic Research, 27:435-441, 2009

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、靱帯等の平行線維性結合組織をインビトロで製造する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、ヒト脊柱靭帯骨化組織の二次元電気泳動パターンをヒト骨組織のそれと比較し、靭帯に特異的に発現するタンパク質としてＰＲＥＬＰを見出した。この遺伝子をマウス間葉系幹細胞に導入し、得られたトランスフェクタントを３Ｄゲル上で培養したところ、驚くべきことにＩ型コラーゲンを含む、靱帯組織様の平行線維性結合組織が形成されることを見出し、更に検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。

【0008】

即ち、本発明は、下記の通りである。
［１］ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養すること、及び培養物から平行線維性結合組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法。
［２］ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養が、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を培養することにより行われる、［１］記載の製造方法。
［３］間葉系幹細胞の培養が、３次元培養により行われる、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養が、ＴＮＦ−αを含む培地中で行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養が、亜鉛イオンを含む培地中で行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法により製造された、平行線維性結合組織。
［７］ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞。
［８］ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞、及び３次元培養用担体を含む組み合わせ物。
［９］（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物。
［１０］更に、３次元培養用担体を含む、［９］記載の組み合わせ物。
［１１］［７］記載の間葉系幹細胞、又は［８］〜［１０］のいずれかに記載の組み合わせ物を含む、平行線維性結合組織製造用キット。
［１２］［６］記載の平行線維性結合組織、又は［７］記載の間葉系幹細胞を含む、靭帯損傷治療剤。
［１３］ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを含む、平行線維性結合組織形成促進剤。
［１４］平行線維性結合組織が靭帯である、［１３］記載の剤。
［１５］ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを含む、靭帯損傷治療剤。
［１６］哺乳動物へ、［６］記載の平行線維性結合組織、又は［７］記載の間葉系幹細胞を移植することを含む、当該哺乳動物における靭帯損傷の治療方法。
［１７］哺乳動物へ、ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを投与することを含む、当該哺乳動物における平行線維性結合組織の形成を促進する方法。
［１８］平行線維性結合組織が靭帯である、［１７］記載の方法。
［１９］哺乳動物へ、ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクターを投与することを含む、当該哺乳動物における靭帯損傷の治療方法。
［２０］靭帯損傷の治療において使用するための、［６］記載の平行線維性結合組織、又は［７］記載の間葉系幹細胞。
［２１］平行線維性結合組織の形成促進において使用するための、ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター。
［２２］平行線維性結合組織が靭帯である、［２１］記載のＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター。
［２３］靭帯損傷の治療において使用するための、ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、インビトロの系で靱帯様の平行線維性結合組織を製造することができる。これにより、人工靱帯の作製が可能となり、スポーツ選手などの靭帯断裂による運動障害などの治療に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ウェスタンブロッティングによる、ＰＲＥＬＰ発現ベクターを導入した間葉系幹細胞の培養上清中のＰＲＥＬＰの検出。

【図2】ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ培養開始前のｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰトランスフェクションしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞（×４）。

【図3】ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ培養後、１日目のｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰトランスフェクションしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞（×４）。

【図4】ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ培養後、２日目のｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰトランスフェクションしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞（×４）。

【図5】ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰトランスフェクションしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞により形成された平行線維性結合組織の電子顕微鏡写真。

【図6】ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターをトランスフェクトしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２マウス間葉系幹細胞の免疫組織染色像。Ｉ型コラーゲン：Alexa Fluor 488、ファロイジン：Alexa Fluor 568、及びＤＡＰＩ。

【図7】ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターをトランスフェクトしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２マウス間葉系幹細胞から誘導された線維状の靭帯様組織の免疫組織染色像。ＰＲＥＬＰ：Alexa Fluor 488、及びＤＡＰＩ。

【図8】ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターをトランスフェクトしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２マウス間葉系幹細胞から誘導された靭帯様組織の透過型電子顕微鏡像。

【図9】ヒト前十字靭帯（ＡＣＬ）、ヒト後十字靭帯（ＰＣＬ）、ヒトＯＰＬＬ組織及びヒト腱におけるＰＲＥＬＰの発現。*P<0.05、**P<0.05、***P<0.05。

【図10】間葉系幹細胞、並びにそれから誘導されたヒト靭帯様組織及びマウス靭帯様組織におけるＩ型コラーゲンの発現（ＥＬＩＳＡ）。

【図11】間葉系幹細胞、並びにそれから誘導されたヒト靭帯様組織及びマウス靭帯様組織におけるＩ型コラーゲンの発現（リアルタイムＰＣＲ）。

【図12】ＰＲＥＬＰを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＰＲＥＬＰ）の導入による、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＭＭＰ−１３及びＩ型コラーゲンの発現の抑制（ＥＬＩＳＡ）。バーは、左からＰＤＧＦ、Ｉ型コラーゲン及びＰＤＧＦを示す。*P<0.001、**P<0.001。

【図13】ＰＲＥＬＰを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＰＲＥＬＰ）の導入により、ＭＭＰ−１３及びＩ型コラーゲンの発現の抑制。

【図14】ヒト靭帯様組織、ヒトＰＣＬ組織、ヒトＯＰＬＬ組織及びヒトＡＣＬ組織におけるＩ型コラーゲンの発現（ウェスタンブロッティング）。

【図15】マウス間葉系幹細胞、及び該幹細胞から誘導された靭帯様組織におけるＩ型コラーゲンの発現（フローサイトメトリー）。

【図16】野生型マウス（ＷＴ）及びＰＲＥＬＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の骨格標本（Ａ及びＢ）及び大腿骨像（Ｃ及びＤ）。

【図17】野生型マウス（ＷＴ）及びＰＲＥＬＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の大腿骨のＢＭＤ（左）、ＢＭＣ（右）及びＴＶ（中）。*P=0.063、**P=0.058、*** P=0.071。

【図18】野生型マウス（ＷＴ）及びＰＲＥＬＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の脊髄靭帯、膝靭帯、歯周靭帯、及び皮膚組織の抗ＰＲＥＬＰ抗体による免疫組織染色像。

【図19】野生型マウス（ＷＴ）及びＰＲＥＬＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の靭帯のストレッチング解析。*P<0.05。

【図20】野生型マウス（ＷＴ）及びＰＲＥＬＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ）の血及び尿中のＩ型コラーゲン及びＭＭＰ−１３濃度。バーは、左からＩ型コラーゲン、ＭＭＰ−１３を示す。*P<0.05。

【図21】ＰＲＥＬＰを導入したマウス間葉系幹細胞から調製した、靭帯様組織とヒト骨芽細胞との融合。セルサイクルの静止期（Ａ）及び分裂中期（Ｂ）を示す。

【図22】ニワトリの靭帯と骨組織との間の癒着領域における、ＰＲＥＬＰ（Alexa Fluor 488）及びＩＩ型コラーゲン(Alexa Fluor 555)の発現。

【図23】pPyCAG-cHA-IpacflexEGFP-PRELPを含む培養液中で培養し、修復されたニワトリから前十時靭帯。ＧＦＰ蛍光（左）、ヘマトキシリン−エオシン染色（右）。

【図24】マウス間葉系幹細胞、野生型マウスの靭帯組織、ＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスの靭帯組織、及びマウス間葉系幹細胞由来靭帯組織についての、アレイ−ＧＣＨによる遺伝子発現解析。

【図25】マウス間葉系幹細胞、野生型マウスの靭帯組織、ＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスの靭帯組織、及びマウス間葉系幹細胞由来靭帯組織についての、アレイ−ＧＣＨによる遺伝子発現解析。

【図26】ＰＲＥＬＰについてのＩＰＡ。

【図27-1】ＰＲＥＬＰの発現ルートの解析。（Ａ）ＺｎＣｌ_２で処理したマウス間葉系幹細胞のNF-κB-p65発現。（Ｂ）PRELP遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞をＴＮＦ−αで処理することにより形成された靭帯様組織。PRELP遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞をＴＮＦ−αで処理してから３時間後（Ｃ）、６時間後（Ｄ）及び１２時間後（Ｅ）におけるNFκB（Alexa Fluor 555）及びPRELP（Alexa Fluor 350）の細胞内分布。

【図27-2】ＰＲＥＬＰの発現ルートの解析。10 μM（Ｆ）、30 μM（Ｇ）、及び50 μM（Ｈ）のZnCl₂で処理した、ＰＲＥＬＰ遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞のNFκB p65（Alexa Fluor 488）及びＤＡＰＩ蛍光イメージ。TNF-α（Ｉ）又はZnCl₂（Ｊ）で処理した、ＰＲＥＬＰ遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞のNFκB p65（Alexa Fluor 488）及びＤＡＰＩ蛍光イメージ。

【図28】各種の処理を施した、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰを導入したヒト間葉系幹細胞に由来する靭帯様組織におけるNF-kBIA、MEKK3、TAK-1及びTRAF6遺伝子発現。バーは左から、NF-kBIA、MEKK3、TAK-1及びTRAF6を示す。

【図29】各種の処理を施した、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰを導入したヒト間葉系幹細胞に由来する靭帯様組織におけるNF-κB-p65、-p52、-p50、及びc-Relの発現。バーは左から、NF-κB-p65、-p52、-p50、及びc-Relを示す。

【図30】TNF-αによりＰＲＥＬＰを発現したヒト間葉系幹細胞におけるTAK1、TRAF6、MEKK3、及びNFκB p65の発現。

【図31】ＰＲＥＬＰを導入したマウス間葉系幹細胞から調製した靭帯様組織による歯周ポケットの再建。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0012】

（平行線維性結合組織の製造方法）
本発明は、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養すること、及び培養物から線維組織を単離することを含む、平行線維性結合組織の製造方法を提供する。

【0013】

Proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein（ＰＲＥＬＰ）は、生体内において結合組織細胞外マトリクスに含まれる公知のポリペプチドである。

【0014】

本明細書中、ＰＲＥＬＰは通常、哺乳動物由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。ＰＲＥＬＰは、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。

【0015】

本明細書中、ポリペプチドやポリヌクレオチド等の因子について、「生物Ｘ由来」とは、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、生物Ｘにおいて天然に発現しているポリペプチド又はポリヌクレオチドと同一又は実質的に同一のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子のアミノ酸配列又は核酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該タンパク質の活性が維持されていることを意味する。

【0016】

ＰＲＥＬＰのヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒトＰＲＥＬＰ及びマウスＰＲＥＬＰの代表的なアミノ酸配列及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）は以下の通りである。尚、かっこ内は、ＮＣＢＩが提供するＧＥＮＢＡＮＫのアクセッション番号を示す。
［ヒトＰＲＥＬＰ アミノ酸配列］
配列番号２（NP_002716）：配列番号１（NM_002725 REGION: 201..1349）のポリヌクレオチドによりコード
配列番号４（NP_958505）：配列番号３（NM_201348 REGION: 191..1339）のポリヌクレオチドによりコード
配列番号６（配列番号２からシグナル配列（１−２０）を削除した（成熟型））：配列番号５（配列番号１からシグナル配列コード領域を削除）のポリヌクレオチドによりコード
配列番号８（配列番号４からシグナル配列（１−２０）を削除した（成熟型））：配列番号７（配列番号３からシグナル配列コード領域を削除）のポリヌクレオチドによりコード
［マウスＰＲＥＬＰ アミノ酸配列］
配列番号１０（NP_473418）：配列番号９（NM_054077 REGION: 164..1300）のポリヌクレオチドによりコード
配列番号１２（配列番号１０からシグナル配列（１−２１）を削除した（成熟型））：配列番号１１（配列番号９からシグナル配列コード領域を削除）のポリヌクレオチドによりコード

【0017】

本明細書中、ＰＲＥＬＰの活性とは、間葉系幹細胞へ接触させた状態で該細胞を培養することにより、平行線維性結合組織の形成を誘導する活性を意味する。

【0018】

本明細書中、「間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。

【0019】

本明細書中、間葉系幹細胞は、通常、哺乳動物由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。間葉系幹細胞は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。

【0020】

生体においては、間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織等の組織中に低頻度で存在する。間葉系幹細胞は、これらの組織から公知の方法で単離することが出来る。例えば、間葉系幹細胞は、パーコールグラディエント法により骨髄液から単離することができる（Hum. Cell, vol.10, p.45-50, 1997）。或いは、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代により間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163e171）。ヒト滑膜、半月板、関節内靭帯、筋肉、脂肪組織、及び骨髄からセルソーターで間葉系幹細胞を単離する方法が報告されている（Journal of Orthopaedic Research, 27:435-441, 2009）。また、市販された間葉系幹細胞を用いてもよい。

【0021】

本発明において用いられる間葉系幹細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれること、例えば、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。

【0022】

単離された間葉系幹細胞の純度（総細胞数に占める間葉系幹細胞の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。

【0023】

間葉系幹細胞を採取するソースとなる個体は特に制限されないが、得られる線維組織が移植医療に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者自身又はＭＨＣの型が同一もしくは実質的に同一の他個体から間葉系幹細胞を採取することが好ましい。ここでＭＨＣの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤等の使用により、該間葉系幹細胞から得られた線維組織を患者に移植した場合に移植した線維組織中に含まれる細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。

【0024】

また、製造する平行線維性結合組織の機能の強化という観点から、強靭な平行線維性結合組織を形成する遺伝的なバックグラウンドを有する同種異系の間葉系幹細胞（例えば、ヒトの場合、黒人の間葉系幹細胞）を用いることも、また好ましい。

【0025】

間葉系幹細胞は、その培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等が挙げられるが、それらに限定されない。

【0026】

本発明において、ＰＲＥＬＰと接触させた状態での間葉系幹細胞の培養方法は、特に限定されることはなく、線維組織の形成を誘導可能であればいかなる方法であってもよい。例えば、（Ａ）ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を培養する方法、（Ｂ）線維組織の形成を誘導するのに十分な量のＰＲＥＬＰ（好ましくは、単離されたＰＲＥＬＰ）を含有する培地中で間葉系幹細胞を培養する方法等を採用することができる。（Ａ）においては、導入された発現ベクターから発現したＰＲＥＬＰが間葉系幹細胞の微小環境中や培地中に放出され、これが間葉系幹細胞へ接触する。好ましくは、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を培養する。

【0027】

ＰＲＥＬＰ発現ベクターは、プロモーター及びＰＲＥＬＰをコードするポリヌクレオチドを含み、当該プロモーターは作動可能に当該ポリヌクレオチドに連結されている。当該プロモーターは、宿主である間葉系幹細胞内で転写を開始可能なものであれば特に限定されない。

【0028】

発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シルビスウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス等のウイルスベクター；ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター等の人工染色体ベクター；プラスミドベクター；宿主細胞内で自律複製可能なエピゾーマルベクター等が挙げられる。該ベクターを間葉系幹細胞に導入する場合は、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等の方法を用いることができる。

【0029】

また、発現ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合は、パッケージング細胞を利用することもできる。パッケージング細胞とは、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であって、この細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスＤＮＡを導入すると、該組換えウイルス粒子を産生するものをいう。それゆえパッケージング細胞としては、ウイルス粒子の構成に必要なタンパク質を組換えウイルスベクターに対して補給する細胞であればいかなるものも用いることができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースにしたパッケージング細胞；Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ｅ細胞、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−Ａ細胞、及び水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰｌａｔ−ＧＰ細胞等を用いることができる（Ｐｌａｔ−Ｅ細胞、Ｐｌａｔ−Ａ細胞及びＰｌａｔ−ＧＰ細胞は、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社より購入することができる）。該パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の従来公知の方法を利用することができる。

【0030】

また、発現ベクターを用いて遺伝子を導入する場合は、該遺伝子の導入を確認するため同時にマーカー遺伝子を利用することもできる。マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子全般をいい、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。また、発光酵素遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられ、発色酵素遺伝子としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。これらのマーカー遺伝子については一種又は二種以上を組み合わせて用いることができ、また、ネオマイシン耐性遺伝子とβガラクトシダーゼ遺伝子との融合遺伝子であるβｇｅｏ遺伝子等のような、二種以上のマーカー遺伝子を含む融合遺伝子も用いることができる。

【0031】

発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。

【0032】

本発明は、このようにして得られたＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞をも提供する。当該間葉系幹細胞においては、導入された発現ベクターがゲノム内に組み込まれていてもよい。このような間葉系幹細胞は、ゲノム構造において、もとの間葉系幹細胞や、天然の哺乳動物から単離された間葉系幹細胞と明確に区別され得る。また、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターを用いた場合、ゲノム上には組み込まれないが、ＰＲＥＬＰは遺伝的に安定に間葉系幹細胞内に存在し、発現され得るので、このようなベクターを用いて得られる間葉系幹細胞もまた、本発明の範囲に包含される。

【0033】

間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。

【0034】

また、該培地は、血清含有培地又は無血清培地とすることができる。無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地や血清代替試薬（例えば、KSR（Invitrogen社）等）が添加されている培地などは無血清培地に該当するものとする。

【0035】

一態様において、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地はＴＮＦ−αを含む。ＴＮＦ−αの存在下で、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養することにより、平行線維性結合組織の形成が促進されることが期待される。例えば、ＴＮＦ−αの存在下で、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養することにより、平行線維性結合組織の形成が促進され、ＴＮＦ−αの非存在下条件と比較して、平行線維性結合組織がより短時間で形成されることが期待される。一態様において、ＴＮＦ−αの存在下で、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を少なくとも２４時間培養することにより、平行線維性結合組織が形成される。

【0036】

本明細書中、ＴＮＦ−αは通常、哺乳動物由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。ＰＲＥＬＰは、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。

【0037】

ＴＮＦ−αのヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒトＴＮＦ−α及びマウスＴＮＦ−αの代表的なアミノ酸配列及びそれをコードするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）は以下の通りである。尚、かっこ内は、ＮＣＢＩが提供するＧＥＮＢＡＮＫのアクセッション番号を示す。
［ヒトＴＮＦ−α アミノ酸配列］
配列番号１４（NP_000585.2）：配列番号１３（NM_000594.3 REGION: 176..877）のポリヌクレオチドによりコード
［マウスＰＲＥＬＰ アミノ酸配列］
配列番号１６（NP_038721.1）：配列番号１５（NM_013693.2 REGION: 157..864）のポリヌクレオチドによりコード

【0038】

培地中のＴＮＦ−α濃度は、平行線維性結合組織の形成を促進する範囲で、当業者であれば適宜設定することが可能であるが、通常０．５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ程度である。

【0039】

ＴＮＦ−αは、好ましくは単離されている。単離されたＴＮＦ−αの純度（総タンパク質重量に占めるＴＮＦ−αの重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％である。

【0040】

一態様において、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）を含む。Ｚｎ^２＋の存在下で、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養することにより、平行線維性結合組織の形成が促進されることが期待される。

【0041】

培地中のＺｎ^２＋濃度は、平行線維性結合組織の形成を促進する範囲で、当業者であれば適宜設定することが可能であるが、通常１〜１００μＭ、好ましくは１０〜５０μＭ程度である。

【0042】

一態様において、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地は、ＴＮＦ−α及び亜鉛イオンを含む、ＴＮＦ−α及び亜鉛イオンの存在下で、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞を培養することにより、平行線維性結合組織の形成が強力に促進されることが期待される。

【0043】

ＴＮＦ−α及び亜鉛イオンを併用する際の各因子の濃度は、平行線維性結合組織の形成を促進する範囲で、当業者であれば適宜設定することが可能であるが、上述の濃度範囲を例示することができる。

【0044】

該培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば増殖因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、抗酸化剤、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、脂肪酸又は脂質、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、無機塩類等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。

【0045】

一態様において、間葉系幹細胞は、シャーレ、プレート、ボトル等の培養容器中で、接着培養される。

【0046】

好ましい態様において、間葉系幹細胞の培養は、３次元培養により行われる。３次元培養を行うことにより、平面での接着培養と比較して平行線維性結合組織の形成が促進される。本発明で「３次元培養」とは、ゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示すような高分子化合物を培養用の担体として使用し、必要に応じて、当該培養用担体に、細胞培養用生理活性物質を配合せしめて培養用の組成物として、それを用いて、当該培養用担体又は培養用組成物中の該高分子化合物をゲル状態にした培地中で、該ゲル物質に培養されるべき細胞及び／又は組織が包埋された状態で培養することを意味する。

【0047】

３次元培養用の担体として使用する高分子化合物としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドのブロック共重合体などに代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのエーテル化セルロース；キトサン誘導体(K. R. Holme. et al. Macromolecules, 24, 3828(1991))；プルラン誘導体（出口茂ら、Polymer Preprints. Japan. 19, 936(1990))などの変性多糖類；ポリN-置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテルなどに代表される温度感応性高分子と水溶性高分子化合物との結合体（例えば松田武久ら、Polymer Preprints. Japan. 39(8), 2559(1990))、生理的な条件下で自己重合し、微小な線維構造を有するハイドロゲルを形成するペプチドなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ等の市販品を適宜使用することができる。

【0048】

本発明においては、線維組織を形成するのに十分な期間（通常１日以上、好ましくは２日以上）、ＰＲＥＬＰと接触させた状態で間葉系幹細胞が培養される。

【0049】

本発明の工程（ｂ）における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件に準じ適宜設定することができる。例えば、培養温度は、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、通常、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。

【0050】

培養の結果、培養物中に平行線維性結合組織が形成される。本明細書中、「平行線維性結合組織」とは、膠原線維が一方向に並列配列した密性結合組織をいう。密性結合組織とは、膠原線維が線維束を作って密に配列することにより形成された結合組織をいう。膠原線維は、通常Ｉ型コラーゲンを含有する。平行線維性結合組織は靭帯組織であり得る。

【0051】

培養物とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、細胞分泌性成分等が含まれる。

【0052】

肉眼観察や顕微鏡観察等によって、平行線維性結合組織の形成を確認した後、培養物から平行線維性結合組織を単離することにより、平行線維性結合組織を得ることができる。

【0053】

こうして得られる平行線維性結合組織は、人工靱帯として、スポーツ選手などの靭帯断裂による運動障害などの治療に有用である。本発明は、上記本発明の方法により製造された平行線維性結合組織をも提供する。本発明の方法により製造された平行線維性結合組織は、骨癒合活性を有しているため、靭帯損傷の治療に好適に用いられる。

【0054】

（組み合わせ物、キット）
また、本発明は、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞、及び３次元培養用の担体を含む組み合わせ物（組み合わせ物Ｉ）を提供する。

【0055】

更に、本発明は、
（１）ＰＲＥＬＰ、又はその発現ベクター；及び
（２）間葉系幹細胞
を含む組み合わせ物（組み合わせ物ＩＩ）を提供する。

【0056】

組み合わせ物ＩＩは、更に３次元培養用の担体を含むことができる。

【0057】

ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞、組み合わせ物Ｉ及びＩＩを用いれば、上記本発明の製造方法により容易に平行線維性結合組織を製造することができる。従って、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞、組み合わせ物Ｉ及びＩＩのそれぞれを、平行線維性結合組織製造用キットとすることもできる。

【0058】

本発明のキットに含まれる各構成要素は、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解又は懸濁し、約−２０℃〜４℃で保存することができる。

【0059】

本発明のキットには、上記本発明の製造方法に用いた種々の試薬（培地、遺伝子導入用試薬等）、培養容器、試験プロトコールを記載した指示書等を含めることができる。

【0060】

本発明の組み合わせ物及びキットに関する各用語の定義は、上述の「平行線維性結合組織の製造方法」の項における各用語の定義と同一である。

【0061】

（靭帯損傷の治療剤Ｉ）
上記本発明の製造方法により製造された平行線維性結合組織を、靭帯損傷を罹患したレシピエント哺乳動物の生体内に移植すると、該平行線維性結合組織がレシピエントの靭帯損傷部位に生着し、該部位において靭帯が再生され、靭帯損傷が治療される。また、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を、靭帯損傷を罹患したレシピエント哺乳動物の生体内に移植すると、該間葉系幹細胞がレシピエントの靭帯損傷部位に生着し、該部位において平行線維性結合組織を生産することにより該部位において靭帯が再生され、靭帯損傷が治療される。従って、本発明は、上記本発明の製造方法により製造された平行線維性結合組織、又はＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を含む、靭帯損傷治療剤を提供するものである（本発明の靭帯損傷の治療剤Ｉ）。

【0062】

靭帯損傷とは、靭帯が外力や感染等によって損傷を受けた状態を意味する。靭帯損傷としては、関節の靭帯損傷（例えば、膝靭帯損傷（外側側副靭帯損傷、内側側副靭帯損傷、前十字靭帯損傷、後十字靭帯損傷など）；足首、足の甲、肘、指等における靭帯損傷など）、歯周靭帯の損傷；眼球を支える靭帯等の体内の臓器をその場所にとどめる強靭な結合組織（ゴムバンド）の損傷などを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0063】

レシピエントの哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。ＰＲＥＬＰは、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）由来のものである。

【0064】

拒絶反応が起こらないという観点から、患者自身又はＭＨＣの型が同一もしくは実質的に同一の他個体から採取された間葉系幹細胞を用いて、本発明の方法により製造された平行線維性結合組織、又は、当該間葉系幹細胞にＰＲＥＬＰ発現ベクターを導入することにより得られる細胞が、移植に好適に用いられる。

【0065】

また、形成される靭帯の機能の強化という観点から、強靭な靭帯を形成する遺伝的なバックグラウンドを有する同種異系の間葉系幹細胞（例えば、ヒトの場合、黒人の間葉系幹細胞）を用いて、本発明の方法により製造された平行線維性結合組織、又は、当該間葉系幹細胞にＰＲＥＬＰ発現ベクターを導入することにより得られる細胞を移植に用いることも、また好ましい。

【0066】

上記平行線維性結合組織や、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞を移植する方法としては、該平行線維性結合組織や間葉系幹細胞がレシピエントの靭帯損傷部位に生着し、該部位において靭帯が再生され、靭帯損傷が治療される限り、特に限定されないが、好ましくは、該平行線維性結合組織や間葉系幹細胞は、レシピエントの靭帯損傷部位に直接移植される。平行線維性結合組織の移植は、例えば、上記本発明の製造方法により得られた平行線維性結合組織のシートを、靭帯損傷部位に貼り付けることにより実施することができる。ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞の移植は、例えば、当該間葉系幹細胞を生体適合性のゲル等の担体に包埋し、これを靭帯損傷部位に移植することにより実施することが出来る。

【0067】

例えば、一部が断裂した関節における靭帯の断裂部位；靭帯断裂治療のための縫合手術部位；歯科手術、感染、加齢等により、損傷や退縮した歯周ポケット等に、上記平行線維性結合組織や、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞が移植される。

【0068】

上記平行線維性結合組織や、ＰＲＥＬＰ発現ベクターが導入された間葉系幹細胞の投与量は、靭帯損傷の程度、部位等に基づき、適宜設定することができる。

【0069】

本発明の靭帯損傷の治療剤Ｉに関する各用語の定義は、上述の「平行線維性結合組織の製造方法」、「組み合わせ物、キット」の項における各用語の定義と同一である。

【0070】

（靭帯損傷の治療剤ＩＩ）
後述の実施例に示すように、生体内においてＰＲＥＬＰを過剰発現させることにより、インビトロのみならず、生体内においても靭帯の形成が促進される。従って、本発明は、ＰＲＥＬＰまたはその発現ベクターを含む、靭帯損傷の治療剤（本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩ）を提供するものである。本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩは、生体内における平行線維性結合組織の形成促進剤としても有用である。

【0071】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩは、ＰＲＥＬＰまたはその発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。

【0072】

医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

【0073】

有効成分として、ＰＲＥＬＰの発現ベクターを用いる場合、核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩは更に核酸導入用試薬を含むことができる。また、核酸導入試薬としては、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（LipofectamineRNAiMAX）、インビボフェクタミン（Invivofectamine）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。

【0074】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩの投与単位形態としては、液剤、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾール剤などが例示される。

【0075】

治療剤（医薬組成物）中のＰＲＥＬＰまたはその発現ベクターの含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、医薬組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。

【0076】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩは、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、注射剤の場合には、靭帯損傷部位、関節腔内、静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、外用剤の場合には、皮膚ないしは粘膜などの所要部位に直接噴霧、貼付または塗布され、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、坐剤の場合には直腸内投与される。

【0077】

本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。

【0078】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩは、通常、ＰＲＥＬＰまたはその発現ベクターが、靭帯損傷部位（好ましくは、靭帯損傷部位に存在する間葉系幹細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。

【0079】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩを投与すると、ＰＲＥＬＰが靭帯損傷部位の間葉系幹細胞へ作用することにより、該靭帯損傷部位における平行線維性結合組織（例えば、靭帯）の形成が促進され、靭帯損傷治癒反応及び靭帯の再構築が促進される。

【0080】

本発明の靭帯損傷の治療剤ＩＩに関する各用語の定義は、上述の「平行線維性結合組織の製造方法」、「組み合わせ物、キット」、「靭帯損傷の治療剤Ｉ」の項における各用語の定義と同一である。

【実施例】

【0081】

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

【0082】

[実施例１]
ヒトＰＲＥＬＰ ｃＤＮＡをクローニングした。クローニングしたＰＲＥＬＰ ｃＤＮＡをＸｈｏｌ処理し、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターのＸｈｏｌサイトに挿入した。発現ベクターがデザイン通りに構築されているか確認するために、構築後のベクターを制限酵素で消化し、電気泳動パターンを確認した。その結果、予想されたパターンの泳動図が確認された。また、挿入されたｃＤＮＡ領域のシーケンス解析を行ったところ、目的とする配列（GENBANKアクセッション番号：EAW91481.1）と一致することを確認した。

【0083】

Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞（ＪＣＲＢ０００３）を１０％ＦＢＳ含むＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（Ｗａｋｏ）にて培養後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ０．０２％ ＥＤＴＡにて剥離することを繰り返すことにより、継代増殖培養をおこなった。Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞を３．５ｍｍシャーレ（ＢＤ）に７０％コンフルエントとなるまで培養後、培養液を５００μＬに調整した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）バッファー（ＤＡＫＯ）１００μＬに、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクター２．０μｇを加え、Ｍｕｌｔｉ Ｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０．０μＬを添加、混合後、室温にて３０分間静置させ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培養液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬを加え、混合後、室温にて５分静置させた。３．５ｍｍウェル１枚に２００μＬのＭｕｌｔｉ Ｆｅｃｔａｍ、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰプラスミドＤＮＡ複合体を加え、均一となるようにプレートを揺らし、３７℃、５％ＣＯ_２にて４時間培養した。培地を、新しい培養液（１０％ＦＢＳ含むＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）に交換し、更に９６時間培養後、上清中にＰＲＥＬＰタンパク質が発現していることをウエスタンブロットにて確認した（図１）。２日に１度の頻度で、培養液を交換した。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ培養開始前のｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰトランスフェクションしたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞を図２に示す。

【0084】

１週間後、シャーレに張り付いたＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２−ｃｌｏｎｅ８マウス間葉系幹細胞を０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ０．０２％ ＥＤＴＡにて剥離し、遠心回収し、細胞ペレットを５．０×１０^４個に調整し、２０％スクロース溶液１ｍＬにて洗浄し、超音波処理したＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（ＢＤ）１ｍＬを加え、素早く混合し、新たなウェル中で培養した。

【0085】

ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ中で培養を開始してから１日後において、線維状の形態を示した（図３）。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ中で培養を開始してから２日後には、ウェル全体が線維状の形態を示した（図４）。

【0086】

顕微鏡観察の結果、膠原線維が一方向に並列配列した構造が確認された（図３及び４）。電子顕微鏡下での観察でも同じ構造が確認された（図５）。形成された線維組織をＩ型コラーゲンに対する抗体を用いて免疫組織染色した結果、Ｉ型コラーゲンの発現が確認された。以上の結果から、得られた線維状の組織は、靭帯等の平行線維性結合組織であることが示唆された。

【0087】

[実施例２]
実施例１と同様に、Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２マウス間葉系幹細胞に、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターをトランスフェクトした。得られたトランスフェクタントをAlexa Fluor 488標識抗Ｉ型コラーゲン抗体、Alexa Fluor 568ファロイジン、及びＤＡＰＩを用いた免疫染色に付した（図６）。

【0088】

また、培養の結果、培養ディッシュから浮いた細胞において、線維状の形態が観察された（図７）。靭帯様組織の厚さは１５μｍ、細胞の厚さは３０μｍであった。Alexa Fluor 488標識抗ＰＲＥＬＰ抗体及びＤＡＰＩにより染色した。

【0089】

また、透過型電子顕微鏡により観察した結果、コラーゲン線維構造の存在が確認された（図８）。

【0090】

[参考例１]
ヒト前十字靭帯（ＡＣＬ）、ヒト後十字靭帯（ＰＣＬ）、ヒトＯＰＬＬ組織及びヒト腱におけるＰＲＥＬＰの発現を、リアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロッティングによりＰＲＥＬＰの発現を調べた。ＣＢＢ染色をコントロールとして用いた。ＡＣＬ、ＰＣＬ及びＯＰＬＬにおいてＰＲＥＬＰの高発現が観察されなかったが、腱においてはＰＲＥＬＰの発現は低かった（図９）。

【0091】

[実施例３]
実施例１と同様に、ヒト間葉系幹細胞及びマウス間葉系幹細胞にｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターを導入し、培養することにより、靭帯様組織を形成させた。ＥＬＩＳＡ及びリアルタイムＰＣＲによりＩ型コラーゲンの発現を調べた。
ＥＬＩＳＡは、Ｉ型コラーゲン中の分解されたアテロペプチドからのアテロコラーゲンを測定できるＥＣ１−Ｅ２０５を用いた。
リアルタイムＰＣＲは、StepOnePlus real-time PCR systemを用いたTaqMan Gene Expression Assay kitにより実施した。TaqMan PCRに用いた配列は次の通り（sequences from mouse collagen, type I, alpha 1Col1a1: Mm00801666_g1; human collagen, type I, alpha 2: Hs00164099_m1; mouse 18S ribosomal RNA, hypothetical LOC790964: Mm03928990_g1; human eukaryotic 18S rRNA: Hs99999901_s1）。それぞれのサンプルについて、Mouse 18S ribosomal RNA及びhuman eukaryotic 18S rRNA mRNAをスタンダードとして用いて、マウスCol1a1（n=21）及びヒトCol1a1（n=24）を定量した。
その結果、いずれの方法においても、間葉系幹細胞よりも、誘導された靭帯様組織においてＩ型コラーゲンの発現が高いことが示された（図１０及び１１）。

【0092】

[実施例４]
ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターを導入したマウス間葉系幹細胞におけるＰＤＧＦ及びＭＭＰ−１３の発現に対する、ＰＲＥＬＰを標的とするｓｈＲＮＡの効果を調べた。
ＰＲＥＬＰを標的とするｓｈＲＮＡのために、４つの遺伝子断片をpRNAi/LV-RNAiベクター(Biosettia, Inc)にクローニングし、ＰＲＥＬＰ発現の抑制を確認した後、上清中のコラーゲン及びＰＤＧＦ受容体発現を抑制した
sh-NM_054077 5′- AAAAGGATTAGGCGTAAACCCAATTGGATCCAATTGGGTTTACGCCTAATCC-3′（配列番号１７）
を用いた。
shRNA-lacZ, AAAAGCAGTTATCTGGAAGATCAGGTTGGATCCAACCTGATCTTCCAGATAACTGC（配列番号１８）、及び
sh-scramble, AAAAGCTACACTATCGAGCAATTTTGGATCCAAAATTGCTCGATAGTGTAGC（配列番号１９）
をコントロールとして作った。トランスフェクションについては、過剰発現のためにLipofectamine 2000 (Life Technology)を製造者のプロトコールに従い用い、shRNAのためにGene Porter (Genlantis)を用いた。ベクターが均一に分散するようにプレートをゆすり、４時間、３７℃、５％ ＣＯ_２にて培養した。培養液を新鮮な培地に交換し、混合物をさらに９６時間培養した。培養上清中のＰＲＥＬＰ発現をウェスタンブロッティングにより確認し、培養液中の産物の分泌を２日毎に確認した。培養液は２日毎に交換した。７日後、細胞は靭帯線維様構造へと変換していた。
トランスフェクトした細胞はPuraMatrix Peptide Hydrogel中で培養し、２４時間後にBioStation ID (GE Healthcare)で得た画像から、細胞が靭帯線維様構造に変換したことが確認された。
ＥＬＩＳＡは、ＰＤＧＦ−ＡＡ(R&D systems)、ＭＭＰ−１３(GE Healthcare) 及びＩ型コラーゲン（ACEL, Japan)について行った。
その結果、ＰＲＥＬＰを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＰＲＥＬＰ）の導入により、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＭＭＰ−１３及びＩ型コラーゲンの発現が抑制された（図１２及び１３）。

【0093】

[実施例５]
実施例１と同様に、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターをヒト間葉系幹細胞へ導入することにより作成した靭帯様組織におけるＩ型コラーゲンの発現を、ウェスタンブロッティングにより、ヒトＰＣＬ組織、ヒトＯＰＬＬ組織及びヒトＡＣＬ組織と比較した。
ＰＣＬ、ＯＰＬＬ、ＡＣＬと同様に、靭帯様組織はＩ型コラーゲンを発現していた（図１４）。

【0094】

[実施例６]
実施例１と同様にして作成した、マウス間葉系幹細胞由来の靭帯様組織におけるＩ型コラーゲン及び幹細胞マーカー（ＣＤ３４）の発現を、マウス間葉系幹細胞と比較した。マウス間葉系幹細胞はＣＤ３４を高発現したが、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰベクターを導入し、靭帯様組織に転換した後は、その発現は低下した。一方、Ｉ型コラーゲンの発現は、靭帯様組織に転換した後の方が高かった（図１５）。

【0095】

[実施例７]
ＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスの製造及びゲノタイピング
ＰＲＥＬＰ遺伝子（３．４ｋｂ）をｐＣＡＧＧＳのＸｈｏＩサイトにライゲートし、マイクロキャピラリー及び倒立顕微鏡を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６の受精卵の前核中に注入した。得られた新生マウスの尾組織から抽出したＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ゲノタイピングを行うことによりトランスジェニックマウスが製造されたことを確認した。

【0096】

ＰＲＥＬＰ遺伝子は、ホスホロアミダイト法を用いて合成し、ｐＣＡＧＧＳ−ＸｈｏＩのＸｈｏＩサイトにライゲートした。発現ベクターをＸｈｏ−Ｉで消化し、電気泳動パターンを確認した。挿入されたｃＤＮＡ領域の配列が、意図した配列（GenBank accession number: EAW91481.1）と一致することを確認した。得られた２０匹の新生マウスから尾組織の切片を切り出し、DNA Mini Kit (Qiagen)により、ＤＮＡを抽出した。以下のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、試料が外来遺伝子を含むか否か決定した。
R5′-GTCGAGGGATCTCCATAAGAGAAGAGGGACA-3′（配列番号２０）
F5′-GTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATC-3′（配列番号２１）
以下のＰＣＲ条件を用いた：９４℃を２分間、９８℃を１０秒、及び６８℃を４分間を３０サイクル。

【0097】

骨格サンプル
トランスジェニックマウス及び野生型の同腹仔を７０％エタノールで固定し、皮膚及び内組織を分離した。マウスを更に２日間７０％エタノールで固定した。９９．５％エタノール中で２日間脱水を行った。マウスを、アルシアンブルーを０．０５％の最終濃度で含む染色溶液である、alcian blue 8GX (JANSSEN、４０％酢酸及び６０％エタノール 容量比)中で３７℃にて５５時間インキュベートした。マウスを、９９．５％エタノール中に、室温にて２日間、浸漬し、次に２％水酸化カリウム中に、室温にて２４時間、透明になるまで浸漬した。アリザリンレッドを０．００５％の最終濃度で含む染色溶液であるalizarin red S (Kodak, C1051) １％ ＫＯＨ中で、室温にて４時間インキュベートし、次に脱色液（１％ ＫＯＨ、２０％ グリセロール）中に、室温にて一晩浸漬した。マウスは保存液（５０％エタノール及び５０％グリセロール）中で保存した。エタノール、酢酸、グリセロール、及び水酸化カリウムの高級試薬は岸田化学から購入した。

【0098】

アルシアンブルー及びアリザリンレッドで染色した４週齢マウスの骨格標本を図１６Ａ（野生型）及びＢ（ＰＲＥＬＰ Ｔｇ）に示す。

【0099】

三次元計算断層撮影骨密度解析
トランスジェニックマウスを吸入麻酔している間に、骨密度及び骨ミネラル密度計測を、３Ｄ微計算断層撮影（Rigaku）を用いて行い、ＲＡＴＯＣソフトウェア（RATOC System Engineering）により解析した。ファントム(S/N: 1101-52)を、コントロールとして用いた。骨密度解析を大腿骨の３Ｄ−ＣＴを行うことにより実施したが、野生型マウスとＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスとの間に、ＢＭＤ、ＢＭＣ及びＴＶの差は認められなかった。トランスジェニックマウスからの骨格サンプルについては、骨組織の変化は観察されなかった（図１７）。

【0100】

靭帯組織の解析
本発明者らは、ＰＲＥＬＰ遺伝子トランスジェニックマウスを作出した（n=4）。脊髄靭帯、膝靭帯、歯周靭帯、及び皮膚組織の画像から、ＰＲＥＬＰ遺伝子トランスジェニックマウスにおいては、対応する野生型マウスからの組織よりも、より完全な靭帯であることが明らかとなった（図１８）。ウサギ抗ＰＲＥＬＰ抗体（Sigma Aldrich; SAB1100370）を一次抗体、Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた免疫組織染色を行った。ＤＡＰＩを核染色に用いた。染色後、組織をＣＳＬＭ（Olympus FluoView FV 1000-D）下で観察した。

【0101】

靭帯ストレッチング解析
トランスジェニックマウス及び野生型マウスからの脊髄靭帯組織をSTB-CH-10ストレッチングシステム(Strex Inc)を用いて、固定負荷条件下で伸ばし、三分の一、二分の一、及び完全に靭帯断裂するまでの時間を計測した。靭帯断裂までの時間は、野生型マウスの靭帯線維よりも、トランスジェニックの方が長く、トランスジェニックマウスの靭帯組織の方がより強かった（図１９）。

【0102】

トランスジェニックマウス及び野生型マウスの血中及び尿中Ｉ型コラーゲン及びＭＭＰ−１３
血液及び尿解析の結果、血液中のＩ型コラーゲンの量はトランスジェニックマウスと野生型マウスとで同等であることが判明した。しかしながら、トランスジェニックマウスの尿においてアテロコラーゲン濃度が高かった（図２０）。この結果から、ＰＲＥＬＰの過剰発現により、Ｉ型コラーゲンの高発現が生じ、尿への排泄が増えたことが示唆された。また、ＭＭＰ−１３の濃度は、血中及び尿中とも、トランスジェニックマウスの方が高かった（図２０）。

【0103】

[実施例８]
骨性癒着及び靭帯再構築
靭帯は骨組織と連結し、骨−骨連結を形成するので、実施例１と同様の方法により製造されたマウス間葉系幹細胞由来靭帯様組織をヒト骨芽細胞と組み合わせることにより、ＰＲＥＬＰ由来靭帯様組織の骨癒合を調べた。染色体蛍光染色により、ヒト染色体（ロダミン）とマウス染色体（ＦＩＴＣ）との融合が示された（図２１）。核型分析により、マウス間葉系幹細胞由来靭帯組織がヒト骨芽細胞と融合したことが確認された。プローブとしては、ヒトCot-1 DNA（ジゴキシゲニン、ロダミンスペクトラムオレンジ標識）及びマウスCot-1 DNA（ビオチン、ＦＩＴＣスペクトラムグリーン標識）を用いた。セルサイクルの静止期（Ａ）及び分裂中期（Ｂ）を示す（図２１）。

【0104】

ニワトリの靭帯と骨組織との間の癒着領域における、ＰＲＥＬＰ及びＩＩ型コラーゲンの発現を調べた。ＰＲＥＬＰ（Alexa Fluor 488）及びＩＩ型コラーゲン(Alexa Fluor 555)の蛍光染色により、ＰＲＥＬＰ発現は靭帯組織においてのみ生じ、靭帯組織と骨との間にＩＩ型コラーゲンが明確に発現することが示された（図２２）。

【0105】

ニワトリから前十字靭帯を摘出し、多数に切断した。pPyCAG-cHA-IpacflexEGFP-PRELPを含む培養液中で培養した後に、破壊された靭帯組織を元に戻した。修復された組織におけるＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により確認した（図２３）。１週間後、コラーゲン線維の連結が、アザン染色により観察された。修復後の新たな靭帯組織のＧＦＰ蛍光から、幹細胞がpPyCAG-cHA-IpacflexEGFP-PRELPを保持していることが明らかとなった（図２３左）。

【0106】

［参考例２］
アレイ−ＣＧＨ
ＲＮＡをAllPrep DNA/RNA mini kit (Qiagen)を用いて抽出し、ＲＮＡの完全性を解析した(Agilent 2100 Bioanalyzer)。9.0以上の値の完全性を有するＲＮＡをSuperscript VILO cDNA synthesis kit（Life Technologies）を用いて逆転写し、Agilent Human Genome Microarray Kit 244 K (Agilent Technologies)を用いてアレイ−ＣＧＨを実施した。アレイ−ＣＧＨプラットフォームは、それぞれ、メジアン長が7.4kb及び16.5kbのコーディング及びノンコーディングゲノム配列に及ぶ約244400個のプローブを含む、高解像度６０merオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイである。標識化及びハイブリダイゼーションは、Agilentにより提供されたプロトコール（Protocol v4.0, June 2006）に従って実施した。アレイは、Agilent DNA microarray scannerを用いて解析した。マウス間葉系幹細胞、野生型マウスの靭帯組織、ＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスの靭帯組織、及びマウス間葉系幹細胞にＰＲＥＬＰを導入することにより調製した（実施例１）幹細胞由来靭帯組織について遺伝子発現を解析した。

【0107】

全ての遺伝子の解析結果から、細胞外マトリクスからの幹細胞と比較した場合の遺伝子発現の変化は、野生型マウスの靭帯組織、ＰＲＥＬＰトランスジェニックマウスの靭帯組織、及び幹細胞由来靭帯組織との間で一致していることが示された（図２４及び２５）。

【0108】

［参考例３］
ＰＲＥＬＰタンパク質及び遺伝子相互作用
ＩＰＡソフトウェアを用いてＲＮＡ遺伝子発現及びＰＲＥＬＰタンパク質相互作用に基づき、新たなパスウェイの解析を行った。これらのネットワークは機能的及び遺伝子的関連を明らかにする。ＩＰＡツールは、公知の生物学的パスウェイとのつながりを示さなかった。この試験から、ＰＲＥＬＰと有意に関連する新たなネットワークの可能性が明らかとなった（図２６）。

【0109】

［実施例９］
ＰＲＥＬＰの発現ルート
マウス間葉系幹細胞をＺｎＣｌ_２で処理すると、高いNF-κB-p65発現を示したが、LY294002の影響はほとんど無かった。*P < 0.001, n = 4（図２７Ａ）。PRELP遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞に10 ng/mLのＴＮＦ−αを加えると、２４時間後に靭帯様組織が現れた。10 ng/mLのＴＮＦ−α及びLY294002を加えても、同様に靭帯様組織への転換が生じた（図２７Ｂ）。NFκB（Alexa Fluor 555）及びPRELP（Alexa Fluor 350）について、免疫蛍光組織染色を実施した。TNF-αを加えて３時間後、細胞内ＥＲの境界が画定し（図２７Ｃ）、６時間後、PRELPタンパク質発現が、ＥＲ内で確認され（図２７Ｄ）、１２時間後に、線維状への転換が生じ、PRELP発現が確認された（図２７Ｅ）。NfκB発現があるので、PRELPは30 μm/mL ZnCl₂により影響される核内転写因子として機能することが示唆された。ＰＲＥＬＰ遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞に、10 μM, 30 μM, 及び50 μMのZnCl₂を加えたときのNFκB p65（Alexa Fluor 488）及びＤＡＰＩ蛍光イメージを図２７Ｆ、Ｇ及びＨに示す。ＰＲＥＬＰ遺伝子を導入したマウス間葉系幹細胞に10 ng/mL TNF-αを加えて１２時間後に靭帯様組織が現れ（Ｉ）、30 μMのZnCl₂を加えた場合にも、同様の靭帯様組織への転換が生じた（Ｊ）。

【0110】

［参考例４］
ｐＣＡＧＧＳ−ＰＲＥＬＰを導入したヒト間葉系幹細胞に由来する靭帯様組織におけるNF-kBIA、MEKK3、TAK-1及びTRAF6遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。これらの遺伝子の発現は、30 μM ZnCl₂、TNF-αにより上昇した（図２８）。

【0111】

ヒト間葉系幹細胞にＰＲＥＬＰを導入後、ZnCl₂及びLY294002（PI3 キナーゼ阻害剤）を加え、ＥＬＩＳＡによりNF-κB-p65、-p52、-p50、及びc-Relを測定した。シグナル伝達経路研究のためNfκB family Transcription factor assay kit (Active Motif, Inc., USA)を用い、抗ＰＲＥＬＰ抗体及び抗NF-κB-p65抗体によるウェスタンブロッティングを用いた。ＣＢＢ染色をコントロールとして用いた。ZnCl₂により上昇したNF-κB-p65、-p52、-p50、及びc-Relの発現は、LY294002によりキャンセルされなかった（図２９）。

【0112】

TNF-αによりＰＲＥＬＰを発現したヒト間葉系幹細胞におけるTAK1、TRAF6、MEKK3、及びNFκB p65発現を、ウェスタンブロッティングにより解析した。ＰＲＥＬＰを導入し、ＴＮＦ−αで処理した幹細胞はTRAF6、MEKK3及びNFκB p65を発現した。ＰＲＥＬＰのウェスタンブロッティングにより、コントロールsh-Lac Z及びsh-scrambleで処理した細胞にはＰＲＥＬＰタンパク質が存在し、shRNA-PRELPにより速やかにＰＲＥＬＰがノックダウンされることが確認された（図３０）。

【0113】

［実施例１０］
実施例１と同様に、ＰＲＥＬＰを導入したマウス間葉系幹細胞から靭帯様組織を製造した。これを破壊された歯周ポケットに移植すると、歯周ポケットが再建された（図３１）。

【産業上の利用可能性】

【0114】

本発明によれば、インビトロの系で靱帯様の平行線維性結合組織を製造することができる。これにより、人工靱帯の作製が可能となり、スポーツ選手などの靭帯断裂による運動障害などの治療に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]