特許 6200714 幹細胞由来成長因子産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6200714

(24)【登録日】2017年9月1日

(45)【発行日】2017年9月20日

(54)【発明の名称】幹細胞由来成長因子産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/738 20060101AFI20170911BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170911BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170911BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/738ZNA

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

   A61P17/00

【請求項の数】2

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2013-152675(P2013-152675)

(22)【出願日】2013年7月23日

(65)【公開番号】特開2015-20996(P2015-20996A)

(43)【公開日】2015年2月2日

【審査請求日】2016年5月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100120905

【弁理士】

【氏名又は名称】深見 伸子

(72)【発明者】

【氏名】出口 恭子

(72)【発明者】

【氏名】坂井田 勉

(72)【発明者】

【氏名】大湖 史朗

(72)【発明者】

【氏名】井上 悠

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 靖司

【審査官】 渡邊 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−２２０３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３４２１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−００１５２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０８７２１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−１７１３０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０１４５８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１７５６７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−３０３１４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１４８９８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２３６１４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２３２７２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 医学のあゆみ, 2011, Vol.239 No.8, p.851-854

【文献】 薔薇大図鑑２０００, 2006，後藤みどり他監修， 株式会社草土出版発行，p.87,88

【文献】 医学のあゆみ, 2011, Vol.239 No.8, p.813-816

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の地上部の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞由来成長因子遺伝子発現促進剤。

【請求項2】

ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞由来成長因子遺伝子発現促進用の皮膚外用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞由来成長因子産生促進剤、および該産生促進剤を含む皮膚外用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞に分化する多能性を有しており、この性質により損傷部の細胞・組織を再生することで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。

【0003】

一方、近年では、幹細胞が産生分泌する成長因子が注目を集めている。再生医療の基本戦略である幹細胞移植においては、実は幹細胞が産生分泌する成長因子が重要であり、これらが組織の再構築に寄与するのではないかと考えられるようになってきた。実際に、幹細胞から培養上清中に分泌された幹細胞由来の成長因子が、幹細胞移植と同等あるいはそれ以上の再生効果をもつことが、骨、皮膚、脊髄、脳を含む様々な組織において実証されている（非特許文献１)。また、幹細胞由来成長因子をシワの改善や発毛促進のために患部に注入して肌や髪を再生する再生美容も盛んになってきている。

【0004】

これまでに、成長因子産生を促進する技術として、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｉ２アゴニスト、ＥＰ２アゴニストおよびＥＰ４アゴニストから選択される１種または２種以上を含有する内因性修復因子産生促進剤（特許文献１）、アムラ抽出物及びリンゴンベリー抽出物の少なくともいずれかを含有する血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）産生亢進剤（特許文献２）、シイタケ、エチナシ、プルーン、モヤシ、アマチャヅルの各抽出物から選択した１種又は２種以上を含有する血管内皮細胞増殖因子産生促進剤（特許文献３）などが報告されている。しかしながら、これらの成長因子産生促進剤はいずれも線維芽細胞や血管内皮細胞などの細胞から成長因子を産生促進するものであり、幹細胞から成長因子を産生促進するものではない。幹細胞から成長因子を産生促進させる技術として、低酸素や紫外線照射の物理的刺激と培地へのビタミン類の添加といった培養条件の検討により脂肪由来幹細胞から成長因子を大量に生産する方法が報告されているが（特許文献４）、培養条件の設定や調整が複雑であり、簡便な方法とはいえない。

【0005】

バラ（薔薇）はバラ科(Rosaceae)バラ属(Rosa)の種の総称であり、バラ科バラ属に属する植物は１５０種以上あるといわれ、多くの栽培品種がある。バラは花の豪華さ、花色の多さ、優美な香りから主には鑑賞用に用いられるが、これまでバラの花びらなどの抽出物に、抗菌作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、保湿作用、収斂作用、鎮静作用など様々な薬効があることが知られており、化粧品や医薬品などにも広く利用されている。しかしながら、幹細胞からの成長因子の産生促進効果についてはこれまで何ら知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１０−１２０９６４

【特許文献2】特開２０１３−００１６６９

【特許文献3】特開２００４−０３５４４３

【特許文献4】特表２００９−５２４４２５

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】医学のあゆみ 239巻8号、2011年11月19日

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、幹細胞による成長因子の産生を促進する物質を探索し、当該物質を皮膚の障害若しくは損傷、または肥満などの予防、改善または治療するための皮膚外用組成物として提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バラ科バラ属植物の特定の品種の抽出物が、幹細胞による成長因子の産生を促進する効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１） ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物を有効成分として含有する、幹細胞由来成長因子産生促進剤。
（２） （１）に記載の幹細胞由来成長因子産生促進剤を含む、皮膚外用組成物。
（３） 皮膚外用組成物が医薬品または医薬部外品である、（２）に記載の皮膚外用組成物。
（４） 皮膚外用組成物が化粧品である、（２）に記載の皮膚外用組成物。
（５） ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物の存在下で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞培養物の製造方法。
（６）幹細胞培養物から成長因子を単離する工程をさらに含む、（５）に記載の方法。
（７）（５）に記載の方法により得られる幹細胞培養物。

【発明の効果】

【0011】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞による成長因子の産生および分泌を促進することができるので、加齢や紫外線暴露などに伴うシワやたるみ、シミなどの皮膚障害や劣化、外傷や熱傷による皮膚損傷、あるいは肥満を予防、改善または治療するための皮膚外用組成物として利用できる。また、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を用いて幹細胞を培養することにより得られる幹細胞培養物または該培養物より単離した成長因子は、皮膚の再生や修復を目的として再生医療や再生美容に利用できる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、本発明について詳細に述べる。

【0013】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物を有効成分として含有する。

【0014】

ロサ・アルバ・セミプレナ（学名：Ｒｏｓａ ａｌｂａ ｓｅｍｉ−ｐｌｅｎａ）は、１６世紀以前に作出されたオールドローズの一種であり、ロサ・カニナとロサ・ダマスケナの交雑種とされている。ロサ・ウィクライアナ（学名：Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ）は、日本の代表的なバラの原種の一つであり、別名は、テリハノイバラ、ハマイバラ、ハイバラといわれている。ロサ・フェティダ（学名：Ｒｏｓａ ｆｏｅｔｉｄａ）は中近東原産のバラ原種の一つである。

【0015】

本発明において、バラ科バラ属植物の抽出物は、植物体全体（全草）、あるいは、花、茎、葉、枝、枝葉、果実、根、種子等の植物体の一部またはそれらの混合物の抽出物をいうが、地上部の植物体の抽出物が好ましい。また、抽出には、これらの植物体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。

【0016】

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、アルコール類、エーテル類、エステル類などを用いることができるが、エタノール、メタノール、アセトン等の水溶性有機溶媒が好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記バラ科バラ属植物の地上部（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で、３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。

【0017】

本発明における「幹細胞由来成長因子の産生促進」とは、生体レベルでまたは培養レベルで幹細胞による成長因子の産生および分泌を促進させることをいう。

【0018】

本発明における「成長因子」には、塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子(ａＦＧＦ）、上皮成長因子(ＥＧＦ)、血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ)、インスリン様成長因子−１(ＩＧＦ−１)、インスリン様成長因子−２(ＩＧＦ−２)、トランスフォーミング成長因子−β１(ＴＧＦ−β１）、トランスフォーミング成長因子−β２(ＴＧＦ−β２）、ケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、神経栄養因子(ＮＧＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)が含まれるが、これらに限定はされない。

【0019】

これらの「成長因子」は、生体において様々な効果を発揮する。例えば、ｂＦＧＦは、皮膚組織の再生を促すことが知られている(特開２００７−０６８８８４）。また、ＩＧＦ−１についても皮膚組織の再生に関与することが知られている（Endocr Rev. 2003 Dec;24(6):737-64.Epidermal homeostasis: the role of the growth hormone and insulin-like growth factor systems.Edmondson SR, Thumiger SP, Werther GA, Wraight CJ.）。また、ＩＧＦ−１については、皮膚組織の再生効果に加えて内臓脂肪の低下効果等を示すことが知られる（特表２００７−５０２８３４）。さらに、ＴＧＦ−β１は、皮膚の創傷治癒過程において非常に重要な役割を果たす（日皮会誌：119（10）．1971-1977. 2009）。

【0020】

本発明において「幹細胞」とは、上記成長因子を産生しうる各種の幹細胞をいい、骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）、脂肪、毛包、筋肉、脳、肝臓、その他の組織に存在する未分化な状態の細胞（総称して、体性幹細胞という）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などを含む。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、及びそれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。このようなＥＳ細胞は、例えば、自体公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。また、これら幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞のいずれであってもよい。

【0021】

また、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞の成長因子産生分泌機構について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。

【0022】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤の有効成分であるロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物は、幹細胞による成長因子の産生を培養レベルまたは生体レベルで促進する作用を有する。従って、本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、その有効量を添加した幹細胞培養用培地にて幹細胞を培養することによって、または、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、幹細胞からの成長因子産生を促進することができる。

【0023】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに皮膚外用組成物に配合して提供することが好ましい。本発明の皮膚外用組成物には、医薬品、医薬部外品、化粧品などが含まれる。

【0024】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤は、幹細胞による成長因子の産生を促進することができるので、当該剤を含む皮膚外用組成物は、皮膚の障害若しくは損傷、または肥満を予防、改善、および治療するのに有効である。

【0025】

ここで、皮膚の障害や損傷としては、限定はされないが、シワ、タルミ、シミ、くすみ、肌荒れ、皮膚の肥厚、毛穴のひらき、ニキビ痕、創傷（切創、裂創、刺傷、咬創、挫創、挫傷、擦過傷等）、褥瘡、熱傷、瘢痕、ケロイドなどが挙げられ、薄毛や脱毛などの頭皮や毛髪の損傷も含まれる。肥満には、顔の輪郭、頸部、腹部、臀部、大腿部などへの皮下脂肪の蓄積のほか、皮下脂肪沈着に起因するセルライトなどが含まれる。

【0026】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて賦形剤、増粘剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、分散剤、乳化剤、ゲル化剤、色素、香料等を用いることができる。本発明の医薬品に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。

【0027】

本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を医薬部外品や化粧品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、または水−油−粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該医薬部外品や化粧品は、幹細胞由来成長因子産生促進剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。

【0028】

医薬部外品や化粧品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤等が挙げられる。

【0029】

本発明の皮膚外用組成物における幹細胞由来成長因子産生促進剤の含有量は、幹細胞から成長因子の産生促進作用が発揮できる量である限り特に限定はされないが、例えばバラ科バラ属植物抽出物の乾燥固形物重量として０．００００１〜１０重量％が好ましく、０．０００１〜１重量％がより好ましい。上記の量はあくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果、及びコストなどを考慮して適宜設定・調整すればよい。

【0030】

一方、幹細胞からの成長因子産生を幹細胞の培養により行う場合、培地に本発明の幹細胞由来成長因子産生促進剤を添加する以外は、培養方法の条件及び操作は、当該技術分野で常套的な条件及び操作に従って行うことができる。幹細胞由来成長因子産生促進剤の培地への添加量は、バラ科バラ属植物抽出物の濃度として０．１〜１０００μｇ/mL、好ましくは１〜１００μｇ/mLである。

【0031】

幹細胞の培養には、幹細胞の未分化性維持および増殖のために一般的に使用されている培地を用いればよい。例えば、幹細胞の生存および増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、細胞の増殖速度を増大させるために、必要に応じて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質などが含有された培地を用いることができる。

【0032】

また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

【0033】

市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。

【0034】

幹細胞の培養に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。

【0035】

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

【0036】

幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。

【0037】

上記培養により得られる幹細胞培養物中の成長因子は、例えばその遺伝子の量を測定することにより確認できる。測定は、培養後の幹細胞中の総ＲＮＡを抽出し、成長因子をコードするｍＲＮＡの量をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なえばよい。あるいは、成長因子に特異的な抗体を利用し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法などの免疫学的測定法により行ってもよい。

【0038】

本発明によれば、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、及びロサ・フェティダから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属植物の抽出物の存在下で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞培養物の製造方法もまた提供される。また、本方法により得られた幹細胞培養物に含まれる成長因子を単離および精製してもよい。例えば、タンパク質の精製に用いられる一般的な方法、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、脱塩法、ＨＰＬＣ、電気泳動法などを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から成長因子を単離精製することができる。

【0039】

上記製造方法により得られる幹細胞培養物は各種の成長因子を高濃度で含有する。ここで、幹細胞培養物とは、培養上清、培養幹細胞、培養幹細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の幹細胞培養物はそのままで、あるいは、それより成長因子を単離し、皮膚組織などに直接注入するといった方法により、再生医療や再生美容への応用が可能である。

【実施例】

【0040】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0041】

（製造例１）ロサ・アルバ・セミプレナの熱水抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・アルバ・セミプレナの熱水抽出物を１．５ｇ得た。

【0042】

（製造例２）ロサ・ウィクライアナの熱水抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・ウィクライアナの熱水抽出物を０．６ｇ得た。

【0043】

（製造例３）ロサ・フェティダの熱水抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇに精製水５００ｍＬを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してロサ・フェティダの熱水抽出物を２．１ｇ得た。

【0044】

（製造例４）ロサ・アルバ・セミプレナの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・アルバ・セミプレナの５０％エタノール抽出物を１．４ｇ得た。

【0045】

（製造例５）ロサ・ウィクライアナの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・ウィクライアナの５０％エタノール抽出物を０．７ｇ得た。

【0046】

（製造例６）ロサ・フェティダの５０％エタノール抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・フェティダの５０％エタノール抽出物を１．８ｇ得た。

【0047】

（製造例７）ロサ・アルバ・セミプレナのエタノール抽出物の調製
ロサ・アルバ・セミプレナの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・アルバ・セミプレナのエタノール抽出物を０．８ｇ得た。

【0048】

（製造例８）ロサ・ウィクライアナのエタノール抽出物の調製
ロサ・ウィクライアナの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・ウィクライアナのエタノール抽出物を０．４ｇ得た。

【0049】

（製造例９）ロサ・フェティダのエタノール抽出物の調製
ロサ・フェティダの地上部の乾燥物２５ｇにエタノール５００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ロサ・フェティダのエタノール抽出物を０．８ｇ得た

【0050】

（実施例１）幹細胞からの成長因子産生促進効果の評価
間葉系幹細胞増殖培地(ＭＦ培地)(ＴＯＹＯＢＯ社製)を用いて培養したヒト成体幹細胞（皮下脂肪細胞由来）(ＤＳファーマバイオメディカル社製)を６ｃｍディッシュに１x１０^６個播種し、評価試料としてロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、またはロサ・フェティダの抽出物(製造例１〜９)を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。培養３日後に、細胞を回収し、ＰＢＳ(-)にて２回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からＲＮＡを抽出した。その後、２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット(Applied Biosystems社製)を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記成長因子(ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦＡ及びＶＥＧＦＡ)増幅用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ(９５℃:１５秒間、６０℃:３０秒間、４０サイクル)を実施し、各遺伝子の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。

【0051】

ｂＦＧＦ用プライマーセット：
フォワードプライマー：TGGTATGTGGCACTGAAACGAA（配列番号１）
リバースプライマー：TTCTGCCCAGGTCCTGTTTT（配列番号２）
ＩＧＦ−１用プライマーセット：
フォワードプライマー：AAGGAGGCTGGAGATGTATTGC（配列番号３）
リバースプライマー：CGGACAGAGCGAGCTGACTT（配列番号４）
ＴＧＦ−β１用プライマーセット：
フォワードプライマー：CGCGTGCTAATGGTGGAAA（配列番号５）
リバースプライマー：ATGCTGTGTGTACTCTGCTTGAACTT（配列番号６）
ＰＤＧＦＡ用プライマーセット：
フォワードプライマー：TCAGGAAGAAGCCAAAATTAAAAGA（配列番号７）
リバースプライマー：GCAGGCGCACTCCAAATG（配列番号８）
ＶＥＧＦＡ用プライマーセット：
フォワードプライマー：CTCTCTCCCTGATCGGTGACA（配列番号９）
リバースプライマー：GGAGGGCAGAGCTGAGTGTT（配列番号１０）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット：
フォワードプライマー：TGCACCACCAACTGCTTAGC（配列番号１１）
リバースプライマー：TCTTCTGGGTGGCAGTGATG（配列番号１２）

【0052】

成長因子産生促進効果は、試料を添加せずに培養した細胞における各成長因子ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出した各成長因子の遺伝子相対発現量（各成長因子の遺伝子発現量/ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量）の値を１．０とし、これに対し、試料を添加して培養した細胞における各遺伝子の相対発現量の値を算出し、評価した。結果を表１に示す。

【0053】

【表1】

【0054】

表１の結果に示されるように、ロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、ロサ・フェティダの抽出物（製造例１〜９）の全てに、顕著な幹細胞からの成長因子産生促進効果が認められた。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、骨髄由来幹細胞、造血幹細胞、胚性の幹細胞(ＥＳ細胞)についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞からの成長因子産生促進効果が認められた。また、各成長因子産生及び分泌促進効果はＥＬＩＳＡ法においても確認された。さらに、上記抽出物（製造例１〜９）以外にも、各植物の葉のみ又は全草から抽出した抽出物にも同様な効果が認められた。

【0055】

（実施例２）製品の処方例
以下に示す処方例に従い、製造例１〜９で製造したロサ・アルバ・セミプレナ、ロサ・ウィクライアナ、またはロサ・フェティダの抽出物を配合したローション、クリームを常法により調製した。

【0056】

処方例１ ローション
処方 成分 配合量(部)
１ 製造例１〜９のバラ科バラ属植物抽出物 0.05
２ １,３−ブチレングリコール 8.0
３ グリセリン 2.0
４ キサンタンガム 0.02
５ クエン酸 0.01
６ クエン酸ナトリウム 0.1
７ エタノール 5.0
８ パラオキシ安息香酸メチル 0.1
９ ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.1
(40E.0.)
１０ 香料 0.1
１１ 精製水 84.52

【0057】

成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過してローションを調製した。

【0058】

処方例２ クリーム
処方 成分 配合量(部)
１ 製造例１〜９のバラ科バラ属植物抽出物 0.03
２ スクワラン 5.5
３ オリーブ油 3.0
４ ステアリン酸 2.0
５ ミツロウ 2.0
６ ミリスチン酸オクチルドデシル 3.5
７ ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E. 3.0
0.)
８ ベヘニルアルコール 1.5
９ モノステアリン酸グリセリン 2.5
１０ 香料 0.1
１１ パラオキシ安息香酸メチル 0.2
１２ パラオキシ安息香酸エチル 0.05
１３ 1,3-ブチレングリコール 8.5
１４ 精製水 68.12

【0059】

成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とした。また、成分１及び成分１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とした。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却することで製品とした。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、皮膚の障害若しくは損傷、または肥満を予防、回復または治療を目的とした医薬品、医薬部外品、化粧品の製造分野において利用できる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]