特許 6201033 新規の韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6201033

(24)【登録日】2017年9月1日

(45)【発行日】2017年9月20日

(54)【発明の名称】新規の韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20170911BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170911BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20170911BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20170911BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20170911BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20170911BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20170911BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20170911BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170911BHJP

   G01N 33/534 20060101ALI20170911BHJP

   G01N 33/558 20060101ALI20170911BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/00

   C12N15/00 AZNA

   A61K39/12

   A61K39/39

   A61K47/10

   A61P31/14

   A61P31/12 171

   G01N33/569 L

   G01N33/53 D

   G01N33/53 Y

   G01N33/534

   G01N33/558

【請求項の数】12

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-505377(P2016-505377)

(86)(22)【出願日】2014年2月3日

(65)【公表番号】特表2016-518118(P2016-518118A)

(43)【公表日】2016年6月23日

(86)【国際出願番号】KR2014000897

(87)【国際公開番号】WO2014148738

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2015年11月24日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0029891

(32)【優先日】2013年3月20日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12096BP

(73)【特許権者】

【識別番号】515266164

【氏名又は名称】オプティファーム カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(74)【代理人】

【識別番号】100151596

【弁理士】

【氏名又は名称】下田 俊明

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒュンイル

(72)【発明者】

【氏名】シン，ソンホ

(72)【発明者】

【氏名】ハン，ボンク

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００１０４２６（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１１−００５２１８３（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Virology Journal 2011, 8:177

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ；ＰＲＲＳＶ)(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)。

【請求項2】

韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を有効成分として含むことを特徴とするワクチン組成物。

【請求項3】

前記ウイルスは、３回〜１２０回の継代培養を通じて得られるウイルスであることを特徴とする請求項２に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

前記ワクチン組成物は、アジュバント、賦形剤または担体をさらに含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

前記ワクチン組成物は、保護剤をさらに含むことを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

前記保護剤は、トレハロース(Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ)であることを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

請求項２〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物を豚に投与する段階を含むことを特徴とする豚生殖器呼吸器症候群の予防方法。

【請求項8】

前記ワクチン組成物を筋肉または鼻腔に接種することを特徴とする請求項７に記載の豚生殖器呼吸器症候群の予防方法。

【請求項9】

前記ワクチン組成物は、２×１０⁵〜２×１０⁷ＰＦＵ/ｍｌの韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスを含むことを特徴とする請求項７又は８に記載の豚生殖器呼吸器症候群の予防方法。

【請求項10】

韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその
抗原を含むことを特徴とする韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの診断キット。

【請求項11】

韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその抗原を利用した抗原−抗体反応を通じて感染されるまたは感染された細胞内で韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を検出することを特徴とする韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの検出方法。

【請求項12】

前記抗原−抗体反応の分析は、組職免疫染色、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)、免疫沈降分析法(Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、免疫拡散分析法(Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、補体結合分析法(Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップ(ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ)分析法からなる群より選択された１種以上の方法を利用して実行することを特徴とする請求項１１に記載の韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ；ＰＲＲＳＶ)及
びこれを利用したワクチン組成物、豚生殖器呼吸器症候群の予防方法に関する。

【背景技術】

【0002】

１９８７年アメリカの養豚地域を中心として原因不明の新しい豚疾病の発生が報告され始めた。繁殖障害と呼吸器感染が複合的に現われるこの疾病は、１９８８年と１９８９年の夏に爆発的に増加した。急に出現してアメリカ養豚業に莫大な被害を与えたこの疾病を、初期には豚ミステリー病と呼んだが、以後、原因ウイルスが分離されて臨床症状、病原性などに対する研究が進行されながら、繁殖障害と呼吸器感染が一緒に現われる臨床症状の特徴によって現在は国際的にＰＲＲＳ(Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａ
ｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；豚生殖器呼吸器症候群)と名付けてい
る。

【0003】

韓国ではこの疾病と類似な症状の流行に関する報告はなかったが、１９９２年からこの疾病に対する研究を始めて、診断法を確立し、韓国内の養豚場に対する易学調査を実施して韓国内にも流入されたことを確認し、韓国内の感染農場で原因ウイルスを分離した。アジア地域では、韓国の外にも日本、台湾で発生の確認及び原因ウイルスの分離を報告した。

【0004】

発生報告の以後にも正確な原因が分からなくて養豚業界を一層混乱に落としたが、１９９１年６月にオランダ中央獣医研究所のＷｅｎｓｖｏｏｒｔ博士が豚の肺胞大食細胞を利用して原因ウイルスを初めて分離した。このウイルスは、オランダ中央獣医研究所が位置した地名を取ってＬｅｌｙｓｔａｄウイルスと命名され、以後、まもなくアメリカを含めた多くの国で原因ウイルスを分離さた。性状と病原性などを調査した結果、その間アメリカとヨーロッパで繁殖障害と呼吸器感染を複合的に起こした新しい豚疾病がこのウイルスによることで判明された。

【0005】

ヨーロッパでは、Ｌｅｌｙｓｔａｄウイルス、アメリカでは、ＳＩＲＳウイルスとよく呼ぶＰＲＲＳウイルスは、外膜を有し、直径４５〜８０nmの小さい球形ウイルスとして、表面には小さい突起が出ている。遺伝子が入っている部位は、直径２５〜３５nmで短鎖ＲＮＡ遺伝子が位置している。外部環境にはあまり強くなくて酸度５以下または７以上でウイルス感染力価が９０％以上減少し、３７℃で１０〜２４時間、２０℃では６日程度経過すれば、感染力価が１０倍以上減少する。このウイルスに感染された場合、病気を起こす程度は非常に多様で、単純に血清検査によってのみ感染が分かる程度に、臨床症状及び経済的損失が全然ない場合から農場の生産に２０％程度の損失を加える程度にひどい場合まである。

【0006】

病名からも分かるように、繁殖障害と呼吸器疾患が複合的に現われる。ＰＲＲＳウイルス感染による繁殖障害の特徴は、主に妊娠１０７日から１１３日の間に集中された妊娠末期遺産または早産胎児分娩、死産及びミイラ子豚の発生、子豚の離乳前斃死率の急増、離乳後斃死率の増加、発情回帰の遅延などであり、この症状は、感染された母豚とその母豚から生まれた子豚に集中的に現われる。ＰＲＲＳウイルス感染による繁殖障害は、大部分感染初期から６ヶ月程度が経過すれば、感染以前状態に回復することで知られている。ＰＲＲＳウイルス感染による呼吸器疾患は、全日齢で現われ、特に哺乳子豚と離乳子豚で集中的に現われる。この場合、はやい腹式呼吸が観察され、眼瞼浮腫、結膜炎、くしゃみ、
下痢などが観察され、短い期間の体温上昇がある場合もあり、珍しくは神経症状を示す場合もある。呼吸器疾患の特徴は、ＰＲＲＳウイルス単独感染の場合よりは細菌性、ウイルス性病原体の２次感染及び複合感染が多く、その場合、病原性が一層増幅される。その他に、耳、腹部、外陰部などに青色斑点ができる場合もあって、イギリスでは青耳病(Ｂｌ
ｕｅ ｅａｒ ｄｉｓｅａｓｅ)とも呼ばれている。

【0007】

以上の臨床症状は、急性でひどく進行される場合に明らかに観察することができ、準臨床型感染や慢性的に進行される場合には、明らかで特徴的な臨床症状をほとんど観察することができない。慢性的感染は、離乳子豚と育成肥肉段階で主に行われ、ＰＲＲＳウイルスの攻撃を受けた呼吸器系に細菌及びウイルスが感染されて鼻炎と肺炎を起こす。結果的に、一日平均増大量が低下し、飼料要求率はさらに増加するようになり、離乳後の斃死率がＰＲＲＳウイルス感染前の平均斃死率より２倍ほど高くなる。ＰＲＲＳウイルスによる呼吸器疾患を病んだ肺は、病理学的に特徴的な癲癇性肺炎所見を示す。

【0008】

ＰＲＲＳウイルスは、現在、ヨーロッパで最初に分離されたＬｅｌｙｓｔａｄウイルス(Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ., １９９１)と北アメリカで分離されたＶＲ−２３３２[０００４]ウイルス(Ｂｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ., １９９２)が、各々ヨーロッパ株(Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ ｓｔｒａｉｎ)と北アメリカ株(Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｔｒａ
ｉｎ)の原型(ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ)に分類されており、これらの間には塩基配列相同性が
約５５〜７０％程度で非常に低い(Ｇａｇｎｏｎ ａｎｄ Ｄｅａ、１９９８；Ｋｗａｎｇ ｅｔ ａｌ., １９９４；Ｍｕｒｔａｕｇｈ ｅｔ ａｌ., １９９５)。ＰＲＲＳウイルスは、現在、ウマ動脈炎ウイルス(ｅｑｕｉｎｅ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＥＡＶ)、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス(ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ virus；ＬＤＶ)、サル出血熱ウイルス(ｓｉｍｉａｎ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ；ＳＨＦＶ)と共にニドウイルス目(ｏｒｄｅｒ Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ)、アルテリウイルス科(ｆａｍｉｌｙ Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ)に属する(Ｃ
ａｖａｎａｇｈ、１９９７)。ＰＲＲＳウイルスは、リン脂質を有した非常に小さいエン
ベローブウイルス(ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ)であり、正多面体形態のヌクレオカ
プシド内に約１５ｋｂ程度のプラス極性の一本鎖のＲＮＡゲノムを有している(Ｃｏｌｌ
ｉｎｓ ｅｔ ａｌ., １９９２)。ウイルスの自己複製に必要な酵素で構成された比構造タンパク質であるレプリカーゼ(ｒｅｐｌｉｃａｓｅ)をエンコードする遺伝子は、ゲノムＲＮＡの５'−末端で約８０％を占めて、ゲノムＲＮＡから発現される互いに重畳される部
位を有したＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂにより作られる。この中でＯＲＦ１ｂは、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔメカニズムによって発現されると報告されたことがある(Ｂｒｉｅｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ., １９８９)。 ウイルスの構造タンパク質は、ゲノムＲＮ
Ａの３'−末端で約２０％を占めて、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂからＯＲＦ７の７個の遺伝
子から発現される。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３及びＯＲＦ４は、各々ＧＰ２、ＧＰ３及びＧＰである糖化された膜タンパク質を生成し、ＯＲＦ５は、ＰＲＲＳウイルスの中和力に一番重要な役目をする糖タンパク質のＧＰ５エンベローブタンパク質、ＯＲＦ６は、Ｍ(ｍａｔ
ｒｉｘ)、そして、ＯＲＦ７は、Ｎ(ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｅ)を生成する(Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., １９９５；Ｂａｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ., ２００４)。これらは感
染された細胞内でｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｍＲＮＡの５'−
末端から発現される(Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ.,１９９３；Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ
ａｌ., １９９９)。ＰＲＲＳウイルスの構造タンパク質だけではなく比構造タンパク質を含んだ大部分のタンパク質に対する機能及び分子生物学的特性に関する研究結果は、まだ些細な状態である。ＰＲＲＳウイルスが豚に感染されると、臨床的な症状としてひどい繁殖障害と呼吸器障害が現われる。ＰＲＲＳウイルスの北アメリカ株とヨーロッパ株は、疾病症状において明らかに差を証明することができないという事実にもかかわらず、それらは抗原的でも遺伝形的でも明らかな差を有している(Ａｌｌｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ., １９９９；Ｈａｌｂｕｒ ｅｔ ａｌ., １９９５；Ｗｏｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ., １９９８)。ま
た、北アメリカ株とヨーロッパ株内でも分離株の間に差を示す。例えば、北アメリカ株に属する多くの分離株の間の塩基配列の変異は、ＲＮＡ重合酵素またはＲＮＡ組換えの本質的なエラーに起因することができ、これらの遺伝学的変異は、ウイルスの病原性に重要な差を示すことができると報告されたことがある(Ａｎｄｒｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ., １９９７；Ｈａｌｂｕｒ ｅｔ ａｌ., １９９６；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ., １９８８)。

【0009】

しかし、今まで韓国型ＰＲＲＳＶを分離して韓国内の変異株に適合なワクチン及びこれを利用した韓国型ＰＲＲＳＶの予防法が実用化されなくて韓国型に一番適合なワクチンに関する研究が必要になっている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、韓国内の豚から豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ；以下、ＰＲＲＳＶ)を分離して研究するうち、分離されたウイルスが新しい韓国型ＰＲＲＳ
Ｖであることを確認し、本発明を完成した。

【0011】

本発明の目的は、新しい韓国型ＰＲＲＳＶ、これを利用したワクチン組成物及び豚生殖器呼吸器症候群の予防方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記のような目的を達成するために本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(
Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ；ＰＲＲＳＶ)(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を提供する。

【0013】

また、本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は、前記ウイルスワクチン組成物を豚に投与する段階を含む豚生殖器呼吸器症候群の予防方法を提供する。

【0015】

また、本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその抗原を含む韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの診断キットを提供
する。

【0016】

また、本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその抗原を利用した抗原−抗体反応を通じて感染されるまたは感染された
細胞内で韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を
検出することを特徴とする韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの検出方法を提供する。

【発明の効果】

【0017】

本発明による受託番号ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰの韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイル
スは、北アメリカ型及びヨーロッパ型と区別される韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスとして、韓国型豚生殖器呼吸器症候群に特異的なワクチン組成物を生産して韓国型豚生殖器呼吸器症候群を予防するか韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの感染可否を特異的に診断することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】無菌豚から分離された豚の肺大食細胞を示した図である(２×１０⁸ｃｅｌｌｓ/ｍｌ)。

【図2】豚の肺大食細胞に豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(以下、ＰＲＲＳＶ)を接種した後、間接免疫蛍光染色法を通じてウイルスの感染可否を判断した結果を示した図である。

【図3】韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)のＯＲＦ５の塩基配列分析結果を利用した系統分析図である。

【図4】分離された韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)の接種後(継代５、継代９１)の抗体価を測定した結果を示した図である。

【図5】韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)の接種後(継代３、継代１２０)の血液内の抗体価を測定した結果を示した図である。

【図6】韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)の接種後(継代３、継代１２０)の個体の血液内白血球とリンパ球の数値を測定した結果を示した図である。

【図7】韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)の接種後(継代３、継代１２０)の個体の臨床症状を分析した結果を示した図である。

【図8】韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)の接種後(継代３、継代１２０)のウイルス排出を、ＰＣＲを通じて確認した結果を示した図である(Ａグループ：ＭＬＶ常用ワクチン接種群、Ｂグループ：継代３ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群、Ｃグループ：継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群、Ｄグループ：陽性対照群、Ｅグループ：陰性対照群)。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ；ＰＲＲＳＶ)(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を提供する。

【0020】

前記韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(以下；ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)(受託番号：ＫＣ
ＴＣ １２０９６ＢＰ)は、野外農場から分離されたウイルスであり、サル腎臓細胞であるＭＡＲＣ−１４５細胞または豚から直接分離培養した豚肺大食細胞(Ｐｏｒｃｉｎｅ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＰＡＭ)で増殖が可能であるが、これに限定されず、本ウイルスが増殖可能な細胞または培地で増殖することができる。

【0021】

また、本発明は、ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を有効成分
として含むワクチン組成物を提供する。

【0022】

前記ワクチン組成物は、ＪＷ−ＰＲＲＳＶを３回〜１２０回継代培養して得られるＪＷ−ＰＲＲＳＶを含むことができ、継代培養の回数は本ウイルスの活性を維持することができれば、制限なしに実行することができるが、好ましくは、３回、５回、９１回、１２０回の継代培養を通じて得られるＪＷ−ＰＲＲＳＶを有効成分として含むことができる。

【0023】

本発明による韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)は、抗体価形成、臨床症状の分析結果、常用ワクチンであるＭＬＶワクチンと同一な程度のウイルス防御能を誘導することができるので、効果的に豚生殖器呼吸器症候群ウイルスに対する新しいワクチン候補物質になることができる。また、本発明の韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)は、接種時に個体内で炎症反応を誘導しないで、注射部位の化膿壊死、発熱などの副作用がない安全性を示し、既存のＰＲＲＳＶワクチンと比較してウイルス排出時間が短縮されることで、既存ワクチンの問題点を改善する効果があって新しい韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスのワクチン用組成物で有用に利用されることができる。

【0024】

前記「ワクチン」は、抗原物質を含む獣医学用ワクチンとして、豚生殖器呼吸器症候群に対して特異的で能動または受動の兔疫性を誘導するための目的で投与される。

【0025】

前記ワクチン組成物を構成するにおいて、有効成分であるＪＷ−ＰＲＲＳＶ(受託番号
：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)の外にもワクチン組成物を構成するにおいて適切な一つ以上のアジュバントまたは賦形剤または担体を含むことができる。

【0026】

免疫反応を増進させる追加の成分は、よくアジュバントと呼ばれる構成物、例えば、水酸化アルミニウム、鉱油または他のオイルまたはワクチンに添加されるか、このような追加成分により各々の誘導後に身体で発生する補助分子、例えば、制限されるものではないが、インターフェロン、インターロイキンまたは成長因子であることができる。

【0027】

本発明で使用されるアジュバントは、注射した動物の免疫反応を増大させる物質を含む。多数の相異なっているアジュバントが当分野において知られている。本発明の明細書で使用されるアジュバントは、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミールジペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、鉱油及び無鉱物油及び
カーボポール(Ｃａｒｂｏｐｏｌ)を含むことができる。好ましい一例で、本発明のワクチンは、油中水型乳剤アジュバントを含むことができる。

【0028】

ワクチンに適合な担体は、技術分野の当業者において公知であり、タンパク質、砂糖などを含むが、これに限定されるものではない。前記担体は、水溶液または非水溶液、懸濁液及びエマルジョンであることができる。非水溶液担体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、食用油、例えば、オリーブオイル、及び注射可能な有機エステル、例えば、エチルオレエートを挙げることができる。水溶液担体は、食塩水及び緩衝媒体を含んだ水、アルコール/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口担体は、
塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸処理リンガーまたは固定オイルを含む。静脈注射用担体は、例えば、リンガーデキストロースを基本とするもののような電解質補充剤、液体及び栄養補充剤などを含む。防腐剤及びその他添加剤、例えば、抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのようなものが追加で存在することができる。好ましい防腐剤は、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンＢ及びアンホテリシンＢを含む。

【0029】

また、本発明によるワクチンは、一つ以上の適切な乳化剤、例えば、スパン(Ｓｐａｎ)またはツイン(Ｔｗｅｅｎ)を含むことができる。

【0030】

また、本発明のワクチン組成物は、保護剤を含むことができ、当業界において公知の保護剤を制限なしに使用することができる。好ましくは、ラクトース(Ｌａｃｔｏｓｅ；Ｌ
ＰＧＧ)またはトレハロース(Ｔｈｒｅｈａｌｏｓｅ；ＴＰＧＧ)であることができ、より
好ましくは、トレハロースを利用することができる。

【0031】

また、本発明は、ＪＷ−ＰＲＲＳＶを利用した豚生殖器呼吸器症候群の予防方法を提供し、これは、ＪＷ−ＰＲＲＳＶワクチン組成物を豚に投与して行われる。

【0032】

豚にワクチン組成物を投与する方法は、一般的なワクチン投与方法によって実行することができ、これに限定されるものではないが、臓内または非経口経路、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内または他の適切な経路を通じた投与を実行することができる。好ましくは、筋肉または鼻腔を通じて接種することができる。

【0033】

前記ワクチン組成物には、２×１０⁵〜２×１０⁷ＰＦＵ/ｍｌの韓国型豚生殖器呼吸器
症候群ウイルスが含まれることが好ましい。

【0034】

また、本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその抗原を含む韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの診断キットを提供
する。

【0035】

前記診断キットは、当業界において通常的に使用される方法を利用して製造されることができる。

【0036】

このような診断キットには、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴ
Ｃ １２０９６ＢＰ)だけではなく免疫学的分析に使用される当分野において一般的に使用される道具、試薬などが含まれる。このような道具/試薬としては、適合な担体、検出可
能な信号を生成することができる標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これに限定されない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定することができる気質及び反応停止剤を含むことができる。適した担体としては、これに限定されないが、可溶性担体、例えば、当分野において公知の生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合わせであることができる。

【0037】

また、本発明は、韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)またはその抗原を利用した抗原−抗体反応を通じて感染されるまたは感染された
細胞内で韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(受託番号：ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)を
検出することを特徴とする韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの検出方法を提供する。

【0038】

抗原−抗体反応は、組職免疫染色、放射能免疫分析法(ＲＩＡ)、酵素免疫分析法(ＥＬ
ＩＳＡ)、ウェスタンブロッティング(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ)、免疫沈降分析法(Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、免疫拡散分析法(Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、補体結合分析法(Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ(ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ)などを利
用して分析することができ、これに限定されない。

【実施例】

【0039】

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することに過ぎず、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。

【0040】

実施例１．韓国型豚生殖器呼吸器症候群ウイルスの分離
１.１ 肺大食細胞(ｐｏｒｃｉｎｅ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；以下、ＰＡＭ)の分離
分離するウイルスを増殖させるためのＰＡＭ細胞の分離に使用する豚は、４〜８週の無菌豚として、当社のＳＰＦ飼育環境で飼育した(Ｏｐｔｉｆａｒｍ−Ｍｅｄｉｐｉｇ)個体を使用した。豚を麻酔させた後、肺気管支を含む肺組職全体を傷がつかないように注意して分離した。肺気管支の内方へ挿入管を連結し、あらかじめ用意したリン酸緩衝溶液(ｐ
Ｈ７.２)を、気管支を通じて肺組職内方へ注入した。肺組職の膨脹が確認されると、挿入管を傾けて肺組職内のリン酸緩衝溶液を収集し、収集されたリン酸緩衝溶液を遠心分離して細胞を沈澱させて、あらかじめ用意した１０％ウシ胎仔血清(ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ)、非必須アミノ酸(ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ)及びペニシリン/ストレプトマイシンが添加された培地に懸濁した。細胞懸濁液を培養容器に入
れて、３７℃、５％のＣＯ₂濃度で培養した。１次分離した肺大食細胞は、総２×１０⁸ｃｅｌｌｓ/ｍｌであり、−８０℃に保管した。培養された豚肺大食細胞の模様を図１に示
した。

【0041】

１.２ ＰＲＲＳＶの分離及びＰＲＲＳＶのＰＡＭ感染の確認
本実験に使用されたウイルスは、ＪＷ農場飼育豚のうち病的症状を示す感染豚から分離した豚生殖器呼吸器症候群ウイルス(Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、ＰＲＲＳＶ)を使用した。感染疑い豚から血液、肺、リンパ、扁桃の組職を粉砕してリン酸緩衝溶液に懸濁し、ＰＣＲ技法でウイルス陽性と判定されたサンプルからウイルス分離実験を進行した。

【0042】

前記実施例１.１で分離されたＰＡＭをＴ−２５フラスコに２×１０⁶ｃｅｌｌｓ/ｍｌ
で株分けし、細胞付着を確認した後、ＰＣＲを通じて陽性と判定された試料の血液、肺、リンパ、扁桃などのサンプルを各々１０〜１００μlで接種した。以後、細胞変性効果(Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥ)が現われると、収穫して−８０℃に保管した。収獲されたウイルスをＰＡＭ細胞が存在するＴ−２５フラスコに１００μlずつ接種し
、間接免疫蛍光染色法(ｉｍｍｕｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ；ＩＦＡ)でウイルスを確認し、ブラインド継代培養を持続的に進行した。より具体的には、ＰＲＲＳＶが感染されたことで確認された細胞を、４％パラホルムアルデヒド固定液を使用して５分間固定した後、緩衝溶液を使用して１０分間３回洗浄した。以後、抗体の非特異結合を防止するために、２％ＢＳＡ溶液で１時間の間処理した後、５分間３回洗浄した。１次抗体として、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＰＲＲＳＶ Ｍａｂ ４Ａ５(ＪＢＴ Ｃａｔ＃９０４１)を使用し、２次抗体としては、ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＦＩＴＣ(Ｓａｎｔａｃｒｕｚ)を使用した。

【0043】

その結果を図２に示した。

【0044】

図２に示したように、分離されたＰＡＭにウイルスを接種した後、９６時間が経つと、ＰＡＭ細胞内で蛍光を確認することができた。これを通じて、ＰＡＭ細胞にＰＲＲＳＶが効果的に感染されたことを確認した。

【0045】

１.３ プラーク分離方法を通じたウイルスクローンの分離
ＰＡＭ細胞を３×１０⁵ｃｅｌｌｓ/ウェル濃度で６−ウェルプレートに接種後に１２時間が経過した後、分離されたＰＲＲＳＶをＭＯＩ＝１から始めて１０倍に希釈し、各々のウェルに接種した。１時間の間培養した後、培地を除去し、ウイルスの感染が行われた細胞層上に０.５％アガロースと１０％ウシ胎仔血清が入っているＤＭＥＭ培地を覆って、
３７℃、５％のＣＯ₂で培養した。約７２時間が経過した後、プラークの形成を目視で確
認し、各々のプラークを独立的に分離精製してＰＲＲＳＶクローンを分離した。

【0046】

実施例２. ＰＲＲＳＶ遺伝子分析を通じたＪＷ−ＰＲＲＳＶ(ＫＣＴＣ １２０９６ＢＰ)
の分離
２.１ ＰＲＲＳＶ遺伝子の増幅
分離されたＰＲＲＳＶのＯＲＦ５部分の遺伝子情報から系統分析してウイルスを分類した。ＰＲＲＳＶ培養液１５０LからＶｉｒａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｉ
ｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ)を利用して製造社の使い方によってＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡ
を抽出した。各々の遺伝子分節に相応するバイラルｃＤＮＡを合成するためにＲＴ−ＰＣＲを進行した。抽出したＲＮＡ１０μlに１０ｐｍｏｌＯＲＦ５の逆方向プライマー２μlを入れて、８０℃で３分間加熱した後また冷却し、ＲＮＡ阻害剤(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)１μl、５× ＲＴ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(Ｐｈ８.３)、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ)、１０ｍＭ ｄＮＴＰ(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)２μl、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)１μlを入れて、３７℃で１
時間３０分間増幅させた。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを進行した。ＰＣＲは、ｐｒｅｍｉｘチューブ(Ｉｎｔｒｏｎ)に滅菌蒸溜水１６μl、ｃＤＮＡ２μl、プライマー１μlを入れて、９４℃で５分、９４℃で２０秒の変性、６０℃で３０秒のアニール、
７２℃で４５秒の伸張の過程で構成された一連の反応を一サイクルとして３４回繰り返し
実行し、最後に、７２℃で５分間インキュベートした。実験に使用したプライマーは、ＯＲＦ５遺伝子の塩基配列分析のために既に塩基配列が報告されたＶＲ２３３２(ＵＳ ｓｔｒａｉｎ、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ. Ｕ８７３８２)を参考に
し、正方向プライマー(ＣＣＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＡ)、逆方向プライマー(ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＡＴ)を使用した。

【0047】

２.２ 分離されたＰＲＲＳＶの系統分析
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに電気泳動した後、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ)で純粋分離し、これらＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔプラスミドベクターのｌａｃ Ｚ遺伝子のマルチクローニング部位に連結
し、Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌをホスト細胞として各々の遺
伝子をクローニングした。より具体的には、−７０℃に保管中のＥ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α
を氷でとかした後、連結されたプラスミドＤＮＡがあるチューブに５０〜７０μl注入し
た。氷上で２０分間放置した後、４２℃で９０秒間熱衝撃を加えて、更に氷上に３分間放置した。チューブにＬＢ(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ)培地１ｍｌを入れて、３７℃の培養器で１時間の間培養した後、アンピシリン(３００ｍｇ/ｍｌ)、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ
などが含有されたＬＢ寒天培地に均一に株分けし、３７℃でひと晩の間培養した。培養後、白いコロニーを選択して塩基配列分析のためのプラスミドＤＮＡ抽出に使用した。選択された白いコロニーをアンピシリンが含有されたＬＢアガープレート５ｍｌに１個ずつ入れて、３７℃の培養器でひと晩の間培養した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ、Ｕ.Ｓ.Ａ.)を使用してプラスミドＤＮＡを抽出した。精製されたプラスミドＤＮＡの遺伝子情報をＷｏｒｋｂｅｎｃｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４(ＣＬＣ Ｂｉｏ、Ａａｒｈｕｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ)ソフトウェアで分析して系統分析図を作って、ウイルス原種のヌクレオチド配
列と継代培養した配列を比較して遺伝的変異を分析した。

【0048】

その結果を図３に示した。

【0049】

図３に示したように、分離したＰＲＲＳＶは、北アメリカ型とは１８％のヌクレオチドが相異なっている新しい韓国型ＰＲＲＳＶであることで確認した。新しい韓国型ＰＲＲＳＶは、ＪＷ−ＰＲＲＳＶと名付け、２０１１年１２月２日にＫＣＴＣ １２０９６ＢＰで
寄託した。

【0050】

実施例３. 韓国型ＰＲＲＳＶ(以下；ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)を利用した開発ワクチンの免疫原性の確認(継代５、継代９１)
３.１ ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種後の臨床測定
新しく分離したＪＷ−ＰＲＲＳＶをワクチンとして開発するために、継代５及び継代９１のＪＷ−ＰＲＲＳＶを豚に接種した後、その効果を観察した。より具体的には、ＰＲＲＳＶ陰性であり、ＳＰＦ(Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ)の初乳未摂取(Ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ−Ｄｅｒｉｖｅｄ)豚１２匹を対象として、継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ、継代９１ＪＷ−ＰＲＲＳＶ、ＭＬＶワクチン(常用生ワクチン)、陰性対照区を含んで総４個のグループを構成して免疫原性を確認した(表１)。

【0051】

【表1】

【0052】

各グループ別にウイルス１×１０⁵ＰＦＵ/ｍｌで２ｍｌずつ接種し、接種した後、１日、３日、６日、１０日、１５日、２１日、２８日、３５日目に体温/運動性/飼料摂取量などの臨床症状を観察した。接種後３７日目に原腫毒ＪＷ野外ウイルスを１×１０⁴ＰＦＵ/ｍｌで攻撃接種し、上と同一な項目に対してモニタリングを実施した。より具体的には、体温及び運動性は、実験期間中で一日２回にわたって同一な時間に測定し、運動性は、個体観察を通じて０点〜４点まで０.５点の間隔差で点数を付与する方式でモニタリングし
た(０点：運動性なし、１点：運動性弱い、２点：運動性普通、３点：運動性良好、４点
：運動性非常に良好)。また、飼料摂取量は、体重による制限給餌を実施し、１０分以内
に全量摂取時に非常に良好(４点)で判断し、飼料を全量摂取する時間によって、０点〜４点まで０.５点の間隔差で点数を付与した。前記のような方式の点数合算を通じて総合的
な運動性と飼料摂取量を評価した。

【0053】

その結果を表２に示した。

【0054】

【表2】

【0055】

表２に示したように、該当点数を解釈した結果、継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ、継代９１ＪＷ−ＰＲＲＳＶ及びＭＬＶ接種群は、実験終了時まで飼料摂取及び運動性がいずれも良好
であった。したがって、継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ、継代９１ＪＷ−ＰＲＲＳＶがいずれも市販されるＭＬＶワクチンと同一な程度のウイルス防御能を誘導することを確認した。

【0056】

３.２ 韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)接種後の抗体価の測定
ＪＷ−ＰＲＲＳＶのワクチン効果の評価のために、前記実施例３.１と同一な条件でウ
イルスを接種した後、抗体価の測定を実行した。接種後３７日目に原腫毒ＪＷ野外ウイルスを１×１０⁴ＰＦＵ/ｍｌで攻撃接種し、実施例３.１と同一な項目に対してモニタリン
グを実施した。攻撃接種１４日後、全個体に対して剖検を実施し、肺、リンパ、扁桃、脾臓、肝、脳、腎臓に対して定量ＰＣＲを進行した。ワクチンウイルスが野外ウイルスに対する防御能を誘導するためには、一次で血清検査で抗体が陽性で判定される必要があり、またウイルス中和能力を有しなければならない。接種動物において抗体価が陽性に転換されたか否かをＥＬＩＳＡ(ＨｅｒｄＣｈｅｋ：ＰＲＲＳ ２ＸＲ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ(ＩＤ
ＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ、ＵＳＡ))方法で測定し
た。ＰＲＲＳＶ抗体有無は、Ｓ/Ｐ割合で示し、Ｓ/Ｐ割合が０.４以上である時に陽性で
判定した。

【0057】

その結果を表３及び図４に示した。

【0058】

【表3】

【0059】

表３及び図４に示したように、接種後１０日目から対照群を除いた継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ、継代９１ＪＷ−ＰＲＲＳＶ及びＭＬＶ接種群の実験群で抗体価の上昇が現われた。接種後３５日目には、全ての実験群で抗体価が陽性に転換されたことを確認することができた。

【0060】

３.３ ＪＷ−ＰＲＲＳＶによるウイルス力価の測定
ＪＷ−ＰＲＲＳＶのワクチン効果の評価のために、前記実施例３.１と同一な条件でウ
イルスを接種した後、血液及び剖検後の組職内のＰＲＲＳＶ力価を測定した。接種後３７日目に原腫毒ＪＷ野外ウイルスを１×１０⁴ＰＦＵ/ｍｌで攻撃接種し、実施例３.１と同
一な項目に対してモニタリングを実施した。

【0061】

その結果を表４に示した。

【0062】

【表4】

【0063】

表４に示したように、継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群では、１０日目まで血液内でウイルスが検出される個体があり、継代９１ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群では、接種後、攻撃接種後に全て血液内でウイルスが検出されなかった。常用生ワクチンＭＬＶでは、接種後６日目に多少のウイルスが検出されたが、攻撃接種後には検出されなかった。陰性対照群では、攻撃接種７日目に相当量のウイルスが血液内で検出された。

【0064】

実施例４．韓国型ＰＲＲＳＶ(ＪＷ−ＰＲＲＳＶ)を利用した開発ワクチンの安全性及び免疫原性の確認(継代３、継代１２０)
ＰＲＲＳＶが陰性であり、ＳＰＦ(Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｆｒｅｅ)である初乳未摂取(Ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ−Ｄｅｒｉｖｅｄ)の豚２０匹を対象として、ＭＬＶワクチン(常用生ワクチン；Ｇ−Ａ)、継代３ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｂ)、継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)、陰性対照群１(攻撃接種に対する陰性対象群；Ｇ−Ｄ)、陰性対照群２(全体実験対比陰性対照群；Ｇ−Ｅ)を含んで総５個のグループを構成した。各グループ別にウイルス１×１０⁵ＰＦＵ/ｍｌで２ｍｌずつ接種し、接種後７日、１４日、２１日、２８日、３５日目に体温/運動性/飼料摂取量などの臨床症状を観察し、各々採血して血液内のウイルス力価と抗体価を測定し、血球分析、臨床症状分析を進行した。そして、４２日目に原腫毒ＪＷ野外ウイルスを１×１０⁴ＰＦＵ/ｍｌで攻撃接種し、上と同一な項目
に対してモニタリングを実施した。ワクチンウイルスが野外ウイルスに対する防御能が生ずるためには、一次で血清検査で抗体が陽性で判定される必要があり、またウイルス中和能力を有しなければならない。接種動物において抗体価が陽性に転換されたか否かは、ＥＬＩＳＡ(ＨｅｒｄＣｈｅｋ：ＰＲＲＳ ２ＸＲ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ(ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ、ＵＳＡ))方法で測定し、中和抗体価が誘導されたか否かは、ＶＮ(Ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ)テストを利用して
測定した。

【0065】

４.１ ＲＴ−ＰＣＲ技法で血液内ウイルスの力価測定
ＰＲＲＳＶの量を測定するために、既に塩基配列が報告されたＶＲ２３３２(ＵＳ ｓｔｒａｉｎ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ、Ｕ８７３８２)を参考
してプライマー(ＯＲＦ７)を製作した(正方向プライマーＡＴＧ ＡＴＧ ＲＧＣ ＴＧＧ
ＣＡＴ ＴＣＴ、逆方向プライマーＡＣＡ ＣＧＧ ＴＣＧ ＣＣＣ ＴＡＡ ＴＴＧ)。ＰＲ
ＲＳＶ培養液１５０μlからバイラルＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｉｎｔｒｏｎ. Ｋｏｒｅａ)を利用してキット製造社の使い方によってＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡ抽出
し、各々の遺伝子分節に相応するバイラルｃＤＮＡを合成するためのＲＴ−ＰＣＲを実行した。抽出したＲＮＡ１０μlに１０ｐｍｏｌ ＯＲＦ５の逆方向プライマー２μlを入れ
て、０℃で３分間加熱した後冷却し、ＲＮＡ阻害剤(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)１μl、
５× ＲＴ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.３)、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ)、１０ｍＭ ｄＮＴＰ(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)２μl、Ｍ
−ＭＬＶ逆転写酵素(Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｕ.Ｓ.Ａ)１μl を入れて、３７℃で１時間３０分間増幅させた。ＰＣＲは、合成されたｃＤＮＡ ２μl、Ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ ｄｙｅ １
０μl (Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｋｏｒｅａ)、滅菌蒸溜水６μl、各１μlのプライマーを使用し
、９５℃で３分、変性段階９６℃(２０秒)、アニール段階６０℃(２０秒)、伸張段階７２℃(３０秒)で構成された一連の反応を１サイクルとして４０回繰り返し実行し、５５℃で１分、６０℃で１０秒の反応を７１回繰り返し後終了した。ＲＴ−ＰＣＲは、連続希釈した量が分かっているＤＮＡを標準でＰＣＲ反応をするので、基本に増幅が指数的に起きる領域で一定増幅産物量になるサイクル数(ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ；Ｃｔ値)を横
軸とし、初期ＤＮＡ量を縦軸として、検量線を作成し、未知濃度飼料も同一条件下で反応してＣｔ値を求めることで、目的ＤＮＡ量を測定した。

【0066】

その結果を表５に示した。

【0067】

【表5】

【0068】

表５に示したように、ＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)を接種したグループでは、接種後７日目に全ての個体でウイルスが検出され、３５日まで持続する個体が存在した。継代５ＪＷ-
ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｂ)では、接種後７日目に全ての個体で高い力価のウイルスが検出された。以後持続的に２８日目まで検出が確認され、３５日目まで検出される個体も存在した。継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)接種群では、接種後１４日目に２個体でウイ
ルスが検出され、接種後２１日目まで維持した後２８日目から検出されなかった。このような結果を通じて、常用ワクチンであるＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)より６倍程度低いウイルス力価を示し、血液内残存日も短いことがわかる。また、ＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)接種群は、全ての接種個体でウイルスが検出されたが、継代１２０ＪＷ-ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)接
種群では、２匹個体でのみウイルスが確認された。４２日目に攻撃接種後、ＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)接種群では、接種後７日目に３匹個体で血液内ウイルス検出されて、継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｂ)では、４個体の全てからウイルスが検出されなかった。これは相同攻撃接種に対する保護作用(ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ protection)であると判断される(Ｒｅｐｏｒｔ：Ｃｏｌｌｏｑｕｉｕｍ ｏｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ
ｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＰＲＲＳ Ｖｉｒｕ
ｓ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ａｕｇｕｓｔ １３、２００７ − Ｄ.Ｌ. Ｒｏｃｋ、ＰｈＤ、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ)。継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｃ)では、攻撃接種後７日目に２個体でウイルス検出が確認された。陰性対照群(Ｇ−Ｄ)で
は、攻撃接種７日目に２個体で相当量のウイルスが血液内で検出され、そのうち一個体は、接種後１４日目に斃死した。この個体に対して剖検を進行し、肺、リンパ、扁桃、腎臓、気管支、肝に対してウイルス力価の測定を実施した。

【0069】

その結果を表６に示した。

【0070】

【表6】

【0071】

表６に示したように、斃死した陰性対照群の肺と扁桃から相当量のウイルスが検出されたことを確認することができた。

【0072】

４.２ 血液内抗体価の測定結果
各接種群別に採血したサンプルをＥＬＩＳＡ(ＨｅｒｄＣｈｅｋ：ＰＲＲＳ ２ＸＲ Ｅ
ＬＩＳＡ ｋｉｔ(ＩＤＥＸＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ、
ＵＳＡ))方法で測定し、ＰＲＲＳＶに対する血液内抗体価を測定した。ＰＲＲＳＶの抗体形成有無は、Ｓ/Ｐ割合で示し、Ｓ/Ｐ割合が０.４以上の場合を陽性として判定した。

【0073】

その結果を表７及び図５に示した。

【0074】

【表7】

【0075】

表７及び図５に示したように、ＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)を接種したグループでは、接種後１４日目から２匹個体で抗体価が陽性に転換され、２８日目には、４匹個体が全て陽性に転換された。継代５ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｂ)では、接種後７日目に１匹個体が陽性に転換され、１４日目には、４匹個体が全て陽性に転換された。継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)接種群では、接種後２１日目に２匹個体の陽性転換を始まり、２８日目は、４匹個体が全て陽性に転換されたことを確認した。これを通じて、継代１２０ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)接種群が安全であると共に抗体価を充分に誘導することができる候補物質であることを確認することができた。

【0076】

４.３ 血球分析結果
自動血球計測機を使用して各接種群から収集した血液サンプルで血液内に存在する各種血液細胞の数値を測定した。

【0077】

その結果を図６に示した。

【0078】

図６に示したように、継代３ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｂ)で白血球が多少増加したが、他の実験群では実験終了時まで白血球数値の変化が大きくないことを確認することができた(ａ)。また、血液内リンパ球の測定結果、ワクチン候補群の接種後にも４.３〜１
３,６００ｃｅｌｌｓ/μlの正常リンパ球の数値を示した(ｂ)。これは、本発明のワクチ
ン候補物質が個体内で炎症を誘発しない安全な物質であることを示す結果である。

【0079】

４.４ 臨床分析結果
ワクチンの攻撃接種後の豚で現われる臨床症状を観察した。体温及び運動性は、実験期間中で一日２回にわたって同一な時間に測定し、運動性は、個体観察を通じて０点〜４点まで０.５点単位で点数を付与した(０点：運動性なし、１点：運動性弱い、２点：運動性普通、３点：運動性良好、４点運動性非常に良好)。飼料摂取量は、体重による制限給餌
を実施し、１０分以内に全量摂取時に非常に良好(４点)で判断し、飼料を全量摂取する時間によって０点〜４点まで０.５点の間隔差で点数を付与した。

【0080】

その結果を表８及び図７に示した。

【0081】

【表8】

【0082】

表８及び図７に示したように、継代３ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(Ｇ−Ｂ)は、全般的に運動性と飼料摂取量が多少弱いことで観察されたが、全般的に特異事項なしに飼料摂取及び運動性は良好であることで確認された。

【0083】

実施例５．ＪＷ−ＰＲＲＳＶワクチンの製造
５.１ 継代方法及び保存
同定試験と免疫原性試験から確認された１０^4.0ＴＣＩＤ₅₀/ｍｌ以上のＰＲＲＳ原腫毒ウイルス(１２０継代株)をＭＡＲＣ−１４５細胞に接種し、３７℃で４〜５日間培養した後に採毒し、凍結乾燥するか−８０℃で凍結保存した。腫毒は原腫毒と同一な方法で増殖
させた組職培養順化ＰＲＲＳＶを採毒した後、凍結乾燥するか−８０℃で凍結保存し、腫毒では３代以上継代しなかった。ウイルス力価は、１０^6.0ＴＣＩＤ₅₀/ｍｌ以上になるように製造した。

【0084】

５.２ バルク生産及びウイルス含量試験
細胞増殖用培地にＭＡＲＣ−１４５またはＰＡＭ細胞を８５０cm²の回転ボトルで培養
した後、３〜５日間隔で継代培養した。８５０cm²の回転ボトル培養細胞の断層が形成さ
れた時、細胞増殖用培地を除去し、製造用ウイルスを細胞が充分に覆うほどの量で接種した後、３７℃で１時間の間吸着させた。接種液を除去して細胞増殖用培地を添加し、３７℃で４〜５日間回転培養した。遠心分離したウイルス培養液を１０倍段階希釈してＭＡＲＣ−１４５またはＰＡＭ細胞が培養された９６ウェルプレートに接種し、３７℃で７日間培養しながら細胞変性効果(ＣＰＥ)を観察した。ウイルスも培養後、ＣＰＥが８０〜９０％以上出現した時、無菌的に収穫して−８０℃に凍結保管した。

【0085】

５.３ 試験ワクチンの製造
*分離されたウイルスを抗原として保護剤を添加して試験ワクチンを製造した。滅菌リ
ン酸緩衝液を加え、凍結乾燥器を利用して試験用ワクチン３種(製造番号；６０ ＰＲＲＳ
０１、６０ ＰＲＲＳ ０２、６０ ＰＲＲＳ ０３)を製造した。製造された試験用ワクチンの含量は、表９、表１０、表１１の通りである。

【0086】

【表9】

【0087】

【表10】

【0088】

【表11】

【0089】

保護剤として既存に使用されるＬＰＧＧ(ラクトース)よりＴＰＧＧ(トレハロース)を使用することで、既存保護剤により生ワクチン製造時に発生できる汚染を最小化してワクチンの安全性を高めた。保護剤別のウイルス含量比較表は、表１２に示した。

【0090】

【表12】

【0091】

５.４ 試験ワクチンの安全性試験
前記実施例５.３で製造された試験ワクチンに対する安全性を試すために、特性、真空
度、水素イオン濃度、含湿度、無菌試験、マイコプラズマ否定試験、迷入ウイルス試験、含量試験、力価試験を、製造当時、製造３ヶ月後、製造６ヶ月後にわたって実行した。
安全性試験に対する結果を表１３に示した。

【0092】

【表13】

【0093】

表１３に示したように、製造された試験ワクチンの６０ ＰＲＲＳ ０１、６０ ＰＲＲ
Ｓ ０２、６０ ＰＲＲＳ ０３は、いずれも製造当時、製造３ヶ月後、製造６ヶ月後にも
全ての安全性実験項目において適合であることを確認することができた。したがって、本発明の新規した韓国型ＰＲＲＳＶであるＪＷ−ＰＲＲＳＶを利用したワクチンは、安全性面においても適合なワクチンであることが分かる。

【0094】

実施例６．試験ワクチンの安全性確認
生ワクチンにおいて一番重要な安全を確認するために、実験動物であるマウス、モルモ
ットと目的動物である子豚に試験ワクチンを接種し、７日間または２１日間の生存率を観察した。接種した試験ワクチンは、前記実施例５.３で製造された６０ ＰＲＲＳ ０１、
６０ ＰＲＲＳ ０２、６０ ＰＲＲＳ ０３を使用し、製造当時、製造３ヶ月後、製造６ヶ月後の試験ワクチンを実験動物及び目的動物に接種し、生存率を各々確認した。

【0095】

６.１ マウスにおいての試験ワクチンの安全性確認
体重１５〜２０ｇのマウス８匹を公試し、各々試験ワクチン０.５ｍｌ(製造当時、製造後３ヶ月、製造後６ヶ月)を腹腔接種し、７日間観察した。
その結果を表１４に示した。

【0096】

【表14】

【0097】

表１４に示したように、試験ワクチンをマウスに接種した際にすべての個体が生存したので、安全なワクチン候補群になることができることを確認した。

【0098】

６.２ モルモットにおいての試験ワクチンの安全性確認
体重３００〜３５０ｇのモルモット４匹を公試し、２匹はモルモット筋肉または皮下に２頭分を、他の２匹は、腹腔に２頭分を接種(製造当時、製造後３ヶ月、製造後６ヶ月の
ワクチン)し、７日間観察した。

【0099】

その結果を表１５に示した。

【0100】

【表15】

【0101】

表１５に示したように、全ての試験ワクチン接種群で７日間何の異常なしに生存を確認し、製造された試験ワクチンがモルモットにおいても安全なワクチンであることを確認した。

【0102】

６.３ 子豚においての試験ワクチンの安全性確認
目的動物である子豚に対して、試験ワクチン(製造当時、製造後３ヶ月、製造後６ヶ月
のワクチン)の安全性を確認した。体重８〜１０ｋｇ(４〜６週齢)のＰＲＲＳＶ抗体陰性
である元気な豚１８匹にワクチン１０頭分を各々筋肉接種した後、２１間観察した。

【0103】

その結果を表１６に示した。

【0104】

【表16】

【0105】

*表１６に示したように、接種後１〜２時間内に子豚で過敏反応が現われなかった。ま
た、２１日間観察する間、注射部位の化膿、壊死、発熱及び下痢などの副作用がなしに全て生存することを確認した。したがって、本発明の試験ワクチンは、豚のＰＲＲＳＶのワクチンとして適合な安全性を有していることが分かる。

【0106】

実施例７．試験ワクチンのＳＰＦ豚に対する安全性確認
前記実施例５で製造された試験ワクチンを高い濃度で目的動物に感染させた時、血液と組職内のウイルス感染程度を確認し、目的動物内で連続継代接種をした時のウイルスの病原性が元々の野生型またはその以上の病原性に復帰するかどうかを確認した。ＳＰＦ状態の豚２匹に１次接種を始まり、弱毒化された１２０継代ＪＷ−ＰＲＲＳＶ ２×１０⁶ＰＦＵ/ｍｌを筋肉と鼻腔に各々２ｍｌ接種し、１日目、３日目、７日目の血液、剖検後の肺
、扁桃、リンパにおいてのウイルス感染程度を確認した。接種個体の日齢と体重、ウイルス内訳と試験日程は、表１７に示し、試験日程によるウイルス感染程度の確認結果は、表１８に示した。

【0107】

【表17】

【0108】

【表18】

【0109】

表１８に示したように、１次〜５次までの目的動物において、逆継代培養後の血液と組職内でウイルス力価を測定した結果、５次接種までの血液では、ウイルスが検出されなく、組職内で低いウイルス力価を示し、５継代の間ウイルスの増幅や転移及び臨床症状は現われなかった(*Ｎ.Ｄ；ｎｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ)。また、接種時から剖検時まで観察した結果、注射部位の化膿、壊死、発熱及び下痢などの副作用がなしに全て生存することを確認した。

【0110】

実施例８．ウイルス排出の確認
一般的に初めて生毒ワクチンを接種する場合には、ワクチンウイルスのウイルス排出(
ｓｈｅｄｄｉｎｇ)を普通３〜５週まで観察することができる。ワクチンウイルスは、何
の異常症状を誘発しないので、生毒ワクチンウイルスのウイルス排出の副作用が問題になる。本発明のワクチン候補物質のウイルス排出時間を確認し、既存の常用ワクチンとの比較を実行した。実験群は、ＭＬＶワクチン(Ａ)接種群、５継代ＪＷ−ＰＲＲＳＶ接種群(
Ｂ)、１２０継代ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｃ)接種群に分類し、ワクチン接種後に７日、１２日
、１５日、１９日、２２日、２６日、２９日、３３日、３６日、攻撃接種後に０日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日の日程で各グループ別に個体の鼻腔サンプルを採取し、ウイルス特異的なプライマーを使用してＰＣＲを実行し、各実験群別にウイルス排出程度を確認した。プライマー配列は、表１９に示した配列を利用した。ＰＣＲは、既存の方法と同一に進行し、１％アガロースゲルで確認した。

【0111】

【表19】

【0112】

その結果を図８に示した。

【0113】

図８に示したように、ＭＬＶワクチン(Ｇ−Ａ)を接種したグループでは、ワクチン接種後に１２日までウイルスの排出が検出された。攻撃接種後には、２８日までウイルスの排出が行われることを確認した。一方、１２０継代ＪＷ−ＰＲＲＳＶ(Ｇ−Ｃ)接種群では、接種期間と野外ウイルス感染後の期間で全てウイルスの排出が確認されなかった。これは、既存に市販されるＰＲＲＳＶに対するワクチンと比較して速いウイルス排出を示すことを意味する。長期間のウイルス排出は何回の複製過程を通すようになり、この過程で組換えを通じて再び毒性を回復して新しいウイルスが出現して更に病原性株に回帰可能性が高いので、本発明のワクチンは、速いウイルス排出により既存のＰＲＲＳＶワクチンの問題点を改善することができることが期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】