特許 6202659 癌組織の不均一性マーカー及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6202659

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】癌組織の不均一性マーカー及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170914BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20170914BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12M1/00 A

   C12N15/00 A

   G01N33/50 P

   G01N33/68

   C07K16/18

   C12N5/09

【請求項の数】26

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2017-503971(P2017-503971)

(86)(22)【出願日】2016年6月30日

(86)【国際出願番号】JP2016069529

(87)【国際公開番号】WO2017002943

(87)【国際公開日】20170105

【審査請求日】2017年1月23日

(31)【優先権主張番号】特願2015-133033(P2015-133033)

(32)【優先日】2015年7月1日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(74)【代理人】

【識別番号】100188592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 洋

(72)【発明者】

【氏名】佐谷 秀行

(72)【発明者】

【氏名】有馬 好美

(72)【発明者】

【氏名】千場 隆

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０１００１２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１１６１４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２５１５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１３１６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１４４８０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５０７９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２７２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０６４７０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 "Homo sapiens calmodulin-like 3 (CALML3), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１４年 ９月 ６日，Ver.3，Accession No. NM_005185，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/635574597?sat=21&satkey=53615290

【文献】 "Homo sapiens biglycan (BGN), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.4，Accession No. NM_001711，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/268607602?sat=21&satkey=51223827

【文献】 "Homo sapiens chloride channel accessory 2 (CLCA2), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.5，Accession No. NM_006536，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/187761335?sat=4&satkey=136622903

【文献】 "Homo sapiens cystatin A (stefin A) (CSTA), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.3，Accession No. NM_005213，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/61743964?sat=4&satkey=136633760

【文献】 "Homo sapiens aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 (ALDH1A1), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.4，Accession No. NM_000689，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/327365354?sat=21&satkey=51816339

【文献】 "Homo sapiens nerve growth factor receptor (NGFR), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.3，Accession No. NM_002507，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/295842401?sat=4&satkey=136635976

【文献】 "Homo sapiens S100 calcium binding protein A8 (S100A8), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.4，Accession No. NM_002964，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/315221156?sat=4&satkey=136650194

【文献】 "PREDICTED: Homo sapiens elastin (ELN), transcript variant X1, mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１２日，Ver.1，Accession No. XM_011515868，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/767946999?sat=4&satkey=136442212

【文献】 "Homo sapiens SNRPN upstream reading frame (SNURF), transcript variant 1, mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.3，Accession No. NM_005678，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/29540557?sat=4&satkey=136622067

【文献】 "Homo sapiens lectin, galactoside-binding, soluble, 7 (LGALS7), mRNA."，[online], インターネット，GenBank，２０１５年 ３月１５日，Ver.3，Accession No. NM_002307，[検索日：平成２９年２月２３日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/194688138?sat=4&satkey=136627445

【文献】 YANG, X. et al.，"Microcirulatory fraction (MCF1) as a potential imaging marker for tumor heterogeneity in breast cancer."，MAGNETIC RESONANCE IMAGING，２０１２年１０月，Vol.30, No.8，P.1059-1067，ISSN 1541-2016

【文献】 YIP, C. et al.，"Primary esophageal cancer: heterogeneity as potential prognostic biomarker in patients treated with definitive chemotherapy and radiation therapy."，RADIOLOGY，２０１４年 １月，Vol.270, No.1，P.141-148，ISSN 0033-8419

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＣＡＬＭＬ３）、Ｂｉｇｌｙｃａｎ（ＢＧＮ）、Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ２（ＣＬＣＡ２）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ａ（ＣＳＴＡ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）、Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、Ｓ１００−ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）、ＳＮＲＰＮ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＳＮＵＲＦ）及びＧａｌｅｃｔｉｎ−７（ＬＧＡＬＳ７）からなる群より選択される遺伝子の、その存在の有無によって癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの情報を提供するためのマーカーとしての使用。

【請求項2】

癌の予後についての情報を提供する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の使用のための、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを含むキット。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の使用のための、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを含むキット。

【請求項5】

ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされるタンパク質の、その存在の有無によって癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの情報を提供するためのマーカーとしての使用。

【請求項6】

癌の予後についての情報を提供する、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

請求項５又は６に記載の使用のための、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質を含むキット。

【請求項8】

前記特異的結合物質が抗体又は抗体断片である、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、
を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット。

【請求項10】

癌の予後判定用である、請求項９に記載のキット。

【請求項11】

癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法。

【請求項12】

前記検出工程は、前記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われる、請求項１１に記載の判定方法。

【請求項13】

前記検出工程は、前記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われる、請求項１１に記載の判定方法。

【請求項14】

前記癌組織試料が、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の判定方法。

【請求項15】

前記乳癌が、エストロゲン受容体（−）プロゲステロン受容体（−）ＨＥＲ２（−）乳癌である、請求項１４に記載の判定方法。

【請求項16】

不均一な前記癌細胞集団が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の判定方法。

【請求項17】

癌の予後についての情報を提供する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の判定方法。

【請求項18】

単独の移植では腫瘍を形成しにくい癌細胞と、単独の移植でも腫瘍を形成する癌細胞とを混合して非ヒト動物に移植する工程を備える、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はタンパク質を発現する、不均一な癌細胞集団の製造方法。

【請求項19】

単独の移植でも腫瘍を形成する前記癌細胞がＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞であり、単独の移植では腫瘍を形成しにくい前記癌細胞がＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞である、請求項１８に記載の製造方法。

【請求項20】

単独の移植でも腫瘍を形成する前記癌細胞又は単独の移植では腫瘍を形成しにくい前記癌細胞が、ヒト由来の癌細胞である、請求項１８又は１９に記載の製造方法。

【請求項21】

単独の移植では腫瘍を形成しにくい癌細胞と単独の移植でも腫瘍を形成する癌細胞とを混合して非ヒト動物に移植することにより得られ、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はタンパク質を発現する、不均一な癌細胞集団。

【請求項22】

単独の移植でも腫瘍を形成する前記癌細胞がＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞であり、単独の移植では腫瘍を形成しにくい前記癌細胞がＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞である、請求項２１に記載の不均一な癌細胞集団。

【請求項23】

単独の移植でも腫瘍を形成する前記癌細胞又は単独の移植では腫瘍を形成しにくい前記癌細胞が、ヒト由来の癌細胞である、請求項２１又は２２に記載の不均一な癌細胞集団。

【請求項24】

生体から単離された、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の不均一な癌細胞集団。

【請求項25】

請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の不均一な癌細胞集団に抗癌剤を投与する工程を備える、抗癌剤による治療効果の評価方法。

【請求項26】

請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の不均一な癌細胞集団に抗癌剤を投与する工程を備える、抗癌剤のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌組織の不均一性マーカー及びその使用に関する。より具体的には、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、タンパク質マーカー、キット、及び癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法に関する。本願は、２０１５年７月１日に、日本に出願された特願２０１５−１３３０３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

１つの癌組織中に性質の異なる癌細胞が混在している場合があることが知られている。このような状態は、腫瘍内不均一性（intratumor heterogeneity）と呼ばれ、癌治療を困難にしている一因であると考えられている（例えば、非特許文献１を参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Inda M. M., et al., Tumor heterogeneity is an active process maintained by a mutant EGFR-induced cytokine circuit in glioblastoma., Genes Dev., 24(16), 1731-1745, 2010.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従来、癌組織の不均一性（癌組織が不均一な癌細胞集団を含む状態）を判定する方法は知られていなかった。そこで、本発明は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーを提供することを目的とする。本発明はまた、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は以下の通りである。
（１）Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＣＡＬＭＬ３）、Ｂｉｇｌｙｃａｎ（ＢＧＮ）、Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ２（ＣＬＣＡ２）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ａ（ＣＳＴＡ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）、Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、Ｓ１００−ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）、ＳＮＲＰＮ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＳＮＵＲＦ）及びＧａｌｅｃｔｉｎ−７（ＬＧＡＬＳ７）からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー。
（２）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされる、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー。
（３）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質からなる、癌の予後判定用マーカー。
（４）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット。
（５）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌の予後判定用キット。
（６）癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法。
（７）前記検出工程は、前記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われる、（６）に記載の判定方法。
（８）前記検出工程は、前記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われる、（６）に記載の判定方法。
（９）前記癌組織試料が、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものである、（６）〜（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）前記乳癌が、エストロゲン受容体（−）プロゲステロン受容体（−）ＨＥＲ２（−）乳癌である、（９）に記載の判定方法。
（１１）不均一な前記癌細胞集団が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む、（６）〜（１０）のいずれかに記載の判定方法。
（１２）癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料が由来する患者は予後不良であると判定する工程と、を備える、癌の予後判定方法。
（１３）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子を発現する、不均一な癌細胞集団。

【発明の効果】

【0006】

本発明によれば、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー及びｃＤＮＡマーカーを提供することができる。また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】（ａ）は、複数の乳癌細胞株におけるＺＥＢ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。（ｂ）は、複数の乳癌細胞株におけるＣＬＤＮ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。

【図2】実験例３の結果を示すグラフである。

【図3】（ａ）は、癌組織の薄切組織標本を抗ＺＥＢ１抗体で染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）とほぼ同視野の薄切組織標本を抗ＣＬＤＮ１抗体で染色した結果を示す写真である。

【図4】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示すグラフである。

【図5】実験例７の結果を示すグラフである。

【図6】実験例８の解析結果を示す図である。

【図7】（ａ）〜（ｊ）は、実験例１０の結果を示す写真である。

【図8】（ａ）〜（ｊ）は、実験例１１の定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0008】

［癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカー］
１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３、アクセッション番号：ＮＭ＿００５１８５、配列番号２５）、ＢＧＮ（Ｂｉｇｌｙｃａｎ、アクセッション番号：ＮＭ＿００１７１１、配列番号２６）、ＣＬＣＡ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ２、アクセッション番号：ＮＭ＿００６５３６、配列番号２７）、ＣＳＴＡ（Ｃｙｓｔａｔｉｎ Ａ（Ｓｔｅｆｉｎ Ａ）、アクセッション番号：ＮＭ＿００５２１３、配列番号２８）、ＡＬＤＨ１Ａ１（Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ Ａ１、アクセッション番号：ＮＭ＿０００６８９、配列番号２９）、ＮＧＦＲ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、アクセッション番号：ＮＭ＿００２５０７、配列番号３０）、Ｓ１００Ａ８（Ｓ１００−ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ８、アクセッション番号：ＮＭ＿００２９６４、配列番号３１）、ＥＬＮ（Ｅｌａｓｔｉｎ、アクセッション番号：ＮＭ＿０００５０１、配列番号３２）、ＳＮＵＲＦ（ＳＮＲＰＮ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、アクセッション番号：ＮＭ＿００５６７８、配列番号３３）及びＬＧＡＬＳ７（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−７、アクセッション番号：ＮＭ＿００２３０７、配列番号３４）からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー及びこれらの遺伝子のｃＤＮＡであるｃＤＮＡマーカーを提供する。

【0009】

すなわち、本実施形態のマーカーは、ＣＡＬＭＬ３ ｃＤＮＡ、ＢＧＮ ｃＤＮＡ、ＣＬＣＡ２ ｃＤＮＡ、ＣＳＴＡ ｃＤＮＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１ ｃＤＮＡ、ＮＧＦＲ ｃＤＮＡ、Ｓ１００Ａ８ ｃＤＮＡ、ＥＬＮ ｃＤＮＡ、ＳＮＵＲＦ ｃＤＮＡ及びＬＧＡＬＳ７ ｃＤＮＡからなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用ｃＤＮＡマーカーであってもよい。

【0010】

実施例において後述するように、発明者らは、単独の移植では腫瘍を形成しない細胞株と、単独の移植でも腫瘍を形成する細胞株とを混合してヌードマウスに移植することにより、予想外にも不均一な細胞集団からなる癌組織を作製することができた。そして、不均一な癌細胞集団を含む癌組織において特異的に発現する遺伝子として、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７を同定したことにより、本発明を完成した。

【0011】

したがって、癌組織中にこれらの遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。

【0012】

また、実施例において後述するように、発明者らは、不均一な癌細胞集団を含む癌組織は、予後が悪い傾向にあることを見出した。したがって、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子及びｃＤＮＡは、癌の予後判定用遺伝子マーカーであるということもできる。

【0013】

癌組織中にこれらの遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。

【0014】

本明細書において、予後が悪いとは、癌細胞の増殖が速い、癌の転移能が高い、癌組織の抗癌剤耐性が高い、又は患者の生存率が低いこと等を意味する。

【0015】

上記の遺伝子マーカーは、オータネーティブスプライシング等による上記遺伝子のスプライシングバリアントであってもよい。また、上記の遺伝子マーカーは、１塩基多型（ＳＮＰ）等を含む上記遺伝子の変異体であってもよい。

【0016】

また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーは、上記の遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。すなわち、判定用マーカーはタンパク質マーカーであってもよい。

【0017】

また、上述した遺伝子マーカーと同様に、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされるタンパク質は、癌の予後判定用タンパク質マーカーであるということもできる。

【0018】

癌組織における上記の遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ解析、ノーザンブロッティング、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析等により検出することができる。

【0019】

癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーとしては、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子、ｃＤＮＡ、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の中でも、特にＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子、ｃＤＮＡ、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質がより好ましい。実施例において後述するように、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子は、実際にヒト乳癌の臨床検体において発現が確認できている。

【0020】

［癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット］
１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キットを提供する。

【0021】

上述したように、癌組織中に上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。したがって、本実施形態のキットは、癌の予後判定用キットであるということもできる。

【0022】

（プライマーセット）
本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを備えていてもよい。

【0023】

プライマーセットは、これらの遺伝子のｃＤＮＡの少なくとも１部を増幅することができれば、その配列は特に限定されない。具体的なプライマーセットの塩基配列としては、一例として、実施例において後述するものを挙げることができる。

【0024】

上記のプライマーセットを構成する少なくとも一方のプライマーは、上記のいずれかの遺伝子の塩基配列においてエクソンとエクソンとの境目を含む塩基配列を有していてもよい。このようなプライマーは自然界には存在しない塩基配列を有している。

【0025】

（プローブ）
本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備えていてもよい。

【0026】

プローブは、例えば上記の遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも１部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸断片であってもよい。また、プローブは、安定性やハイブリダイゼーション時の特異性等を向上させる等の目的で、種々の化学修飾を有していてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を抑制するために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。

【0027】

また、上記のプローブは、上記のいずれかの遺伝子の塩基配列においてエクソンとエクソンとの境目を含む塩基配列を有していてもよい。このようなプローブは自然界には存在しない塩基配列を有している。

【0028】

プローブは固相上に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、板状基板、膜等が挙げられる。

【0029】

プローブは、例えば、板状基板の表面に固定されてマイクロアレイを形成していてもよい。この場合、例えば、癌組織試料からＲＮＡを抽出して蛍光物質で標識し、マイクロアレイとハイブリダイゼーションさせてマイクロアレイ上のプローブに結合したＲＮＡを検出することにより、癌組織中に上記の遺伝子の発現を検出することができる。上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。

【0030】

（特異的結合物質）
本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質を備えていてもよい。

【0031】

特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に上記のタンパク質を抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。

【0032】

アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。上記のタンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、上記のタンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。

【0033】

特異的結合物質は、上記のタンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。

【0034】

例えば、固定した癌組織の薄切標本を上記の特異的結合物質を用いて免疫染色することにより、上記のタンパク質の存在を検出することができる。上記のタンパク質の存在の検出は、ウエスタンブロッティング法により行ってもよいし、ＥＬＩＳＡ法により行ってもよいし、フローサイトメトリー解析等により行ってもよい。

【0035】

上記のタンパク質のいずれか１つまたは複数の存在は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含んでいることを示す。

【0036】

［癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法］
１実施形態において、本発明は、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供する。

【0037】

上述したように、癌組織試料中に上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。したがって、本実施形態の判定方法は、癌の予後判定方法であるということもできる。

【0038】

上記の検出工程は、上記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われてもよい。あるいは、上記の検出工程は、上記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われてもよい。

【0039】

上記遺伝子のｍＲＮＡの検出は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ解析、ノーザンブロッティング等により行うことができる。また、上記遺伝子がコードするタンパク質の検出は、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析等により行うことができる。

【0040】

上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。

【0041】

上記の癌組織試料は、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものであってもよい。これらの癌には不均一な癌細胞集団を含むものが存在し、不均一な癌細胞集団を含むものは予後が悪いことが知られている。

【0042】

上記の乳癌は、エストロゲン受容体（−）プロゲステロン受容体（−）ＨＥＲ２（−）乳癌、すなわち、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＨＥＲ２を発現していない乳癌であってもよい。このような乳癌はトリプルネガティブ乳癌とも呼ばれ、予後が悪い乳癌であることが知られている。

【0043】

また、上記の不均一な癌細胞集団は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞、すなわちＺＥＢ１を発現しＣＬＤＮ１を発現していない細胞と、ＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞、すなわちＺＥＢ１を発現しておらずＣＬＤＮ１を発現している細胞と、を含むものであってもよい。

【0044】

ＺＥＢ１（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ Ｅ−ｂｏｘ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｏｍｅｏｂｏｘ
１）は、上皮細胞がその細胞極性や周囲細胞との細胞接着機能を失い、遊走、浸潤能を得ることで、間葉系様の細胞へと変化する現象である、上皮間葉転換を誘導する転写因子である。また、ＣＬＤＮ１（Ｃｌａｕｄｉｎ１）は、タイトジャンクションに存在する主要なタンパク質である。

【0045】

実施例において後述するように、不均一な癌細胞集団を含む癌組織の一例として、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む癌組織を挙げることができる。

【0046】

［不均一な癌細胞集団］
１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子を発現する、不均一な癌細胞集団を提供する。本実施形態の癌細胞集団は、インビボで形成したものであることが好ましい。実施例において後述するように、例えば、免疫不全マウスに、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）である癌細胞及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）である癌細胞を混合した混合物を移植することにより、担癌マウスの癌組織として不均一な癌細胞集団を形成することができる。

【0047】

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子のｃＤＮＡを提供する。上述したように、これらのｃＤＮＡは、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、又は癌の予後判定用マーカーとして用いることができる。

【0048】

１実施形態において、本発明は、癌組織試料を患者から採取する工程と、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はｃＤＮＡの発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質との結合の検出により検出する工程と、を備える、癌組織試料中の前記遺伝子の発現を検出する方法を提供する。

【0049】

１実施形態において、本発明は、癌組織試料を患者から採取する工程と、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はｃＤＮＡの発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質との結合の検出により検出する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供する。本実施形態の判定方法は、癌の予後判定方法であるということもできる。

【実施例】

【0050】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0051】

＜不均一な癌組織を有するモデルマウスの作製＞
［実験例１］
（乳癌細胞株におけるＺＥＢ１及びＣＬＤＮ１の発現の検討）
発明者らは、トリプルネガティブ乳癌細胞株である、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＣＣ１９３７、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞における、ＺＥＢ１遺伝子及びＣＬＤＮ１遺伝子の発現を、定量的リアルタイムＰＣＲにより検討した。ＺＥＢ１遺伝子の増幅にはプライマーＺＥＢ１ Ｆｗ（配列番号１）及びＺＥＢ１ Ｒｖ（配列番号２）を使用した。また、ＣＬＤＮ１遺伝子の増幅にはプライマーＣＬＤＮ−ｓ（配列番号３）及びＣＬＤＮ−ａｓ（配列番号４）を使用した。

【0052】

図１（ａ）は、各乳癌細胞株におけるＺＥＢ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、各乳癌細胞株におけるＣＬＤＮ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。

【0053】

その結果、発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）であることを見出した。また、ＨＣＣ１９３７細胞株が、ＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）であることを見出した。

【0054】

［実験例２］
（担癌マウスの作製）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株とＨＣＣ１９３７細胞株とを、ＨＣＣ１９３７細胞株の細胞数がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の細胞数より多くなるように、好ましくはＨＣＣ１９３７細胞株の細胞数：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の細胞数が２：１以上になるように、例えば９：１で混合した混合物を免疫不全マウス（４週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の４番乳腺脂肪組織に移植し担癌マウスを作製した（以下、「Ｍｉｘマウス」という場合がある。）。対照として、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のみ、及びＨＣＣ１９３７細胞株のみを、それぞれ免疫不全マウス（４週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）の４番乳腺脂肪組織に移植し、担癌マウスを作製した（以下、それぞれ「２３１マウス」、「１９３７マウス」という場合がある。）。

【0055】

［実験例３］
（腫瘍体積の経時変化の観察）
実験例２で作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスの腫瘍径を、癌細胞の移植後約３０日間経時的に測定し、腫瘍体積の経時変化を観察した。

【0056】

図２は、各担癌マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。その結果、ＨＣＣ１９３７細胞株のみを移植した１９３７マウスでは、腫瘍が形成されないことが明らかとなった。また、１９３７マウスでは腫瘍が形成されなかったにもかかわらず、ＨＣＣ１９３７細胞株にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を混合して移植したＭｉｘマウスでは腫瘍が形成された。また、Ｍｉｘマウスでは、同数のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株のみを移植した２３１マウスよりも大きな腫瘍が形成されることが明らかとなった。

【0057】

［実験例４］
（担癌マウスの癌組織の免疫染色）
実験例２と同様にして作製したＭｉｘマウスから、癌細胞株の移植１６日後に癌組織を摘出した。続いて、摘出した癌組織をパラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋した。続いて、癌組織の薄切組織標本を作製し、免疫染色により、ＺＥＢ１タンパク質及びＣＬＤＮ１タンパク質の発現を検討した。

【0058】

図３（ａ）は、癌組織の薄切組織標本を抗ＺＥＢ１抗体（カタログ番号「ｓｃ−１０５７２」、サンタクルーズ社）で染色した結果を示す写真である。図３（ｂ）は、図３（ａ）とほぼ同視野の薄切組織標本を抗ＣＬＤＮ１抗体（カタログ番号「ａｂ１５０９８」、アブカム社）で染色した結果を示す写真である。

【0059】

実験例３の結果から、１９３７マウスでは腫瘍が形成されないことが明らかとなった。
この結果から、Ｍｉｘマウスの癌組織は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のみで構成され、ＣＬＤＮ１タンパク質が発現していない可能性が考えられた。これに対し、予想外にも、Ｍｉｘマウスの癌組織において、ＺＥＢ１タンパク質だけでなくＣＬＤＮ１タンパク質の発現が確認された。また、ＺＥＢ１タンパク質の発現とＣＬＤＮ１タンパク質の発現は相互排他的であり、ＺＥＢ１（＋）細胞はＣＬＤＮ１（−）であり、ＣＬＤＮ１（＋）細胞はＺＥＢ１（−）であることが示された。

【0060】

すなわち、Ｍｉｘマウスの癌組織中にはＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞とＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞とが混合して存在しており、不均一な癌組織が形成されていることが確認された。

【0061】

実験例３及び４の結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株とＨＣＣ１９３７細胞株との混合物を免疫不全マウスに移植することにより、不均一な癌組織を有するモデルマウスを作製できることが明らかとなった。また、不均一な癌組織は、より大きな腫瘍を形成したことから、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。

【0062】

＜不均一な癌組織の悪性度の評価＞
［実験例５］
（肺転移の評価）
実験例２で作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスから、癌細胞株の移植１１週後に肺を摘出してパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。続いて、肺の薄切組織標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色して顕微鏡で観察し、癌の肺転移巣の存在を検討した。

【0063】

その結果、Ｍｉｘマウスでは、２３１マウスと比較して、肺転移巣の形成が多かった。
この結果からも、不均一な癌組織は、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。

【0064】

［実験例６］
（抗癌剤による治療効果の検討）
実験例２と同様にして作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスに、パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）を週１回腹腔内投与して腫瘍径を経時的に測定し、腫瘍体積の経時変化を観察した（それぞれｎ＝５）。対照として、パクリタキセルの代わりに生理的食塩水を腹腔内投与した群（対照群）についても腫瘍体積の経時変化を観察した（それぞれｎ＝５）。

【0065】

図４（ａ）は、２３１マウスの結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、Ｍｉｘマウスの結果を示すグラフである。図中、「パクリタキセル」は、パクリタキセル投与群の結果を示し、「対照」は、対照群の結果を示す。その結果、Ｍｉｘマウスの癌組織は、２３１マウスの癌組織と比較して、パクリタキセルに対する耐性が高いことが明らかとなった。この結果からも、不均一な癌組織は、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。

【0066】

［実験例７］
（ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者の予後の検討）
乳癌患者２９５名に由来する癌組織試料のマイクロアレイ遺伝子発現解析結果（ChangH. Y. et al., Robustness, scalability, and integration of a wound-response geneexpression signature in predicting breast cancer survival., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102(10), 3738-3743, 2005. PMID: 15701700 を参照。）を用いて、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者、ＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）乳癌患者及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（−）乳癌患者の予後（生存率）を検討した。ここで、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）である癌組織は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（−）細胞及びＺＥＢ１（−）ＣＬＤＮ１（＋）細胞が混在した不均一な癌組織であると考えられた。

【0067】

図５は、検討結果を示すグラフである。その結果、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者の生存率は低いことが明らかとなった。この結果からも、不均一な癌組織は、より悪性度が高いことが示された。

【0068】

以上、実験例４〜７の結果から、不均一な癌組織は、より悪性度が高いことが示された。

【0069】

＜癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーの探索＞
［実験例８］
（網羅的トランスクリプトーム解析）
実験例２と同様にして作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織における網羅的トランスクリプトーム解析を行った。

【0070】

まず、各担癌マウスから癌組織を摘出し、ＲＮＡを抽出した。続いて、キット（商品名「ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２」、イルミナ社）を用いてライブラリーを作製した。続いて、次世代シーケンサー（型式「ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘ」、イルミナ社）を用いてシーケンス解析を行い、バイオインフォマティクス解析を行った。

【0071】

より具体的には、検出された塩基配列を、ソフトウエア「Ｘｅｎｏｍｅ」を用いてヒト由来の塩基配列とマウス由来の塩基配列に分離した。続いて、得られた塩基配列データをソフトウエア「Ｔｏｐｈａｔ」を用いてリファレンス配列にマッピングした。続いて、マッピングされた塩基配列データを既知遺伝子配列とともに可視化し、ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いて、各試料間のｍＲＮＡ発現を比較した。

【0072】

図６は、ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いた解析結果を示す図である。ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いた解析の結果、Ｍｉｘマウスの癌組織で高発現し、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織では発現がほとんど認められない遺伝子として、図６の中央下領域における、丸で囲んだ領域に示される遺伝子が見出された。これらの遺伝子は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補である。

【0073】

［実験例９］
（定量的リアルタイムＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析）
実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、定量的リアルタイムＰＣＲによる発現解析を行った。

【0074】

まず、実験例２と同様にして作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスから癌組織を摘出し、一部からＲＮＡを抽出した。また、一部をパラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋して後の実験に用いた。

【0075】

続いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的リアルタイムＰＣＲにより候補遺伝子の発現を解析した。

【0076】

その結果、実施例８のトランスクリプトーム解析において２３１マウス及び１９３７マウスでほとんど発現の見られなかったＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子は、定量的リアルタイムＰＣＲによっても、Ｍｉｘマウスの癌組織で高発現していることが確認された。すなわち、これらの遺伝子は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＨＣＣ１９３７細胞を混合して移植し癌細胞集団が不均一性を示して高発現が検出されることから、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーとして使用できることが示された。中でも、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、ＥＬＮ、ＬＧＡＬＳ７遺伝子は、後述のインビトロ実験でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＨＣＣ１９３７細胞を混合しても発現量の増加は認められなかったにもかかわらず（図８参照）、Ｍｉｘマウスの癌組織において高発現を示した。その発現量は、トランスクリプトーム解析では、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織における発現量と比較してその差が大きかった。

【0077】

表１に、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの名称及び配列番号を示す。

【0078】

【表1】

【0079】

［実験例１０］
（免疫染色による候補遺伝子の発現解析）
実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、免疫染色により発現を検討した。

【0080】

より具体的には、実験例９で作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスの癌組織の標本を薄切して組織切片標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び免疫染色を行った。

【0081】

図７（ａ）〜（ｊ）は免疫染色の代表的な結果を示す写真である。図７（ａ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＡＬＭＬ３抗体（カタログ番号「ＧＴＸ１１４９５４」、Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｂ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＡＬＭＬ３抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。
図７（ｃ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＬＣＡ２抗体（カタログ番号「ＮＢＰ２−３３４８２」、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｄ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＬＣＡ２抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｅ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＳＴＡ抗体（カタログ番号「ＨＰＡ００１０３１」、ＡＴＲＡＳ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｆ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＳＴＡ抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｇ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＬＧＡＬＳ７抗体（カタログ番号「ＨＰＡ００１５４９」、ＡＴＲＡＳ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｈ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＬＧＡＬＳ７抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｉ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗Ｓ１００Ａ８抗体（カタログ番号「ＮＢＰ２−２５２６９」、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｊ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗Ｓ１００Ａ８抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。

【0082】

その結果、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＬＧＡＬＳ７及びＳ１００Ａ８タンパク質は、Ｍｉｘマウスの癌組織において高発現し、２３１マウスの癌組織ではほとんど発現が認められないことが確認された。

【0083】

［実験例１１］
（インビトロ試料を用いた定量的リアルタイムＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析）
実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、インビトロ試料を用いて定量的リアルタイムＰＣＲによる発現解析を行った。

【0084】

まず、２３１細胞、１９３７細胞、及び２３１細胞と１９３７細胞を１：１で混合した細胞を、培養皿内で５日間培養し、インビトロ試料とした。続いて、各細胞試料からそれぞれＲＮＡを抽出した。続いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的リアルタイムＰＣＲにより候補遺伝子の発現を解析した。定量的リアルタイムＰＣＲは実験例９と同様にして行った。

【0085】

図８は定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図８中、「２３１」は２３１細胞の結果であることを示し、「１９３７」は１９３７細胞の結果であることを示し、「ｍｉｘ」は２３１細胞と１９３７細胞を１：１で混合した細胞の結果であることを示す。

【0086】

その結果、インビトロで２３１細胞と１９３７細胞を混合した試料では、実験例９及び１０において得られた移植癌細胞集団からのインビボ試料でみられたような、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨＡ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子の高発現は確認できなかった。

【0087】

この結果から、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーは、インビトロで癌細胞を混合して培養しただけでは高発現せず、インビボにおいて不均一な癌細胞集団を形成した場合に初めて高発現することが明らかとなった。

【0088】

［実験例１２］
（乳癌手術検体の免疫染色）
実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、臨床検体の免疫染色により発現を検討した。

【0089】

より具体的には、インフォームドコンセントが取得された乳癌患者の、手術によって得られた組織のホルマリン固定パラフィン包埋された薄切組織標本を用いて、免疫組織染色を行い、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７タンパク質の発現を検討した。

【0090】

その結果、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７タンパク質の染色が確認され、ヒト乳癌手術検体において、これらのマーカータンパク質の発現が検出できることが確認された。

【0091】

この結果は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、ｃＤＮＡマーカー、及びタンパク質マーカーが、実際にヒト試料において使用できることを示す。

【産業上の利用可能性】

【0092】

本発明によれば、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーを提供することができる。また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]