特許 6202669 ペプチド及びその複合体、組織修復用スキャフォールド及びその表面処理方法、並びに表面処理液又は処理液のセット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6202669

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】ペプチド及びその複合体、組織修復用スキャフォールド及びその表面処理方法、並びに表面処理液又は処理液のセット

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20170914BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 5/08 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 5/10 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/00ZNA

   A61L27/22

   C07K5/06

   C07K5/08

   C07K5/10

   C07K19/00

   C07K14/475

【請求項の数】19

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-94744(P2013-94744)

(22)【出願日】2013年4月26日

(65)【公開番号】特開2014-214140(P2014-214140A)

(43)【公開日】2014年11月17日

【審査請求日】2016年4月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】000153030

【氏名又は名称】株式会社ジェイ・エム・エス

(74)【代理人】

【識別番号】100145713

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 竜太

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(72)【発明者】

【氏名】山岡 哲二

(72)【発明者】

【氏名】柿木 佐知朗

(72)【発明者】

【氏名】馬場 俊輔

(72)【発明者】

【氏名】橋本 典也

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２１２４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５１１１１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０４０１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／０８１６１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０２−１９１６２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Aust. J. Chem.，２０１２年，Vol.65，p.1349-1358

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチル−Ｌ−アラニン、又は（３Ｒ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−セリンの残基からなる接着性部位と、塩基性アミノ酸残基が３以上連続している塩基性部位とを、アミノ酸配列中に有し、
前記接着性部位と、前記塩基性部位とがスペーサー部位を介して結合しており、
前記スペーサー部位を構成するアミノ酸残基の数が３以上３０以下であり、
Ｎ末端又はＣ末端が、末端又はその近傍に塩基性部位を有する塩基性末端であり、
当該塩基性部位より塩基性末端側に、アミノ酸残基が存在しないか、１以上５以下のアミノ酸残基からなり接着性部位を含まない部位が存在し、
前記塩基性末端の他端が、末端又はその近傍に接着性部位を有する接着性末端であり、
前記接着性末端から５アミノ酸残基以内に、前記接着性部位を含み、且つ前記塩基性部位を含まない、ペプチド。

【請求項2】

Ｃ末端から９残基の配列が、配列番号１で示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のペプチドと、グリコサミノグリカンとの複合体。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子との複合体であって、
前記細胞増殖因子が、前記グリコサミノグリカンと結合しており、且つ、前記グリコサミノグリカンを介して前記ペプチドの前記塩基性部位と結合している複合体。

【請求項5】

表面に、請求項１又は２に記載のペプチドが前記接着性部位で結合している、組織修復用のスキャフォールド。

【請求項6】

表面にグリコサミノグリカンを有する組織修復用のスキャフォールドであって、
請求項１又は２に記載のペプチドが前記接着性部位で前記スキャフォールドの表面と結合しており、
前記グリコサミノグリカンが、前記ペプチドの前記塩基性部位と結合している、組織修復用のスキャフォールド。

【請求項7】

表面に細胞増殖因子を有する組織修復用のスキャフォールドであって、
請求項１又は２に記載のペプチドが前記接着性部位で前記スキャフォールドの表面と結合しており、
前記細胞増殖因子が、グリコサミノグリカンと結合しており、且つ、前記グリコサミノグリカンを介して前記ペプチドの前記塩基性部位と結合している、組織修復用のスキャフォールド。

【請求項8】

請求項１又は２に記載のペプチドを組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項9】

さらに、前記ペプチドの前記塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合させる、請求項８に記載の組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項10】

さらに、前記ペプチドに結合した前記グリコサミノグリカンに、細胞増殖因子を結合させる、請求項９に記載の組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項11】

請求項３に記載の複合体を組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項12】

さらに、前記複合体中の前記グリコサミノグリカンに、細胞増殖因子を結合させる、請求項１１に記載の組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項13】

請求項４に記載の複合体を組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法。

【請求項14】

請求項１又は２に記載のペプチドを含有する、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液。

【請求項15】

請求項１４に記載の処理液と、グリコサミノグリカンを含有する処理液とを含む、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセット。

【請求項16】

さらに、細胞増殖因子を含有する処理液を含む、請求項１５に記載の組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセット。

【請求項17】

請求項３に記載の複合体を含有する、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液。

【請求項18】

請求項１７に記載の処理液と、細胞増殖因子を含有する処理液とを含む、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセット。

【請求項19】

請求項４に記載の複合体を含有する、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組織修復用スキャフォールドの表面処理に好適に使用されるペプチドと、当該ペプチドを含む複合体とに関する。また、本発明は、当該ペプチド又は当該複合体を用いて表面処理された組織修復用スキャフォールドに関する。さらに、本発明は、当該ペプチド又は当該複合体を用いる組織修復用スキャフォールドの表面処理方法と、当該ペプチド又は当該複合体を含む、組織修復用スキャフォールドの表面処理用の処理液又は処理液のセットに関する。

【背景技術】

【0002】

従来より、種々の生体組織の修復に、細胞成長の足場となるスキャフォールドと呼ばれる材料が使用されている。このようなスキャフォールドの材質としては、天然又は合成高分子や、無機材料が種々使用されているが、これらの材料と生体組織との親和性は必ずしも高くない。このため、生体組織の修復にスキャフォールドを適用しても、所望する程度に組織が修復されなかったり、組織の修復に著しく時間を要したりする場合がある。

【0003】

このような問題を解決するために、スキャフォールドを細胞増殖因子とともに用いることが知られている。スキャフォールドを細胞増殖因子とともに用いる生体組織修復用の材料としては、例えば、スキャフォールドと、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の細胞増殖因子とを含む骨再生材料が知られている（特許文献１を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１２−０１６５１７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、特許文献１に記載されるように、スキャフォールドと、細胞増殖因子とを単に物理的に混合して用いても、組織を修復させる間に、細胞増殖因子がスキャフォールドから遊離してしまい、所望する組織修復の促進効果を得にくい。スキャフォールドからの細胞増殖因子の遊離を防ぐため、化学架橋剤や静電気的相互作用によって、スキャフォールドに細胞増殖因子を固定させることが考えられる。しかし、このような方法では、細胞増殖因子の構造変化や活性低下が懸念されるばかりか、固定化に用いる資材が及ぼす生体組織の修復への悪影響も懸念される。

【0006】

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであって、生体組織の修復に悪影響を与える材料を用いることなく生体組織の修復を促進させることができる組織修復用スキャフォールドの表面処理を可能とするペプチドと、当該ペプチドを含む複合体と、当該ペプチド又は当該複合体を用いて表面処理された組織修復用スキャフォールドと、当該ペプチド又は当該複合体を用いる組織修復用スキャフォールドの表面処理方法と、当該表面処理方法に使用される処理液又は処理液のセットとを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、それぞれ所定のアミノ酸残基からなる接着性部位と塩基性部位とを含むペプチドと、グリコサミノグリカンとを組み合わせて組織修復用スキャフォールドの表面処理を行うことで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、生体組織の修復に悪影響を与える材料を用いることなく生体組織の修復を促進させることができる組織修復用スキャフォールドの表面処理を可能とするペプチドと、当該ペプチドを含む複合体と、当該ペプチド又は当該複合体を用いて表面処理された組織修復用スキャフォールドと、当該ペプチド又は当該複合体を用いる組織修復用スキャフォールドの表面処理方法と、当該表面処理方法に使用される処理液又は処理液のセットとを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実施例８で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図2】実施例９で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図3】比較例１で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図4】参考例１で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図5】参考例２で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図6】参考例３で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図7】参考例４で撮影された、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の像を示す図である。

【図8】実施例１０で撮影された、スキャフォールド埋入後２８日目のＩＣＲマウスの皮下組織の、ＨＥ染色及び抗ＣＤ３１抗体免疫染色後の像を示す図である。

【図9】実施例１１で撮影された、スキャフォールド充填４週間後のマウスの骨欠損部のＸ線ＣＴ画像を示す図である。

【図10】比較例２で撮影された、スキャフォールド充填４週間後のマウスの骨欠損部のＸ線ＣＴ画像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［第１の態様］
本発明の第１の態様に係るペプチドは、２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる接着性部位と、塩基性アミノ酸残基が３以上連続している塩基性部位とを、アミノ酸配列中に有するペプチドである。以下、本出願の明細書において、当該ペプチドを「接着性ペプチド」とも記す。かかる接着性ペプチドは、接着性部位で組織修復用のスキャフォールドの表面と結合でき、塩基性部位でグリコサミノグリカンと結合できる。以下、本出願の明細書において、「組織修復用のスキャフォールド」を単に「スキャフォールド」とも記す。

【0011】

第１の態様に係るペプチドは、組織修復用のスキャフォールドの表面処理に好適に使用される。表面処理された組織修復用のスキャフォールドを用いて修復される組織は、特に限定されない。表面処理された組織修復用のスキャフォールドを用いて修復される好ましい組織としては、血管、皮膚、筋肉、軟骨、骨、消化管、乳房、心臓弁、歯周組織及び眼周囲組織等が挙げられる。

【0012】

第１の態様に係るペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。典型的には、接着性ペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、４以上１００以下が好ましく、５以上５０以下がより好ましく、１０以上３０以下が特に好ましい。

【0013】

接着性ペプチドが有する接着性部位は２，３−ジヒドロキシフェニル基又は３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の残基からなる。接着性部位は、２つの水酸基が隣接するジヒドロキシフェニル基を有するため、スキャフォールドの表面と結合できる。スキャフォールドが金属材料からなる場合、スキャフォールドの表面に存在する金属原子とジヒドロキシフェニル基とのキレーションによって、接着性ペプチドが接着性部位を介してスキャフォールドの表面に結合する。スキャフォールドが、水酸基やアミノ基のような活性水素を含む官能基を有する有機高分子やセラミック等の材料からなる場合、ジヒドロキシフェニル基が酸化されて生成するキノンと、水酸基やアミノ基のような活性水素を含む官能基とが反応することで、接着性ペプチドが接着性部位を介してスキャフォールドの表面に結合する。

【0014】

２，３−ジヒドロキシフェニル基及び３，４−ジヒドロキシフェニル基とでは、スキャフォールドの表面との反応しやすさから３，４−ジヒドロキシフェニル基が好ましい。３，４−ジヒドロキシフェニル基を有するアミノ酸の具体例としては、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチル−Ｌ−アラニン（メチルドーパ）、及び（３Ｒ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）等が挙げられる。これらの中では、実際に、イガイのような生物中でペプチドを構成するアミノ酸として利用されていることや、ペプチドを調製する際に入手が容易であること等から、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）が好ましい。

【0015】

接着性ペプチドは塩基性部位でグリコサミノグリカンと結合するが、第１の態様に係る接着性ペプチドは、塩基性アミノ酸残基が３以上連続している塩基性部位を有するため、接着性ペプチドとグリコサミノグリカンとを接触させる際に、効率よく塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合させることができる。塩基性部位を構成する連続する塩基性アミノ酸の残基の数は、３以上３０以下が好ましく、３以上１０以下がより好ましい。塩基性部位を構成する塩基性アミノ酸の残基は、リシン残基（Ｌｙｓ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）、ヒスチジン残基（Ｈｉｓ）の他、５−ヒドロキシリシン、オルチニン、キヌレニン及び修飾されたこれらのアミノ酸残基から選択される。なお、アミノ酸残基の修飾は、修飾後のアミノ酸残基が塩基性であれば特に限定されず、種々の公知のアミノ酸残基の修飾から選択し得る。

【0016】

接着性ペプチド中で、接着性部位と塩基性部位とはスペーサー部位を介して結合しているのが好ましい。スペーサー部位を構成するアミノ酸残基の数は特に限定されないが、１以上５０以下が好ましく、３以上３０以下がより好ましい。接着性部位と塩基性部位とが、このような数のアミノ酸残基から構成されるスペーサー部位を介して結合する場合、接着性部位を起点としてスキャフォールドの表面から伸びるペプチド鎖が比較的自由に運動可能であるため、塩基性部位によるグリコサミノグリカンの捕捉や、塩基性部位に結合したグリコサミノグリカンによる細胞増殖因子の捕捉が容易である。

【0017】

接着性ペプチドでは、Ｎ末端又はＣ末端が、末端又はその近傍に塩基性部位を有する塩基性末端であるのが好ましい。末端又はその近傍に塩基性部位を有するとは、当該塩基性部位より塩基性末端側に、アミノ酸残基が存在しないか、１以上５以下のアミノ酸残基からなり接着性部位を含まない部位が存在する状態である。塩基性部位より塩基性末端側にある程度長いペプチド鎖が存在する場合、塩基性部位よりも塩基性末端側のペプチド鎖の立体障害により、塩基性部位によりグリコサミノグリカンを捕捉しにくい場合がある。しかし、塩基性部位が接着性ペプチドの末端又はその近傍にあれば、このような不具合が生じにくい。

【0018】

また、接着性ペプチドは、塩基性末端の他端が、末端又はその近傍に接着性部位を有する接着性末端であるものが好ましい。末端又はその近傍に接着性部位を有するとは、接着性末端から５アミノ酸残基以内に、接着性部位を含み、且つ塩基性部位を含まない状態である。接着性ペプチドが接着性末端を有すると、接着性ペプチドのほぼ全長が、スキャフォールドの表面で自由に運動可能な状態となるため、塩基性末端によりグリコサミノグリカンを捕捉しやすい。

【0019】

このような塩基性末端と接着性末端とを有する接着性ペプチドとしては、Ｃ末端から９残基のアミノ酸配列が、下記配列番号１で示されるアミノ酸配列であるものが好ましい。下記配列番号１で示されるアミノ酸配列は、イガイが産生する接着性ペプチドのアミノ酸配列中に繰り返し存在する配列である。イガイが産生する接着性ペプチドは、このような繰り返し配列からなる部位を有するため、種々の基質に対して強く結合することができる。
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｌｙｓ・・・（１））
（配列番号（１）中、ＸａａはＬ−ドーパの残基である。）

【0020】

接着性ペプチドは、設計されたアミノ酸配列に従って、公知の手法により取得することができる。好適な方法としてはＦｍｏｃ法やＢｏｃ法のような固相合成方法が挙げられる。このような固相合成方法で得られる粗製の接着性ペプチドは、必要に応じて逆相ＨＰＬＣ等の方法を用いて精製することができる。取得される接着性ペプチドが所望の配列であるか否かは、公知の手段で確認することができる。このような手段としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで測定される接着性ペプチドの分子量と、アミノ酸配列から算出される接着性ペプチドの理論上の分子量とを比較する方法が挙げられる。

【0021】

以上説明した接着性ペプチドは、接着性部位で種々のスキャフォールドの表面に結合することができ、塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合することができる。また、グリコサミノグリカンは、種々の細胞増殖因子と結合することができる。このため、スキャフォールドを第１の態様に係る接着性ペプチドで表面処理した後、さらに、グリコサミノグリカンや、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子とを用いて表面処理すると、スキャフォールドを用いることによる組織の修復を著しく促進させることができる。

【0022】

［第２の態様］
本発明の第２の態様は、前述の接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンとからなる複合体である。当該複合体では、接着性ペプチドの塩基性部位にグリコサミノグリカンが結合している。当該複合体は、例えば、水中で、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンとを混合することで形成される。

【0023】

グリコサミノグリカンの種類は本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。グリコサミノグリカンの具体例としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケタラン硫酸、ヒアルロン酸が挙げられる。これらのグリコサミノグリカンの中では、入手が容易で安価であることや、細胞増殖因子との結合性に優れることからヘパリンが好ましい。

【0024】

第２の態様に係る複合体を、組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させると、複合体が、複合体中の接着性ペプチドが有する接着性部位で、スキャフォールドの表面に結合する。第２の態様に係る複合体が表面に結合したスキャフォールドは、複合体に含まれるグリコサミノグリカンに細胞増殖因子を結合させることができる。このため、このようなスキャフォールドを修復対象の組織内に載置すると、組織の種類によっては、組織内に存在する細胞増殖因子をスキャフォールド周辺に集中させて、組織の修復を促進させることができる。

【0025】

また、スキャフォールドの表面に担持される第２の態様に係る複合体に、予め、細胞増殖因子を結合させておくのも好ましい。そうすると、修復される組織内にスキャフォールドを載置することで、スキャフォールド周辺に細胞増殖因子を徐放させることができ、組織の修復の促進効果をより高めることができる。

【0026】

グリコサミノグリカンの分子量は、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。グリコサミノグリカンの分子量は、通常、３，０００〜１，０００，０００ダルトンが好ましく、３，０００〜１００，０００ダルトンがより好ましく、５，０００〜３０，０００ダルトンが特に好ましい。このような範囲の分子量のヘパリンを用いる場合、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子との複合体の形成が容易である。

【0027】

［第３の態様］
本発明の第３の態様は、前述の接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子との複合体である。当該複合体では、接着性ペプチドの塩基性部位にグリコサミノグリカンが結合しており、接着性ペプチドに結合しているグリコサミノグリカンに細胞増殖因子が結合している。当該複合体は、例えば水中で、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子とを混合することで形成される。

【0028】

第３の態様に係る複合体を、組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させると、複合体が、複合体中の接着性ペプチドが有する接着性部位で、スキャフォールドの表面に結合する。第３の態様に係る複合体が表面に結合したスキャフォールドを修復対象の組織内に載置すると、スキャフォールドの表面で複合体に含まれる細胞増殖因子が徐放され、組織の修復が顕著に促進される。

【0029】

細胞増殖因子の種類は特に限定されず、スキャフォールドを用いる修復の対象組織の種類に応じて適宜選択される。細胞増殖因子の例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク（ＢＭＰ）、インターロイキン１（ＩＬ−１），インターロイキン（ＩＬ−２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、シュワン細胞種由来増殖因子（ＳＤＧＦ）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。

【0030】

［第４の態様］
本発明の第４の態様は、前述の接着性ペプチドが、接着性ペプチドが有する接着性部位で組織修復用のスキャフォールドの表面に結合している組織修復用のスキャフォールドである。第４の態様の組織修復用のスキャフォールドは、表面に結合している接着性ペプチドが塩基性部位を有するため、さらにヘパリンを結合させることや、ヘパリンを介して細胞増殖因子を結合させることができる。

【0031】

スキャフォールドを構成する材料は特に限定されず、従来からの組織修復用のスキャフォールドの材料として使用されている材料から適宜選択される。スキャフォールドの材料としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギン酸、セルロース及びキチン等の天然高分子；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリメチレンカーボネート、ポリジオキサノン及びこれらの共重合体、等の合成高分子；アルミナ、ジルコニア、アパタイト等のセラミック；ステンレス、コバルト合金、チタン、チタン合金等の金属材料；炭酸カルシウムやリン酸カルシウム等の無機材料が挙げられる。

【0032】

スキャフォールドの形態は、特に限定されず、再生される組織の種類や、再生される部位の形状に応じて適宜選択される。スキャフォールドの形態の例としては、多孔質、シート、メッシュ、及び粉末等が挙げられる。スキャフォールドが多孔質材料である場合、多孔質材料の具体的な形状としては、円柱、角柱、平板、球、及び楕円球等が挙げ有られる。

【0033】

［第５の態様］
本発明の第５の態様は、表面にグリコサミノグリカンを有する組織修復用のスキャフォールドであって、前述の接着性ペプチドが、接着性ペプチドが有する接着性部位でスキャフォールドの表面に結合しており、グリコサミノグリカンが、接着性ペプチドが有する塩基性部位に結合している組織修復用のスキャフォールドである。このようなスキャフォールドを用いることで、第二の態様について説明した効果と同様の効果を得られる。

【0034】

［第６の態様］
本発明の第６の態様は、表面に細胞増殖因子を有する組織修復用のスキャフォールドであって、前述の接着性ペプチドが、接着性ペプチドが有する接着性部位でスキャフォールドの表面に結合しており、細胞増殖因子が、グリコサミノグリカンと結合しており、且つ、グリコサミノグリカンを介して接着性ペプチドが有する塩基性部位と結合している組織修復用のスキャフォールドである。このようなスキャフォールドを用いることで、第三の態様について説明した効果と同様の効果を得られる。

【0035】

［第７の態様］
本発明の第７の態様は、前述の接着性ペプチドを組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法である。接着性ペプチドを組織修復用のスキャフォールドの表面に接触させることで、接着性ペプチドが、接着性部位で組織修復用のスキャフォールドの表面に結合する。そうすることで、スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位に、グリコサミノグリカンを結合させることが可能となる。塩基性部位に結合するグリコサミノグリカンは、さらに種々の細胞増殖因子と結合可能である。このため、スキャフォールドの表面に接着性ペプチドを介してグリコサミノグリカンを結合させ、このようなスキャフォールドを修復される組織内に載置すると、組織の種類によっては、組織内に存在する細胞増殖因子をスキャフォールド周辺に集中させて、組織の修復を促進させることができる。

【0036】

また、スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドに結合するグリコサミノグリカンには、予め、細胞増殖因子を結合させておくのが好ましい。そうすると、修復される組織内にスキャフォールドを載置することで、スキャフォールド周辺に細胞増殖因子を徐放させることができ、組織の修復の促進効果をより高めることができる。

【0037】

以上の理由から、スキャフォールドの表面には、以下の（１）及び（２）の処理か、（１）、（２）、及び（３）の処理が施される。
（１）スキャフォールドの表面に接着性ペプチドを接触させる処理。
（２）スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合させる処理。
（３）スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドに結合したグリコサミノグリカンに細胞増殖因子を結合させる処理。

【0038】

また、上記の（１）の処理を行った後、（２）及び（３）の処理に変えて、以下の（４）の処理を施すこともできる。（４）の処理を行う場合、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体中のグリコサミノグリカンが、接着性ペプチドが有する塩基性部位とが結合する。
（４）スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位にグリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体を結合させる処理。

【0039】

組織修復用のスキャフォールドに対して、（１）及び（２）の処理を施すことで、第５の態様に係るスキャフォールドを形成することができる。また、組織修復用のスキャフォールドに対して（１）、（２）及び（３）の処理か、（１）及び（４）の処理を施すことで、第６の態様に係るスキャフォールドを形成することができる。以下、上記の工程（１）〜（４）について順に説明する。

【0040】

〔工程（１）〕
組織修復用のスキャフォールドの表面と接着性ペプチドとを接触させる方法は特に限定されない。組織修復用のスキャフォールドの表面と接着性ペプチドとを接触させる際、組織修復用のスキャフォールドの表面と接着性ペプチドとの均一な接触が容易であることから、通常、接着性ペプチドは溶液の形態で使用される。接着性ペプチドの溶液をスキャフォールドの表面に接触させる方法としては、塗布、噴霧、及び浸漬のようは方法が挙げられる。これらの方法の中では浸漬が好ましい。スキャフォールドが多孔質材料からなる場合もあるが、多孔質材料が有する細孔の内部表面にも接着性ペプチドを接触させることができることができるからである。

【0041】

浸漬により、スキャフォールドの表面に接着性ペプチドを接触させる際の温度や時間は、接着性ペプチドのスキャフォールドの表面への結合が良好に進行する限り特に限定されない。典型的には、浸漬は、５〜９０℃、好ましくは２０〜７０℃で行われる。また、浸漬時間は、０．１〜４８時間が好ましく、１〜２４時間がより好ましい。

【0042】

スキャフォールドの表面に接着性ペプチドを接触させる際の接着性ペプチドの使用量は、スキャフォールドの表面積に対して、０．１〜５０ｍｇ/ｍ^２が好ましく、１．０〜１０ｍｇ/ｍ^２がより好ましい。

【0043】

表面処理時に用いる接着性ペプチドの溶液の濃度は特に限定されない。典型的には、接着性ペプチドの溶液の濃度は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｍＬがより好ましい。

【0044】

スキャフォールドと、接着性ペプチドの溶液とを接触させた後は、そのまま工程（２）又は（４）を行ってもよく、スキャフォールドを乾燥させた後、工程（２）又は（４）を行ってもよい。

【0045】

〔工程（２）〕
工程（２）では、スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合させる。スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位にグリコサミノグリカンを結合させるためには、通常、接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンの溶液とを接触させる。グリコサミノグリカンは酸性の官能基である、スルホン酸基やカルボン酸基を有するが、これらの酸性基は、グリコサミノグリカンの溶液中で、ナトリウム塩やカリウム塩のような塩を形成していてもよい。

【0046】

接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンの溶液との接触は、工程（１）における、スキャフォールドと、接着性ペプチドの溶液との接触と同様の方法で行われる。接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドを、グリコサミノグリカンの溶液に浸漬して処理する場合、浸漬時の温度や時間は、グリコサミノグリカンの接着性ペプチドへの結合が良好に進行する限り特に限定されない。典型的には、浸漬は、５〜９０℃、好ましくは２０〜７０℃で行われる。また、浸漬時間は、０．１〜４８時間が好ましく、１〜２４時間がより好ましい。

【0047】

表面処理時に用いるグリコサミノグリカンの溶液の濃度は特に限定されない。典型的には、グリコサミノグリカンの溶液の濃度は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ（ヘパリンの場合、力価として２０〜２０００単位／ｍＬ）が好ましく、０．５〜５ｍｇ／ｍＬ（ヘパリンの場合、力価として１００〜１０００単位／ｍＬがより好ましい。

【0048】

表面処理時のグリコサミノグリカンの使用量は特に限定されず、接着性ペプチドに十分な量のグリコサミノグリカンが結合できるように適宜選択される。

【0049】

〔工程（３）〕
工程（３）では、スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位に結合するグリコサミノグリカンに細胞増殖因子を結合させる。スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位に結合するグリコサミノグリカンに細胞増殖因子を結合させるためには、通常、塩基性部位にグリコサミノグリカンが結合している接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンの溶液とを接触させる。塩基性部位にグリコサミノグリカンが結合している接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンの溶液との接触は、工程（１）における、スキャフォールドと、接着性ペプチドの溶液との接触と同様の方法で行われる。

【0050】

塩基性部位にグリコサミノグリカンが結合している接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドを、細胞増殖因子の溶液に浸漬して処理する場合、浸漬時の温度や時間は、細胞増殖因子のグリコサミノグリカンへの結合が良好に進行する限り特に限定されない。典型的には、浸漬は、５〜７０℃、好ましくは５〜３０℃で行われる。また、浸漬時間は、０．１〜４８時間が好ましく、１〜２４時間がより好ましい。

【0051】

表面処理時に用いる細胞増殖因子の溶液の濃度は特に限定されない。典型的には、細胞増殖因子の溶液の濃度は、１〜１，０００μｇ／ｍＬが好ましく、１０〜５００μｇ／ｍＬがより好ましい。

【0052】

表面処理時の細胞増殖因子の使用量は特に限定されず、接着性ペプチドに結合するグリコサミノグリカンに、十分な量の細胞増殖因子が結合できるように適宜選択される。

【0053】

〔工程（４）〕
工程（４）では、工程（１）に次いで、接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体とを接触させて、スキャフォールドの表面に担持される接着性ペプチドが有する塩基性部位にグリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体を結合させる。グリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体は、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子とを、水のような溶媒中で混合することで形成される。

【0054】

接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドと、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体との接触は、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子との複合体の溶液中に、接着性ペプチドを表面に担持するスキャフォールドを浸漬して行うのが好ましい。この浸漬は、工程（３）と同様に行われる。

【0055】

［第８の態様］
本発明の第８の態様は、第２の態様に係る、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンとからなる複合体を、組織修復用のスキャフォールドに接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法である。第２の態様に係る複合体と、スキャフォールドとの接触は、第２の態様に係る複合体の溶液を用いて、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（１）と同様に行われる。

【0056】

第２の態様に係る複合体と、スキャフォールドとの接触させた後、必要に応じて、第２の態様に係る複合体を表面に担持するスキャフォールドと、細胞増殖因子とを接触させてもよい。そうすることで、スキャフォールドの表面に担持された第２の態様に係る複合体中のグリコサミノグリカンに、細胞増殖因子が結合する。

【0057】

［第９の態様］
本発明の第９の態様は、第３の態様に係る、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子とからなる複合体を、組織修復用のスキャフォールドに接触させる、組織修復用のスキャフォールドの表面処理方法である。第３の態様に係る複合体と、スキャフォールドとの接触は、第３の態様に係る複合体の溶液を用いて、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（３）と同様に行われる。

【0058】

［第１０の態様］
本発明の第１０の態様は、前述の接着性ペプチドを含有する組織修復用のスキャフォールドの表面処理液である。第１０の態様に係る表面処理液に含まれる溶媒の種類は、接着性ペプチドを溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。接着性ペプチドの溶解性や、スキャフォールドを用いて修復される組織に対する悪影響がないこと等から、通常、表面処理液に含まれる溶媒としては水が使用される。

【0059】

表面処理液の調製方法は特に限定されない。接着性ペプチドが溶液の状態である場合、接着性ペプチドを含む溶液を、接着性ペプチドの濃度が所望する濃度となるように、希釈又は濃縮することで表面処理液が得られる。接着性ペプチドがフリーズドライ等の方法で粉末化されている場合、接着性ペプチドの粉末と水等の溶媒とを所定の比率で混合して、接着性ペプチドを溶媒に溶解させることで表面処理液が得られる。

【0060】

表面処理液中の接着性ペプチドの濃度は、特に限定されない。表面処理液中の接着性ペプチドの好ましい濃度は、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（１）で使用される接着性ペプチドの溶液と同様である。

【0061】

第１０の態様に係る表面処理液は、本発明の目的を阻害しない範囲で、接着性ペプチドが有する接着性部位と塩基性部位とに結合しない種々の添加剤を含んでいてもよい。表面処理液に配合される添加剤としては、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、粘度調整剤、安定剤、着色剤、香料、酸化防止剤、防腐剤、防黴剤、及び紫外線吸収剤等が挙げられる。これらの添加剤は、通常、これらの添加剤が種々の薬液に対して配合される量に従って、表面処理液に添加される。

【0062】

［第１１の態様］
本発明の第１１の態様は、第１０の態様に係る、接着性ペプチドを含有する表面処理液と、グリコサミノグリカンを含有する表面処理液とを含む、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセットである。グリコサミノグリカンを含有する表面処理液に含まれる溶媒の種類は、グリコサミノグリカンを溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。グリコサミノグリカンの溶解性や、スキャフォールドを用いて修復される組織に対する悪影響がないこと等から、通常、グリコサミノグリカンを含有する表面処理液に含まれる溶媒としては水が使用される。

【0063】

グリコサミノグリカンを含有する表面処理液中のグリコサミノグリカンの濃度は、特に限定されない。表面処理液中のグリコサミノグリカンの好ましい濃度は、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（２）で使用されるグリコサミノグリカンの溶液と同様である。グリコサミノグリカンを含有する表面処理液は、接着性ペプチドを含む表面処理液と同様に、種々の添加剤を含んでいてもよい。

【0064】

第１１の態様に係る、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセットは、さらに細胞増殖因子を含有する表面処理液を含んでいてもよい。表面処理液中の細胞増殖因子の好ましい濃度は、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（３）で使用される細胞増殖因子の溶液と同様である。細胞増殖因子を含有する表面処理液は、接着性ペプチドを含む表面処理液と同様に、種々の添加剤を含んでいてもよい。

【0065】

［第１２の態様］
本発明の第１２の態様は、第２の態様に係る接着性ペプチドとグリコサミノグリカンとの複合体を含有する表面処理液である。第１２の態様に係る表面処理液に含まれる溶媒の種類は、複合体を溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。複合体の溶解性や、スキャフォールドを用いて修復される組織に対する悪影響がないこと等から、通常、表面処理液に含まれる溶媒としては水が使用される。

【0066】

第２の態様に係る複合体を含む表面処理液の調製方法は、第１０の態様に係る表面処理液の調製方法と同様である。表面処理液中の複合体の濃度は、特に限定されない。表面処理液中の複合体の濃度は、表面処理液中の複合体に含まれる接着性ペプチドの濃度が、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（１）で使用される接着性ペプチドの溶液の好適な濃度と同様となるのが好ましい。接着性ペプチドとグリコサミノグリカンとの複合体を含有する表面処理液は、第１０の態様に係る表面処理液と同様に、種々の添加剤を含んでいてもよい。

【0067】

［第１３の態様］
本発明の第１３の態様は、第１２の態様に係る、接着性ペプチドとグリコサミノグリカンとの複合体を含有する表面処理液と、細胞増殖因子を含有する表面処理液とを含む、組織修復用のスキャフォールドの表面処理用の処理液のセットである。細胞増殖因子を含有する表面処理液は、第１１の態様について説明したものと同様である。

【0068】

［第１４の態様］
本発明の第１４の態様は、第３の態様に係る、接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子との複合体を含有する表面処理液である。第１４の態様に係る表面処理液に含まれる溶媒の種類は、複合体を溶解させることができれば、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。複合体の溶解性や、スキャフォールドを用いて修復される組織に対する悪影響がないこと等から、通常、表面処理液に含まれる溶媒としては水が使用される。

【0069】

第３の態様に係る複合体を含む表面処理液の調製方法は、第１０の態様に係る表面処理液の調製方法と同様である。表面処理液中の複合体の濃度は、特に限定されない。表面処理液中の複合体の濃度は、表面処理液中の複合体に含まれる接着性ペプチドの濃度が、第７の態様に係る表面処理方法について説明した工程（１）で使用される接着性ペプチドの溶液の好適な濃度と同様となるのが好ましい。接着性ペプチドと、グリコサミノグリカンと、細胞増殖因子との複合体を含有する表面処理液は、第１０の態様に係る表面処理液と同様に、種々の添加剤を含んでいてもよい。

【実施例】

【0070】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0071】

［実施例１］
Ｆｍｏｃ固相合成方法により、Ｃ末端から９残基の配列が、下記配列番号（１）のアミノ酸配列である、下記配列番号（２）のアミノ酸配列からなる接着性ペプチドを合成した。
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｌｙｓ・・・（１））
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｌｙｓ・・・（２）
（配列番号（１）及び（２）中、ＸａａはＬ−ドーパの残基である。）

【0072】

得られた粗製の接着性ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した後、精製された接着性ペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより測定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより測定されたペプチドの分子量は２０１１．７であり、配列番号（３）のアミノ酸配列からなる接着性ペプチドの計算上の分子量２０１１．３とほぼ一致していた。

【0073】

［実施例２］
実施例１で得られた接着性ペプチドを蒸留水に溶解させて、濃度１．０ｍｇ／ｍＬの接着性ペプチドの水溶液を調製した。α−ＴＣＰ（α型リン酸三カルシウム）の多孔体（多孔体の体積に占める細孔の体積は約７０％）からなる直径５ｍｍ、高さ２ｍｍの円柱型の組織修復用スキャフォールドの基体を、５０℃で２４時間、接着性ペプチドの水溶液０．１ｍＬに浸漬して、接着性ペプチドを基体の表面に結合させた。その後、接着性ペプチドの水溶液から基体を取り出し、基体を蒸留水２０ｍＬで洗浄した後に乾燥させた。乾燥後の基体の表面をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）により分析したところ、ペプチドに含まれる窒素原子に由来するＮ１ｓのピークが確認された。

【0074】

［実施例３］
接着性ペプチドの水溶液の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｇ／ｍＬに変えることの他は、実施例２と同様にして、組織修復用スキャフォールドの基体を、接着性ペプチド水溶液で処理した。処理後の組織修復用のスキャフォールドの基体の表面を、実施例２と同様にしてＸＰＳにより分析したところ、ペプチドに含まれる窒素原子に由来するＮ１ｓのピークが確認された。

【0075】

［実施例４］
実施例２で得られた、接着性ペプチドにより処理された組織修復用スキャフォールドの基体を、ノボ・ヘパリン注（１万単位／１０ｍＬ、持田製薬株式会社製）に、室温で、８時間浸漬して、スキャフォールドの基体に担持される接着性ペプチドの塩基性部位にヘパリンを結合させた。その後、ノボ・ヘパリン注から基体を取り出し、基体を蒸留水２０ｍＬで洗浄した後に乾燥させた。

【0076】

［実施例５］
実施例２で得られた、接着性ペプチドにより処理された組織修復用スキャフォールドの基体を、実施例３で得られた基体に変えることの他は、実施例４と同様にして、組織修復用スキャフォールドの基体を、ノボ・ヘパリン注で処理した。

【0077】

［実施例６］
フィブラスト（登録商標）スプレー２５０（科研製薬株式会社製）に付属の、細胞増殖因子としてヒトリコンビナントＦＧＦの凍結乾燥品を含むガラス瓶と、溶解液とを用いて細胞増殖因子の水溶液を調製した。具体的には、ガラス瓶に溶解液を加えてヒトリコンビナントＦＧＦの凍結乾燥品を溶解液に溶解させて、濃度１００μｇ／ｍＬの細胞増殖因子の水溶液を調製した。実施例４で得られた、ヘパリン及び接着性ペプチドで処理された組織修復用スキャフォールドの基体を、調製した細胞増殖因子の水溶液０．５ｍＬに浸漬して、基体の表面で接着性ペプチドに結合するヘパリンに細胞増殖因子を結合させた。その後、細胞増殖因子の水溶液から基体を取り出し、基体を蒸留水２０ｍＬで洗浄した後に乾燥させた。細胞増殖因子を用いて処理される前の基体の表面と、処理後の基体の表面と、をＸＰＳにより分析したところ、細胞増殖因子を用いる処理によりＣ２ｓのピークの強度が著しく強くなったことが確認された。これは、基体表面の接着性ペプチドに結合するヘパリンに細胞増殖因子が結合することによる、基体表面の炭素原子数の増加によると考えられる。

【0078】

［実施例７］
実施例４で得られた、ヘパリン及び接着性ペプチドで処理された組織修復用スキャフォールドの基体を、実施例５で得られた基体に変更することの他は、実施例６と同様にして、組織修復用スキャフォールドの基体を、細胞増殖因子の水溶液で処理した。細胞増殖因子を用いて処理される前の基体の表面と、処理後の基体の表面と、をＸＰＳにより分析したところ、細胞増殖因子を用いる処理によりＣ２ｓのピークの強度が著しく強くなったことが確認された。

【0079】

［実施例８、実施例９、及び比較例１］
基体表面の接着性ペプチドに結合するヘパリンに細胞増殖因子が結合している組織修復用スキャフォールド、又は表面処理されていない組織修復用スキャフォールドを、６週齢のオスのＩＣＲマウスの皮下に埋入した後に、埋入後７日目のスキャフォールド周辺の組織を観察した。実施例８では、実施例６で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。実施例９では、実施例７で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。比較例１では、表面処理されていない組織修復用スキャフォールドを用いた。実施例８、実施例９、及び比較例１の、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の写真を、図１（実施例８）、図２（実施例９）、及び図３（比較例１）として示す。

【0080】

図１及び図２によれば、基体表面の接着性ペプチドに結合するヘパリンに細胞増殖因子が結合している組織修復用スキャフォールドを用いた場合、ＩＣＲマウスの皮下組織における血管新生が良好に進行していることが分かる。他方、図３によれば、表面処理されていない組織修復用スキャフォールドを用いた場合、血管新生の速度が遅いことが分かる。

【0081】

［参考例１〜４］
基体表面に接着性ペプチドが結合している組織修復用スキャフォールド又は、基体表面の接着性ペプチドにヘパリンが結合している組織修復用スキャフォールドを用いることの他は、実施例８と同様にして、スキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織を観察した。参考例１では、実施例２で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。参考例２では、実施例３で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。参考例３では、実施例４で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。参考例４では、実施例５で得られた組織修復用スキャフォールドを用いた。参考例１〜４のスキャフォールド埋入後７日目のＩＣＲマウスの皮下組織の写真を、図４（参考例１）、図５（参考例２）、図６（参考例３）、及び図７（参考例４）として示す。

【0082】

図４及び図５によれば、接着性ペプチドのみを用いて表面処理された組織修復用スキャフォールドを用いる場合、ＩＣＲマウスの皮下組織では、血管新生の速度が遅いことが分かる。図５及び図６によれば、接着性ペプチドとヘパリンとで表面処理された組織修復用スキャフォールドを用いる場合も、ＩＣＲマウスの皮下組織では、血管新生の速度が遅いことが分かる。

【0083】

［実施例１０］
実施例８に続いて、実施例６で得られたスキャフォールド埋入後２８日目のＩＣＲマウスの皮下組織について組織学的評価を行った。組織学的評価は、ＨＥ染色と、抗ＣＤ３１抗体免疫染色とにより行った。ＨＥ染色及び抗ＣＤ３１抗体免疫染色後の皮下組織の断面の像を、図８に示す。図８に示す像では、多くの浸潤細胞と、血管構造とが認められた。つまり、接着性ペプチドと、ヘパリンと、細胞増殖因子とで表面処理されたスキャフォールドを用いることで、ＩＣＲマウスの皮下組織の修復が良好に進行している。

【0084】

［実施例１１及び比較例２］
（マウス頭蓋骨の骨再生試験）
α−ＴＣＰ（α型リン酸三カルシウム）の粉末を、実施例１で得られた接着性ペプチドと、ヘパリンとを用いて表面処理した。具体的には、α−ＴＣＰ（α型リン酸三カルシウム）の粉末２８．７ｍｇを、濃度１．０ｍｇ／ｍＬの実施例１で得られた接着性ペプチドの水溶液０．１ｍＬに２４時間、５０℃、遮光下で浸漬後、インキュベーター内で一晩風乾した。得られたペプチド修飾α−ＴＣＰ粉末を、ノボ・ヘパリン注（１万単位／１０ｍＬ、持田製薬株式会社製）０．１ｍＬに常温で８時間浸漬し、インキュベーター内での風乾を経て、表面処理されたα−ＴＣＰの粉末を得た。実施例１１では、得られた表面処理されたα−ＴＣＰの粉末をスキャフォールドとして用いた。比較例２では、未処理のα−ＴＣＰの粉末をスキャフォールドとして用いた。

【0085】

マウスの頭蓋骨に、トレフィンバーを用いて直径４ｍｍ、深さ０．３ｍｍの骨欠損部を形成した。形成された骨欠損部に、粉末状のスキャフォールドを充填した。スキャフォールドの充填後、骨欠損部位をｅＰＴＦＥ膜で被覆した。スキャフォールド充填後４週目に、骨欠損部をＸ線ＣＴで撮影した。実施例１１のＸ線ＣＴ画像を図９に示し、比較例２のＸ線ＣＴ画像を図１０に示す。図９及び図１０の比較によれば、図９では、画像上で、骨欠損部内の白化がより進行していることが分かる。つまり、実施例１１では、比較例２よりも骨再生がより進行している。接着性ペプチドと、ヘパリンとを用いて表面処理されたスキャフォールドを用いた場合、マウス頭部に内在する細胞増殖因子がスキャフォールドの表面に捕捉され、骨再生が促進されたと考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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