特許 6202716 バイオマスの糖化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6202716

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】バイオマスの糖化方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/14 20060101AFI20170914BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20170914BHJP

   C12N 9/42 20060101ALI20170914BHJP

   B09B 3/00 20060101ALI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170914BHJP

   C12R 1/80 20060101ALN20170914BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/14 AZAB

   C12N1/14 AZNA

   C12N9/42

   B09B3/00 304Z

   !C12N15/00 A

   C12N1/14 AZNA

   C12R1:80

【請求項の数】6

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2013-55080(P2013-55080)

(22)【出願日】2013年3月18日

(65)【公開番号】特開2013-223489(P2013-223489A)

(43)【公開日】2013年10月31日

【審査請求日】2016年2月19日

(31)【優先権主張番号】特願2012-64109(P2012-64109)

(32)【優先日】2012年3月21日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  FERM P-22221

(73)【特許権者】

【識別番号】500433225

【氏名又は名称】学校法人中部大学

(74)【代理人】

【識別番号】100098707

【弁理士】

【氏名又は名称】近藤 利英子

(74)【代理人】

【識別番号】100135987

【弁理士】

【氏名又は名称】菅野 重慶

(74)【代理人】

【識別番号】100161377

【弁理士】

【氏名又は名称】岡田 薫

(74)【代理人】

【識別番号】100169812

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛志

(72)【発明者】

【氏名】永井 和夫

(72)【発明者】

【氏名】倉根 隆一郎

(72)【発明者】

【氏名】青山 晃久

(72)【発明者】

【氏名】松浦 明

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１７１７７２８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Appl. Biochem. Biotechnol., 2011, 164:819-830

【文献】 J. Microbiol. Biotechnol., 2011, 21(12):1322-1329

【文献】 Enzyme and Microbial Technology, 2003, 32:606-615

【文献】 Bioresource Technology, 1991, 35:73-80

【文献】 The Chinese Journal of Process Engineering, 2003, 3(5):447-452

【文献】 Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(7):870-875

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. GU724348, 12-Apr-2010 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. GU724347, 12-Apr-2010 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. HM053477, 12-Jun-2010 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. HM469410, 27-Mar-2011 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. HE651152, 23-Jan-2012 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. AF034455, 02-Jun-1998 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. AY213620, 22-Jan-2007 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

【文献】 Database GenBank[online], Accession No. DQ123663, 23-May-2008 uploaded, [retrieved on 2017-01-20]

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｂ０９Ｂ １／００− ５／００

Ｃ１２Ｎ １／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属する糸状菌が分泌するセルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物と、化学的な前処理及び高温高圧の水による前処理のいずれも行っていない草本系バイオマスまたは木質系バイオマスとを接触させることを含み、
前記糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１で特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株であるバイオマスの糖化方法。

【請求項2】

ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属する糸状菌を液体培養し、その液体培地から菌体を除去して得られる、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する液体組成物と、化学的な前処理及び高温高圧の水による前処理のいずれも行っていない草本系バイオマスまたは木質系バイオマスとを接触させることを含み、
前記糸状菌が、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１で特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株であるバイオマスの糖化方法。

【請求項3】

前記液体組成物と接触させた後の前記草本系バイオマスまたは前記木質系バイオマスを漉し取って固液分離する工程をさらに含む請求項２に記載のバイオマスの糖化方法。

【請求項4】

前記糸状菌が、配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ１−５．８Ｓ ｒＤＮＡ−ＩＴＳ２領域を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオマスの糖化方法。

【請求項5】

前記糸状菌が、配列番号２に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなる２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオマスの糖化方法。

【請求項6】

５〜１０ｍｍの長さに粗粉砕した前記草本系バイオマスまたは前記木質系バイオマスを用いる請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオマスの糖化方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオマスの活用に関し、より詳しくは草本系バイオマスおよび木質系バイオマスの糖化効率が高い微生物、その微生物から得られるセルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物および液体組成物、並びに、その分泌物または液体組成物を用いる草本系および木質系バイオマスの糖化方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物由来の資源であるバイオマスを利用するバイオ燃料は、非化石燃料であり、これを消費して二酸化炭素を排出しても大気中の二酸化炭素量は増減しないため、二酸化炭素の排出はないものとして取り扱われる。このため、バイオ燃料は、従来使用されてきた化石燃料に代わる新たなエネルギー源として注目を集めている。

【0003】

トウモロコシやサトウキビを原料とするバイオエタノールなどのバイオ燃料は、世界的に利用が進んでおり、増産が続いている。しかし、トウモロコシやサトウキビは、食糧としても利用される作物であり、食糧との競合により食糧価格の高騰を招くという弊害も生じている。
そこで近年では、稲わらや間伐材、建築廃材等の、食糧とは競合しない草本系バイオマスおよび木質系バイオマスがバイオ燃料源として注目されている。

【0004】

草本系バイオマスや木質系バイオマスをバイオエタノールとして利用する場合、まず、ポリマーであるバイオマス構成成分を、オリゴマーを経てモノマーである単糖類にまで分解（糖化）し、次いで、単糖類をエタノールに変換する。このうち、ポリマーをモノマーに変換する糖化反応の効率は非常に低いため、基質である草本系バイオマスまたは木質系バイオマスに対して酸やアルカリによる前処理がなされている。しかし、バイオマスを酸やアルカリで処理する方法には、以下の５つの問題が存在する。

【0005】

第１に、糖の過分解の問題がある。Ｃ５やＣ６の単糖をＣ２、Ｃ３、Ｃ４などの種々の化合物に分解してしまい、単糖類への変換効率が下がる問題がある。
第２に、糖の過分解によって発生するフラン類や有機酸類が、単糖をアルコール発酵する際の阻害剤となることが知られている。
第３に、黒液が発生し、その処理に多量のエネルギーが必要となる問題がある。酸やアルカリによる前処理をすると、リグニンが分解されて、水溶性となったリグニン誘導体を主成分とする黒液が発生する。この黒液は水分を多量に含むため、サーマルリサイクルを行うことは困難である。このため、排水処理が必要となるが、現状では、バイオエタノールの製造に伴って発生する黒液の処理に、得られるバイオエタノールのエネルギーよりも多量のエネルギーが必要とされており、草本系バイオマスや木質系バイオマスからバイオエタノールを製造する際の障害となっている（特許文献１参照）。
第４に、リグニン分解産物として生成するフェノール類がセルラーゼ阻害作用を持つことおよびアルコール発酵を阻害する問題がある。
第５に、処理後に酸やアルカリを中和する必要があり、中和によって塩が形成され、この塩が酵素反応を阻害し、アルコール発酵の妨げとなる問題がある。

【0006】

酸やアルカリを用いる代わりに、基質である草本系バイオマスまたは木質系バイオマスを高温・高圧の水で前処理する方法もあるが、この方法でも、上記第５の問題を除き、同様の問題が生じる。

【0007】

また、セルロース系バイオマスからエタノールを製造する際には、エタノールを１リットル得るために糖化酵素費用が２５円かかると試算されており、セルロース系バイオマスからのエタノール生産を実用化するために糖化酵素の費用を削減することが求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１０−９４５９３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

このため、バイオエタノールの原料として利用が進んでいない草本系バイオマスおよび木質系バイオマスを効率よく糖化し、バイオエタノール製造コストを低減できる酵素およびそれを生産する微生物が産業界より切望されていた。
従って、本発明の目的は、草本系バイオマスおよび木質系バイオマスを効率よく、かつ、安価に糖化できる酵素およびそれを産生する微生物を提供し、その微生物が産生する草本系および木質系バイオマス糖化活性を有する分泌物、並びに、その微生物および分泌物の利用方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するにあたり、まず、草本系バイオマスの糖化工程について詳細に検討した。
草本系バイオマスの構成成分にはセルロース成分、ヘミセルロース成分と少しのリグニン成分が含まれている。このうち、セルロース成分を高効率で糖化できるセルラーゼはいくつか知られているものの、単一の微生物に由来する酵素でセルロースに加えてヘミセルロースも効率よく糖化できる酵素はこれまで知られていない。
そこで、本発明者らは多数の土壌サンプルについて、セルロースとヘミセルロースの両方について糖化活性が高い微生物を鋭意研究し、探索した。この結果、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属する糸状菌で、セルロースとヘミセルロースの糖化活性が非常に高い菌株を特定し、この菌株の培養液が草本系バイオマスの糖化活性のみならず、木質系バイオマスの糖化活性も備えていることを見いだし、上記目的を達成しうる本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属し、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物を体外に分泌することを特徴とする糸状菌を提供する。

【0011】

本発明においては、前記ペニシリウム属に属する糸状菌が、ペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）であること；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１で特定されるペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）ＳＡ５７−２株であることが好ましい。

【0012】

また、本発明においては、前記ペニシリウム属に属する糸状菌の性状が、
Ａ．ポテトデキストロース寒天培地で培養した際のコロニーの巨視的形態として、
（１）表面の色調：濃緑色〜灰色がかった緑
（２）裏側の色調：黄味を帯びた白
（３）表面性状：ビロード状
（４）可溶性色素：なし
（５）形：円形
Ｂ．ポテトデキストロース寒天培地で培養した際の微視的形態として、
（１）栄養菌糸
（イ）形成箇所：寒天表面上及び寒天内の少なくともいずれか
（ロ）色調：無色
（ハ）隔壁：あり
（２）分生子柄の形態：栄養菌糸より直生し、分生子柄の先端部から円筒形のメトレが形成され、その先に皮針形のフィアライドが形成される。
（３）分生子
（イ）分生子形成型：フィアロ型
（ロ）形態：楕円形
（ハ）単位：１細胞
（ニ）表面性状：平滑〜粗面
（４）２週間培養中の有性生殖器官の形成：なし
であることが好ましい。

【0013】

また、本発明においては、前記ペニシリウム属に属する糸状菌が、配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ１−５．８Ｓ ｒＤＮＡ−ＩＴＳ２領域を有すること；配列番号２に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなる２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域を有することが好ましい。

【0014】

また、本発明は、前記糸状菌が分泌する、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物；該分泌物と草本系バイオマスまたは木質系バイオマスとを接触させることを含むバイオマスの糖化方法；前記糸状菌を液体培養し、その液体培地から菌体を除去して得られる、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する液体組成物；該液体組成物と草本系バイオマスまたは木質系バイオマスを接触させることを含むバイオマスの糖化方法を提供する。この糖化方法においては、液体組成物と接触させた後の草本系バイオマスまたは木質系バイオマスを漉し取って固液分離する工程をさらに含むことが好ましい。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有し、草本系バイオマスおよび木質系バイオマスを効率よく糖化できる糸状菌の分泌物およびその分泌物を産生する糸状菌、並びに、その分泌物を利用して、バイオマスを前処理することなく糖化できる直接糖化方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】Ａ株の分生子柄の形態を示す顕微鏡写真。

【図2】Ａ株の分生子柄の先端部の形態を示す顕微鏡写真。

【図3】Ａ株の分生子の形態を示す顕微鏡写真。

【図4】Ａ酵素の安定性測定結果を示すグラフ。

【図5】Ａ菌株培養液のモニタリング結果を示すグラフ。

【図6】Ａ酵素、ＣＴｅｃ、ＣＴｅｃ２の基質特異性を示すグラフ。

【図7】Ａ酵素とＣＴｅｃ２の相乗効果測定結果を示すグラフ。

【図8】Ａ酵素の密度勾配等電点電気泳動による各分画の酵素活性を示すグラフ。

【図9】Ａ酵素、Ｚ酵素、ＣＴｅｃ２の酵素活性を示すグラフ。

【図10】Ｚ酵素とＣＴｅｃ２の酵素活性を示すグラフ。

【図11】粗粉砕稲わらに対する糖化活性を示すグラフ。

【図12】アンモニア処理稲わらに対する糖化活性を示すグラフ。

【図13】Ｚ酵素とアクレモニウムセルラーゼの糖化活性を示すグラフ。

【図14】Ｚ酵素とアクレモニウムセルラーゼの糖化活性を示すグラフ。

【図15】稲わらの糖化における酵素濃度の依存性を示すグラフ。

【図16】小麦わらの糖化における酵素濃度の依存性を示すグラフ。

【図17】葦に対する糖化酵素活性を示すグラフ。

【図18】イネ籾殻に対する糖化酵素活性を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0017】

次に、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。
本発明でいうセルロース糖化活性とは、ポリマーであるセルロースをモノマーであるグルコースに分解する酵素活性のことをいう。また、ヘミセルロース糖化活性とは、ポリマーであるヘミセルロースをモノマーであるキシロースやガラクトースなどの単糖類に分解する酵素活性のことをいう。
本発明の糸状菌が属するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）は、アオカビ類とも呼ばれる。本発明の糸状菌はセルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物を体外に分泌するので、液体培養した場合、その培地がセルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を発揮する。このため、この液体培地から菌体を取り除くだけで、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する液体組成物を容易に入手することができる。

【0018】

前記糸状菌はペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）であることが好ましく、フルカツム（Ｆｕｒｃａｔｕｍ）亜属、フルカツム節のＣｕｒｒｉｅ＆Ｔｈｏｍに属することがより好ましい。
具体的な菌株としては本発明者らが単離したＡ５９２−４Ｂ株（以下『Ａ株』と略す。）およびＳＡ５７−２株が挙げられる。ＳＡ５７−２株（以下『Ｚ株』と略す。）は、本発明者らにより２０１２年２月２０日（受領日）に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１が付与された。
Ｚ株は、Ａ株胞子にＵＶ照射して得られた変異株であり、Ａ株より優れたバイオマスの糖化活性を有する菌株である。

【0019】

本発明の前記ペニシリウム属に属する糸状菌は配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＩＴＳ１−５．８Ｓ ｒＤＮＡ−ＩＴＳ２領域を有することが好ましい。また、配列番号２に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有する塩基配列からなる２８Ｓ ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域を有することが好ましい。

【0020】

本発明のペニシリウム属に属する糸状菌は、ペニシリウム属に属する微生物を培養する公知の方法で培養できる。培地の組成は、特に限定されないが、培養時のコンタミネーションを防ぐ観点から、草本系バイオマスまたは木質系バイオマスを唯一の炭素源として用いることが好ましい。培地は、固形培地および液体培地のどちらでもよいが、液体培地を用いて培養することにより、培地中にセルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する分泌物が分泌され、糖化酵素群が蓄積されて培地のバイオマス糖化活性を向上できるため好ましい。
培養時の温度は２５〜３５℃であることが好ましく、２８〜３０℃であることがより好ましい。培地の初発ｐＨは、３．０〜７．０であることが好ましく、４．０〜６．０であることがより好ましい。
培養方法は静置培養、振盪培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すればよい。

【0021】

前記の通り、本発明のペニシリウム属に属する糸状菌を液体培養した液体培地は、セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有し、草本系バイオマスおよび木質系バイオマスの糖化に使用することができる。前記本発明の糸状菌を培養した液体培地をそのままバイオマスの糖化に使用してもよいが、本発明者らは、前記液体培地から糸状菌を除去することにより、単糖類の収率が格段に向上することを見いだした。培地中に存在する本発明の糸状菌は生成した単糖類を急速に消費しており、培地中から前記糸状菌の菌体を除去することで、生成した単糖類が培地中に蓄積され、単糖類の回収率を向上できるものと考えられる。

【0022】

液体培地中から菌体を除去する方法は特に制限されず、遠心分離や濾過など周知の手段を用いればよいが、遠心分離して菌体、基質バイオマスおよびその分解物を沈殿させ、上清画分を得る方法が簡便で好ましい。菌体の除去の際には、基質であるバイオマスおよびその分解物も併せて除去することがより好ましい。このようにして得られる本発明の液体組成物は、基質が稲わらであれば家庭用ミルで５〜１０ｍｍ程度の長さに粗粉砕しただけで、それ以上処理することなく高い効率で直接糖化することができる。

【0023】

既知の酵素や酵素製剤は、バイオマスそのものに対する分解酵素活性が非常に弱く、バイオマスの糖化にあたっては、酸やアルカリを用いる方法あるいは高温高圧の水を用いることによりバイオマスを化学的に前処理することが必須であった。しかし、酸やアルカリを用いる方法あるいは高温高圧の水を用いる方法によってバイオマスの処理をすると、上述の通り、難溶性の黒液が発生し、その処理にコストがかかるため、単糖類や目的物であるバイオエタノールの製造コストが高価となり、さらに黒液は酵素を吸着するので糖化反応をいっそう困難なものとしていた。
一方、本発明の分泌物および液体組成物は、バイオマスを糖化するにあたって化学的な前処理が不要であり、単に物理的に粉砕をするだけで草本系バイオマスや木質系バイオマスを直接糖化できるため、糖化やバイオエタノールの製造コストを格段に低減できる可能性がある。さらに、本発明の分泌物または液体組成物を作用させた反応液中には黒液が発生せず、エタノール発酵阻害物も極めて少ないため、この反応液を直接エタノール発酵に利用することができる。
糖化処理を終えた後に残る草本系バイオマスや木質系バイオマスの残渣は目の粗い布や網目状のフィルターで漉し取るだけで回収でき、また、回収したバイオマスの残渣は、燃焼してサーマルリサイクルをすることも容易である。

【0024】

草本系バイオマスはポリマー成分としてセルロースを４０質量％程度、ヘミセルロースを４０質量％程度、リグニンを１０質量％程度含んでいる。セルロースの糖化は、
セルロース→セロオリゴ糖→セロビオース→グルコース
の順で進む。このセルロース糖化活性を有する酵素は従来公知であり、市場から入手できる酵素として、アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）やＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ２、（いずれもノボザイムズ社製）が挙げられる。前記酵素のうち、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃとＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２が基本的な糖化酵素を含んだもので、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃとＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ２は特にバイオマス糖化に有効なヘミセルラーゼ群を含んだ添加剤である。前者と後者を９：１の質量比で混合して用いることが、メーカーにより推奨されている。本明細書中では、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃとＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃを９：１の質量比で混合した酵素を『ＣＴｅｃ』、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２とＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ２を９：１の質量比で混合した酵素を『ＣＴｅｃ２』と略す。

【0025】

一方、ヘミセルロースの糖化は、ヘミセルロースの主成分であるキシランを例に挙げると、
キシラン（ヘミセルロース）→キシロオリゴ糖→キシロビオース→キシロース
の順で進む。セルラーゼは、通常多少のヘミセルロース分解活性も有しているが、上記セルロース糖化活性に加えて、実用的なヘミセルロース糖化活性を併せ持つ単一菌株由来の酵素は知られていなかった。このため、市販のバイオマス糖化酵素製剤は、セルラーゼに加えて、ヘミセルラーゼ、キシロシダーゼ、β―グルコシダーゼなどが補填されている。また、上記キシランの糖化反応には少なくとも２種の酵素、すなわち、キシランをキシロオリゴ糖に分解するキシラナーゼと、キシロオリゴ糖からキシロビオースを経てキシロースとする反応を触媒するキシロシダーゼが関与することも、ヘミセルロースの糖化反応を困難にしていた。

【0026】

しかし、前記本発明の分泌物および液体組成物は、セルロース糖化活性とヘミセルロース糖化活性を併せ持つため、別の菌や細菌を培養して各種の酵素を精製、入手する必要がないことに加え、単一菌株の分泌物または培養液の組成物として入手できるので、大量に調製することも容易であり、非常に実用的である。また、本発明の分泌物および液体組成物は、草本系バイオマスの糖化にあたってアルカリ処理等の化学的な前処理をしなくても糖化酵素活性を発揮できるためリグニンを分解せずに済み、その結果、黒液が発生しないため、糖化反応後の処理費用も少なくて済む。さらに草本系バイオマスの糖化率が高いため、廃棄物の発生も少ないという優れた効果を発揮する。また、本発明の分泌物および液体組成物は、木質系バイオマスに対しても強力な糖化活性を有している。

【0027】

前記の通り、本発明の分泌物および液体組成物はセルロース糖化活性とヘミセルロース糖化活性を併せ持っている。このため、バイオマスを糖化する場合、単に前記本発明の分泌物または液体組成物とバイオマスとを接触させればよい。接触面積と糖化速度は比例するので、バイオマスはあらかじめ粗粉砕または微粉砕してから糖化の基質として用いることが好ましい。稲わらを粗粉砕する場合、家庭用ミルで５〜１０ｍｍ程度の長さにすればよい。微粉砕は、例えば製粉機を用いて行うことができる。また、バイオマスに汚れがついていると、糖化酵素活性が阻害されることもあるため、予め洗浄してから粉砕することが好ましい。

【0028】

本発明の分泌物または液体組成物は、密度勾配等電点電気泳動による分析結果から等電点がｐＨ４〜５の酵素とｐＨ６〜７の酵素の、少なくとも２種の酵素を含む酵素群であると考えられる。本発明の分泌物または液体組成物はｐＨ３〜１０の広い範囲で草本系バイオマスに対する高い糖化活性を示し、糖化酵素活性の至適ｐＨは５である。また、糖化酵素活性の至適温度は５０℃である。
なお、本発明において、Ａ株由来の液体組成物をＡ酵素液、Ｚ株由来の液体組成物をＺ酵素液と呼び、Ａ酵素液中の全タンパク質をＡ酵素、Ｚ酵素液中の全タンパク質をＺ酵素と呼ぶ。

【0029】

本発明の分泌物または液体組成物の適切な使用量は、基質である草本系バイオマスや木質系バイオマスの種類にも依存し一概には言えないが、基質１ｇ当たりタンパク質量として０．１ｍｇ〜２０ｍｇを挙げることができる。Ｚ酵素は低濃度であっても稲わらと小麦わらの両方に対して、既存のバイオマス糖化酵素と比べてより高い酵素活性を発揮する。このため、本発明の分泌物および液体組成物は、従来のバイオマス糖化酵素と比べて費用対効果に優れ、バイオ燃料の生産コスト低減に有用である。
なお、酵素液中のタンパク質濃度は、市販のキットを用いて、ＢＳＡを標準とするブラッドフォード法により決定することができる。市販のキットの例としては子牛血清アルブミンプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド製、５００−０００２ＪＡ）が挙げられる。

【0030】

セルロース糖化活性およびヘミセルロース糖化活性を有する本発明の分泌物または液体組成物に、セルロース糖化活性を有する別の酵素またはヘミセルロース糖化活性を有する別の酵素を加えて、草本系または木質系バイオマスと接触させ、糖化処理に使用してもよい。別の酵素の例としては、複数の菌株に由来する酵素の混合物と考えられるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）や単一菌株由来のセルラーゼであるアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）が挙げられる。

【0031】

本発明者らは、Ａ酵素とＣＴｅｃ２とを混合して粉砕稲わらの糖化に用いたところ、驚くべきことに、Ａ酵素やＣＴｅｃ２を単独で用いた場合と比べて、単糖への分解量が最大３０％も向上することを見いだした。また、Ｚ酵素とＣＴｅｃ２とを混合して粉砕稲わらの糖化に用いたところ、条件によっては、ＣＴｅｃ２を単独で用いた場合と比べて、単糖への分解量が約４０％も向上することを見いだした。

【0032】

この理由は明らかではないが、草本系バイオマスや木質系バイオマスには様々なセルロースやヘミセルロースが存在し、単一の酵素だと分解されにくい成分が存在することがある。このため、本発明の分泌物または液体組成物とは別に加えた酵素が、本発明の分泌物または液体組成物による分解が遅い成分を効率よく分解し、本発明の分泌物または液体組成物と相乗効果を発揮して、極めて高い糖化活性を得られる場合があると考えている。

【0033】

草本系バイオマスの具体例としては、稲わら、もみ殻、麦わら、青刈りトウモロコシ、牧草、葦等が挙げられる。日本では年間８５３万トンの稲わらが発生するとされており、我が国で実施する場合には、生産量が多い稲わらを用いることが好ましい。一方、全世界では、稲わらの賦存量が５．８億トン／年であるのに対し、小麦わらの賦存量は７．９億トン／年とされている。本発明の分泌物および液体組成物は、小麦わらに対しても優れた糖化活性を有しており、海外でのバイオ燃料の生産にも非常に有用である。その他の海外における有望な草本系バイオマス資源としては、イネ科のエリアンサス、ネピアグラスが挙げられる。

【0034】

木質系バイオマスの具体例としては、間伐材、林地残材、建築廃材、製材廃材、竹などが挙げられる。

【0035】

本発明者らが見いだしたＡ酵素およびＺ酵素は単一種の微生物に由来するにもかかわらず、麦わらおよび小麦わらに対し、複数の菌体に由来する酵素の混合物と考えられるＣＴｅｃ２と同等以上の糖化活性を有する。単一種の微生物から糖化酵素を入手する場合、複数の微生物から酵素を入手する場合や複数の酵素を混合して酵素を調製する場合と比べて、手間やコストを数分の１から数十分の１に減らすことができる。さらにＡ酵素およびＺ酵素は、低濃度でも従来販売されている草本系バイオマス糖化酵素と比べて、優れた酵素活性を示すので、バイオ燃料の生産に要する酵素量を減らし、生産コストを削減することができる。
また、Ａ酵素およびＺ酵素は草本系バイオマスのみならず、木質系バイオマス由来のブナ材キシランに対する糖化活性も、市販の最強酵素製剤といわれているＣＴｅｃ２と同程度であり、木質系バイオマスの糖化にも好適に使用することができる。

【実施例】

【0036】

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の単なる例示であって、本発明の限定を意図するものではない。
なお、本発明における１Ｕは、１分間当たりに１μモルのグルコース（または還元糖）を遊離する酵素活性の意味である。

【0037】

＜草本系バイオマス糖化酵素を有する微生物の探索と同定＞
腐食を多く含む土壌サンプル、約８００サンプルから菌を採取し、稲わらを唯一の炭素源とする集積培養を行った。この集積培養には、表１の組成の培地を使用した。粉砕稲わらは、長野県産稲わら（有限会社宮原商店製、長野市）をハサミで５ｍｍ程度にカットしてからセラミックミル（パナソニック製ＥＵ６８２０Ｐ−Ｇ）にて粉砕したものを用いた。

【0038】

前記集積培養の結果、草本系バイオマスの糖化効率が高い菌株（Ａ５９２−４Ｂ株。「Ａ株」と略す。）が得られ、その同定試験を業者（株式会社テクノスルガ・ラボ、静岡市）に委託した。ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ（配列番号１）および２８Ｓ ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２（配列番号２）をアポロンＤＢ−ＦＵおよびＢＬＡＳＴ相同性検索した結果、菌株はペニシリウム・オキサリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｘａｌｉｃｕｍ）に属する菌株と同定された。Ａ株をポテトデキストロース寒天培地平板上で培養したときのコロニーは濃緑色で、その形状は真円形で平坦かつ均一に広がった。Ａ株を種々の培地上で２５℃にて１週間培養した後の巨視的観察結果を表２に示す。

【0039】

なお、表の色調欄の（）内の数値は、Ｋｏｒｎｅｒｕｐ ａｎｄ Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）で用いられている色のコード番号を示す。

【0040】

Ａ株の微視的観察結果は以下の通りである。
・栄養菌糸：菌糸は寒天表面上または寒天内に形成され、無色、有隔壁菌糸の形成が認められた。
・無性生殖器官
（１）分生子柄および分生子形成細胞：分生子柄は栄養菌糸より直生し、分生子柄の先端部から円筒形のメトレが形成され、その先に分生子形成細胞であるフィアライドが形成される二輪性ペニシルスが主に観察された（図１、２）。フィアライドは皮針形を示した（図２）。
（２）分生子：フィアロ型分生子で、フィアライドから鎖状に連なって形成され、楕円形、１細胞、表面は平滑〜粗面（図３）。
・有性生殖器官：約２週間の培養検体からは有性生殖器官の形成は確認できなかった。

【0041】

［実施例１］＜Ａ酵素の取得と活性測定＞
（前培養）
小麦ふすま質量２％を含む液体培地１０ｍＬを２５ｍｍ径のガラス試験管に分注し、シリコセン（登録商標）をして高圧蒸気滅菌器（平山製作所製、ＨＶＡ−１１０）で１２１℃、１５分間滅菌した後、常温にして前培養用の液体培地を調製した。これに、ＰＤＡ培地上のＡ菌株を無菌的に１白金耳植菌し、培養恒温反応器（タイテック株式会社製、ＢＲ−４３ＦＬ）で３０℃にて３日間、２５０ｓｐｍで往復振盪して、前培養を行った。

【0042】

（Ａ酵素液の調製）
表１の組成の液体培地１Ｌを、２Ｌのバッフル付きフラスコ（柴田科学製）に調製し、シリコセン（登録商標、アズワン製Ｃ−６５）を装着して高圧蒸気滅菌器（平山製作所製、ＨＶＡ−１１０）で１２１℃、１５分間滅菌して培養液を調製した。常温の培養液に前培養液１０ｍＬを植菌し、これを培養器（ブリス株式会社製、ＴＢ−２５ＲＳ）中１００ｒｐｍで回転させながら、３０℃にて７日間培養した。得られたＡ菌株培養液を遠心分離器（日立製作所製、ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ）で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清約９００ｍＬを得、これをＡ酵素液とした。

【0043】

（Ａ酵素の安定性の検討）
粉砕稲わらを基質として、温度３０〜６０℃、ｐＨ３〜７の条件下でＡ酵素による糖化反応を行い、反応後に上清中の還元糖量をソモギーネルソン法で測定することによりＡ酵素の活性を求めたところ、Ａ酵素の至適温度は５０℃、至適ｐＨは５であった。また、ｐＨ５．０として３０〜７０℃で３０分間保った後に酵素活性を測定することでＡ酵素液の温度安定性を調べたところ、５０℃以下では安定であった。また、ｐＨ２〜１１で３０分間保った後の酵素活性を測定した結果、Ａ酵素の活性はｐＨ３〜１０の範囲で安定であった。ｐＨ安定性については、ｐＨ５とｐＨ９で活性が高い二峰性を示したが、本発明者らは、Ａ酵素液中に複数存在する酵素の安定性の違いに起因するものと考えている。結果をグラフとしたものを図４ａ〜ｄに示す。

【0044】

（酵素活性の測定）
１ｇの粉砕稲わらと１０ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に蒸留水を添加して９５ｍＬにメスアップして基質液を調製した。この基質液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに１９０μＬずつ分注し、プレートシールを貼ってからサーモシェーカー（バイオサン製ＰＳＴ−６０ＨＬ−４）にセットした。１５分間保温した後、各ウェルにＡ酵素を含む酵素液を１０μＬずつ添加し、３０分間８５０ｒｐｍで回転振盪して酵素反応させた。その後、各ウェルに１Ｍ ＮａＯＨを１５μＬ添加し、酵素反応を止めた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレート遠心機（クボタ製、ＰｌａｔｅＳｐｉｎＩＩ）にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清中の遊離還元糖濃度を後述するＤＮＳ法で測定した。この結果、Ａ酵素の比活性は、１８．２Ｕ／ｍｇであった。

【0045】

（ＤＮＳ法の手順）
ＤＮＳ法の手順は以下のとおりである。
１．まず、９６穴ＰＣＲプレートの各ウェルにサンプル２０μＬを入れる。
２．次いで、サンプルを入れたウェルに表３の組成のＤＮＳ試薬を４０μＬ添加し、プレートの表面にプレートシール（株式会社バイオクロマト製、タイタースティックＨＣ）を貼って密封した後、プレートを沸騰水に入れて５分間反応させる。
３．プレートを氷水中で５分間冷却してから、プレートシールを剥がし、各ウェルに蒸留水１８０μＬを加える。
４．各ウェルに発色液１８０μＬを加えたのち、プレートリーダー（大日本住友製薬製、Ｖｉｅｎｔｏ）で５４０ｎｍの吸光度を測定し、この吸光度から遊離還元糖濃度を求める。

【0046】

表３にＤＮＳ試薬の組成を示す。ＤＮＳ試薬は褐色瓶に入れて使用するまで室温で保存した。

【0047】

［実施例２］＜１ＬスケールでのＡ株の培養モニタリング＞
表１の組成の液体培地１Ｌを、２Ｌのバッフル付きフラスコ（柴田科学製）に計３サンプル調製し、実施例１と同様にして滅菌して培養液を調製した。これにＡ株の前培養液１０ｍＬを植菌し、このフラスコを培養器（ブリス株式会社製、ＴＢ−２５ＲＳ）中９０ｒｐｍで回転させ、３０℃にて７日間培養しながら、１日ごとに培養液中の酵素活性、タンパク質濃度、還元糖濃度およびｐＨを測定した。

【0048】

その結果、還元糖濃度については実験開始直後０．７ｍｇ／ｍＬ程度であったが、２４時間後には０．２ｍｇ／ｍＬまで下がり、以後ほとんど変化しなかった。これは、粉砕稲わらに含まれる可溶性の還元糖が調製直後の培地に溶解するものの、菌体が生育のために利用・吸収し、その後もＡ酵素の作用で生成した還元糖を、菌体がすぐに取り込むためと考えられる。

【0049】

ｐＨは２４時間で３．５付近まで急激に下がるが、その後徐々に上昇し、培養４日目でｐＨ５．５付近まで戻った。
タンパク質量は、培養開始直後は０．１ｍｇ／ｍＬ未満であったが、２４〜９６時間後にかけてなだらかに上昇した。
稲わら分解活性については、培養直後はほぼ０であったが、２４時間後から上昇しはじめ、９６時間後に最大値となった。稲わら分解活性の推移は、タンパク質量およびｐＨの推移と正の相関を示した。結果をグラフにしたものを図５に示す。
なお、タンパク質濃度の測定はＢＳＡを標準としてブラッドフォード法により測定した。測定には子牛血清アルブミンプロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド製、５００−０００２ＪＡ）を用いた。酵素活性の測定は上記ＤＮＳ法で行った。

【0050】

＜各種基質に対するＡ酵素の糖化活性＞
［実施例３］
酵素溶液を適宜希釈し、表４の組成の反応溶液を調製し、１７０ｓｐｍで往復振盪させながら、４５℃にて３０分反応させた。その後、氷冷して反応を止め、４℃にて１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の還元糖濃度を実施例１の（ＤＮＳ法の手順）と同様にして測定した。その結果、粉砕稲わらに対するＡ酵素の糖化酵素活性は１３．４±０．５３Ｕ／ｍｇであった。

【0051】

【0052】

［比較例１］
反応溶液中のＡ酵素の代わりにノボザイムズ社（デンマーク）のＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃとＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃを９：１の割合で混合したもの（ＣＴｅｃと略す。）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして糖化酵素活性を測定した。その結果、ＣＴｅｃの糖化酵素活性は２．７０±０．０２Ｕ／ｍｇであった。

【0053】

［比較例２］
反応溶液中のＡ酵素の代わりにノボザイムズ社（デンマーク）のＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２とＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ２を９：１の割合で混合したもの（ＣＴｅｃ２と略す。）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして糖化酵素活性を測定した。その結果、ＣＴｅｃ２の糖化酵素活性は５．１０±０．０１Ｕ／ｍｇであった。

【0054】

［実施例４、比較例３、４］
粉砕稲わらの代わりにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｗａｋｏ製）を用い、遠心分離を行わなかったこと以外はそれぞれ実施例３、比較例１、２と同様にして各酵素のＣＭＣ糖化活性を測定した。

【0055】

［実施例５、比較例５、６］
粉砕稲わらの代わりにアビセル（登録商標）ＰＨ−１０１（Ｆｌｕｋａ製）を用いたこと以外はそれぞれ実施例３、比較例１、２と同様にして各酵素のアビセル（登録商標）糖化活性を測定した。

【0056】

［実施例６、比較例７、８］
粉砕稲わらの代わりにブナ材キシラン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いたこと以外はそれぞれ実施例３、比較例１、２と同様にして各酵素のブナ材キシラン糖化活性を測定した。

【0057】

［実施例７］
表４中、１０ｍｇの粉砕稲わらの代わりに終濃度０．２５ｍＭのｐ−ニトロフェノール−β−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ；和光純薬工業製）を用いて反応溶液を調製し、これを１７０ｒｐｍで回転振盪させながら、４５℃にて１５分反応させた。その後、反応溶液に２ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加え、アルカリ性にすることで反応を停止するとともに遊離のパラニトロフェノール（ＰＮＰ）を発色させ、プレートリーダーで５００ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線と比較することによりＡ酵素のＰＮＰＧ分解活性を求めた。
［比較例９、１０］
Ａ酵素の代わりにそれぞれＣＴｅｃ、ＣＴｅｃ２を用いたこと以外は実施例７と同様にしてＰＮＰＧ分解活性を求めた。

【0058】

実施例３〜７および比較例１〜１０の結果をグラフにしたものを、図６に示す。ＣＴｅｃ２はすべての基質でＣＴｅｃより優れていたので、本発明のＡ酵素とＣＴｅｃ２を比較すると、ＣＭＣ、アビセル（登録商標）およびＰＮＰＧに対する活性は、ＣＴｅｃ２の方がＡ酵素より高く、ＣＭＣで２．３倍、アビセル（登録商標）で５．２倍、ＰＮＰＧで８．９倍であった。しかし、草本系バイオマスである粉砕稲わらについては、本発明のＡ酵素の方がＣＴｅｃ２よりも２．６倍も活性が高かった。これらの結果から、Ａ酵素は自然物であるバイオマス原料に対して優れた糖化活性を持っていると考えられる。
また、ブナ材キシランに対する活性はＡ酵素とＣＴｅｃ２とで同程度であった。この結果から、Ａ酵素は木質系バイオマスの糖化活性も十分に有していることが明らかである。

【0059】

＜Ａ酵素とＣＴｅｃ、ＣＴｅｃ２との相互作用の検討＞
実施例８、９および比較例１１、１２では、本発明のＡ酵素と、市販の複合酵素であるＣＴｅｃおよびＣＴｅｃ２との相互作用を検討した。
［実施例８］
４．５ｍｇ／ｍＬのＡ酵素液を用いて表４の組成の溶液を調製し、１７０ｒｐｍで回転振盪させながら、４５℃にて反応させた。所定時間後に氷冷して反応を止め、４℃にて１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の還元糖濃度を実施例１の（ＤＮＳ法の手順）と同様にして測定することにより、実験開始から１２０時間後までの溶液中の還元糖濃度を測定した。結果を図７に三角（△）で示す。

【0060】

［実施例９］
４．５ｍｇ／ｍＬのＡ酵素液１００μＬに加えて、４．５ｍｇ／ｍＬのＣＴｅｃ２を１００μＬ同時に添加したこと以外は、実施例８と同様の手順で溶液中の還元糖濃度を測定した。結果を図７に（×）で示す。

【0061】

［比較例１１］
Ａ酵素液の代わりに、ＣＴｅｃを用いたこと以外は、実施例８と同様の手順で溶液中の還元糖濃度を測定した。結果を図７にひし形（◇）で示す。

【0062】

［比較例１２］
Ａ酵素液の代わりに、ＣＴｅｃ２を用いたこと以外は、実施例８と同様の手順で溶液中の還元糖濃度を測定した。結果を図７に四角（□）で示す。

【0063】

実施例８、９および比較例１１、１２の結果から、驚くべきことに本発明のＡ酵素とＣＴｅｃ２とを混合した場合に、粉砕稲わらの糖化率が向上することが明らかとなった。なお、Ａ酵素とＣＴｅｃを混合した酵素の粉砕稲わら糖化率は、Ａ酵素のみを用いた実施例８と同程度であった（不図示）。また、実施例８、９および比較例１１、１２の中では、実施例９のみ酵素添加量が他の倍の０．９ｍｇとなっているが、酵素量は０．４５ｍｇでも大過剰であり、各酵素を単独で使用した場合、酵素量を０．４５ｍｇより増やしても粉砕稲わらの糖化率に変化は見られなかった（不図示）。
Ａ酵素とＣＴｅｃ２を混合して用いた場合（実施例９）の粉砕稲わら糖化率は、Ａ酵素を単独で用いた場合（実施例８）やＣＴｅｃ２を単独で用いた場合（比較例１１）の約１．３倍であった。この結果から、粉砕稲わら基質中にＡ酵素のみが糖化できる成分と、ＣＴｅｃ２のみが糖化できる成分とが存在することが示唆される。すなわち、本発明のＺ酵素とＣＴｅｃ２とを混合して用いることにより、稲わらをより効率的に糖化できるとともに、糖化に伴い発生する廃棄物を減少できる可能性がある。

【0064】

［実施例１０］
Ａ酵素の密度勾配等電点電気泳動を行い、得られた各フラクションについて２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０ｎｍ）の測定、並びに、フラクションのＣＭＣ糖化（ＣＭＣａｓｅ）活性、アビセル糖化（Ａｖｉｃｅｌａｓｅ）活性、ＰＮＰＧ糖化（ＰＮＰＧａｓｅ）活性およびキシラン糖化（キシラナーゼ）活性を測定した。結果を各フラクションの溶出時のｐＨと併せて図８に示す。

【0065】

Ａ２８０ｎｍのピークは、大きい方からｐＨ２．５、ｐＨ４．５、ｐＨ７．０の３カ所に見られた。しかし、ｐＨ２．５付近のフラクションには酵素活性が全くみられないことから、雑タンパク質と考えられる。
一方、ｐＨ４．５とｐＨ７．０付近のどちらかのフラクションに各酵素の活性が見られた。具体的には、ＣＭＣａｓｅ活性はｐＨ４．２およびｐＨ６．５付近に極大が見られた。Ａｖｉｃｅｌａｓｅ活性もＣＭＣａｓｅ活性と同様でｐＨ４．５付近およびｐＨ６．３に極大が見られた。ＰＮＰＧａｓｅ活性は、ｐＨ４付近にのみ極大が見られた。キシラナーゼ活性は、ｐＨ４から９にわたり広範に活性が見られ、ｐＨ６．７付近に最大の活性が見られた。

【0066】

上記の結果と、ペニシリウム属のキシラナーゼにはアイソザイムが存在するとの報告があること、リグノセルロースの分解には複数の酵素の関与が必要とされていることを考慮すると、本発明のＡ酵素液には少なくとも２種の酵素が存在し、これらの酵素がエンド−β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびキシラナーゼ活性を発揮していることが示唆される。
また、Ａ２８０ｎｍを総計したうちの約３分の１がｐＨ２．５付近に存在していたことから、この分画を除去することでＡ酵素液の比活性を１．５倍程度向上できると考えられる。

【0067】

［実施例１１］＜Ｚ酵素の取得と活性測定＞
Ａ菌株胞子にＵＶ照射することによって変異株であるＺ株を得た。
そして、Ａ菌株の代わりにＺ菌株を用いたこと以外は実施例１と同様にしてＺ酵素液を取得し、その活性を測定したところ、Ｚ酵素の比活性は３０．６Ｕ／ｍｇであった。すなわち、Ｚ酵素はＡ酵素に対し約１．７倍の比活性を有している。
このペニシリウム・オキサリクムＳＡ５７−２株（Ｚ株）を２０１２年２月２０日（受領日）に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１が付与された。

【0068】

［比較例１３］＜粉砕稲わらの完全糖化率の測定＞
粉砕稲わらを硫酸で完全分解して、その糖組成を調べた。具体的には、３００ｍｇの粉砕稲わらに７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃にて１時間保温し、この間１０分に１回撹拌した。その後、蒸留水８４ｍＬを加え、オートクレーブに入れて１２１℃にて１時間保った。溶液に炭酸カルシウムを加えて中和した後、０．２μｍのフィルターに通し、ろ液をＨＰＬＣ分析用試料とした。
ＨＰＬＣの溶離液として蒸留水を０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を１０μＬ注入し、ＲＩ検出器（日本分光株式会社製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いて遊離糖を測定した。この結果、ＨＰＬＣ分析用試料の糖組成は、稲わら重量に対してグルコース２４．７％、キシロース１０．８％、アラビノース２．０％、ガラクトース１．８％で、前記稲わらを完全分解したときの遊離糖の割合は稲わら重量の３９．３％であった。なお、カラムはアジレントテクノロジー社製ＰＬ Ｈｉ−Ｐｌｅｘ Ｐｂ ３００×７．７ｍｍを使用し、カラム温度は８０℃とした。

【0069】

［実施例１２］＜Ｚ酵素による限界糖化率の測定＞
表５の組成の反応溶液を調製し、４５℃にて２５０ｓｐｍで往復振盪し５日間保った。その後、溶液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００℃で５分間加熱処理してから０．２μｍ径のＨＰＬＣ前処理フィルター（アドバンテック社製、２５ＨＰ０２０ＡＮ）に通してＨＰＬＣ分析用試料とした。

【0070】

ＨＰＬＣの溶離液として蒸留水を０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を１０μＬ注入し、ＲＩ検出器（日本分光製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いて遊離糖を測定した。その結果、前記試料中の遊離糖濃度は３．４０ｍｇ／ｍＬであった。また、比較例１３の稲わらを完全分解したときの糖組成の結果を用いて計算したところ、Ｚ酵素による稲わらの糖化率は８６．６％であった。
なお、カラムはアジレントテクノロジー社製ＰＬ Ｈｉ−Ｐｌｅｘ Ｐｂ ３００×７．７ｍｍを使用し、カラム温度は８０℃とした。

【0071】

［実施例１３］＜Ａ酵素による限界糖化率の測定＞
前記反応溶液中のＺ酵素の代わりにＡ酵素を用いたこと以外は実施例１２と同様にして、ＨＰＬＣ分析用試料中の遊離糖を測定した。その結果、試料中の遊離糖濃度は３．１３ｍｇ／ｍＬ、稲わらの糖化率は７９．６％であった。

【0072】

［比較例１４］＜ＣＴｅｃ２による限界糖化率の測定＞
前記溶液中のＺ酵素を、ノボザイムズ社（デンマーク）のＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２とＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ２を９：１の割合で混合したもの（ＣＴｅｃ２）に代えたこと以外は、実施例１２と同様にしてＨＰＬＣ分析用試料中の遊離糖を測定した。その結果、試料中の遊離糖濃度は２．５５ｍｇ／ｍＬ、稲わらの糖化率は６４．８％であった。

【0073】

上記実施例１２、１３および比較例１４の結果をまとめたグラフを図９に示す。図中の数字は稲わらの糖化率である。この図から、Ｚ酵素およびＡ酵素がともに、市販の強力なセルラーゼであるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２よりも稲わら糖化率が高いこと、Ｚ酵素はＡ酵素よりも稲わら糖化活性も稲わら糖化率も高い有用な変異株であることが明らかである。

【0074】

＜２０％稲わら糖化活性の比較＞
［実施例１４］
前記実施例１２、１３および比較例１４の結果から、Ｚ酵素およびＡ酵素の両方がＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２よりも高い稲わら糖化率を示すことが分かったが、稲わら添加濃度が１質量％と低く、稲わらの完全分解率を測定するために酵素添加量が多かった。実用的には、高濃度の稲わらを含む溶液から高濃度の糖液を得ることが好ましく、また、酵素添加量を少なくし高い酵素活性を発揮させることが好ましい。
このため、粉砕稲わら濃度を２０質量％、酵素添加量を１０ｍｇ酵素／ｇ稲わら、１００ｍＭ（終濃度）酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を含むＺ酵素反応溶液を調製し、酵素反応を行った。

【0075】

前記Ｚ酵素反応溶液を調製後、恒温反応器で４５℃にて７日間、２５０ｓｐｍで往復振盪した。その後、溶液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００℃で５分間加熱処理してから０．２μｍ径のＨＰＬＣ前処理フィルター（アドバンテック社製、２５ＨＰ０２０ＡＮ）に通してＨＰＬＣ分析用試料とした。
ＨＰＬＣの溶離液として、アセトニトリルと蒸留水を３：１の容積比で混合したものを０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を注入し、ＲＩ検出器（日本分光製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いてグルコース、キシロースおよび全遊離糖を測定した。その結果、前記試料中のグルコース濃度は４８．３４ｍｇ／ｍＬ、キシロース濃度は１３．６６ｍｇ／ｍＬ、全遊離糖濃度は６５．７１ｍｇ／ｍＬであった。また、比較例１３で得られた糖組成に基づいて完全糖化率に対する各糖への分解率を求めたところ、グルコース：９７．９％、キシロース：６３．２％、糖全体：９２．５％であった。結果を図１０にグラフとして示す。図中の数字は、完全糖化率に対する各糖への分解率を示す。

【0076】

［比較例１５］
Ｚ酵素の代わりに、ＣＴｅｃ２を用いたこと以外は実施例１４と同様にして実験を行った。その結果、試料中のグルコース濃度は４２．３９ｍｇ／ｍＬ、キシロース濃度は８．８９ｍｇ／ｍＬ、全遊離糖濃度は５５．００ｍｇ／ｍＬであった。また、完全糖化率に対する各糖への分解率は、グルコース：８５．８％、キシロース：４１．２％、糖全体：７７．５％であった。結果を図１０に示す。

【0077】

実施例１４および比較例１５の結果から、本発明者らが見いだしたＺ酵素は、２０質量％という高い基質濃度、１０ｍｇ酵素／ｇ稲わらの酵素添加量でも高い稲わら糖化率を維持しており、最新市販酵素ＣＴｅｃ２よりも高い糖化率を示すことが明らかである。

【0078】

＜粗粉砕稲わらの糖化活性測定＞
［実施例１５］
長野県産稲わら（有限会社宮原商店、長野市）をハサミで５ｃｍ程度にカットしてから家庭用ミキサー（パナソニック製ＭＪ−Ｍ３）にて３０秒程度粉砕し、粗粉砕稲わらを調製した。粗粉砕稲わら１ｇを５０ｍＬ遠心チューブに入れ、これにＺ酵素５ｍｇ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍＬを入れて、脱イオン水で１０ｍＬにメスアップして密栓した。このチューブを振盪培養器（タイテック製ＢＲ−４３ＦＬ）に直立にセットし、３００ｒｐｍで回転振盪して４５℃にて７日間反応させた。その後、反応液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００℃で５分間加熱処理してから０．２μｍ径のＨＰＬＣ前処理フィルター（アドバンテック社製、２５ＨＰ０２０ＡＮ）に通してＨＰＬＣ分析用試料とした。

【0079】

ＨＰＬＣの溶離液として、アセトニトリルと蒸留水を３：１の容積比で混合したものを０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を注入し、ＲＩ検出器（日本分光製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いてグルコース、キシロースおよび全遊離糖を測定した。この測定結果と比較例１３で得られた糖組成に基づいて完全糖化率に対する各糖への分解率を求めたところ、グルコース：７５．１３％、キシロース：３６．２８％、遊離糖全体：６４．４０％であった。結果を図１１にグラフとして示す。なお、カラムは昭和電工製Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ ２５０×４．６ｍｍを使用し、カラム温度は２６℃とした。

【0080】

［比較例１６］
Ｚ酵素の代わりに、ＣＴｅｃ２を用いたこと以外は実施例１５と同様にして実験を行った。その結果、各糖への分解率は、グルコース：５２．３４％、キシロース：３７．９３％、遊離糖全体：４６．６１％であった。結果を図１１に示す。

【0081】

［比較例１７］
Ｚ酵素の代わりに、単一菌株由来酵素の市販製品で、最も強いバイオマス糖化活性を持っているとされるアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）を用いたこと以外は実施例１５と同様にして実験を行った。その結果、各糖への分解率は、グルコース：４８．４１％、キシロース：１１．２２％、遊離糖全体：３７．３３％であった。結果を図１１に示す。

【0082】

実施例１５、比較例１６、１７の結果から、本発明のＺ酵素が、現在市販されている酵素の中でも高いセルラーゼ活性を持つとされるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２や高いバイオマス糖化活性を持つアクレモニウムセルラーゼと比べても、ミキサー処理しただけの粗粉砕稲わらを、化学的な前処理をすることなく６４．４％という高い分解率で糖化できることが示された。
従来、稲わら等のバイオマスを糖化する際には、酵素による糖化に先立ち酸やアルカリあるいは高温高圧の水による前処理が必要とされてきた。アルカリ法や高温高圧の水を用いる方法による前処理では黒液が発生し、別途黒液等の廃液処理が必要であるが、本発明のＺ酵素は粗粉砕稲わらを高い分解率で直接糖化できるため、黒液等の廃液処理を必要とせず、バイオマス糖化の実用化に当たり非常に有利である。

【0083】

＜アンモニア処理わらの糖化活性比較＞
［実施例１６］
（アンモニア処理わらの調製）
実施例１５に記載の手順で調製した粗粉砕稲わらに２８％アンモニア水を稲わら重量の２．５倍量加え、それを６０℃にて３時間振盪反応器で振盪した。その後、粉砕稲わらを乾燥し、製粉機（マルマス機械製、商品名：マルマスホーミル）でさらに粉砕して、アンモニア処理わらとした。

【0084】

（アンモニア処理わらの酵素処理）
アンモニア処理わら２６０ｍｇ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬおよびＺ酵素２．６ｍｇにイオン交換水を添加して全量１ｍＬの酵素反応液を調製し、この反応液をマイクロチューブ（ザルスタット社製、７２．６９４．００７）に入れた。マイクロチューブを振盪培養器（タイテック社製、ＢＲ−４３ＦＬ）に横向きにセットし、４５℃にて７日間、３００ｓｐｍで往復振盪して、酵素反応させた。
その後、酵素反応液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００℃で５分間加熱処理してから０．２μｍ径のＨＰＬＣ前処理フィルター（アドバンテック社製、２５ＨＰ０２０ＡＮ）に通してＨＰＬＣ分析用試料とした。

【0085】

（反応液のＨＰＬＣ分析）
ＨＰＬＣの溶離液として、アセトニトリルと蒸留水を３：１の容積比で混合したものを０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を注入し、ＲＩ検出器（日本分光製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いてキシロースとキシロビオースを測定した。その結果、酵素反応液中のキシロースの濃度は３４．０８ｍｇ／ｍＬ、キシロビオースの濃度は８．１０ｍｇ／ｍＬであった。別に行った組成成分分析では、アンモニア処理わらを完全に分解すると、その重量のうち２０％がキシロースとなったことから、本実施例で使用したアンモニウム処理わら２６０ｍｇを完全に糖化したときのキシロースの理論値は５２ｍｇである。この値を元に、酵素反応液におけるキシロースとキシロビオースへの分解率を算出した。分解率を図１２のグラフ中に示す。キシロースとキシロビオースを合わせると生成率は理論値の８１．１％であった。なお、カラムはアジレントテクノロジー社製ＰＬ Ｈｉ−Ｐｌｅｘ Ｐｂ ３００×７．７ｍｍを使用し、カラム温度は２６℃とした。

【0086】

［比較例１８］
Ｚ酵素の代わりに、ＣＴｅｃ２を用いたこと以外は実施例１６と同様にして実験を行った。その結果、酵素反応液中のキシロースの濃度は３２．４３ｍｇ／ｍＬ、キシロビオースの濃度は９．４７ｍｇ／ｍＬ、キシロースとキシロビオースを合わせると生成率は理論値の８０．６％であった。結果を図１２に示す。

【0087】

［比較例１９］
Ｚ酵素の代わりに、単一菌株由来酵素の市販製品で、最も強いバイオマス糖化活性を持っているとされるアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）を用いたこと以外は実施例１６と同様にして実験を行った。その結果、酵素反応液中のキシロースの濃度は１６．２３ｍｇ／ｍＬ、キシロビオースの濃度は１５．７０ｍｇ／ｍＬ、キシロースとキシロビオースを合わせると生成率は理論値の６１．４％であった。結果を図１２に示す。

【0088】

実施例１６および比較例１８、１９の結果から、本発明のＺ酵素は単一菌株由来酵素でありながら、複数種の酵素を組み合わせた複合酵素製剤であるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２とほぼ互角の糖化率を示した。また、単一菌（アクレモニウム・セルロリティカス；Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）を遙かにしのぐ糖化率を示した。アクレモニウムセルラーゼは、単一菌株由来酵素としては最も優れたセルラーゼ活性を持つといわれているが、本発明のＺ酵素はそれに勝っているため、単一菌株由来酵素で最強であると考えられる。さらに、本発明のＺ酵素は、上記ＣＴｅｃ２やアクレモニウムセルラーゼと比較して、分解中間物であるキロビオースが残りにくく、単糖であるキシロースに効率よく分解できることが示された。

【0089】

＜Ｚ酵素とアクレモニウムセルラーゼとの比較＞
［実施例１７］
実施例１６の（アンモニア処理わらの調製）の手順にてアンモニア処理わらを得、これに脱イオン水を加えて９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨ててから再度脱イオン水を加えて洗浄し、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿を得、これを乾燥して洗浄微粉砕稲わらを得た。

【0090】

上記表６の組成の基質液を調製し、これをマイクロプレートに４５０μＬ／ウェル分注した。このプレートをプレートシェイカーにセットし３０℃に予備加熱した後、Ｚ酵素濃度が２０ｍｇ／ｍＬのＺ酵素液を１ウェルあたり５０μＬ加え、８５０ｒｐｍで回転振盪して２時間酵素反応させた。その後に１ウェルあたり２５μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加えて撹拌し、酵素反応を止めた。次いで、マイクロプレートをマイクロプレート遠心機（クボタ製、ＰｌａｔｅＳｐｉｎＩＩ）にて１５００ｇで１０分間、室温にて遠心分離し、上清を回収し、これにアセトニトリルを加えて２倍に希釈してからフィルタープレート濾過（３μｍガラスフィルター／０．２μｍフィルター）したサンプルをＨＰＬＣ分析用試料とした。

【0091】

上記ＨＰＬＣ分析用試料について、実施例１５と同様にしてＨＰＬＣで試料中のグルコース濃度、キシロース濃度およびアラビノース濃度を求めた。結果を図１３に示す。

【0092】

［実施例１８〜２２、比較例２０］
酵素反応液中の全酵素濃度を２ｍｇ／ｍＬとしたまま、Ｚ酵素濃度とアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）濃度を表７に記載の濃度としたこと以外は、実施例１７と同様にして酵素反応を行い、試料中のグルコース濃度、キシロース濃度およびアラビノース濃度を求めた。結果を図１３に示す。

【0093】

アクレモニウムセルラーゼによる遊離糖濃度の合計が７ｍｇ／ｍＬであるのに対して、本発明のＺ酵素は９ｍｇ／ｍＬと多く、本発明のＺ酵素が反応開始から２時間という短時間で草本系バイオマスを単糖に分解する能力に優れていることが示された。Ｚ酵素は特にキシロース、アラビノースへの分解が迅速である。また、Ｚ酵素とアクレモニウムセルラーゼを混合して用いることにより、Ｚ酵素やアクレモニウムセルラーゼをそれぞれ単独で用いた場合よりも、グルコースへの分解が迅速であることが示された。

【0094】

［実施例２３］
酵素反応時間を６日間とし、遠心分離後に得られた上清を水で３倍に希釈した後、さらにアセトニトリルを加えて２倍に希釈（最終的に６倍希釈）したこと以外は実施例１７と同様にして酵素反応を行い、試料中のグルコース濃度、キシロース濃度およびアラビノース濃度を求めた。結果を図１４に示す。

【0095】

［実施例２４〜２８、比較例２１］
酵素反応液中の酵素濃度を２ｍｇ／ｍＬとしたまま、Ｚ酵素濃度とアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）濃度を表７に記載の濃度としたこと以外は、実施例２３と同様にして酵素反応を行い、試料中のグルコース濃度、キシロース濃度およびアラビノース濃度を求めた。結果を図１４に示す。

【0096】

本発明のＺ酵素による遊離糖濃度の合計は５２ｍｇ／ｍＬで、アクレモニウムセルラーゼの４８ｍｇ／ｍＬより糖化率が高いことが示された。アクレモニウムセルラーゼと比べて、Ｚ酵素は特にキシロースへの糖化力が優れている。また、Ｚ酵素とアクレモニウムセルラーゼを混合して用いることにより、Ｚ酵素やアクレモニウムセルラーゼをそれぞれ単独で用いた場合よりも、稲わらの分解率を向上し得ることが示された。

【0097】

＜ヘミセルラーゼ活性の測定＞
［実施例２９］
Ａ酵素の代わりにＺ酵素を用い、反応温度を３０℃としたこと以外は実施例６と同様にして、Ｚ酵素のキシラナーゼ活性を求めた。また、Ａ酵素の代わりにＺ酵素を用い、反応温度を３０℃とし、ＰＮＰＧの代わりにｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰＸ）を用いたこと以外は実施例７と同様にして、Ｚ酵素のキシロシダーゼ活性を求めた。その結果、Ｚ酵素のキシラナーゼ活性は２０．３Ｕ／ｍｇ、キシロシダーゼ活性は５６．１Ｕ／ｍｇであった。

【0098】

［比較例２２］
Ｚ酵素の代わりにアクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）を用いて実施例２９と同様の実験を行い、酵素活性を求めたところ、アクレモニウムセルラーゼのキシラナーゼ活性は８．７Ｕ／ｍｇ、キシロシダーゼ活性は２．２Ｕ／ｍｇであった。

【0099】

［比較例２３］
Ｚ酵素の代わりにＣＴｅｃ２を用いて実施例２９と同様の実験を行い、酵素活性を求めたところ、ＣＴｅｃ２のキシラナーゼ活性は８．２Ｕ／ｍｇ、キシロシダーゼ活性は３３．０Ｕ／ｍｇであった。

【0100】

実施例２９および比較例２２、２３の結果から、本発明のＺ酵素は、アクレモニウムセルラーゼと比較してキシラナーゼ活性は２．３倍、キシロシダーゼ活性は２５．５倍と優れた酵素活性を示した。
また、本発明のＺ酵素はＣＴｅｃ２に対しても、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性のいずれもが優れていた。

【0101】

＜酵素活性の濃度依存性の確認＞
［実施例３０］
粉砕稲わら１ｇあたりＺ酵素を１０ｍｇ含む、表８の組成の反応溶液を調製し、４５℃にて４日間９００ｒｐｍで撹拌した。その後、溶液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を１００℃で５分間加熱処理してから０．２μｍ径のＨＰＬＣ前処理フィルター（アドバンテック社製、２５ＨＰ０２０ＡＮ）に通してＨＰＬＣ分析用試料とした。

【0102】

ＨＰＬＣの溶離液として、アセトニトリルと蒸留水を３：１の容積比で混合したものを０．５ｍＬ／分で流し、これに前記ＨＰＬＣ分析用試料を注入し、ＲＩ検出器（日本分光製ＲＩ−２０３１ Ｐｌｕｓ）を用いてグルコース、キシロースおよび全遊離糖を測定した。比較例１３で得られた遊離糖の量に基づいて完全糖化率に対する分解率を求めたところ、６３．０％であった。また、Ｚ酵素を５ｍｇ、２．５ｍｇとして同様の測定を行った。結果を図１５に黒菱形（◆）で示す。

【0103】

［比較例２４〜２６、実施例３１］
Ｚ酵素の代わりに、それぞれＣＴｅｃ（比較例２４）、ＣＴｅｃ２（比較例２５）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製セルラーゼ；比較例２６）またはＺ酵素とＣＴｅｃ２とをタンパク質量として１：１の割合で混合したもの；実施例３１）を用いたこと以外は実施例３０と同様にして測定を行った。図１５に、ＣＴｅｃの結果を黒四角（■）、ＣＴｅｃ２の結果を黒三角（▲）、ＧＣ２２０の結果を黒丸（●）、Ｚ酵素：ＣＴｅｃ２＝１：１の結果を（×）で示す。

【0104】

これらの結果から、本発明のＺ酵素が、市販のセルラーゼであるＣＴｅｃ、ＣＴｅｃ２およびＧＣ２２０より高い稲わら糖化率を示すこと、並びに、希釈をした場合でも、市販のセルラーゼよりも高い酵素活性を維持することが明らかである。また、１０ｍｇ酵素／ｇ稲わらの際の糖化率を１００％としたときの、２．５ｍｇ酵素／ｇ稲わらの糖化率は、ＣＴｅｃ２が約７４％であるのに対し、本発明のＺ酵素は約８６％であり、濃度希釈による酵素活性の低下が少なかった。特に、酵素濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＺ酵素とＣＴｅｃ２を１：１の割合で混合して使用した混合製剤の糖化率は５３．３％であり、ＣＴｅｃ２のみを用いた場合（３８．８％）の１．３８倍の糖化率を示した。
セルロース系バイオマスから１リットルのバイオエタノールを製造するときの酵素費用は約２５円とされており、高額な酵素費用がバイオエタノール製造の障壁となっているが、本発明のＺ酵素は低濃度であっても従来市販されているセルラーゼよりも高い酵素活性を示すことから、バイオエタノールの製造コスト低減に極めて有効である。

【0105】

＜粉砕小麦わらに対する糖化活性の測定＞
［比較例２７］
粉砕稲わらの代わりに、粉砕小麦わらを用いたこと以外は比較例１３と同様にして、粉砕小麦わらを硫酸で完全分解したときの、遊離糖の量と糖組成を測定した。

【0106】

［実施例３２］
粉砕稲わらの代わりに、粉砕小麦わらを用いたこと以外は実施例３０と同様にして、Ｚ酵素を粉砕小麦わらに作用させたときに発生する遊離糖の量を測定した。この結果、遊離糖の濃度は１４．８ｍｇ／Ｌであった。また、比較例２７で得られた遊離糖の測定値に基づいて、完全糖化率に対する分解率を求めたところ６９．３％であった。また、Ｚ酵素を５ｍｇ、２．５ｍｇとして同様の測定を行った。結果を図１６に黒菱形（◆）で示す。

【0107】

［比較例２８〜３０、実施例３３］
Ｚ酵素の代わりに、それぞれＣＴｅｃ（比較例２８）、ＣＴｅｃ２（比較例２９）、ＧＣ２２０（比較例３０）またはＺ酵素とＣＴｅｃ２とをタンパク質量として１：１の割合で混合したもの（実施例３３）を用いたこと以外は実施例３２と同様にして測定を行った。図１６に、ＣＴｅｃの結果を黒四角（■）、ＣＴｅｃ２の結果を黒三角（▲）、ＧＣ２２０の結果を黒丸（●）、Ｚ酵素：ＣＴｅｃ２＝１：１の結果を（×）で示す。

【0108】

これらの結果から、本発明のＺ酵素が、稲わらだけでなく小麦わらに対しても、市販のセルラーゼであるＣＴｅｃ、ＣＴｅｃ２およびＧＣ２２０より高い糖化活性を持つことが明らかである。本発明のＺ酵素は希釈をした場合でも、同様に市販のセルラーゼよりも高い糖化活性を示した。また、酵素濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＺ酵素とＣＴｅｃ２を１：１の割合で混合して使用した場合、完全糖化率に対する分解率は７５．４％であり、Ｚ酵素の約１．１倍、ＣＴｅｃ２の約１．３倍であった。
本発明のＺ酵素は、稲わらのみならず、全世界では稲わらよりも賦存量の多い小麦わらに対しても優れた糖化酵素活性を有することから、バイオ燃料の製造に極めて有用である。

【0109】

＜粉砕葦に対する糖化活性の測定＞
［比較例３１］
粉砕稲わらの代わりに、粉砕葦を用いたこと以外は比較例１３と同様にして、粉砕葦を硫酸で完全分解したときの、遊離糖の量と糖組成を測定した。

【0110】

［実施例３４］
粉砕稲わらの代わりに、粉砕葦を用いたこと以外は実施例３０と同様にして、粉砕葦１ｇに対して１０ｍｇのＺ酵素を作用させたときに発生する遊離糖（グルコース、キシロース、アラビノースおよびセロビオース）の量を測定した。結果を図１７に示す。また、比較例３１で得られた遊離糖の測定値に基づいて、完全糖化率に対する分解率を求めたところ、特にアラビノースへの変換率は２４．７％と高い値であった。

【0111】

［比較例３２〜３４、実施例３５］
Ｚ酵素の代わりに、それぞれＣＴｅｃ（比較例３２）、ＣＴｅｃ２（比較例３３）、ＧＣ２２０（比較例３４）またはＺ酵素とＣＴｅｃ２とをタンパク質量として１：１の割合で混合したもの（実施例３５）を用いたこと以外は実施例３４と同様にして測定を行った。結果を図１７に示す。

【0112】

これらの結果から、本発明のＺ酵素が、市販のセルラーゼと同程度の粉砕葦に対する糖化活性を持つことが明らかとなった。市販のセルラーゼがアラビノースへの糖化酵素活性を全く持たないのに対し、Ｚ酵素はアラビノースへの高い糖化酵素活性を示した。アラビノースへの変換率は、Ｚ酵素とＣＴｅｃ２を１：１の割合で混合して用いた実施例３５でも２１．０％と高いことから、バイオ燃料製造用の複合酵素群の一成分としても非常に有用である。

【0113】

＜粉砕イネ籾殻に対する糖化活性の測定＞
［実施例３６］
粉砕稲わらの代わりに、粉砕イネ籾殻を用いたこと以外は実施例３０と同様にして、粉砕イネ籾殻１ｇに対して１０ｍｇのＺ酵素を作用させたときに発生する遊離糖（グルコース、キシロース、アラビノースおよびセロビオース）の量を測定した。結果を図１８に示す。

【0114】

［比較例３５〜３７、実施例３７］
Ｚ酵素の代わりに、それぞれＣＴｅｃ（比較例３５）、ＣＴｅｃ２（比較例３６）、ＧＣ２２０（比較例３７）またはＺ酵素とＣＴｅｃ２とをタンパク質量として１：１の割合で混合したもの；実施例３７）を用いたこと以外は実施例３６と同様にして測定を行った。結果を図１８に示す。

【0115】

これらの結果から、本発明のＺ酵素が粉砕イネ籾殻に対し市販のセルラーゼと同程度の糖化活性を持ち、イネ籾殻からバイオ燃料を製造するにあたっても非常に有用な糖化酵素であることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0116】

本発明によれば、草本系バイオマスおよび木質系バイオマスを、迅速に効率よく、かつ安価に糖化することができる糸状菌が提供される。本発明の糸状菌を液体培養した場合、培地中にセルロース分解活性およびヘミセルロース分解活性を有する分泌物が蓄積するので、その液体培地から菌体を除去して得られる液体組成物を直接バイオマスの糖化に利用することができる。本発明の糸状菌が分泌するバイオマスの糖化酵素群は、従来公知の酵素よりも糖化活性が高く、さらに草本系バイオマスに対しては前処理することなく糖化でき、黒液等の廃棄物の発生もないため、バイオエタノールの製造に非常に有望である。

【受託番号】

【0117】

ＦＥＲＭ Ｐ−２２２２１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]