特許 6203372 サルシン及び他の関連する真菌リボトキシンに由来するリボトキシン分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203372

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】サルシン及び他の関連する真菌リボトキシンに由来するリボトキシン分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/38 20060101AFI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20170914BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20170914BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170914BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/38

   C12N15/00 AZNA

   C07K19/00

   C07K16/00

   A61K38/16

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61K47/68

【請求項の数】28

【全頁数】70

(21)【出願番号】特願2016-500564(P2016-500564)

(86)(22)【出願日】2014年3月3日

(65)【公表番号】特表2016-512251(P2016-512251A)

(43)【公表日】2016年4月25日

(86)【国際出願番号】US2014020035

(87)【国際公開番号】WO2014158770

(87)【国際公開日】20141002

【審査請求日】2017年3月2日

(31)【優先権主張番号】61/902,972

(32)【優先日】2013年11月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/783,589

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】512208040

【氏名又は名称】リサーチ コーポレーション テクノロジーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ゲールセン カート アール．

(72)【発明者】

【氏名】ジョーンズ ティモシー デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】カー フランシス ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ハーン アーロン

【審査官】 白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−２９２９６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２００２年，vol.277 no.21，pp.18632-18639

【文献】 BMC Biochemistry，２００９年，vol.10 no.9，pp.1-11，doi:10.1186/1471-2091-10-9

【文献】 第６９回日本生化学会大会、第１９回日本分子生物学会年会、合同年会講演要旨集，１９９６年，p.399, 3-P-0100

【文献】 FEMS Microbiol Rev，２００７年，vol.31，pp.212-237

【文献】 三共生命科学研究振興財団研究報告集，１９９８年，vol.12，pp.46-56

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型α−サルシンポリペプチドと比較して少なくとも１つの突然変異を含む修飾サルシンポリペプチドであって、前記少なくとも１つの突然変異が、前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｄ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の１又は複数にあり、かつ前記野生型α−サルシンポリペプチドの第１のＴ細胞エピトープ内にあり、及び／又は前記野生型α−サルシンポリペプチドの
アミノ酸Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数にあり、かつ前記野生型α−サルシンポリペプチドの第２のＴ細胞エピトープ内にあり、また前記第１のＴ細胞エピトープが配列番号６のアミノ酸配列からなり、前記第２のＴ細胞エピトープが配列番号４のアミノ酸配列からなり、さらに前記修飾サルシンポリペプチドがタンパク質合成を阻害するとともに、前記野生型α−サルシンポリペプチドと比較してＴ細胞応答の低減を引き起こし、タンパク質合成の阻害がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳アッセイ（ＩＶＴＴ）を使用して測定される、修飾サルシンポリペプチド。

【請求項2】

前記少なくとも１つの突然変異が前記第１のＴ細胞エピトープ内にあり、かつ前記野生型α−サルシンのアミノ酸Ｄ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の１又は複数にある、請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項3】

前記修飾サルシンポリペプチドが、タンパク質合成の阻害により測定されるように前記野生型α−サルシンよりも毒性があり、タンパク質合成がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳アッセイ（ＩＶＴＴ）を使用して測定される、請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項4】

前記少なくとも１つの突然変異が前記第２のＴ細胞エピトープ内にあり、該第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異が前記野生型α−サルシンのアミノ酸Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数にある、請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項5】

前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異が前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数にある、請求項４に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項6】

前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、又はＱ１４２Ｔである、請求項５に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項7】

少なくとも１つの第１の突然変異が前記第１のＴ細胞エピトープ内にあり、少なくとも１つの第２の突然変異が前記第２のＴ細胞エピトープ内にあり、前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異が前記野生型α−サルシンのアミノ酸Ｄ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の１又は複数にあり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異が前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数にある、請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項8】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異が前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｑ１０又はＮ１６の第１の突然変異を含み、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異が前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｋ１３９の第２の突然変異と、前記野生型α−サルシンポリペプチドのアミノ酸Ｑ１４２の第３の突然変異とを含む、請求項７に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項9】

請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチドと、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【請求項10】

標的分子に接合された又は融合された請求項１に記載の修飾サルシンポリペプチドを含む融合タンパク質。

【請求項11】

前記標的分子が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１０に記載の融合タ
ンパク質。

【請求項12】

配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型α−サルシンポリペプチドと比較して少なくとも１つの突然変異を含む修飾サルシンポリペプチドであって、前記少なくとも１つの突然変異が前記野生型α−サルシンポリペプチドの第１のＴ細胞エピトープ及び／又は第２のＴ細胞エピトープ内にあり、前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＤ９Ａ、Ｄ９Ｔ、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０Ａ、Ｐ１３Ｉ、Ｔ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、Ｔ１５Ｈ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、Ｙ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒの１又は複数であり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、Ｋ１３９Ｎ、Ｅ１４０Ｄ、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇの１又は複数であり、前記第１のＴ細胞エピトープが配列番号６のアミノ酸配列からなり、前記第２のＴ細胞エピトープが配列番号４のアミノ酸配列からなり、さらに前記修飾サルシンポリペプチドがタンパク質合成を阻害するとともに、少なくとも前記野生型α−サルシンポリペプチドと同程度に細胞毒性であり、且つ前記野生型α−サルシンポリペプチドと比較してＴ細胞応答の低減を引き起こす、修飾サルシンポリペプチド。

【請求項13】

前記少なくとも１つの突然変異が、前記第１のＴ細胞エピトープ内にあり、かつＤ９Ａ、Ｄ９Ｔ、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０Ａ、Ｐ１３Ｉ、Ｔ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、Ｔ１５Ｈ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、Ｙ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒの１又は複数である、請求項１２に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項14】

前記少なくとも１つの突然変異が、前記第２のＴ細胞エピトープ内にあり、かつＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、Ｋ１３９Ｎ、Ｅ１４０Ｄ、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇの１又は複数である、請求項１２に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項15】

前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、又はＱ１４２Ｔである、請求項１２に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項16】

少なくとも１つの第１の突然変異が前記第１のＴ細胞エピトープ内にあり、少なくとも１つの第２の突然変異が前記第２のＴ細胞エピトープ内にあり、前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異がＤ９Ａ、Ｄ９Ｔ、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０Ａ、Ｐ１３Ｉ、Ｔ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、Ｔ１５Ｈ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、Ｙ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒの１又は複数であり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異がＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、Ｋ１３９Ｎ、Ｅ１４０Ｄ、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇの１又は複数である、請求項１２に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項17】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異が、Ｑ１０Ｋ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒの１又は複数であり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異が、Ｋ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、又はＱ１４２Ｔの１又は複数である、請求項１６に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項18】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異がＱ１０Ｋ又はＮ１６Ｒであり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異が第２の突然変異と第３の突然変異とを含み、該第２の突然変異がＫ１３９Ｄ又はＫ１３９Ｅであり、該第３の突然変異がＱ１４２Ｔである、請求項１７に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項19】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＤ９Ｔ又はＰ１３Ｉであ
る、請求項１３に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項20】

前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの突然変異がＱ１４２Ｔである、請求項１４に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項21】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異がＤ９Ｔであり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異がＱ１４２Ｔである、請求項１６に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項22】

前記第１のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第１の突然変異がＰ１３Ｉであり、前記第２のＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つの第２の突然変異がＱ１４２Ｔである、請求項１６に記載の修飾サルシンポリペプチド。

【請求項23】

標的分子に接合された又は融合された請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の修飾サルシンポリペプチドを含む融合タンパク質。

【請求項24】

前記標的分子が抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２３に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

請求項１９に記載の修飾サルシンポリペプチドと薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【請求項26】

請求項２０に記載の修飾サルシンポリペプチドと薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【請求項27】

請求項２１に記載の修飾サルシンポリペプチドと薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【請求項28】

請求項２２に記載の修飾サルシンポリペプチドと薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サルシン及び他の関連する真菌リボトキシンに由来するリボトキシン分子に関する。

【背景技術】

【0002】

α−サルシンは、糸状菌であるアスペルギルス・ギガンテウム（Aspergillus giganteum）ＭＤＨ１８８９４の生成物として１９６５年に発見された最初のリボトキシンの一つである。或る特定の肉腫細胞株に対するその毒性により命名された。この毒性は、後に１９７０年代中ごろ、動物界全体で保存されるリボソームＲＮＡ（サルシン−リシンループ）の或る特定のセグメントの毒素による特異的な切断に起因すると特定された。上記毒素によるそのリボソームＲＮＡの切断は、細胞によるタンパク質産生を阻害する。上記毒素は毒性が高く、アポトーシス機構により細胞を殺傷する。

【0003】

α−サルシンは、１５０アミノ酸タンパク質である（非特許文献１）。α−サルシンの構造について多くが知られている。Ｔｙｒ４８、Ｈｉｓ５０、Ｇｌｕ９６、Ａｒｇ１２１、Ｈｉｓ１３７及びＬｅｕ１４５は、ＲＮＡｓｅ活性の活性部位に重要なアミノ酸である。５本鎖ベータシート及び単一のα−へリックスが上記分子の３Ｄ構造に重要である。上記タンパク質は２つのジスルフィド結合を含む。α−サルシンと関連する生物に由来する分子との間の大半の自然変異は、これらの構造的要素間のループ中にある。アミノ酸７〜２２の欠失は、タンパク質の高次構造に影響を及ぼさないようである。（しかしながら、膜相互作用には影響を及ぼす）。上記分子は高い等電点を伴って非常に高い負電荷を帯びる。アミノ酸１１６〜１３９は、細胞膜の通過等の細胞膜相互作用に関与する可能性がある。Ａｓｎ５４は、基質に対する結合ポケットに関与する可能性がある。Ａｒｇ１２１は、脂質膜との相互作用に重要な可能性がある。サルシンの免疫原性は十分に研究されていない。

【0004】

他の真菌リボトキシンは、α−サルシンと同じファミリーに属し、他のアスペルギルス種によって産生され、例えば、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンを含む。このファミリーのリボトキシンのメンバーは、一般に８５％超の高いアミノ酸同一性を共有し（非特許文献１）、同じ機構、すなわち、リボソームＲＮＡの保存されたサルシンリッチループ中のホスホジエステル結合を切断することにより、毒性を媒介する。クラビン及びギガンチンは１５０アミノ酸長であるのに対し、Ａ．レストリクタス（A. restrictus）から単離された同じポリペプチドの変異体であるレストリクトシン及びマイトギリンは１４９アミノ酸長である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Lacadena et al., 2007, FEMS Microbiol Rev 31, 212-237

【発明の概要】

【0006】

簡潔には、本開示は、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンを含む真菌リボトキシンの修飾リボトキシンエピトープ、例えば「修飾リボトキシンエピトープ」を特徴とする。いかなる理論又は機構にも束縛されることを意図するものではないが、本出願に開示される修飾リボトキシンエピトープは、対応する野生型リボトキシンエピトープと比較して、ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する減少した結合を有し、及び／又は減少したＴ細胞応答を誘発すると考えられる。

【0007】

或る一つの例示的な実施の形態では、上記修飾Ｔ細胞エピトープは、ＸＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号４４）（ここで、ＸはＱ又はＤＱである）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープの１又は複数のアミノ酸修飾を含む。別の例示的な実施の形態では、修飾Ｔ細胞エピトープは、ＩＩＡＨＴＫＥＮＱ（配列番号４）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープの１又は複数のアミノ酸修飾を含む。

【0008】

また、本開示は、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンを含む真菌リボトキシンの構造に基づく修飾分子、例えば、「修飾リボトキシン分子」を特徴とする。いかなる理論又は機構にも束縛されることを意図するものではないが、本発明の修飾リボトキシン分子は、野生型リボトキシンと比較して、ヒトに対して免疫原性が低いと考えられる。分子の有効性は、特に、その分子が治療又は予防の状況で使用される場合に望ましくない免疫応答によって制限される場合がある。したがって、或る特定の例では、分子の免疫原性を低減することが望ましい場合がある。

【0009】

或る一つの例示的な実施の形態では、修飾サルシンポリペプチドは野生型α−サルシンポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つの突然変異を含み、少なくとも１つの突然変異が野生型α−サルシンポリペプチドの第１のＴ細胞エピトープ及び／又は第２のＴ細胞エピトープ内にあり、第１のＴ細胞エピトープがアミノ酸配列ＸＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号４４）（ここで、ＸはＱ又はＤＱである）からなり、第２のＴ細胞エピトープがアミノ酸配列ＩＩＡＨＴＫＥＮＱ（配列番号４）からなる。

【0010】

また、本開示は、修飾リボトキシン分子（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシン）及び標的分子を含む融合タンパクを特徴とする。標的分子として、限定されないが、抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、ＶＨドメイン、改変されたＣＨ２ドメイン、ペプチド、サイトカイン、ホルモン、他のタンパク質スキャフォルド等を挙げることができる。上記融合タンパク質は、治療剤として使用されてもよい。例えば、或る実施の形態では、上記融合タンパクは、望ましくない病原体又は癌細胞を標的とする。そのため、或る特定の実施の形態は、疾患又は状態を治療又は管理するため修飾リボトキシン分子を含む融合タンパク質を使用する方法に関する。

【0011】

別の態様は、上記修飾リボトキシン分子（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシン）又はそれらを含む融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトに関する。上記核酸コンストラクトを、例えば、宿主細胞における上記核酸コンストラクトの発現、及び上記修飾リボトキシン分子又は融合タンパク質を単離することによって上記修飾リボトキシン分子又は融合タンパク質を産生する方法に使用することができる。

【0012】

本明細書に記載される特徴又は特徴の組合せはいずれも、任意のかかる組合せに含まれる特徴が、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかなように、相互に矛盾しない限り、本発明の範囲に含まれる。本発明の追加の利点及び態様は、以下の詳細な説明において明らかである。

【0013】

本発明の更なる理解を提供するため含まれ、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の態様を解説し、本発明の説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＲＣＴ０２研究コホート（ｎ＝５２）、並びに世界、欧州及び北米の集団において発現されるドナーアロタイプの頻度の比較を示す図である。

【図2】サルシン配列にかかる１２アミノ酸が重複する４６個の１５−ｍｅｒペプチド、並びにヌル突然変異体Ｅ９６Ｑ及びＨ１３７Ｑにかかる２セットの５ペプチドを試験するＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイの結果を示す図である。各エピトープを６つ組（sextuplicate）の培養で試験し、図２Ａにおいて非調整（全ての複製物）又は図２Ｂにおいて調整（異常値を除外）としてデータを表した。応答するドナーの数（ＳＩ＞２）が完全なデータセットプラス２×ＳＤ（両方のデータセットで６．６％）に対する平均応答よりも大きい場合にペプチドを陽性とした。

【図3】α−サルシン毒素及び単一アミノ酸変異体のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピングによって同定されたエピトープを示す。Ａ）エピトープ１（残基１０〜１８）及び（図３Ａは、それぞれ表示順に、配列番号５１及び配列番号５３、並びにそれらの対応する突然変異体配列を配列番号５２及び配列番号５４として、それぞれ開示する）Ｂ）エピトープ２（残基１３４〜１４２）（図３Ｂは、それぞれ表示順に、配列番号５５及び配列番号５７、並びにそれらの対応する突然変異体配列を配列番号５６及び配列番号５８として、それぞれ開示する）。

【図4】Ｂ−Ｐｅｒ抽出の後の可溶性（Ｓ）画分及び不溶性（Ｉ）画分の抗Ｈｉｓウェスタンブロットによるα−サルシン二重エピトープ変異体の発現の分析を示す図である。サイズマーカーは、予め染色されたタンパク質スタンダードＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓ（カタログ番号ＳＭ１８１１）である。

【図5】野生型α−サルシン、α−サルシンヌル突然変異体Ｈ１３７Ｑ、及び様々なα−サルシン二重変異体を含む可溶性抽出物を使用するＩＶＴＴアッセイの結果を示す図である。

【図6】野生型α−サルシン、α−サルシンヌル突然変異体（Ｈ１３７Ｑ）、及びα−サルシンの三重／四重変異体をコードするプラスミドを使用するＩＶＴＴアッセイの結果を示す図である。

【図7】α−サルシン三重変異体のタンパク質発現の分析を示す図である。図７Ａは、Ｂ−Ｐｅｒ抽出後の可溶性（Ｓ）画分及び不溶性（Ｉ）の画分の抗Ｈｉｓウェスタンブロットである。図７Ｂは、Ｈｉｓ精製変異体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。

【図8】野生型α−サルシン、α−サルシンヌル突然変異体（Ｈ１３７Ｑ）、及びα−サルシンの三重変異体の精製タンパク質を使用するＩＶＴＴアッセイの結果を示す図である。

【図9】野生型α−サルシン、α−サルシンヌル突然変異体（Ｈ１３７Ｑ）、及びα−サルシンの三重変異体を使用する細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞毒性アッセイの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１２日付で出願された米国仮特許出願第６１／９０２，９７２号、及び２０１３年３月１４日付で出願された米国仮特許出願第６１／７８３，５８９号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0016】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。２０１４年２月２７日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０１８５．０００１−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、４２４１３バイトのサイズである。

【0017】

定義
本発明の様々な実施形態の検討を容易にするため、以下の具体的な用語の説明を提供する。

【0018】

分子生物学、細胞生物学、及び免疫学における共通の用語の定義は、Kuby Immunology, Thomas J. Kindt, Richard A. Goldsby, Barbara Anne Osborne, Janis Kuby, published by W.H. Freeman, 2007 (ISBN 1429202114)、及びGenes IX, Benjamin Lewin, published by Jones & Bartlett Publishers, 2007 (ISBN-10: 0763740632)に見出され得る。

【0019】

抗体：免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１又は複数のポリペプチドを含むタンパク質（又は複合体）。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューの定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含み得る。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかとして分類され得る。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、それぞれ、順に免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのクラスを定義し得る。

【0020】

本明細書で使用される、「抗体」の用語は、インタクト免疫グロブリン、また同じくフラグメント（例えば、約１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する）を含む。抗体フラグメントは、（１）Ｆａｂ、パパイン酵素による抗体全体の消化によって産生されてインタクトの軽鎖及び１つの重鎖の一部を生じる、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント；（２）Ｆａｂ’、ペプシン酵素によって抗体全体を処理した後、還元してインタクトな軽鎖及び重鎖の一部を生じることによって得られる抗体分子のフラグメント；１つの抗体分子当たり２つのＦａｂ’フグメントが得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、その後の還元を行わずに抗体全体をペプシン酵素で処理することによって得られる抗体のフラグメント；（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合によって共に保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体；（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子改変されたフラグメント；並びに（６）ｓｃＦｖ、遺伝子融合された単鎖分子として好適なポリペプチドリンカーにより連結された、単鎖抗体、軽鎖の可変領域を含む遺伝子改変された分子、重鎖の可変領域、を含んでもよい。抗体フラグメントを作製する方法は通例となっている（例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999を参照されたい）。抗体フラグメントは上述の例に限定されない、例えば、抗体フラグメントはＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ等を含み得る。

【0021】

抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。モノクローナル抗体は、様々な方法、例えば、ファージディスプレイ及びヒト抗体ライブラリを含む方法から調製され得る。モノクローナル抗体産生に関する手順の例は、Longberg及びHuzar (Int Rev Immunol., 1995, 13:65-93)、Kellermann及びGreen (Curr Opin Biotechnol., 2002, 13:593-7）、並びにHarlow及びLane (Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999)に記載される。齧歯類ハイブリッドーマを調製する古典的な方法はKohler及びMilstein (Nature 256:495-97, 1975)において検討されている。

【0022】

ヒト化抗体等の標準的な「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域、及び非ヒト（例えば、マウス、ラット、合成等）免疫グロブリンに由来する１又は複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、ＣＤＲを供給するドナー抗体と同じ又は類似の抗原に結合する。上記分子は、遺伝子工学によって構築され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。

【0023】

抗原：抗体の産生又はＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、又は物質であり、注射される又は吸収される組成物を含む。抗原（Ａｇ）は、特異的な液性免疫又は細胞性免疫の生成物と反応する。或る実施形態では、抗原は、かかる相互作用が免疫応答を生じるか否かに関わらず、修飾サルシン分子及び／又はリボトキシン融合タンパク質（例えば、結合部分）の特異的な結合標的の場合もある。

【0024】

結合活性：多重結合形態へと編成され得るように、それ自体が多重結合であるか、又は細胞若しくはウイルスの表面に存在するかのいずれかである多価の標的抗原又は受容体に同時に結合し得る、二価又は多価の結合部位による結果としての（例えば、増加した）結合親和性。例えば、免疫グロブリンの２つのＦａｂアームは、いずれの部位も免疫グロブリンが解離するように非結合でなくてはならないことから、単一のＦａｂアームの結合と比較して、抗原に対してかかる結合活性の増加を提供することができる。

【0025】

結合親和性：結合部位とリガンドとの間（例えば、結合部分、例えば抗体と抗原又はエピトープとの間）の結合の強度。結合部位ＸのリガンドＹに対する親和性は、溶液中に存在するＸの結合部位の半分を占めるのに必要なＹの濃度である、解離定数（Ｋｄ）によって表される。より低い（Ｋｄ）は、より強い又はより高い親和性のＸとＹとの間の相互作用を示し、より低い濃度のリガンドがその部位を占めるのに必要とされる。一般に、結合親和性は、パラトープ（エピトープを認識する分子の部分）によって認識されるエピトープ中の１又は複数のアミノ酸の変更、修飾、及び／又は置換によって影響を受ける可能性がある。また、結合親和性は、パラトープ中の１又は複数のアミノ酸の変更、修飾及び／又は置換によって影響を受ける場合がある。結合親和性は、抗原を結合する抗体の親和性であってもよい。

【0026】

或る一つの例では、Ａｇ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいてエンドポイント滴定によって結合親和性を測定することができる。結合親和性は、修飾された／置換されたエピトープについて特異的な抗体のエンドポイント力価が、変更されていないエピトープと比較して、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍以上等異なる場合、抗体パラトープによって認識されるエピトープ中の１又は複数のアミノ酸の修飾及び／又は置換によって実質的に低下（又は測定可能な程度に減少）され得る。

【0027】

ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン分子：免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインに由来するポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）。別段の指示がない限り、免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭであってもよい。ＣＨ２又はＣＨ３分子は、構造化されていないアミノ酸配列のループによって接続されるいくつかの平行なβストランドで構成される。ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン分子は、完全な超可変ループ等の追加のアミノ酸配列（複数の場合がある）を更に含むことができる。或る実施形態では、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインは、その分子のループ領域に１又は複数の突然変異を含む。或る実施形態では、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインは、スキャフォルド領域中に（例えば、安定化等のため）１又は複数の突然変異を含む。ＣＨ２又はＣＨ３ドメインの「ループ領域」は、βシートの領域の間に位置するタンパク質の部分を指す（例えば、各ＣＨ２ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向けて７つのβシートＡ〜Ｇを含む）。ＣＨ２ドメインは６つのループ領域、すなわちループ１、ループ２、ループ３、ループＡ−Ｂ、ループＣ−Ｄ、及びループＥ−Ｆを含む。ループＡ−Ｂ、ループＣ−Ｄ、及びループＥ−Ｆは、βシートのＡとＢ、ＣとＤ、及びＥとＦの間にそれぞれ位置する。ループ１、ループ２、及びループ３は、βシートのＢとＣ、ＤとＥ、及びＦとＧの間にそれぞれ位置する。天然のＣＨ２ドメイン中のこれらのループは、構造ループと呼ばれることが多い。ＣＨ２ドメイン分子の非限定的な例は、国際公開第２００９／０９９９６１号に見ることができる。

【0028】

天然のＣＨ２ドメイン分子及びＣＨ３ドメイン分子は、サイズが小さく、通常１５ｋＤ未満である。改変されたＣＨ２ドメイン分子及びＣＨ３ドメイン分子は、ループ領域に挿入されたドナーループの長さ、いくつのドナーループが挿入されたか、別の分子（結合部分、エフェクタ分子、又は標識等）がＣＨ２又はＣＨ３ドメインに接合又は連結されたかどうかに応じてサイズが変化し得る。ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＤに由来してもよい。ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのＣＨ２ドメインに相同なＩｇＥ又はＩｇＭのＣＨ３ドメインに由来してもよい。

【0029】

ＣＨ２Ｄ：ＣＨ２ドメイン分子又はＣＨ３ドメイン分子。ＣＨ２ドメイン分子又はＣＨ３ドメイン分子は、その分子が抗原を特異的に結合するように改変されてもよい。抗原に結合するように改変されたＣＨ２ドメイン分子及びＣＨ３ドメイン分子は、Ｆｃ受容体結合を維持することができる既知の抗原特異的結合抗体ドメインに基づく分子のうち最も小さい。

【0030】

接触する：固体及び液体の形態の両方を含む、直接的な物理的関連の配置。

【0031】

変性ポリヌクレオチド：本明細書で使用される「変性ポリヌクレオチド」は、遺伝暗号における重複性の結果として変性される配列を含むタンパク質（例えば、修飾サルシン分子、融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドである。２０の天然アミノ酸が存在し、その大半は１より多いコドンによって特定されている。したがって、そのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質（例えば、修飾サルシン分子、融合タンパク質）のアミノ酸配列が変化されない限り、全ての変性ヌクレオチド配列が包含される。

【0032】

上記コドンは、選択された宿主生物において良好に発現されることが好ましい。変性種のコーディング核酸の使用は、異なる発現系において発現を最適化する場合がある（「コドン最適化」）。例えば、Ｅ．コリ（E. coli）発現系は或る１つのアミノ酸に対して１つのコドンを好むのに対し、ピキアタンパク質発現系はタンパク質のその位置の同じアミノ酸に対して異なるコドンを好む場合がある。

【0033】

ドメイン：残りのタンパク質から独立してその三次構造を維持するタンパク質構造。或る場合には、ドメインは、別々の機能特性を有し、機能を失わずに付加、除去又は別のタンパク質に輸送され得る。

【0034】

エフェクタ分子：分子又はキメラ分子が標的とされる細胞に対して所望の効果を有することが意図される分子又はキメラ分子の部分。エフェクタ分子は、エフェクタ部分（ＥＭ）、治療剤若しくは診断剤、又は類似の用語としても知られている。エフェクタ分子の例として、限定されないが、検出可能な標識、生物学的に活性なタンパク質、薬物、細胞毒素分子、又は毒素（細胞毒素分子）が挙げられる。

【0035】

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である分子上の特定の化学基、又は連続若しくは不連続なペプチド配列であり、すなわち、それらは特異的な免疫応答を誘発する。抗体は、抗体及び一致する（又は同族の）エピトープの三次元構造に基づいて特定の抗原性エピトープを結合する。

【0036】

発現：タンパク質への核酸配列の翻訳。タンパク質は発現され、細胞内に残り、細胞表面膜の構成要素となるか、又は細胞外基質若しくは培地中に分泌され得る。

【0037】

発現制御配列：制御可能に連結される異種の核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列が転写、必要に応じて核酸配列の翻訳を制御及び調節する場合に、発現制御配列は核酸配列に制御可能に連結される。そのため、発現制御配列は、タンパク質コーディング遺伝子の前に適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、遺伝子にｍＲＮＡの適切な転写を可能とする正確なリーディングフレームの維持、及び停止コドンを含むことができる。「制御配列」の用語は、少なくともその存在が発現に影響を与え得る構成要素を含むことが意図され、また、その存在が有利である追加の構成要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含んでもよい。発現制御配列はプロモーターを含んでもよい。

【0038】

プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ要素等の転写の開始部位に近い必要な核酸配列を含む。また、プロモーターは、転写開始部位から数千塩基対も遠くに位置し得る遠位のエンハンサー要素又はリプレッサー要素を含んでもよい。構成型プロモーター及び誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology 153:516-544を参照されたい）。

【0039】

また、細胞型特異的、組織特異的に制御可能なプロモーター依存性遺伝子発現を与えるのに十分な、又は外部シグナル若しくは物質によって誘導可能なプロモーター要素も含まれ、かかる要素は、遺伝子の５’領域又は３’領域に位置してもよい。構成型プロモーター及び誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology 153:516-544を参照されたい）。例えば、細菌系においてクローニングする場合、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等の誘導性プロモーターを使用してもよい。或る実施形態では、哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（メタロチオネインプロモーター等）又は哺乳動物ウイルス（レトロウイルスの長末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等）を使用することができる。また、組換えＤＮＡ又は合成技術によって産生されるプロモーターは、核酸配列の転写を提供するため使用され得る。

【0040】

ポリヌクレオチドは、挿入された宿主の遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターへと挿入され得る。発現ベクターは、典型的には複製起点、プロモーター、また、形質転換された細胞の表現型選択を可能とする特異的な核酸配列を含む。

【0041】

発現系：遺伝子産物、例えば、タンパク質を発現する系。発現系は、細胞系であってもよく、無細胞系であってもよい。発現系の例として、限定されないが、細菌系（例えば、Ｅ．コリ、Ｂ．サチリス（B. subtilis））、酵母系（例えば、ピキア、Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiae））、昆虫系、真核生物細胞系、ウイルス系（例えば、バキュロウイルス、ラムダ、レトロウイルス）等が挙げられる。

【0042】

Ｆｃ結合領域：ＣＨ２領域のＦｃＲｎ結合領域は、アミノ酸残基Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｖ２５９、Ｖ３０８、Ｈ３１０、Ｑ３１１（ＩｇＧのＫａｂａｔナンバリング）を含むことが知られている。これらのアミノ酸残基は、全長ＩｇＧ分子及び／又はＦｃフラグメントをＦｃＲｎとの相互作用に直接影響するＣＨ２ドメインの残基に配置する研究により同定されてきた。これらの一連の調査は、特に、（ａ）Ｆｃに結合したＦｃＲｎ複合体の結晶学の研究、（ｂ）様々なヒトアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）と互い、並びにＦｃＲｎ結合及び血漿半減期において相違を呈する他の種に由来するＩｇＧとを比較し、具体的なアミノ酸残基の相違に対して特性の変化を関連付けること、並びに（ｃ）突然変異分析、特に、ＦｃＲｎに対する増強された結合を示しながら、ＦｃＲｎ相互作用のｐＨ依存性を維持する突然変異の単離を解明してきた。これらの３つのアプローチは全て、ＦｃＲｎとの相互作用にＣＨ２領域の同じ領域が重要であることを強調する。また、ＩｇＧのＣＨ３ドメインは、ＦｃＲｎとの相互作用に貢献するが、Ｈ３１０のプロトン付加／脱プロトンは、上記相互作用のｐＨ依存性の主な原因であり、十分であると考えられている。本発明では、リボトキシン融合タンパク質は、融合タンパク質分子の半減期を増すため機能性ＦｃＲｎ結合部位（又は追加の結合部位）を有するＣＨ２ドメインを含んでもよい。

【0043】

異種性：異種性のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、異なる起源又は種に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。

【0044】

免疫応答：Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、又は多核球等の免疫系細胞の抗原等の刺激に対する応答。免疫応答は、宿主の防御応答に関与する身体の任意の細胞、例えば、インターフェロン又はサイトカインを分泌する上皮細胞を含み得る。免疫応答は、限定されないが、生得の免疫応答又は炎症を含む。

【0045】

免疫複合体：エフェクタ分子の標的分子への共有結合。エフェクタ分子は、検出可能な標識、生物学的に活性なタンパク質、薬物、細胞特性分子、又は毒素（細胞毒性分子）であってもよい。

【0046】

毒素の具体的で非限定的な例として、限定されないが、アブリン、リシン、緑膿菌外毒素（ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、及びＰＥ４０等のＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、低分子毒素、サポリン、レストリクトシン又はゲロニン、サルシン、リシン、それらのフラグメント又はそれらの修飾毒素が挙げられる。他の細胞毒素物質として、オーリスタチン、マイタンシノイド、及び細胞溶解性ペプチドが挙げられる。他の免疫複合体は、薬物分子（ＡＤＣ、すなわち「抗体薬物複合体」；Ducry and Stump, Bioconj Chem 21: 5-13, 2010；Erikson et al., Bioconj Chem 21: 84-92, 2010）に連結された結合タンパク質（例えば、結合部分を有する標的分子）で構成され得る。これらの毒素／免疫毒素は、直接又は間接に細胞成長を阻害するか、又は細胞を殺傷する。例えば、ＰＥ及びＤＴは典型的には肝毒性により死をもたらす非常に毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥ及びＤＴは、毒素の生来の標的成分（ＰＥのドメインＩａ、及びＤＴのＢ鎖等）を除去し、それを異なる標的部分と置き換えることにより免疫毒素としての用途の形態へと修飾され得る。或る実施形態では、本発明の修飾サルシン分子又は融合タンパク質は、エフェクタ分子（ＥＭ）につなげられる。抗体（又はそのフラグメント）に接合された薬物（例えば、細胞毒性物質）である抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、それらの複合体結合パートナーへと治療分子を送達する。エフェクタ分子は、低分子薬物、又はエリスロポエチン等の生物学的に活性なタンパク質であってもよい。或る実施形態では、エフェクタ分子は、ＶＨ又はＣＨ１ドメイン等の免疫グロブリンドメインであってもよい。或る実施形態では、エフェクタ分子につなげられた修飾サルシン分子又は融合タンパク質は、その半減期を増加するため、脂質又は他の分子、タンパク質若しくはペプチドに更につなげられてもよい。結合は、化学的手段又は組換え手段のいずれかであってもよい。「化学的手段」は、２つの分子の間に形成されて１つの分子を形成する共有結合が存在するような、修飾サルシン分子又は融合タンパク質とエフェクタ分子との間の反応を指す。ペプチドリンカー（短鎖ペプチド配列）が修飾サルシン分子又は融合タンパク質とエフェクタ分子との間に含まれてもよい。かかるリンカーは、所望の作用部位においてエフェクタ分子を放出するため内因性又は外因性のリンカーによるタンパク質加水分解に供され得る。免疫複合体は、本来は、抗体及びエフェクタ分子等の別々の機能性を有する２つの分子から調製されることから、免疫複合体は「キメラ分子」と呼ばれることもある。したがって、本明細書で使用される「キメラ分子」の用語は、エフェクタ分子に接合（カップリングされた）リガンド、抗体、又はそれらのフラグメント若しくはドメイン等の標的部分を指す。

【0047】

「接合すること」、「つなぐこと」、「結合すること」、又は「連結すること」の用語は、２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチド分子とすること、又は放射性ヌクレオチド又は他の分子をポリペプチドに共有結合により付着することを指す。具体的な内容において、上記用語は、或る実施形態では、抗体部分等のリガンドをエフェクタ分子（「ＥＭ」）につなぐことを指す場合がある。また、「接合すること」、「つなぐこと」、「結合すること」、又は「連結すること」の用語は、ペプチドを毒素（例えば、サルシン、修飾サルシン分子等）に付着することを指す。

【0048】

免疫原：適切な条件下で、動物における抗体産生又はＴ細胞応答等の免疫応答を刺激することができる化合物、組成物、又は物質であり、動物に注射又は吸収される組成物を含む。

【0049】

本明細書で使用される「免疫原性」の用語は、免疫応答を誘発する免疫原の能力である。免疫応答は、液性応答であってもよく、細胞応答であってもよい。免疫応答は、Ｔ細胞応答であることが好ましい。免疫応答の活性化を測定することは、当該技術分野でよく知られている幾つかの方法によって行われ得る。

【0050】

本明細書で使用される「減少した免疫原性」の用語は、修飾リボトキシン又は修飾リボトキシン融合タンパク質が対応する非修飾リボトキシン又は非修飾リボトキシン融合タンパク質よりも免疫原性が少ないことを意味する。修飾リボトキシン又は修飾リボトキシン融合タンパク質は、対応する非修飾リボトキシン又は非修飾リボトキシン融合タンパク質と比較して減少したＴ細胞応答を誘発することが好ましい。

【0051】

本明細書で使用される「減少したＴ細胞応答」の用語は、修飾リボトキシン又は修飾リボトキシン融合タンパク質が、対応する非修飾リボトキシン又は非修飾リボトキシン融合タンパク質よりも、ＣＤ８＋枯渇ヒト末梢血単核細胞を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖（^３｛Ｈ｝−チミジン取り込み）アッセイによって測定されるより少ないＴ細胞活性化を誘導することを意味する。或る一つの実施形態では、修飾リボトキシン又は修飾リボトキシン融合タンパク質の刺激指数（ＳＩ）は２．０未満、より好ましくは１．５未満である。本明細書で使用される「刺激指数」の用語は、修飾リボトキシン又は修飾リボトキシン融合タンパク質のＴ細胞を活性化する能力を指す。ＳＩは、従来通り１試験試料当たりの平均ｃｐｍ／１対照試料（試験ペプチドを全く含まない）当たりの平均ｃｐｍとして提供される。

【0052】

単離された：それから、他の染色体又は染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ並びに他の抗体を含むタンパク質等の上記成分が天然に生じる（例えば、細胞の他の生体成分）他の生体成分から実質的に分離され精製された「単離された」生体成分（核酸分子又はタンパク質等）。「単離された」核酸及びタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された抗体」は、その抗原特異性が維持されるように他のタンパク質又は生体成分から実質的に分離されるか、又は精製された抗体である。また、上記用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸及びタンパク質、また同じく化学的に合成された核酸若しくはタンパク質、又はそれらのフラグメントを包含する。

【0053】

標識：直接又は間接に別の分子（例えば、修飾サルシン分子、標的分子、リボトキシン融合タンパク質等）に接合されてその分子の検出を容易にする検出可能な化合物又は組成物。標識の具体的で非限定的な例として、蛍光タグ、酵素結合、及び放射性同位体が挙げられる。SARCIN TO RIBOTOXIN?

【0054】

リガンド接触残基（Ligand contact residue）又は特異性決定残基（ＳＤＲ）：リガンド又は抗原との接触に参加する分子内のアミノ酸残基。リガンド接触残基は、特異性決定残基（ＳＤＲ）としても知られている。

【0055】

リンカー：共有結合又は非常に密接な非共有結合、すなわち、特に、グリシン、セリン、プロリン、アラニンに富む様々なアミノ酸配列、若しくは免疫グロブリンドメインを接続する天然の結合アミノ酸配列の変異体の化学接合又は直接遺伝子融合、及び／又は例えば、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、分離したＰＥＧ（ｄＰＥＧ）を含む糖。典型的な長さは、２〜２０以上のアミノ酸の範囲であってもよいが、本発明はこれらの長さ（例えば、リンカーは１〜２０アミノ酸のペプチドであってもよい）に限定されない。最適な長さは、具体的な標的抗原（複数の場合がある）のスペーシング及び方向と一致するように変化して、エントロピーを最小化するが、複数の抗原の効果的な結合を可能とし得る。

【0056】

修飾：タンパク質の配列、構造等に対する変化、又は核酸配列等に対する変化。本明細書で使用される「修飾された（修飾した）」又は「修飾」の用語は、１又は複数の突然変異、欠失、置換、物理的変更（例えば、架橋修飾、構成成分の共有結合、翻訳後修飾、例えば、アセチル化、グリコシル化等、又はそれらの組合せ）等、又はそれらの組合せを含み得る。修飾、例えば、突然変異は、無作為の修飾（例えば、ランダム変異誘発）に限定されず、合理的設計も含む。

【0057】

多量体化ドメイン：タンパク質内の多くのドメインが非常に密接な非共有結合二量体、又は他のタンパク質ドメイン（複数の場合がある）との会合による多量体を形成することが知られている。最も小さい例の幾つかは、いわゆるロイシンジッパーモチーフであり、自己会合してホモ二量体（例えば、ＧＣＮ４）を形成し得る７アミノ酸繰返しを含む小型のドメインであるか、代替的には、ロイシンジッパーモチーフは優先的に別のロイシンジッパーと会合してヘテロ二量体（例えば、ｍｙｃ／ｍａｘ二量体）、又はより複雑な四量体を形成し得るいずれかである（Chem Biol. 2008 Sep 22;15(9):908-19. A heterospecific leucine zipper tetramer. Deng Y, Liu J, Zheng Q, Li Q, Kallenbach NR, Lu M.）。７アミノ酸繰返しにおいてロイシンに代えてイソロイシンを有する密接に関係するドメインは、三量体「コイルドコイル」の集合（例えば、ＨＩＶ ｇｐ４１）を形成する。二量体の７アミノ酸繰返しにおけるイソロイシンのロイシンへの置換は、有利な構造を三量体に変更し得る。小さいドメインは製造に有利であり、全タンパク質分子に対して小さいサイズを維持するが、より大きなドメインは多量体形成に有用な場合がある。非共有結合多量体を形成する任意のドメインが採用され得る。例えば、ＩｇＧのＣＨ３ドメインはホモ二量体を形成するのに対し、ＩｇＧのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインはヘテロ二量体を形成する。

【0058】

核酸：ホスホジエステル結合を介して、関連する天然の構造変異体、及びその合成非天然類縁体に連結されるヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然の構造変異体、及びその合成非天然類縁体）で構成されるポリマー。そのため、上記用語は、ヌクレオチド及びそれらの間の結合が非天然合成類縁体、例えば、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）等を含むヌクレオチドポリマーを含む。かかるポリヌクレオチドを、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を使用して合成することができる。「オリゴヌクレオチド」の用語は、典型的には、一般的には約５０ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表される場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」に置き換わる相補的なＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むと理解される。

【0059】

ヌクレオチド配列を説明するため、本明細書において従来の表記法、すなわち、１本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端を５’末端とし、２本鎖ヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と呼ぶ表記法を使用する。新生ＲＮＡ転写産物へのヌクレオチドの５’から３’方向の付加は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と呼ばれ、そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列であって、ＲＮＡ転写産物の５’から５’末端に位置する配列を有するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列であって、コーディングＲＮＡ転写産物の３’から３’末端である配列は「下流配列」と呼ばれる。

【0060】

ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに対して相補的又は同一である１本鎖又は２本鎖のいずれかの形態のＤＮＡを指す。「コードしている」は、他のポリマー及び規定されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は規定されたアミノ酸の配列及びそれから生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的なプロセスにおける巨大分子の合成用のテンプレートの役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド中のヌクレオチドの具体的な配列の生得的な特性を指す。そのため、遺伝子は、その遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物系においてタンパク質を産生する場合、そのタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコーディング鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写用のテンプレートとして使用される非コーディング鎖の両方が、タンパク質又はその遺伝子若しくはｃＤＮＡの他の生成物をコードするとされる場合がある。別段の明示がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに変性種であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチオ配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含む場合がある。

【0061】

組換え核酸は、本来結合していないヌクレオチド配列を有する核酸を指し、そうでなければ分離された配列の２つのセグメントを人工的に合わせることによって作製され得る。この人工的な結合は、化学合成、又はより一般的には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学の技術によって完成されることが多い。組換え核酸は、好適な宿主細胞を形質転換又は形質移入するために使用することができる増幅した又は会合した核酸を含む核酸ベクターを含む。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子は、その後、組換え宿主細胞において発現されて「組換えポリペプチド」を産生する。また、組換え核酸は、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）の役目をする場合がある。

【0062】

制御可能に連結された；第１の核酸配列は、その第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で配置される場合に、第２の核酸配列に制御可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、コーディング配列に制御可能に連結される。一般に、制御可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コーディング領域を結びつける必要がある場合、同じリーディングフレーム内に存在する。

【0063】

薬学的に許容可能なビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容可能な担体（ビヒクル）は、従来のものであってもよいが、従来のビヒクルに限定されない。例えば、E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)、及びD. B. Troy, ed. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD and Philadelphia, PA, 21^st Edition (2006)は、１又は複数の抗体等の１又は複数の治療用化合物又は分子と、追加の薬剤との薬学的な送達に適した組成物及び製剤を記載する。

【0064】

一般に、担体の性質は、採用される投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理学的食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等のビヒクルとしての薬学的及び生理学的に許容可能な流体を含む、注射用の流体を含む。非限定的な例として、注射用トラスツズマブに対する製剤は、注射前に滅菌水で再構成される、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジン、トレハロース二水和物、及びポリソルベート２０を乾燥粉末としてガラス容器中に含む。非経口又は皮下の用途のための抗体及びタンパク質の他の製剤は当該技術分野でよく知られている。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、又はカプセルの形態）に対しては、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中立な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及び、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート等のｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性の助剤物質を含有してもよい。

【0065】

ポリペプチド：単量体がアミド結合によってつながったアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。本明細書で使用される「ポリペプチド」又は「タンパク質」の用語は、任意のアミノ酸配列を包含することが意図され、糖タンパク質等の修飾配列を含む。「ポリペプチド」の用語は、その内容に応じて天然タンパク質、また同じく組換えにより又は合成により生成されたタンパク質を含んでもよい。「残基」又は「アミノ酸残基」の用語は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに組み込まれるアミノ酸に対する参照を含む。

【0066】

「保存的」アミノ酸置換は、ポリペプチドの活性又は抗原性に実質的に影響しないか又はそれらを減少しない置換である。例えば、ポリペプチドは、最大で約１、最大で約２、最大で約５、最大で約１０、又は最大で約１５の保存的置換を有することができ、元のポリペプチドに結合する抗体を特異的に結合することができる。また、保存的変化の用語は、置換したポリペプチドへと産生された抗体もまた非置換のポリペプチドと免疫反応する限り、非置換の親アミノ酸に代えて置換したアミノ酸の使用を含む。保存的置換の例としては、（ｉ）Ａｌａ−Ｓｅｒ；（ｉｉ）Ａｒｇ−Ｌｙｓ；（ｉｉｉ）Ａｓｎ−Ｇｉｎ又はＨｉｓ；（ｉｖ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ；（ｖ）Ｃｙｓ−Ｓｅｒ；（ｖｉ）Ｇｉｎ−Ａｓｎ；（ｖｉｉ）Ｇｌｕ−Ａｓｐ；（ｖｉｉｉ）Ｈｉｓ−Ａｓｎ又はＧｌｎ；（ｉｘ）Ｉｌｅ−Ｌｅｕ又はＶａｌ；（ｘ）Ｌｅｕ−Ｉｌｅ又はＶａｌ；（ｘｉ）Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕ；（ｘｉｉ）Ｍｅｔ−Ｌｅｕ又はＩｌｅ；（ｘｉｉｉ）Ｐｈｅ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒ；（ｘｉｖ）Ｓｅｒ−Ｔｈｒ；（ｘｖ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ；（ｘｖｉ）Ｔｒｐ−Ｔｙｒ；（ｘｖｉｉ）Ｔｙｒ−Ｔｒｐ又はＰｈｅ；（ｘｖｉｉｉ）Ｖａｌ−Ｉｌｅ又はＬｅｕが挙げられる。

【0067】

保存的置換は、一般的に、（ａ）置換の範囲におけるポリペプチド骨格、例えばシート又はヘリックスの立体配置としての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性及び／又は（ｃ）側鎖の大きさを維持する。一般にタンパク質特性において最も大きな変化をもたらすと予想される置換は非保存的であり、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリン若しくはスレオニンを疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、若しくはアラニンに（又はそれによって）置換する、（ｂ）システイン若しくはプロリンを任意の他の残基に（又はそれによって）置換する、（ｃ）正電荷を持つ側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン、若しくはヒスチジンを、負電荷を持つ残基、例えば、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸に（又はそれによって）置換する、又は（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンを、側鎖を有しないもの、例えば、グリシンに（又はそれによって）置換する、変化である。

【0068】

疾患を予防すること、治療すること、管理すること又は改善すること：疾患を「予防すること」は、疾患の全面的な発症を阻害することを指す。「治療すること」は、疾患が発症し始めた後に疾患の兆候若しくは症状、又は病理学的状態を改善する治療的介入を指す。「管理すること」は、疾患の兆候又は症状を悪化させない治療的介入を指す。「改善すること」は、疾患の兆候又は症状の数又は重症度の減少を指す。

【0069】

プローブ及びプライマー：プローブは、検出可能な標識又はレポーター分子に付着した単離された核酸を含む。プライマーは短い核酸であり、例えば、１５ヌクレオチド長以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、その後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野で既知の他の核酸増幅方法によって核酸配列の増幅に使用され得る。当業者は、特定のプローブ又はプライマーの特異性はその長さに伴って増加することを理解するであろう。そのため、例えば、２０の連続するヌクレオチドを含むプライマーは、わずか１５ヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニールする。よって、より大きな特異性を得るため、プローブ及びプライマーは、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上の連続するヌクレオチドを含むものを選択してもよい。

【0070】

精製された（精製した）：精製された（精製した）の用語は絶対的な純粋さを必要とするものではなく、むしろ相対的な用語として意図される。そのため、例えば、精製した分子は、分子がその天然の状態と比較して、例えば、細胞抽出物又は生体液内のその純度と比較して測定可能な程度まで精製される、天然に関連するタンパク質及び他の汚染物質から全体又は一部が単離されるものである。

【0071】

「精製された（精製した）」の用語は、類縁体若しくは模倣物、又は他の生物学的に活性な化合物としてのかかる所望の生成物を含み、他の化合物の付着を可能とするため、及び／又は治療的処置又は診断手順において有用な製剤に対して提供するため、追加の化合物又は部分がその分子に結合される。

【0072】

一般的に、実質的に精製された分子は、治療用投与のための完全な医薬製剤において各化合物と追加の原料との混合又は製剤化の前に、調製物中に全ての巨大分子種の８０％超を含む。追加の原料は、薬学的な担体、賦形剤、緩衝液、吸収促進剤、安定化剤、保存剤、アジュバント又は他のそのような共同原料（co-ingredients）を含んでもよい。より典型的には、上記分子は、他の製剤原料と混合する前に精製された調製物中に存在する全ての巨大分子種の９０％超、しばしば９５％超となるように精製される。他の場合では、精製された調製物は、本質的に均質であり、他の巨大分子種は１％未満である。

【0073】

組換えタンパク質：組換え核酸に関しては上記の「組換え核酸」を参照されたい。組換えタンパク質又はポリペプチドは、天然ではない配列を有するか、又はそうでなければ分離された配列の２つのセグメントの人工的な結合によって作製された配列を有するものである。この人工的な結合は、化学合成、又はより一般的には、核酸の単離されたセグメントの人工操作によって、例えば、遺伝子工学の技術によってなされることが多い。組換えタンパク質は、異種性のタンパク質の合成を指示する遺伝要素によって形質導入された、形質移入された、又は形質転換された細胞において作製され得る。また、組換えタンパク質は、無細胞系においても作製され得る。特に有用な宿主細胞として、ＣＨＯ及びＨＥＫ ２９３等の哺乳動物細胞、昆虫細胞、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）若しくはサッカロミセス等の酵母、又はＥ．コリ若しくはシュードモナス等の細菌細胞が挙げられる。

【0074】

試料：全体を代表する部分、一片又は区分。この用語は、例えば、被験体から得られた試料を含む任意の材料を包含する。

【0075】

「生体試料」は、限定されないが、細胞、組織、及び体液を含む被験体から得られる試料である。体液として、例えば、唾液、痰、脳脊髄液、尿、血液、並びに血清及びリンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びそれらのサブフラクション等）を含む血液の派生物及び画分が挙げられる。組織として、例えば、非固定、凍結、ホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋された組織を含む、生検、剖検によるもの、及び病理標本、また同じく生検された又は外科的に摘除された組織が挙げられる。

【0076】

或る実施形態では、血液又は血清等の生体試料は、被験体から得られる。生体試料は、典型的にはラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギ又は霊長類等の哺乳動物から得られる。或る実施形態では、霊長類は、マカク、チンパンジー、又はヒトである。

【0077】

スキャフォルド：他のドメイン、ループ、突然変異等の導入に使用されることが多いプラットフォーム分子。例として、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインスキャフォルドは、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインに対して抗原結合を与えるためドナーループ及び／又は突然変異（ループ領域等への）を導入するため使用され得るＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインである。或る実施形態では、スキャフォルドは、本来の分子と比べて増加した安定性を呈するように変更されてもよい。例えば、スキャフォルドにシステイン残基対を導入するため突然変異を行って、１又は複数の非天然ジスルフィド結合の形成を可能としてもよい。スキャフォルドはこれらの定義に限定されない。別の例では、スキャフォルドは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、セントリン、アフィボディ、DARPINS、環状ペプチド、ナノ抗体（ラマ由来のＶＨＨドメイン）、シャークドメイン（shark domains）等であってもよい。

【0078】

配列同一性：ヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表現され、別名で配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセント同一性（又は類似性若しくは相同性）に関してしばしば測定され、その割合が高くなると２つの配列はより類似している。ホモログ又は変異体は、標準的な方法を使用して整列した場合に全体又は特定の領域で比較的高い程度の配列同一性を持つ。

【0079】

比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野でよく知られている。様々なプログラム及びアラインメトアルゴリズムがSmith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, Journal of Molecular Biol. 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene 73:237-244, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988；及びPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genetics 6:119-129, 1994に記載されている。

【0080】

NCBI Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ（商標））（Altschul et al., Journal of MoIecular Biology 215:403-410, 1990.）は、配列分析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用に対し、National Center for Biotechnology Information（メリーランド州ベセスダのＮＣＢＩ）を含む幾つかの供給元より、及びインターネット上で利用可能である。

【0081】

特異的結合物質：実質的に規定の標的にのみ結合する物質。そのため、抗原特異的結合物質は、抗原性のポリペプチド又はその抗原性のフラグメントに実質的に結合する物質である。或る一つの実施形態では、特異的結合物質は、抗原性のポリペプチド若しくはその抗原性のフラグメントに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナルの抗体、又はペプチド若しくはスキャフォルド分子である。

【0082】

「特異的に結合する」の用語は、非標的（例えば、検出可能な量のその標的を欠く細胞又は組織）ではなく、標的（例えば、その結合物質の標的を有する細胞又は組織）と結合物質又は標的部分（ホルモン、ペプチド、ペプチドフラグメント、ドメイン、サイトカイン、他のリガンド及び受容体、スキャフォルド等）の全体又は一部における選択的会合を指す。もちろん、ある程度の非特異的な相互作用は分子と非標的細胞又は組織との間で生じ得ると認識されている。それにも関わらず、特異的結合は、抗原の特異的な認識によって媒介されて区別され得る。特定のタンパク質と特異的反応性の分子の選択に対して、様々な免疫アッセイフォーマットがふさわしい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが日常的に使用される。

【0083】

被験体：ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む部類の脊椎動物を含む、多細胞の生体。

【0084】

治療剤は、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸又はその誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、糖、低分子、組換えウイルス等のような化合物を含む。核酸治療部分及び診断部分として、アンチセンス核酸、一本鎖又は二重鎖のＤＮＡとの共有結合架橋のための誘導オリゴヌクレオチド、及びトリプレックス形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。代替的には、標的部分に連結された分子は、薬物、核酸（アンチセンス核酸等）、又は循環系への直接暴露から保護することができる別の治療用部分等の治療用組成物を含有するリポソーム又はミセル等の封入系であってもよい。抗体に付着したリポソームを調製する手段は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、及びConnor et al. 1985, Pharm. Ther. 28:341-365を参照されたい。診断剤又は診断部分は、放射性同位体及び他の検出可能な標識を含む。かかる目的に有用な検出可能な標識は当該技術分野でよく知られており、Ｔｃ^９９ｍ、Ｉｎ^１１１、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、及び^１３１Ｉ等の放射性同位体、フルオロフォア、化学発光剤、及び酵素が挙げられる。

【0085】

治療的有効量：その薬剤によって治療されている被験体において所望の効果を達成するのに十分な指定の薬剤の量。かかる薬剤は、本明細書に記載される修飾リボトキシン分子（例えば、修飾したサルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン分子）及び融合タンパク質を含む。例えば、これは、癌等の疾患又は状態の予防、治療、又は改善に有用な修飾サルシン分子を含む融合タンパク質の量であってもよい。理想的には、修飾リボトキシン分子（例えば、修飾したサルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン分子）又は融合タンパク質の治療的有効量は、被験体において実質的な細胞毒性効果を引き起こさずに被験体において状態又は疾患を予防、治療、又は改善するのに十分な量である。被験体を予防、改善、及び／又は治療するのに有用な治療的有効量の薬剤は、治療される被験体、病気の種類及び重症度、並びに治療用組成物の投与方式に依存する。

【0086】

毒素：免疫複合体を参照されたい。

【0087】

形質導入された（形質導入した）：形質導入された（形質導入した）細胞は、分子生物学の技術によってそこに核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される形質導入の用語は、ウイルスベクターによる形質移入、プラスミドベクターによる形質転換、及び電子穿孔法によるネイキッドＤＮＡの導入、リポフェクション、及びパーティクルガン加速を含む、それによってかかる細胞へと核酸分子を導入し得る全ての技術を包含する。かかる細胞は形質転換細胞と呼ばれることがある。

【0088】

ベクター：宿主細胞に導入され、それにより形質転換宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、宿主細胞においてその複製を可能とする複製起点等の核酸配列を含んでもよい。また、ベクターは、１又は複数の選択可能なマーカー遺伝子及び当該技術で知られている他の遺伝要素を含んでもよい。

【0089】

詳細な説明
本開示は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を提供し、ここで、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシン（例えば、野生型のα−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）と比較してより免疫原性が少ないか、非免疫原性である。野生型リボトキシン（例えば、野生型のα−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を修飾して「修飾リボトキシン分子」を作製し、ここで、野生型リボトキシン分子の修飾は、その免疫原性を減少する、例えば、（以下に記載されるように）Ｔ細胞エピトープの数を減少するか、又は排除する。本明細書で使用される「修飾された（修飾した）」の用語は、１又は複数の突然変異、欠失、付加、置換、切断、物理的変更（例えば、架橋修飾、構成要素の共有結合、翻訳後修飾、例えば、アセチル化、グリコシル化）等を含んでもよい。

【0090】

Ｔ細胞エピトープ
免疫系の抗原提示細胞がタンパク質を取り込む場合、タンパク質はペプチドへとタンパク質分解性消化に供され（「プロセスされ（processed）」）、その一部はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してＴ細胞に対して抗原提示細胞の表面上に提示される。ＭＨＣクラスＩＩに対するペプチドの結合は、ペプチドのアミノ酸側鎖とＭＨＣ溝内の特異的結合「ポケット」、例えば、３４のヒトＭＨＣクラスＩＩアレルの自由（open-ended）結合溝内の位置ｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７、及びｐ９のポケットとの相互作用に起因すると考えられる。クラスＩＩＭＨＣ分子のｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７、及びｐ９のポケット位置と相互作用するペプチドのアミノ酸は、アンカー残基（例えば、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ９クラスＩＩＭＨＣアンカー残基）と呼ばれる。

【0091】

かかる提示されたペプチドがＣＤ４＋（ヘルパー）Ｔ細胞を活性化する状況では、これらのペプチドはＣＤ4＋Ｔ細胞エピトープと規定され、これは、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩとの複合体がＴ細胞受容体によって結合される場合に生じ、同時刺激シグナルと併せて、Ｔ細胞活性化をもたらす。そのような場合、これらのペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子内の溝内で結合し、ＭＨＣクラスＩＩにおけるアロタイプ変異はかかるタンパク質の結合に影響を与える場合があり、或る場合では少数のアロタイプへの結合を限定し得る（「アロタイプ制限された」）。他の場合では、ペプチドは種々のＭＨＣアロタイプに幅広く結合することができ、かかる非制限結合は「乱交雑（promiscuous）」又は「変性」結合と呼ばれる。

【0092】

修飾サルシン分子
表１は、野生型α−サルシン（配列番号１）に対応する配列を示す。本発明の修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン、例えば、野生型α−サルシン又は野生型α−サルシンのフラグメントに由来する。

【0093】

【表1】

【0094】

２０１３年３月１５日付で出願された米国仮出願第６１／７８３，５８９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）は、可能性のあるＴ細胞エピトープを同定するための野生型α−サルシンタンパク質のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を記載する。簡潔には、野生型α−サルシン配列に由来する全ての重複する９ｍｅｒペプチドを３４のヒトＭＨＣクラスＩＩＤＲアロタイプのデータベースに通し、各々のＭＨＣクラスＩＩ分子との一致及び相互作用に基づいて個別に採点した。

【0095】

この研究による結果は、野生型αサルシンが、残基２４（Ｌ／ロイシン）にｐ１アンカーを有する単一の乱交雑な高親和性ＭＨＣ結合ペプチド、並びに残基１２２（Ｖ／バリン）及び残基１３４（Ｉ／イソロイシン）にｐ１アンカーを有する２つの乱交雑な中程度の親和性ＭＨＣ結合ペプチドを含む、少なくとも３つの可能性のあるＴ細胞エピトープを含むことを示唆する（表２を参照されたい）。他の可能性のある低い〜非常に低い免疫原性のＴ細胞エピトープも同定された。

【0096】

【表2】

【0097】

野生型α−サルシンをＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（イギリス、ケンブリッジ）免疫原性アッセイによって更に分析し、野生型α−サルシン内のＴ細胞エピトープの存在及び可能性を同定した。簡潔には、１２アミノ酸によって重複し、野生型α−サルシンにかかる４６の１５ｍｅｒペプチドを、集団においてＨＬＡ−ＤＲアレルの広がりを最もよく代表するように選択された５０の健康なＰＢＭＣドナーに対する増殖について試験した。この分析から、表３に示されるように、野生型α−サルシン内に２つのＴ細胞エピトープが同定された。

【0098】

【表3】

【0099】

サルシンエピトープ１は、膜及び相互作用、並びにリボソームへのα−サルシンの結合に関与するＮ末端２２アミノ酸領域内の野生型α−サルシンのアミノ酸残基１０〜１８に対応する。サルシンエピトープ１は、Ｎ末端すぐ隣のアミノ酸（Ｐ−１アンカー残基）を含んでもよく、そのため、野生型α−サルシンのアミノ酸９〜１８に対応するアミノ酸配列ＤＱＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号６）を含んでもよい。

【0100】

サルシンエピトープ１は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合を減少するか、又は排除するように修飾され得る。或る１つの実施形態では、修飾サルシンエピトープ１は、サルシンエピトープ１の１又は複数のＰ−１、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、又はＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基において１又は複数の突然変異を有し、ここで、Ｐ−１アンカー残基は、野生型α−サルシンにおいてサルシンエピトープ１のすぐＮ末端のアミノ酸（Ｄ）に対応する。別の実施形態では、修飾サルシンエピトープ１は、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ−１の残基Ｄ９においてＤ９Ｔ若しくはＤ９Ａ、Ｐ１アンカーの残基Ｑ１０において、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、若しくはＱ１０Ａ、Ｐ４アンカーの残基Ｐ１３においてＰ１３Ｉ、Ｐ６アンカーの残基Ｔ１５においてＴ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、若しくはＴ１５Ｈ、Ｐ７アンカー残基のＮ１６においてＮ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｙ１８においてＹ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、若しくはＹ１８Ｒを有する。言い換えれば、修飾サルシンエピトープ１は、Ｘ_１Ｘ_２ＫＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６（ここで、Ｘ_１はＤ、Ａ、又はＴ、Ｘ_２はＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡ、Ｘ_３はＰ又はＩ、Ｘ_４はＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨ、Ｘ_５はＮ、Ｒ、Ｋ、又はＡ、及びＸ_６はＹ、Ｈ、Ｋ、又はＲ）（配列番号７）のアミノ酸配列を有する。

【0101】

１又は複数のアンカー残基の修飾に加えて、修飾されたエピトープが野生型αサルシンと比較して減少したＭＨＣクラスＩＩ結合を維持する限り、サルシンエピトープ１において１又は複数の非アンカー残基を修飾することも可能である。サルシンエピトープ１と、他の関連する真菌リボトキシンにおける対応するエピトープの整列は、非アンカー残基の置換を可能とする手引きを提供する。当業者は、従来の方法及び技術を使用して、他の非アンカー残基置換を容易に同定することができるであろう。

【0102】

別の実施形態では、修飾サルシンエピトープ１は、Ｘ_１Ｘ_２ＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６（ここで、Ｘ_１はＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡ、Ｘ_２はＫ、又はＬ、Ｘ_３はＰ、又はＩ、Ｘ_４はＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨ、Ｘ_５はＮ、Ｒ、Ｋ又はＡ、及びＸ_６はＹ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、又はＷ）（配列番号８）のアミノ酸配列を有する。更に別の実施形態では、修飾サルシンエピトープ１は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＮＸ_４ＫＸ_５Ｘ_６ＫＸ_７（ここで、Ｘ_１はＤ、Ａ、又はＴ、Ｘ_２はＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡ、Ｘ_３はＫ又はＬ、Ｘ_４はＰ又はＩ、Ｘ_５はＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨ、Ｘ_６はＮ、Ｒ、Ｋ又はＡ、及びＸ_７はＹ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、又はＷ）（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。

【0103】

サルシンエピトープ２は、野生型α−サルシンのアミノ酸残基１３４〜１４２に対応し、そのため、触媒三残基の一部であるＨ１３７にかかる。サルシンエピトープ２は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合を減少するか、又は排除するように修飾され得る。或る１つの実施形態では、修飾サルシンエピトープ２は、サルシンエピトープ２の１又は複数のＰ１、Ｐ６、Ｐ７、又はＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基において１又は複数の突然変異を有する。別の実施形態では、修飾サルシンエピトープ２は、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｉ１３４においてＩ１３４Ａ、Ｐ６アンカーの残基Ｋ１３９においてＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、若しくはＫ１３９Ｎ、Ｐ７アンカー残基のＥ１４０においてＥ１４０Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｑ１４２においてＱ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、若しくはＱ１４２Ｇを有する。言い換えれば、修飾サルシンエピトープ２は、Ｘ_１ＩＡＨＴＸ_２Ｘ_３ＮＸ_４（ここで、Ｘ_１はＩ、又はＡ、Ｘ_２はＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮ、Ｘ_３はＥ、又はＤ；及びＸ_４はＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧ）（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する。

【0104】

１又は複数のアンカー残基の修飾に加えて、修飾されたエピトープが野生型αサルシンと比較して減少したＭＨＣクラスＩＩ結合を維持する限り、サルシンエピトープ２において１又は複数の非アンカー残基を修飾することも可能である。サルシンエピトープ２と、他の関連する真菌リボトキシンにおける対応するエピトープの整列は、非アンカー残基の置換を可能とする手引きを提供する。当業者は、従来の方法及び技術を使用して、他の非アンカー残基置換を容易に同定することができるであろう。

【0105】

別の実施形態では、修飾サルシンエピトープ２は、Ｘ_１Ｘ_２ＡＨＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＮＸ_６（ここで、Ｘ_１はＩ、又はＡ、Ｘ_２はＩ、又はＶ、Ｘ_３はＴ、又はＱ、Ｘ_４はＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮ、Ｘ_５はＥ、又はＤ、及びＸ_６はＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧ）（配列番号１１）のアミノ酸配列を有する。

【0106】

いかなる理論又は機構にも束縛されることを意図するものではないが、本明細書に記載されるヒトＭＨＣクラスＩＩ結合を減少又は排除する突然変異は、ヒトにおいて野生型α−サルシンの免疫原性を減少又は排除に役立つ可能性があると考えられる（例えば、Ｔ細胞エピトープの数及び／又は免疫原性を減少することにより）。

【0107】

或る実施形態では、修飾サルシン分子は、野生型α−サルシンと比較して少なくとも１つ少ないＴ細胞エピトープ（又は、少なくとも２つ少ないＴ細胞エピトープ、少なくとも３つ少ないＴ細胞エピトープ等）を含む。例えば、野生型α−サルシンが２つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、１つのＴ細胞エピトープ又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型α−サルシンが３つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型α−サルシンが１０のＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、９つのＴ細胞エピトープ、８つのＴ細胞エピトープ、７つのＴ細胞エピトープ、６つのＴ細胞エピトープ、５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型α−サルシンが８つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、７つのＴ細胞エピトープ、６つのＴ細胞エピトープ、５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型α−サルシンが６つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型α−サルシンが４つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。

【0108】

より具体的には、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシンと比較して、少なくとも１つの突然変異を含んでもよく、親α−サルシンは少なくとも野生型α−サルシンの一部（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）である。或る１つの実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して減少した結合能力を有する、若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合能力を有しないエピトープを生じるか、又は対応する野生型α−サルシンと比較して減少したＴ細胞応答を誘発する修飾サルシン分子を生じる、Ｔ細胞エピトープの突然変異を含む。例えば、少なくとも１つの突然変異は、サルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内、及び／又はサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内にあってもよい。

【0109】

或る実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して、少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、（野生型α−サルシンの）アミノ酸Ｄ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の少なくとも１つの突然変異を含む。

【0110】

例えば、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して、１又は複数の以下の突然変異、すなわちＤ９Ｔ、Ｄ９Ａ、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０Ａ、Ｐ１３Ｉ、Ｔ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、Ｔ１５Ｈ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、Ｙ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒを含む。

【0111】

或る実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して、少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸Ｉ１３４、Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の少なくとも１つの突然変異を含む。

【0112】

例えば、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して、１又は複数の以下の突然変異、すなわちＩ１３４Ａ、Ｋ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、Ｋ１３９Ｎ、Ｅ１４０Ｄ、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇを含む。

【0113】

他の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して、第１及び第２の突然変異を含み、ここで、第１の突然変異は（野生型α−サルシンの）アミノ酸Ｄ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の少なくとも１つの突然変異を含み、第２の突然変異は（野生型α−サルシンの）アミノ酸Ｉ１３４、Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の少なくとも１つの突然変異を含む。例えば、或る特定の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して１又は複数の以下の突然変異、すなわち、Ｑ１０における第１の突然変異及びＫ１３９若しくはＱ１４２における第２の突然変異、Ｎ１６における第１の突然変異及びＫ１３９若しくはＱ１４２における第２の突然変異、又はＹ１８における第１の突然変異及びＫ１３９若しくはＱ１４２における第２の突然変異を含む。

【0114】

例えば、或る実施形態では、修飾サルシン分子は、野生型α−サルシン（配列番号１）と比較して第１の突然変異を含み（ここで、第１の突然変異はＤ９Ｔ、Ｄ９Ａ、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０Ａ、Ｐ１３Ｉ、Ｔ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、Ｔ１５Ｈ、Ｎ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、Ｎ１６Ａ、Ｙ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、又はＹ１８Ｒから選択される）、また野生型α−サルシンと比較して第２の突然変異を含む（ここで、第２の突然変異はＩ１３４Ａ、Ｋ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、Ｋ１３９Ｎ、Ｅ１４０Ｄ、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇから選択される）。

【0115】

他の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して１又は複数の以下の突然変異、すなわち、Ｑ１０Ｋを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異、Ｎ１６Ｒを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異、Ｎ１６Ｒを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異、Ｎ１６Ｋを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異、Ｙ１８Ｋを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異、又はＹ１８Ｒを含む第１の突然変異及びＫ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｑ１４２Ｎ、若しくはＱ１４２Ｔを含む第２の突然変異を含む。

【0116】

他の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して３つの突然変異を含む。例えば、修飾サルシン分子は、サルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内の第１及び第２の突然変異、並びにサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内の第３の突然変異を含んでもよい。代替的には、修飾サルシン分子は、サルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内の第１の突然変異、並びにサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内の第２及び第３の突然変異を含んでもよい。

【0117】

或る特定の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して１又は複数の以下の突然変異、すなわち、アミノ酸Ｑ１０又はＮ１６における第１の突然変異、Ｋ１３９における第２の突然変異、及びＱ１４２における第３の突然変異を含む。或る１つの実施形態ではＱ１０又はＮ１６における第１の突然変異は、Ｑ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、若しくはＱ１０Ａ、又はＮ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、若しくはＮ１６Ａ（好ましくはＱ１０Ｋ又はＮ１６Ｒ）から選択される。別の実施形態では、Ｋ１３９における第２の突然変異は、Ｋ１３９Ｄ、Ｋ１３９Ｅ、Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｑ、Ｋ１３９Ｈ、又はＫ１３９Ｎ（好ましくはＫ１３９Ｄ又はＫ１３９Ｅ）から選択される。別の実施形態では、Ｑ１４２における第３の突然変異は、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ、又はＱ１４２Ｇ（好ましくは、Ｑ１４２Ｔ）から選択される。

【0118】

更に別の実施形態では、第１の突然変異はＱ１０Ｋ又はＮ１６Ｒであり、第２の突然変異はＫ１３９Ｅ又はＫ１３９Ｄであり、第３の突然変異はＱ１４２Ｔである。別の実施形態では、第１の突然変異はＱ１０Ｋであり、第２の突然変異はＫ１３９Ｅであり、第３の突然変異はＱ１４２Ｔである。別の実施形態では、第１の突然変異はＱ１０Ｋであり、第２の突然変異はＫ１３９Ｄであり、第３の突然変異はＱ１４２Ｔである。別の実施形態では、第１の突然変異はＮ１６Ｒであり、第２の突然変異はＫ１３９Ｅであり、第３の突然変異はＱ１４２Ｔである。別の実施形態では、第１の突然変異はＮ１６Ｒであり、第２の突然変異はＫ１３９Ｄであり、第３の突然変異はＱ１４２Ｔである。

【0119】

他の実施形態では、修飾サルシン分子は、「親」α−サルシン（例えば、野生型α−サルシン、野生型α−サルシンのフラグメント等）と比較して４つの突然変異を含む。例えば、修飾サルシン分子は、サルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内に２つの突然変異、及びサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内に２つの突然変異、サルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内に１つの突然変異、及びサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内に３つの突然変異、又はサルシンＴ細胞エピトープ１（配列番号５又は配列番号６）内に３つの突然変異、及びサルシンＴ細胞エピトープ２（配列番号４）内に１つの突然変異を含んでもよい。

【0120】

更に別の実施形態では、修飾サルシンポリペプチドは、野生型α−サルシンポリペプチド（配列番号１）と比較して少なくとも１つの突然変異を含み、その修飾サルシンポリペプチドのアミノ酸配列は、
ＡＶＴＷＴＣＬＮＸ_１Ｘ_２ ＫＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６ＥＴ ＫＲＬＬＹＮＱＮＫＡ ＥＳＮＳＨＨＡＰＬＳ ＤＧＫＴＧＳＳＹＰＨ ＷＦＴＮＧＹＤＧＤＧ ＫＬＰＫＧＲＴＰＩＫ ＦＧＫＳＤＣＤＲＰＰ ＫＨＳＫＤＧＮＧＫＴ ＤＨＹＬＬＥＦＰＴＦ ＰＤＧＨＤＹＫＦＤＳ ＫＫＰＫＥＮＰＧＰＡ ＲＶＩＹＴＹＰＮＫＶ ＦＣＧＸ_７ＩＡＨＴＸ_８Ｘ_９ ＮＸ_１０ＧＥＬＫＬＣＳＨ
（ここで、上記修飾サルシンポリペプチドが野生型α−サルシンポリペプチド（配列番号１）と同一でない限り、Ｘ_１〜Ｘ_１０は任意のアミノ酸であってもよい）（配列番号１２）を含む。

【0121】

別の実施形態では、Ｘ_１はＤ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_２はＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡであり、Ｘ_３はＰ又はＩであり、Ｘ_４はＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨであり、Ｘ_５はＮ、Ｒ、Ｋ又はＡであり、Ｘ_６はＹ、Ｈ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ_７はＩ又はＡであり、Ｘ_８はＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮであり、Ｘ_９はＥ又はＤであり、Ｘ_１０はＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧ（配列番号１３）である。

【0122】

表４は、修飾サルシン分子の非限定的な例を記載する。表４における修飾サルシン分子は、上述の１又は複数のアミノ酸置換を含む。

【0123】

【表4】

【0124】

野生型α−サルシンの修飾は、上述のようなアミノ酸置換を含んでもよい。或る実施形態では、アミノ酸置換は、１アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ）、２アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ及びＱ１４２Ｇ）、３アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ、Ｎ１６Ａ、Ｑ１４２Ｇ）、４アミノ酸置換、５アミノ酸置換、６アミノ酸置換、７アミノ酸置換、８アミノ酸置換、９アミノ酸置換、１０アミノ酸置換、又は１０超のアミノ酸置換である。

【0125】

野生型α−サルシンの修飾は、アミノ酸置換に限定されない。例えば、修飾は、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を含んでもよい。或る実施形態では、アミノ酸欠失は、１アミノ酸欠失、２アミノ酸欠失、３アミノ酸欠失、４アミノ酸欠失、５アミノ酸欠失、６アミノ酸欠失、７アミノ酸欠失、８アミノ酸欠失、９アミノ酸欠失、１０アミノ酸欠失、又は１０超のアミノ酸欠失である。或る実施形態では、アミノ酸付加は、１アミノ酸付加、２アミノ酸付加、３アミノ酸付加、４アミノ酸付加、５アミノ酸付加、６アミノ酸付加、７アミノ酸付加、８アミノ酸付加、９アミノ酸付加、１０アミノ酸付加、又は１０超のアミノ酸付加である。欠失及び／又は付加は、Ｔ細胞エピトープ領域以外の分子の領域における欠失に対応してもよい。

【0126】

野生型α−サルシンは、２つのジスルフィド結合（アミノ酸Ｃｙｓ６とＣｙｓ１４８との間、及びアミノ酸Ｃｙｓ７６とＣｙｓ１３２との間）を有する。或る実施形態では、修飾サルシン分子は、追加のジスルフィド結合を含む。或る実施形態では、追加のジスルフィド結合は、野生型のジスルフィド結合部位に隣接する部位に付加されてもよい。或る実施形態では、追加のジスルフィド結合は、アミノ酸の付加により分子中に組み込まれてもよい。或る実施形態では、ジスルフィド結合はアミノ酸の置換により分子中に組み込まれてもよい。或る実施形態では、修飾サルシン分子はジスルフィド結合を有しない。

【0127】

野生型α−サルシンの修飾は、（上述のような）アミノ酸置換、及び追加の修飾、例えば、欠失、付加、切断（例えば、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断）、又はそれらの組合せを含んでもよい。

【0128】

他の修飾真菌リボトキシン分子
先に述べたように、α−サルシンに加えて、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンを含む他のアスペルギルス種によって産生される他の関連するリボトキシンファミリーのメンバーが存在する。表５は、野生型のクラビン（配列番号２４）、ギガンチン（配列番号２５）、マイトギリン（配列番号２６）、及びレストリクトシン（配列番号４５）に対応する配列を示す。本発明の修飾されたクラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンの分子は、「親」のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシン、例えば、野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、若しくはストリクトシン、又は野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、若しくはレストリクトシンのフラグメントにそれぞれ由来する。

【0129】

【表5】

【0130】

タンパク質分子の免疫原性の分析のための迅速な方法の例は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合の予測を含む。ＭＨＣクラスＩＩに結合するごく一部のペプチドが実際のＴ細胞エピトープであるが、ＭＨＣクラスＩＩへのペプチド結合の分析は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープがＭＨＣクラスＩＩを結合することから、タンパク質配列の免疫原性の可能性の迅速な分析を提供することができる。さらに、乱交雑な高親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、Ｔ細胞エピトープの存在と相関することが示され（Hill et al., 2003, Arthritis Res Ther, 1:R40-R48）、それにより、かかる乱交雑な結合ペプチドの分析は「可能性のある」Ｔ細胞エピトープの分析の根拠を提供する。

【0131】

かかる相互作用をモデル化するため、ペプチドスレッディングソフトウェア（国際公開第０２／０６９２３２号、国際公開第９８／５９２４４号）に基づく、ｉＴｏｐｅ（Perry et al., 2008, Drugs in R&D, 9(6) 385-396）等のコンピュータ法が開発されてきた。ｉＴｏｐｅでは、目的の配列に由来する重複する９ｍｅｒを３４の異なるヒトＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプとの相互作用について個別に試験し、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々とのそれらの一致及び相互作用に基づいて個別に採点する。各ＭＨＣアロタイプについて、相互作用の合わせた強度は、各９ｍｅｒのペプチドの物理的な結合強度の予測、及び高親和性結合のペプチドの指定を提供し得る。３４のＭＨＣクラスＩＩアロタイプの全てに対する９ｍｅｒの結合の収集分析により、乱交雑な又は制限された結合の程度を決定することができる。これは、それによりＴ細胞エピトープ活性を有する可能性が高いと考えられる、乱交雑な高親和性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を可能とする。

【0132】

非自己ヒトＭＨＣクラスＩＩバインダーについてクラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンの野生型アミノ酸配列を分析した。野生型リボトキシン配列に由来する全ての重複する９ｍｅｒを３４のヒトＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのデータベースに通し、ＭＨＣクラスＩＩ分子の各々との一致及び相互作用に基づいて個別に採点した。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプ（「ｐ１アンカー」）に対する９ｍｅｒペプチド結合の第１の残基の位置である、ＭＨＣクラスＩＩに対する予測される結合は、０．５５〜０．６の結合スコアを有するか、又は結合スコアは０．６超であった。免疫原性の可能性があるペプチドを含む領域は「乱交雑な高い」及び「乱交雑な中程度の」と示される。「乱交雑な高」ＭＨＣ結合ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩに対する全アレル結合の５０％であり、また高親和性アレル結合の５０％と規定される。「乱交雑な中程度の」ＭＨＣ結合ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩに対する全アレル結合の５０％であるが、ＭＨＣクラスＩＩに対する高親和性アレル結合の５０％未満と規定される。

【0133】

この研究の結果は、野生型クラビンが、残基１３４（Ｉ／イソロイシン）にｐ１アンカーを有する乱交雑な高親和性ＭＨＣ結合ペプチドを含む幾つかの可能性あるＴ細胞エピトープ、並びに残基６３（Ｌ／ロイシン）、１２２（Ｖ／バリン）、及び１３０（Ｖ／バリン）にｐ１アンカーを有する３つの乱交雑な中程度の親和性のＭＨＣ結合ペプチドを含むことを示唆する（表６を参照されたい）。可能性のある低〜非常に低い免疫原性のＴ細胞エピトープも同定された。

【0134】

【表6】

【0135】

さらに、α−サルシンのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（イギリス、ケンブリッジ）免疫原性分析は、クラビンがＱ１０のｐ１アンカー残基を有する以下のＴ細胞エピトープ、ＱＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号５）を含むことを示唆する。

【0136】

また、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの研究も、野生型ギガンチンが、残基６３（Ｌ／ロイシン）及び残基１２２（Ｖ／バリン）においてｐ１アンカーを有する２つの乱交雑な高親和性ＭＨＣ結合ペプチドを含む、幾つかの可能性のあるＴ細胞エピトープを含むことを示唆する（表７を参照されたい）。可能性のある低〜非常に低い免疫原性のＴ細胞エピトープも同定された。

【0137】

【表7】

【0138】

さらに、α−サルシンのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（イギリス、ケンブリッジ）免疫原性分析は、ギガンチンが、それぞれ、Ｑ１０及びＩ１３４のｐ１アンカー残基を有する以下の２つのＴ細胞エピトープ、ＱＫＮＩＫＴＮＫＹ（配列番号３１）及びＩＩＡＨＴＲＥＮＱ（配列番号３２）を含むことを示唆する。

【0139】

また、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの研究も、アスペルギルス・レストリクタス（Aspergillus restrictus）から単離された同じタンパク質の変異体である野生型のマイトギリン及びレストリクトシンが、残基６２（Ｉ／イソロイシン）、残基１２９（Ｖ／バリン）、及び残基１３３（Ｉ／イソロイシン）にｐ１アンカーを有する３つの乱交雑な高親和性のＭＨＣ結合ペプチド、並びに残基１２１（Ｖ／バリン）にｐ１アンカーを有する単一の乱交雑な中程度の親和性のＭＨＣ結合ペプチドを含む、幾つかの可能性のあるＴ細胞エピトープを含むことを示唆する（表８を参照されたい）。可能性のある低〜非常に低い免疫原性のＴ細胞エピトープも同定された。

【0140】

【表8】

【0141】

さらに、α−サルシンのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（イギリス、ケンブリッジ）免疫原性分析は、マイトギリン及びレストリクトシンが、Ｑ１０のｐ１アンカー残基を有する以下のＴ細胞エピトープ、ＱＬＮＰＫＴＮＫＷ（配列番号３６）を含むことを示唆する。

【0142】

上記で同定されたクラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンのＴ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合を減少又は排除するように修飾され得る。或る１つの実施形態では修飾されたクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンのＴ細胞エピトープは、１又は複数のＰ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、又はＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基において１又は複数の突然変異を有する。

【0143】

或る１つの実施形態では、ｐ１アンカーＱ１０を有する修飾されたクラビン又はギガンチンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１の残基Ｑ１０においてＱ１０Ｋ、Ｑ１０Ｒ、若しくはＱ１０Ａ、Ｐ４アンカーの残基Ｐ１３において（クラビンについてのみ）Ｐ１３Ｉ、Ｐ６アンカーの残基Ｔ１５においてＴ１５Ｇ、Ｔ１５Ｑ、若しくはＴ１５Ｈ、Ｐ７アンカーの残基Ｎ１６においてＮ１６Ｒ、Ｎ１６Ｋ、若しくはＮ１６Ａ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｙ１８においてＹ１８Ｈ、Ｙ１８Ｋ、若しくはＹ１８Ｒを有する。

【0144】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＱ９を有する修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｑ９においてＱ９Ｋ、Ｑ９Ｒ、若しくはＱ９Ａ、Ｐ４アンカーの残基Ｐ１２においてＰ１２Ｉ、Ｐ６アンカーの残基Ｔ１４においてＴ１４Ｇ、Ｔ１４Ｑ、若しくはＴ１４Ｈ、Ｐ７アンカーの残基Ｎ１５においてＮ１５Ｒ、Ｎ１５Ｋ、若しくはＮ１５Ａ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｙ１７においてＹ１７Ｈ、Ｙ１７Ｋ、若しくはＹ１７Ｒを有する。

【0145】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＬ６３を有する修飾クラビンエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわちＰ１アンカーの残基Ｌ６３においてＬ６３Ａ若しくはＬ６３Ｄ、Ｐ４アンカーの残基Ｒ６６においてＲ６６Ｇ、Ｒ６６Ｑ、Ｒ６６Ｈ、Ｒ６６Ｎ、Ｒ６６Ｄ、Ｒ６６Ｅ、Ｐ７アンカーの残基Ｉ６９においてＩ６９Ａ、若しくはＩ６９Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｗ７１においてＷ７１Ｇ、Ｗ７１Ａ、Ｗ７１Ｄ、若しくはＷ７１Ｅを有する。

【0146】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＬ６３を有する修飾ギガンチンエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわちＰ１アンカーの残基Ｌ６３においてＬ６３Ａ若しくはＬ６３Ｄ、Ｐ４アンカーの残基Ｒ６６においてＲ６６Ｇ、Ｒ６６Ｑ、Ｒ６６Ｈ、Ｒ６６Ｎ、Ｒ６６Ｄ、Ｒ６６Ｅ、Ｐ７アンカーの残基Ｉ６９においてＩ６９Ａ、若しくはＩ６９Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｆ７１においてＦ７１Ｇ、Ｆ７１Ａ、Ｆ７１Ｄ、若しくはＦ７１Ｅを有する。

【0147】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＩ６２を有する修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわちＰ１アンカーの残基Ｉ６２においてＩ６２Ａ若しくはＩ６２Ｄ、Ｐ４アンカーの残基Ｒ６５においてＲ６５Ｇ、Ｒ６５Ｑ、Ｒ６５Ｈ、Ｒ６５Ｎ、Ｒ６５Ｄ、Ｒ６５Ｅ、Ｐ７アンカーの残基Ｉ６８においてＩ６８Ａ、若しくはＩ６８Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｆ７０においてＦ７０Ｇ、Ｆ７０Ａ、Ｆ７０Ｄ、若しくはＦ７０Ｅを有する。

【0148】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＶ１２２を有する修飾されたクラビン又はギガンチンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわちＰ１アンカーの残基Ｖ１２２においてＶ１２２Ａ、Ｖ１２２Ｋ、若しくはＶ１２２Ｒ、Ｐ４アンカーの残基Ｔ１２５においてＴ１２５Ｇ、Ｔ１２５Ｑ、若しくはＴ１２５Ｈ、Ｐ６アンカーの残基Ｐ１２７においてＰ１２７Ｉ、Ｐ７アンカーの残基Ｎ１２８においてＮ１２８Ｒ、Ｎ１２８Ｋ、若しくはＮ１２８Ａ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｖ１３０においてＶ１３０Ａ、Ｖ１３０Ｋ、若しくはＶ１３０Ｒを有する。

【0149】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＶ１２１を有する修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわちＰ１アンカーの残基Ｖ１２１においてＶ１２１Ａ、Ｖ１２１Ｋ、若しくはＶ１２１Ｒ、Ｐ４アンカーの残基Ｔ１２４においてＴ１２４Ｇ、Ｔ１２４Ｑ、若しくはＴ１２４Ｈ、Ｐ６アンカーの残基Ｐ１２６においてＰ１２６Ｉ、Ｐ７アンカーの残基Ｎ１２７においてＮ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｋ、若しくはＮ１２７Ａ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｖ１２９においてＶ１２９Ａ、Ｖ１２９Ｋ、若しくはＶ１２９Ｒを有する。

【0150】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＶ１３０を有する修飾クラビンエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｖ１３０においてＶ１３０Ａ、Ｖ１３０Ｋ、若しくはＶ１３０Ｒ、Ｐ４アンカーの残基Ｇ１３３において、Ｇ１３３Ａ、Ｇ１３３Ｄ、Ｇ１３３Ｅ、若しくはＧ１３３Ｋ、Ｐ７アンカーの残基Ａ１３６において、Ａ１３６Ｒ、Ａ１３６Ｋ、若しくはＡ１３６Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｔ１３８において、Ｔ１３８Ｇ若しくはＴ１３８Ｈを有する。

【0151】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＶ１２９を有する修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｖ１２９においてＶ１２９Ａ、Ｖ１２９Ｋ、若しくはＶ１２９Ｒ、Ｐ４アンカーの残基Ｇ１３２において、Ｇ１３２Ａ、Ｇ１３２Ｄ、Ｇ１３２Ｅ、若しくはＧ１３２Ｋ、Ｐ７アンカーの残基Ａ１３５において、Ａ１３５Ｒ、Ａ１３５Ｋ、若しくはＡ１３５Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｑ１３７において、Ｑ１３７Ｇ若しくはＱ１３７Ｈを有する。

【0152】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＩ１３４を有する修飾クラビンエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｉ１３４においてＩ１３４Ａ、Ｐ６アンカーの残基Ｒ１３９において、Ｒ１３９Ｄ、Ｒ１３９Ｅ、Ｒ１３９Ｇ、Ｒ１３９Ｑ、Ｒ１３９Ｈ、若しくはＲ１３９Ｎ、Ｐ７アンカーの残基Ｅ１４０において、Ｅ１４０Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｑ１４２において、Ｑ１４２Ｄ、Ｑ１４２Ｎ、Ｑ１４２Ｔ、Ｑ１４２Ｅ、Ｑ１４２Ｒ若しくはＱ１４２Ｇを有する。

【0153】

別の実施形態では、ｐ１アンカーＩ１３３を有する修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンのエピトープは、１又は複数の以下の置換、すなわち、Ｐ１アンカーの残基Ｉ１３３においてＩ１３３Ａ、Ｐ６アンカーの残基Ｒ１３８において、Ｒ１３８Ｄ、Ｒ１３８Ｅ、Ｒ１３８Ｇ、Ｒ１３８Ｑ、Ｒ１３８Ｈ、若しくはＲ１３８Ｎ、Ｐ７アンカーの残基Ｇ１３９において、Ｇ１３９Ｄ、及び／又はＰ９アンカーの残基Ｑ１４１において、Ｑ１４１Ｄ、Ｑ１４１Ｎ、Ｑ１４１Ｔ、Ｑ１４１Ｅ、Ｑ１４１Ｒ、若しくはＱ１４１Ｇを有する。

【0154】

１又は複数のアンカー残基を修飾することに加えて、その修飾エピトープが対応する野生型リボトキシンと比較して減少したＭＨＣクラスＩＩ結合を維持する限り、上記に特定されるクラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンのＴ細胞エピトープにおいて１又は複数の非アンカー残基を修飾することもできる。

【0155】

或る実施形態では、修飾Ｔ細胞エピトープは、修飾リボトキシン分子（例えば、修飾されたクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンの分子）の一部であり、修飾リボトキシン分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して少なくとも１つ少ないＴ細胞エピトープ（又は、少なくとも２つ少ないＴ細胞エピトープ、少なくとも３つ少ないＴ細胞エピトープ等）を含む。例えば、野生型リボトキシンが２つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型リボトキシンが３つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型リボトキシンが１０のＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は９つのＴ細胞エピトープ、８つのＴ細胞エピトープ、７つのＴ細胞エピトープ、６つのＴ細胞エピトープ、５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型リボトキシンが８つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は７つのＴ細胞エピトープ、６つのＴ細胞エピトープ、５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型リボトキシンが６つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は５つのＴ細胞エピトープ、４つのＴ細胞エピトープ、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。或いは、野生型リボトキシンが４つのＴ細胞エピトープを含む場合、或る実施形態では、修飾リボトキシン分子は、３つのＴ細胞エピトープ、２つのＴ細胞エピトープ、１つのＴ細胞エピトープ、又は０のＴ細胞エピトープを含む。

【0156】

より具体的には、修飾リボトキシン分子（例えば、修飾されたクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンの分子）は、「親」リボトキシンと比較して少なくとも１つの突然変異を含んでもよく、親リボトキシンは野生型リボトキシン（例えば、野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン、野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンのフラグメント等）の少なくとも一部である。或る１つの実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して減少した結合能力を有する、又はＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合能力を有しないエピトープを生じる、Ｔ細胞エピトープの突然変異を含む。

【0157】

より具体的には、修飾リボトキシン分子は、「親」リボトキシンと比較して、少なくとも１つの突然変異を含んでもよく、親リボトキシンは野生型リボトキシン（例えば、野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン、野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンのフラグメント等）の少なくとも一部である。或る１つの実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して減少した結合能力を有する、又はＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合能力を有しないエピトープを生じる、Ｔ細胞エピトープの突然変異を含む。例えば、少なくとも１つの突然変異は、１若しくは複数の以下のクラビンＴ細胞エピトープ（配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３、及び／又は配列番号５）内、１若しくは複数の以下のギガンチンＴ細胞エピトープ（配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び／又は配列番号３）内、又は１若しくは複数の以下のマイトギリン若しくはレストリクトシンのＴ細胞エピトープ（配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び／又は配列番号３）内であってもよい。

【0158】

或る実施形態では、修飾クラビン分子は、「親」クラビン（例えば、野生型クラビン、野生型クラビンのフラグメント等）と比較して少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、（野生型クラビンの）少なくとも１つのアミノ酸Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、Ｙ１８、Ｌ６３、Ｒ６６、Ｉ６９、Ｗ７１、Ｖ１２２、Ｔ１２５、Ｐ１２７、Ｎ１２８、Ｖ１３０、Ｇ１３３、Ｉ１３４、Ａ１３６、Ｔ１３８、Ｒ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の突然変異を含む。

【0159】

或る実施形態では、修飾ギガンチン分子は、「親」ギガンチン（例えば、野生型ギガンチン、野生型ギガンチンのフラグメント等）と比較して少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、（野生型ギガンチンの）少なくとも１つのアミノ酸Ｑ１０、Ｔ１５、Ｎ１６、Ｙ１８、Ｌ６３、Ｒ６６、Ｉ６９、Ｆ７１、Ｖ１２２、Ｔ１２５、Ｐ１２７、Ｎ１２８、Ｖ１３０の突然変異を含む。

【0160】

他の実施形態では、修飾されたマイトギリン又はレストリクトシンの分子は、「親」のマイトギリン又はレストリクトシン（例えば、野生型のマイトギリン又はレストリクトシン、野生型のマイトギリン又はレストリクトシンのフラグメント等）と比較して、少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、（野生型のマイトギリン又はレストリクトシンの）少なくとも１つのアミノ酸Ｑ９、Ｐ１２、Ｔ１４、Ｎ１５、Ｙ１７、Ｉ６２、Ｒ６５、Ｉ６８、Ｆ７０、Ｖ１２１、Ｔ１２４、Ｐ１２６、Ｎ１２７、Ｖ１２９、Ｇ１３２、Ｉ１３３、Ａ１３５、Ｑ１３７、Ｒ１３８、Ｇ１３９、又はＱ１４１の突然変異を含む。

【0161】

野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンの修飾は、上述のアミノ酸置換を含んでもよい。或る実施形態では、アミノ酸置換は、１アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ）、２アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ及びＱ１４２Ｇ）、３アミノ酸置換（例えば、Ｑ１０Ａ、Ｎ１６Ａ、Ｑ１４２Ｇ）、４アミノ酸置換、５アミノ酸置換、６アミノ酸置換、７アミノ酸置換、８アミノ酸置換、９アミノ酸置換、１０アミノ酸置換、又は１０超のアミノ酸置換である。

【0162】

野生型のクラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシンの修飾は、アミノ酸置換に限定されない。例えば、上記修飾は、アミノ酸欠失又はアミノ酸付加を含んでもよい。或る実施形態では、アミノ酸欠失は、１アミノ酸欠失、２アミノ酸欠失、３アミノ酸欠失、４アミノ酸欠失、５アミノ酸欠失、６アミノ酸欠失、７アミノ酸欠失、８アミノ酸欠失、９アミノ酸欠失、１０アミノ酸欠失、又は１０超のアミノ酸欠失である。或る実施形態では、アミノ酸付加は、１アミノ酸付加、２アミノ酸付加、３アミノ酸付加、４アミノ酸付加、５アミノ酸付加、６アミノ酸付加、７アミノ酸付加、８アミノ酸付加、９アミノ酸付加、１０アミノ酸付加、又は１０超のアミノ酸付加である。欠失及び／又は付加は、Ｔ細胞エピトープ領域以外の分子の領域における欠失に対応してもよい。

【0163】

リボ毒性（RIBOTOXICITY）及び細胞毒性
修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの細胞毒性を維持し得る。細胞毒性は、具体的な基質、例えば、オリゴヌクレオチド基質（例えば、リボソーム）に対するリボ核酸分解活性、細胞系アッセイにおいてタンパク質合成を干渉する能力、又は特定の細胞型に対する細胞殺傷活性を指す場合がある。例えば、細胞毒性アッセイは、毒素がリボソームを分解する能力を測定してもよい。細胞毒性は上述の定義に限定されない。

【0164】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと同程度に細胞毒性であってもよい。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、少なくとも対応する野生型リボトキシンと同程度に細胞毒性である。或る特定の実施形態において、驚くべきことに、修飾サルシン分子が、野生型α−サルシンよりも細胞毒性であることを発見した。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりも低細胞毒性である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか１０％未満の低細胞毒性である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか１５％未満の低細胞毒性である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか２０％未満の低毒性である。

【0165】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのコアリボトキシン構造を維持する。本明細書で使用される「コアリボトキシン構造」の用語は、野生型リボトキシンのアルファへリックス及びベータシートの配置を指す。例えば、或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと同じアルファへリックス配置を有し、例えば、アルファへリックスの一般的な構造を同じように維持する。或る実施形態では、アルファへリックスのアミノ酸は、野生型リボトキシンと同じままである。アルファへリックスアミノ酸は、マイトギリン又はレストリクトシンについてＧｌｕ２７〜Ａｌａ３７（Perez-Canadilas et al., J Mol Biol 2009, 299:1061-73）又はＧｌｕ２６〜Ａｌａ３６を指す場合がある。或る実施形態では、アルファへリックスにおける１又は複数のアミノ酸が修飾され得るが、アルファへリックスの構造は維持されたままである。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと同じベータシート構造を有し、例えば、ベータシートの一般的な構造を同じように維持する。或る実施形態では、ベータシートのアミノ酸は野生型リボトキシンと同じままである。或る実施形態では、アルファへリックスの１又は複数のアミノ酸が修飾され得るが、アルファへリックスの構造は維持されたままである。ベータシートのアミノ酸は、マイトギリン又はレストリクトシンにおいてＨｉｓ５０〜Ｐｈｅ５２及び／又はＬｅｕ９４〜Ｐｈｅ９７及び／又はＡｌａ１２０〜Ｔｙｒ１２４及び／又はＧｌｙ１３３〜Ｔｈｒ１３８及び／又はＧｌｕ１４４〜Ｌｅｕ１４６（Perez-Canadilas et al., J Mol Biol 2009, 299:1061-73）、又はＨｉｓ４９〜Ｐｈｅ５１及び／又はＬｅｕ９３〜Ｐｈｅ９６及び／又はＡｌａ１１９〜Ｔｙｒ１２３及び／又はＧｌｙ１３２〜Ｇｌｎ１３８及び／又はＡｓｐ１４３〜Ｌｅｕ１４６を指す場合がある。或る実施形態では、活性部位の１又は複数のアミノ酸、例えば、Ｈｉｓ５０及び／又はＧｌｕ９６及び／又はＡｒｇ１２１及び／又はＨｉｓ１３７（又は、マイトギリン若しくはレストリクトシンにおいてＨｉｓ４９、Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ１２０、及び／又はＨｉｓ１３６）は修飾リボトキシン分子において変化されない。或る実施形態では、活性部位の１又は複数のアミノ酸が修飾される。

【0166】

修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのリボ毒性を維持し得る。リボ毒性は、具体的な基質、例えば、オリゴヌクレオチド基質（例えば、リボソーム）に対するリボ毒性（例えば、核酸分解）活性を指す場合があり、又は細胞系アッセイにおけるタンパク質合成を干渉する能力を指す場合がある。リボ毒性は、上述の定義に限定されない。

【0167】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと同程度にリボ毒性であってもよい。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと少なくとも同程度にリボ毒性である。或る特定の実施形態において、驚くべきことに、修飾サルシン分子が野生型α−サルシンよりもリボ毒性であることを発見した。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりもリボ毒性が低い。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか１０％未満の低いリボ毒性である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか１５％未満の低いリボ毒性である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのわずか２０％未満の低いリボ毒性である。

【0168】

サルシンのリボ毒性及び細胞毒性に対するアッセイは当該技術分野でよく知られており、Carreras-Sangra et al., 2012, PEDS 25, 425-35に記載される。従来のリボ毒性及び細胞毒性のアッセイとして、本出願の実施例に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイが挙げられる。

【0169】

安定性及び溶解性
タンパク質の安定性は、保存条件又は輸送条件に耐えるタンパク質の能力を決定し得る。また、安定性は、投与後（例えば、血清中での）そのタンパク質の半減期に影響し得る。タンパク質の融解温度、又はタンパク質がその三次構造を喪失する温度は、タンパク質の物理的安定性の測定の非限定的な例である。

【0170】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの融解温度を維持する（「融解温度を維持する」の用語は、プラス又はマイナス２％、プラス又はマイナス５％、プラス又はマイナス１０％を指す場合がある）。例えば、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、その融解温度が対応する野生型リボトキシンの融解温度のプラス又はマイナス５％以内である場合に、対応する野生型リボトキシンの融解温度を維持する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりも高い融解温度を有する。

【0171】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりも低い融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの融解温度よりも２度超低い融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの融解温度よりも５度超低い融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの融解温度よりも１０度超低い融解温度を有する。

【0172】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも４０℃の融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも５０℃の融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも６０℃の融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも６５℃の融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも７０℃の融解温度を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は少なくとも８０℃の融解温度を有する。かかるタンパク質の融解温度を決定する方法は、当業者によく知られている（例えば、Gong et al., 2009, JBC 284:21, pp 14203-14210、及び国際公開第２００９／０９９９６１号を参照されたい）。

【0173】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの溶解性を維持する（「溶解性を維持する」の用語は、プラス又はマイナス２％、プラス又はマイナス５％、プラス又はマイナス１０％を指す場合がある）。例えば、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、その溶解性が野生型リボトキシンの溶解性のプラス又はマイナス５％以内である場合に野生型リボトキシンの溶解性を維持する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりも高い溶解性を有する。

【0174】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンよりも低い溶解性を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの溶解性のわずか１０％未満の溶解性を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの溶解性のわずか１５％未満の溶解性を有する。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンの溶解性のわずか２０％未満の溶解性を有する。

【0175】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質は、タグを含む。タグとして、限定されないが、Ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ等を挙げることができる。

【0176】

いかなる理論又は機構にも束縛されることを意図するものではないが、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、及びレストリクトシンは、血清プロテアーゼによって分解されないと考えられる。また、それらは、リソソーム又は細胞質のプロテアーゼに対して比較的抵抗性であると考えられる。或る実施形態では、修飾リボトキシン分子を作製するための野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に対する修飾（複数の場合がある）は、野生型リボトキシンのプロテアーゼ耐性特性に影響しない。例えば、或る実施形態では、修飾（複数の場合がある）は、プロテアーゼ切断部位を付加しない。

【0177】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンのプロテアーゼ耐性特性を保持する（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して、わずか１０％未満のプロテアーゼ耐性である（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して、わずか２０％未満のプロテアーゼ耐性である（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して、わずか３０％未満のプロテアーゼ耐性である（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して、わずか４０％未満のプロテアーゼ耐性である（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、対応する野生型リボトキシンと比較して、わずか５０％未満のプロテアーゼ耐性である（例えば、血清プロテアーゼ及び／又はリソソームプロテアーゼ及び／又は細胞質プロテアーゼに供された場合）。

【0178】

リボトキシン融合タンパク質
また、本発明は、リボトキシン融合タンパク質、例えば、上述の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を含むリボトキシン融合タンパク質を特徴とする。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、対応する野生型リボトキシンと比較してヒトにおいて減少した免疫原性を有し、標的の結合に有効な標的分子を有する、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を含む。

【0179】

標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に連結されてもよい。或る実施形態では、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に組み込まれてもよい。

【0180】

或る実施形態では、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に連結される。或る実施形態では、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端に連結される。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、標的分子のＮ末端に連結される。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、標的分子のＣ末端に連結される。或る実施形態では、標的分子のＮ末端は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端に連結される。或る実施形態では、標的分子のＮ末端は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に連結される。或る実施形態では、標的分子のＣ末端は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端に連結される。或る実施形態では、標的分子のＣ末端は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に連結される。

【0181】

リンカー
修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子と標的分子を融合タンパク質において共に連結するため、リンカーを使用してもよい。或る実施形態では、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端にリンカーを介して連結される。或る実施形態では、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端にリンカーを介して連結される。或る実施形態では、融合タンパク質は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子と標的分子とのオリゴマーである。例えば、或る実施形態では、融合タンパク質は、２つの標的分子と、１つの修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子とを含む。或る実施形態では、融合タンパク質は２つの修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子と、１つの標的分子とを含む。融合タンパク質を連結して共にオリゴマーを形成するため、又は融合タンパク質内の構成要素を共に連結するため、１又は複数のリンカーを使用してもよい。

【0182】

リンカーは融合タンパク質の全体構造、及び融合タンパク質の構成要素の機能性領域の近接性に影響する場合がある。例えば、プロリン残基は、タンパク質の構造を曲げるか、又は捻れさせることが知られており、そのため、１又は複数のプロリン残基を含むリンカーは融合タンパク質の構造を曲げるか、又は捻れさせる可能性がある。

【0183】

リンカーは、例えば、限定されないが、様々なアミノ酸長及び／又は配列のペプチドを含んでもよい。或る実施形態では、リンカーは、０アミノ酸長〜１０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、０アミノ酸長〜１５アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、０アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、１アミノ酸長〜１０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、１アミノ酸長〜１５アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、１アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、２アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、３アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、４アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、５アミノ酸長〜１０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、１０アミノ酸長〜１５アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、１５アミノ酸長〜２０アミノ酸長のものである。或る実施形態では、リンカーは、２０超のアミノ酸長のものである。最適な長さは、具体的な標的（複数の場合がある）のスペーシング及び方向に一致するように変化し得る。

【0184】

リンカーは、融合タンパク質をコードする遺伝子にコードされてもよい。或る実施形態では、リンカーは融合タンパク質の一部に共有結合（例えば、架橋）されてもよい。リンカーは共有結合、又は非常に緊密な非共有結合、すなわち、様々なアミノ酸配列、例えば、（ａ）グリシン、セリン、プロリン、アラニンに富むもの、若しくは（ｂ）免疫グロブリンドメインを接続する天然連結アミノ酸配列の変異体の化学的結合又は直接的な遺伝子融合であってもよい。

【0185】

或る実施形態では、リンカーは、非ペプチド構成要素（例えば、糖残基、重金属イオン、治療用化学物質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、分離したＰＥＧ等の化学物質）を含む。

【0186】

或る実施形態では、ｄＰＥＧは、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のセリン、チロシン、システイン、又はリシンのいずれか１つにおいて、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に連結される。或る実施形態では、ｄＰＥＧは、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のグリコシル化部位に連結される。或る実施形態では、ｄＰＥＧは、標的分子のセリン、チロシン、システイン、又はリシンのいずれか１つにおいて標的分子に連結される。或る実施形態では、ｄＰＥＧは、標的分子のグリコシル化部位に連結される。或る実施形態では、ｄＰＥＧは約２００ダルトン〜１００００ダルトンである。

【0187】

或る実施形態では、リンカーはヒンジ構成要素である。例えば、標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子上の後半ヒンジ構成要素を結合することができる前半ヒンジ構成要素を含んでもよい。或る実施形態では、ヒンジ構成要素は、１又は複数の多量体化ドメインを含む。多量体化ドメインは、ヒンジ構成要素からタンパク質分解によって結果的に切断され得るように構成されてもよい。リンカー中にその特定の設計された認識配列に対して十分な特異性を呈するが、融合タンパク質の任意の他の配列を切断しない、任意のプロテアーゼを使用してもよい。切断は、最終融合タンパク質分子がプロテアーゼ認識部位の一部であるいかなる追加のアミノ酸残基も維持しないように、認識モチーフの最末端で生じ得る。プロテアーゼは、微量のプロテアーゼが精製（例えば、第Ｘ因子、トロンビン）の後に持ち越されても、患者にわずかな影響を有するか、又は何らの影響も有しない酵素であってもよい。

【0188】

切断可能なリンカー（又はアダプター）の例は、Heisler et al., 2003, Int. J. Cancer 103 277-282、及びKeller et al., 2001, J Control Release 74, 259-261に見ることができる。例えば、リンカー（アダプター）は、細胞質切断可能ペプチド（cytosolic cleavable peptide：ＣＣＰ）、膜輸送ペプチド（membrane transfer peptide：ＭＴＰ）及びエンドソーム切断可能ペプチド（endosomal cleavable peptide：ＥＣＰ）を含む。融合タンパク質のエンドサイト―シスの際、酵素切断がＭＴＰを露出するリガンドを放出して、ＣＣＰの酵素切断によってＭＴＰが毒素（例えば、サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）から放出されるサイトゾル中への移行を可能とする。本明細書に記載されるリボトキシン融合タンパク質は、類似の切断可能なリンカー、又は上記の参照文献に記載されるようなリンカーの様々な構成要素を使用してもよい。

【0189】

先に述べたように、融合タンパク質はオリゴマーであってもよく、例えば、融合タンパク質は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に連結された標的分子二量体（又は複数の標的分子）を含んでもよい。或る実施形態では、標的分子は二量体である。或る実施形態では、標的分子は三量体である。或る実施形態では、標的分子は四量体である。或る実施形態では、標的分子は五量体である。或る実施形態では、融合タンパク質は５より多いサブユニットを含む。或る実施形態では、融合タンパク質はオリゴマーであってもよく、例えば、融合タンパク質は、標的分子に連結された修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子の二量体（又は複数の修飾リボトキシン分子）を含んでもよい。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は二量体である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は三量体である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は四量体である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は五量体である。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は５より多いサブユニットを含む。

【0190】

２若しくは複数の標的分子、又は２若しくは複数の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子をリンカーによって連結してもよく、ここで、リンカーは任意の適切な場所で個々の標的分子又は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に付着され得る。リンカーが標的分子上に付着され得る場所の例として、ＣＨ２ドメインのＣ末端、Ｎ末端、システインが先行する又はシステインが続くＣ末端又はＮ末端が挙げられる。或る実施形態では、（例えば、二量体、三量体等を形成するための）２以上の標的分子又は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子の連結は、システイン間のジスルフィド結合の形成によって制御される。

【0191】

或る実施形態では、リンカーは、２−イミノチオラン、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ビス−ジアゾベンジジン及びグルタルアルデヒドからなる群から選択され得る。或る実施形態では、リンカーをアミノ酸基のアミノ基、カルボン酸基、スルフヒドリル基又はヒドロキシル基に付着させてもよい。リンカーが付着し得るアミノ基としては、例えば、アラニン、リシン、又はプロリンを挙げることができる。リンカーが付着し得るカルボン酸基は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸であってもよい。リンカーが付着し得るスルフヒドリル基は、例えば、システインであってもよい。リンカーが付着し得るヒドロキシル基は、例えば、セリン、トレオニン、又はチロシンであってもよい。標的分子を別の標的分子に（又は、標的分子を修飾リボトキシン分子に）化学的に付着することが可能な当業者に知られている任意のカップリング化学を使用することができる。

【0192】

標的分子及び標的
融合タンパク質は、標的を結合するのに有効な標的分子を含む。或る実施形態では、標的分子はペプチドを含む。或る実施形態では、標的分子は、抗体、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、アブジュリン（abdurin）、ＣＨ２ドメイン分子、ＣＨ２ドメインフラグメント、ＣＨ３ドメイン分子、ＣＨ３ドメインフラグメント、タンパク質スキャフォルド、ホルモン、受容体結合ペプチド等、又はそれらの組合せを含む。或る実施形態では、標的分子は結合部分を含み、その結合部分はＶＨドメイン、ＶＬドメイン、フィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型ドメイン、設計されたアンキリンリピートタンパク質、セントリンスキャフォルド、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド、受容体、ホルモン、酵素、サイトカイン、小分子、それらのフラグメント等、又はそれらの組合せを含む。標的分子は、上述の例に限定されない。

【0193】

或る実施形態では、標的分子は、抗原結合領域を含む。或る実施形態では、標的分子は、約２０ｋＤａ未満の分子量を有するＣＨ２ドメイン分子である。或る実施形態では、標的分子は、少なくとも１つの機能性ＦｃＲｎ結合部位を含む。或る実施形態では、標的分子は、複数のＦｃＲｎ結合部位（例えば、改善された血清半減期のため）を含む。

【0194】

或る実施形態では、リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）融合タンパク質は、例えば、そのリボトキシン融合タンパク質が１つの標的に特異的である、単一特異的分子である。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、例えば、そのリボトキシン融合タンパク質が２つの標的に特異的である、二重特異的分子である。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、例えば、そのリボトキシン融合タンパク質が３つの標的に特異的である、三重特異的分子である。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、３よりも多い標的に特異的である。

【0195】

或る実施形態では、標的分子は、第１のエピトープに特異的な少なくとも第１のパラトープを含む。或る実施形態では、標的分子は、第１のエピトープに各々特異的な少なくとも２つの第１のパラトープを含む。或る実施形態では、標的分子は、第１のエピトープに特異的な第１のパラトープ、及び第２のエピトープに特異的な第２のパラトープを含む。

【0196】

先に述べたように、リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の標的分子を更に含んでもよい。例えば、或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、例えば、標的分子又は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のいずれかに連結された、第２の標的分子を更に含む。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、第３の標的分子を更に含む。或る実施形態では、リボトキシン融合タンパク質は、第４の標的分子を更に含む。

【0197】

或る実施形態では、第２の標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に連結され、上記標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端に連結される。或る実施形態では、第２の標的分子は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＣ末端に連結され、上記標的分子は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に連結される。

【0198】

或る実施形態では、第２の標的分子は、第１のエピトープに特異的な第１のパラトープを含む。或る実施形態では、第２の標的分子は、第２のエピトープに特異的な第２のパラトープを含む。或る実施形態では、標的分子は、第１のエピトープに特異的な第３のパラトープ、又は第３のエピトープに特異的な第４のパラトープを含む。

【0199】

先に述べたように、リボトキシン融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を更に含んでもよい。例えば、或る実施形態では、リボトキシン融合タンパクは、第２の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を更に含む。或る実施形態では、第２の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、修飾リボトキシン分子に連結される。或る実施形態では、第２の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、標的分子に連結される。

【0200】

上記標的は、任意の適切な標的であってもよい。標的として、細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、タンパク質、ペプチド、分子、細菌、ウイルス、原生生物、真菌等、又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、或る実施形態では、標的は受容体、例えば、細胞表面受容体である。具体的な標的の非限定的な例として、Ｈｅｒ２受容体、ＰＭＳＡ、ヌクレオリン、細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ受容体、腫瘍壊死因子受容体等）、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＤＲ５、ｅｐｈＡ２、Ｍｕｃ１、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、細菌及び真菌の細胞表面受容体、ＣＤ８０等が挙げられる。

【0201】

或る実施形態では、リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）融合タンパク質は、画像化試薬、放射性同位体、薬物、免疫複合体等、又はそれらの組合せを更に含む。画像化試薬、放射性同位体、薬物、又は免疫複合体は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び／又は標的分子に連結されてもよい。

【0202】

細胞透過性及び保持
（例えば、リボトキシン融合タンパク質の）修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子にとって、膜透過性を欠損する（又は野生型リボトキシンと比較して減少した膜透過性を有する）ことは有利な場合がある。これは、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子をより安全に患者に投与することを可能とし得る。例えば、（例えば、リボトキシン融合タンパク質の）修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子が標的分子から切断された場合、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、（リボトキシン融合タンパク質の標的分子の特異性に従い）意図される標的細胞でない細胞によって取り込まれることがない（又は、取り込まれる可能性が低い）。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、膜相互作用に重要な１又は複数のアミノ酸において突然変異を含む。例えば、或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、アミノ酸Ｒ１２０又はＲ１２１に突然変異を含む。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、突然変異Ｒ１２０Ｑ又はＲ１２１Ｑを含む。或る実施形態では、修飾リボトキシンは、突然変異Ｒ１２０Ｓ又はＲ１２１Ｓを含む。

【0203】

膜透過性の突然変異は、Ｔ細胞エピトープ部位における突然変異と必ずしも一体でなくてもよい。しかしながら、或る実施形態では、膜透過性の突然変異は、Ｔ細胞エピトープ部位における１又は複数の突然変異（上述の突然変異）と一体である。

【0204】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、その膜透過性を減少したが、その細胞毒性を減少しない突然変異を含む。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、その膜透過性を減少したが、そのリボ毒性を減少しない突然変異（例えば、リボソームのＳＲＬ部位に対するターゲッティング及び／又は結合は影響されない）を含む。

【0205】

或る実施形態では、分子は、（例えば、リボトキシン融合タンパク質の）修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子のＮ末端に結合され、上記分子は、標的細胞における修飾サルシン分子の取り込みに際して切断され得る。

【0206】

減少した膜透過性を有する修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、Ｒ１２０Ｑ、Ｒ１２０Ｓ、Ｒ１２１Ｑ、又はＲ１２１Ｓの突然変異に限定されない。例えば、α−サルシン、ギガンチン、若しくはクラビンの最初の２２アミノ酸、又はレストリクトシン若しくはマイトギリンの最初の２１アミノ酸は、膜相互作用（及びｒＲＮＡサルシンリッチループの標的部へのトラフィッキング）に重要な可能性がある。或る実施形態では、リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）の最初の２１アミノ酸又は２２アミノ酸のうち１又は複数を修飾して膜相互作用を変更する。例えば、或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、最初の５アミノ酸における欠失、最初の１０アミノ酸における欠失、最初の１５アミノ酸における欠失、最初の２０アミノ酸における欠失、最初の２２アミノ酸における欠失を含む。或る実施形態では、配列番号３８の１又は複数のアミノ酸を修飾、例えば、欠失、置換してもよい。代替的には、膜透過性を排除（又は減少）するのを補助するため、アミノ酸をＮ末端に付加（例えば、ｔａｇ等）してもよい。

【0207】

リボトキシン融合タンパク質は、野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）、リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）単独、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子単独、及び／又は標的分子単独と比較して、増強した特性（例えば、増強された細胞保持）を有し得る。例えば、或る実施形態では、標的分子は、その細胞透過性を増強するように修飾される。或る実施形態では、リボトキシンは、（上述の通り）その細胞透過性を減少するように修飾される。或る実施形態では、標的分子は細胞透過性を増強するように修飾され、リボトキシンはその細胞透過性を減少するように修飾される。

【0208】

或る実施形態では、融合タンパク質は、標的分子単独と比較して増加した細胞透過性を有する。或る実施形態では、融合タンパク質は修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子単独と比較して増加した細胞透過性を有する。或る実施形態では、融合タンパク質は、野生型リボトキシンと比較して細胞透過性を増加するように修飾される。或る実施形態では、融合タンパク質は、標的分子単独と比較して細胞透過性を増加するように修飾される。或る実施形態では、融合タンパク質は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子単独と比較して細胞透過性を増加するように修飾される。或る実施形態では、融合タンパク質は、野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）と比較して増加した細胞保持を有する。

【0209】

或る実施形態では、融合タンパク質は、標的分子単独と比較して増加した細胞保持を有する。或る実施形態では、融合タンパク質は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子単独と比較して増加した細胞保持を有する。或る実施形態では、融合タンパク質は、野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）と比較して細胞保持を増加するように修飾される。或る実施形態では、融合タンパク質は、標的分子単独と比較して細胞保持を増加するように修飾される。或る実施形態では、融合タンパク質は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子単独と比較して細胞保持を増加するように修飾される。

【0210】

リボトキシン融合タンパク質は、エンドソームから逃れることを可能とする手段（例えば、リンカー）を含んでもよい。或る実施形態では、リンカーは細胞質において切断されるように設計される。或る実施形態では、血液、例えば血清中でリンカーを切断することができない。

【0211】

発現
修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び／又はリボトキシン融合タンパク質は、任意の適切な発現系において発現されてもよい。例えば、或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び／又はリボトキシン融合タンパク質は、Ｅ．コリ発現系において発現される。或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び／又はリボトキシン融合タンパク質は、ピキア・パストリス発現系において発現される。

【0212】

医薬組成物
或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、医薬組成物を含むか、又はそれに含有される。或る実施形態では、上記融合タンパク質は、医薬組成物を含むか、又はそれに含有される。抗体及びペプチドに関する医薬組成物の例は、当業者によく知られており、以下に記載される。

【0213】

或る実施形態では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質は、増加した安定性（例えば、血清半減期）を与える分子（又は複数の分子）に結合される。デキストラン、様々なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びアルブミン結合ペプチドは、この目的の非常に一般的なスキャフォルドである（例えば、Dennis et al., 2002, Journal of Biological Chemistry 33:238390を参照されたい）。上記分子は、様々な機構、例えば、化学処理及び／又はタンパク質構造、配列の等の修飾等（例えば、Ashkenazi et al., 1997, Current Opinions in Immunology 9:195-200、米国特許第５，６１２，０３４号、米国特許第６，１０３，２３３号を参照されたい）によって、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質に接合されてもよい。上記分子（例えば、デキストラン、ＰＥＧ等）は、結合ループと反対側のタンパク質の末端においてシステインを組み込むことによって反応性スルフヒドリルにより、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質に結合されてもよい。かかる技術は、当該技術分野でよく知られている。別の例では、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質は、循環半減期を増加するため血清中においてアルブミンを利用するように、アルブミンに特異的に結合してもよい。

【0214】

増加したタンパク質安定性、又は増加したタンパク質安定性を与えるスキャフォルドへの修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子若しくは融合タンパク質の結合を与える医薬組成物の選択が、上記タンパク質の安定性を改善することができる唯一の方法ではない。或る実施形態では、本発明の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質を、安定性を変更するように修飾してもよい。この内容において「修飾した（修飾された）」又は「修飾」の用語は、１又は複数の突然変異、付加、欠失、置換、ジスルフィド結合の付加、物理的変更（例えば、架橋修飾、構成要素の共有結合、翻訳後修飾、例えば、アセチル化、グリコシル化、ペグ化、又はそれらの組合せ）等、又はそれらの組合せを含み得る。Gong et al. (2009, Journal of Biological Chemistry 284:14203-14210)は、増加した安定性を有する修飾タンパク質の例を示す。

【0215】

タンパク質の不安定な特性のため、医薬組成物は、温度制御された連続するサプライチェーンである、コールドチェーン（低温流通体系）により輸送され、保存されることが多い。例えば、或る医薬組成物は、摂氏約２度〜８度の温度で保存され、輸送され得る。コールドチェーンは、かかる医薬組成物のコストを飛躍的に増加する。いかなる理論又は機構にも束縛されることを意図するものではないが、（例えば、医薬組成物等を介して）本発明の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質の安定性を増加することは、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子又は融合タンパク質をコールドチェーンによって保存し、輸送する必要を軽減するか、又は排除するのに役立つ可能性があると考えられる。

【0216】

薬学的担体（ビヒクル）は従来のものであってもよいが、従来の担体（ビヒクル）に限定されない。例えば、E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)、及びD. B. Troy, ed. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD and Philadelphia, PA, 21st Edition (2006)は、１又は複数の抗体等の１又は複数の治療用化合物若しくは分子と追加の薬学的物質との薬学的送達に適した組成物及び製剤を記載する。米国特許第７，６４８，７０２号は、免疫グロブリンのＦｃドメインを含有するポリペプチドの長期保存に適した水性医薬組成物を特徴とする。

【0217】

医薬組成物としては、緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ｔｒｉｓ）、酢酸塩、ジエタノールアミン等）、アミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、ヒスチジン、グリシン、セリン、リシン、アラニン、グルタミン酸、プロリン）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、スクロース、グルコース、マンニトール、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、組換えアルブミン）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化水素、サクロシン（sacrosine）、γ−アミノ酪酸、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、亜鉛イオン、銅イオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、ＣＨＡＰＳ、スクロースモノラウレート、２−Ｏ−β−マンノグリセレート等、又はそれらの組合せを挙げることができる。本発明は、本明細書に開示される医薬組成物の成分に何ら限定されず、例えば、医薬組成物は、エアロゾル送達用の高圧ガス（例えば、ヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ））を含んでもよい。米国特許第５，１９２，７４３号は、（例えば、保存のため）再構成された場合に目的のタンパク質の安定性を改善し得るゲルを形成する製剤を記載する。

【0218】

医薬組成物は、一部又は全ての投与経路、例えば、局所投与（吸入及び経鼻投与を含む）、経口又は経腸投与、静脈内又は非経口投与、経皮投与、硬膜外投与等のため適切に構築され得る。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理学的食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的及び生理学的に許容可能な流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態）のため、従来の非毒性固体担体、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中立な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及び、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート等のｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性の助剤物質を含有してもよい。

【0219】

或る実施形態では、非経口製剤は、水、生理学的食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的及び生理学的に許容可能な流体をビヒクルとして含む注射用流体を含んでもよい。非限定的な例として、注射用トラスツズマブに対する製剤は、注射前に滅菌水で再構成される、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジン、トレハロース二水和物、及びポリソルベート２０を乾燥粉末としてガラス容器中に含む。非経口又は皮下の用途のための抗体及びタンパク質の他の製剤は当該技術分野でよく知られている。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、又はカプセルの形態）に対しては、従来の非毒性固体担体として、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中立な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤、及び、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレート等のｐＨ緩衝剤等の少量の非毒性の助剤物質を含有してもよい。タンパク質安定性を増加するための上述の医薬組成物及びタンパク質修飾は、米国特許出願公開第２００９／０３２６９２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるように適用され得る。

【0220】

修飾リボトキシン分子及び融合タンパク質を産生する方法
本明細書に記載される修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び融合タンパク質を産生する方法は当業者によく知られている。例えば、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、細菌系（例えば、限定されないが、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）を含む：Henze et al., Eur J Biochem 192: 127-131, 1990）、酵母系、ファージディスプレイ系、昆虫系、哺乳動物系、リボソームディスプレイ、シスディスプレイ系（Odegrip et al., 2004, PNAS 101, 2806-2810）等、又はそれらの組合せにおいて発現されてもよい。Ｐ．パストリス発現系におけるサルシンを含む融合タンパク質の構築は、Carreras-Sangra et al., 2012, PEDS 25, 425-35に記載される。本発明は、本明細書に記載される方法（例えば、タンパク質発現及びディスプレイ系）に限定されない。簡潔には、例として、上記方法は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に対する配列を有するベクターを得ること、発現系において修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子に対する配列のタンパク質生成物を産生すること、及びそのタンパク質生成物を少なくとも部分的に精製することを含んでもよい。

【0221】

また、本発明は、本明細書に記載される方法（例えば、下記実施例を参照されたい）によって産生された、対応する野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）と比較して減少した免疫原性を有する、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子を特徴とする。先に述べたように、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）は、対応する野生型リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）と比較して、向上した溶解性及び安定性、及び／又は減少した膜透過性若しくは増強した細胞保持を有してもよく、本明細書に記載される方法により産生されてもよい。

【0222】

リボトキシン融合タンパク質による疾患の治療又は管理
本開示の修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子は、疾患又は状態を治療又は管理するための重要な手段であってもよい。また、本開示は、疾患又は状態（例えば、哺乳動物、例えばヒトにおいて）を治療又は管理する方法を提供する。上記方法は、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子（又はそれを含む融合タンパク質）を得ること、及びその修飾リボトキシン分子又は融合タンパク質を患者に導入することを含み、上記修飾リボトキシン分子又は融合タンパク質が標的に結合し、その結合がその標的の中和又は破壊を引き起こすように機能する。

【0223】

任意には、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子（又はそれを含む融合タンパク質）は、その標的によるシグナル伝達事象を活性化又は阻害のいずれかを引き起こす第１又は第２の標的に結合する。修飾リボトキシン分子又はそれを含む融合タンパク質は、第１の標的を中和又は破壊するように機能する薬剤（例えば、化学物質、ペプチド、毒素）を含んでもよい。或る実施形態では、上記薬剤は、修飾リボトキシン分子又はそれを含む融合タンパク質として構築される場合、不活性であるか、又は減少した活性を有し、上記薬剤は、取込み又は再利用の際に活性化又は放出され得る。

【0224】

修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子（又はそれを含む融合タンパク質）融合タンパク質の結合は、標的の中和又は破壊を引き起こすように機能し得る。上記標的は、例えば、細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、タンパク質、ペプチド、分子、細菌、ウイルス、原生生物、真菌等、又はそれらの組合せであってもよい。上記標的は、上述の例に限定されない。例として、標的細胞（この例では腫瘍）の破壊は、以下の融合タンパク質、すなわち、修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子、及び特定の主要表面抗原（ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ヌクレオリン、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、幹細胞マーカー等）に向けられたＣＨ２ドメイン分子を含む標的分子を使用する治療法によって達成され得る。

【0225】

或る実施形態では、上記融合タンパク質は、免疫エフェクタ細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３のようなＴ細胞特異的抗原、又はＦｃγＲＩＩＩａのようなＮＫ細胞特異的抗原）に結合することができる。

【0226】

試料中の融合タンパク質（例えば、標的分子）の標的への結合を検出するため、様々な方法が使用され得る。かかる方法は、当業者によく知られている。

【0227】

ＤＮＡ配列及びコンストラクト
明白に記載されていないが、本発明は、本明細書に記載される修飾リボトキシン（例えば、α−サルシン、クラビン、ギガンチン、マイトギリン、又はレストリクトシン）分子及び融合タンパク質の産生のための単離されたＤＮＡ配列及び組換えコンストラクトも特徴とする。ＤＮＡ配列は、様々な発現宿主についてコドン最適化されてもよい。

【実施例】

【0228】

実施例１：α−サルシンにおけるＴ細胞エピトープのマッピング
以下の実施例はα−サルシンにおける可能性のあるＴ細胞エピトープのマッピングを説明する方法である。

【0229】

１５０アミノ酸のα−サルシン毒素配列に由来する重複ペプチド（及びリード二量体化α−サルシン毒素変異体の発現及び試験を可能とするためのヌル突然変異に対するペプチド）をＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング技術（イギリス、ケンブリッジのAntitope Ltd）を使用して試験した。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）は、全タンパク質、ペプチド、製剤及びＮＣＥ（新規化学物質）に対するヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞応答を特定するために使用される非常に正確で感受性のヒトｅｘ ｖｉｖｏＴ細胞アッセイ技術である。

【0230】

ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｔ細胞エピトープマッピング技術プロトコルは、１２アミノ酸によって重複する１５ｍｅｒのペプチドを使用する。１５−ｍｅｒペプチドの使用は、Ｔ細胞エピトープの場所の同定に役立つ。本研究のため、４６の１５−ｍｅｒペプチドを使用した。さらに、ヌル突然変異体Ｅ９６Ｑ及びＨ１３７Ｑにかかる２セットの５ペプチドを試験した。

【0231】

その集団におけるＨＬＡ−ＤＲアレルの広がりを最もよく表すため選択された５０の健康なＰＢＭＣドナーに対する増殖について１５−ｍｅｒのα−サルシンペプチドを試験した。図１。ＰＢＭＣ試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させてＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答の検出を排除した。各ドナーに由来するＰＢＭＣを解凍し、数を数え、生存率を評価した。細胞密度を２×１０^６〜３×１０^６のＰＢＭＣ／ｍｌ（増殖細胞ストック）に調整する前に、室温のＡＩＭ ＶＲ培養培地（イギリス、ペイズリーのInvitrogen）において細胞を回復させた。遊離Ｎ末端アミン及びＣ末端カルボン酸により１ｍｇ〜３ｍｇのスケールでペプチドを合成した。ペプチドを１０ｍＭの濃度までＤＭＳＯに溶解し、ウェルにおいてＡＩＭ ＶＲ培養培地に最終濃度５μＭの濃度まで希釈することによりペプチド培養ストックを調製した。各ペプチド及び各ドナーについて、平底９６ウェルプレートにおいて６つ組の培養物を確立した。陽性及び陰性の両方の対照培養物も６つ組で試験した。各ドナーについて、３つの対照（ＫＬＨタンパク質、並びにＩＦＶ及びＥＢＶに由来するペプチド）も含まれた。陽性対照について、ＰＨＡ（イギリス、ドーセットのSigma）を最終濃度２．５μｇ／ｍｌで使用した。

【0232】

０．７５μＣｉの３［Ｈ］−チミジン（イギリス、ビーコンスフィールドのPerkin ElmerR）を各ウェルに添加する前に培養物を合計６日間インキュベートした。ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩ細胞採取器を使用してフィルターマット上に採取する前に、培養物を更に１８時間インキュベートした。パラルクス（paralux）の低バックグラウンド測定モードでＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ（イギリス、ビーコンスフィールドのPerkin ElmerR）上のＭｅｌｔｉｌｅｘ（商標）（イギリス、ビーコンスフィールドのPerkin ElmerR）シンチレーション測定により、各ウェルのｃｐｍを決定した。

【0233】

データを非調整（全ての複製物）及び調整（異常値を除外）として表し、以前に確認したアッセイパラメーターを使用して分析した。応答ドナーの数（刺激指数（ＳＩ）２．０以上）が、完全なデータセットプラス２×標準偏差に対する平均応答（両方のデータセットで６．６％）よりも大きい場合にペプチドを陽性とした（ここで、ＳＩ＝試験ウェルの平均ｃｐｍ／培地対照ウェルの平均ｃｐｍ）。この方法で提示されるデータは、２．００以上のＳＩ、ｐ＜０．０５として示される。独立２標本ステューデントのｔ検定を使用する、試験ウェルと培地対照ウェルとのｃｐｍを比較することによる応答の有意性（ｐ＜０．０５）。

【0234】

α−サルシンのＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（イギリス、ケンブリッジのAntitope Ltd）Ｔ細胞エピトープマッピングの結果を図２に示す。２つのＴ細胞エピトープが同定され、１つは膜相互作用及びリボソームへのサルシンの結合に関与するＮ末端２２アミノ酸領域内に位置し（「サルシンエピトープ１」）、もう１つは触媒三残基の一部であるＨ１３７にかかる（「サルシンエピトープ２」）。サルシンエピトープ１について、以下に示されるようにペプチド２、ペプチド３、及びペプチド４の整列は、α−サルシン（配列番号５）のアミノ酸１０〜アミノ酸１８に対応する予測されたＨＬＡ−ＤＱコア９ｍｅｒ結合レジスタを明らかにした。

【0235】

ペプチド２：ＷＴＣＬＮＤＱＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号３７）

【0236】

ペプチド３：ＬＮＤＱＫＮＰＫＴＮＫＹＥＴＫ（配列番号３８）

【0237】

ペプチド４：ＱＫＮＰＫＴＮＫＹＥＴＫＲＬＬ（配列番号３９）

【0238】

ペプチド２及びペプチド３は、非調整と調整の両方のデータセットにおいて陽性Ｔ細胞応答を刺激した。ペプチド４は有意なＴ細胞応答を誘発しなかった。これは、おそらくはそのペプチド（野生型α−サルシンの残基９）において、ＨＬＡ−ＤＱへのペプチド結合を支持するＰ−１残基が欠如していることに起因する。

【0239】

サルシンエピトープ２について、以下に示されるペプチド４４、ペプチド４５、ペプチド５３、及びペプチド５４（ペプチド５３及びペプチド５４はＨ１３７ヌル突然変異体由来であった）の整列は、第２のＴ細胞エピトープ、すなわち野生型α−サルシン（配列番号４）のアミノ酸１３４〜アミノ酸１４２に対応する予測されるＨＬＡ−ＤＲコア９ｍｅｒ結合レジスタを明らかにした。

【0240】

ペプチド４４：ＶＦＣＧＩＩＡＨＴＫＥＮＱＧＥ（配列番号４０）

【0241】

ペプチド４５：ＧＩＩＡＨＴＫＥＮＱＧＥＬＫＬ（配列番号４１）

【0242】

ペプチド５３：ＶＦＣＧＩＩＡＱＴＫＥＮＱＧＥ（配列番号４２）

【0243】

ペプチド５４：ＧＩＩＡＱＴＫＥＮＱＧＥＬＫＬ（配列番号４３）

【0244】

ペプチド４４、ペプチド４５、ペプチド５３、及びペプチド５４は、非調整及び調整の両方のデータセットにおいて陽性Ｔ細胞応答を刺激した。このエピトープは触媒残基Ｈ１３７にかかり、ヌル突然変異Ｈ１３７Ｑを含むペプチドは免疫原性でもある。

【0245】

実施例２−アルファサルシンの単一エピトープ変異体の設計
以下の実施例は、α−サルシンの単一エピトープ変異体の設計を記載する。

【0246】

その細胞毒性機能を維持しながら野生型α−サルシンタンパク質の免疫原性を減少するか排除するため、Ｔ細胞エピトープマッピングで同定された免疫原性の領域を修飾する方法で個々のα−サルシンの単一エピトープ変異体を設計した。かかる変異体の設計をα−サルシンタンパク質構造のコンピュータモデリングによって支援した。特定の場所におけるα−サルシンの修飾に対する制約を考慮し、α−サルシン毒素からのＴ細胞エピトープの除去のため、（二次及び三次のタンパク質構造、また同じくアミノ酸側鎖とタンパク質のコアとの可能性のある相互作用を考慮して）適切なアミノ酸変化を設計した。具体的なアミノ酸変化の選択は、特に、アミノ酸がα−サルシン毒素の既知の又は予想される機能、またα−サルシンの正しい折り畳みに寄与し得るようにアミノ酸が配置される場合に、利用可能な生物物理学及び生化学のデータによる影響を受けた。

【0247】

実施例１で同定された２つのＴ細胞エピトープ（配列番号５及び配列番号４）内、及びそのすぐ近く（Ｐ−１、エピトープに対してすぐのＮ末端のアミノ酸）の両方に多くの単一アミノ酸突然変異を作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイにおいて毒性活性を評価した。

【0248】

より具体的には、図３に示される単一の突然変異を有する２９の単一エピトープ変異体をα−サルシン野生型発現プラスミドｐＲＣＴ０２−００１をテンプレートとして使用し、ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を適用して作製した。単一エピトープ変異体をＴ７発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen、カタログ番号６９７４４）のＮｄｅＩ部位の下流にクローニングした。発現プラスミド（ｐＲＣＴ０２−００２）に由来するヌル突然変異（Ｈ１３７Ｑ）が免疫原性であると以前に示されていることから、代替の非免疫原性ヌル突然変異（Ｅ９６Ｑ）もＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発（ｐＲＣＴ０２−０３６）を使用して含めた。全てのコンストラクトをシーケンシングによって確認した。

【0249】

上記単一エピトープ変異体の毒性活性を評価するため、ＴｎＴ（商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega、カタログ番号Ｌ４６１０）を用いて、無細胞ＩＶＴＴアッセイを行った。簡潔には、野生型α−サルシン（ｐＲＣＴ０２−００１）、α−サルシンＨ１３７Ｑ（ｐＲＣＴ０２−００２）、α−サルシンＥ９６Ｑ（ｐＲＣＴ０２−０３６）、又は図３に示される単一突然変異を有する２９の単一エピトープ変異体のいずれかを含むｐＥＴ２２ｂプラスミドを１２．５μｌの反応物当たり２００ｎｇ〜３．１２５ｎｇの範囲の濃度で試験した。試験ＤＮＡをＩＶＴＴ反応混合物と合わせ、２２℃で４５分間インキュベートした。ＴｎＴ（商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega、カタログ番号Ｌ４６１０）により提供された２５０ｎｇのＴ７ルシフェラーゼプラスミドを添加し、その反応物を２４℃で更に９０分間インキュベートした。製造業者の指示書に従い、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（商標）試薬（Promega、カタログ番号Ｅ２５１０）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。発光をＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（BMG Labtech）で測定した。ＰＲＣＴ０２−００１（陽性対照）及びｐＲＣＴ０２−００２（陰性対照）のプラスミドを各実験に含めた。結果を表９に要約する。

【0250】

【表9】

【0251】

上記データは、エピトープ２におけるＩ１３４Ａを除いて、２９のα−サルシンの単一エピトープ変異体のうち２８（エピトープ１で１５／１５、エピトープ２で１３／１４）が、野生型α−サルシン（ｐＲＣＴ０２−００１）と同様のレベルでルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を顕著に阻害する能力を維持したことを示す。変異体の大半が野生型α−サルシン（アッセイ変化に供する）に同様のレベルでルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を阻害した。幾つかの変異体は、予想外にも野生型α−サルシンよりも高いレベルでルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を阻害した。３つの単一エピトープ変異体（Ｋ１３９Ｇ、Ｋ１３９Ｎ、及びＱ１４２Ｄ）に関するデータは、翻訳の阻害の減少を示唆した（１．５超の相対ＩＣ５０）。ヌル突然変異体サルシンＥ９６ＱをコードするＲＣＴ０２−０３６では阻害は観察されなかった。

【0252】

実施例３−アルファサルシンの複数のエピトープ変異体
以下の実施例は、サルシンエピトープ１に１つの突然変異、サルシンエピトープ２に１つの突然変異を有するα−サルシンの複数のエピトープ変異体の設計及び構築を記載する。

【0253】

野生型α−サルシン発現プラスミドｐＲＣＴ０２−００１をテンプレートとして使用し、表１０に詳述されるプラスミドを生じるＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を適用して二重エピトープ変異体を作製した。二重エピトープ変異体をＴ７発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen、カタログ番号６９７４４）のＮｄｅＩ部位の下流にクローニングした。全てのコンストラクトをＤＮＡシーケンシングによって確認した。

【0254】

【表10】

【0255】

二重エピトープ変異体の毒性活性を評価するため、一部修飾を加えた製造業者の指示書に従って、ＴｎＴ（商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega、カタログ番号Ｌ４６１０）により無細胞ＩＶＴＴアッセイを行った。簡潔には、野生型αサルシン（ｐＲＣＴ０２−００１）、αサルシン−Ｈ１３７Ｑ（ｐＲＣＴ０２−００２）、又は二重エピトープ変異体のいずれかを含むｐＥＴ２２ｂプラスミドを、１２．５μｌの反応物当たり２００ｎｇ〜３．１２５ｎｇの範囲の濃度で試験した。試験ＤＮＡをＩＶＴＴ反応混合物と合わせ、２２℃で４５分間インキュベートした。ＴｎＴ（商標）Ｔ７ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega、カタログ番号Ｌ４６１０）によって提供される２５０ｎｇのＴ７ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡを添加し、その反応物を２４℃にて更に９０分間インキュベートした。製造業者の指示書に従い、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（商標）試薬（Promega、カタログ番号Ｅ２５１０）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（BMG Labtech）を使用して発光を測定した。ｐＲＣＴ０２−００１（陽性対照）及びｐＲＣＴ０２−００２（陰性対照）のプラスミドを各実験に含めた。αＳ−ＷＴ（ｐＲＣＴ０２−００１）のＩＣ５０を同じプレートに対してアッセイした二重エピトープ変異体のＩＣ５０で除して相対ＩＣ５０値を算出した。結果を上記表９に要約する。上記データは、２０の二重エピトープ変異体のうち１８が、野生型α−サルシン（ｐＲＣＴ０２−００１）の２倍以内のレベルでルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を阻害する能力を維持したことを示した。

【0256】

タンパク質産生及び更なる分析のため、表１１に示されるように８つの二重エピトープ変異体を選択した。これらは、部分的に活性データ（表１０に要約される）及び他の選択基準に基づき、例えば、Ｑ１４２Ｎが多数のより活性の低い変異体と関連することに基づいてそれを排除した。表１１に詳述される発現ベクターを作製するため、８つの選択された二重エピトープ変異体をコードする遺伝子を、元の配列と比較して改善されたプロセッシング及びエクスポートを有することが示されている（Lacadena J., et al. 1994）Ｔ７発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen）の修飾ＯＭＰＡ（外膜タンパク質Ａ）リーダーペプチドの下流にクローニングした。さらに、抗Ｈｉｓ抗体を使用する検出を可能とするため、またタンパク質精製において使用するため、６×Ｈｉｓタグ（配列番号５０）を上記タンパク質のＣ末端に遺伝子融合した。

【0257】

【表11】

【0258】

上記二重エピトープ変異体を発現するため、シャペロニンＧｒｏＥＬ／Ｓを過剰発現するＥ．コリＢＬ２１株ＳＨｕｆｆｌｅ（商標） Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ（NEB、カタログ番号Ｃ３０２９Ｈ）誘導体を使用した。野生型α−サルシン及びヌル突然変異体（α−サルシン−Ｈ１３７Ｑ）をコードする発現プラスミドと共に、二重変異体をコードする発現プラスミドによって細菌を形質転換し、これらを播種した。単一のコロニーを選択し、２ＹＴブロス中、３７℃で終夜成長させた。翌日、終夜培養物を２ＹＴブロスに１：２０で希釈し、３７℃での細菌成長をＯＤ６００の測定によりモニターした。ＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭを与えることによりＯＤ６００ｎｍ＝１．０でタンパク質発現を誘導し、その後、遠心分離によって細胞を採取する前に培養物を２０℃で終夜成長させた。５０ｍｌの培養物当たり、プロテアーゼ阻害剤（Roche、カタログ番号０４６９３１５９００１）を含むＤｎａｓｅ Ｉ（Roche、カタログ番号０４７１６７２８００１）を含有する１０ｍｌのＢ−ＰＥＲ（Pierce、カタログ番号７８２４８）試薬に細胞ペレットを再懸濁した。不溶性タンパク質を製造業のプロトコルに従って遠心分離により除去し、可溶性タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（カタログ番号５００−０００６）を使用して定量した。タンパク質ゲルにウェスタンブロットを行い、抗Ｈｉｓ抗体（Sigma、カタログ番号Ａ７０５８）を使用して発現されたタンパク質を検出した。ウェスタンブロットは、二重エピトープ変異体の発現されたタンパク質のかなりの割合が可溶性であったことを示した。図４。わずかな可溶性画分を伴うかなりの不溶性画分を示した変異体Ｙ１８Ｋ Ｙ１３９Ｄ（ｐＲＣＴ０２−０５８）が例外であった。図４。

【0259】

活性を評価するため、先に述べたように可溶性物質をＩＶＴＴアッセイにおいて試験した。第１のウェルにおいて１ｎｇの可溶性タンパク質抽出物から開始する４倍の希釈系列を行った後、２５０ｎｇのＴ７ルシフェラーゼプラスミドを各反応物に添加する前に、ＩＶＴＴ試薬と共に３０℃にて１５分間予備インキュベートした。反応物を３０℃で９０分間インキュベートし、上記の通りＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（商標）試薬（Promega、カタログ番号Ｅ２５１０）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。二重突然変異体の多くが、顕著に多い量の可溶性物質の産生を伴って、野生型αサルシンと比較して増強された発現レベルを示した。二重エピトープ変異体粗抽出物における可溶性物質は、αサルシンＨ１３７Ｑと比較してＩＶＴＴアッセイにおいて著しくより活性であり、そのタンパク質が正しく折り畳まれたことを示唆する。図５。一部のバックグラウンド活性はαサルシンＨ１３７Ｑに由来する可溶性抽出物と関連したが、これは、α−サルシンＨ１３７Ｑタンパク質が精製されていないため、他の細菌宿主タンパク質を含有したという事実による可能性がある。

【0260】

要約すると、２０のα−サルシンの二重エピトープ変異体をコードする遺伝子を作製し、クローニングし、ＩＶＴＴアッセイにおいて試験した。もちろん、１８の変異体はＩＶＴＴアッセイにおいて野生型αサルシンの２倍以内の活性を維持した。８つの選択された二重エピトープ変異体の発現及び活性を、発現ベクター中にクローニングした後にさらに分析した。野生型αサルシンと比較して、Ｙ１８Ｋ Ｙ１３９Ｄ（ｐＲＣＴ０２−０５８）以外の全ての変異体に対して可溶性タンパク質の発現が改善され、これら変異体の各々に由来する可溶性タンパク質を抽出して、ＩＶＴＴアッセイにおいて活性であることを示した。

【0261】

実施例４−アルファサルシンの三重変異体及び四重変異体
以下の実施例は、１）サルシンエピトープ１に２つの突然変異とサルシンエピトープ２に１つの突然変異とを有するか、又はサルシンエピトープ１に１つの突然変異とサルシンエピトープ２に２つの突然変異を有する、いずれかのα−サルシンの三重変異体、及び２）サルシンエピトープ１に２つの突然変異とサルシンエピトープ２に２つの突然変異とを有するα−サルシンの四重変異体の設計及び構築を記載する。

【0262】

７つの三重変異体及び２つの四重変異体をα−サルシン−ＷＴ発現プラスミドｐＲＣＴ０２−００１をテンプレートとして使用し、表１２に詳述されるプラスミドを生じるＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を適用することによって作製した。エピトープ変異体をＴ７発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen、カタログ番号６９７４４）のＮｄｅＩ部位の下流にクローニングした。全てのコンストラクトをＤＮＡシーケンシングにより確認した。

【0263】

【表12】

【0264】

三重変異体及び四重変異体の毒性活性を実施例３に記載されるように評価した。結果を図６に示し、上記表１２に要約する。上記データは、９つのα−サルシンの三重変異体及び四重変異体のうち４つがルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＣＴ０２−００１）の翻訳を阻害する能力を維持したことを示した。

【0265】

タンパク質産生及び更なる分析のため、表１３に示される４つの三重変異体を活性データ（表１２に要約される）に基づいて選択した。表１３に詳述される発現ベクターを作製するため、４つの選択された三重変異体をコードする遺伝子を、元の配列と比較して改善されたプロセッシング及びエクスポートを有することが示されている（Lacadena J., et al. 1994）Ｔ７発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen）の修飾ＯＭＰＡ（外膜タンパク質Ａ）リーダーペプチドの下流にクローニングした。さらに、抗Ｈｉｓ抗体を使用する検出を可能とするため、またタンパク質生成を支援するため６×Ｈｉｓタグ（配列番号５０）を上記タンパク質のＣ末端に遺伝子融合した。

【0266】

【表13】

【0267】

α−サルシンの三重変異体を実施例３の通り発現した。図７Ａに示されるように、そのタンパク質ゲルにウェスタンブロットを行い、抗Ｈｉｓ抗体（Sigma、カタログ番号Ａ７０５８）を使用して発現したタンパク質を検出した。図７Ａは、三重変異体に対して発現されたタンパク質のかなりの割合が可溶性であったことを示す。全ての三重変異体によって産生された可溶性物質の量は、α−サルシン−ＷＴに匹敵した。ｐＲＣＴ０２−０９２及びｐＲＣＴ０２−０９３からのタンパク質発現は、ｐＲＣＴ０２−０９０及びｐＲＣＴ０２−０９１から発現されるものよりも多いことがわかった。

【0268】

α−サルシンの三重変異体をバッチ精製するため、シャペロニンＧｒｏＥＬ／Ｓを過剰発現するＥ．コリＢＬ２１株ＳＨｕｆｆｌｅ（商標） Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ誘導体（NEB、カタログ番号Ｃ３０２９Ｈ）を使用した。α−サルシン−ＷＴ及びヌル突然変異体（αＳ−Ｈ１３７Ｑ）をコードする発現プラスミドと共に、三重変異体をコードする発現プラスミドによって細菌を形質転換し、これらを播種した。単一のコロニーを選択し、２ＹＴブロス中、３７℃で終夜成長させた。翌日、終夜培養物を５００ｍｌの２ＹＴブロスに１：２０で希釈し、３７℃での細菌成長をＯＤ６００の測定によりモニターした。ＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭを与えることによりＯＤ６００ｎｍ＝１．０でタンパク質発現を誘導し、その後、遠心分離によって細胞を採取する前に培養物を２０℃で終夜成長させ、−８０℃で凍結した。プロテアーゼ阻害剤（Roche、カタログ番号０４６９３１５９００１）を含むＤｎａｓｅ Ｉ（Roche、カタログ番号０４７１６７２８００１）を含有するＢ−ＰＥＲ（Pierce、カタログ番号７８２４８）に細胞ペレットを再懸濁した。不溶性タンパク質を製造業のプロトコルに従って遠心分離により除去した。可溶性タンパク質を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール中で２倍希釈し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び４０ｍＭイミダゾールに（結合バッファー）によって予め平衡化した１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース（Qiagen、カタログ番号１０１８２４４）の添加の前に遠心分離によって清澄にし、４℃で回転しながら終夜インキュベートした。結合していないタンパク質を遠心分離の後に結合バッファーによる１０ＣＶ洗浄で除去した。その後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール（洗浄バッファー）による１０ＣＶ洗浄で開始し、続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾール（溶離バッファー）による溶離で段階溶離を行った。溶離液に由来する１ｍｌの画分を回収し、タンパク質ゲル上で流した。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換し、可溶性タンパク質をBio-Radのタンパク質アッセイ（カタログ番号５００−０００６）を使用して定量した。その後、全てのタンパク質を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１μｇの各試料をＮｕＰａｇｅ４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen、カタログ番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上にのせ、２００Ｖで３５分間流した。図７Ｂ。

【0269】

精製した三重変異体の活性を評価するため、上述のＩＶＴＴアッセイを一部修正して行った。簡潔には２５０ｎｇのＴ７ルシフェラーゼプラスミドを各反応物に添加する前に、５ｎｇの精製タンパク質、及びその１０倍希釈物をリボソームと共に３０℃で１５分間予備インキュベートした。その反応物を３０℃で９０分間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を上記の通りＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ（商標）試薬を使用して測定した。図８に示されるように、全ての変異体は、野生型α−サルシンに匹敵する活性を維持した。

【0270】

標的としてＴリンパ芽球細胞株Ｊｕｒｋａｔを使用して細胞の細胞毒性アッセイにおいて精製タンパク質の細胞毒性活性を測定した。簡潔には、対数増殖期のＪｕｒｋａｔ細胞を１．２５×１０^５細胞／ｍｌまで希釈し、５０μｌを９６ウェルのホワイトウォール組織培養プレート（Corning、カタログ番号３６１０）の各ウェルに分配した。各試験試料の７点の５倍希釈系列を含む希釈プレートを調製し、５０μｌの各希釈系列をＪｕｒｋａｔ細胞に直接移した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞プレートをインキュベータに戻し、更に７２時間置いた。インキュベーションの後、プレートを室温で１０分間平衡化した。１００μｌのＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）試薬（Promega、カタログ番号Ｇ７５７１）を各ウェルに添加することによってプレートを展開し、ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（BMG Labtech）を使用して１秒の発光読取りを撮った。

【0271】

精製した三重変異体を使用して、効率的なＪｕｒｋａｔ細胞の殺傷が全ての変異体により観察され（図９）、そのタンパク質が細胞膜を越えて移行し、α−サルシン−ＷＴと同様にタンパク質合成を阻害することを示した。

【0272】

要約すると、７つの三重変異体及び２つの二重変異体を作製し、ＩＶＴＴアッセイにおいて試験した。これらのデータは、三重変異体のうち４つがルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳を阻害する能力を維持したことを示した。これらの変異体は各々、エピトープ１に１つの突然変異、及びエピトープ２に２つの突然変異を含んだ。２つの突然変異を各エピトープに含む四重変異体と同様、エピトープ１に２つの突然変異及びエピトープ２に１つの突然変異を含む変異体は全て、ＩＶＴＴアッセイにおいて活性の欠陥を有することが示された。活性を維持した４つの三重変異体を更に分析して発現及び活性を評価した。これらの三重変異体に由来する著しいレベルのタンパク質は可溶性であり、精製タンパク質はＩＶＴＴアッセイ、また細胞の細胞毒性アッセイにおいて活性であることが示された。

【0273】

実施例５−Ａ−サルシンのエピトープ変異体の免疫原性試験
以下の実施例は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）全タンパク質タイムコースＴ細胞アッセイを使用する最適化されたエピトープ変異体の免疫原性試験を記載する。

【0274】

免疫原性の評価のため、同定されたリード及びバックアップの最適化されたα−サルシン毒素エピトープ変異体（上記を参照されたい）を発現し（ヌル突然変異体として）、精製し、減少した免疫原性の危険性を確認するためＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）全タンパク質タイムコースＴ細胞アッセイにおいて精製した野生型（ヌル突然変異体）α−サルシン毒素と比較した。

【0275】

選択された健康なドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣのバルク培養を野生型及び最適化変異体α−サルシン毒素の存在下で確立する。増殖（３Ｈ−チミジン取り込み）及びＩＬ−２サイトカイン分泌（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）によってＴ細胞活性化の評価を行いながら５日目〜８日目にＴブラストのアリコートをバルク培養から除去する。

【0276】

２０のＨＬＡ型の健康なドナーに由来するバフィコートを使用して生理学的レベルのＡＰＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣを単離する。ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答の検出を排除するためＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させる；各ドナーをキーホールリンペットヘモシアニン（有力なネオ抗原）又は破傷風トキソイド（リコール抗原）を含む再現性制御抗原（reproducibility control antigens）に対して試験する；その後、α−サルシン毒素特異的Ｔ細胞活性化を増殖（３Ｈ−チミジン取り込み）及びＩＬ−２分泌（ＥＬＩＳｐｏｔ）により特定する；統計学的分析及び頻度の分析を含む追加の情報によって支持される以前に確認されたアッセイパラメーターを使用してデータを分析し、それにより２．０超の刺激指数（ＳＩ）の応答を陽性と採点する；最適化されたα−サルシン変異体に関するデータを野生型α−サルシン毒素と比較する。これは、野生型と比較した最適化α−サルシン変異体の免疫原性の相対的なリスクの評価のため提供される；最適化α−サルシン変異体に関する免疫原性データを、臨床段階の抗体及び既知の免疫原性を有するタンパク質の範囲に関するベンチマークＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）データとも比較する。これは、リード及びバックアップの最適化α−サルシン変異体に関する臨床免疫原性のリスクの評価のため提供される。ドナーＭＨＣクラスＩＩアロタイプとリード及びバックアップの最適化α−サルシン変異体に対するＴ細胞応答との間の任意の関連により評価を構成する。

【0277】

以下の米国特許、すなわち、米国特許第７，７５０，１３６号、米国特許第８，２５２，８９７号、米国特許出願公開第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願公開第２００７／０１３５６２０号の開示は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

【0278】

本明細書に記載されるものに加えて、上述の記載より本発明の様々な修飾が当業者に明らかであろう。また、かかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。本出願において引用される各参照は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

【0279】

本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、当業者であれば本発明の範囲を超えない修飾がそれらに対して行われ得ることをすぐに理解するであろう。

【0280】

追加の開示：

【0281】

以下の開示は特許請求の範囲ではない。

【0282】

追加の実施形態−修飾リアルサルシン１エピトープ

【0283】

１．修飾α−サルシンＴ細胞エピトープであって、その修飾Ｔ細胞エピトープがＸＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号４４）（ここで、ＸはＱ又はＤＱである）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープの１又は複数のアミノ酸置換を含み、上記修飾Ｔ細胞エピトープが野生型Ｔ細胞エピトープと比較してヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に対して減少した結合を有する、修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0284】

２．上記修飾Ｔ細胞エピトープが、ＱＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号５）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープのＰ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、若しくはＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基の１若しくは複数において、又はＤＱＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープのＰ⁻１、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、若しくはＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基の１若しくは複数において修飾される、請求項１に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0285】

３．上記修飾Ｔ細胞エピトープがＸ_１Ｘ_２ＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６（ここで、Ｘ_１がＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡであり、Ｘ_２がＫ又はＬであり、Ｘ_３がＰ又はＩであり、Ｘ_４がＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨであり、Ｘ_５がＮ、Ｒ、Ｋ又はＡであり、Ｘ_６がＹ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、又はＷである）のアミノ酸配列（配列番号８）を有するか、又は上記修飾Ｔ細胞エピトープがＸ_１Ｘ_２Ｘ_３ＮＸ_４ＫＸ_５Ｘ_６ＫＸ_７（ここで、Ｘ_１がＤ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_２がＱ、Ｋ、Ｒ又はＡであり、Ｘ_３がＫ又はＬであり、Ｘ_４がＰ又はＩであり、Ｘ_５がＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨであり、Ｘ_６がＮ、Ｒ、Ｋ又はＡであり、Ｘ_７がＹ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、又はＷである）のアミノ酸配列（配列番号９）を有する、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0286】

４．上記修飾Ｔ細胞エピトープが配列番号５のＰ１（Ｑ）及びＰ７（Ｎ）又はＰ９（Ｙ）のアンカー残基において修飾される、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0287】

５．上記修飾Ｔ細胞エピトープが配列番号５のＰ７（Ｎ）及びＰ１（Ｑ）又はＰ９（Ｙ）のアンカー残基において修飾される、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0288】

６．上記修飾Ｔ細胞エピトープが配列番号５のＰ９（Ｙ）及びＰ７（Ｎ）又はＰ１（Ｑ）のアンカー残基において修飾される、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0289】

追加の実施形態−修飾リアルサルシン２エピトープ

【0290】

１．修飾α−サルシンＴ細胞エピトープであって、その修飾Ｔ細胞エピトープがＩＩＡＨＴＫＥＮＱ（配列番号４）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープの１又は複数のアミノ酸置換を含み、上記修飾Ｔ細胞エピトープが野生型Ｔ細胞エピトープと比較して減少したＴ細胞応答を誘発する、修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0291】

２．修飾α−サルシンＴ細胞エピトープであって、その修飾Ｔ細胞エピトープがＩＩＡＨＴＫＥＮＱ（配列番号４）のアミノ酸配列を有する野生型Ｔ細胞エピトープのＰ１、Ｐ６、Ｐ７、又はＰ９のＭＨＣクラスＩＩアンカー残基の１又は複数において修飾される、修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0292】

３．上記修飾Ｔ細胞エピトープがＸ_１Ｘ_２ＡＨＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＮＸ_６（ここで、Ｘ_１がＩ又はＡであり、Ｘ_２がＩ又はＶであり、Ｘ_３がＴ又はＱであり、Ｘ_４がＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮであり、Ｘ_５がＥ又はＤであり、Ｘ_６がＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧである）のアミノ酸配列（配列番号１１）を有する、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0293】

４．上記修飾Ｔ細胞エピトープが配列番号４のＰ６（Ｋ）及びＰ９（Ｑ）のアンカー残基において修飾される、請求項２に記載の修飾α−サルシンＴ細胞エピトープ。

【0294】

追加の実施形態−修飾サルシン分子
１．修飾サルシン分子又はそのフラグメントであって、配列番号１に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＸＫＮＰＫＴＮＫＹ（配列番号４４）（ここで、ＸはＱ又はＤＱである）、及びＩＩＡＨＴＫＥＮＱ（配列番号４）から選択される配列における少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む少なくとも１つの修飾Ｔ細胞エピトープコアを含み、上記修飾サルシン分子又はそのフラグメントがタンパク質合成を阻害し、野生型α−サルシン（配列番号１）と比較して減少したＴ細胞応答を誘発する、修飾サルシン分子又はそのフラグメント。

【0295】

２．上記修飾サルシン分子が野生型α−サルシン（配列番号１）のＤ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の１又は複数において少なくとも１つの第１の突然変異を含む、実施形態１に記載の修飾サルシン分子。

【0296】

３．上記修飾サルシン分子が野生型α−サルシン（配列番号１）のＩ１３４、Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数において少なくとも１つの第１の突然変異を含む、実施形態１に記載の修飾サルシン分子。

【0297】

４．上記修飾サルシン分子が野生型α−サルシン（配列番号１）のＤ９、Ｑ１０、Ｐ１３、Ｔ１５、Ｎ１６、又はＹ１８の１又は複数において少なくとも１つの第１の突然変異を含み、野生型α−サルシン（配列番号１）のＩ１３４、Ｋ１３９、Ｅ１４０、又はＱ１４２の１又は複数において少なくとも１つの第２の突然変異を含む、実施形態１の修飾サルシン分子。

【0298】

５．実施形態１の修飾サルシン分子と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【0299】

６．少なくとも１つの細胞結合リガンドを更に含む、実施形態１に記載の修飾サルシン分子。

【0300】

７．上記細胞結合リガンドが抗体若しくはその抗体結合フラグメント、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、又はインスリンである、実施形態６に記載の修飾サルシン分子。

【0301】

８．上記サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ−５である、実施形態７に記載の修飾サルシン分子。

【0302】

９．上記抗体がモノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、遺伝子改変されている、又はグラフトされている、実施形態７に記載の修飾サルシン分子。

【0303】

１０．上記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、（ＳｃＦｖ）２、単鎖結合ポリペプチド、ＶＨ、又はＶＬである、実施形態７に記載の修飾サルシン分子。

【0304】

１１．実施形態６の修飾サルシン分子と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む組成物。

【0305】

１２．野生型アルファサルシン（配列番号１）と比較して減少したＴ細胞応答を誘発する修飾サルシンタンパク質であって、その修飾サルシンタンパク質のアミノ酸配列が、
ＡＶＴＷＴＣＬＮＸ_１Ｘ_２ ＫＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６ＥＴ ＫＲＬＬＹＮＱＮＫＡ ＥＳＮＳＨＨＡＰＬＳ ＤＧＫＴＧＳＳＹＰＨ ＷＦＴＮＧＹＤＧＤＧ ＫＬＰＫＧＲＴＰＩＫ ＦＧＫＳＤＣＤＲＰＰ ＫＨＳＫＤＧＮＧＫＴ ＤＨＹＬＬＥＦＰＴＦ ＰＤＧＨＤＹＫＦＤＳ ＫＫＰＫＥＮＰＧＰＡ ＲＶＩＹＴＹＰＮＫＶ ＦＣＧＸ_７ＩＡＨＴＸ_８Ｘ_９ ＮＸ_１０ＧＥＬＫＬＣＳＨ
（ここで、修飾サルシンタンパク質のアミノ酸配列が野生型サルシンタンパク質（配列番号１）と同一でない限り、Ｘ_１〜Ｘ_１０は任意のアミノ酸でもよい（配列番号１２））
を含む、修飾サルシンタンパク質。

【0306】

１３．Ｘ_１がＤ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_２がＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡであり、Ｘ_３がＰ又はＩであり、Ｘ_４がＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨであり、Ｘ_５がＮ、Ｒ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ_６がＹ、Ｈ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ_７がＩ又はＡであり、Ｘ_８がＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮであり、Ｘ_９がＥ又はＤであり、Ｘ_１０がＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧである（配列番号１３）、実施形態１２に記載の修飾サルシンタンパク質。

【0307】

１４．少なくとも１つの修飾Ｔ細胞エピトープを含む修飾サルシンタンパク質又はそのフラグメントであって、その少なくとも１つの修飾Ｔ細胞エピトープが配列番号１のポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、上記修飾サルシンタンパク質又はそのフラグメントが野生型アルファサルシン（配列番号１）と比較して減少したＴ細胞応答を誘発する、修飾サルシンタンパク質又はそのフラグメント。

【0308】

追加の実施形態−修飾サルシンをコードする核酸

【0309】

１．修飾サルシンタンパク質をコードする核酸であって、その修飾サルシンタンパク質が野生型サルシンタンパク質（配列番号１）と比較して減少した免疫応答を誘発する性質を有し、上記修飾サルシンタンパク質のアミノ酸配列が、
ＡＶＴＷＴＣＬＮＸ_１Ｘ_２ ＫＮＸ_３ＫＸ_４Ｘ_５ＫＸ_６ＥＴ ＫＲＬＬＹＮＱＮＫＡ ＥＳＮＳＨＨＡＰＬＳ ＤＧＫＴＧＳＳＹＰＨ ＷＦＴＮＧＹＤＧＤＧ ＫＬＰＫＧＲＴＰＩＫ ＦＧＫＳＤＣＤＲＰＰ ＫＨＳＫＤＧＮＧＫＴ ＤＨＹＬＬＥＦＰＴＦ ＰＤＧＨＤＹＫＦＤＳ ＫＫＰＫＥＮＰＧＰＡ ＲＶＩＹＴＹＰＮＫＶ ＦＣＧＸ_７ＩＡＨＴＸ_８Ｘ_９ ＮＸ_１０ＧＥＬＫＬＣＳＨ
（ここで、修飾サルシンタンパク質のアミノ酸配列が野生型サルシンタンパク質（配列番号１）と同一でない限り、Ｘ_１〜Ｘ_１０は任意のアミノ酸であってもよい（配列番号１２））
を含む、修飾サルシンタンパク質をコードする核酸。

【0310】

１．１．上記修飾サルシンタンパク質がリボソームに対してタンパク質合成を阻害する、実施形態１に記載の修飾サルシンタンパク質をコードする核酸。

【0311】

２．Ｘ_１がＤ、Ａ、又はＴであり、Ｘ_２がＱ、Ｋ、Ｒ、又はＡであり、Ｘ_３がＰ又はＩであり、Ｘ_４がＴ、Ｇ、Ｑ、又はＨであり、Ｘ_５がＮ、Ｒ、Ｋ、又はＡであり、Ｘ_６がＹ、Ｈ、Ｋ、又はＲであり、Ｘ_７がＩ又はＡであり、Ｘ_８がＫ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、又はＮであり、Ｘ_９がＥ又はＤであり、Ｘ_１０がＱ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、又はＧである（配列番号１３）、実施形態１に記載の修飾サルシンタンパク質をコードする核酸。

【0312】

３．上記免疫応答がＴ細胞活性である、実施形態１に記載の修飾サルシンタンパク質をコードする核酸。

【0313】

４．（ａ）標的部分をコードする核酸であって、（ｂ）実施形態１に記載の修飾サルシンタンパク質をコードする核酸に付着している核酸を含む、細胞毒素をコードする核酸。

【0314】

５．（ａ）標的に結合するリガンドをコードする核酸であって、（ｂ）実施形態１に記載の修飾サルシンタンパク質をコードする核酸に付着している核酸を含む、細胞毒素をコードする核酸。

【0315】

６．上記リガンドが上記標的に結合する抗体又は抗体フラグメントである、実施形態５に記載の細胞毒素をコードする核酸。

【0316】

７．上記抗体又は抗体フラグメントが癌細胞の表面上のＥｐ−ＣＡＭに結合する、実施形態６に記載の細胞毒素をコードする核酸。

【0317】

８．Ｅｐ−ＣＡＭに結合する上記抗体又は抗体フラグメントがヒトＥｐ−ＣＡＭの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体又は抗体フラグメントであり、ＭＯＣ−３１抗体に由来する相補性決定領域配列を含む、実施形態７に記載の細胞毒素をコードする核酸。

【0318】

９．上記修飾サルシンタンパク質に付着した癌結合リガンドの可変領域が４Ｄ５ＭＯＣＢである、実施形態７に記載の細胞毒素をコードする核酸。

【0319】

１０．上記抗体又は抗体フラグメントが上記癌細胞の表面上の腫瘍関連抗原に結合する、実施形態６に記載の細胞毒素をコードする核酸。

【0320】

追加の実施形態−融合タンパク質
１．リボトキシン融合タンパク質であって、
（ａ）野生型α−サルシンと比較してヒトにおいて低減された免疫原性を有する修飾サルシン分子と、
（ｂ）上記修飾サルシン分子に連結された標的分子であって、標的を結合するのに有効である標的分子と、
を含む、リボトキシン融合タンパク質。

【0321】

２．上記標的分子が上記修飾サルシン分子のＮ末端に連結される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0322】

３．上記標的分子が上記修飾サルシン分子のＣ末端に連結される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0323】

４．上記標的分子が上記修飾サルシン分子内に組み込まれる、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0324】

５．上記標的分子及び修飾サルシン分子がリンカーを介して連結される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0325】

５．１．上記リンカーがアミノ酸又はペプチドを含む、実施形態５に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0326】

６．上記リンカーが１〜２０のアミノ酸長である、実施形態５に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0327】

７．上記リンカーが３〜２０のアミノ酸長である、実施形態５に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0328】

８．上記リンカーが４〜３０のアミノ酸長である、実施形態５に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0329】

９．上記リンカーが分離したポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）を含む、実施形態５に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0330】

９．１．上記ｄＰＥＧが修飾サルシン分子のセリン、チロシン、システイン、若しくはリシンの１つ、又は上記修飾サルシン分子のグリコシル化部位のいずれかにおいて上記修飾サルシン分子に連結される、実施形態９に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0331】

９．２．上記ｄＰＥＧが上記標的分子のセリン、チロシン、システイン、若しくはリシンの１つ、又は上記標的分子のグリコシル化部位のいずれかにおいて上記標的分子に連結される、実施形態９に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0332】

９．３．上記ｄＰＥＧが約２００〜１００００ダルトンである、実施形態９に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0333】

９．４．上記分岐したｄＰＥＧ分子が上記標的分子に連結される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0334】

９．５．１〜１２のサルシン分子が分岐したｄＰＥＧ分子の１又は複数の分岐に付着される、実施形態９．３に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0335】

１０．上記標的分子がペプチドを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0336】

１１．上記標的分子が、抗体、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、アブジュリン、ＣＨ２ドメイン分子、ＣＨ２ドメインフラグメント、ＣＨ３ドメイン分子、ＣＨ３ドメインフラグメント、タンパク質スキャフォルド、ホルモン、受容体結合ペプチド、又はそれらの組合せを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0337】

１１．０１．上記標的分子がＨｅｒ２受容体、ＰＭＳＡ、ヌクレオリン、又は細胞死受容体を標的とする、実施形態１１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0338】

１１．０２．上記細胞死受容体がＦａｓ受容体又は腫瘍壊死因子受容体である、実施形態１１．０１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0339】

１１．１．上記標的分子が結合部分を含み、その結合部分がＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ラクダ科ＶＨＨドメイン、フィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型ドメイン、設計されたアンキリンリピートタンパク質、セントリンスキャフォルド、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド、受容体、ホルモン、酵素、サイトカイン、小分子、それらのフラグメント、又はそれらの組合せを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0340】

１２．上記標的分子が抗原結合領域を含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0341】

１３．上記標的分子が約２０ｋＤａ未満の分子量を有するＣＨ２ドメイン分子である、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0342】

１４．上記標的分子が少なくとも１つの機能性ＦｃＲｎ結合部位を含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0343】

１５．上記融合タンパク質が単一特異性分子である、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0344】

１６．上記融合タンパク質が二重特異性分子である、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0345】

１７．上記融合タンパク質が三重特異性分子である、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0346】

１８．上記標的分子が第１のエピトープに特異的な少なくとも１つの第１のパラトープを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0347】

１９．上記標的分子が各々第１のエピトープに特異的な少なくとも２つの第１のパラトープを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0348】

２０．上記標的分子が第１のエピトープに特異的な第１のパラトープ、及び第２のエピトープに特異的な第２のパラトープを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0349】

２１．上記標的分子又は上記修飾サルシン分子のいずれかに連結された第２の標的分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0350】

２１Ａ．少なくとも１つの追加の標的分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0351】

２２．上記第２の標的分子が、上記修飾サルシン分子のＮ末端に連結され、その標的分子が上記修飾サルシン分子のＣ末端に連結される、実施形態２１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0352】

２３．上記第２の標的分子が、上記修飾サルシン分子のＣ末端に連結され、その標的分子が上記修飾サルシン分子のＮ末端に連結される、実施形態２１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0353】

２４．上記第２の標的分子が第１のエピトープに特異的な第１のパラトープを含む、実施形態２１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0354】

２５．上記第２の標的分子が第２のエピトープに特異的な第２のパラトープを含む、実施形態２１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0355】

２６．上記標的分子が第１のエピトープに特異的な第３のパラトープ又は第３のエピトープに特異的な第４のパラトープを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0356】

２７．第２の修飾サルシン分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0357】

２７Ａ．少なくとも１つの追加の修飾サルシン分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0358】

２８．上記第２の修飾サルシン分子が上記修飾サルシン分子に連結される、実施形態２７に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0359】

２９．上記第２の修飾サルシン分子が上記修飾サルシン分子に連結される、実施形態２７に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0360】

２９．１上記リボトキシン融合タンパク質が上記標的分子へと上記修飾サルシン分子を連結する切断可能なリンカーを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0361】

２９．２上記切断可能なリンカーが細胞基質において切断され得る、実施形態２９．１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0362】

２９．３上記切断可能なリンカーがエンドソームにおいて切断され得る、実施形態２９．１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0363】

２９．４上記切断可能なリンカーが血清中で切断されない、実施形態２９．１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0364】

３０．上記第２の修飾サルシン分子が、上記修飾サルシン分子又は標的分子にリンカーを介して連結される、実施形態２７に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0365】

３１．上記リンカーが分離したポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ）を含む、実施形態３０に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0366】

３２．上記ｄＰＥＧが修飾サルシン分子のセリン、チロシン、システイン、若しくはリシンの１つ、又は上記修飾サルシン分子のグリコシル化部位のいずれかにおいて上記修飾サルシン分子に連結される、実施形態３１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0367】

３３．上記ｄＰＥＧが上記標的分子のセリン、チロシン、システイン、若しくはリシンの１つ、又は上記標的分子のグリコシル化部位のいずれかにおいて上記標的分子に連結される、実施形態３１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0368】

３４．上記ｄＰＥＧが約２００ダルトン〜１００００ダルトンである、実施形態３１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0369】

３５．薬学的担体を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0370】

３６．画像化試薬、放射性同位体、薬物、免疫複合体、又はそれらの組合せを更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0371】

３７．上記画像化試薬、放射性同位体、薬物、又は免疫複合体が上記修飾サルシン分子に連結される、実施形態３６に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0372】

３８．上記画像化試薬、放射性同位体、薬物、又は免疫複合体が上記標的分子に連結される、実施形態３６に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0373】

３９．上記標的が受容体を含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0374】

４０．上記標的が、細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、タンパク質、ペプチド、分子、細菌、ウイルス、原生生物、真菌、又はその組合せを含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0375】

４１．第２の標的分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0376】

４２．第３の標的分子を更に含む、実施形態４１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0377】

４３．第４の標的分子を更に含む、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0378】

４４Ａ．上記融合タンパク質が野生型α−サルシンと比較して増加した細胞透過性を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0379】

４４Ｂ．上記融合タンパク質が標的分子単独と比較して増加した細胞透過性を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0380】

４４Ｃ．上記融合タンパク質が修飾サルシン分子単独と比較して増加した細胞透過性を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0381】

４４Ｄ．上記融合タンパク質が野生型α−サルシンと比較して細胞透過性を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0382】

４４Ｅ．上記融合タンパク質が標的分子単独と比較して細胞透過性を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0383】

４４Ｆ．上記融合タンパク質が修飾サルシン分子単独と比較して細胞透過性を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0384】

４５Ａ．上記融合タンパク質が野生型α−サルシンと比較して増加した細胞保持を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0385】

４５Ｂ．上記融合タンパク質が標的分子単独と比較して増加した細胞保持を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0386】

４５Ｃ．上記融合タンパク質が修飾サルシン分子単独と比較して増加した細胞保持を有する、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0387】

４５Ｄ．上記融合タンパク質が野生型α−サルシンと比較して細胞保持を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0388】

４５Ｅ．上記融合タンパク質が標的分子単独と比較して細胞保持を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0389】

４５Ｆ．上記融合タンパク質が修飾サルシン分子単独と比較して細胞保持を増加するように修飾される、実施形態１に記載のリボトキシン融合タンパク質。

【0390】

４６．発現系において発現される実施形態１に記載の修飾サルシン分子。

【0391】

４７．上記発現系がＥ．コリ発現系又はピキア・パストリス発現系である、実施形態４６に記載の修飾サルシン分子。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]