特許 6203394 ステロイド依存性疾患における３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203394

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】ステロイド依存性疾患における３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170914BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170914BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   G01N33/574 A

   !C12N15/00 A

【請求項の数】2

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2016-527004(P2016-527004)

(86)(22)【出願日】2014年7月14日

(65)【公表番号】特表2016-533737(P2016-533737A)

(43)【公表日】2016年11月4日

(86)【国際出願番号】US2014046477

(87)【国際公開番号】WO2015009603

(87)【国際公開日】20150122

【審査請求日】2016年9月13日

(31)【優先権主張番号】61/846,344

(32)【優先日】2013年7月15日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】595033056

【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＣｌｉｎｉｃＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】シャリフィ，ニーマ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，カイ−シャン

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００２３１３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 WILSON, E. M. et al.，"More evidence intratumoral DHT synthesis drives castration-resistant prostate cancer"，Asian J. Androl.，２０１４年，Vol. 16，pp. 99-100，Published online: 16 Dec 2013

【文献】 CHANG, K.-H. et al.，"A gain-of-function mutation in DHT synthesis in castration-resistant prostate cancer"，Cell，２０１３年 ８月２９日，Vol. 154，pp. 1074-1084, Supplemental Information

【文献】 PARK, J. Y. et al.，"Association between polymorphisms in HSD3B1 and UGT2B17 and prostate cancer risk"，Urology，２００７年，Vol. 70，pp. 374-379

【文献】 CHANG, B.-L. et al.，"Joint effect of HSD3B1 and HSD3B2 genes is associated with hereditary and sporadic prostate cancer susceptibility"，Cancer Res.，２００２年，Vol. 62，pp. 1784-1789

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−１５／９０

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

前立腺がんの治療を必要とする治療対象体の治療方法を決めることを補助する方法であって、
前記治療対象体から得た前立腺がんのサンプルで、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子（ＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０４７３０３）または３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質（ＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０４７３０３）が発現されているか否かを決定し、
前記ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または前記３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が発現されている場合は、前記治療対象体に対し、ステロイドアブレーション以外の治療をガイドすることを含む、方法。

【請求項2】

前記前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２０１３年７月１５日にファイルされた米国仮特許出願第６１／８４６，３４４号の優先権の利益を主張するものであり、かかる出願全体を本明細書に援用する。

【0002】

政府の資金援助
本発明は、米国陸軍医学研究司令部（ＮＳ）からの助成金PC080193、1R01CA168899(NS)および1R01CA172382-01(NS)ならびに、助成金PO1-CA85859(RV, PSN)、PC093509(PSN)およびP50CA097186(RV, PSN)による政府の支持を得てなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されて本明細書にその全体が援用される配列表を含む。２０１４年７月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、CCF-022549WOORD_SL.txtというファイル名であり、サイズは６，６１６バイトである。

【背景技術】

【0004】

がん性前立腺細胞の増殖には、アンドロゲンによるアンドロゲン受容体（ＡＲ）の刺激が必要であり、こうしたアンドロゲンのうち最も活性が高いのが、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）である。進行性前立腺がんは通常、性腺テストステロン遮断治療法（すなわち、医学的または外科的な去勢）で最初は退行するが、ほぼ必ず、最終的には去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）として進行する。ＣＲＰＣの表現型は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）における機能獲得によってドライブされ、その後は通常、腫瘍内のＤＨＴ濃度が約１ｎＭとなる。これは、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＳ融合がん遺伝子をはじめとするＡＲ誘導遺伝子を発現させるには、十分である。Sharifi, N., Mol Endocrinol 27, 708-714 (2013)。ＣＲＰＣを進行させる際の腫瘍内におけるアンドロゲン合成の要件は、１７α−ヒドロキシラーゼ／１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）を阻害してアンドロゲンの合成を阻止する薬剤である酢酸アビラテロンならびに、ＡＲのリガンド結合ドメインに対するＤＨＴの結合を阻止する強力なＡＲアンタゴニストであるエンザルタミドを用いる場合の延命効果によって、最もはっきりと示される。de Bono et al., N Engl J Med 364, 1995-2005 (2011); Scher et al., N Engl J Med. 367, 1187-97 (2012)。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

副腎由来の前駆体からのＤＨＴの腫瘍内合成は、テストステロンを回避する経路で行われる。Chang et al., Proc Natl Acad Sci USA 108, 13728-13733 (2011)。この合成には、３種類の酵素すなわち、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ；ＨＳＤ３Ｂによってコードされる）、ステロイド−５α−レダクターゼ（ＳＲＤ５Ａ）、１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１７βＨＳＤ）アイソエンザイムが必要である（図１Ａ参照）。それでもなお、ＣＲＰＣにおけるＤＨＴ合成の増加は、今のところステロイド機構（steroidogenic machinery）の構成要素をコードする遺伝子のいずれの変異にも起因していない。３βＨＳＤは、３β−ヒドロキシルを３−ケトに酸化し、Δ^５をΔ^４に異性化する（図１Ａ参照）。すなわちこれらは、一緒になって、ＤＨＴの合成に至るすべての可能な経路に必要な酵素によって、このステップを実質的に不可逆にする反応である。Evaul et al., Endocrinology 151, 3514-3520 (2010)。ＨＳＤ３Ｂ１は、末梢で発現されるアイソエンザイム（３βＨＳＤ１）をコードし、１２４５位に、生殖細胞系の一塩基多型（ＳＮＰ）を有する。この一塩基多型では、ＡがＣに変化し、３βＨＳＤ１の３６７番目のアミノ酸でアスパラギン（Ｎ）がスレオニン（Ｔ）に置換される。

【0006】

過去１０年間は、特定の患者に存在する、特定の疾患を発生させる酵素変異体（disease-driven enzyme mutation）に合わせた分子標的治療法の開発が脚光をあびてきた。こうした進歩は主に、これらのシグナル伝達酵素における機能獲得型変異を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤の形でなされている。これには、非小細胞肺がんにおける変異ＥＧＦ受容体を持つ腫瘍に合うＥＧＦ受容体阻害剤、ＢＲＡＦの変異によってドライブされるメラノーマに対するＲＡＦ阻害剤の例が含まれる。Chapman et al. N Engl J Med 364, 2507-2516 (2011); Kobayashi et al., N Engl J Med 352, 786-792 (2005)。これとは対照的に、転移性ＣＲＰＣに対するケアの標準には、酵素の変異に基づく薬剤ターゲティングの例が存在しない。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前立腺がん細胞の増殖は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のアンドロゲン刺激に依存する。最も活性の高いアンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）は、通常、精巣から分泌されるテストステロンから、前立腺において合成される。化学的または外科的去勢後、前立腺がんは通常、テストステロン不足により縮小する。しかしながら、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を形成して、腫瘍が再発することが多い。本発明者らは、ＣＲＰＣが、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（３βＨＳＤ１）の機能獲得につながる安定獲得型変異を発現することがあり、これが、副腎由来のステロイドであるデヒドロエピアンドロステロンからＤＨＴへの変換における最初の律速段階を触媒することを、本明細書において示す。この変異（Ｎ３６７Ｔ）は、触媒機能に影響をおよぼすのではなく、酵素にユビキチン化および分解に対する耐性を持たせて、十分な蓄積につなげている。デヒドロエピアンドロステロンからＤＨＴへの変換は通常、非常に限られているが、３６７Ｔの発現はこの変換を加速して、ＡＲの活性化に必要なＤＨＴを提供する。本発明者らは、３βＨＳＤ１がＣＲＰＣの治療用の有効なターゲットであるという仮説を立てている。

【0008】

以下の図面を参照することにより、本発明を一層容易に理解できよう。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、変異ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）によってコードされる３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が、これがなければ律速となる、ＤＨＴに至る過程でのＤＨＥＡからＡＤへのフラックスとＡＲ応答性遺伝子の発現を増すことを示すグラフを提供する。（Ａ）［^３Ｈ］−ＤＨＥＡ（１００ｎＭ）からＡＤへ、さらにはそれより下流での５αジオンおよびＤＨＴへの代謝フラックスは、ＬＮＣａＰ細胞で強いが、ＬＡＰＣ４では制限されている。代謝経路とステロイドの構造を図示し、ＤＨＥＡのＡＤへの変換における３βＨＳＤ１による修飾部位を示す。ステロイドについては、表記の時点でＨＰＬＣによって定量した。（Ｂ）ＤＨＥＡは、ＬＮＣａＰではＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現を濃度依存的に誘導するが、ＬＡＰＣ４ではそうならない。発現をｑＰＣＲによって評価し、ＲＰＬＰ０および溶媒対照に標準化した。（Ｃ）ＨＳＤ３Ｂ１の１２４５位でＡをＣに変換する置換は、３βＨＳＤ１のアミノ酸３６７でＮからＴへの変化をコードするＶＣａＰおよびＬＮＣａＰで発生する。（Ｄ）野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）および３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は、同等の動力学的特性を持つ。３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）（丸）および３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）（正方形）酵素でのＤＨＥＡ代謝のミカエリス−メンテンプロット。３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）および３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質に対するＫ_ｍは、それぞれ、３２μΜおよび７７μΜである。（Ｅ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の内因性発現が、タンパク質量の増加と関連している。Ａ、Ｂ、Ｄにおけるエラーバーは、三重に実施した実験に対するＳＤを示す。

【図2】図２は、点変異に関連するＤＨＥＡからＡＤへの代謝フラックスの増加が転写調節によるものではなく、フラックスと変異との関連が他のモデルでも発生することを示すグラフを提供する。Ａ．ＨＳＤ３Ｂ１転写物およびＨＳＤ３Ｂ２転写物の発現は、ＬＮＣａＰとＬＡＰＣ４で同等である。ｑＰＣＲによるＨＳＤ３Ｂ１アイソエンザイムおよびＨＳＤ３Ｂ２アイソエンザイムの発現を、ＬＮＣａＰに対するＬＡＰＣ４で相対的に示し、ＲＰＬＰ０（上）およびＧＡＰＤＨ（下）に対して正規化する。エラーバーは、三重に実施した実験に対するＳＤを示す。Ｂ．［^３Ｈ］−ＤＨＥＡ（１００ｎＭ）からＡＤへの代謝フラックスは、ＶＣａＰでは３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）によって強いが、ＤＵ１４５、ＲＷＰＥ−１、ＰｚＨＰＷでは３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）で制限される。下流における５αジオンとＤＨＴへのフラックスはＶＣａＰで発生し、ＤＵ１４５、ＲＷＰＥ−１、ＰｚＨＰＷでは検出できない。ステロイドを、指定の時点でＨＰＬＣによって定量した。実験を３回行い、エラーバーはＳＤを示す。

【図3】図３は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）の体細胞選択が、アンドロゲン欠乏に対する抵抗性とともに生じることを示すグラフを提供する。（Ａ）ＨＳＤ３Ｂ１におけるＡからＣへの変換は、ホモ接合野生型が遺伝した患者からの３つのＣＲＰＣ腫瘍で発生する。新鮮な凍結腫瘍（ＵＴＳＷ７）由来のｃＤＮＡクローンの配列から、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）転写物が発現されているのは確実である。（Ｂ）ヘテロ接合が遺伝した患者からの３つのＣＲＰＣ腫瘍は、野生型ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）アレルのＬＯＨを呈する。隣接する有益な（ヘテロ接合）５’（ｒｓ６２０３）および３’（ｒｓ３４８１４９２２およびｒｓ１１３０９６７３３）ＳＮＰのシーケンシングから、ＬＯＨが確認される。（Ｃ）３βＨＳＤ１タンパク質は、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）アレルのＬＯＨを持つ腫瘍には豊富であるが、ヘテロ接合の発現またはホモ接合のＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）の発現が生じる腫瘍には認められない。また、試験したＬＯＨを持つ両方の腫瘍は、ＡＲおよびＰＳＡ（各腫瘍についてレーンごとにロードされた２０μｇのタンパク質）を発現する。（Ｄ）ＨＳＤ３Ｂ１においてＡからＣに変換する体細胞変異は、精巣摘出後に酢酸アビラテロン（Ａｂｉ）で処理した２つのＬＡＰＣ４異種移植腫瘍で発生し、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）転写物の発現は、これらの腫瘍からのｃＤＮＡクローンを配列決定することによって証明される。精巣摘出のみで処理した２つの代表的な対照腫瘍（ＣＴＲＬ＃１およびＣＴＲＬ＃２）から得られるゲノム配列を、比較のために示す。ＣＴＲＬ＃１およびＣＴＲＬ＃２からの３７のｃＤＮＡクローンはすべて、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）をコードするＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）転写物を有する。

【図4】図４は、ヒトＣＲＰＣ組織におけるＨＳＤ３Ｂ１ ＬＯＨを示すグラフを提供する。Ａ．３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルのＬＯＨは、ＣＲＰＣでは発生しない。図示されているのは、図３Ｂに示されていない生殖細胞系ヘテロ接合を持つ残りの例である。これら８例は、ＣＲＰＣ腫瘍から抽出したゲノムＤＮＡの両方のアレルを維持する。Ｂ．ＬＯＨを持つＵＷ腫瘍におけるＨＳＤ３Ｂ１ ｍＲＮＡの発現は、３βＨＳＤ１のタンパク質の発現の増加を説明しない。発現をＲＰＬＰ０に正規化し、エラーバーは、三重に実施した実験に対するＳＤを示す。

【図5】図５は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の遺伝子サイレンシングはＤＨＥＡからＤＨＴへの変換、ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現の誘導、ＣＲＰＣの成長を妨げることを示すグラフを提供する。（Ａ）は、ＨＳＤ３Ｂ１（ｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃１およびｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃２）に対する２つの独立したｓｈＲＮＡコンストラクトの安定したレンチウイルス発現は、ＬＮＣａＰ細胞における３βＨＳＤ１タンパク質の発現をサイレンシングする。３βＨＳＤ１タンパク質を定量化し、非サイレンシングレンチウイルスベクター（ｓｈＣＴＲＬ）およびβ−アクチンを発現する細胞に標準化した。（Ｂ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）のサイレンシングは、［^３Ｈ］−ＤＨＥＡ（１００ｎＭ）からＡＤへのフラックスのみならず、さらに下流での５α−ジオンおよびＤＨＴへのフラックスもブロックする。［^３Ｈ］−ＤＨＥＡを用いて細胞を三重に処理し、指定された時点で、ＨＰＬＣを用いてステロイドを定量した。（Ｃ）ＡＲ調節遺伝子の阻害。表記の濃度のＤＨＥＡで２４時間細胞を処理し、ｑＰＣＲによって遺伝子発現を評価して、ＲＰＬＰ０ハウスキーピング遺伝子および溶媒で処理したｓｈＣＴＲＬ感染細胞に正規化した。（Ｄ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）のサイレンシングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を阻害する。２０ｎｍのＤＨＥＡまたは溶媒の存在下にて細胞を増殖させ、各細胞株の増殖を指定日に溶媒に正規化する。（Ｅ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の枯渇が、ＬＮＣａＰ異種移植におけるＣＲＰＣの増殖をブロックする。異種移植腫瘍が１００ｍｍ^３の閾値量に達した時に、マウスに外科的な精巣摘出とＤＨＥＡペレット移植を同時に行った。各コホートをマウス１５匹で開始し、ｓｈＣＴＲＬ、ｓｈＨＳＤ３Ｂｌ ＃１、ｓｈＨＳＤ３Ｂｌ ＃２群ではそれぞれ７匹、８匹、１０匹のマウスで開始して、正常な性腺機能を有するマウスで腫瘍体積１００ｍｍ^３を達成し、精巣摘出を行い、ＣＲＰＣ分析に含めた。精巣摘出から腫瘍体積が≧６００ｍｍ^３になるまでの日数を示す。ログランク検定を用いて、ｓｈＣＴＲＬとｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃１およびｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃２、それぞれＰ＝０．００２および０．００３の比較で。（Ｆ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が、ｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃１およびｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃２を発現しているＬＮＣａＰから増殖するＣＲＰＣ腫瘍で回復する。表記のＬＮＣａＰ ＣＲＰＣ腫瘍からのタンパク質で３βＨＳＤ１およびβ−アクチンのイムノブロットを行った。Ｂ、Ｃ、Ｄにおけるエラーバーは、三重に実施した実験に対するＳＤを示す。

【図6】図６は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）および３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）のタンパク質の半減期を示すグラフおよび画像を提供する。Ａ．ＨＡ標識３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）（Ｔ−ＨＡ）は、ＤＵ１４５前立腺がん細胞株における野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）（Ｎ−ＨＡ）タンパク質と比較して、半減期が長い。空のベクターのみ（ベクター）、野生型（Ｎ−ＨＡ）および変異（Ｔ−ＨＡ）タンパク質をコードするコンストラクトを用いて細胞を一過的にトランスフェクトし、ＣＨＸで処理し、指定の時点でタンパク質を回収し、ウェスタンブロットを実施し、シグナルを定量化して時刻０とβ−アクチンに対して正規化した。３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）および３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の計算された半減期は、それぞれ、２．７時間および＞１００時間である。Ｂ．ＬＡＰＣ４における安定な発現は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）（Ｎ−ＨＡ）タンパク質よりＨＡタグ３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）（Ｔ−ＨＡ）のほうが半減期の長いことを示している。発現は、ドキシサイクリン誘導性発現コンストラクトまたは溶媒（ｖ）でのレンチウイルス感染後に誘導された。細胞をＣＨＸで処理し、タンパク質を表記の時点で回収し、ウェスタンブロットを行い、シグナルを定量化して時刻０とβ−アクチンに対して正規化した。野生型および変異タンパク質の計算された半減期は、それぞれ、３．７時間および＞１００時間である。Ｃ．抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降によって証明されるように、ＭＧ１３２（８時間１０ｕＭ）でのプロテオソーム阻害は、ＬＮＣａＰにおけるポリユビキチン化３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の増加につながらない。

【図7】図７は、ユビキチン化およびプロテオソームによる分解に対する耐性が、タンパク質の半減期の延長につながる３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）とともに発生することを示すブロットの画像を提供する。（Ａ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は、タンパク質翻訳の阻害後も持続する。野生型（Ｎ−ＨＡ）および（Ｔ−ＨＡ）タンパク質をコードするコンストラクトを用いてＬＡＰＣ４細胞を一過的にトランスフェクトし、指定のインキュベーション時間、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理した。抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットを行い、シグナルを定量化し、時刻０およびβ−アクチンに対して正規化した。（Ｂ）ＭＧ１３２による処理（１０μΜ；８時間）は、ＬＡＰＣ４における３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質の喪失を反転させ、ＬＮＣａＰにおける３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の増加のない結果につながる。（Ｃ）ＭＧ１３２を用いたプロテオソーム阻害（１０μΜ；８時間）は、抗ユビキチン抗体を用いた免疫沈降によって証明されるように、ＬＡＰＣ４におけるポリユビキチン化３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質の増加につながる。（Ｄ）プロテオソームによる分解に対する３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）脆弱性の喪失は、ユビキチン化に対する感受性の低下によって説明される。Ｈｉｓ−ユビキチン（Ｈｉｓ−ｕｂｉ）は、２９３の細胞において野生型（Ｎ−ＨＡ）または（Ｔ−ＨＡ）タンパク質とともに発現され、その後、Ｎｉ−アガロースビーズを用いたプルダウンおよび抗ＨＡ免疫ブロットを行った。

【図8】図８は、ＥＲ−関連分解（ＥＲＡＤ）経路およびＡＦＭＲが３βＨＳＤ１のユビキチン化および分解を調節することを示す質量分析結果とブロット画像を提供する。（Ａ、Ｂ）３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）でのＫ７０およびＫ３５２ユビキチン化は、質量分析によって検出可能である。図８Ａおよび８図Ｂは、出現順にそれぞれ、配列番号２６〜２７としてコアペプチド配列を開示している。（Ｃ）Ｋ７０、３５２Ｒ変異３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）は、ユビキチン化に対する耐性がある。Ｎ−ＨＡのＫ７０ＲおよびＫ３５２Ｒのシングルおよびダブルの変異形は、２９３の細胞におけるＨｉｓ−ｕｂｉで発現され、続いて、Ｎｉ−アガロースビーズを用いたプルダウンと抗ＨＡ免疫ブロットを行った。（Ｄ）ＥＲＡＤ阻害剤であるイーアレスタチン（Ｅｅｒｌ、１０μΜ）での処理は、ＬＡＰＣ４における内因性３βＨＳＤ１タンパク質を増加させる。（Ｅ）ＡＭＦＲは、野生型タンパク質（Ｎ−ＨＡ）と優先的かつ物理的に会合する。タンパク質を２９３の細胞で発現させ、抗ＨＡ抗体で免疫沈降した後、ＡＭＦＲについてイムノブロットした。（Ｆ）ユビキチンＥ３リガーゼＡＭＦＲをサイレンシングすると、ＬＡＰＣ４細胞において検出される３βＨＳＤ１タンパク質が増加する。これとは対照的に、ユビキチンＥ３リガーゼＳＫＰ２を遺伝的にサイレンシングしても、３βＨＳＤ１に対する検出可能な効果はない。

【図9】図９は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）がＤＨＥＡからＤＨＴへの代謝フラックスを増加させ、ＣＲＰＣを誘発することを示すグラフを提供する。（Ａ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）（Ｔ）の一過性の発現は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）（Ｎ）と比較して、ＤＨＥＡからＡＤへの変換、さらには下流のステロイドへの変換の増加につながる。ＬＡＰＣ４細胞を表記のプラスミドでトランスフェクトし、ＣＨＸで処理し、［^３Ｈ］−ＤＨＥＡ（１００ｎＭ）とともに培養した。ステロイドを抽出し、指定の時点でＨＰＬＣによって測定した（スチューデントのｔ検定を使用して、Ｎ形およびＴ形によるＤＨＴの合成における差異のｐ値＝０．０２３）。（Ｂ）ｑＰＣＲによる、両方の転写物の等価な発現における一過性トランスフェクションの結果。（Ｃ）安定な発現が３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の活性の増加を示している。ルシフェラーゼ（Ｌ）、野生型（Ｎ）または（Ｔ）を発現するレンチウイルスコンストラクトを安定して発現させ（ＣＨＸ処理なし）、上述したように［^３Ｈ］−ＤＨＥＡからＤＨＴへのフラックスを評価した（スチューデントのｔ検定を使用して、Ｎ形およびＴ形によるＤＨＴの合成における差異のｐ値＝０．０１５）。（Ｄ）ｑＰＣＲによる両方の酵素転写物の発現は同等である。（Ｅ）３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）が安定して発現した状態でのＤＨＥＡからＤＨＴへのフラックスの増加は、ＬＡＰＣ４におけるＰＳＡの増幅発現につながる。指定されたコンストラクトを安定的に発現している細胞を、４８時間、表記のステロイドで処理した。ＤＨＴ陽性対照によって誘導されるＰＳＡ発現は、３つの細胞集団で同等である。Ｂ、ＤおよびＥについては、発現を、ＲＰＬＰ０およびベクター、ルシフェラーゼまたは溶媒対照に対して正規化する。エラーバーは、三重に実施した実験に対するＳＤを示す。（Ｆ）３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）と比較して、ＣＲＰＣの発達は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）を安定して発現しているＬＡＰＣ４異種移植片においてより急速に起こる。各脇腹に細胞を皮下注射してから腫瘍サイズが５０ｍｍ^３になるまでの時間が、マウスの脇腹で発達した腫瘍ごとに示されている（各群においてｎ＝４０マウスの脇腹）。ログランク検定を用いた比較でＰ＝０．０１７。（Ｇ）ＰＳＡの発現は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）と比較すると、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）を発現しているＣＲＰＣ腫瘍において高くなっている（スチューデントのｔ検定によるｐ値＝０．０１５）。発現を、ＲＰＬＰ０に正規化する。バーは、個々の腫瘍値の上下の四分位数を表する。

【図10】図１０は、標準的なアンドロゲン抑制治療法（ＡＤＴ）で治療した患者において、ＨＳＤ３Ｂ１変異の存在が、進行までの時間（ＴＴＰ）に対しておよぼす影響を示すグラフを提供する。結果は、ＡＤＴでＨＳＤ３Ｂ１バリアントと進行までの時間との間に強い相関を示している。ホモ接合バリアントの男性は、ホモ接合野生型の男性に比べて進行までの時間が顕著に短い（３１．８か月対７８．９か月）のに対し、ヘテロ接合体は、臨床経過が中間である（進行までの時間＝４９．７か月）。どちらの場合も、参照群（ホモ接合野生型）と比較して、ログランクｐ値＜０．０５であり、遺伝子量効果の証拠が存在する（傾向のログランク検定、ｐ＝０．０１１）。

【図11】図１１は、体細胞変異検出法（ＰＣＲ１）および生殖系列ＳＮＰ検出法（ＰＣＲ２）の溶融曲線を示すグラフを提供する。溶融温度の差を用いて、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）の存在を検出することができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、ＤＨＴ合成を増大し、前立腺がんなどのステロイド依存性疾患でのアンドロゲン抑制治療法に対する耐性を引き出す、ＨＳＤ３Ｂ１における機能獲得に関する。この機能獲得の検出を利用して、ステロイド依存性疾患の治療をガイドすることが可能である。

【0011】

［定義］
本明細書で使用する場合、「診断」という用語は、治療対象体が疾患を発症する尤度あるいは、治療対象体における疾患の存在または性質を決定することを包含し得る。また、診断という用語は、本明細書で使用する場合、疾患の重篤度および考えられるアウトカムあるいは、疾患のエピソードまたは回復の見込み（これは通常、予後と呼ばれる）を決定することを包含する。さらに、「診断」は、合理的な治療法における文脈での診断を包含し得る。この場合、診断が、治療法の最初の選択、治療法の変更（たとえば、用量または投与計画の調節）などを含めて、治療法を導く。

【0012】

本明細書で使用する場合、「予後」という用語は、疾患の考えられる過程およびアウトカムあるいは、疾患からの回復の尤度の予測をいう。予後は、通常は治療対象体が疾患を持つことがすでにわかっているという点で、診断とは区別されるが、予後および診断を同時に行ってもよい。前立腺がんの予後の場合、予後は前立腺がんの相対的な重篤度を類別し、これは、前立腺がんの適切な治療法の選択を導くのに利用できる。

【0013】

本明細書で使用する場合、「治療（treatment）」、「治療すること（treating）」などの用語は、所望の薬理学的効果または生理学的効果を得ることをいう。この効果は、疾患または疾患による副作用の部分的または完全な治癒という意味で、治療法的であってもよい。「治療」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、疾患または状態を阻害することすなわち、その進行を停止させることならびに、疾患の軽減すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含んでもよい。

【0014】

予防または予防法は、本明細書で使用する場合、疾患（たとえば、原発性疾患に関連しているか、これによって引き起こされる疾患を含む）にかかりやすいが、まだそれがあると診断されていない治療対象体において、疾患または疾患の症状が起こるのを予防することをいう。予防は、疾患または症状を、完全にまたは部分的に予防することを含んでもよい。

【0015】

治療法という用語は、本明細書で使用する場合、疾患を治療するために実施される行為を包含する。治療法を実施するために行われる具体的な行為は、手術、放射線治療法、ホルモン治療法、化学治療法の使用または１以上の治療剤（たとえば、抗がん剤）の使用を含んでもよい。

【0016】

「治療法的に有効」および「薬理学的に有効」という表現は、一般に代替療法に関連した副作用を回避しながら、それぞれの作用剤での治療によって疾患の重篤度および発生頻度を改善する目標を達成する、作用剤量を与えることを意図している。治療の有効性は、抗がん剤の投与に応答した治療対象体における腫瘍負荷の低減または腫瘍増殖の減少を評価することによって測定できる。腫瘍負荷の減少は、質量の直接的な減少を表してもよく、あるいは、対照腫瘍が特定の体積に増殖するまでの平均時間を、治療対象となる腫瘍が同じ体積まで増殖するのに必要な時間から減算することにより算出される腫瘍増殖遅延の点で測定されてもよい。

【0017】

「遺伝子型」という用語は、治療対象体または患者由来のＤＮＡに存在するアレルをいい、ここで、アレルは、１以上の特定の部位の核酸配列に存在する１以上の特定のヌクレオチドによって定義することが可能である。多くの場合、遺伝子型は、ヒト集団において変化することが知られている一塩基多型部位（single polymorphic site）に存在する１以上のヌクレオチドである。

【0018】

さらに、遺伝子型または多型バリアントは、「ハプロタイプ」に関連して表現されることもある。ハプロタイプとは、本明細書で使用する場合、集団内の治療対象体群においてゲノムＤＮＡに発生する２以上の多型変異体をいう。たとえば、それぞれのＳＮＰ位置がシトシンの変化とアデニンの変化を含む２つのＳＮＰが、遺伝子内に存在してもよい。集団に含まれる特定の治療対象体が、それぞれのＳＮＰ位置にシトシンのある遺伝子を持つアレルを１つ有する（ヘテロ接合）こともあれば、２つのアレルを有する（ホモ接合）こともある。遺伝子の各ＳＮＰに対応する２つのシトシンは、これらの治療対象体における一方または両方のアレルで一緒に動くため、治療対象体は、遺伝子の２つのＳＮＰに関してシトシン／シトシンハプロタイプを有するものと特徴付けられる。

【0019】

本明細書で使用する場合、「多型部位」とは、治療対象体の集団由来の多数の核酸サンプルに２以上の別のヌクレオチド配列が観察される核酸内の領域をいう。多型部位は、２以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であってもよく、挿入されたヌクレオチドまたはヌクレオチド配列、欠失されたヌクレオチドまたはヌクレオチド配列あるいは、マイクロサテライトなどであってもよい。多型部位は、長さが２以上のヌクレオチドであってもよく、長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上、２０以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、５００以上あるいは約１０００ヌクレオチドであってもよく、この場合、すべてまたはいくつかのヌクレオチド配列が、領域内で異なっている。多型部位は、長さが１ヌクレオチドであることも多く、本明細書ではこれを一塩基多型（ＳＮＰ）という。

【0020】

ある範囲の値が提供される場合、文脈が明確に他のことを述べていないかぎり、その範囲の上限と下限との間で、下限の単位の１０分の１まで、その間にあるそれぞれの値と、その表記の範囲内における他の表記の値または間にある値も、本発明に包含されることは理解できよう。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれていてもよいし、表記の範囲における任意の具体的に除外される限界を条件として、本発明に包含される。表記の範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。

【0021】

他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0022】

本明細書で使用する場合および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「および（and）」および「the」は、文脈から明らかにそうでない場合を除き、複数も含む。よって、たとえば、「サンプル」といえば、複数のこのようなサンプルを含み、「３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質」といえば、１以上のタンパク質分子を含むといった具合である。

【0023】

本発明の一態様は、治療対象体から生物学的サンプルを得る工程と、この生物学的サンプルで、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質が発現されているか否かを決定する工程と、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が発現されている場合は、治療対象体がステロイドアブレーションに耐性があると診断する工程と、を含む、ステロイド依存性疾患を有する治療対象体を診断する方法を提供する。

【0024】

本発明の別の態様は、治療対象体から生物学的サンプルを得る工程と、この生物学的サンプルで、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質が発現されているか否かを決定する工程と、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が発現されている場合は、治療対象体にステロイドアブレーション以外の治療またはステロイドアブレーションに加えた治療をほどこす工程と、を含む、ステロイド依存性疾患の治療を必要とする治療対象体においてステロイド依存性疾患を治療する方法を提供する。

【0025】

［ステロイド依存性疾患］
本発明は、ステロイド依存性疾患を診断し、治療し、その治療を導くための方法を提供する。ステロイド依存性疾患は、本明細書で使用する場合、持続するために、ステロイドホルモンの存在に依存する疾患をいう。特に、ステロイド依存性疾患は、ＨＳＤ３Ｂによってコードされる３βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３βＨＳＤ；が、疾患が依存するステロイドの量の調節に何らかの役割を果たす疾患をいう。ステロイド依存性疾患の例としては、喘息、高血圧症、炎症性腸疾患（たとえば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎炎症候群、子宮内膜症、乳がん、前立腺がんがあげられる。本明細書で使用する場合、ステロイド依存性疾患は、通常はステロイド依存性疾患であると特徴付けられるが、ステロイド非依存性を有するまたは発達させる疾患も包含する。

【0026】

いくつかの実施形態では、ステロイド依存性疾患は、がんである。ステロイド依存性がんの例としては、膀胱がん、乳がん、子宮内膜がん、膵臓がん、前立腺がんがあげられる。ステロイド依存性であり得る別のタイプのがんの同定は、現在進行中である。いくつかの実施形態では、がんが依存するステロイドは、性ステロイドである。性腺ステロイドとしても知られる性ステロイドは、アンドロゲン受容体またはエストロゲン受容体と相互作用するステロイドホルモンである。性ステロイドは、アナボリックステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、テストステロンなどのアンドロゲンと、エストラジオール、エストリオール、エストロンなどのエストロゲンと、プロゲストゲンプロゲステロンと、を含む。

【0027】

本明細書で使用する場合、「腫瘍」または「がん」という用語は、治療対象体の異常細胞の異常な急増殖を特徴とする状態をいう。異常細胞は、固形腫瘍を形成できる形質転換細胞である「新生物細胞」と呼ばれることが多い。「腫瘍」という用語は、悪性であろうと良性であろうと、前がん性細胞であろうとがん性細胞であろうと、過剰な細胞分裂または異常な細胞分裂に起因する細胞の異常な塊または集団（たとえば、２つ以上の細胞）をいう。悪性腫瘍は、制御されない細胞増殖に加えて、周囲の組織に侵入することができ、転移することができる、という点で良性の増殖または腫瘍から区別される。

【0028】

いくつかの実施形態では、がんは、前立腺がんである。前立腺がんは、本明細書で使用する場合、がんが男性生殖器系の前立腺に発症する疾患をいう。前立腺がんは、正常な精液分泌前立腺細胞が変異してがん細胞になるときに始まる、腺がん（adenocarcinoma）または腺がん（glandular）に分類される。前立腺がんの初期段階では、がん細胞の小塊は、がんがなければ正常な前立腺に閉じ込められたままであり、この状態は、非浸潤性がんまたは前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）内がんすなわち、前立腺の前がんとして知られている。時間が経つにつれて、これらのがん細胞は増殖して周囲の前立腺組織（間質）に広がり始め、腫瘍を形成する。前立腺がんは、前立腺から生じるものであり、前立腺内に残る場合もあるが、前立腺腫瘍細胞は、血流やリンパ系を移動する機能を発達させることができるため、他の器官または組織に見出されることがある。前立腺がんは、最も一般的には、骨、リンパ節、直腸、膀胱に転移する。前立腺がんの治療または予防は、本明細書で使用する場合、他の器官または組織に見られる転移性前立腺がんの治療もいう。

【0029】

大半のステロイド依存性がんは、１〜３年後に不応性となり、治療法にもかかわらず増殖を再開する。したがって、いくつかの実施形態では、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がんであり、これはホルモン不応性前立腺がんまたはアンドロゲン非依存性前立腺がんとしても知られている。去勢抵抗性前立腺がんを有する治療対象体は、化学的または外科的手段による利用可能なアンドロゲン／テストステロン／ＤＨＴの減少である去勢処置には、もはや応答しない。しかしながら、これらのがんは依然として、アンドロゲン受容体活性化のためのホルモンへの依存を示している。

【0030】

前立腺がんまたは他のステロイド依存性疾患の存在は、当業者に知られたさまざまな技術を用いて確認できる。前立腺がんの存在を確認するための好ましい方法は、生検を得ることである。前立腺がんの生検では、前立腺からの組織サンプルは一般に、特別な中空コアニードルを挿入して抜き取るバイオプシーガンを使用して直腸を介して得られる。その後、がん細胞が存在するかどうかを決定し、見つかったがんの顕微鏡的な特徴またはグリーソンスコアを評価するために、組織サンプルは顕微鏡下で検査される。ヒトの治療対象体が前立腺がんを有するかどうかを決定するための追加の手順としては、デジタル直腸検査、膀胱鏡検査、経直腸的超音波、超音波、磁気共鳴イメージングがあげられるが、これらに限定されるものではない。

【0031】

［生体試料］
本明細書に記載される多数の方法は、治療対象体から生物学的サンプルを得る工程を含む。「生物学的サンプル」は、本明細書で使用する場合、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の検出用の分析に適した治療対象体からのあらゆる生物学的サンプルを含むことを意味する。好適な生物学的サンプルとしては、血液関連サンプル（たとえば、全血、血清、血漿、他の血液由来サンプル）、尿、精液、脳脊髄液などの体液、気管支肺胞洗浄液などがあげられるが、これらに限定されるものではない。生物学的サンプルの他の例は、組織サンプルである。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、がん細胞またはがん細胞を含む組織である。ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質を、定量的または定性的のいずれかで評価することができ、検出は、in vitroまたはex vivoのいずれかで決定できる。

【0032】

本方法は、治療対象体から生物学的サンプルを提供することまたは得ることを含み、これは、針刺、針生検、スワブ、などを含む公知の任意の手段によって得られる。例示的な方法では、生物学的サンプルは、たとえば静脈穿刺によって得られる血液サンプルである。

【0033】

生物学的サンプルは、新鮮なものであってもよいし、保存されたものであってもよい。生物学的サンプルは、適切な組織保存条件下で保存またはバンク保存されたものであってもよいし、そのようにされていてもよい。生物学的サンプルは、本発明のアッセイ用に明示的に得られた組織サンプルであってもよいし、本発明のアッセイ用にサブサンプル可能な、他の目的で得られた組織サンプルであってもよい。サンプルの劣化を防止するために保管されている場合、好ましくは、生物学的サンプルは、回収直後に冷蔵されるか凍結される。

【0034】

サンプルは、適当な緩衝液中での希釈によって必要に応じて前処理されていてもよいし、ヘパリン化されてもよく、必要であれば、超遠心分離、高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣによる分画あるいは、硫酸デキストランまたは他の方法でのタンパク質の沈殿を含むがこれらに限定されない任意の数の方法で、濃縮あるいは分画されていてもよい。リン酸塩、トリスなど、生理学的ｐＨでの多数の標準的な水性緩衝液のうちのいずれかを使用してもよい。

【0035】

［治療対象体］
「個体」、「治療対象体」、「患者」という用語は、治療対象体が現在、何らかの形態の治療を受けているか、こうした治療を有するか否かとは関係なく、本明細書では同義に用いられる。本明細書で使用する場合、「治療対象体」という用語は一般に、任意の脊椎動物をいい、哺乳動物を含むがこれに限定されるものではない。サルおよびヒトを含む霊長類、ウマ科の動物（ウマなど）、イヌ科の動物（イヌなど）、ネコ、さまざまな家畜（たとえば、ブタ（swine）、ブタ（pig）、ヤギ、ヒツジなどの有蹄動物）のみならず、ペット（たとえば、ネコ、ハムスター、マウス、モルモット）を含む哺乳動物の例。ヒトの治療または診断は特に重要である。

【0036】

［Ｄ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ（３６７Ｔ）タンパク質を検出するための方法］
３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（３βＨＳＤ１）での機能獲得につながる安定獲得型変異は、遺伝子（ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ））のバリアント形態またはタンパク質（３βＨＳＤ１（３６７Ｔ））のバリアント形態のいずれかを検出することによって、治療対象体において同定可能である。機能獲得変異の存在を決定するための方法は、遺伝子またはタンパク質が検出されているかどうかによって異なる。遺伝子またはタンパク質は、キットなどの分析デバイスまたは携帯式または固定のいずれであってもよい従来の実験装置によって検出または測定可能である。いくつかの実施形態では、バリアント遺伝子またはタンパク質のレベルは、検出対象となる遺伝子またはタンパク質の量を定量するための分析を行うときに、１以上のサンプルの対応する内部標準のレベルと比較されてもよい。

【0037】

ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質は一般に、治療対象体から得られた生物学的サンプルで検出される。しかしながら、いくつかの実施形態では、変異を検出するための非侵襲的イメージングモダリティが使用される。たとえば、ＰＥＴイメージングを用いた１８Ｆ−ＤＨＥＡの投与を用いて、変異酵素を有する腫瘍を検出できる。これらの腫瘍は、ＤＨＥＡから下流のアンドロゲン代謝産物に大きなフラックスを持つと予想されるためである。

【0038】

いくつかの実施形態では、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の存在が決定される。生物学的サンプルにおける３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の存在および／または量は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質バリアントと免疫反応性であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて決定できる。抗体の使用は、個体から採取したサンプルを１以上の抗体と接触させ、サンプル中のタンパク質またはペプチドと抗体との複合体の形成をアッセイすることを含む。検出を容易にするために、抗体は、カラム、プラスチック皿、マトリックスまたは膜、好ましくは、ニトロセルロースなどの基質に付着させることができる。サンプルは、抗体と結合する前に、沈殿、分画、分離または精製してもよいし、未処理であってもよい。サンプル中の抗体と３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質との相互作用は、放射分析、比色分析または蛍光分析による手段、サイズ分離または沈殿によって検出される。好ましくは、抗体−タンパク質またはペプチド複合体の検出は、たとえば酵素、フルオロフォアまたは発色団などの検出可能なタグに結合された二次抗体を添加することによる。複合体の形成は、サンプル中における３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の存在を示す。

【0039】

標準的な手順を用いて３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）に免疫特異的な抗体を作製および標識した後、イムノアッセイに用いてサンプル中の３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の存在を検出してもよい。好適なイムノアッセイとしては、たとえば、免疫沈降法、微粒子イムノアッセイ、免疫比濁法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ、直接、間接または競合ＥＬＩＳＡアッセイ、酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、免疫組織化学、ウェスタンブロットならびに、標的分析物に結合する抗体、抗体フラグメント、受容体、リガンドまたは他の作用剤などを用いるタンパク質チップアッセイがあげられる。３βＨＳＤ１（３６７Τ）に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、確立された手順に従って製造されている。一般に、ポリクローナル抗体の調製用に、タンパク質またはそのペプチド断片が宿主動物を免疫化するための最初のステップとして使用される。イムノアッセイの概要については、Methods in Cell Biology v. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993)およびBasic and Clinical Immunology 7th Ed., Stites & Terr, eds. (1991)に記載されている。

【0040】

いくつかの実施形態では、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質は、イムノアッセイ以外の方法を用いて検出される。たとえば、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて検出することができる。また、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質は、３βＨＳＤ１タンパク質を精製し、ペプチドシーケンシング法を用いてその配列を決定することにより検出することもできる。タンパク質精製技術は、当業者によく知られている。これらの技術は、あるレベルで、細胞環境を粗分画してポリペプチドおよび非ポリペプチド画分にすることを含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離し、クロマトグラフィおよび電気泳動技術を用いて目的のポリペプチドをさらに精製および／または定量し、部分的または完全な精製（または均質になるまでの精製）を達成してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、免疫組織化学、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィまたはＨＰＬＣですらある。その後、精製されたタンパク質の配列を得ることができる。タンパク質シーケンシングのさまざまな方法が当業者に知られている。たとえば、配列は質量分析法またはエドマン分解反応を用いて同定できる。

【0041】

また、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質を、そのタンパク質の野生型と比較し、特性の違いに基づいて検出することもできる。本発明者らは、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質が３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質よりもユビキチン化および分解に対して耐性が高いことを実証した。したがって、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の存在は、ユビキチン化および／または分解アッセイを用いて検出することができる。同様に、本発明者らは、タンパク質分解に関与する自己分泌型運動因子受容体（ＡＭＦＲ）は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質よりも３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質に対してより低い親和性を示すことを示している。したがって、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の存在はまた、ＡＭＦＲに対する３βＨＳＤ１の親和性を評価することによって決定できる。また、いくつかの腫瘍は、ＤＨＴの合成と治療抵抗性の増大につながる、ＡＭＦＲ発現の体性喪失（somatic loss）あるいは、腫瘍をタンパク質安定化の代償機構として機能させうる野生型酵素（３βＨＳＤ１（３６７Ν））安定化の他の手段を持つ場合がある。

【0042】

いくつかの実施形態では、血清ステロイドプロファイルを観察することによって、３βＨＳＤ１（３６７Τ）の存在を間接的に検出可能である。血清ステロイドプロファイルの評価は、ＨＳＤ３Ｂ１遺伝子型と相関することがある。たとえば、変異酵素は、酵素産物対前駆体（すなわち、アンドロステンジオン／ＤＨＥＡおよびプロゲステロン／プレグネノロン）の割合の増加と関連することがある。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）のアレルの存在が決定される。ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルの存在および／またはレベルは、たとえば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、パイロシーケンシング、ＳＮＰチップ技術または制限断片長多型（ＲＦＬＰ）など、ポリヌクレオチド発現レベルを検出および／または決定する、すでに知られているまたは今後開発されるアッセイまたは方法のうち任意のものを用いて決定できる。さらに別の実施形態では、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子がヘテロ接合性であるかないか、ホモ接合性であるかないかを決定することもできる。

【0044】

塩基配列を決定するための方法の多くは、ＰＣＲを利用する。本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）という用語は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，９６５，１８８号に記載の方法をいい、これらの特許は、すべて本明細書に援用され、クローニングまたは精製をすることなく、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法に関する。本明細書で使用する場合、「ＰＣＲ産物」および「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング、伸長が完了するＰＣＲステップの２以上のサイクル後に得られる化合物の混合物をいう。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上のセグメントの増幅があった場合を包含する。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルの存在および／またはレベルを検出することは、多型ヌクレオチドに隣接する配列にハイブリダイズするプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルの存在および／またはレベルを決定することは、多型ヌクレオチドを含む領域にプローブをハイブリダイズすることを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、相補的配列とのハイブリダイゼーションを使用して、配列同士が完全に一致するか不完全に一致する配列の異なる特性に基づいて、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルの存在を検出してもよい。たとえば、本明細書にて説明するように、蛍光融解が、増幅されるアレルに特異的なプローブ／標的二重鎖の２つの異なる融解温度を明らかにする非対称ＰＣＲアッセイを使用できる。このアッセイは、生殖細胞または体細胞でＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルを検出するのに使用可能である。

【0046】

遺伝子（ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ））のバリアント形態またはタンパク質（３βＨＳＤ１（３６７Ｔ））のバリアント形態の存在および／またはレベルが決定されたら、これらを様々な方法で表示できる。たとえば、レベルは数値または比例バー（すなわち、棒グラフ）または当業者に知られた任意の他の表示方法として、ディスプレイ上にグラフィカルに表示可能である。グラフィック表示は、評価対象となる生物学的サンプル中のバリアント遺伝子またはタンパク質の量の視覚的表現を提供できる。

【0047】

［治療法］
本発明は、ステロイドアブレーション以外の治療あるいはステロイドアブレーションに加えた治療を必要とする治療対象体を特定する方法を提供する。ステロイドアブレーションは一般に、ステロイド依存性疾患の治療に有用であるが、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の発現は、ユビキチン化および分解に対するタンパク質の耐性による、５α−アンドロスタンジオン（５α−ジオン）経路を介してデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）からＤＨＴへの代謝フラックスを増加させることで、そうでなければステロイド形成における律速となるステップを触媒することにより、ステロイド枯渇への耐性につながる。いくつかの実施形態では、ステロイドアブレーションが継続されるが追加の治療法も提供されるのに対し、他の実施形態では、ステロイドアブレーションが中止され、代わりの治療法が追加で提供される。

【0048】

ステロイドアブレーションを実施するための多くの方法が当業者に知られている。いくつかの実施形態では、ステロイドアブレーションは、化学的に行うことができる。ステロイドアブレーションのために使用できる化学的な治療の例としては、ＧｎＲＨ−アゴニスト（たとえば、ロイプロリドまたはゴセレリンなど）またはＧｎＲＨ−アンタゴニスト（デガレリクス）、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、エンザルタミドおよび酢酸シプロテロンなどのアンドロゲン受容体アンタゴニスト、アビラテロンおよびケトコナゾールなどのアンドロゲン合成阻害剤、５−α−還元酵素阻害剤（フィナステリド、デュタステリド）を用いた医学的去勢または外科的去勢（精巣摘出）の適用を含む。上記の治療は、互いに併用されてもよいし、非ホルモン療法に加えて適用されてもよい。たとえば、医学的または外科的去勢は、放射線治療法または根治的前立腺切除術と組み合わされてもよい。また、去勢は、ドセタキセル化学治療法を含むがこれに限定されるものではない化学治療法と、組み合わされてもよい。

【0049】

前立腺がんの治療対象体は、去勢抵抗性前立腺がんを有することがすでに特徴付けられていてもよい。去勢抵抗性前立腺がんを有することを特徴とする治療対象体は、ステロイドアブレーションに代わるものとして、ドセタキセル、カバジタキセル、ラジウム−２２３、シプロイセル−Ｔ、アビラテロン又はエンザルタミドなどの化合物を用いて治療できる。

【0050】

ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質が発現されている場合は、ステロイドアブレーション以外の治療を治療対象体に提供することができる。たとえば、治療対象体は、ステロイドアブレーションの代わりに、サルベージ凍結療法、放射線治療法（たとえば、外部ビーム放射線治療法および近接照射治療法）、根治的前立腺切除術、陽子線治療法または高強度の集束超音波のうちの１以上を用いて治療できる。根治的前立腺切除術は、前立腺とその周囲の組織の一部を除去するための手術であり、開腹または腹腔鏡手術によって行うことができる。これらの治療は前立腺がんを破壊または除去するため、前立腺がんの中に別の代謝経路が生じる議論の余地を与えることになる。

【0051】

他の実施形態では、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が検出された治療対象体に、ステロイドアブレーションに加えての治療が提供される。たとえば、治療対象体は、アビラテロンまたはエンザルタミドによる治療と一緒に医学的または外科的去勢を使用するなど、より集中的なホルモン治療法で治療することができる。

【0052】

本発明の他の実施形態は、ステロイド依存性疾患（たとえば、前立腺がん）を治療するために、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質がユビキチン化および分解に対するタンパク質の耐性に対しておよぼす影響に関する知識を、より直接的に利用する。たとえば、３βＨＳＤ１（３６７Τ）に特異的な抗体は、体細胞変異を有する細胞に対する特異的免疫治療法のために使用できる。ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの使用などの遺伝的方法も、３βＨＳＤ１（３６７Τ）の発現を抑制するのに使用できる。別のアプローチは、ユビキチン化活性化剤を、そうでなければユビキチン化に対して安定した３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質とともに使用して、腫瘍における３βＨＳＤ１（３６７Τ）または３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）の耐性を克服することであろう。たとえば、ユビキチンＥ３リガーゼＡＭＦＲのエピジェネティックなサイレンシングを有する腫瘍は、３βＨＳＤ１タンパク質の喪失と腫瘍退縮を引き起こす、ＡＭＦＲ再発現を誘導するＤＮＡメチル化阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤で処理されてもよい。最後に、３βＨＳＤ１（３６７Τ）タンパク質の酵素活性を阻害する化合物の機能について試験するアッセイを使用して、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝子または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質が検出されているステロイド依存性疾患を有する治療対象体の治療に有効な新規な作用剤を同定することができる。

【0053】

候補の作用剤を、動物モデルで試験してもよい。一般に、動物モデルは、がんの研究のためのものである。動物モデル（たとえば、マウス）におけるさまざまながんの研究は、ヒトのがんの研究のために一般に受け入れられているやり方である。たとえば、ヒト腫瘍細胞を注射したヌードマウスモデルは一般に、前立腺がんを含む多岐にわたるがんの研究に有用な一般的なモデルとして受け入れられている（たとえば、Polin et al., Investig. New Drugs, 15:99-108 (1997)を参照のこと）。結果は一般に、候補の作用剤で処理した対照動物間および処理しなかった対照同腹子間で比較されている。トランスジェニック動物モデルも利用可能であり、ヒトの疾患に対するモデルとして一般に受け入れられている（たとえば、Greenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3439-3443 (1995)を参照のこと）。候補の作用剤をこれらの動物モデルで使用して、たとえば、がん転移、がん細胞運動性、がん細胞の浸潤性またはそれらの組み合わせを含む、がんに関連する症状の１つ以上を候補の作用剤が減少させるか否かを決定することができる。

【0054】

［キット］
また、本開示は、治療対象体におけるステロイド依存性疾患の治療を導くためのキットも提供する。このキットは、３βＨＳＤ１（３６７Τ）またはＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）を検出可能な１つ以上のプライマーまたはプローブと、このプライマーまたはプローブを保持するためのパッケージとを含む。キットは通常、１種類以上の別々の組成物として、あるいは任意に、試薬同士が相溶な混合物としての試薬を保持する１つ以上の容器を有するパッケージを含む。キットはさらに、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）またはＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）の検出を行うために必要な酵素（たとえば、ポリメラーゼ）、緩衝液、標識剤、ヌクレオチド、対照、任意の他の材料を含んでもよい。キットはまた、たとえば、パンチ生検または針生検を得るためのパンチツールとして、治療対象体からサンプルを得るためのツールを含むことができる。

【0055】

いくつかの実施形態では、キットは、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）を検出できるプライマーを含む。たとえば、キットは、ＡからＣへの変換などＨＳＤ３Ｂ１の領域を増幅する適切なサイズのオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、ＡからＣへの変換を含み、かつ、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドを含むＨＳＤ３Ｂ１からの領域を使用できる。特定の好適なプライマーは、本明細書において実施例に記載されている。プライマーは、検出を容易にするために標識されていてもよい。

【0056】

別の態様では、アレイおよび／またはマイクロアレイ、ＨＳＤ３Ｂ１アレルのヌクレオチド１２００あたりからヌクレオチド１３００あたりの領域を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーと、使用説明書とを含む、治療を導くためのキットが提供される。あるいはまたはそれに加えて、ＨＳＤ３Ｂ１のヌクレオチド１２１０あたりからヌクレオチド１２８０あたり、ＨＳＤ３Ｂ１のヌクレオチド１２２０あたりからヌクレオチド１２７０あたり、ＨＳＤ３Ｂ１のヌクレオチド１２３０あたりからヌクレオチド１２６０あたり、ＨＳＤ３Ｂ１のヌクレオチド１２３５あたりからヌクレオチド１２５０あたり、あるいは、ＰＣＲまたは当業者に知られた他の配列決定技術を用いて増幅してＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）の存在を検出するのに必要であるまたは適切であると当業者が決定する他の部分を増幅するプライマーが提供されてもよい。

【0057】

いくつかの実施形態では、キットは、３βＨＳＤ１（３６７Τ）を検出できるプローブを含む。好ましいタイプのプローブは、３βＨＳＤ１（３６７Τ）に特異的に結合できる抗体である。本開示で使用できる抗体の例として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、親和性成熟抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体および上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメントがあげられるが、これらに限定されるものではない。

【0058】

本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という表現は、抗体と別の化学種との相互作用をいい、ここで、この相互作用は、当該化学種上の特定の構造（たとえば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存する。たとえば、抗体は、タンパク質全般ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。

【0059】

また、キットは、サンドイッチイムノアッセイフォーマットで捕捉抗体および／または検出抗体として機能する抗体が結合する固相を含んでもよい。固相は、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、水晶の結晶、フィルム、濾紙、ディスクまたはチップなどの材料であってもよい。キットはまた、検出抗体として機能する抗体などの抗体であり得るか、またはそれに結合される検出可能な標識を含んでもよい。検出可能な標識は、たとえば、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子ケミルミノフォア（chemiluminophore）、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤またはビオチンであってもよい直接的な標識であり得る。試験キットは、任意に、標識を検出するのに必要な追加の試薬を含んでもよい。

【0060】

また、キットは、治療対象体におけるステロイド依存性疾患の治療を導く方法を実施するのにキットを使用するための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステロイド依存性疾患は、前立腺がんなどのステロイド依存性がんである。キットに含まれる説明書は包装材料に貼付されてもよいし、パッケージインサートとして含まれてもよい。説明書は一般に、書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されるものではない。そのような説明書を記憶し、エンドユーザーにそれらを伝達できる任意の媒体が本開示によって企図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（たとえば、ＣＤ ＲＯＭ）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。

【0061】

本発明およびそれに関連するコストや操作上の利点の特定の実施形態を一層明確に説明するために、実施例が含まれている。しかしながら、本発明の範囲内で多岐にわたる他の実施形態があり、これらは、本明細書で提供される特定の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0062】

［実施例１：遺伝的機構は去勢抵抗性前立腺がんにおけるＤＨＴの合成を増強する］
本発明者らは、触媒活性の増加ではなく、ユビキチン化および分解に対するタンパク質の耐性によって５α−アンドロスタンジオン（５α−ジオン）経路を介したデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）からＤＨＴへの代謝フラックスを増加する、３βＨＳＤ１（３βＨＳＤ１（３６７Ｔ））の３６７Ｔ形態をＣＲＰＣが発現する場合があることを、本明細書にて示す。生殖細胞系のヘテロ接合が継承された患者における野生型コピーのヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）によるヒトＣＲＰＣ腫瘍の体細胞変異ならびに、アビラテロン酢酸で処理したマウス異種移植モデルにおいて発生する同じ体細胞突然変異の発生および発現から、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）が選択されていることは明らかである。

【0063】

［結果］
３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）を有する細胞は、ＤＨＴへのフラックスが増加している。３βＨＳＤ１によるＤＨＥＡからΔ^４アンドロステンジオン（ＡＤ）への変換は、副腎前駆体からＤＨＴへの代謝のための末梢組織における近位のステップである。Lorence et al., Endocrinology 126, 2493-2498 (1990); Simard et al., Endocr Rev 26, 525-582 (2005)。ＣＲＰＣを有する患者由来の２つの細胞株は、３βＨＳＤ１および３βＨＳＤ２（図２Ａ）の両方をコードする転写物の同じような発現にもかかわらず、ＤＨＥＡからＡＤ（図１Ａ）に広く異種のフラックスを有する。同じ条件下で、ＬＮＣａＰ細胞は、４８時間後に［^３Ｈ］−ＤＨＥＡの９０％より多くを３βＨＳＤ酵素活性によってＡＤに代謝するのに対し、ＬＡＰＣ４細胞は、［^３Ｈ］−ＤＨＥＡのわずか約１０％しか代謝しない。ＬＮＣａＰではなくＬＡＰＣ４では、優勢経路（ＤＨＥＡ→ＡＤ→５α−ジオン→ＤＨＴ）でのＤＨＴに至る過程でのＤＨＥＡからＡＤへの見かけの律速変換は、下流での代謝産物の蓄積に限りがあること、ＡＲ調節ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２におけるＤＨＥＡ濃度依存的増加がない（図１Ｂ）ことから、さらに明らかである。両方のＨＳＤ３Ｂアイソエンザイムのエクソンのシーケンシングによって、ＬＡＰＣ４ではなくＬＮＣａＰで３βＨＳＤ１のアミノ酸位置３６７のアスパラギン（Ｎ）がスレオニン（Ｔ）に入れ替える、ＡからＣに変換するＨＳＤ３Ｂ１の１２４５位における単一の非同義置換（図１Ｃ）が明らかになる。ＨＳＤ３Ｂ１配列とステロイド代謝との間の関連をさらに試験するために、他のヒト前立腺細胞株を調査した。他の前立腺がんおよび不死化前立腺細胞株における野生型（１２４５Ａ）およびバリアント（１２４５Ｃ）ＨＳＤ３Ｂ１配列の存在も、ＤＨＥＡからＡＤへの「遅い」および「速い」フラックスと一致する（図２Ｂ）。しかしながら、組換え３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）および３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）タンパク質の動力学的特性は、それぞれのタンパク質を発現している細胞間のステロイド代謝の違いを説明していない（図１Ｄ）。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするアレルが、これらの細胞におけるタンパク質のより多くの量に関連しているか否かを決定するために、ウェスタンブロットを行った。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするどちらのモデルも、野生型配列を持つモデルに比べて３βＨＳＤ１タンパク質が増加した（図１Ｅ）。

【0064】

アンドロゲン抑制は、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）を選択する。
ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）；３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）アレルは、生殖系列ＳＮＰバリアントで生じる（ｒｓ１０４７３０３；アレル頻度２２％）（Shimodaira et al., Eur J Endocrinol 163, 671-680 (2010)）だけでなく、前立腺がんにおける体細胞変異としても発生する可能性がある。生殖細胞系ホモ接合ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）の遺伝は防げないが、ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰの両方に証拠のあるＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルが単独で存在する理由を説明できる可能性が最も高いシナリオは、ホモ接合のＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）遺伝が想定される頻度が低いとすれば、生殖細胞系のヘテロ接合遺伝に野生型アレルのヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）が続くか、生殖細胞系ホモ接合野生型遺伝に１２４５Ａ→Ｃの体細胞変異が続くかのいずれかである。ヒト腫瘍におけるＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）選択で考えられるこれらの機序の存在を同定するために、マッチしている生殖細胞系と腫瘍ＤＮＡをＣＲＰＣのある男性からシーケンシングした。ゲノムＤＮＡは、University of Texas Southwestern Medical Center(UTSW)およびで治療を受けた患者由来のＣＲＰＣおよび正常組織ならびに、University of Washington(UW)rapid autopsy programから単離した。ＣＲＰＣのある４０名の男性のうち、２５個体、１１個体、４個体の生殖細胞系はそれぞれ、ホモ接合野生型ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）、ヘテロ接合およびホモ接合バリアントＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）である。ホモ接合ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）が遺伝した２５のうち３例（１２％）のＣＲＰＣ腫瘍は、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルを獲得していた（図３Ａ）。ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）転写物の発現は、利用できる新鮮な凍結腫瘍１つで確認された。２５名の患者で生じている３つの同一のｄｅ ｎｏｖｏ変異の観察は、二項法を使用して１，０００，０００塩基対あたり４つの変異率を仮定すると、偶然だけでなく統計的有意性の高い（ｐ＝１．４７×１０^−１３）選択によるものである可能性が高い。Greenman et al., Nature 446, 153-158 (2007)。ヘテロ接合が遺伝した１１のＣＲＰＣ腫瘍のうち、３つ（２７％）はＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）アレルのＬＯＨを有し、優先的に検出可能なＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルにつながる（図３Ｂ）。これら３つの腫瘍では、隣接するヘテロ接合ＳＮＰのＬＯＨから、第１染色体のこの領域の損失がさらに確認される。これとは対照的に、ヘテロ接合が遺伝した１１例はいずれも、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルのＬＯＨを呈さなかった（図４Ａ）。

【0065】

ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）アレルのＬＯＨを持つ２つの腫瘍（ＵＷ９およびＵＷ２５）には、さらに研究するための組織が残っていた。ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルを持つだけのＬＮＣａＰおよびＶＣａＰで得られた知見と一致して、これらの腫瘍は両方とも検出可能な３βＨＳＤ１タンパク質を豊富に有する（図３Ｃ）。これとは対照的に、ヘテロ接合の発現およびホモ接合のＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）の発現で試験した両方の腫瘍は、検出可能な３βＨＳＤ１をほとんど、あるいは全く持たなかった。ｑＰＣＲによるｍＲＮＡの定量を行うと、ＬＯＨを有する腫瘍に特異的に起こる３βＨＳＤ１タンパク質の存在量の増加が転写物の過剰発現に起因しないことがわかる（図４Ｂ）。ＬＯＨを持つ両方の腫瘍は、ＡＲおよびＰＳＡをロバストに発現し、ＡＲシグナル伝達を誘発する３βＨＳＤ１タンパク質機能によって維持されるＤＨＴへのフラックスを示唆している（図３Ｃ）。

【0066】

アビラテロンは、ＣＹＰ１７Ａ１を阻害し、３βＨＳＤを弱く阻害して、腫瘍内アンドロゲン濃度をさらに低下させ、ＣＲＰＣの生存期間を長くする。したがって、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルへの変換によって、前駆体の利用可能性が低いにもかかわらず、アンドロゲン合成を維持することが可能になり得る。アビラテロン処理がＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルを選択するか否かを判断するために、アビラテロンまたは溶媒で処理した精巣摘出マウス（ｎ＝１処理あたりマウス８匹）で増殖させたＬＡＰＣ４異種移植腫瘍からのゲノムＤＮＡを単離し、配列決定した。Li et al., Clinical Cancer Research 18, 3571-3579 (2012)。アビラテロン処理群において８つのうち２つの腫瘍（Ａｂｉ＃１およびＡｂｉ＃２）で１２４５Ｃアレルが検出可能であり、溶媒群では腫瘍は検出されない（図３Ｄ）。アビラテロン群における体細胞的に獲得した変異の発現を確認するために、ｃＤＮＡクローンを生成し、配列決定した。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードする変異ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）転写物は、Ａｂｉ＃１から配列決定した２１のｃＤＮＡクローンのうち１２例（５７％）で確認され、Ａｂｉ＃２からは２６のクローンのうち７例（２７％）で確認されている。対照的に、変異転写物は、２つの溶媒処理ＬＡＰＣ４異種移植腫瘍から得られた３７のｃＤＮＡクローンのいずれにも存在しない。

【0067】

３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をブロックすると、ＤＨＴ合成、ＡＲ−応答およびＣＲＰＣが阻害される。
ＤＨＥＡからＤＨＴへのフラックスの調節およびＡＲ刺激における３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の発現の役割を決定するために、２つの独立したレンチウイルスのｓｈＲＮＡを使用して内因性発現をＬＮＣａＰでサイレンシングした（図５Ａ）。両ｓｈＲＮＡのある３βＨＳＤ１の発現をブロックすると、ＤＨＥＡからＡＤへのフラックスが阻害され、下流の５α−ジオンおよびＤＨＴへの検出可能な変換は、ほとんどあるいは全く生じない（図５Ｂ）。変異３βＨＳＤ１の発現をサイレンシングし、ＤＨＴへのフラックスをブロックすると、ＡＲ調節ＰＳＡおよびＴＭＰＲＳＳ２の発現が妨げられ（図５Ｃ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖の阻害につながる（図５Ｄ）。ｉｎ ｖｉｖｏでは、内因的に発現される変異３βＨＳＤ１の欠乏が、外科的に精巣摘出したマウスでＣＲＰＣの増殖を大幅に妨げる（図５Ｅ）。最初はレンチウイルスのｓｈＲＮＡノックダウンコンストラクトを発現している細胞株から最終的に発達するＣＲＰＣ腫瘍は、おそらくはｓｈＲＮＡコンストラクトを失った細胞の選択から、３βＨＳＤ１タンパク質を取り戻す（図５Ｆ）。

【0068】

３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は、ユビキチン化および分解に対する耐性がある。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の内因性発現は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）の発現と比較して、タンパク質の存在量の増加を生じさせるように思われる（図１Ｅ）。背後にある機序がタンパク質分解の変化によるものであるか否かを決定するために、野生型（ＨＳＤ３Ｂ１（Ｎ）−ＨＡ）および（ＨＳＤ３Ｂ１（Ｔ）−ＨＡ）コンストラクトを作製して一過的に発現させ、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理での翻訳の阻害後にタンパク質レベルを比較した。３６７Ｎ→Ｔ変異は、タンパク質の半減期を２．１時間から２７時間に実質的に増加させる（図７Ａ）。前立腺がん細胞株を変えた同様の実験（図６Ａ）およびレンチウイルスコンストラクトの安定な発現を用いた同様の実験（図６Ｂ）で、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）半減期が長くなっていることが確認される。野生型タンパク質の分解増大がプロテアソーム阻害で可逆的であるか否かを決定するために、細胞をＭＧ１３２で処理した。薬理学的プロテアソーム阻害は、ＬＡＰＣ４における内因性の野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）を増すが、ＬＮＣａＰにおける３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は増さず（図７Ｂ）、ポリユビキチン化内因性３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）は、ＬＡＰＣ４においてＭＧ１３２処理で蓄積する（図７Ｃ）。対照的に、ポリユビキチン化内因性３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は、ＭＧ１３２処理でＬＮＣａＰにおいて増加しない（図６Ｃ）。ＮｉアガロースプルダウンによるＨＡタグ化野生型と変異タンパク質とのユビキチン化の直接的な比較は、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）がポリユビキチン化に耐性である（図７Ｄ）ことを実証しており、プロテアソームによる分解に対する脆弱性の低下とタンパク質の半減期が長くなることを説明している。

【0069】

ＡＭＦＲは３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）と結合し、ユビキチン化に必要である。質量分析を用いて、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）上の１以上のユビキチン化リジン残基を決定した。ユビキチン化は、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）のＫ７０（図８Ａ）およびＫ３５２（図８Ｂ）の両方で検出可能である。Ｋ３５２ＲおよびＫ７０Ｒ単一変異および二重変異がユビキチン化に対しておよぼす影響を、Ｎｉ−アガロースプルダウンによって評価した（図８Ｃ）。Ｋ３５２はＫ７０よりもユビキチン化の重要な部位であるように思われ、両方の部位の変異は、片方の変異だけの場合よりもユビキチン化を減少させる。ＡＭＦＲ（自己分泌型運動因子受容体、ｇｐ７８としても知られる）は、小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）経路を介して機能する膜結合型ユビキチンリガーゼである。Song et al., Mol Cell 19, 829-840 (2005)。イーアレスタチンＩ（Ｅｅｒｌ）は、ＥＲＡＤ経路を介してタンパク質分解を阻害する小分子である。Wang et al., J Biol Chem 283, 7445-7454 (2008)。内因性３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質は、Ｅｅｒｌ処理したＬＡＰＣ４細胞で増加することから、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）の分解にはＥＲＡＤ経路が必要であることが示唆される（図８Ｄ）。高分解能質量分析と併用した細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を使用して、優先的に３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）と関連するバイアスのない方法で、候補ユビキチンリガーゼを同定した。Ong et al., Mol Cell Proteomics 1, 376-386 (2002)。この実験では、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）−ＨＡおよび３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）−ＨＡを発現する細胞を、それぞれ軽培地と重培地で増殖させた。１：１の比で混合された３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）−ＨＡと３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）−ＨＡ免疫沈降混合物中、正規化されたタンパク質比１．６７（≦１７％で変動するペプチド比から誘導）でＡＭＦＲが検出され、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質との優先的な物理的会合を示していた。３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）−ＨＡおよび３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）−ＨＡの免疫沈降に続いてＡＭＦＲイムノブロットを行い、ＡＭＦＲと３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質との優先的な物理的会合を確認する（図８Ｅ）。この相互作用の機能的結果を評価するために、ｓｉＲＮＡを用いてＡＭＦＲをサイレンシングした（図８Ｆ）。ＡＭＦＲノックダウンは、３βＨＳＤ１のタンパク質の量を増加させ、ＥＲＡＤ経路を介したＡＭＦＲが３βＨＳＤ１分解に必要であることを実証している。これとは対照的に、ｓｉＲＮＡによる代わりのユビキチンリガーゼＳＫＰ２をサイレンシングすると、３βＨＳＤ１に対する検出可能な効果は認められない。

【0070】

３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）は、ＤＨＴの合成を増加させる。３βＨＳＤ１に起因するタンパク質のユビキチン化および分解（３６７Ｔ）に対する耐性が、前駆体ステロイドからＤＨＴへの合成を増すか否かを決定するために、本発明者らは、ＬＡＰＣ４細胞に、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）、またはベクターのみをコードするコンストラクトを発現させ、［^３Ｈ］−ＤＨＥＡから下流のステロイドへの代謝フラックスを評価した。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするコンストラクトで一過的にトランスフェクトしたＬＡＰＣ４細胞は、ＤＨＥＡからＡＤ→５αジオン→ＤＨＴへのフラックスの増加を呈する（図９Ａ）。ｑＰＣＲにより、両方の転写物の等価な発現が確認された（図９Ｂ）。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の安定したレンチウイルス発現からも、同様に、野生型（図９Ｄ）に匹敵する転写の発現とＤＨＥＡからＡＤ→５αジオン→ＤＨＴへのフラックスの増加が確認される（図９Ｃ）。最後に、本発明者らは、ＤＨＥＡからＤＨＴへのフラックスを加速する３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）表現型がアンドロゲン調節遺伝子発現の応答を増幅し（図９Ｅ）、ヒト副腎生理学を模倣するためにＤＨＥＡを補った精巣摘出マウスでＣＲＰＣ異種移植腫瘍が発達する時間を早める（図９Ｆ）ことを決定した。３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）腫瘍は、ＰＳＡ転写物を３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）腫瘍よりも高いレベルで発現し、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）腫瘍で生じる、より高い持続ＤＨＴ濃度の存在を示唆している（図９Ｇ）。まとめると、これらの知見は、アンドロゲン欠乏状態で３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）をコードするアレルの遺伝子選択に有利な機序を裏付けている。

【0071】

最後に、図１０は、標準的なアンドロゲン抑制治療法（ＡＤＴ）で治療した患者における進行までの時間（ＴＴＰ）に対してＨＳＤ３Ｂ１変異の存在がおよぼす影響を示す。クリーブランドクリニックで前立腺切除術後にＰＳＡを上昇させるためにＡＤＴを受けた男性１１９名のコホートにおいて標的生殖細胞系の遺伝子型決定を実行する（サンガー配列決定で検証した）高解像度融解アッセイ。生殖細胞系ＤＮＡは、アーカイブされた良性の前立腺切除組織から得られた。このアッセイを使用した予備的な結果は、ＡＤＴでの進行までの時間とＨＳＤ３Ｂ１バリアントとの間の強い相関関係を明らかにしている。ホモ接合バリアントの男性は、ホモ接合野生型の男性に比べて進行までの時間が著しく短い（３１．８か月対７８．９か月）のに対し、ヘテロ接合体は、中間の臨床経過を有する（進行までの時間＝４９．７か月）。両方の症例において、対照群（ホモ接合性野生型）と比較したログランクｐ値＜０．０５であり、遺伝子用量効果の証拠が存在する（トレンドのログランク検定は、ｐ＝０．０１１）。
考察

【0072】

最前線の性腺のＴ欠乏（または去勢）治療法に対する抵抗性の主要な機序は、獲得される代謝能力であり、これは、ＣＲＰＣ腫瘍がＡＲ刺激および腫瘍の進行に十分なＤＨＴ濃度を維持するのを可能にする。本研究は、ＤＨＴへのフラックスを増加させるステロイド産生機構における機能獲得型変異を初めて同定するものである。注目すべきは、主要な副腎経路を利用するか、おそらくはコレステロールからのｄｅ ｎｏｖｏでのステロイド産生を利用するかを問わず、３βＨＳＤ酵素活性による３−ケトへの３β−ヒドロキシル酸化およびΔ^５→４異性化は、Ｔおよび／またはＤＨＴの合成に至るすべての経路に必要とされることである。副腎ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ−硫酸塩は一般に、ヒト血清中に高濃度で存在する。腫瘍内３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）の発現の文脈では、性腺Ｔ枯渇に対する臨床応答は、おそらくいくらかは腫瘍内ＤＨＴへの副腎前駆体の寄与が限られていることによっても発生する。したがって、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）でタンパク質の存在量が増えて生じる３βＨＳＤ活性の増大は、ＤＨＴ合成のためのそうでなければ律速的な近位のステップのはけ口を開く一助となり、ＣＲＰＣの発症につながるのであろう。特に、ヘテロ接合遺伝の設定で、３βＨＳＤ１タンパク質の発現は、野生型配列を保持する腫瘍と比較して、野生型ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ａ）アレルを失った腫瘍で顕著に高くなっている（図２Ｃ）。野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）タンパク質の発現および共局在が、二量体化またはオリゴマー化によって変異３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）のユビキチン化およびその後の分解を復元するがゆえに、この所見が生じる可能性がある。それにもかかわらず、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）の発現を操作すると、内因性３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）が発現されるにもかかわらず、ＤＨＴへのフラックスの増加とＣＲＰＣ開発を引き起こす（図９）。そのため、３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）だけの発現から混合発現、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）が優勢な発現への移行は、おそらくＤＨＴ合成のキャパシティの増加に対する段階的な選択を示している。

【0073】

ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルの集団頻度は約２２％であるが、これは民族（ＵＣＳＣ）ごとに大きく異なるように見える。他の研究は、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）アレルがアルドステロンレベルを上昇させ、本態性高血圧症のリスクを高める可能性があることを示唆している。これはおそらく、アルドステロン合成に必要な３βＨＳＤ酵素活性が高まることに起因する。アルドステロンは一般に、３βＨＳＤ２を必要とすると考えられているにもかかわらず、である。興味深いことに、この表現型は、ホモ接合ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）があるほうが厳しいように見える。ホモ接合ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）でアルドステロンが非常に高くなるという観察結果は、ＣＲＰＣで酵素活性が高くなり、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）だけの発現が段階的に選択されることと一致している。限局性前立腺がんのリスクに対しては、ＨＳＤ３Ｂ１（１２４５Ｃ）による一貫性のある影響は存在しない。Cunningham et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16, 969-978 (2007)。

【0074】

実験手順

【0075】

［^３Ｈ］標識ＤＨＥＡ（１００ｎＭ、３００，０００〜６００，０００ｃｐｍ；PerkinElmer）を含有する１ｍＬの無血清培地での処理により細胞を播種後、ステロイド代謝実験を１２時間行った。最大４８時間まで培地のアリコートを収集し、６５℃で４時間、βグルクロニダーゼ（１０００単位；Sigma-Aldrich）で処理した。脱抱合ステロイドを抽出し、窒素気流下で蒸発させ、５０％メタノールに溶解し、モデル７１７プラスオートインジェクター（Waters Corp.）を取り付けたBreeze 1525システムに注入し、Ｌｕｎａ １５０×３ｍｍ、３．０μΜ Ｃ_１８逆相カラム（Phenomenex）でステロイド代謝物を分離した。カラム溶出液をLiquiscintシンチレーションカクテル（National Diagnostics）と混合し、β−ＲＡＭモデル３インライン放射能検出器（IN/US Systems）で分析した。トランスフェクションの２４時間後および２５μΜシクロヘキシミド（ＣＨＸ）での処理の１２時間後に、ｐＣＭＶ５−ＨＳＤ３Ｂ１（３６７Ｎおよび３６７Ｔ）コンストラクトを用いて一過性酵素の発現でのステロイド代謝実験を行った。pLVX-Tight-Puroベクターでのレンチウイルス感染後、安定した酵素発現でのステロイド代謝実験を行った。UT SouthwesternおよびUniversity of Washington rapid autopsy programでのＩＲＢ承認プロトコールを用いて、ヒト組織を得た。レンチウイルスコンストラクトをｍｉＲ３０スタイルｓｈＲＮＡ配列から作製し、ｐＧＩＰＺベクターにクローニングし、コンストラクトを発現する感染細胞を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選択した。ＡＢＩ−７５００リアルタイムＰＣＲ装置（Applied Biosystems）においてＲＯＸキット（Bio-Rad）でiTaq SYBR Green Supermixを用いてｑＰＣＲにより遺伝子を発現させた。ＰＣＭＸ−ＨＳＤ３Ｂｌ−ＨＡ（３６７Ｎおよび３６７Ｔ）プラスミドでの一過性トランスフェクション後に、タンパク質の半減期を測定し、２４時間、１００ｎＭのＤＨＥＡを含有する無血清培地にて２５μΜＣＨＸを続けた。２ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンでのタンパク質発現の誘導およびＣＨＸでの処理後、pLVX-Tight-PuroにおけるＨＡタグＨＳＤ３Ｂ１（３６７Ｎおよび３６７Ｔ）を安定して発現する細胞を用いてタンパク質の半減期を決定した。

【0076】

細胞株。ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５はＡＴＣＣ（Manassas, VA）から購入し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ＶＣａＰはＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で維持した。ＬＡＰＣ４は、Charles Sawyers博士（Memorial Sloan Kettering Cancer, New York, NY）から惜しみなく提供され、１０％ウシ胎児血清を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で維持した。ＲＷＰＥ−１は、ＡＴＣＣから得て、ケラチノサイト無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ）（Invitrogen, Carlsbad, CA）にて培養した。ＰｚＨＰＶ７は、JT Hsieh博士（UT Southwestern）から惜しみなく提供され、ＰｒＥＧＭ（Lonza, Allendale, NJ）で維持した。ＶＣａＰ以外のすべての細胞を、５％ＣＯ_２加湿インキュベーターでインキュベートした。ＶＣａＰ細胞を、１０％ＣＯ_２加湿インキュベーターで増殖させた。

【0077】

ステロイド代謝。細胞（１ウェルあたり３００，０００〜４００，０００個）を、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングした１２ウェルのプレートに播種した。播種の１２時間後、培地を、PerkinElmer（Waltham, MA）から購入した［^３Ｈ］標識ＤＨＥＡ（１００ｎＭ、３００，０００〜６００，０００ｃｐｍ）を含む１ｍＬの無血清培地と交換した。細胞を３７℃でインキュベートし、培地のアリコート（０．２５〜０．３ｍＬ）を最大４８時間まで採取した。ステロイドからβ−Ｄ−グルクロン酸基を加水分解するために、１０００単位のβ−グルクロニダーゼ（H. pomatia; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を各アリコートに添加し、６５℃で４時間インキュベートした。脱抱合ステロイドを１：１の酢酸エチル：イソオクタン１ｍＬで抽出し、窒素気流下で試薬を蒸発させた。乾燥サンプルを５０％メタノールに溶解し、モデル７１７プラスオートインジェクター（Waters Corp., Milford, MA）を取り付けたBreeze 1525システムに注入した。Ｌｕｎａ １５０×３ｍｍ、３．０μΜ Ｃ_１８逆相カラム（Phenomenex, Torrance, CA）で、メタノール／水勾配を用いて２５℃にてステロイド代謝物を分離した。カラム溶出液をLiquiscintシンチレーションカクテル（National Diagnostics, Atlanta, GA）と混合し、β−ＲＡＭモデル３インライン放射能検出器（LabLogic, Brandon, FL）で分析した。すべての代謝試験は三重で行い、独立した実験で繰り返した。

【0078】

一過性の酵素発現を伴うＬＡＰＣ４のステロイド代謝分析のために、ｐＣＭＶ５−ＨＳＤ３Ｂ１は、J.Ian Masonの善意で提供を受け、配列決定し、３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）のエンコーディングとして確認された。Lorence et al., Endocrinology 126, 2493-2498 (1990)。Quick Change Site directed Mutagenesisキット（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を使用して、プライマーセット（フォワード：５’−GGACCGGCACAAGGAGAACCTGAAGTCCAAGACTCAG−３’（配列番号１）およびリバース：５’−CTGAGTCTTGGACTTCAGGTTCTCCTTGTGCCGGTCC−３’（配列番号２））を用いて、野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）をコードするプラスミドを誘導した。プラスミドＤＮＡ（２０ｎｇ）を、PLUS試薬（Life Technology, Grand Island, NY）と一緒にリポフェクタミンを用いて、１ウェルあたり３００，０００個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を２５μΜ ＣＨＸで１２時間処理した後、上述したようにステロイドを分析した。

【0079】

安定した発現を伴うステロイド代謝研究用に、ＨＳＤ３Ｂ１、野生型（３６７Ｎ）または変異（３６７Ｔ）を、プライマーセット（フォワード：５’−TCCGCGGCCGCGGAGTGATTCCTGCTA−３’（配列番号３）およびリバース：５’−AAGACGCGTGAGCTCTAGTAGTCAAAA−３’（配列番号４））を用いてＰＣＲ増幅し、ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩ制限部位によってpLVX-Tight-Puroベクター（Clontech, Mountain View, CA）にサブクローニングした。pLVX-Tight-Puroベクター、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐｓＰＡＸ２ベクター各１０μｇの同時トランスフェクションによって、２９３Ｔ細胞にレンチウイルス粒子をパッケージ化した。レンチウイルス感染および２週間の２μｇ／ｍｌのピューロマイシン選択後、１ウェルあたり３００，０００個の細胞を代謝フラックスの分析に使用した。

【0080】

ヒト組織。ＩＲＢ承認番号３９０５３で、University of Washington rapid autopsy programから、ＣＲＰＣと正常組織（ＵＷ１−ＵＷ２６）のマッチングを得た。UT Southwesternでは、ＩＲＢ承認済みのプロトコールＳＴＵ−０３２０１１−１８７およびＳＴＵ−０６２０１０−２１２を用いて、腫瘍と正常組織（ＵＴＳＷ１−ＵＴＳＷ１４）のマッチングを得た。すべての配列決定研究を独立して繰り返した。

【0081】

ＤＮＡの単離とＨＳＤ３Ｂ１配列分析。DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN, Germantown, MD）を用いて、細胞株および臨床サンプル（転移性ＣＲＰＣ腫瘍およびマッチした末梢血または正常組織）からゲノムＤＮＡを調製した。プロモーター領域のＰＣＲ産物、すべてのエクソン、エクソン−イントロン接合部、３’−ＵＴＲを配列決定し、ＨＳＤ３Ｂ１における変異を同定した。プライマーおよびアニーリング温度は、過去に説明されていた。Chang et al., Cancer Res. 62, 1784-1789 (2002)。ＨＳＤ３Ｂ１の３’フランキング領域を配列決定するために、プライマーセット（フォワード：５’−ATGTGGAGGGAGGTGTGAGT−３’（配列番号５）およびリバース：５’−ACGGAGATGGGTCTCTTCCA−３’（配列番号６））を、アニーリング温度６２℃で使用した。ジェノタイピングＰＣＲ反応（５０μｌ）は、３０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰを含む１×ＰＣＲ緩衝液、各０．２μΜのプライマー、０．５μｌのPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（New England BioLabs Inc, Ipswich, MA）で構成されていた。ＤＮＡシーケンシングおよび多型解析は、McDermott Center, UT Southwesternにて実施した。

【0082】

ＨＳＤ３Ｂ１転写物の分析用に、全ＲＮＡを回収し、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Bio-Rad）によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。クローニングプライマーセット（フォワード：５’−ACTGAATTCCAGGCCAATTTACACCTATCG−３’（配列番号７）；リバース：５’−ACTCTCGAGTCAAACTATGTGAAGGAATGGA−３’（配列番号８））を使用して、ＨＳＤ３Ｂ１エキソン４の３’領域をＰＣＲ増幅し、ｐＣＭＸベクターにサブクローニングした。インサートを有するコロニーを配列決定のために採取した。

【0083】

遺伝子は、レンチウイルスベクターまたはＲＮＡ干渉によりノックダウン。レンチウイルスベクターの構築、ウイルスパッケージングおよび感染は、過去に説明されているようにして行った。Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 13728-13733 (2011)。簡単に説明すると、ＨＳＤ３Ｂ１に対する３つのｍｉＲ３０スタイルｓｈＲＮＡ配列（＃１：５’−TGCTGTTGACAGTGAGCGACCTCATACAGAAAGTGACAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGTCACTTTCTGTATGAGGCTGCCTACTGCCTCGGA−３’（配列番号９）；＃２：５’−TGCTGTTGACAGTGAGCGAAGAGGAAAGACCATGTGGTTTTAGTGAAGCCACAGATGTAAAACCACATGGTCTTTCCTCTGTGCCTACTGCCTCGGA−３’（配列番号１０））をＰＣＲ増幅し、ｐＧＩＰＺベクター（Open Biosystems, Huntsville, AL）にクローニングし、シーケンシングによって確認した。ウイルスパッケージングは、ｐＧＩＰＺ、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐｓＰＡＸ２ベクター各１０μｇを同時トランスフェクトすることで、２９３Ｔ細胞にて行った。形質導入効率を高めるために、レンチウイルス粒子を含有する３０ｍＬの上清を回収し、０．４５μｍのニトロセルロース膜で濾過し、室温にて途切れることなく２時間２０分間、１９，０００ｒｐｍでの超遠心分離によって濃縮した。ウイルス粒子を含有するペレットを、１０％ＦＢＳを含む３ｍｌのＲＰＭＩ １６４０で再懸濁し、１ｍＬを用いて、ポリブレン（６μ／ｍｌ）加ＬＮＣａＰ細胞に感染させた。２４時間後、感染細胞を２週間、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選択した後、ノックダウン効率を評価した。

【0084】

ＲＮＡ干渉には、２５ｎＭのsiGENOME Human siRNA（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を、Lipofectamine RNAiMax（Life Technology, Grand Island, NY）によってＬＡＰＣ４（ポリ−Ｌ−オルニチンをコーティングした６ウェルのプレートで１ウェルあたり１×１０^６個の細胞）にトランスフェクトした。細胞溶解物を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、ウサギ抗ＡＭＦＲおよびウサギ抗ＳＫＰ２を用いるウェスタンブロットによりノックダウン効率を決定した。

【0085】

マウス異種移植研究。過去に詳細に説明されているようにして、マウス異種移植研究および酢酸アビラテロン処理を行った。Li et al., Clin Cancer Res 18, 3571-3579 (2012)。簡単に説明すると、６〜８週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをUT Southwestern Animal Resources Centerから入手し、外科的な精巣摘出とＤＨＥＡペレット（５ｍｇの９０日間徐放）移植をし、２日後に７×１０^６のＬＡＰＣ４細胞を皮下注射した。体積が３００ｍｍ^３に達する腫瘍を、４週間にわたり、週５日間、毎日１回、腹腔内アビラテロン酢酸または溶媒で処理（１処理あたりｎ＝８匹）した。マウスの屠殺時に、新鮮な状態で腫瘍を凍結した。変異３βＨＳＤ１ノックダウンの研究のために、ｓｈＨＳＤ３Ｂｌ＃１、＃２およびｓｈＣＴＲＬを安定して発現しているＬＮＣａＰ細胞（７×１０^６個）を、正常性腺機能を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、マトリゲルと一緒に皮下注射した（１群あたりｎ＝１５）。体積が１００ｍｍ^３に達した腫瘍を有するマウスには、外科的去勢とＤＨＥＡのペレット移植を行った。去勢から腫瘍体積が≧６００ｍｍ^３になるまでの時間を評価した。野生型と変異３βＨＳＤ１との比較のために、pLVX-Tight-Puro−ＨＳＤ３Ｂｌ（３６７Ｎ）またはpLVX-Tight-Puro−ＨＳＤ３Ｂｌ（３６７Ｔ）を安定して発現しているＬＡＰＣ４細胞（７×１０^６個）を、外科的に精巣摘出してＤＨＥＡ（５ｍｇ、９０日間徐放）ペレットを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注入した。腫瘍直径をデジタルノギスで週に２〜３回測定した。

【0086】

細胞増殖研究。ポリ−Ｌ−オルニチンをコーティングした１２ウェルのプレートに、ＬＮＣａＰ細胞を１００，０００個／ウェルで三重に播種し、２０ｎＭのＤＨＥＡまたは溶媒対照の存在下にて最大７日間増殖させた。ヘキストで核酸を染色することによって、相対的な細胞数を決定した。Kan et al., Cancer Res 67, 9862-9868 (2007)。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで洗浄し、２５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と一緒に冷凍した。核酸を染色するために、プレートを完全に解凍し、５００μＬのヘキスト染色緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中ヘキスト１０μｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．５）を各ウェルに加えた。プレートを室温にて２時間、暗所で穏やかに振盪した後、３６０ｎｍでの励起とプレートリーダーを用いての４６０ｎｍでの発光測定によって、各ウェルの蛍光を決定した。ＤＮＡの量を、標準曲線との比較によって推定した。

【0087】

遺伝子発現。各遺伝子転写物を正確に定量するために、過去に説明されているようにして、ｑＰＣＲを行った。Chang et al., 2011。簡単に説明すると、ＲＯＸキットを含むiTaq SYBR Green Supermix（Bio-Rad, Hercules, CA）を、ＡＢＩ−７５００リアルタイムＰＣＲ装置Applied Biosystems, Foster City, CA）にて、熱サイクル反応用に増幅した。ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN）によって回収した全ＲＮＡ（１μｇ）を、iScript cDNA合成キット（Bio-Rad）を用いるＲＴに使用した。以下のプライマーセットを用いて、ｑＰＣＲ分析を三重に行った。ＨＳＤ３Ｂ１（フォワード：５’−CCATGTGGTTTGCTGTTACCAA−３’（配列番号１１）；リバース：５’−TCAAAACGACCCTCAAGTTAAAAGA−３’（配列番号１２））、ＰＳＡ（フォワード：５’−GCATGGGATGGGGATGAAGTAAG−３’（配列番号１３）；リバース：５’−CATCAAATCTGAGGGTTGTCTGGA−３’（配列番号１４））、ＴＭＰＲＳＳ２（フォワード：５’−CCATTTGCAGGATCTGTCTG-３’（配列番号１５）；リバース：５’−GGATGTGTCTTGGGGAGCAA−３’（配列番号１６））、ハウスキーピング遺伝子large robosomal protein P0（ＲＰＬＰ０）（フォワード：５’−CGAGGGCACCTGGAAAAC−３’（配列番号１７）；リバース：５’−CACATTCCCCCGGATATGA−３’（配列番号１８））およびＧＡＰＤＨ（フォワード：５’−AGAAGGCTGGGGCTCATTTG−３’（配列番号１９）；リバース：５’−AGGGGCCATCCACAGTCTTC−３’（配列番号２０））。それぞれのｍＲＮＡ転写物は、ＲＰＬＰ０またはＧＡＰＤＨおよび非サイレンシング対照細胞（ノックダウン）または溶媒処理した細胞（ステロイド処理細胞）にサンプル値を正規化することによって定量した。すべての遺伝子発現研究を、独立した実験で繰り返した。

【0088】

酵素反応速度。野生型および３６７Ｔタンパク質について、酵母ベクターＶ１０−３βＨＳＤ１を用いて、S cerevisciae株Ｗ３０３Ｂにて組換えヒト３βＨＳＤ１を発現させ、記載のあるようにしてミクロソームを調製した。Li et al., 2012。５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．４）０．２５ｍｌ中に［^３Ｈ］−ＤＨＥＡ（０．５〜４０μΜ、１００，０００ＣＰＭ）およびミクロソームタンパク質２５μｇを含有するインキュベーションを、３７℃で１分間プレインキュベートした後、ＮＡＤ^＋（０．１ｍＭ）との反応を開始した。３７℃で２０分後、ジクロロメタン１ｍｌでステロイドを抽出し、濃縮し、メタノール−水勾配を０．４ｍｌ／分で使用して、Kinetex ２．１×１００ｍｍ、２．６μｍ Ｃ_１８逆相カラム（Phenomenex, Torrance, CA）を備えたAgilent 1260 HPLCで分離した。β−ＲＡＭ４（LabLogic）のインラインシンチレーションカウンターおよびBio-SafeIIカクテル（Research Products International）を用いて、カラム溶出液を分析した。三重測定の平均を、ｖ対［Ｓ］としてプロットし、Originバージョン７．５を用いてミカエリス・メンテン式にデータをフィットすることで、反応速度定数Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘを得た。

【0089】

ＬＡＰＣ４における３βΗＳＤ１の安定した発現のために、pLVX-Tight-Puroベクター系（Clontech, Mountain View, CA）によって、ＨＳＤ３Ｂ１に融合した野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）ＨＡタグを発現している細胞を構築した。１０％Tet System Approved FBS（Clontech）を含有するＥＶＩＤＭでポリ−Ｌ−オルニチンをコーティングした６ウェルのプレートの各ウェルに、１００万個の細胞を播種した。２ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンによって、２４時間、３βΗＳＤの発現を誘導した。ＣＨＸ処理および溶解物の収集は上述したようにして実施した。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。フィルムをスキャンし、ImageJによって定量した。過去に説明されているようにして、タンパク質の半減期を計算した。Bloom et al., Cell 115, 71-82 (2003)。簡単に説明すると、３βＨＳＤ１シグナルを、β−アクチンおよび時刻０に正規化した。対数トレンドラインから誘導した式によって、ｔ_１／２を算出した。すべての実験を独立して繰り返した。

【0090】

ウェスタンブロット分析および免疫沈降。ウェスタンブロット分析のために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Sigma- Aldrich）を用いて、全細胞タンパク質抽出物を回収した。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Thermo Scientific, Rockford, IL）によってタンパク質濃度を決定し、タンパク質２０μｇを８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、マウス抗３βＨＳＤ１抗体（Sigma）、ウサギ抗ＨＡ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、マウス抗アクチン抗体（Sigma）によって検出した。３βＨＳＤ１安定性におけるＥＲＡＤ経路の役割を決定するために、細胞溶解物を回収する６時間前に、細胞をイーアレスタチン（Sigma）で処理した。

【0091】

内因性ユビキチン修飾３βＨＳＤ１を精製するために、１０μΜのＭＧ１３２で６時間（EMD Millipore, Billerica, MA）処理した１０００万個のＬＡＰＣ４細胞からの全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび２０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（Sigma）を加えたＩＰ溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸グリセロール、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、０．１％Nonidet P-40）を用いて回収した。予備清澄化ライセートを、マウス抗ユビキチン抗体（Santa Cruz）と共に４℃で３時間インキュベートした後、プルダウンのためにさらに１時間、Protein AG UltraLink Resin（Thermo Scientific）４０μｌを添加した。溶解緩衝液で十分に洗浄した後、精製されたタンパク質を２５μｌ ２×ＳＤＳサンプル緩衝液で溶出させ、ウェスタンブロットで分析した。

【0092】

３βＨＳＤ１およびＡＭＦＲの共免疫沈降のために、ポリエチレンイミン（Polysciences, Warrington, PA）によって、４つのディッシュの２９３Ｔ細胞（６０％コンフルエンス）を、野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）ＰＣＭＸ−ＨＳＤ３Ｂｌ−ＨＡ ５μｇで３６時間トランスフェクションした。免疫沈降アッセイを上述したようにして行った。すべての免疫沈降研究を独立した実験で繰り返した。

【0093】

ｉｎ ｖｉｖｏユビキチン化アッセイ。６ｘＨｉｓ−ユビキチン（配列番号２１として開示される「６ｘＨｉｓ」）結合タンパク質を精製するために、過去に説明されているようにして、若干の修正を加えて実験を行った。Rodriguez et al., EMBO J 18, 6455-6461 (1999)；Xirodimas et al., Cell 118, 83-97 (2004)。簡単に説明すると、野生型３βＨＳＤ１（３６７Ｎ）または３βＨＳＤ１（３６７Ｔ）ＰＣＭＸ−ＨＳＤ３Ｂｌ−ＨＡと一緒にｐｃＤＮＡ３−６ｘＨｉｓユビキチン（配列番号２１として開示されている「６ｘＨｉｓ」）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３６時間トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を氷冷ＰＢＳ中で掻き取って回収した。細胞懸濁液の２０％をペレット化し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解した。異種発現タンパク質をウェスタンブロットによって分析した。残りの細胞をペレット化し、４ｍＬの溶解緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）で溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（QIAGEN Inc, Valencia, CA）４０μｌを加えることによって６ｘＨｉｓ−ユビキチン（配列番号２１として開示されている「６ｘＨｉｓ」）によって共有結合したタンパク質をプルダウンし、室温にて２時間インキュベートし、以下の緩衝液で連続的に洗浄した。（１）６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭイミダゾールプラス１０ｍＭ β−メルカプトエタノール；（２）８Ｍ尿素、０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールプラス０．１％トリトンＸ−１００；（３）８Ｍ尿素、０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ６．３、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）、２０ｍＭイミダゾールプラス０．２％トリトンＸ−１００、２回；（４）１０ｍＭイミダゾールプラス０．１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液Ａ；（５）１０ｍＭイミダゾールプラス０．０５％トリトンＸ−１００を含む緩衝液Ａ。最後の洗浄後、２００ｍＭイミダゾールを含有する２５μｌ ２Ｘ ＳＤＳサンプル緩衝液でタンパク質を溶出した後、溶出液１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。ユビキチン共役部位を決定するために、プライマーセット（Ｋ７０Ｒフォワード：５’−GAT GAG CCA TTC CTG AGG AGA GCC TGC CAG GAC-３’（配列番号２２）；Ｋ７０Ｒリバース：５’−GTC CTG GCA GGC TCT CCT CAG GAA TGG CTC ATC−３’（配列番号２３）；Ｋ３５２Ｒフォワード：５’−GAG GAA GCC AAG CAG AGA ACG GTG GAG TGG GTT−３’（配列番号２４）；Ｋ３５２Ｒリバース：５’−AAC CCA CTC CAC CGT TCT CTG CTT GGC TTC CTC−３’（配列番号２５））を用いて、Quick Change Site directed Mutagenesisキット（Agilent Technologies）を使用して、リジン残基をアルギニンで置換した。ユビキチン化の研究は、独立した実験で繰り返した。

【0094】

質量分析

【0095】

材料。１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）溶液、ｄｌ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド、プロテオミクスシークエンシンググレードのトリプシンは、Sigmaから購入した。ＬＣ／ＭＳグレードのアセトニトリルおよびＬＣ／ＭＳグレードのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Fisher Scientificから購入した。

【0096】

ゲル内消化。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、標準的な手順に従ってSimplyBlue SafeStain（Invitrogen）で染色した。簡単に説明すると、ゲルを超純水で５分間３回洗浄し、２０ｍＬのSimplyBlue SafeStainで室温にて１時間、染色した。１００ｍＬの超純水で１時間、２回洗浄した後、各ゲルのレーンを、各々がほぼ同じ量のタンパク質を含むであろうようにして３つに切断した。その後、切断した各ゲルバンドをさらに細かく１ｍｍ四方の立方体にした。ゲル内消化を、以下のプロトコールに従って実施した。５０ｍＭの炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）中、３７℃で３０分間のインキュベーションによって、クーマシーブルー染色を除去した。ゲル片を室温にてアセトニトリルで脱水した後、ＤＴＴおよびヨードアセトアミドを用いて還元／アルキル化した。次に、ゲル片をアセトニトリルで脱水し、トリプシン溶液（５０ｍＭの酢酸中４００ｎｇ／μｇ）で再水和した。トリプシン消化を３７℃で一晩行った。５０％アセトニトリルおよび３．３％ＴＦＡの最終濃度になるように抽出緩衝液を用いて３７℃で３０分のインキュベーション後にペプチドを抽出した。特に明記しない限り、すべてのステップは、サーモシェーカー（Eppendorf, NJ）で実施した。抽出物を真空遠心分離機にて乾燥させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に、Oasis HLB μElutionプレート（Waters, MA）を用いて、塩を除去した。

【0097】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。２μｍの樹脂を充填した内径７５μｍ×５０ｃｍのThermo Scientific Easy-Sprayカラムを備えたUltimate 3000ナノＨＰＬＣシステム（Dionex）にて、一次元液体クロマトグラフィを行った。ペプチドの分離は、０．１％ギ酸中１％から２５％アセトニトリルの２００分間の直線勾配により３５０ｎｌ／分で行った。Easy-Sprayソース（Thermo Electron）を用いてカラム温度を上昇させ、６０℃に維持した。（ｍ／ｚ ２００で）解像度７０Ｋで取得したフルＭＳスキャンおよび解像度１７．５Ｋで取得したＭＳ／ＭＳスキャンを用いて、データ依存性のトップ２０の方法を使用して、QExactive装置（Thermo Electron）にて質量分光分析を行った。３ｍ／ｚの分離ウィンドウおよびＭＳ／ＭＳ取得のための１００ｍ／ｚの固定された第１の質量で、アンダーフィル比を０．１％に設定した。割り当てられていない単一荷電種を除外するために、電荷除外を適用し、１５秒の時間でダイナミック除外を使用した。GlyGly(K)を可変修飾として指定したことを除いてデフォルトのパラメータでMaxQuant（バージョン１．３．０．５）を使用して、ＳＩＬＡＣ ＭＳデータを分析した。Cox, J., and Mann, M., Nat Biotechnol 26, 1367-1372 (2008)。
実施例２：生殖細胞／体細胞変異検出アッセイ

【0098】

体細胞変異の検出（ＰＣＲ１）：

【0099】

野生型アレルの増幅をブロックして変異アレルが優先的に増幅されるようにする、野生型アレルに特異的な非標識３’ロックド核酸（ＬＮＡ）を用いる非対称ＰＣＲアッセイによって、野生型個体における（Ｎ３６７Ｔ）体細胞変異を検出する。ＤＮＡ飽和色素のエンドポイント蛍光融解は、両方のアレルを等しく増幅する第２の非遮断ＰＣＲから生じるプローブ／野生型標的二重鎖の融解温度と比較できるプローブ／変異標的二重鎖に特異的である溶融動態につながる。アッセイは、全アレル集団中の変異アレルの０．７５％に対して感受性である。

【0100】

各サンプルについて、以下の表１に示すようにして２種類のＰＣＲ混合物を調製する。

【0101】

【表1】

【0102】

ＰＣＲ１については、表２に示すように、以下の「プレＰＣＲ」サイクルを行う。

【0103】

【表2】

【0104】

ＰＣＲ１（プレ−ＰＣＲサイクル後）およびＰＣＲ２はどちらも、表３に示すサイクルで行う。

【0105】

【表3】

【0106】

生殖細胞ＳＮＰ検出（ＰＣＲ２）：

【0107】

ＤＮＡ飽和色素の存在下、非対称ＰＣＲにおける野生型特異的非標識ロックド核酸（ＬＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブを用いて、（Ｎ３６７Ｔ）生殖系ＳＮＰ検出アッセイを設計した。LC-Green Lightscanner（登録商標） Master Mix（Biofire Defense, Salt Lake City, UT）を使用して、プライマー比１：１０で、２１９ｂｐ−アンプリコンを増幅する。ＰＣＲ終了後、エンドポイント蛍光融解は、増幅されたアレルに特異的なプローブ／標的二重鎖の２つの異なる融解温度を明らかにする（野生型で７３．６℃、変異で７１．５℃）。ヘテロ接合の遺伝子型は、２つの融解ピークを示す。３ＢＨＳＤ２および４つの３ＢＨＳＤ１偽遺伝子は、プライマーの特異性およびＰＣＲのストリンジェンシーの高さがゆえに、このジェノタイピングアッセイに干渉しない。参照方法として配列決定と比較した場合、このアッセイは１００％の一致を示した。新鮮な凍結組織およびＦＦＰＥ組織から抽出した４０ｎｇのＤＮＡについてアッセイを検証した。

【0108】

アッセイの実施結果を図１１に示す。ＰＣＲ１に使用したのと同じプロトコールを用いて行われる、生殖細胞系変異アッセイ（ＰＣＲ２）の背後にある目的は、同時ＰＣＲ２で体細胞変異の遺伝子型を決定し、検出することである。既知の野生型サンプルだけを試験する場合には、これは不要である。また、ＰＣＲ２アッセイはまた、ヘテロ接合変異と体細胞変異（いずれもＰＣＲ１における変異となる）とを区別し、ヘテロ接合性の喪失を検出することを可能にする。

【0109】

本明細書に引用されるすべての特許、特許出願および刊行物ならびに電子的に利用可能な資料の完全な開示内容が、本明細書に援用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためだけに与えられている。そこから不必要な制限が理解されるべきではない。当業者に明らかな変形が特許請求の範囲に規定される本発明の範囲に含まれるため、本発明は、図示および記載された詳細な内容に厳密に限定されるものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]