特許 6203733 細胞および／または粒子を分離するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203733

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】細胞および／または粒子を分離するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20170914BHJP

   G01N 33/49 20060101ALI20170914BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   G01N15/14 K

   G01N33/49 K

   C12M1/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-533243(P2014-533243)

(86)(22)【出願日】2012年9月27日

(65)【公表番号】特表2014-528089(P2014-528089A)

(43)【公表日】2014年10月23日

(86)【国際出願番号】SE2012051028

(87)【国際公開番号】WO2013048323

(87)【国際公開日】20130404

【審査請求日】2015年9月25日

(31)【優先権主張番号】1150889-2

(32)【優先日】2011年9月28日

(33)【優先権主張国】SE

(31)【優先権主張番号】61/540,217

(32)【優先日】2011年9月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514072883

【氏名又は名称】アコーソート アクチエボラグ

【氏名又は名称原語表記】ＡｃｏｕＳｏｒｔ ＡＢ

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】ラウレル，トマス

(72)【発明者】

【氏名】グレンヴァル，カール

(72)【発明者】

【氏名】マグヌソン，セシーリア

(72)【発明者】

【氏名】アウグストソン，ペール

【審査官】 土岐 和雅

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０６８７６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０７−０４７２５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表昭６１−５００２７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０８５２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０５５０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５１３１０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０８２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０２４７５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００００９３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Thomas Laurell et al.，Chip integrated strategies for acoustic separation and manipulation of cells and particles.，Chem.Soc.Rev.，米国，２００７年，Vol.36，492-506

【文献】 O Manneberg et al.，Wedge transducer design for two-dimensional ultrasonic manipulation in a microfluideic chip，J. Micromech.Microeng. ，２００８年，Vol.18，1-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ１／００〜１／４４、１５／００〜１５／１４、３３／４８〜３３／９８、Ｃ１２Ｍ１／００〜１／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

懸濁液中の異なる種類の細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離するためのマイクロスケール方法において、以下のステップ：
ｉ）懸濁液に圧力を加えるステップであって、前記圧力は、前記懸濁液を微小流体チップ上に存在する１つの入口（１１）の中および少なくとも１つの事前整列チャネルの中に押しやり、前記事前整列チャネルが、床、天井、および両壁を有する、ステップと、
ｉｉ）前記懸濁液に、前記事前整列チャネル（１５）の長手方向に垂直に向けられた二次元音響力を加えるステップと、
ｉｉｉ）前記細胞および／または粒子の前記混合物と第２入口（１２）経由の無細胞緩衝溶液とを、同時に、少なくとも１つの分離チャネルへ注入するステップであって、細胞および／または粒子の前記混合物は、前記無細胞緩衝溶液によって前記分離チャネルの壁方向に押しやられるステップと、
ｉｖ）前記細胞および／または粒子に、前記分離チャネル（１６）の長手方向に垂直に向けられた一次元音響力を加えるステップと、
ｖ）前記微小流体チップ上に存在する前記分離チャネルから同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ細胞および／または粒子を少なくとも２つの出口（１３、１４）経由で収集するステップと
を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、ステップｉｉ）における前記二次元音響力が互いに垂直な１／２波長定在波および１波長定在波から構成されることを特徴とする方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法において、ステップｉｖ）における前記一次元音響力が１／２波長定在波から構成されることを特徴とする方法。

【請求項4】

請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記二次元音響力が１〜１０ＭＨｚの周波数により引き起こされることを特徴とする方法。

【請求項5】

請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法において、前記方法が一定温度に維持されることを特徴とする方法。

【請求項6】

請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、チャネルの高さまたは幅が７５ｕｍ〜８００ｕｍであることを特徴とする方法。

【請求項7】

請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記細胞および／または粒子が１〜５０μｍのサイズをもつことを特徴とする方法。

【請求項8】

請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記細胞がガン細胞であり、かつ、前記懸濁液が血液であることを特徴とする方法。

【請求項9】

懸濁液中の異なる種類の細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離するための微小システムにおいて：
ｉ）床、天井、および両壁を有する事前整列チャネル（１５）および少なくとも１つの分離チャネル（１６）をもつマイクロチップであって、少なくとも２つの入口（１１、１２）と、少なくとも２つの出口（１３、１４）を有するマイクロチップと、
ｉｉ）圧力を与える手段であって、前記圧力は、前記懸濁液を前記第１入口（１１）の中に押しやる手段と、
ｉｉｉ）二次元音響力を与える手段であって、前記二次元音響力は、前記事前整列チャネル（１５）に垂直な方向に向けられる手段と、
ｉｖ）無細胞緩衝液を前記第２入口（１２）に注入する手段と、
ｖ）一次元音響力を与える手段であって、前記一次元音響力は、前記分離チャネル（１６）に垂直な方向に向けられる手段と、
ｖｉ）前記分離チャネル（１３、１４）から同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ細胞および／または粒子を収集する手段と
を含み、細胞および／または粒子の前記混合物は、前記無細胞緩衝溶液によって前記分離チャネルの壁方向に押しやられることを特徴とする微小システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、懸濁液中に存在する細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離する方法およびシステムであって、一次元または二次元で働く音響力に前記懸濁液が曝され、前記細胞および／または粒子が相互に分離され、サイズおよび／または質量密度および／または圧縮性に関して同様の特性をもつグループを形成する、方法およびシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

マイクロ流体工学は、細胞および粒子の高性能取り扱いが非常にうまく行くことが分かっている固有の領域である。高品質の細胞処理に関する業界標準および臨床的標準を形成する有力な技術基盤の一部は、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）（蛍光検出および選別）およびコールター・カウンター（粒度分布測定）に見出される。蛍光識別細胞特異抗体とＦＡＣＳ技法の組み合わせが現代細胞生物学における革新への道を開いた。しかし、この技法により、すべての問題が解決できるわけではない。たとえば、マーカーを使用せず、したがって生体分子変化またはその他の細胞の動揺をもたらさない細胞の集団からの特異細胞の分離のような問題がある。

【0003】

広範な研究により、決定論的横変位、流体力学的濾過、水力学泳動分離およびピンチド・フロー・フラクネーションのような細胞および粒子を分離する受動的流体力学的技法が探求された。これらの技法は、粒子サイズに関する分離チャネルの流体力学的特性のみに依存する。これらの技法は、一般的に良好な分離特性を示すが、良好な分離を達成するために粒子濃度を低くしなければならないが故にスループットが低いという欠点を伴う。これらの問題を克服するために、スプリット・シン・フラクネーション、磁気泳動、光学的方法および誘電泳動を含む多くの代替的方法が調査されてきた。これらの方法の１つの共通の特徴は、粒子／細胞の軌道の選択的偏向を引き起こすために全般的な流れの方向に対して横断方向に向けて加えられる力場の手段により粒子／細胞が分離されることである。しかし、これらのすべての技法は、これまでのところ、高度の粒子／細胞識別および／または生物科学応用における広範な適用可能性にとって十分な粒子スループットをもたらす細胞分離に成功していない。音響泳動も、懸濁液中の粒子に作用する音響力場の使用により粒子／細胞分離を行うことが示されてきた。音響泳動の被るスループット限界は小さく、また、たとえば誘電泳動技法に比してイオン強度またはｐＨに対する高度の依存もない。

【0004】

水性懸濁液中における種の分離のためにマクロチャネルを使用する場合に共通する問題は、スケール長が小さい場合の層流条件による分散の問題である。層流は、かかるチャネルの長手方向（ｘ）の流速（ｕ）がチャネル幅（ｙ方向）および高さ（ｚ方向）に関する空間的位置に依存することを意味する。管壁付近において速度はゼロに近づくが、大部分において流速はより高い。したがって、粒子／細胞のチャネルにおける保持時間は、事実上、その初期横方向位置（ｙおよびｚ）によって決まる。すなわち、チャネルの横断面の異なる位置において入った粒子／細胞は、異なる速度でチャネル中を通過する。分離は、粒子／細胞が正確に同一の横方向位置において分離チャネルに入り、それにより分離チャネル中を等速で流れた場合のみ、真に決定論的となる。したがって、かかる分離チャネルの末端における粒子／細胞の位置は、粒子／細胞の初期位置および使用される外部力場の関数である。

【0005】

決定論的分離成果のための要件を満たす前提条件は、粒子／細胞が実際の分離段階を取り囲んでいるチャネル領域に入る前に流体流のｙｚ平面においてあらかじめ整列されることである。事前整列は、ｙ軸およびｚ軸沿いの二次元外力を使用することにより行うことができる。

【0006】

米国特許第２００９／００４２３ｌ０号明細書は、音響力の使用による粒子の分離を開示しているが、この場合、前記音響力は、細胞を分離するために２回加えられる一次元力であり、また、この場合、分離される細胞は、ある流速で移動する粒子である。

【0007】

Ｍａｎｎｅｂｅｇ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００８，１８，ｐ．１−９は、ｘ軸とｙ軸の両方の一次元の力がどのようであるか開示している。

【0008】

腫瘍細胞を捕捉するチャネル中において、また、マイクロビーズまたはマイクロポストを含む生化学的親和性応用方法により、物理的たとえば身体的構造などの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離するためにいくつかの方策が提案されている。現在まで、転移性ガン患者からのＣＴＣを濃縮する方法として最も成功している技法は、免疫標識に依存している。上皮細胞一般および上皮由来腫瘍細胞の大多数は、上皮細胞接着タンパク（ＥｐＣＡＭ）および種々のサイトケラチン（ＣＫ）を示すが、これらは正常な血液細胞には存在しない。これらの標識は、利用可能なＣＴＣ分離方法において大いに使用されている。しかし、１つの欠点は、ＥｐＣＡＭまたはＣＫ陰性ＣＴＣの排除である。ＣＴＣ間の形態および抗原発現の両方における相当な変異は、その結果として、ＣＴＣ濃縮を強化する革新的な方法を求めている。本発明は、これらのシステムについて上述した欠点を対象としている。

【発明の概要】

【0009】

音響定在波力場は、流路が流体伝導管として役立つと同時にチャネルサイズにより決定される音響共振器として働くということを利用することにより、微小流体システムにおいて細胞を収束／集中するために広範に使用されてきた。種々の粒子の本質的な音響物理的パラメータに基づいて音響力場において種々の粒子を分離する試みが報告されているが、いまもなお、分離段階を行う力場における保持時間の変動を引き起こす放物線流れプロフィールにより悩まされている。本発明が行われた時点において、同一の周波数を使用して２つの音響波を生成することは不可能であるということが常識であった。偶然のみにより、本発明者らは、それを試み、かつ、本発明者らが使用する周波数においてそれがうまく行くことを発見した。当業者は、それを試みようとさえしなかったであろう。その計算を始めてみると、それは理論上、可能ではないからである。

【0010】

本発明は、音響定在波力場が二次元と一次元の両方、すなわち三次元において粒子／細胞に作用するようにチャネルを設計することにより、粒子／細胞の事前整列を行う方法を開示する。無細胞緩衝溶液の導入との組み合わせにおける最初の二次元力の使用およびそれに続く一次元力の使用により、細胞を分離し、従来と比較して高い分解能で特定の分離経路中に収束することが可能である。

【0011】

続いて、事前整列された粒子／細胞は、音響定在波共振モードのために設計されたマイクロチャネル・セグメントの中に入る。それは、一次元に沿って粒子／細胞分離を行う力場を生ずる。粒子／細胞の事前整列は、分離領域における等しい保持時間を確保し、したがって、層流状態の放物線流れプロフィールによる低い分離分解能において一般的に遭遇する問題が軽減される。

【0012】

一態様において、本発明は、懸濁液中の種々の細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離するミクロスケール方法であって、以下のステップ：
ｉ）懸濁液に圧力を加えるステップであって、前記圧力は、前記懸濁液を微小流体チップ上に存在する少なくとも１つの入口（１１）および少なくとも１つの事前整列チャネルに押しやる、ステップと、
ｉｉ）前記懸濁液に、事前整列チャネル（１５）の長手方向に垂直に向けられた二次元音響力を加えるステップと、
ｉｉｉ）第２注入口（１２）経由で、同時に少なくとも１つの分離チャネルへ、細胞および／または粒子の混合物を押しやり、無細胞緩衝溶液を注入するステップであって、細胞および／または粒子の前記混合物は、チャネルの壁の方向に押しやられるステップと、
ｉｖ）前記細胞および／または粒子に、分離チャネル（１６）の長手方向に垂直に向けられた一次元音響力を加えるステップと、
ｖ）微小流体チップ上に存在する分離チャネルの末端において、少なくとも２つの出口（１３、１４）経由で同一のサイズまたは質量密度および／または圧縮性をもつ細胞および／または粒子を収集すること。
を含む方法に関する。

【0013】

別の態様において、本発明は、懸濁液中の種々の種類の細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離する微小システムであって：
ｉ）少なくとも２つの入口（１１、１２）をもつ少なくとも１つの事前整列チャネル（１５）および少なくとも２つの出口（１３，１４）をもつ少なくとも１つの分離チャネル（１６）をもつマイクロチップと、
ｉｉ）圧力を与える手段であって、前記圧力は、前記懸濁液を第１入口（１１）の中に押しやる手段と、
ｉｉｉ）二次元音響力を与える手段であって、前記二次元音響力は、事前整列チャネル（１５）に対して垂直の方向に向けられる手段と、
ｉｖ）無細胞緩衝液を前記第２入口（１２）に注入する手段と、
ｖ）一次元音響力を与える手段であって、前記一次元音響力は、分離チャネル（１６）に垂直の方向に向けられる手段と、
ｖｉ）少なくとも２つの出口（１３、１４）から同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ物体を収集する手段と
を含むマイクロシステムに関する

【0014】

細胞および／または粒子相互間のわずかな差異でさえ、それらを分離するレベルまで、微小システムの分解能を高めることが初めて可能になる。これは、粒子／細胞をｙ−ｚ平面上の一定の位置に差し向けることができる少なくとも１つの事前整列マイクロチャネルに、二次元音響力を加えることにより達成される。これにより粒子／細胞は、分離チャネルに入る前に、流れに対して横断方向の平面上の１つまたは複数の離散位置に限定され、したがって分離が決定論的となり、粒子／細胞の固有特性および粒子／細胞と水媒体間の流体力学的相互作用が分離結果を支配することとなる。このような事前整列と分離の組み合わせ効果により、かかるシステムの分解能が向上し、例に示すように近縁関係にある細胞を分離する可能性を初めてもたらす。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、２つの懸濁された種のオンチップ・トランスポートの概略図である。平面図。正確な縮尺ではない。

【図2】図２は、２つの懸濁された種のオンチップ・トランスポートの概略図である。垂直断面図。正確な縮尺ではない。

【図3】図３は、完成装置の推奨実施例を示す。平面図。原寸比例。

【図4】図４は、完成装置の推奨実施例を示す。中央垂直平面に沿って半分に切ったときの垂直断面図。原寸比例。

【図5】図５は、チャネル中の流れを駆動する外部流体工学装置の略図である。

【図6】図６は、出口の流れの分割比を示す。

【図7】図７は、片面ＦＦＡを示す。

【図8】図８は、５μｍおよび７μｍのポリスチレン粒子を含む試料混合物に対する事前収束の効果を示すグラフである。

【図9】図９は、ＤＵ１４５ガン細胞および白血球を含む試料混合物に関する事前収束の効果を示すグラフである。

【図10】図１０は、ＤＵ１４５ガン細胞および白血球を含む試料混合物に関する流量の変更の効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

定義
文字、（ｘ）、（ｙ）および（ｚ）は、それぞれ、マイクロチャネルの長さ（ｌ）、幅（ｗ）、および高さ（ｈ）に沿った空間位置を指す。文字（Ｑｉ）、（ｖ）、および（ｐｉ）は、それぞれ、体積流量、流速および圧力を指す。ただし、添え字（ｉ）は、特性の複数の例を示す。用語、懸濁液は、沈殿するために十分な大きさの固体の粒子または細胞を含む流体を指す。

【0017】

方法およびシステム
本発明は、細胞および／または粒子などの物体のサブグループを懸濁液から分離するための方法およびシステムに関する。

【0018】

方法Ｉ
１つの態様において、本発明は、以下のステップを含む方法に関する：
ａ）懸濁液（５１）の容器中の静水圧ｐ_１を高めてチャネル入口（１１）における圧力をその他の流体接続部（１２、１３、および１４）のいずれにおけるよりも高くすることにより懸濁液（５１）を管（５５）経由で少なくとも１つの事前整列チャネル（１５）に押しやるステップ。前記圧力差により、チャネル中に層流が生ずる。この流れは、１μＬ／分〜２ｍＬ／分まで変化し得る。高い圧力は、注射器ポンプ、蠕動ポンプを使用することにより、または流体の容器が置かれている密閉チャンバ内のガス圧を調節することにより生成することができる。
ｂ）前記懸濁液中の懸濁された物体（図１、差し込み図ｃ）に、事前整列チャネル（１５）に垂直な方向に向けられた二次元音響力ポテンシャル（図１のａ−ａ’および図２のｆ−ｆ’）を加えて細胞および／または粒子のすべてが流れの横断面中の１つまたは複数の点に局在させるステップ。二次元音響力ポテンシャルは、音響的に柔らかい水と音響的に硬いチャネルの壁の間の界面における反射により引き起こされる水で満たされたチャネル内部の超音波の共振モードから生ずる。超音波振動の周波数を調節することにより、懸濁された細胞および／または粒子をチャネルの壁、床および天井から最寄りの振動圧力ノードに押しやるモードを発生させることができる。（１１）における懸濁液の恒常的流入が二次元音響力ポテンシャルとの組み合わせと相まって、懸濁液の細胞および／または粒子が事前チャネルを出る直前に狭い帯状に整列させる（図１の差し込み図ｄおよび図２の差し込み図ｈ）。

【0019】

事前整列チャネルの幅および／または高さは、７５μｍ〜８００μｍ（たとえば７５μｍ〜２００μｍ）、または２００μｍ〜３７５μｍ、または３００μｍ〜４００μｍ、または４００μｍ〜７００μｍまたは７００μｍ〜８００μｍ、または１５０μｍ、３００μｍ、１８８μｍ、３７５μｍまたは７５０μｍとすることができる。

【0020】

事前整列チャネルの幅および高さは、幅ｗを整数ｎで除した値が高さｈを整数ｍで除した値に等しくなるように関係づけることができる。この場合、高さおよび幅のサイズと同時に共振条件を満たす単一の振動周波数を次のように選択することができる。

ここでｃは、懸濁流体中の音速である。

【0021】

チャネルの幅と高さが関係づけられない場合、共振条件は、高さおよび幅について、それぞれ、別々の振動周波数を個別に／選択的に使用して制御することができる。振動周波数は、１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚとすることができ、かつ、上述のチャネルの寸法の選択およびｎ＝１、ｍ＝２、ｃ＝１５００ｍ／ｓなどの選択により黙示的に決定される。その他の例は、１〜５ＭＨｚ、たとえば２〜５ＭＨｚまたは２ＭＨｚもしくは５ＭＨｚである。

【0022】

この二次元音響力ポテンシャルの１つの例は、振動周波数ｆ_１５＝５ＭＨｚに対して幅ｗ_１５＝３００μｍおよび高さｈ＝１５０μｍの水の満たされた事前整列チャネル（１５）の場合である。１５００ｍ／ｓの懸濁液中の規定音速ｃの場合、音響波長λ_１５＝ｃ／ｆ_１５＝３００μｍである。チャネルが半波長の倍数のみをサポートできるならば、振動がチャネル中にｙ軸（図１のａ−ａ’）とｚ軸（図２のｆ−ｆ’）の両方に沿って共振を含み得ることは明らかである。組み合わされたｙｚモードは、（ｙ_１，ｚ_１）＝（ｗ_１５／４，ｈ／２）および（ｙ_２，ｚ_２）＝（３Ｗ_１５／４，ｈ／２）において２つの振動圧力最小値をもつ。
ｃ）前記の音響的に事前収束された懸濁液および中央入口（１２）経由の注入無粒子液体を同時に第２分離チャネル（１６）の中に押しやるステップ。この場合、細胞および／または粒子の前記混合物は、前記第２チャネルの１つまたは複数の壁の付近に導かれる。したがって懸濁液は、音響泳動マイクロチャネルの片側または両側に沿って層状となる一方、無粒子流体は、チャネルの残りの部分を占める。無粒子液体と懸濁液の相対的体積流量Ｑ_２およびＱ_１は、それぞれ、第２チャネル（１６）に入ったときの細胞および／または粒子の横方向位置（ｙ＝ｗ_１）を決定する。Ｑ_２の増大は、ｗ_１の減少をもたらす。それを行う原動力は、項（ｄおよびｅ）において明らかにする。
ｄ）細胞および／または粒子の前記混合物に、主として前記分離チャネルのｙ軸沿いの方向に向けられる一次元音響力ポテンシャルを加え、それにより対象物のすべてをチャネルの垂直中央平面の方向に移動させるステップ。この一次元音響力ポテンシャルは、音響的に柔らかい水と音響的に硬いチャネルの壁の間の界面における反射により引き起こされる水の満たされたチャネル内の超音波の共振モードから生ずる。超音波振動の周波数を調節することにより、懸濁されている物体をチャネルの壁からチャネル中央の振動圧力ノードの方向に押しやる半波長共振モードを発生させることができる。これまでに二次元事前整列チャネルより整列させられており、壁の近傍に存在するこれらの物体は、チャネルの中央に存在する中央振動圧力最小地点の方向へ移動する。

【0023】

分離チャネルの幅は、７５μｍ〜８００μｍ（たとえば７５μｍ〜２００μｍ）、または２００μｍ〜３７５μｍ、または３００μｍ〜４００μｍ、または４００μｍ〜７００μｍまたは７００μｍ〜８００μｍ、または１５０μｍ、３００μｍ、１８８μｍ、３７５μｍまたは７５０μｍとすることができる。

【0024】

幅は、振動周波数ｆが次式のようになるように選ぶことができる：

ここで、ｃは、懸濁流体中の音速である。

【0025】

振動周波数は、１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で変化することができ、かつ、上述のチャネルの特定の寸法ならびにｎ＝１、およびｃ＝１５００ｍ／ｓなどの選択により黙示的に決定される。

【0026】

この一次元音響力ポテンシャルの一例は、振動周波数ｆ_１６＝２ＭＨｚに対して幅ｗ_１５＝３７５μｍおよび高さｈ＝１５０μｍの、水の満たされた分離チャネル（１６）とすることができる。１５００ｍ／ｓの懸濁液中の規定音速に対して、音響波長λ_１６＝ｃ／ｆ_１６＝７５０μｍ。このチャネルが半波長の倍数のみサポートできるものとすると、この振動がチャネルにおいてｙ軸（図１のｂ−ｂ’）に沿ってのみ共振を誘起し得ることは明らかである。このモードは、ｙ＝ｗ_１６／２において１つの振動圧力最小をもつ。

【0027】

各細胞および／または粒子は、流れに駆動されてチャネルに沿ってｘ方向に移動しつつ、ｙ方向に中央振動ノードに向かって懸濁媒体および細胞および／または粒子それぞれの音響機械的特性、質量密度および圧縮性により決定される速度で流される。この速度は、細胞および／または粒子のサイズおよび音響共振の強度によっても決定される。第２チャネル中の音響共振の振幅を調節することにより、細胞および／または粒子の経路を偏向させ、類似していない音響運動性をもつ細胞および／または粒子をｙ軸沿いの種々の位置でチャネルから離脱させることができる。

【0028】

すべての細胞および／または粒子は、分離チャネルに入るとき、ｙｚ平面において事前整列されているので、それらの個別軌道は、それらの音響物理的特性およびサイズを高度に反映している。事前整列がない場合、個々の細胞および／または粒子の軌道は、分離チャネルに入るときのそれらの初期位置により強く影響され、それは、実際には細胞および／または粒子の本質的特性ではない。
ｅ）入口（図６のＱ_１およびＱ_２）および出口Ｑ_３およびＱ_４における体積流量を調節し、処理時間を犠牲にして移動距離（ｗ_２）を最大にすること。細胞および／または粒子が中央出口（１３）に到達するためにより長い移動距離を強いることにより、その出口において誤識別される細胞および／または粒子の個数が減少する。Ｑ_４に対比してＱ_３を低減することにより、中央出口の流体力学的開口部（ｗ_３）が狭くなり、かつ（ｗ_２）の増大をもたらす。同様に、Ｑ_２に対比してＱ_１を低減することは、（ｗ１）を低減する。選択度の向上は、ある有限の体積の試料の処理時間（それはＱ_１に関係する）および十分に安定した流れを作成する外部流体工学装置の能力（この能力はＱ_３に関連するＱ_４の擾乱に関係する）に関する要求との釣り合いを維持しなければならない。

【0029】

方法ＩＩ
本発明は、第２の態様において、以下のステップを含む方法に関する：
ａ）懸濁液（５１）の容器中の静水圧ｐ_１を高めてチャネル入口（１１）における圧力をその他の流体接続部（１２、１３、１４、および７１）より高くすることにより、懸濁液（５１）を管（５５）経由で少なくとも１つの事前整列チャネル（１５）の中に押しやるステップ。前記圧力差により、チャネル中に層流が生ずる。この流れは、１μＬ／分から２ｍＬ／分まで変化し得る。高い圧力は、注射器ポンプ、蠕動ポンプを使用することにより、または流体の容器が置かれている密閉チャンバ内のガス圧を調節することにより生成することができる。
ｂ）細胞および／または粒子の懸濁液を事前整列チャネル（１１）の中に押しやり、前記懸濁液中の懸濁された細胞および／または粒子に、前記事前整列チャネルに垂直な方向に向けた二次元音響力ポテンシャルを加えるステップ（図７の差し込み図ｄ）。これにより粒子のすべてが１点に事前整列され、同時に流れのｘｙ平面および横断面のｚ平面において中央に集められる（図７の差し込み図ｅ）。前述の流速およびチャネルのサイズのときに支配的な層状の流れプロフィールは、事前整列後に前記点において収束された細胞および／または粒子を含んでいる。

【0030】

懸濁液中の細胞および／または粒子の音響力駆動分離を改善するこの二次元力ポテンシャルの実装形態の一例として、ｆ＝５ＭＨｚの共振周波数で設計された幅ｗ_２＝１５０μｍおよび高さｈ＝１５０μｍの、水の満たされたチャネル・セグメント（１５）を挙げることができる。１５００ｍ／ｓの懸濁液中の規定音速ｃに対して、音響波長λ＝ｃ／ｆ＝３００μｍであり、したがって正方チャネル横断面は、高さ（ｚ）方向と幅（ｘｙ）方向の両方における半波長定在波をサポートすることができる。
ｃ）懸濁液中の事前整列された前記細胞および／または粒子をチャネルの中に押しやり（このチャネルは、幅ｗ_３＝３７５μｍ、高さｈ_２＝１５０μｍとすることができる）、（１２）から層状主緩衝流を注入しつつ、全流量（事前整列流量＋主緩衝流量）を十分に低く保ってチャネル中の層状流れ形態を維持し、それにより事前整列された細胞および／または粒子の流れを前記第２チャネルの側壁に沿って層流化するステップ（図７の差し込み図ｅ）。前記のチャネルは、ｆ＝２ＭＨｚの共振周波数で設計することができる。１５００ｍ／ｓの規定懸濁液中音速に対して、音響波長λ＝ｃ／ｆ＝７５０μｍとなり、したがって矩形チャネル断面（ｃ−ｃ’）は、幅（ｙ）方向の半波長定在波のみサポートすることができる。
（ｄ）細胞および／または粒子の前記の事前整列された流れに、前記第２チャネル（ｃ−ｃ’）に垂直な方向に向けられた一次元音響力ポテンシャルを加えることより、これらの物体のすべてをｙ平面に沿って流れの横断面中の一点に向かって移動させるステップ（図７の差し込み図ｆ）。二次元事前整列により前もって整列され、現在側壁近傍に存在する細胞および／または粒子の向かう先の点は、前述したチャネル幅ｗ_３および規定音速における音響共振周波数により決定されるチャネルの中央における中央振動圧力最小点である。第２チャネルの中央に向かう粒子相互間の移動速度の差は、粒子の材料的特性、すなわち、サイズ、密度および音速の差異により決定される。したがって、一定の音響振幅および緩衝条件の下で、チャネル中の細胞および／または粒子の横方向位置（図７の差し込み図ｆおよびｉ）は、細胞および／または粒子がシステムを出て行く出口を（１３）、（１４）、（７１）のいずれかに決定する。よって出口の個数、流速および音響的効果を調節することにより、層流の一部を特定の出口に向かわせることが可能になる。これは、前述した音響的特性およびサイズなどによって一定の細胞および／または粒子の抽出を区別することを可能にする。
ｅ）流れを２つ以上のチャネルに分割することにより前記第２チャネルから、同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ細胞および／または粒子を収集するステップ。

【0031】

システム
別の態様において、本発明は、懸濁液中に存在する異なる種類の細胞および／または粒子の混合物から細胞および／または粒子のサブグループを分離するシステムに関し、このシステムは、以下を含む：
ｉ）２つの入口（１１、１２）および少なくとも２つの出口（１３，１４）ならびに少なくとも１つの第１チャネルをもつマイクロチップ。
ｉｉ）圧力を加える手段であって、前記圧力は、前記懸濁液を入口（１１）の中および少なくとも１つの事前整列チャネル（１５）の中に押しやる手段、
ｉｉｉ）二次元音響力（１５）を与える手段、
ｉｖ）前記チャネル（１２）に無粒子溶液を注入する手段
ｖ）一次元音響力（１６）を与える手段、および
ｖｉ）少なくとも２つの出口（１３、１４）から同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ物体を収集する手段。

【0032】

システムの一例は、図１〜５に示されている。図１および２は、細胞のサブセットたり得る粒子を含む懸濁液をシステム（１１）に押しやる方法を示している。次に、粒子を含む懸濁液（図１の差し込み図ｃ）を事前整列チャネル（１５）に導き、そして主としてｙｚ平面において働く第１の二次元音響力ポテンシャル（それぞれ、図１のａ−ａ’および図２のｆ−ｆ’）に曝して、細胞を２つの細胞のサブグループに収束する。これらのサブグループを２つの別々のチャネル中に分離し、次に無細胞溶液をシステムスルー（１２）に導く。無細胞溶液は、事前整列粒子の２つのサブグループをチャネルの壁に近い位置に押しやる（図１の差し込み図ｄ）。次に細胞のサブグループを一次元音響力（図１のｂ−ｂ’）（１６）に曝す。これは、相異なるサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ細胞を相互に分離して相異なる細胞の新しいサブグループ（図１の差し込み図ｅ）とする。次に、同一のサイズおよび／または質量密度および／または圧縮性をもつ細胞を（１３）および（１４）において収集する。これは、図５に示されている。これは、使用時にシステムにおいて生じていることを簡略化した図である。別の例を図７に示す。

【0033】

１つの実施形態では、マイクロチップは、図３および４に示すように取り付けることができる。これらの図は、同一のマイクロチップを２つの角度から見た図である。

【0034】

図３には、懸濁液中の細胞および／または粒子がマイクロチップに入る入口（１１）がある。無粒子緩衝溶液（１２）のための入口がある。この溶液は任意の適切な緩衝液でよく、当該分離レベルで分離されるべきもの、すなわち粒子／細胞が相互に類似する程度に依存する。緩衝液の例は、水、０．９％のＮａＣｌのような食塩水または細胞媒体または血液、血清、尿、乳またはその他の生物流体などの哺乳類から得られる液体である。その他の例は、油、湖沼からの水、飲料、水に懸濁させた沈殿物などの環境から得られる液体である。少なくとも２つの出口、すなわち、中央出口（１３）および側面出口（１４）があり、ここで細胞および／または粒子を収集する。

【0035】

チャネルをもつマイクロチップの上に、マイクロチャネル（３１）を密閉するガラス製のカバー／シーリングがある。シリコン基板（３２）も備えられており、この中にチャネル・セグメントがエッチングされている。分離チャンバ中に超音波作動のためのトランスデューサ（３３）が設けられている。二次元事前整列用の超音波作動のための第２トランスデューサ（３４）も設けられている。この実施形態では、装置中の温度の制御を可能にするペルチェ素子（３５）も設けられる。また、アルミ製の顕微鏡搭載台／放熱板（３６）も設けられており、ペルチェ素子から余分の熱を吸収する。ＰＴ−１００熱抵抗温度センサ（３７）を使用してフィードバック制御ループの温度を監視する。

【0036】

図４では、アルミニウム板（４１）が装置内の熱の一様な分布のために使用されている。入口接続部（４２）、シリコン管部品がある。その他の関連部品は図３に示すとおりであり、また、前述したとおりである。

【0037】

図５は、動作中のシステムの簡略化概要である。入力粒子／細胞懸濁液の圧力チャンバ（５１）が設けられている。ここで細胞および／または粒子は、マイクロチップの中に押しやられる。細胞および／または粒子を含まない緩衝溶液のための１つの圧力チャンバ（５２）が設けられている。これは、この溶液をマイクロチップの中に押しやる。中央出口（５３）および側面出口（５４）のための２つの圧力チャンバも設けられている。チャンバ中に４つの容器も用意されている。１つは細胞および本発明者らの粒子懸濁液のためであり（５１）、１つは粒子／細胞を含まない緩衝溶液（５２）（上述したような任意の溶液でよい）のためであり、１つの容器は中央出口（５３）のためであり、１つは側面出口（５４）のためである。チャンバ（５１）および（５２）ならびに２つのチャンバ（５３）および（５４）からの液体の転送を可能にする多数の管（５５、５６、５７および５８）も設けられている。

【0038】

本発明の１つの実施形態では、音響分離システムは、等温状態で作動する。一部の実施形態では、温度変動は、マイクロチャネル音響共振子の音響特性、ひいては分離結果に厳しい影響を及ぼすからである。これは、分離チップ近傍の温度センサからのフィードバックによりコンピュータ制御されるペルチェ素子上に微小流体音響分離チップを実装することにより達成できる。これによりマイクロチップ全体の上の温度が同じレベルに維持される。温度が高すぎる場合、それは、細胞および／または粒子に影響を及ぼすであろう。人体のような哺乳類に後刻送り込まれる細胞が分離される場合に、１つの例がある。細胞が高すぎる温度に曝されると、それらはストレスを受け、死滅することがあり、これらの細胞を必要とする対象者に戻すことが不可能となる。

【0039】

マイクロチャネルのサイズは、分離される細胞および／または粒子のサイズの上限を規定する。分離される細胞および／または粒子は、形状およびサイズにおいて、１μｍ〜５０μｍ（たとえば、１〜５μｍ、１〜２５μｍ、５〜５０μｍ、５〜４０μｍ、５〜３０μｍ、５〜２５μｍ、８〜２５μｍ）、または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０μｍ、または１０〜２０μｍもしくは１０〜１５μｍとすることができる。細胞および／または粒子の体積は、０．０００５〜７０×１０^−１５ｍ^３（たとえば、０．０００５〜０．００３×１０^−１５ ０．０００５〜０．０７×１０^−１５ｍ^３、０．０００５〜８×１０^−１５ｍ^３、０．０５〜０．１０×１０^−１５ｍ^３、０．０７〜７０×１０^−１５ｍ^３、０．０７〜３５×１０^−１５ｍ^３、０．０７〜１４×１０^−１５ｍ^３、０．０７〜８×１０^−１５ｍ^３、０．２５〜６×１０^−１５ｍ^３、０．３〜８×１０^−１５ｍ^３、０．０７〜３５×１０^−１５ｍ^３または０．５〜１５×１０^−１５ｍ^３）とすることができる。

【0040】

したがってバクテリア細胞を含む細胞および哺乳類に存在する細胞の大部分が含まれる。これらの細胞は、真核細胞から原核細胞までの任意の種類を含み、その例は、哺乳類細胞とバクテリア細胞の両方を含む。特殊な例は、ガン細胞、血小板、赤血球、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、大食細胞など）、脂肪細胞および大腸菌を含む。

【0041】

前記粒子は、たとえば、相異なる生物学的部分を互いに分離するためにしばしば使用される任意の種類のビーズであり得る。たとえば、そのようなビーズに対して認識要素の抗体を結合し、それにより種々の生物学的部分の懸濁液から生物学的部分を分離することができる。高分子ビーズ、電磁ビーズ、シリカ・ビーズなどのビーズに抗体が結合される場合にその一例があるが、この場合、抗体は、生物学的試料のような試料から抗原を分離するために使用される。

【0042】

実施例３では、二次元事前整列を使用した場合に５および７マイクロメートルのポリスチレン粒子の分離が改善されることが図８に示すように実証されている。

【0043】

前記チャネルの幅は、５０μｍから２０００μｍまで変化できる（たとえば、５０〜１０００、１５０〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ）。幅は、システムに適した好ましい波長のサイズおよび種々の細胞および／または粒子を収束する方法により規定される。

【0044】

本発明が利用できる一例は、ガンの領域である。このシステムは、潜在性／遅発性ガンと疾病死亡率の高いリスクに関連する浸潤性ガンの区別に有用となり得る。それは、疾病再発、進行および治療介入に対する応答の検出にも有用となり得る。

【0045】

免疫親和性応用技術（すなわちＶｅｒｉｄｅｘ−ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標））を用いてＣＴＣを分離する現在の臨床実務とは異なり、本発明は、血球からのＣＴＣの無標識分離を可能にする。したがって、本発明は、現在発見できないＣＴＣの亜母集団、すなわち、在来の免疫親和性抽出が成功するほど十分に高いレベルのＥｐＣＡＭを示さない細胞の分離も将来的に可能にするであろう。

【0046】

ガンは、ますます早期段階において連続に診断されている。しかしながら、多くの患者が転移性疾病のために倒れ続けており、また、局部的または遠隔播種を抱える患者にとって、予後診断は、依然として貧弱である。腫瘍は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の手段により新しい場所に広がると考えられている。ＣＴＣは、原発巣腫瘍またはその転移先から流れ出し、末梢血中を循環する腫瘍細胞として定義されている。ＣＴＣは、転移疾病をもつ上皮ガン患者の血液中で発見されている。また、ＣＴＣは、見掛け固形局所腫瘍の患者においても検出されているが、健康人では非常にまれであり、転移疾病の発病以前にさえＣＴＣが血流に流れ出すことを示している。

【0047】

血液中のＣＴＣの存在と臨床的関連の連関は、種々の形態の上皮ガンの患者において実証されている。ＣＴＣは、転移疾患の患者における無進行生存と全生存の両方の独立予測因子であることが見出されている。報告された食い違いは、いろいろな種類の上皮ガン相互間の差異に大いに起因するものであろうが、臨床試料における腫瘍細胞の検出に多大な困難をもたらしている末梢血液系におけるＣＴＣの希少性にもよるであろう。１０億の血液細胞に１個のＣＴＣという少なさである。

【0048】

細胞のカウントにより、または遺伝子発現プロフィール識別により、転移性ガン病期を監視し、かつ、種々の処置方法の治療効果を評価する末梢血液からのＣＴＣの抽出および分析は、最近出現した。

【0049】

この方法およびシステムを利用できるいろいろな種類のガンの例は、前述した固形腫瘍、前立腺、結腸直腸、乳房、肺臓の腺ガン、ＮＳＣＬＣ、卵巣、膵臓、ＧＩＳＴ、腎臓のガン、膀胱または腎臓の尿路上皮がん、黒色腫、中皮腫および神経膠種を含む。

【0050】

以下の例は、説明を意図するものであり、本発明をいかなる方法、形態、形状においても、明示的にも暗示的にも限定するものではない。

【実施例】

【0051】

実験設定
マイクロチャネル構造および入口と出口の穴は、厚さ３５０μｍの＜１００＞シリコン・ウエハーにＫＯＨエッチングされ、４０ｍｍ×３ｍｍのサイズに切断された（３２）。ホウケイ酸塩ガラス片（３１）（４０ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ）を陽極接合してチャネルを密閉した。入口および出口は、チップの裏側に接着されて外部流体装置の管に接続するシリコン製の管（４２）部品を含んでいる。

【0052】

チップ・アセンブリのすべての部品は、相互に接着される。下から上へ相互にサンドイッチされる：放熱板の役目も果たすアルミニウム取付板、ペルチェ素子（３５）（１５ｍｍ×１５ｍｍ）、シリコン入口／出口管の半径に合わせてドリルされた穴をもつアルミニウム棒（４１）（４０ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）、２つの圧電アクチュエータ、事前整列チャネルの下に配置される１つの約５ＭＨｚトランスデューサ（３４）（５ｍｍ×５ｍｍ）、および分離チャネル下に配置される１つの約２ＭＨｚトランスデューサ（３３）（１５ｍｍ×５ｍｍ）、および音響泳動チップ、図３および４参照。温度測定のためのＰｔ１００熱抵抗素子は、音響泳動チップに平行している２ＭＨｚ圧電セラミック・アクチュエータに接着される、図３参照。

【0053】

圧電セラミック・トランスデューサは、信号電力増幅器付きの２つの信号発生器により駆動される。音響共振は、周波数およびトランスデューサの電圧を調節することにより制御することができる。

【0054】

懸濁液中の細胞／微粒子は、５０または７０μＬ ｍｉｎ^−１の流量で第１事前収束チャネル（１５）に入る。ｙｚ平面における５ＭＨｚの共振により粒子は、２つの狭い帯状に収束される、図１および２参照。清浄な緩衝媒体が４５０または４９０μＬ／ｍｉｎで入り込み（１２）、事前整列粒子をさらに分割して粒子の流れを分離チャネル（１６）の壁付近に押しやる。ｙ座標沿いの１．９４ＭＨｚ共振のみ粒子をチャネル垂直中央平面の方向へ収束する。分離チャネルの末端において、流れは、三分流出口（１３および１４）において分かれる。中央出口（１３）体積流量は、１５０または２８０μＬ／ｍｉｎに設定され、結合側面出口（１４）の体積流量は２５０または２８０μＬ／ｍｉｎである。

【0055】

実施例１、５μｍおよび７μｍのポリスチレン・ビーズの分離
試料準備。５μｍおよび７μｍのポリスチレン・ビーズの混合物（約５ｍｇ ｍＬ^−１）をＰＢＳ中のトリトンＸ１００の溶液（０．０１％）に加えた。

【0056】

流れ系の設定。システム中の体積流量は、３つの１０ｍＬガラス注射器（１０１０ ＴＬＬ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により制御する。これらのうちの２つは、同じ注射器ポンプ（ＷＰＩ ｓｐ２６０ｐ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）上に実装する。これにより、中央出口と結合側面出口において、それぞれ、体積流量Ｑ３＝Ｑ４＝２５０μＬ ｍｉｎ^−１を維持する（Ｑｉの定義については、図６参照）。これらの２つの注射器の流量が主チャネル中の全体積流量（Ｑ_{ｔｏｔａｌ}＝５００μＬ ｍｉｎ^−１）を決定する。別の注射器ポンプ（ｎｅＭＥＳＹＳ，Ｃｅｔｏｎｉ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に実装される第３の注射器により、中央入口においてチャネルに無細胞緩衝溶液を全流量の９０％に相当する体積流量（Ｑ２＝４５０μＬ ｍｉｎ^−１）で注入する。粒子混合物は、大気圧の下で、テスト・チューブの底から側面入口に、３つの注射器により生成される正味流束により決定される全体積流量の１０％の流量（Ｑ１＝５０μＬ ｍｉｎ^−１）で引き込まれる。６ポートと２路からなる２つの試料ループ（Ｖ−４５１，Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）（それぞれ体積１００μＬ）を直列に出口に接続してシステムの作動中に分離性能を調べた。

【0057】

この装置の入口管を約１ｍＬの粒子混合物を含むテスト・チューブに浸す。テスト・チューブ中の沈殿効果を最小化するために、試料処理中に試料をピペットで静かに上下することにより混合する。流れをシステム中で数秒間安定化させてから２つの試料ループを収集モードに切り換えた。ループを各実験の過程において３回サンプルして、側面および中央の出口の粒子内容のそれぞれの分析を可能にした。

【0058】

得られた出口留分の分析。音響泳動の後、中央のそれぞれの側面出口留分中のマイクロビーズをフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により数え上げた。２つのビーズ・サイズは、前方／側方散布図において明確に区別することができた。

【0059】

音響泳動粒子分離方法。超音波作動周波数は、第１二次元事前収束チャネルでは約４．７９ＭＨｚに調節し、第２分離チャネルでは約１．９４ＭＨｚの基本共振を使用した。第１の実験では、２ＭＨｚ分離チャネル・トランスデューサ（３３）の電圧振幅は、０から１１Ｖｐｐまで変化させたが、５ＭＨｚ事前トランスデューサ（３４）はオフとした。事前整列トランスデューサをオンにした後、分離トランスデューサへの電圧を再び０から１１Ｖｐｐまで変化させた。結果を図８に示す。マイクロビーズの二次元事前整列が２つのビーズ・サイズ間の識別能力を改善したことは明らかである。

【0060】

実施例２。血液からの腫瘍細胞の抽出
細胞培養および正常血液提供者。ヒト前立腺ガン細胞株ＤＵ１４５をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＴＣ）から入手し、ＡＴＴＣの推奨に従って培養した。血液は、Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）の血液バンクの健康なボランティアから入手した。

【0061】

細胞の免疫染色、準備およびスパイキング実験。１ｍＬの試料の処理のために、１００μＬのアリコートの血液を蛍光色素共役した抗体ＣＤ４５−ＡＰＣ（１：５に希釈）または対照ＩｇＧ−ＡＰＣ（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡから）とともに室温において２０分間培養し、続いて等浸透圧ＲＢＣ溶解を１５分行った。５００ｇの遠心分離５分の後に、溶解した赤血球を含む上澄みを廃棄し、次にＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）による洗浄措置を行った。応用に応じて、細胞沈殿物をＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する前に、細胞を２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中において固定したか、または固定しなかった。前立腺ガン細胞をトリプシン／ＥＤＴＡにより分離し、次にＦＡＣＳ緩衝液により繰り返し洗浄した。次に、蛍光色素共役した抗体ＥｐＣＡＭ−ＰＥ（１：５に希釈）または対照ＩｇＧ−ＰＥ抗体（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を再懸濁し、氷の上で４０分間培養した。ガン細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁する前に、２％ ＰＦＡにより固定したか、または固定しなかった。赤血球溶解血液（１：１０に希釈）は、ＰＢＳ中において、２．５×１０^５ｍＬ^−１ＤＵ１４５細胞によりスパイクされた。

【0062】

流れ系の設定。システム中の体積流量は、３つの１０ｍＬガラス注射器（１０１０ ＴＬＬ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（そのうちの２つは、同じ注射器ポンプ（ＷＰＩ ｓｐ２６０ｐ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）上に実装される）により制御され、中央出口と結合側面出口の両方において、それぞれ、Ｑ３＝Ｑ４＝２８０μＬ ｍｉｎ^−１の体積流量を維持する（Ｑｉの定義については図６参照）。これらの２つの注射器の流量により主チャネル中の全体積流量（Ｑ_{ｔｏｔａｌ}＝５６０μＬ ｍｉｎ^−１）が決定される。別の注射器ポンプ（ｎｅＭＥＳＹＳ，Ｃｅｔｏｎｉ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に実装される第３の注射器により中央入口において無細胞緩衝溶液を全流量の７／８に相当する体積流量（Ｑ２＝４９０μＬ ｍｉｎ^−１）でチャネルに注入する。粒子混合物は、大気圧の下で、テスト・チューブの底から側面の入口に３つの注射器により生成される正味流束により決定される全体積流量の１／８の流量（Ｑ１＝７０μＬ ｍｉｎ^−１）で引き込まれる。６ポートと２路からなる２つの試料ループ（Ｖ−４５１，Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）（それぞれ体積１００μＬ）を直列に出口に接続してシステムの作動中に分離性能を調べた。

【0063】

この装置の入口管を約１ｍＬの粒子混合物を含むテスト・チューブの中に浸す。テスト・チューブ中の沈殿効果を最小化するために、試料処理中に試料をピペットで静かに上下することにより混合する。流れをシステム中で数秒間安定化させてから２つの試料ループを収集モードに切り換えた。ループを各実験の過程において３回サンプルして、側面および中央の出口の粒子内容のそれぞれの分析を可能にした。

【0064】

音響泳動細胞分離方法。超音波作動周波数は、第１の二次元事前収束チャネルにおいては約５．０ＭＨｚに調節し、第２の分離チャネルにおいては、約２ＭＨｚの基本共振を使用した。

【0065】

取得した出口留分の分析。音響泳動の後、中央のそれぞれの側面出口留分中の蛍光標識された細胞をフローサイトメトリにより数え上げた。ＷＢＣは、ＣＤ４５陽性およびＥｐＣＡＭ陰性として特徴付けられる一方、腫瘍細胞は、ＥｐＣＡＭ陽性およびＣＤ４５陰性として表記された。蛍光発光は、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量化された。

【0066】

音響事前整列対非事前整列。細胞の事前整列の効果は、ＤＵ１４５とＷＢＣの細胞混合物について試験した。これらの細胞は、事前整列チャネル中に超音波の存在する状態と存在しない状態のマイクロチップ中で分離チャネル中の電圧の振幅を上昇させつつ処理された。フローサイトメトリを使用して中央出口および側面出口の留分の細胞組成を評価した。細胞の定在波圧力ノードへの事前整列により、細胞は同じ高さおよび速度で分離チャネルに入るようになり、その結果、ガン細胞のＷＢＣからの分離が改善し、より安定化した。図９参照。

【0067】

実験結果の分析。実験結果を分析するために、中央出口および側面出口におけるガン細胞およびＷＢＣの個数をフローサイトメトリにより測定した。分離性能をプロットするために３つの尺度について計算した：腫瘍細胞捕捉効率 − 両方の出口における全検出ガン細胞個数に対する中央出口におけるガン細胞の個数。ＷＢＣ枯渇効率 − 両方の出口における全検出ＷＢＣ個数に対する側面出口におけるＷＢＣの個数。腫瘍細胞捕捉純度 ― 中央出口における全検出細胞個数に対する中央出口におけるガン細胞個数。

【0068】

保持時間の変化。ＷＢＣから腫瘍細胞を区別する能力はチップ中の細胞保持時間に強く依存することが示された。保持時間は、一定の圧電アクチュエータ駆動電圧および周波数の下で入口および出口の相対流量比を一定に保ちつつ、チップ中の全流量を変えることにより評価した。

【0069】

所望の応用に応じて、完全なＷＢＣ枯渇または全面的なＤＵ１４５細胞回復（しかし、ＷＢＣ枯渇の低下という犠牲の下に）が達成できる、図１０。試料処理流量は全流量の１／８に保ったので、４０μＬ ｍｉｎ^−１〜１００μＬ ｍｉｎ^−１にわたった。

【0070】

上記の試料処理流量は、システムの能力の上限を規定しない。圧電アクチュエータ駆動電圧の振幅を増加することにより、試料スループットは、低い流量について示されたものと同様な分離挙動を維持しつつ、１０ｍＬ ｈ^−１よりかなり高いレベルまで高めることができる（データは示されていない）。

【0071】

出口流量比の効果。図１０において、試料入口の流量および中央緩衝液入口の流量の比率は、１：７であった。この構成は、２つの出口における細胞の希釈をもたらした。これらの出口において、２つの試料収集ループにおける等しい保持時間を確保するために、流量は１：１の一定比率に維持した。側面対中央出口流量比を７：１に調節することにより、中央出口留分において検出された細胞と入力試料組成間の直接比較を行うことができる。

【0072】

中央出口における水力学的開口部を調整するこの方策は、分離条件を最適化する手段を提供する。出口比を調整することにより、最適濃縮を達成することができる。出口流構成の変更により、ＷＢＣの程度を低く維持しつつ高い腫瘍細胞捕捉効率をもたらし、かつ、ＷＢＣから少なくとも８００倍の腫瘍細胞の濃縮が達成された。中央出口および側面出口の流れの間の低減出口比は（水力学的開口部を縮減すること）、細胞が中央出口に行き着くまでに長い距離を進ませ、それによりＷＢＣ排除効率を高めることを意図している。

【0073】

例２は、音響泳動が独立技法またはその他の連続的に結合されるＣＴＣ分離技法に接続される技法として、ＣＴＣの効率的な分離のための実行可能な方法であることの第１の実験的証拠を記述している。

【0074】

提案するＣＴＣ分離方法の重要な特徴は、標識されていない、固定されているかまたは生きている細胞を対象とし得ることである。後者の場合、生細胞回復により、遺伝子のプロファイルおよび多様性の突っ込んだ分析のための分離後培養および抽出されたＣＴＣの増殖への道を開き、ひいては診断および予後予測を改善することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】