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特許6203745Ｔ細胞増殖のためのプロセス

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203745

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞増殖のためのプロセス

(51)【国際特許分類】

C12N 5/0783 20100101AFI20170914BHJP

C12N 1/00 20060101ALI20170914BHJP

A61P 31/12 20060101ALN20170914BHJP

A61K 35/12 20150101ALN20170914BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N1/00 GZNA

!A61P31/12

!A61K35/12

【請求項の数】16

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-546633(P2014-546633)

(86)(22)【出願日】2012年12月12日

(65)【公表番号】特表2015-501653(P2015-501653A)

(43)【公表日】2015年1月19日

(86)【国際出願番号】GB2012053113

(87)【国際公開番号】WO2013088147

(87)【国際公開日】20130620

【審査請求日】2015年7月6日

(31)【優先権主張番号】1121308.9

(32)【優先日】2011年12月12日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514100290

【氏名又は名称】セル・メディカ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部達彦

(72)【発明者】

【氏名】ライナー・ルートヴィヒ・クナウス

(72)【発明者】

【氏名】ケーティ・レベッカ・ニュートン

【審査官】伊達利奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１１／０２８５３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／１４６４７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／０５３１０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７−５１１２０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Visualized Experiments，2011.05.27, Vol.51, e2736, pp.1-6

【文献】 Cytotherapy，2008, Vol.10, No.3, pp.289-302

【文献】 Blood，2005, Vol.105, pp.2793-2801

【文献】 Journal of Immunology，2001, Vol.167, pp.3129-3138

【文献】 Blood，2007, Vol.110, No.11, p.2973

【文献】 Journal of Immunotherapy，2010, Vol.33, No.3, pp.305-315

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ５／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させるためのインビトロ増殖プロセスであって、標的抗原に関するペプチドおよびペプチドミックスからなる群から選択される抗原の存在下、ガス透過性容器においてＰＢＭＣの集団を培養するステップを含み；
サイトカインが外因性ＩＬ−２以外であるという特徴を有する少なくとも一種の外因性サイトカインの存在下、前記培養が実施され、サイトカイン、培地および栄養が前記増殖プロセスの開始の後に追加または交換されず、前記外因性サイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、インビトロ増殖プロセス。

【請求項2】

所望のＴ細胞集団を提供する増殖が、１４日間以下であることをさらに特徴とする、請求項１に記載のインビトロ増殖プロセス。

【請求項3】

前記外因性サイトカインが、ＩＬ−４およびＩＬ−７の組み合わせである、請求項１または２に記載のインビトロ増殖プロセス。

【請求項4】

前記培養が、Ｔ細胞増殖培地が存在する状態で実施される、請求項１から３のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項5】

前記ペプチドミックスが、２から５００のペプチドを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項6】

前記ペプチドが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のアミノ酸をオーバーラップする、請求項５に記載のインビトロプロセス。

【請求項7】

前記ペプチドが平均で、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長である、請求項１から６のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項8】

前記増殖が、１３、１２、１１、１０またはそれ以下の日数で実施される、請求項１から７のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項9】

ドナー由来の前記最初のＰＢＭＣ試料が、動員された試料または動員されたアフェレーシス試料である、請求項１から８のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項10】

前記ガス透過性容器が、ＧＲｅｘシステムまたは派生したもしくは等価のシステムである、請求項１から９のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項11】

前記ＧＲｅｘシステムを、無菌的な製造に適切な閉鎖系を提供するよう適応させた、請求項１０に記載のインビトロプロセス。

【請求項12】

無菌的にまたはクリーンルームで実施される、請求項１から１１のいずれか１項に記載のインビトロプロセス。

【請求項13】

薬学的に許容できる組成物を調製するステップをさらに含み、このステップがさらに希釈剤、安定剤、保存剤および／または他の薬剤的に許容できる添加剤を追加するステップを含む、請求項１から１２のいずれか１項で定義されたプロセス。

【請求項14】

前記抗原特異的Ｔ細胞集団またはこれを含む医薬組成物をコンテナに充填し、前記コンテナを密閉するさらなるステップを含む、請求項１３に記載のプロセス。

【請求項15】

同種抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させるためのインビトロ増殖プロセスであって、標的抗原に関するペプチドおよびペプチドミックスからなる群から選択される抗原の存在下、ガス透過性容器において同種ＰＢＭＣの集団を培養するステップを含み、サイトカインが外因性ＩＬ−２以外であるという特徴を有する外因性サイトカインの存在下、前記培養が実施され、前記プロセスが１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７日間以下の日数の前記抗原特異的Ｔ細胞の増殖から成り、前記外因性サイトカインが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、インビトロ増殖プロセス。

【請求項16】

ペプチド濃度が４、５、６、７、８、９または１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ細胞、特に同種Ｔ細胞等の抗原特異的Ｔ細胞を増殖するための新規の方法、そこから得られる細胞集団、前記細胞集団を含む医薬組成物、および治療、とりわけ免疫不全患者におけるウイルス感染の治療または予防のための細胞と組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫不全患者は日和見ウイルス感染にかかりやすい。これは骨髄臓器移植患者にとって大きな問題である。なぜなら患者の免疫細胞は通常、骨髄移植手技の間に消耗され、また骨髄移植の一般的な合併症である移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）に対するステロイド治療により免疫機能が抑えられることもある。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびアデノウイルス（ＡＤＶ）のような潜伏ウイルスが再活性化されると、身体は感染症と戦うことができない。本明細書に使用される用語、骨髄移植は、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ）の形式をすべて表し、これには、関連するあるいは関連のないドナー、または臍帯血から提供された幹細胞に関する手技を含む。

【0003】

免疫再構成という手法は進化を遂げてきた。免疫再構成においては、ＨＬＡが一致するドナーの免疫細胞を臓器移植患者へ移植（養子免疫細胞移入）がされるが、このドナーは通常骨髄を提供したのと同じドナーである。これらの細胞は患者内で生着し、ドナーの造血幹細胞が生着し種種の血液細胞と免疫細胞を作り出すことで患者自身の免疫系が完全に再構成されるまで、感染症との戦いにおいて病原体に対する長期的な免疫となり、または少なくとも一時的な援助となっているようである。

【0004】

骨髄移植後の患者で免疫再構成を達成する、ドナーからの免疫細胞の養子免疫細胞移入に対する数年間の臨床研究では、このアプローチの有益性とともに、アプローチを最適化して、効果的で安全な結果を常に確実なものとするための挑戦が示されてきた。ある場合には、特定の病原体に対する免疫再構成をもたらすのに必要なドナーの免疫細胞の数は、単純な機械的選択システムよって決定できない。そのような場合、治療的免疫細胞（特に標的病原体に適応可能な記憶免疫応答を示す抗原特異的Ｔ細胞）の最小用量は、エクスビボベースの細胞培養システムを使用して、ドナーの所望のＴ細胞集団を増殖することにより決定できる。従来技術では、ドナー試料からの細胞の増殖プロセスは一般に約２１日かかり、適切な細胞集団をできるだけ多くの数（産生量）得るために、また、できるだけ高純度、例えば、標的細胞に対して１００パーセント純粋に近い集団を得るために特定の細胞を増殖することに焦点を置いてきた。この増殖は明らかに時間がかかり、細胞培養による細胞増殖が確実に継続されるよう、抗原刺激が繰り返された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、恐らくこの背後にある考え２つの目的があり、第１は、適切な細胞の数が増加するほど、治療の効果が上がり、第２は、標的集団の純度の高さを保証することにより、毒性および細胞産物の混入からの有害反応が回避されるということである。

【0005】

外因性ＩＬ−２はＴ細胞増殖因子であると見なされてきたため、このサイトカインは培養において伝統的に使用されてきた。通常、増殖プロセスの間、外因性ＩＬ−２を週に１、２回供給する必要がある。

【0006】

発明者らは、以下の利点を１つまたは複数提供する抗原特異的Ｔ細胞の迅速な増殖プロセスを確立した：
１）細胞産物の生産において、効率的、頑強、実行可能でかつ／または、経済的にコスト効率に優れる
２）最小の培養期間で抗原特異的Ｔ細胞の治療用量（産成量）を提供する。
３）患者、特に臨床的に適切な文脈で移植臓器対個体反応疾患において、不要な毒性を引き起こし得る他の細胞からの混入を最小限にする。
４）ＧＭＰ要件に一致しない既存の技術に対して、新しく創造性のある技術的を適応させることで、ＧＭＰ製造要件へのコンプライアンスを保証する。
５）外因性ＩＬ−２を追加する必要のないオプションを提供する。
６）動員を受けたと考えられるドナーの血液試料からの増殖を可能とする。動員とは骨髄（造血幹細胞）提供前に、Ｇ−ＣＳＦをドナーへ投与することと定義される。
７）抗原特異的Ｔ細胞集団の適切な増殖と、有害となる恐れのある汚染細胞集団の存在との間の実現すべき所望のバランスを最適化することで、産物に従来技術と等しい、または従来技術より優れた特徴を付与する。
８）５０〜１００ｍｌｓという少量のドナー試料から増殖できる。

【0007】

以下に本プロセスを詳述する。

【0008】

これらの実用的な改良に加えて、本発明者らには、細胞を培養する従来技術の方法は、ＩＬ−２が存在する状態では特に長時間となり、これによりある程度消耗した、またはアネルギーを示すＴ細胞集団が生成されるということを信じるに足る理由がある。つまり、集団には所望の細胞が数多く存在するかもしれないが、これらのうちの多くは、機能しない、または複数の機能面において低応答性であるなどして、最良の機能を果たせない可能性がある。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らは、同種抗原特異的Ｔ細胞等の抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させるためのインビトロ増殖プロセスを考案した。このプロセスはガス透過性の培養表面を含む容器内でＰＢＭＣ（同種ＰＢＭＣ等）の集団を培養するステップを含むが、この培養は、標的抗原に関するペプチドまたはペプチドミックスの存在下で、少なくとも１つの外因性サイトカインの存在下で実施される。この少なくとも１つのサイトカインは外因性ＩＬ−２以外であるという特徴を有する。

【0010】

また、同種抗原特異的Ｔ細胞を急速に増殖させるためのインビトロでの増殖プロセスが提供されるが、このプロセスは、ガス透過性の培養表面を含む容器内で、同種ＰＢＭＣの集団を培養するステップを含み、この培養は、標的抗原に関するペプチドまたはペプチドミックスの存在下、抗原特異的Ｔ細胞の所望の集団を提供する増殖を１４日間以下の期間で実施するという特徴を有する、少なくとも１つの外因性サイトカインの存在下で実施される。

【0011】

本開示のプロセスは、抗原特異的Ｔ細胞を増殖するのに必要な時間とリソースを減少させ、頑強であり、汚染の危険を最小限にするという数多くの長所を有する。本プロセスをＧＭＰに準拠させ、治療を必要とする数多くの患者にとって利用可能とするため、これらの側面は実用上大変重要である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆから入手可能なＧＲｅｘシステムの図である。

【図2】図３で使用した装置の図である。

【図3】閉鎖系としての使用に適した改造済みＧＲｅｘシステムの図

【図4A】採血量５０〜１００ｍｌは、ＩＬ−４／７を使用した場合、アデノウイルス特異的Ｔ細胞を満足できる用量に増殖させるのに十分な量であるが、ＩＬ−４／７が無い場合は増殖が不十分であることを示す２つの試料のグラフである。

【図4B】採血量５０〜１００ｍｌは、ＩＬ−４／７を使用した場合、アデノウイルス特異的Ｔ細胞を満足できる用量に増殖させるのに十分な量であるが、ＩＬ−４／７が無い場合は増殖が不十分であることを示す２つの試料のグラフである。

【図5A】ドナーＩＩおよびＩＩＩから得て増殖させた細胞に対するサイトカイン特異的アッセイにおいてスポットを形成した細胞を示す。細胞はＣＭＶペプチドｐｐ６５、ＩＬ４およびＩＬ７の存在下、またはサイトカインの非存在下で培養した。

【図5B】ドナーＩＩおよびＩＩＩから得て増殖させた細胞に対するサイトカイン特異的アッセイにおいてスポットを形成した細胞を示す。細胞はＣＭＶペプチドｐｐ６５、ＩＬ４およびＩＬ７の存在下、またはサイトカインの非存在下で培養した。

【図6A】ＣＭＶおよびアデノウイルス特異的増殖集団の細胞増殖速度を示す。

【図6B】ＣＭＶおよびアデノウイルス特異的増殖集団の細胞増殖速度を示す。

【図7】Ｅｌｉｓｐｏｔを使用したアデノウイルスおよびＣＭＶ特異的サイトカインの生産を示す。

【図8】ＩＬ４増殖プロトコル対ＩＬ２増殖プロトコルを示す。

【図9】Ｆｉｇｕｒｅ９５ｎｇ／ｍｌ（ＣＭＶ）、５０ｎｇ／ｍｌ（１０×ＣＭＶ）または２５０ｎｇ／ｍｌ（５０×ＣＭＶ）のペプチド濃度での培養を示す。

【図10】異なるペプチド濃度でのＩＦＮｇ生産を示す

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書で採用される急速な増殖は、治療的産物を１８日間未満で、例えば７から１０日間で得るプロセスを指す。

【0014】

本プロセスから得られた抗原特異的Ｔ細胞集団は、従来技術方法で得られた産物と少なくとも同等であるが、数多くの点で特性が改良され、例えば、従来技術のプロセスにより調製した細胞と比較してアネルギーまたは消耗がまったく無いか少ない。

【0015】

Ｔ細胞の活性化は、多くの正負の調節プロセスによって厳密に制御されている。これにより、身体は自己免疫を最小限にしながら病原体に対する免疫を働かせることができる。Ｔ細胞の活性化は、樹状細胞のような成熟抗原提示細胞の表面の特定の分子がＴ細胞受容体と結合し、さらに共刺激因子を提供する際に起こる。

【0016】

例えば抗原提示細胞上の抗原が共刺激シグナルのない状態でＴ細胞受容体と結合した場合、アネルギーまたは低応答性が生じる場合があることが記述されている。この低応答性はサイトカイン分泌の減少、例えばインターフェロンガンマの分泌が低レベルになる、および／またはＩＬ−１３の分泌が低レベルになることにより明らかとなる。

【0017】

アネルギーの程度は次のようにして説明され得る。例えば、全集団の分泌を測定し、その後、適切な集団内の細胞の数で割って平均を出す。このとき、本プロセスにより調製した細胞が、従来技術のプロセスにより調製した細胞より多くのインターフェロンγを平均して分泌する場合、アネルギー−が軽度であることが説明され得る。

【0018】

インビトロにおいて、少なくともあるタイプのアネルギーは、例えばＩＬ−２の追加により逆転させられる。インビトロで、患者に細胞の養子免疫細胞移入を行う場合、アネルギー細胞がどのように応答するかは知られておらず、アネルギー細胞が復活してもともと有していた機能を果たすかどうかは不明である。

【0019】

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、治療用抗原特異的Ｔ細胞集団を調製する場合、投与する細胞の絶対数は、有効な産物を提供するという点で最も決定的な因子ではない場合がある。むしろ、投与する細胞の機能性がより重要である可能性がある。つまり、低応答性の細胞の数が最小限となる細胞の投与が重要となる場合がある。

【0020】

本プロセスは、細胞の培養が比較的短期間、一般に１４日以下であるという点で機能細胞の量を最適化する。したがって、この細胞は、それらが生存可能でない、または低応答性となり始めるポイントまで人為的に活性化されない。

【0021】

一実施形態では、細胞は、外因性ＩＬ−２が存在せず、代わりに内因的なＩＬ−２だけが存在する状態で増殖する。ＩＬ−２はＴ細胞刺激因子であることが知られているが、本方法中で使用した場合、それは、増殖を早めるが、ある不利益をもたらす場合があることが経験的観察によりわかっている。

【0022】

一実施形態では、外因性ＩＬ−２は少量で、例えば、１ｍｌ当たり１０ユニット以下で使用する。

【0023】

外因性の因子は、それを追加しない限りはＰＢＭＣの培養に存在しないものであるか、または細胞培養中に元々存在する量は、外因性の因子を追加することで増大されるものである。

【0024】

細胞増殖期間の短縮、および／または外因性ＩＬ−２の追加が必要ない細胞の増殖は、従来技術のプロセスでの人工的な条件（例えば長時間の増殖および／または高レベルの刺激）を回避し、これらに起因するアネルギー／消耗が最小限となり得ることを意味する。

【0025】

本プロセスでは、細胞の非標的集団を排除する必要はないが、しかしこれを最小限にしながら、十分な抗原特異的Ｔ細胞の集団を生成するようバランスを取る。

【0026】

通常、本プロセスから得られた増殖させた細胞集団は、標的抗原特異的Ｔ細胞集団の８０％以上を含まず、これは当該分野で確立された見識から著しく逸脱している。

【0027】

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、生成させた抗原特異的Ｔ細胞の集団は、インビボで十分増殖し続けることができると考えられる。これは産生した細胞がアネルギーでない／消耗されていないことが要因の一部である可能性がある。

【0028】

注入によって患者に投与された細胞は、インビボで増殖し続けるように意図されている。本明細書に記載されたプロセスによって生成された抗原特異的Ｔ細胞は意図した治療目的に適していると考えられる。

【0029】

本開示による増殖産物中の他の細胞集団は、少なくとも有害でなく、実際有益であり得る。なぜなら、例えば患者へ注入される全細胞集団がインビボでの天然環境を呈しており、結果この環境への適合性に優れることとなり得るからである。

【0030】

本明細書の文脈においてアネルギーは、抗原の存在下、１つまたは複数の方法でＴ細胞の機能的な非応答性を指すことを意図している。例えば、抗原特異的増殖を受けないおよび／またはＴＮＦ−αまたはインターフェロン−γのようなサイトカインを分泌しないなどである。本明細書で使用される集団は、数多くの別個の細胞を含む。集団の少なくとも８０％は何らかの点においてアネルギーではなく、例えば、適切な細胞の８５、９０、９５または１００％はアネルギーではない場合、適切な集団はアネルギーであるとは見なさない。もちろん、アネルギーは有る無しではなく、１つ以上の機能的なアッセイにより測定できるＴ細胞応答の一連の特質において観察されるべきである。

【0031】

上述のように、本明細書の文脈においてアネルギーは、１つまたは複数の関連する点で低下した細胞の機能を指す総称であることを意図する。本用語は、細胞の消耗、例えば細胞が分裂できなくなることを含む。つまりこの細胞は老化現象を示している。染色体の端部にありＤＮＡを防御する部分であるテロメアは複製に必要であるが、細胞分裂毎に短くなり、最後には、生物学的機構上これ以上の細胞分裂を制限するポイントまで短くなるため、細胞は分裂しなくなる。

【0032】

一実施形態では、アネルギーは低応答性である。

【0033】

一実施形態において、アネルギーはＩＬ−２の追加により、インビトロで可逆的であり得る。この特徴はあるタイプのアネルギーの分析として使用され得る。

【0034】

アネルギー細胞が提示する細胞表面マーカーには、例えばＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１ＵｎｉｐｒｏｔＱ１５１１６）またはＰＤ−１リガンドがある。一実施形態において、増殖した抗原特異的Ｔ細胞集団の１０％以下、例えば９、８、７、６、５、４、３、２または１％は表面にＰＤ−１を発現する。Ｂｌｉｍｐ−１はアネルギーの別の細胞表面マーカーであり得る。

【0035】

別の実施形態において、ＰＤ−１は、Ｔ細胞の上で恒久的に発現されず、発現は可逆的である。

【0036】

アポトーシス性の可能性がある細胞のマーカーには、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＳＡ、ＣＤ４５ＲＢの１つもしくは複数、またはこれらの組み合わせのダウンレギュレーション、および／またはＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ６９およびＣＤ２５の１つまたは複数のアップレギュレーションを含み得る。

【0037】

「Ｔ細胞」は一般に当技術分野において使用される用語で、ＣＤ３＋細胞をすべて含み、これは胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性Ｔリンパ球を含む。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得るが、Ｔ細胞をグループ化する他の集団が綿密な研究に基づき発見されている。Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞または他のＴ細胞の部分集合であり得る。

【0038】

本プロセスの産物であるＴ細胞の際立った特徴は、このＴ細胞が細胞の有効性および安全性の重要な側面である抗原特異性を提供する、ＣＤ３＋関連のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するということである。この抗原特異性は、患者において病原体特異的な方式で免疫を再構成するという意図した目的に必要なものである。細胞の標的集団はこのマーカーを使用して選択できる。

【0039】

一実施形態において、標的抗原特異的Ｔ細胞集団はＣＤ４＋を産生しやすい集団となる。それはつまり、抗原特異的応答がＣＤ４＋細胞に集中すると言うことである。一実施形態において、集団は、例えばＣＤ８＋細胞よりＣＤ４＋細胞を多く含む。

【0040】

本明細書で使用される抗原特異的Ｔ細胞集団は、標的となる抗原に特異的なＴ細胞を指す。特異的とは、適切なＴ細胞が、標的となる抗原と標的でない他の存在とを判別する能力を指す。

【0041】

ガス透過性の培養表面を含む容器は本プロセスの重要な部分となる。というのも、必要な全栄養素（Ｔ細胞増殖培地）があり、培地を交換、または因子を追加する必要がない状態で増殖を効率的に行えるからである。したがって、この容器には、必要とされる容積の培地を支持しつつ、周囲環境とのガス交換を行い、細胞増殖に十分な酸素レベルを確保できる。

【0042】

本開示のプロセスは、ガス透過性の培養表面を含む容器において適切に実行される。本明細書で使用される容器は、細胞、培地などを保持するのに適切な何らかのタイプのコンテナを指すことを意図し、例えば注入タイプのバッグ（ガス透過性部分を有する）等のバッグ、またはＧＲｅｘ（登録商標）システムのような硬質容器である。図１を参照すること。ガス透過性培養表面は、細胞の急速な増殖を促進し、必要な培地交換の回数を最小限にする。これにより、いわゆるワンタッチプロセスでの増殖細胞の製造が可能となり、プロセスに必要な構成要素はすべて１回で挿入され、増殖が完了するまで、干渉することなく放置できる。残るステップは、増殖した細胞の回収だけである。

【0043】

参照により本明細書に組み込んだ国際公開第２００５／０３５７２８は、ガス透過性容器（すなわちガス透過性の培養表面を含む容器）を準備する方法について記述している。一実施形態においてシリコンのガス透過性物質が使用される。

【0044】

一実施形態において、使用したシステムはＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆのＧＲｅｘ（登録商標）システムである。システムでは、細胞は２０日間以下、例えば１４、１３、１２、１１、１０日間以下、例えば１４日間または１０日間で増殖できる。

【0045】

本明細書で使用される急速な増殖は約１８日間以下、例えば１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、また例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８または７日間の増殖である。ほとんどの場合には９日か１０日が最適であると考えられる。

【0046】

この急速な増殖では、例えばプロセスの初めに培養に必要な全栄養物質および培地を加えることが可能であり、細胞は干渉を受けることなく増殖、分裂できる。これは、混入および誤操作の可能性を最小限にし、また細胞の増殖に必要な人的資源を最小限にするという利点を有する。

【0047】

産物が無菌的に製造できるよう、システムを閉鎖系にできる。これは例えば、米国仮出願番号第６１／５５０，２４６号に記載されている。本文献を参照により本明細書に組み込む。一実施形態において、システムは、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５８７に記載されているような改造されたシステムである。本文献を参照により本明細書に組み込む。

【0048】

したがって、一実施形態において、システムは治療的細胞を無菌培養するのに適切な閉鎖系であり本システムは、
（ｉ）細胞増殖を支援するのに適切であり、培養中の細胞にガスを送出できるガス透過性部分、および
基部に接した少なくとも１つの壁を有する容器であって、
前記容器は内部の容積を画定し、前記容器は細胞培養を支援するために必要な容積の培地を含むよう適応される容器、
（ｉｉ）液体が通過する内部開口部とこれに対して遠位にある外部開口部を画定する導管を含む通気管であって、この導管はシステムの構造上の特徴として閉鎖系の外部から伸長し、容器の内部へ伸長し、容器内部の内部開口部で終結し、内部開口部は、液体培地の充填および排出の際、液体によって遮断されにくいよう配置され、
外部開口部は無菌フィルタに連結するよう適応され、これによって容器中へ、または容器外へフィルタを通して、液体および細胞を容器へ出し入れするために必要なガスの出入りを可能とする、通気管、
（ｉｉｉ）容器へ液体および細胞を無菌的に導入できるよう適合され、システムを外的環境に曝さずに、システムから液体を排出できるように適合され、出口ポートから流体の流れに細胞を載せるようシステムが傾き、出口ポートが開いた時に、容器内で培養した細胞が重力によってシステムから排出できるよう適応されたポート（複数可）、を含む。

【0049】

この装置のシステムの例を、図３に示す。

【0050】

一実施形態において、全増殖プロセスは、閉鎖系で無菌的に実施した。

【0051】

一実施形態において、本システムに、表面積ｃｍ^２当たり約５０万個〜２００万個の細胞を播種した。１０ｃｍ^２の表面積を有するＧＲｅｘ−１０では、最小５００万個から最大２０００万個の細胞が播種される。

【0052】

一実施形態において、本システムには、約１０ｃｍ^２の細胞と等しい約２０００万個のエフェクター細胞を播種する。

【0053】

本発明は細胞のエクスビボ処理およびそこから得られたＴ細胞産物に関する。通常、本発明は、患者から試料を得るステップを含まない。

【0054】

ドナーから適切な試料を得るステップはルーチンの技術であり、血液試料の採取を含む。このプロセスは、ドナーを危険にさらすことはほとんど無く、また医者によって行なわれる必要はなく、適切に訓練された補助スタッフによって行なえる。一実施形態では、患者からの試料は血液約２００ｍｌであり、またはこれよりも少なく５０〜１００ｍｌである。

【0055】

十分な数の抗原特異的Ｔ細胞がこの少量の血液を使用して生成できることは驚くに値する。

【0056】

驚いたことに、発明者らは動員した血液試料のＰＢＭＣが増殖プロセスで使用され得ることを発見した。動員した試料とは、骨髄を刺激して幹細胞を産生させ、幹細胞を血液中へ放出させるＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）および他の因子を投与されたドナーの試料である。それが適切でないと考えられたというだけの理由で、今回得られた血液試料は患者の免疫の再構成療法において使用されてこなかった。ＮａｗａらはＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０００）２５，１０３５−１０４０で、例えば、Ｇ−ＣＳＦは、インターフェロンγ、ＩＬ−４の分泌能力を減少させ、さらに、増殖応答も低下させると示唆している。ＳｈａｎｔａｒａｍらはＢｌｏｏｄ，１５Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２００１，Ｖｏｌ９８，ｎｕｍｂｅｒ６においてさらに血液細胞の免疫機能がＧ−ＣＳＦでの動員後に減少することを示唆している。他の研究では、Ｇ−ＣＳＦによってＴ細胞集団が、細胞内でのウイルス感染の制御にあまり効果が見られないＴｈ２群へ変化する可能性があることが示唆されている。

【0057】

しかしながら、造血幹細胞提供後に、生体試料をさらに得る目的で再びドナーに来院を求めるのは不都合である。対照的に、移植用幹細胞試料をドナーから採取する際に免疫再構成産物の生成を目的とした増殖に必要な血液試料を採取するのは非常に好都合である。

【0058】

したがって、動員された血液を増殖に使用することは、医療従事者とドナーに実用上利点がある。

【0059】

本明細書で使用される動員された血液は、Ｇ−ＣＳＦ等の薬剤での処置によって動員されたドナーからの血液試料を指す。動員プロセスにより、末梢血の幹細胞の数が増加する。

【0060】

本明細書で使用される動員されたアフェレーシスは、Ｇ−ＣＳＦ等の薬剤での処置によって動員されたドナーの試料を指す。動員プロセスにより、末梢血の幹細胞の数が増加する。

【0061】

Ｔ細胞増殖のためのＰＢＭＣは、一般に当業者に既知のフィコール密度勾配分離によって血液またはアフェレーシス産物から得られる。

【0062】

当業者には既知であるが、Ｔ細胞の増殖は一般に適切なＴ細胞増殖培地で実施される。Ｔ細胞増殖培地は、例えば、コンシストリクローズまたは特許請求の範囲において指定したような、通常増殖ステップで使用する血清、培地および何らかのサイトカインを含む。

【0063】

一実施形態において、培地は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＡｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ培地またはＲＰＭＩ培地１６４０である。ＡｄｖａｎｃｅＲＰＭＩ培地は動物由来産物を含み、約２％のヒト血清で通常使用される。対照的に、ＲＰＭＩ培地１６４０は動物由来産物を含まず、１０％のヒト血清で通常使用される。ＲＰＭＩ培地１６４０は、一般的に本方法での使用に適している。

【0064】

また、リンパ球培養のための無血清培地はＡＱＩＸＲＳ−Ｉから入手可能である。

【0065】

一実施形態において、培地は４５％のａｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩ、４５％のＥＨＡＡ、１０％のＦＣｓおよび２００ｍＭのＬ−グルタミンを含む。

【0066】

一実施形態では、細胞増殖培地は１０％のヒトＡＢ血清、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、４５％Ｅａｒｌｅ’ｓＨａｍ’ｓアミノ酸（ＥＨＡＡまたはＣｌｉｃｋ’ｓ培地）、および４５％ａｄｖａｎｃｅｄＲＰＭＩまたは、ＲＰＭＩ−１６４０を含む。

【0067】

一実施形態では、使用するサイトカインは以下で議論される。

【0068】

一実施形態では、使用するＴ細胞増殖培地は、増殖プロセスの間に交換、補充されない。

【0069】

本明細書で使用される細胞増殖は細胞分裂の結果細胞の集団において標的細胞の数を増加させることを指す。

【0070】

Ｔ細胞増殖は、生存ＣＤ３＋細胞（つまり、細胞の標的集団はＣＤ３＋である）を計数することにより評価され得る。

【0071】

生存細胞はトリパンブルーでの細胞染色（および光学顕微鏡検査）により、または生体染色色素、６７０ｎｍ放出の７−アミノ−アクチノマイシンＤ（またはＶｉａＰｒｏｂｅ、７ＡＡＤの即時使用可能な市販溶液）とフローサイトメトリーにより、当業者に既知の技術を使用することで試験することができる。染料が細胞に浸透した場合、細胞は生存していないと考えられる。染料を取り入れない細胞は、生存していると考えられる。典型的な方法では、細胞懸濁液約１００μＬにつき７ＡＡＤ約５μＬ、およびＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（アポトーシス中に表面に露出されるリン脂質であるホスファチジルセリンに結合するリン脂質結合タンパク質）約５μＬを使用し得る。この混合物を約１５分間、暗室、室温でインキュベートし得る。その後、そのフローサイトメトリーにより分析し得る。例えばＭＧＷｉｎｇ，ＡＭＰＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｓ．ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉａｎｄＪＶＷａｔｓｏｎ．ＡｎＩｍｐｒｏｖｅｄＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎｓｉｎＳａｍｐｌｅｓｏｆＬｏｗＶｉａｂｉｌｉｔｙｕｓｉｎｇＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ１２６：２１−２７１９９０を参照のこと。

【0072】

別の染色は、ＴＯ−ＰＲＯ−３である。これは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７またはＣｙ５色素に類似した近赤外蛍光のカルボシアニンモノマーの核酸染色法である。これは核対比染色および死細胞指標として有益であり、核酸検出において最も高感度のプローブの１つである。

【0073】

抗原特異的Ｔ細胞集団が増殖できるウイルスには、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、帯状疱疹ウイルス、ＢＫウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルス、およびサイトメガロウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトＴリンパ好性ウイルスがある。

【0074】

本プロセスで使用する抗原は完全長ポリペプチド、ポリペプチドまたはペプチドのフラグメントを含む。

【0075】

本明細書で使用されるペプチドは、ペプチド結合により結合した短いアミノ酸のポリマーを指すように意図され、ペプチドは、少なくとも２つの、通常は最高５０のアミノ酸を含む。

【0076】

使用するペプチドは、１つまたは複数の線形のエピトープを提示するのに十分長く、平均７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または、２０のアミノ酸長である。

【0077】

一実施形態において、ペプチドの混合物のいくつかはオーバーラップしており（単一抗原の配列に関して）、つまりそれらは単一抗原に基づき、フラグメントの一部分、および親配列からのアミノ酸のある配列が、混合物内の１つ以上のペプチドフラグメントに生じるよう配列されることを言う。

【0078】

一実施形態において、各ペプチドには１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸のオーバーラップがある。

【0079】

一実施形態において、各タンパク質のペプチドライブラリは１５アミノ酸長で１１個のアミノ酸によるオーバーラップがあり、タンパク質が潜在的なエピトープをすべて表現できる。例えば、ペプチドを長くしてもよく、２５個のアミノ酸には１５個のオーバーラップが、または３０個のアミノ酸により２０個のオーバーラップがある。

【0080】

一実施形態において、標的ウイルスはＣＭＶであり、例えば、標的ウイルスで使用される抗原はｐｐ６５である。ヒト−サイトメガロウイルス（ＡＤ１６９株）に対する配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースのＮｏ．Ｐ０６７２５下にある。組換え型タンパク質はＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈから購入できる。後者の企業は、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＣＭＶｐｐ６５を提供するが、これは１１個のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップした、主として１５個のアミノ酸から成るペプチドのプールであり、ヒト−サイトメガロウイルスのｐｐ６５タンパク質の全配列をカバーしている。ＣＭＶの標的抗原はさらに、ｐｐ５０およびＩＥ−１（ＵＬ１２３として知られる）を含む。

【0081】

標的ＥＢＶ抗原にはＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２およびＢＡＲＦ１がある。これらの抗原に適切なペプチド配列の例には、関連の配列リストで開示した配列ＩＤＮＯ：１〜３３５の配列を含む。３４０個の抗原の配列を含む配列リストが、本出願に含まれている。

【0082】

アデノウイルスに対しては、標的抗原はヘキソンとペントンを含む。

【0083】

ＢＫウイルスについては、標的抗原には大型Ｔ抗原および小型ｔ−抗原を含む。

【0084】

一実施形態において、ペプチドミックスは２〜１０００のペプチドに含むか、これらから成り、より限定的には２〜５００、例えば２〜４００、２〜３００、２〜２００、または２〜１００、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００のペプチドを含むか、これらから成る。

【0085】

一実施形態において、５〜５００ｎｇのペプチド、または各ペプチドライブラリが培養１ｍｌ当たりに使用され、例えば５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０ｎｍ／ｍｌ、特に５ｎｇ／ｍｌが使用される。あるいは１、２、３または４ｎｇ／ｍｌのペプチドが使用され得る。

【0086】

約５ｎｇ／ｍｌ（４、５、６、７、８、９または１０ｎｇ／ｍｌ等）の濃度で使用したペプチドにより増殖した抗原特異的Ｔ細胞集団は、より高濃度のペプチドを使用して増殖した細胞と同等の、またはより高いインターフェロンγを９日目または１０日目に分泌する結果となる可能性があり有利である。

【0087】

一実施形態において、使用したペプチドはＧＭＰグレードである。つまり、ペプチドは製造管理および品質管理に関する基準を使用して製造されており、治療産物の調製に使用されるのに適切であることを意味する。

【0088】

本開示のプロセスで使用し得るサイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５を含む。

【0089】

まだ決定的ではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が、記憶細胞の表現を形成する際に必須の役割をどのように果たすかを記載した大量の文献がある。ＩＬ−２はＴ細胞クローン性増殖および収縮を制御し、リンパ球分化を促進する。ＩＬ−２とＩＬ−１５はさらに記憶細胞の分裂を支持でき、抗原誘発刺激と共にＣＴＬの増殖に使用できる。

【0090】

ＩＬ−７は末梢Ｔ細胞のホメオスタシスを調節し、インビボでのＣＤ４およびＣＤ８記憶Ｔリンパ球の両方の生成および長期生存に寄与する。

【0091】

一実施形態において、本開示によるプロセスで使用したサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ１５、特にＩＬ−４およびＩＬ−７から独立して選ばれる。

【0092】

一実施形態において、使用するサイトカインはＩＬ−４および／またはＩＬ−７である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、発明者らはこれらのサイトカインが、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の頻度、レパートリーおよび増殖を形成する際にある役割を有していると考えている。

【0093】

Ｔ細胞のレパートリーはプールに分注したペプチドライブラリでの刺激の後にＥＬＩＳＰＯＴ分析により決定され得る。（Ｋｅｒｎ，Ｆ．，Ｎ．Ｆａｕｌｈａｂｅｒ，Ｃ．Ｆｒｏｍｍｅｌ，Ｅ．Ｋｈａｔａｍｚａｓ，Ｓ．Ｐｒｏｓｃｈ，Ｃ．Ｓｃｈｏｎｅｍａｎｎ，Ｉ．Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｒ．Ｖｏｌｋｍｅｒ−Ｅｎｇｅｒｔ，Ｈ．Ｄ．Ｖｏｌｋ，およびＰ．Ｒｅｉｎｋｅ．２０００．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＤ８Ｔｃｅｌｌｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇｐｏｏｌｓｏｆｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．３０：１６７６−１６８２およびＳｔｒａａｔｈｏｆ，Ｋ．Ｃ．，Ａ．Ｍ．Ｌｅｅｎ，Ｅ．Ｌ．Ｂｕｚａ，Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｈ．Ｈｕｌｓ，Ｈ．Ｅ．Ｈｅｓｌｏｐ，Ｃ．Ｍ．Ｒｏｏｎｅｙ，およびＣ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｒｄ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｌａｔｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ２ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｉｎＣＴＬｌｉｎｅｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＥＢＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：４１３７−４１４７）。

【0094】

ＩＬ−４は一般に、２５０ｎｇ／培養ｍｌ以下の最終濃度、例えば２００ｎｇ／ｍｌ以下の最終濃度で使用される。

【0095】

ＩＬ−７は一般に、５０ｎｇ／培養ｍｌ以下の最終濃度、例えば２０ｎｇ／ｍｌ以下、特に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用される。

【0096】

もしＩＬ−１５が使用される場合、適切な最終濃度は５０ｎｇ／培養ｍｌ以下、例えば２０ｎｇ／ｍｌ以下、特に１０ｎｇ／ｍｌである。

【0097】

一実施形態において、ＧＲｅｘ−１０当たり約２０ｍｌｓ（例えば２０×１０^６ＰＢＭＣ）では、ＩＬ−４（１ｍＬ当たり１６６６ユニット）およびＩＬ−７（１ｍｌ当たり１０ｎｇ）を含む１０ｍｌｓ培地が追加される。

【0098】

ＩＬ−１２は、Ｔｈ１の集中に関与しており、Ｔｈ１／Ｔｈ２が均衡することが望まれる場合、外因性ＩＬ−１２は省略され得る。一実施形態において、本開示のプロセスは外因性ＩＬ−１２を使用しない。しかしながら、本Ｔ細胞産物の文脈において、ＣＤ４＋集団のＴｈ１応答が望ましいと考えられる。

【0099】

一実施形態において、本開示の増殖プロセスで１０日目または１１日目にＩＬ−４を使用する場合、増殖細胞の数は、ＩＬ−４をＩＬ−２に替えて類似のプロトコルを使用して増殖させた細胞より１０、２０、３０、４０５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００％上昇する可能性がある。

【0100】

しかしながら、約９、１０または１１日後に、ＩＬ−２およびＩＬ−４／７のプロトコルから提供される抗原特異的Ｔ細胞の数が、特定のγ分泌細胞の数の点から同じである場合でも、ＩＬ−２生存細胞はかなり少ない。細胞の生存率は本明細書に記載したように試験できる。

【0101】

外因性ＩＬ−２を急速な増殖システムで使用する場合、Ｔ細胞の過剰増殖が起こる。この過剰な急速増殖が生じると、増殖が速すぎ、残存細胞の多くが死滅せず、全細胞集団の中に存在し続け、所望のＴ細胞と残存細胞とのバランスが最適とならない。したがって本発明者らは急速な増殖で本質的に不適合な因子とある期間の細胞培養における選択性とを調整し、ＩＬ−２を省略すると、所望の細胞対残存細胞の比率が改善することを発見した。その上、７〜１４日間、例えば１０日間で、所望の細胞対残存細胞の比が、培養産物が治療での使用に適切となるポイントと交差する。この交差ポイントは治療用Ｔ細胞が十分有効性を発揮できる最小量が、患者体重１ｋｇ当たり最大５×１０５ＣＤ３＋Ｔ細胞の安全閾値以内となる用量処方内で達成される時点であると定義される。

【0102】

本発明者らはこの安全性閾値は、骨髄移植後の免疫再構成の実現を目的とする抗原特異的Ｔ細胞産物の投薬を最適化する文脈においてゴールドスタンダードとなるであろうことを期待している。

【0103】

最終的な増殖Ｔ細胞産物はそれぞれ、最初のドナー試料の本質的な違いにより厳密な組成は一様ではない可能性がある。しかし本産物の安全性プロフィールは、抗原特異的Ｔ細胞と残存細胞との比率を監視することにより制御できる。臨床上の文脈で本発明のプロセスから得られた産物の安全性を保証するよう制御できることは有利な点である。

【0104】

一実施形態において、増殖させた抗原特異的Ｔ細胞集団はＣＤ４＋細胞集団を産生する傾向がある。

【0105】

一実施形態において、本開示のプロセスはＣＤ４＋Ｔ細胞集団、例えばＴｈ１集団を含む細胞集団を提供するために使用される。本明細書で使用されるＴｈ１集団は、ＣＤ４＋集団を指すことを意図し、細胞の５％以上、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％以上がＴｈ１として分類される。

【0106】

記憶Ｔ細胞はＴｈ１細胞の構成要素である。

【0107】

一実施形態では、本プロセスから得られた細胞の集団は、記憶Ｔ細胞の下位集団を含み、例えば、記憶Ｔ細胞は、増殖細胞の１０、２０、３０、４０、５０または６０％に相当し、ＣＤ２７，ＣＤ２８，ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯを含むエフェクター記憶細胞のマーカーを一般に発現するであろう。これは増殖前の記憶細胞の集団より著しく高い数値となるであろう。

【0108】

本明細書で使用される標的抗原は、特定のウイルス（例えばＣＭＶ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＫウイルス）等の治療標的に対して、Ｔ細胞の特異性を発生させるために使用する抗原を指すことを意図する。したがって、標的ウイルス感染した細胞または癌細胞は通常標的抗原を発現し、従ってそれら自身が免疫系によるクリアランスの標的となる。免疫系は、身体から感染細胞を除去する（殺傷する）特別な能力を有しているが、問題となる細胞に感染する病原体に最低限の逃避機会を与えている。

【0109】

最終的な細胞集団の残りのＣＤ３、ＣＤ５６＋およびＮＫ細胞は有益となる可能性があるため、許容できる。

【0110】

本開示のプロセスを使用して増殖させた細胞集団は、所望のＴ細胞集団を含むが、一般的に所望の集団からのみ構成されることはないであろう。患者に投与される最終産物は、本プロセスにより増殖させる意図がなかった他の多くの細胞を含んでいるだろう。一実施形態では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の所望の集団は全細胞集団の約６０％以下、７０％以下または８０％以下を構成する。細胞集団の頻度は、当業者に既知のγ−ＩＦＮＥｌｉｓｐｏｔ分析を使用して測定され得る。

【0111】

一実施形態において、スペクトラタイピングで分析すると、本プロセスから得られたＴ細胞集団は多様であり、優性クローンの発現が無い。つまり開始試料でのＴ細胞の多様性は、増殖Ｔ細胞においてはっきり表れ、つまり、増殖は通常単一のクローンの増殖とはならない。

【0112】

一実施形態では、調製されたＴ細胞の適切な集団は表面にＴ細胞受容体を有する。１つまたは複数の実施形態において、本開示による細胞集団は、先行技術の方法で調製された細胞と比較すると、１つまたは複数の有利な特性を有する。

【0113】

一実施形態において、本開示の抗原特異的Ｔ細胞は、最大細胞径の９５％以下、９０％以下、例えば８５％以下、より明確には８０％以下の平均細胞径を有する。

【0114】

一実施形態では、適切なＴ細胞集団の細胞の平均細胞径は、１０〜１４ミクロンの範囲にあり、平均細胞径は、約１０、１１、１２、１３または１４ミクロンである。

【0115】

我々は、本開示の方法を使用して、最高用量に対してでも十分な細胞を調製できると考える。

【0116】

産物のリリース基準には以下のものがある。
同一性：ＣＤ４５＋細胞中でＣＤ３＋が５０％を超える
生存度：ＣＤ４５＋細胞の７０％以上
安全性：ＣＤ３＋用量が指定したＴ細胞の数を超過しない。
ウイルス特異性：特定のＩＦＮｇ産生により定義されるｋｇ当たり最低１００個のウイルス特異的細胞

【0117】

本発明の細胞培養は一般的に毒性が低く、例えば、炎症反応、細胞傷害、インフルエンザ様症状、悪心、脱毛等わずかの毒性不耐性応答を伴うだけであり、有利である。

【0118】

いくつかの実施形態では、本開示による細胞集団はさらに、以下の１つまたは複数の有利な特性を供給し得る。例えば、インターフェロンガンマ分泌のレベル、インビボでの増殖、Ｔ細胞活性化マーカー（例えばＴ細胞受容体）のアップレギュレーションが、集団内の抗原特異的Ｔ細胞の総数と比して高くなる可能性がある。

【0119】

一実施形態では、γキャプチャーを標的細胞集団の選択に使用してもよい。

【0120】

本明細書で使用されるような高レベルのインターフェロンガンマの分泌は、平均（ａｖｅｒａｇｅ）して（例えば、平均（ｍｅａｎ）とも表現される）、本方法により調製された集団内の細胞が先行技術の方法によって調製した細胞よりインターフェロンγを高いレベルで分泌する可能性があるという事実を指すことを意図している。この特性を分析するには、インターフェロンガンマ分泌のレベルを測定する前に、増殖後のある期間、細胞を休止させる必要がある場合があるこれは集団レベルで測定できるが、単一細胞レベルで測定する場合、従来技術を使用して作られた細胞と比較して、抗原特異的、つまり、インターフェロンγを産生する細胞の割合が高いことが明らかになるであろう。

【0121】

一実施形態において、本開示の細胞は、従来技術の方法により調製した細胞と比較して抗原特異性が増強されていることを、例えば本明細書で開示したアッセイにおいて示し得る。

【0122】

一実施形態において、本開示の細胞集団は従来技術の方法により調製された細胞集団に比較可能な（大きくは異ならない）親和性を示す。

【0123】

提供される治療用抗原特異的Ｔ細胞集団は、本発明の組成物においては技術的に治療用量以下で含まれ得る。しかしながら、患者への注入後、細胞はさらに増殖して、患者の免疫レパートリーの再構成を支援し得る。したがって、注入された細胞が消耗されていたりアネルギー性であったりする場合、インビボでの細胞の有効性は、１つまたは複数の点において損なわれ、または低下する可能性がある。

【0124】

したがって、細胞の「潜在能力」または「生物学的効果」は、標的治療用Ｔ細胞の再構成能力においては大変重要な問題である。

【0125】

本発明者らはこの洞察が当分野でのＴ細胞療法に対する現行の思考とアプローチにパラダイムシフトをもたらすと考える。

【0126】

一実施形態では、本開示によって提供されるＴ細胞集団はインビボでの増殖に効果を発揮し、標的ウイルスに感染した細胞および／または標的ウイルスに関連した癌細胞に対して適切な免疫応答をもたらす。

【0127】

本発明はさらに、本発明による同種抗原特異的Ｔ細胞集団を含む組成物にまで及ぶ。これらの組成物は、プロセス主要な手順の後に細胞集団に添加される希釈剤、担体、安定剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤または他の薬剤的に許容できる添加剤を含み得る。添加剤は調合物を安定させる、半減期を延ばす、組成物を患者等のインビボシステムにより適合させる機能を一般に有する。

【0128】

一実施形態において、タンパク質安定化剤は、例えばアルブミン、特にヒト血清アルブミンの製造後、細胞培養に追加され、安定化剤として作用し得る。製剤に使用されるアルブミンの量は、１〜５０％ｗ／ｗ、例えば１０〜５０％ｗ／ｗ、例えば２．２５、４．５または１２．５％ｗ／ｗ等である。

【0129】

一実施形態において、製剤はさらに、凍結保存剤、例えばグリセロール、ＤＭＳＯを含む。
ＤＭＳＯの量は、一般に１２％以下であり、例えば約１０％ｗ／ｗである。

【0130】

一実施形態において、本発明のプロセスは、薬剤的に許容できる添加剤、特に希釈剤、安定剤および／または保存剤等の本明細書に記載したような添加剤の追加により医薬製剤を調製するさらなるステップを含む。

【0131】

本明細書で使用される添加剤は、Ｔ細胞集団に添加される成分をすべて包含する総称であり、生物学的または生理学的機能を有しない。

【0132】

一態様では、患者に増殖した同種抗原特異的Ｔ細胞集団の医薬組成物が提供されるが、本組成物は、
ＣＤ３＋Ｔ細胞集団を含み、全集団においてＣＤ３＋は、患者１ｋｇ当たり５×１０５細胞を超えず、前記ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は、Ｔｈ１集団としての特性を有するＣＤ４＋細胞の治療的Ｔ細胞集団を、例えばＣＤ８＋ＣＴＬと一緒に含み；
任意で、非ＣＤ３＋細胞の集団を組成物の全細胞集団の２０パーセント以下であり、
適切な増殖させた抗原特異的Ｔ細胞集団はインビボで増殖可能であるという特徴を有する。

【0133】

一実施形態において、患者に増殖させた抗原特異的Ｔ細胞集団の医薬組成物を供給するが、本組成物は、
少なくとも７０％のＣＤ３＋Ｔ細胞集団および３０パーセント未満の非ＣＤ３＋細胞を含み、ＣＤ３＋細胞の全集団は、患者１ｋｇ当たり５×１０^４細胞（または５×１０５）を超えず、前記ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は、主にＴｈ１として特性を有するＣＤ４＋細胞の治療的Ｔ細胞集団を含み、
適切な増殖させた抗原特異的Ｔ細胞集団はインビボで増殖可能であるという特徴を有する。

【0134】

抗原特異的Ｔ細胞がインビボでの増殖に適切かどうかの分析は、細胞増殖分析、例えば本明細書に記述したＣＦＳＥ分析を例えば使用して、インビロトのシステムを利用して実施し得る。

【0135】

一実施形態において、増殖させた抗原特異的Ｔ細胞は、インビロトおよびインビボでさらなる増殖が可能であり、例えば２、３、４、５倍、またはそれ以上の高水準での増殖が可能である。

【0136】

一実施形態において、色素排除試験またはフローサイトメトリーによって測定可能であるが、適切な細胞の少なくとも７０％は生存可能であり、例えば、細胞の７５％、８０％または８５％以上が生存可能である。

【0137】

一実施形態において、増殖させた抗原特異的Ｔ細胞集団は、Ｔｈ１サイトカインを、例えば生物学上適切なレベルで産生できる。

【0138】

細胞増殖は、所与の刺激に対する分裂を監視する蛍光性化合物ＣＦＳＥで細胞を標識することで分析され得る。手短に言えば、細胞をＣＦＳＥで標識し、細胞分裂を刺激する抗原を添加する。これらの細胞を監視して、染料が各娘細胞に分割される際に、細胞の明るさが半分になるのをフローサイトメトリーによって検出する。そのため細胞集団の分裂回数を測定できる。

【0139】

最終製剤を調製したら、これを適切なコンテナ、例えば注入バッグまたはｃｒｙｏｖｉａｌに充填するであろう。

【0140】

一実施形態において、本開示によるプロセスは、Ｔ細胞集団またはその医薬製剤を注入バッグのような適切なコンテナに充填し、それを密閉するさらなるステップを含む。

【0141】

一実施形態において、本開示のＴ細胞集団、またはこれを含む医薬組成物を充填したコンテナは、保管と輸送のため凍結され、例えば約−１３５℃で保管される。

【0142】

一実施形態において、本開示のプロセスは、本開示のＴ細胞集団またはこれを含む医薬組成物を凍結させるさらなるステップを含む。一実施形態において、「産物」は毎分１℃ずつ温度を低下させることにより凍結させ、形成された結晶が細胞組織を破壊しないようにする。試料が約−１００℃に達するまで、このプロセスを継続し得る。

【0143】

本開示による産物は、本開示の培養細胞集団またはこれを含む医薬組成物を指すことを意図する。

【0144】

一実施形態において、本産物は患者のいる場所へ凍結した状態で移動、出荷、輸送される。

【0145】

一実施形態において、本開示による産物は、非経口投与、例えば注射、遅延注射、大量注射に適切な形態で提供される。一実施形態において、製剤は静脈注射に適切な形態で提供される。

【0146】

一態様では、本開示は本開示よる産物を、製造場所、または都合のよい集荷場所から目的の患者の近辺まで輸送する方法を提供し、本方法では、Ｔ細胞産物は輸送中に０℃以下、例えば−１００℃未満で保管される。

【0147】

一実施形態において、Ｔ細胞産物の温度変動を保管および／または輸送中に監視する。

【0148】

ある一実施形態において、治療、例えばウイルス病原体の治療に使用するための本開示の産物が提供され、ウイルスはアデノウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルス、単純性疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、肝炎、ロタウイルス、または類似したウイルスである。

【0149】

一実施形態において、本治療は免疫不全患者の治療である。

【0150】

一実施形態において、本開示による産物で患者を治療する方法が提供されるが、この方法は本明細書で定義した産物の治療上有効な量を投与するステップを含む。

【0151】

治療上有効な用量は、直ちに治療上の効果をもたらす量を必ずしも意味せず、インビボで増殖（投与後）して治療効果を提供するのに適切な用量を含む。

【0152】

技術的に適切な場合、本明細書に記載された実施形態が１つ以上組み合わせ得ることが想定される。

【0153】

本明細書の文脈では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されることとなる。

【0154】

ある要素を含む本開示の態様は、適切な要素から「成る」または「本質的に成る」他の実施形態まで拡大されることを意図する。

【0155】

本明細書で引用された参考文献はすべて、参照により明確に組み込まれる。
ＳｉｌｉＵらＬａｒｇｅ−ｓｃａｌｅｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ−ｐｒｉｍｅｄｐｏｌｙｃｏｌｏｎａｌｈｕｍａｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌｉｎｅｓｕｓｉｎｇｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄｃｅｌｌｓｆｏｒａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｏｔｈｅｒ．２００３Ｍａｙ−Ｊｕｎ：２６（３）：２４１−５６
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【0156】

実施例
抗原特異的Ｔ細胞産成物の増殖
試薬
本手順では、ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆｅＧＲｅｘシステムを使用して産生された養子細胞免疫療法の産生および凍結保存を記載する。

【0157】

【表1】

ＣＭＶｐｐ６５またはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（商標）等の標的ウイルスからのペプチドまたはペプチドミックス

【0158】

【表2】

【0159】

受入血液産物の受取：
全ドナーは、血液を採取して３０日以内に感染症（Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎、梅毒、ＨＴＬＶＩおよびＩＩおよびＨＩＶのマーカー）マーカーの検査を受けなくてはならない。万一ドナーに何らかの感染症に陽性の結果が出た場合、産物の採取は行われず、プロセスはキャンセルされる。

【0160】

ＩＬ−４
ＩＬ−４の５０μｇバイアルを注射用水２５０μｌで希釈して保存溶液２００μｇ／ｍｌ産生した。必要に応じて、希釈試料２０μＬを培養毎に添加する。残った試料を１．８ｍｌのＮｕｎｃＣｒｙｏｖｉａｌｓに５０μＬで小分けする。凍結バッチのＩＬ−４を使用する場合、物質が使用前に完全に溶解されていることを確認する。

【0161】

ＩＬ−７
ＩＬ−７の５０μｇバイアルを注射用水（ＷＦＩ）２００μｌで希釈した。溶液を、ＷＦＩ２４０μｌを加えてさらに１：２５に希釈し、１０μｇ／ｍｌの作業溶液を産生する。その後、この２０μｌを培養毎に使用する。残った試料を１．８ｍｌのＮｕｎｃＣｒｙｏｖｉａｌｓに５０μＬで小分けする。凍結バッチのＩＬ−７を使用する場合、物質が使用前に完全に溶解されていることを確認する。

【0162】

ペプチド
ペプチドを、１００μｇ／ペプチドバイアルにＷＦＩを２ｍｌ加えて再構成する。再構成したペプチド１００μｌを取り出して、ＷＦＩ９００μｌでさらに希釈する。その後、希釈したペプチド２０μＬを各培養に添加する。再構成したペプチドの５０μｌアリコートをＮｕｎｃｃｒｙｏｖｉａｌｓに分注する。濃縮したペプチドの残りの１５００μｌ（５０μｇ／ｍｌ）は、ＱＣ分析で使用するためにリリースする。

【0163】

洗浄用ＲＰＭＩ
ＲＰＭＩの５Ｌバッグを６００ｍｌの輸送パックの連結器に取り付ける。風袋はかりの上に輸送パックを置き、ＲＰＭＩ約５００ｍｌ（５００ｇ）を移した。一旦、バッファーをすべて移したら、線状に３回熱圧してヒートシールする。「患者識別子、洗浄用５００ｍｌ、使用まで２〜８℃で保存」と記載したラベルを貼る。

【0164】

注入用ＲＰＭＩ
ＲＰＭＩの５Ｌバッグに結合されているチューブに新規の６００ｍｌの輸送パックを接続する。風袋はかりを使用して１００ｍｌのＲＰＭＩをバッグへ移した。

【0165】

Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
１０００ｍｌバッグの連結器にＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐのボトルを取り付ける。２つの給気口をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐに取り付け、１００ｍｌをバッグへ入れる。「患者識別子、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ１００ｍｌ」と記載したラベルを貼る。

【0166】

単核細胞の調整−０日目
ＰＢＭＣをｓｅｐａｘの装置で密度勾配遠心法により調製する。プロトコルは当業者に既知である。

【0167】

実施例１２２６ＣＭＶ用のプロセス
−０日目
緩衝液調製
ＩＬ−４
ＩＬ−４（ＵＳＰグレード、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘｃａｔ１００３−０５０）の５０μｇバイアルをＷＦＩ（ＵＳＰグレードＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔＡ１２８７３）２５０μｌで希釈して保存溶液２００μｇ／ｍｌを産生した。保存溶液はポット接種に使用するため保存されているアリコートと一緒に−８０℃で保管した。

【0168】

ＩＬ−７
ＩＬ−４（ＧＭＰ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘｃａｔ１０１０−０５０）の５０μｇバイアルを、ＷＦＩ（ＵＳＰグレードＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔＡ１２８７３）２００μＬで希釈し、保存溶液を生成した。溶液を、ＷＦＩで１：２５に希釈し、作業溶液を産生し、その後、ポット接種に使用するため保存されているアリコートと一緒に−８０℃で保管した。

【0169】

ＣＭＶＰｅｐＴｉｖａｔｏｒのペプチド
６０ｎｍｏｌ／ペプチドのペプチド（ＧＭＰＰｅｐＴｉｖａｔｏｒｐｐ６５）を２ｍｌのＷＦＩ（ＵＳＰグレードＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔＡ１２８７３）で再構成した。再構成したペプチド１００μｌを採取し、ＷＦＩ９００μｌでさらに希釈した。希釈ペプチドの２０μＬを小分けした残りの容積と一緒にポット接種のために保持し、−８０℃で保存した。

【0170】

ＲＰＭＩ
ＲＰＭＩ＋Ｇｌｕｔａｍａｘの５Ｌバッグ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔ６１８７０）を６００ｍｌの輸送パックに接続し、ＲＰＭＩ５００ｍｌ（産物洗浄）を移した。ＲＰＭＩを２番目の６００ｍｌ輸送パックに接続して、さらに１００ｍｌ移した（ポット接種）。

【0171】

Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡｘｉｓＳｈｉｅｌｄＣａｔ１１１４７４０）１００ｍｌを１０００ｍｌ輸送パックへ移し、ＤＧＢＳ（密度勾配に基づく分離）サイクルで使用するため保管した。

【0172】

細胞の操作
非動員アフェレーシス１００ｍｌは、一致したドナーから２〜８℃の温度監視の下出荷された後、サイトに到着した。細胞生成物から３ｍｌ試料（ＳＴＡ）を取り、１ｍｌは１セットのＢａｃｔｅｃｓへ接種した。以下のＱＣおよび工程内試験を残りの出発物質で実施した。下記のテーブルに結果を示す。
細胞計数、自動細胞カウンタで実施
ＴｒｕｃｏｕｎｔによるＴ細胞の絶対的計数（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）
生存度染色（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ）

【0173】

【表3】

【0174】

ＲＰＭＩの５００ｍｌバッグおよびＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ１００ｍｌを、受入全血物質の残り（９７ｍｌ）と一緒にＣＳ９００．０２に接続した。Ｖ１２８ＤＧＢＳサイクルをＳｅｐａｘで選択し、キットをインストールした。サイクルの完了時に、４２ｍｌのＰＢＭＣを溶出し、以下の試験を行なった。

【0175】

１ｍｌの試料を溶出液バッグから取り出し、以下のテストを実施した。
細胞計数、自動細胞カウンタで実施
ＴｒｕｃｏｕｎｔによるＴ細胞の絶対的計数（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）
生存度染色（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、Ｃｄ４５−ＰＥ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ）

【0176】

【表4】

【0177】

２０×１０^６ＷＢＣ（細胞懸濁液４１０μｌ）を、２ｍｌのヒトＡＢ血清（ＧＭＰＧｅｒｍａｎＢｌｏｏｄＳｅｒｖｉｃｅ）、２０μｌのＩＬ−４／ＩＬ−７およびペプチドと一緒にＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆｅＢｉｏｐｏｔ（ＧＰ−４０Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に接種した。全容積をＲＰＭＩ（１９．６ｍｌ）を使用して、２０ｍｌまで増加させた。

【0178】

その後、ポットを、３７±２℃、５±１％ＣＯ２、９５％の湿度インキュベータで１０日間インキュベートした。

【0179】

−１０日目
細胞洗浄
１０日目に、ポットをインキュベータから出し、静かに揺動してＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆｅｂｉｏｐｏｔの基部の細胞を再懸濁する。２ｍｌの試料を採取し、２×２５０μＬはマイコプラズマ試験に使用する。残りの試料は以下の工程内試験において使用する。
トリパンブルーでのマニュアルの細胞計数
Ｔ細胞同定ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ

【表5】

【0180】

４．５％のＨＡＳ（ＢＰＬ）の２３０ｍｌバッグを調製し、残りの細胞懸濁液を希釈し、３００ｘ「ｇ」で１０分間遠心分離した。遠心分離が終わったら、細胞は固まり、上澄みはＰｌａｓｍａＰｒｅｓｓを使用して除去し、細胞を再懸濁し４．５％ＨＳＡ２３０ｍｌでさらに希釈した。細胞を３００ｘ「ｇ」で１０分間遠心分離する。これが最後の遠心分離である。その後上澄みを再び除去する。ペレットは新規の４．５％ＨＳＡで再懸濁する。

【0181】

試料１ｍｌを取り、以下のＱＣおよび工程内試験を実施する。
細胞内γ染色

【0182】

【表6】

【0183】

凍結と出荷
４．５％ＨＳＡ（ＢＰＬ）中２０％のＤＭＳＯ（Ｃｒｙｏｓｕｒｅ−ＤＭＳＯ，Ｗａｋ−Ｃｈｅｍｉｅ）溶液１００ｍｌを、氷嚢上で調製し冷却した。
必要な細胞用量＝３×１０^４Ｔ細胞／ｋｇ
患者の体重＝１６ｋｇ
したがって必要とされる細胞＝４８０，０００Ｔ細胞
以下の容積をＣｒｙｏｃｙｔｅｍａｎｉｆｏｌｄセットにより適切な大きさのＣｒｙｏｃｙｔｅバッグへ移した。

【0184】

【表7】

【0185】

３ｍｌの試料をＣｒｙｏｃｙｔｅバッグから取り出し、２ｍｌを各々１セットのＢａｃｔｅｃｓに入れる。残りの１ｍｌの試料は−８０℃で保存し、内毒素試験に回す。

【0186】

細胞産物を含むＣｒｙｏｃｙｔｅバッグは、冷凍速度を制御できる冷凍装置内に置き、細胞を−１℃／分の割合で−３０℃まで凍結させ、次に、−２℃／分で−１００℃まで凍結させた。凍結サイクルの完了時に、温度監視されたＬＮ２デュワーの気相に細胞を置いた。

【0187】

以下の安全性試験の結果は産物をリリースする前に得られた。

【0188】

【表8】

【0189】

一旦、患者の医師により要求があれば、産物はＱＰによりリリースし、温度監視された認証済断熱容器内に入れ、適切な幹細胞実験室に輸送する。到着後、細胞を注入するまで幹細胞実験室のデュワー瓶の気相内で保管した。

【0190】

実施例２２２６ＡＤＶのプロセス
−０日目
緩衝液調製
ＩＬ−４
ＩＬ−４（ＵＳＰグレード、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘｃａｔ１００３−０５０）の５０μｇバイアルを、ＷＦＩ（ＵＳＰグレードＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔＡ１２８７３）２５０μＬで希釈し、保存溶液２００μｇ／ｍｌを生成した。保存溶液を、ポット接種で使用するために残したアリコートと一緒に−８０℃で保管した。

【0191】

【0192】

ＡＤＶＰｅｐＴｉｖａｔｏｒペプチド
６０ｎｍｏｌ／ペプチドのペプチド（ＧＭＰＰｅｐＴｉｖａｔｏｒｈｅｘｏｎＶ）を２ｍｌのＷＦＩ（ＵＳＰグレードＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣａｔＡ１２８７３）で再構成した。再構成したペプチド１００μｌを採取し、ＷＦＩ９００μｌでさらに希釈した。希釈ペプチドの２０μＬを小分けした残りの容積と一緒にポット接種のために保持し、−８０℃で保存した。

【0193】

【0194】

【0195】

細胞の操作
非動員アフェレーシス１００ｍｌは、一致したドナーから２〜８℃の温度監視の下出荷された後、サイトに到着した。細胞生成物から３ｍｌ試料（ＳＴＡ）を取り、１ｍｌは１セットのＢａｃｔｅｃｓへ入れた。以下のＱＣおよび工程内試験を残りの出発物質で実施した。下記のテーブルに結果を示す。
細胞計数、自動細胞カウンタで実施
ＴｒｕｃｏｕｎｔによるＴ細胞の絶対的計数（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）
生存度染色（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ）

【0196】

【表9】

【0197】

【0198】

１ｍｌの試料を溶出液バッグから取り出し、以下のテストを実施した。
細胞計数、自動細胞カウンタで実施
ＴｒｕｃｏｕｎｔによるＴ細胞の絶対的計数（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ）
生存度染色（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ）

【0199】

【表10】

【0200】

【0201】

その後、ポットを、３７±２℃、ＣＯ２５±１％、湿度９５％のインキュベータで１０日間インキュベートした。

【0202】

１０日目
細胞洗浄
１０日目に、ポットをインキュベータから出し、静かに揺動してＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆｅｂｉｏｐｏｔの基部の細胞を再懸濁する。２ｍｌの試料を採取し、２×２５０μＬはマイコプラズマ試験に使用する。残りの試料は以下の工程内試験において使用される。
トリパンブルーでのマニュアルの細胞計数
Ｔ細胞同定ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ

【0203】

【表11】

【0204】

４．５％ＨＡＳ（ＢＰＬ）の２３０ｍｌバッグを調製し、残りの細胞懸濁液を希釈し、１０分間３００ｘ「ｇ」で遠心分離した。遠心分離が終わったら、細胞は固まり、上澄みはＰｌａｓｍａＰｒｅｓｓを使用して除去し、細胞を再懸濁し４．５％ＨＳＡ２３０ｍｌでさらに希釈した。細胞を１０分間３００ｘ「ｇ」で最後に遠心分離し、上澄みを再び除去した。ペレットは新規の４．５％ＨＳＡで再懸濁させた。

【0205】

試料１ｍｌを取り、以下のＱＣおよび工程内試験を実施した。
細胞内γ染色

【0206】

【表12】

【0207】

凍結および出荷
４．５％ＨＳＡ（ＢＰＬ）中２０％ＤＭＳＯ（Ｃｒｙｏｓｕｒｅ−ＤＭＳＯ、Ｗａｋ−Ｃｈｅｍｉｅ）溶液の１００ｍｌを調製し氷嚢上で冷却した。
必要な細胞用量は＝３×１０^４Ｔ細胞／ｋｇ
患者の体重＝１６ｋｇ
したがって必要とされる細胞＝４８０，０００Ｔ細胞

【0208】

以下の容積はＣｒｙｏｃｙｔｅｍａｎｉｆｏｌｄセットにより適切に分類されたＣｒｙｏｃｙｔｅバッグへ移した。

【0209】

【表13】

【0210】

３ｍｌの試料をＣｒｙｏｃｙｔｅバッグから取り出し、２ｍｌを１セットのＢａｃｔｅｃｓの各々の１つに入れた。残りの１ｍｌの試料は−８０℃で保存し、内毒素試験に回す。

【0211】

細胞産物を含むＣｒｙｏｃｙｔｅバッグは、冷凍速度が制御された冷凍装置内に置き、細胞を−１℃／分の割合で−３０℃まで凍結させ、次に、−２℃／分で−１００℃まで凍結させた。凍結サイクルの完了時に、温度監視されたＬＮ２デュワーの気相に細胞を置いた。

【0212】

以下の安全性試験結果は産物のリリース前に得られた。

【0213】

【表14】

【0214】

【0215】

実施例３
細胞の開始集団は、図で示したような適合させたＧ−Ｒｅｘシステムで培養した。培養には、１０％ヒト血清、ＩＬ４、ＩＬ７および所望の抗原に特異的なオーバーラップペプチドプールの存在下、ＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。その後のＣＭＶ特異的増殖に使用したペプチドはｐｐ６５だった。アデノウイルス（ＡＤＶ）に対してはａｄ５ヘキソンのオーバーラップペプチドを使用した。０．５，１または２×１０^６／ｃｍの播種密度を使用した。２×１０^６／ｃｍ^２で最大の細胞増殖が得られた。

【0216】

ＣＭＶ増殖の播種密度

【表15】