特許 6203752 前立腺癌の治療／予防処置の診断、予測及び評価のための材料及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203752

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】前立腺癌の治療／予防処置の診断、予測及び評価のための材料及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

   G01N33/574 D

   G01N33/574 A

   G01N33/53 Y

   G01N33/48 P

【請求項の数】18

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2014-550359(P2014-550359)

(86)(22)【出願日】2012年12月20日

(65)【公表番号】特表2015-503348(P2015-503348A)

(43)【公表日】2015年2月2日

(86)【国際出願番号】US2012070746

(87)【国際公開番号】WO2013101612

(87)【国際公開日】20130704

【審査請求日】2015年12月4日

(31)【優先権主張番号】61/582,212

(32)【優先日】2011年12月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507051972

【氏名又は名称】アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，イン

(72)【発明者】

【氏名】モリソン，ラリー

(72)【発明者】

【氏名】ペストバ，エカテリーナ

(72)【発明者】

【氏名】ソコロワ，イリーナ

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−０００１９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１８５２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５１１４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３６４９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３８６５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０６５８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Cellular Biochemistry，２００６年，Vol.97，p.433-447

【文献】 Cell，２００７年，Vol.128, No.1，p.157-170

【文献】 Acta Oncologica，２０１０年，Vol.49，p.888-894

【文献】 Cancer Letters，２００８年，Vol.270，p.13-24

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者からの前立腺細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブからなる検出可能に標識されたプローブのセットと接触させ、染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌の検出方法であって、
患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の、（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は、該患者が前立腺癌を有していることを示し、それにより該患者の前立腺癌が検出される、前記方法。

【請求項2】

前記前立腺細胞のサンプルは患者の前立腺の切片である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記切片をホルマリン固定・パラフィン包埋し、顕微鏡スライド上に載せる、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

染色体異常の存在を調べる前に、方法は前記切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定することを更に含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

染色体異常の存在を調べる前に、方法は前記切片を免疫蛍光法により評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩを同定することを更に含む、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記切片の免疫蛍光法による評価は該切片を検出可能に標識された抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを含み、該切片の領域中のＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩの存在を示す、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記切片の免疫蛍光法による評価の前に、方法は該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを更に含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

腫瘍ＲＯＩ中の染色体異常を調べることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

同一腫瘍標本の良性ＲＯＩ中の染色体異常を調べることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブからなる、前立腺癌診断用プローブセット。

【請求項11】

（ａ）ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブからなる、患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、並びに
（ｂ）患者から得た前立腺細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌を診断するための説明書
を含む前立腺癌診断用キットであって、
患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の、（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す、前記キット。

【請求項12】

染色体異常の存在を調べる前に、患者からの前立腺の切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定するための説明書を更に含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

染色体異常の存在を調べる前に、患者の前立腺の切片を免疫蛍光法により評価し、腫瘍ＲＯＩの存在を同定するための説明書を更に含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項14】

検出可能に標識された抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体を更に含み、前記の患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価するための説明書は、該切片を検出可能に標識された抗−ＡＭＡＣＲ抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを更に含み、該切片の領域中のＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩの存在を示す、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記説明書は更に、患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価する前に、該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含む、請求項１３に記載のキット。

【請求項16】

前記説明書は更に、患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価する前に、該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

前記説明書は腫瘍ＲＯＩ中の染色体異常を調べることを含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項18】

前記説明書は腫瘍ＲＯＩに隣接している良性ＲＯＩ中の染色体異常を調べることを含む、請求項１１に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌、特に前立腺癌の治療または予防処置の診断、予測及び評価方法、表現型及び遺伝子型異常の検出、免疫蛍光法及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、並びに前記方法において有用なプローブのセット及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺癌は男性において最も一般的な悪性腫瘍であり、男性における死亡原因は肺癌に次ぐ２番目である。２０１０年に新たに２１７，７３０の症例があると推定され、３２，０５０例が死に至った（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）。腫瘍の大部分は前立腺に限定されている。他は前立腺周囲エリアに臨床的に局在しているが、前立腺被膜を介して広がり、精嚢を含み得る。残りの腫瘍は転移性である。

【0003】

腫瘍が前立腺に限定されているときにこの腫瘍を早期且つ正確に検出することができる信頼できる診断マーカー及び疾患の進行を予測できる予後マーカーがないことが前立腺癌の管理における根本問題である。前立腺癌の早期検出及び診断は現在直腸指診（ＤＲＥ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）測定、経直腸的超音波測定法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）に頼っている。主要な診断アプローチはＤＲＥと血清ＰＳＡの測定の組合せを使用している。しかしながら、このアプローチは多数の限界を有している。ＰＳＡレベルの上昇の検出は特異的よりもより高感受性である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＮＥＪＭ ３５０：２２３９−２２４６（２００４））。従って、より多くの男性がＰＳＡスクリーニングのために無駄に針生検を受けており、残念ながら前立腺癌の局所的性質により診断中１５〜３０％の偽陰性率で針生検サンプリングエラーが生ずる（Ｃａｍｐｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．，５５：６００−６０９（２００９））。米国で毎年前立腺生検を受けている約１２０万人の患者のうち７０〜８０％が陰性の結果を受けるが、癌がサンプリングエラーにより見落とされるおそれがあるので安心することができない（Ｎｏｎｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６９：１４７０−１４７９（２００９））。従って、高いＰＳＡレベルが続いているために繰り返し（２回目、３回目または４回目）の生検が必要である（上掲のＣａｍｐｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，（２００９））。

【0004】

ＰＳＡ以外に、他のマーカー及び方法が同定されている。例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅レベルの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による測定が前立腺癌の重症度の測定方法であると開示されている（国際特許出願公開ＷＯ １９９８／０４５４７９）。増幅した８ｑ２４．１−２４．２染色体バンドセグメントの存在の測定が前立腺癌進行の診断方法であると開示されている（米国特許Ｎｏ．５，６５８，７３０）。８ｐ２１−２２遺伝子座の損失、８番染色体の増加、及びセントロメアコピー数に対するｃ−ｍｙｃのコピー数の更なる増加の測定が前立腺癌を予測する方法であると開示されている（米国特許Ｎｏ．６，６１３，５１０）。８ｐ遺伝子座（例えば、８ｐ２１−２２）に対するプローブ及び８ｑ２４遺伝子座に対するプローブを含む染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを測定し、そのハイブリダイゼーションパターンを前立腺癌診断と相関させることも開示されている（米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／００９１９９４）。８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ）の増加、及び８ｐ２１−２２（ＬＰＬ）のヘテロ接合性の損失（Ｂｏｖａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：３８６９−３８７３（１９９３）；Ｋａｇａｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１１：２１２１−２１２６（１９９５）；及びＥｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２９５９−２９６２（１９９５））及び１０ｑ２３（ＰＴＥＮ）（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７（５）：６７８−６８５（Ｓｅｐｔ．３，２００７；電子版Ａｕｇ．１４，２００７）も開示されている。１番〜２２番染色体の１つ以上上の１つ以上の遺伝子座でのヘテロ接合性の損失の検査も腫瘍または腫瘍発生前の表現型を有する細胞の検出方法として開示されている（米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／０１６５８９５）。２０Ｐ１Ｆ１２／ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の発現レベルの増加の検出が前立腺癌を同定するための方法として開示されている（米国特許Ｎｏ．７，０３７，６６７）。ＳＭＲＴ遺伝子座のヒト染色体１２ｑ２４の配列中の切断のＦＩＳＨを用いる検出が前立腺癌転移の可能性を調べる方法として開示されている（米国特許Ｎｏ．７，４２５，４１４）。ＰＴＥＮ ＲＮＡのような構成要素のレベルの測定が前立腺癌の存在を評価するための方法として開示されている（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ２００８／１２１１３２）。ＡＣＳＬ３−ＥＴＳ遺伝子融合の検出が前立腺癌の診断方法として開示されている（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ２００９／１４４４６０）。ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子の転写制御領域からの５’部分及びＥＲＧ、ＥＴＶ１またはＥＴＶ４遺伝子からの３’部分を有する遺伝子融合の存在の検出が前立腺癌を同定する方法（米国特許Ｎｏ．７，７１８，３６９）、及び再発、進行及び転移の可能性を予測する方法（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ２０１０／０５６９９３）として開示されている。ＰＩＴＸ２の過剰発現の検出が前立腺癌の存在またはそのリスクを診断するための方法として開示されている（国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ２０１０／０９９５７７）。ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、Ｉｆ４、ｋｅｒａｔｉｎ ８及びｕＰＡＲから選択される核酸またはポリペプチドの高いレベルの同定が前立腺癌の同定方法として開示されている（国際特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０３７６４３）。

【0005】

上記に加えて、前立腺癌「フィールド効果」は幾つかのグループにより研究されている。デジタル画像解析を用いて、研究者は前立腺癌に隣接している組織学的に良性の組織中の核形態のわずかな変化を同定した（Ｑｉａｎら，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，２８：１４３−１４８（１９９７）；及びＶｅｌｔｒｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１０：３４６５−３４７３（２００４））。ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、前立腺癌の隣接正常組織と臓器提供者から得た正常組織間の遺伝子発現プロフィールの違いが報告されている（Ｃｈａｎｄｒａｎら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，５（１）：４５（２００５）；Ｙｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２（１４）：２７９０−２７９９（２００４）；及びＲｉｚｚｉら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３（１０）：ｅ３６１７（２００８））。免疫組織化学を用いて、複数のバイオマーカーのタンパク質発現変化が近位及び遠位の正常及び高悪性度の前立腺上皮内腫瘍（ＨＧＰＩＮ）腺が注目された。これらのマーカーには、Ｍｃｍ−２及びＫｉ６７（Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，６：７３（２００６）；Ｓａｎｔｉｎｅｌｌｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２８（４）：６５７−６６６（２００７））、α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）（上掲のＳａｎｔｉｎｅｌｌｉら，（２００７）；及びＡｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６３（４）：３４１−３４６（２００５））及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５（３）：５６９−５７６（１９９９））等が含まれる。レーザーマイクロダイセクション及び定量的メチル化特異的ＰＣＲを用いて、前立腺発癌における高メチル化による遺伝子サイレンシングに対するフィールド効果も複数のグループにより知見された（Ｍｅｈｒｏｔｈｒａら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６８（２）：１５２−１６０（２００８）；及びＡｉｔｃｈｉｓｏｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７（６）：６３８−６４４（２００７））。遺伝子には、ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＳＳＦＩＡ、ＨＩＮ−１及びＲＡＰＡが含まれる。

【0006】

上記に照らして、前立腺癌の管理においてより信頼でき、情報を与える診断及び予測方法に対する要望が依然としてある。本発明は癌、特に前立腺癌の診断、予測、及び治療または予防処置の評価のためのマーカーのセット、並びに使用方法及び前記マーカーのセットを含むキットを提供しようとしている。この目的及び他の目的及び作用効果、並びに本発明の特徴は本明細書中の詳細な説明から明らかとなるであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第１９９８／０４５４７９号

【特許文献2】米国特許第５，６５８，７３０号明細書

【特許文献3】米国特許第６，６１３，５１０号明細書

【特許文献4】米国特許出願公開第２００３／００９１９９４号明細書

【特許文献5】米国特許出願公開第２００３／０１６５８９５号明細書

【特許文献6】米国特許第７，０３７，６６７号明細書

【特許文献7】米国特許第７，４２５，４１４号明細書

【特許文献8】国際公開第２００８／１２１１３２号

【特許文献9】国際公開第２００９／１４４４６０号

【特許文献10】米国特許第７，７１８，３６９号明細書

【特許文献11】国際公開第２０１０／０５６９９３号

【特許文献12】国際公開第２０１０／０９９５７７号

【特許文献13】国際公開第２０１１／０３７６４３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＮＥＪＭ ３５０：２２３９−２２４６（２００４）

【非特許文献2】Ｃａｍｐｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．，５５：６００−６０９（２００９）

【非特許文献3】Ｎｏｎｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６９：１４７０−１４７９（２００９）

【非特許文献4】Ｂｏｖａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：３８６９−３８７３（１９９３）

【非特許文献5】Ｋａｇａｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１１：２１２１−２１２６（１９９５）

【非特許文献6】Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２９５９−２９６２（１９９５）

【非特許文献7】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９７（５）：６７８−６８５（Ｓｅｐｔ．３，２００７；電子版Ａｕｇ．１４，２００７）

【非特許文献8】Ｑｉａｎら，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．，２８：１４３−１４８（１９９７）

【非特許文献9】Ｖｅｌｔｒｉら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１０：３４６５−３４７３（２００４）

【非特許文献10】Ｃｈａｎｄｒａｎら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，５（１）：４５（２００５）

【非特許文献11】Ｙｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２（１４）：２７９０−２７９９（２００４）

【非特許文献12】Ｒｉｚｚｉら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３（１０）：ｅ３６１７（２００８）

【非特許文献13】Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎら，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，６：７３（２００６）

【非特許文献14】Ｓａｎｔｉｎｅｌｌｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２８（４）：６５７−６６６（２００７）

【非特許文献15】Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６３（４）：３４１−３４６（２００５）

【非特許文献16】Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５（３）：５６９−５７６（１９９９）

【非特許文献17】Ｍｅｈｒｏｔｈｒａら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６８（２）：１５２−１６０（２００８）

【非特許文献18】Ａｉｔｃｈｉｓｏｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７（６）：６３８−６４４（２００７）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

患者の前立腺癌の検出方法を提供する。この方法に従って、前立腺腫瘍（悪性腫瘍；本明細書中「腫瘍関心領域（ＲＯＩ）」と呼ぶ）または前立腺の隣接する見かけ上良性のエリア（本明細書中、「良性ＲＯＩ」と呼ぶ）、例えば前立腺の１つ以上の組織切片中のゲノム異常を同定し、アッセイする。１つの実施形態では、方法は、患者からの前立腺細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させ、染色体異常の存在を調べることを含み、患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。

【0010】

別の実施形態では、方法は、患者からの前立腺細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させ、染色体異常の存在を調べることを含む。患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）からの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜２２の範囲で）１４を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％（増加％はＭＹＣ／ＬＰＬ ＞１の細胞の％である）、（２６〜４０の範囲で）３４を超える８番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）、（２２〜５４の範囲で）４４を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、または（１０〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％（増加％は＞１のＭＹＣ／８番染色体細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。標的パフォーマンスの領域：９７．１％の感受性と９６．２％の特異性の間の四分円において腫瘍ＲＯＩ ＦＩＳＨパラメーターについて組み合わせた「ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＰＴＥＮの損失％、またはＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％」のカットオフを選択した。患者の前立腺の良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜１９の範囲で）１８を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、（２５〜３４の範囲で）３２を超える８番染色体の異常％、（２２〜２８の範囲で）２６を超えるＰＴＥＮの損失％、または（９〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％は該患者が前立腺癌を有していることを示す。標的パフォーマンスの領域：８０．８％の感受性と８２．４％の特異性の間の四分円において良性ＲＯＩ ＦＩＳＨパラメーターについて組み合わせた「ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＰＴＥＮの損失％、またはＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％」のカットオフを選択した。

【0011】

前立腺細胞のサンプルは患者の前立腺の切片であり得る。切片はホルマリン固定・パラフィン包埋され、顕微鏡スライド上に載せられ得る。染色体異常の存在を調べる前に、方法は更に該切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定することを含み得る。或いは、染色体異常の存在を調べる前に、方法は更に切片を免疫蛍光法により評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩを同定することを含み得る。切片の免疫蛍光法による評価は、該切片を検出可能に標識されている抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを含み得、該切片の領域中のＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩの存在を示す。切片を免疫蛍光法により評価する前に、方法は更に該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含み得る。

【0012】

プローブのセットも提供する。１つの実施形態では、プローブのセットはＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、このプローブのセットは場合により更に検出可能に標識され得る抗−ＡＭＡＣＲ抗体を含む。別の実施形態では、プローブのセットはＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ＬＰＬに対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む。このプローブのセットは場合により更に検出可能に標識され得る抗−ＡＭＡＣＲ抗体を含む。

【0013】

キットも提供する。１つの実施形態では、キットは（ａ）ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含む患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、
（ｂ）患者から得た前立腺細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌を診断するための説明書
を含む。患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。別の実施形態では、キットは（ａ）ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ＬＰＬに対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、
（ｂ）患者から得た前立腺細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌を診断するための説明書
を含む。患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）からの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜２２の範囲で）１４を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％（増加％はＭＹＣ／ＬＰＬ ＞１の細胞の％である）、（２６〜４０の範囲で）３４を超える８番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）、（２２〜５４の範囲で）４４を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、または（１０〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％（増加％は＞１のＭＹＣ／８番染色体細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。患者の前立腺の良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜１９の範囲で）１８を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、（２５〜３４の範囲で）３２を超える８番染色体の異常％、（２２〜２８の範囲で）２６を超えるＰＴＥＮの損失％、または（９〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％は該患者が前立腺癌を有していることを示す。キットは更に、染色体異常の存在を調べる前に、患者からの前立腺の切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定するための説明書を含み得る。或いは、キットは染色体異常の存在を調べる前に、患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価し、腫瘍ＲＯＩの存在を同定するための説明書を含み得、このキットは更に検出可能に標識され得る抗−ＡＭＡＣＲ抗体を含み得、更に患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価するための説明書は更に該切片を検出可能に標識されている抗−ＡＭＡＣＲ抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを含み得、該切片の領域中のＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩの存在を示す。説明書は更に患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価する前に、該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1a】前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び癌標本（腫瘍関心領域、すなわち腫瘍ＲＯＩ）における染色体エニュメレータープローブ（ＣＥＰ）８の遺伝子座についての損失％及び増加％のグラフである。

【図1b】ＢＰＨ及び癌標本（良性ＲＯＩ）における染色体エニュメレータープローブ（ＣＥＰ）８の遺伝子座についての損失％及び増加％のグラフである。

【図2a】腫瘍ＲＯＩについての感受性対１−特異性（受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線）のグラフである。（黒四角）は染色体エニュメレータープローブ８の異常％（ＣＥＰ８の異常％）であり、（黒三角）はＭＹＣ／リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の増加％（ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％）であり、（黒丸）はＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％（ＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％）であり、（白四角）はホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の損失％（ＰＴＥＮの損失％）であり、（白丸）はＣＥＰ８、ＭＹＣ、ＬＰＬ及びＰＴＥＮの組合せカットオフ（４プローブカットオフ）である。

【図2b】良性ＲＯＩについての感受性対１−特異性（ＲＯＣ曲線）のグラフである。（黒四角）は染色体エニュメレータープローブ８の異常％（ＣＥＰ８の異常％）であり、（黒三角）はＭＹＣ／リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の増加％（ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％）であり、（黒丸）はＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％（ＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％）であり、（白四角）はホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）の損失％（ＰＴＥＮの損失％）であり、（白丸）はＣＥＰ８、ＭＹＣ、ＬＰＬ及びＰＴＥＮの組合せカットオフ（４プローブカットオフ）である。

【図3】ＣＥＰ８の異常％、ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％及びＰＴＥＮの損失％についての診断カットオフの表である。

【図4】個々のＦＩＳＨパラメーター（ＰＴＥＮの損失％、Ｃｅｐ７の異常％、ＭＹＣの増加％及びＣＥＰ８の増加％）、及び４プローブ組合せについての感受性対１−特異性のグラフ（ＲＯＣ曲線）である。データは１７個の良性ＲＯＩ及び２６個のＢＰＨ標本のＦＩＳＨ評価から計算した。４プローブ組合せについてのＲＯＣプロットは３３個の腫瘍ＲＯＩ及び２６個のＢＰＨ標本に基づいている。ＲＯＣ曲線の最大ＡＵＣを表に示す。

【図5】ＰＴＥＮの損失％、Ｃｅｐ７の異常％、ＭＹＣの増加％及びＣＥＰ８の増加％についての診断カットオフの表である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、癌、特に前立腺癌の治療または予防処置を診断、予測及び評価するためのマーカーのセット、並びに前記マーカーのセットの使用方法及び前記マーカーのセットを含むキットを提供する。以下の用語は本発明に関連している。

【0016】

「約」は表示されている値からおおよそ±１０％の変動を指す。前記変動は、特に言及がなされていてもいなくても常に本明細書中に記載されている所与の値中に含まれていると理解すべきである。

【0017】

国立衛生研究所が定義している「バイオマーカー」は、「治療介入に対する正常な生物学的プロセス、発病プロセスまたは薬理応答の指標として客観的に測定され、評価される特性」である。

【0018】

「染色体エニュメレーションプローブ（ＣＥＰ）」または「セントロメアプローブ」は、細胞中の特定染色体の数を計数できるプローブである。染色体エニュメレーションプローブは、典型的には特定の染色体のセントロメアまたはその近く（「セントロメア周囲」と称する）の領域、典型的には反復ＤＮＡ配列（例えば、α−サテライトＤＮＡ）を認識し、結合する。細胞分裂中の正確な隔離のためにセントロメアが必要であるので、染色体のセントロメアは典型的にはその染色体を表すと見なされる。特定の染色体領域の欠失または増幅は、特定遺伝子座に対応するシグナルの数（コピー数）をセントロメアに対応するシグナルの数と比較することによりその中に通常存在している全染色体（異数染色体）の損失または増加と区別され得る。この比較を行うための１つの方法は遺伝子座に相当するシグナルの数をセントロメアに相当するシグナルの数で割ることである。１未満の比は遺伝子座の相対的損失または欠失を示し、１を超える比は遺伝子座の相対的増加または増幅を示す。同様に、染色体内のアンバランスな増加または損失を示すべく同一染色体、例えば染色体の２つの異なる腕上の２つの異なる染色体間で比較を行い得る。染色体に対するセントロメアプローブの代わりに、染色体腕プローブを交互に使用して全染色体損失または増加を概算することができることを当業者は認識している。しかしながら、前記プローブに対するシグナルの損失は必ずしも全染色体の損失を示さないことがあるので、そのプローブは染色体を計数するほど正確でない。染色体エニュメレーションプローブの例には、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ（旧Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，イリノイ州ダウナーズ・グローブ）から市販されているＣＥＰ（登録商標）プローブが含まれる。

【0019】

「コピー数」は、単一遺伝子座、１つ以上の遺伝子座、または全ゲノムにせよそのＤＮＡの測定値である。２の「コピー数」は（６つの染色体を除いて二倍性であるので）ヒトにおいて「野生型」である。（性染色体を除いて）ヒトにおける２以外の「コピー数」は野生型から逸脱している。この逸脱には、増幅、すなわちコピー数の増加、及び欠失、すなわちコピー数の減少及び０というコピー数も含まれる。

【0020】

「標識されている」、「検出可能な標識で標識されている」及び「検出可能に標識されている」は、実在物（例えば、プローブ）が検出され得ることを指すべく本明細書中で互換可能に使用されている。「標識」及び「検出可能な標識」は、実在物が検出され得るように該実在物に結合している部分、例えば標的配列に結合するとプローブが検出され得るように該プローブに結合している部分を意味する。その部分そのものは検出可能でなくてもよいが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。用語「検出可能に標識されている」の使用は標識することを包含すると意図される。検出可能な標識は、標識が測定され得、その強度が結合している実在物の量に比例しているシグナルを発生するように選択され得る。分子、例えばプローブのような核酸を標識する及び／または検出するための広範囲のシステムが公知である。標識されている核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段により直接または間接的に検出され得る標識を取り込むかまたはコンジュゲートすることにより作成され得る。適当な検出可能な標識には、放射性同位元素、蛍光体、発色団、化学発光剤、ミクロ粒子、酵素、高磁気粒子、電子密度粒子、質量標識、スピン標識、ハプテン等が含まれる。蛍光体及び化学発光剤が本発明において好ましい。

【0021】

「遺伝子座特異的プローブ」及び「遺伝子座特異的同定子（ＬＳＩ）」は、染色体上の領域中の特定遺伝子座、例えば転移において増加／損失を受けたことが分かっている遺伝子座に選択的に結合するプローブを指すべく互換可能に使用され得る。プローブは標的コーディングまたは非コーディング領域またはその両方、例えばエクソン、イントロン、及び／またはプロモーター配列等のような調節配列であり得る。

【0022】

「核酸サンプル」は、プローブとのハイブリダイゼーションのために適した形態の核酸を含むサンプル、例えば核、または前記核から単離または精製された核酸を含むサンプルを指す。核酸サンプルは全部または部分的（例えば、特定の染色体）ゲノムＤＮＡ、全部または部分的ｍＲＮＡ（例えば、特定の染色体または遺伝子）、または選択した配列を含み得る。（間期または中期中に存在するような）凝縮した染色体がｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）において標的として使用するために適している。

【0023】

「所定カットオフ」及び「所定レベル」は、通常アッセイ結果を所定のカットオフ／レベルと比較することにより診断／予測／治療有効性結果を評価するために使用されるカットオフ値を指し、前記した所定のカットオフ／レベルはすでに各種臨床パラメーター（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善等）にリンクまたは関連している。

【0024】

本発明との関係で、「プローブ」は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にするかまたは促進させる条件下で標的配列の少なくとも一部に対して選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。通常、プローブはＤＮＡのコーディング、すなわちセンス（＋）鎖に対して相補的であり、またはＤＮＡの非コーディング、すなわちアンチセンス（−）鎖に対して相補的（時に、「逆相補的」と称す）であり得る。プローブの長さは大きく変わり得る。幾つかの用途では、約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば約１５〜約７５ヌクレオチド（例：約１５〜約５０ヌクレオチド）の長さが好ましいが、染色体プローブのためには約５０〜１×１０^５ヌクレオチドの長さが好ましく、遺伝子座特異的プローブのためには約２５，０００〜約８００，０００ヌクレオチドの長さが好ましい。

【0025】

「前立腺癌」には、すべてのタイプの前立腺癌、例えば腺癌、小細胞癌、扁平上皮細胞癌、肉腫及び移行上皮細胞癌が含まれる。前立腺癌の大部分（約９５％）が腺癌である。前立腺癌は前立腺癌の前駆体である前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ，更に低悪性度または高悪性度として区別される）と区別される。小細胞癌及び扁平上皮細胞癌は非常に攻撃性である傾向にあるが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の増加をもたらさない。移行上皮細胞癌は稀に前立腺に進行するが、膀胱及び／または尿道中の原発性腫瘍に由来しない。

【0026】

本発明との関係で、「選択的にハイブリダイズする」（及び「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的ハイブリダイゼーション」）は、核酸分子をストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的に結合する、二重鎖を形成するまたはハイブリダイズすることを指す。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的配列に対して優先的にハイブリダイズし、他の非標的配列に対して殆どまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレー、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨ）との関係で、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種条件下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な手引きは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈ．２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）（“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）中に記載されている。一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨで特定配列についての融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔ_ｍは（規定のイオン強度及びｐＨで）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブのＴ_ｍに等しいように選択される。アレー上、またはサザンまたはノーザンブロットではフィルター上に１００以上の相補的残基を有している相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は標準のハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）を参照されたい）。

【0027】

「標的配列」、「標的領域」及び「核酸標的」は、例えばその損失及び／または増加を調べる特定の染色体位置にあるヌクレオチド配列を指す。

【0028】

本明細書中で使用されている専門用語は特定の実施形態を説明する目的のみであり、そうでないにせよ限定的であると意図されない。

【0029】

前立腺癌の治療／予防処置の有効性を検出、診断、予測及びモニターする方法
患者の前立腺癌の検出方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、患者からの前立腺細胞のサンプルをハイブリダイゼーション条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させ、染色体異常の存在を調べることを含み、前記患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。別の実施形態では、方法は、患者からの前立腺細胞のサンプル（例えば、患者から得た組織切片または細胞）をハイブリダイゼーション条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させ、染色体異常の存在を調べることを含む。患者の前立腺の腫瘍ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜２２の範囲で）１４を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％（増加％はＭＹＣ／ＬＰＬ ＞１の細胞の％である）、（２６〜４０の範囲で）３４を超える８番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）、（２２〜５４の範囲で）４４を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、または（１０〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％（増加％は＞１のＭＹＣ／８番染色体細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。患者の前立腺の良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜１９の範囲で）１８を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、（２５〜３４の範囲で）３２を超える８番染色体の異常％、（２２〜２８の範囲で）２６を超えるＰＴＥＮの損失％、または（９〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％は該患者が前立腺癌を有していることを示す。腫瘍ＲＯＩ ＦＩＳＨパラメーターについての組み合わせた「ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＰＴＥＮの損失％、またはＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％」のカットオフを標的パフォーマンスの領域：９７．１％の感受性と９６．２％の特異性の間の四分円において選択した。良性ＲＯＩ ＦＩＳＨパラメーターについての組み合わせた「ＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＰＴＥＮの損失％、またはＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％」のカットオフを標的パフォーマンスの領域：８０．８％の感受性と８２．４％の特異性の間の四分円において選択した。

【0030】

プローブのセットは更に、ｐ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１遺伝子座）、３番染色体に対するセントロメアプローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ、１０番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブの１つ以上を含み得る。検出可能に標識されているプローブのセットは更に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２；１２ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）に対する遺伝子座特異的プローブ、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上を含み得る。

【0031】

前立腺癌に対する組織学的サンプル前処理及びハイブリダイゼーション方法を提供する。ＦＦＰＥ（ホルマリン固定・パラフィン包埋）組織学的標本スライド（切片）を５６℃で２〜２４時間焼いた後、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）またはＸｙｌｉｎｅを用いて室温で５〜１０分間ずつ２〜３回前処理した後、１００％ エタノールを用いて室温で１分間濯ぎを２回実施し、４５％ ギ酸／０．３％ 過酸化水素中、室温で１５分間インキュベートし、次いで脱イオン水を用いて３〜１０分間濯いだ。次いで、スライドを前処理溶液（１×ＳＳＣ，ｐＨ６．３）中、８０±５℃で３５〜５０分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３分間濯ぎ、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中０．１５％ ペプシン中、３７℃で２２±５分間インキュベートし、再び脱イオン水を用いて３分間濯いだ。スライドを７０％、８５％及び１００％ エタノールを用いて１分間ずつ脱水した後、風乾させた。標本に１０μＬのそれぞれのプローブハイブリダイゼーションミックス（ＬＳＩ（登録商標）緩衝液，ブロッキングＤＮＡ，標識したプローブ）を添加し、カバーガラスを被せ、ラバーセメントでシールした。スライドを７３±２℃で５分間共変性し、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ（Ｖｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて３７℃で１０〜２４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを外した。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成されている洗浄溶液中に入れ、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させ得る。次いで、サンプルを有している支持体を溶解状態の核ＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し得、またはサンプルを得る。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩで対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せる。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存し得る。

【0032】

前立腺ＦＦＰＥスライドＩＦ−ＦＩＳＨ手順の方法を提供する。同一ＦＦＰＥ前立腺固形腫瘍組織スライドに対する同時ＦＩＳＨ及び免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイのために、標本前処理／抗原賦活化プロトコルを開発し、ＩＦ−ＦＩＳＨ用のＦＦＰＥ組織に対する最良結果のために最適化した。

【0033】

この手順の第１ステップは抗原賦活化である。前立腺癌ＦＦＰＥスライドを５６℃で２時間〜一晩焼く。Ｈｅｍｏ−Ｄｅ中に１０分間ずつ２回浸漬することにより脱パラフィン化する。１００％ エタノール中で２分間ずつ２回インキュートする。８５％、７０％、５０％及び３０％ エタノール中に２分間ずつ置くことにより水和する。分子グレードのミリＱ水中に５分間浸す。温度が９６±４℃に達するまでクエン酸ナトリウム緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝液：１０ｍＭ クエン酸ナトリウム，０．０５％ トゥイーン２０，ｐＨ６．０）を収容しているコプリンジャーを用いて水浴を予加熱する。２０〜６０分間インキュベートする。ベンチを用いて室温で２０〜４０分間冷却する。スライドをミリＱ水で５分間洗浄する。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を用いて５分間１回濯ぐ。

【0034】

第２ステップはＡＭＡＣＲ抗体及びチラミドシグナル増幅アッセイ（３４）を用いる免疫蛍光法（ＩＦ）である。チラミド溶液アッセイ（ＴＳＡ）キット、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＴＳＡ（チラミドシグナル増幅）キット番号２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の指示に従って使用する。３％ Ｈ_２Ｏ_２中、室温で３０分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。ブロッキング試薬（１００μＬ／スライド）を添加し、加湿ボックスにおいて室温で３０分間インキュベートする。１００μＬの希ＡＭＡＣＲ家兔抗体（１％ ブロッキング試薬を用いて１：１００希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートする。スライドをＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄する。ストックＨＲＰコンジュゲート溶液を１％ ブロッキング溶液を用いて１：１００希釈する。１００μＬ容量のこの作業溶液が標準２２×２２ｍｍカバーガラスを覆うのに十分である。室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄する。ＰＢＳを用いて１回洗浄する。１００μＬ／スライドのチラミド溶液を添加した後、暗所において室温で１０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳを用いて５分間洗浄する。スライドをミリＱ水を用いて５分間洗浄する。ＦＩＳＨまで進める。

【0035】

第３ステップはＦＩＳＨアッセイである。スライドをアルコール（７０％、８５％及び１００％，１分間ずつ）を用いて脱水し、完全に風乾させる。各スライドに１０μＬのプローブ溶液を添加し、スライド上のカバーガラスをラバーセメントでシールする。プローブ及び標的ＤＮＡを７３℃で５分間共変性した後、３７℃で一晩ハイブリダイする。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成されている洗浄溶液中に入れ得、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させ得る。次いで、サンプルを有している支持体を溶解状態の核ＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し得、またはサンプルを暗所で乾燥し得る。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩで対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せる。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存し得る。

【0036】

上記した方法のすべてに関して、プローブの種類／サイズは少なくとも部分的に特定パラメーター、例えばコピー数、コピー数比、または関心遺伝子の増加％を測定するために使用される方法に依存する。上記診断／予測方法をｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨにより実施する場合、プローブは比較的大きくてもよい。上記診断／予測方法を別の方法により実施する場合、プローブはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）のために使用されるプローブより小さくても、実質的に小さくてもよく、この場合プローブを関心の遺伝子内の配列に対してハイブリダイズすることが好ましい。

【0037】

上にてらして、ＭＹＣを含むパラメーター、例えばＭＹＣのコピー数、ＭＹＣを含むコピー数比またはＭＹＣの増加％をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）により検出するためのプローブをＭＹＣ遺伝子を含む８番染色体の８ｑ２４領域に対してハイブリダイズさせることが好ましい。プローブは８ｑ２４のセントロメア側に位置する隣接領域、８ｑ２４のテロメア側に位置する隣接領域、または両方に対してもハイブリダイズし得る。好ましいプローブは８ｑ２４のおおよそ８２０ｋｂ、例えば８２１ｋｂをカバーし、ＭＹＣ遺伝子の中心にある。ＭＹＣを含むパラメーターを別の方法により検出するためのプローブは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）のために使用されるプローブよりも小さくても、実質的に小さくてもよく、この場合プローブがＭＹＣ遺伝子内の配列（配列情報はソース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ，ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ））からオンラインで入手可能である）に対してハイブリダイズすることが好ましい。「ＭＹＣ」は、パラメーターを測定するために使用する具体的方法に関係なくコピー数、コピー数比、増加％等のいずれにせよＭＹＣを含むパラメーターを測定するために使用され得る任意及びすべてのプローブを指すべく本明細書中で使用されている。

【0038】

「ＭＹＣ」のように、「ＬＰＬ」は、パラメーターを測定するために使用する具体的方法に関係なくコピー数、コピー数比、増加％等のいずれにせよＬＰＬを含むパラメーターを測定するために使用され得る任意及びすべてのプローブを指すべく本明細書中で使用されている。「ＬＰＬ」には、ＬＰＬ遺伝子を含む８番染色体のｐ２２領域に対してハイブリダイズするプローブが含まれる。ＬＰＬプローブは８ｐ２２のセントロメア側に位置する隣接領域、８ｐ２２のテロメア側に位置する隣接領域、または両方に対してもハイブリダイズし得る。好ましいＬＰＬプローブは８ｐ２２のおおよそ１７０ｋｂをカバーし、ＬＰＬ遺伝子の中心にある。「ＰＴＥＮ」は、パラメーターを測定するために使用する具体的方法に関係なくコピー数、コピー数比、増加％等のいずれにせよＰＴＥＮを含むパラメーターを測定するために使用され得る任意及びすべてのプローブを指すべく本明細書中で使用されている。「ＰＴＥＮ」には、好ましくはＰＴＥＮ遺伝子を含む１０番染色体のｑ２３領域に対してハイブリダイズするプローブが含まれる。ＰＴＥＮプローブは１０ｑ２３のセントロメア側に位置する隣接領域、１０ｑ２３テロメア側に位置する隣接領域、または両方に対してもハイブリダイズし得る。好ましいＰＴＥＮプローブは１０ｑ２３のおおよそ３６５〜３７０ｋｂ、例えば３６８ｋｂをカバーし、ＰＴＥＮ遺伝子の中心にある。ＰＴＥＮＥ遺伝子の隣接領域はセントロメア側上のＳＴＳマーカーＤ１０Ｓ２１５及びテロメア側上のＲＨ９３６２６を含む。上で説明したプローブ呼称の使用法が本明細書で検討されている方法、プローブ及びキットに当てはまる。同じ使用法が本明細書中に記載されている他のプローブの呼称にも当てはまる。ＭＹＣ遺伝子について上で示したように、本明細書中で列挙されている遺伝子についての配列情報はソース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｂ／ｇｅｎｂａｎｋ）及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。

【0039】

前立腺細胞のサンプルは患者の前立腺の切片である。組織切片のようなサンプルは、外科的切除、針生検、経尿道的前立腺摘除術（ＴＵＲＰ）または類似のテクニックにより得られ得る。切片をホルマリン固定・パラフィン包埋し、顕微鏡スライド上に載せる。或いは、凍結のような他の手段により保存した切片を使用してもよい。

【0040】

染色体異常の存在を調べる前に、方法は更に切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定することを含み得る。或いは、染色体異常の存在を調べる前に、方法は更に切片を免疫蛍光法により評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩを同定することを含み得る。切片の免疫蛍光法による評価は、該切片を検出可能に標識されている抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを含み得、切片の領域中でのＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩが存在していることを示す。切片を免疫蛍光法により評価する前に、方法は更に該切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含み得る。

【0041】

上記方法は当業界で公知の方法の適当な検出方法を用いて実施され得る。好ましくは、上記方法はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて実施される。好ましくは、各プローブを別個の標識、例えば別個の蛍光体で検出可能に標識する。或いは、本明細書中に記載されている放射標識したヌクレオチド検出（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ））、染色小粒ハイブリダイゼーション検出等を使用してもよい。

【0042】

上記方法を各プローブが別個の標識で検出可能に標識されているｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば各プローブが別個の蛍光体で標識されているＦＩＳＨにより実施する場合、方法は前立腺の生検により得た新鮮細胞（新鮮細胞は１〜３日間培養し、染色体が高度に凝縮される中期中に細胞をブロックするように培養物にコルセミドのようなブロッカーを添加し得、可視化し得る）のような新鮮な、凍結されている、または固定されている（例えば、ホルマリン固定・パラフィン包埋されてる）、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接近可能性を高め、非特異的結合を減らすように（例えば、ＲＮアーゼ及びペプシン）で処理されている前立腺細胞のサンプルに対して実施した後、１つ以上のプローブとハイブリダイズし、非結合プローブを除去するために洗浄し、ハイブリダイズしたプローブを検出し得る。例えば、細胞懸濁液をスライド上に単層として適用し得、細胞密度は光学または位相差顕微鏡により測定され得る。細胞は他のソース、例えば尿や精液のような体液から入手し、固定液、例えばメタノール−酢酸（カルノア試薬）中に保存し、微鏡検査及び分析のためにスライドまたは類似の支持体に適用してもよい。

【0043】

或いは、組織の切片（おおよそ厚さ４〜６μｍ）、例えば前立腺組織のホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの切片をスライド、例えばＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ正電荷を持っているスライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ，ペンシルベニア州ピッツバーグから入手可能）上に載せ、５６℃で２〜２４時間（一晩）焼き得る。ＦＩＳＨアッセイのために、その後Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，テキサス州ケラー）またはＸｙｌｉｎｅを用いて室温で５〜１０分間ずつ２〜３回前処理することにより切片を脱パラフィン化し、次いで１００％ エタノールを用いて室温で１分間の濯ぎを２回実施し、４５％ ギ酸／０．３％ 過酸化水素中、室温で１５分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３〜１０分間濯ぐ。次いで、スライドを前処理溶液（１×ＳＳＣ，ｐＨ６．３）中、８０±５℃で３５〜５０分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３分間濯ぎ、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中０．１５％ ペプシン中、３７℃で２２±５分間インキュベートし、再び脱イオン水を用いて３分間濯ぐ。スライドを７０％、８５％及び１００％ エタノールを用いて１分間ずつ脱水した後、風乾させる。

【0044】

標本に１０μＬのそれぞれのプローブハイブリダイゼーションミックス（ＬＳＩ（登録商標）緩衝液，ブロッキングＤＮＡ，標識したプローブ）を添加し、カバーガラスを被せ、ラバーセメントでシールする。スライドを７３±２℃で５分間共変性し、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ（Ｖｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて３７℃で１０〜２４時間ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを外す。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成されている洗浄溶液中に入れ、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させる。次いで、サンプルを有している支持体を溶解状態のＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し得、またはサンプルを暗所で乾燥し得る。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩで対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せる。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存し得る。

【0045】

この点で、熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を実施して、免疫蛍光法及びＦＩＳＨを同時に実施し得る。同一ＦＦＰＥ前立腺固形腫瘍組織スライドに対する同時ＦＩＳＨ及び免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイのために、標本前処理／抗原賦活化プロトコルを開発し、ＩＦ−ＦＩＳＨ用のＦＦＰＥ組織に対する最良結果のために最適化した。

【0046】

この手順の第１ステップは抗原賦活化である。前立腺癌ＦＦＰＥスライドを５６℃で２時間〜一晩焼く。次いで、スライドをＨｅｍｏ−Ｄｅ中に１０分間ずつ２回浸漬することにより脱パラフィン化する。次いで、スライドを１００％ エタノール中で２分間ずつ２回インキュベートする。スライドを８５％、７０％、５０％及び３０％ エタノール中に２分間ずつ置くことにより水和し、最後に分子グレードのミリＱ水中に５分間浸す。温度が９６±４℃に達するまでクエン酸ナトリウム緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝液：１０ｍＭ クエン酸ナトリウム，０．０５％ トゥイーン２０，ｐＨ６．０）を収容しているコプリンジャーを用いて水浴を前加熱する。スライドを２０〜６０分間インキュベートし、ベンチを用いて室温で２０〜４０分間冷却する。次いで、スライドをミリＱ水で５分間洗浄し、ＰＢＳを用いて５分間１回濯ぐ。

【0047】

第２ステップはＡＭＡＣＲ抗体及びチラミドシグナル増幅アッセイを用いる免疫蛍光抗体法（ＩＦ）である。チラミド溶液アッセイ（ＴＳＡ）キット及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＴＳＡ（チラミドシグナル増幅）キット番号２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の指示に従って使用する。３％ Ｈ_２Ｏ_２中、室温で３０分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。ブロッキング試薬（１００μＬ／スライド）を添加し、スライドを加湿ボックスにおいて室温で３０分間インキュベートする。１００μＬの希ＡＭＡＣＲ家兔抗体（１％ ブロッキング試薬を用いて１：１００希釈）を添加し、スライドを室温で１時間インキュベートする。スライドをＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄する。ストックＨＲＰコンジュゲート溶液を１％ ブロッキング溶液を用いて１：１００希釈する。１００μＬ容量のこの作業溶液が標準２２×２２ｍｍカバーガラスを覆うのに十分である。スライドを室温で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄した後、ＰＢＳを用いて１回洗浄する。各スライドにチラミド溶液（１００μＬ）を添加し、スライドを暗所において室温で１０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳを用いて５分間洗浄した後、スライドをミリＱ水を用いて５分間洗浄する。

【0048】

第３ステップはＦＩＳＨアッセイである。スライドをアルコール（７０％、８５％及び１００％，１分間ずつ）を用いて脱水し、完全に風乾させる。各スライドにプローブ溶液（１０μＬ）を添加し、カバーガラスをスライド上にラバーセメントでシールする。プローブ及び標的ＤＮＡを７３℃で５分間共変性した後、３７℃で一晩ハイブリダイズする。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成されている洗浄溶液中に入れ得、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させ得る。次いで、サンプルを有している支持体を溶解状態の核ＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し得、またはサンプルを暗所で乾燥し得る。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩで対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せる。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存し得る。

【0049】

検出前に、細胞サンプルを場合により見かけ上の細胞学的異常に基づいて前選択してもよい。前選択は疑わしい細胞を同定し、これによりスクリーニングをこれらの細胞に集中させることができる。前選択により、より早いスクリーニングが可能となり、陽性結果が見落とされない可能性が高まる。好ましくは、前立腺標本スライド上の関心領域をα−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）の過剰発現をＩＦ及び抗−ＡＭＡＣＲ抗体を用いて検出することにより同定する。或いは、生物学的サンプルからの細胞を顕微鏡スライド上に載せ、通常異形成及び新生細胞に関係する細胞学的異常を視覚的にスキャンすることができる。前記異常には、通常プローブをその標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションした後、核を核酸ステインまたは染料（例えば、ヨウ化プロピジウムまたは４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ））で対比染色することにより評価される核サイズ、核の形及び核染色の異常が含まれる。典型的には、新生細胞は広がった不規則な形を有し、及び／またはまだらな核染色パターンを示す。典型的には約０．４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で使用されるヨウ化プロピジウムは６１４ｎｍの発光ピーク波長で観察され得る赤色蛍光ＤＮＡ特異的染料である。典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されるＤＡＰＩは低倍率のＤＡＰＩフィルターを用いて４５２ｎｍの発光ピークで観察され得る青色蛍光ＤＮＡ特異的ステインである。この場合、検出のために前選択した細胞のみを染色体損失及び／または増加についてカウントする。好ましくは、少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０〜４０個のオーダーの前選択した細胞を染色体損失及び／または増加について評価するために選択する。

【0050】

或いは、あるレベルの形成異常または疑わしい病変を示すエリアを低倍率のＤＡＰＩフィルターを用いて局在化させ、異常コピー数のプローブを有している核の存在について十分に調査し得る。正常細胞では、所与プローブの２コピーが検出される。異常細胞では、所与プローブよりもより多いまたはより少ないコピーが検出される。最も有意なコピー数変化を有するエリアをエニュメレーションのために選択することが好ましい。可能ならば、３つの異常エリアを選択し、各異常エリア内で１０個のランダムな核を高倍率（６４×または１００×対物レンズ）で分析する。好ましくは、核は非重複性であり、十分に明るいシグナルを有する。

【0051】

或いは、検出のための細胞は細胞学的または組織学的特徴と無関係に選択され得る。例えば、顕微鏡スライド上の所与の１つ以上のエリア中の非重複細胞のすべてが染色体損失及び／または増加について評価し得る。更なる例として、スライド上の細胞、例えば顕微鏡スライド上に順序通りに現れる少なくとも約５０個、より好ましくは少なくとも約１００個のオーターの変化した形態を示している細胞が染色体損失及び／または増加を評価するために選択され得る。

【0052】

ＭＹＣ（８ｐ２４）、ＬＰＬ（８ｐ２２）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）及び８番染色体のコピーを単独で、またはｐ１６（９ｐ２１）、３番染色体、７番染色体、１０番染色体及び１７番染色体の１つ以上のコピーと更に組み合わせて、並びにＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１）及びその欠失及び／または転座をカウントする。加えて、ｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上のコピーをカウントする。

【0053】

よって、前記方法は患者から得た前立腺細胞のサンプル、例えば核酸サンプルをプローブがその標的核酸配列との選択的な結合及び安定なハイブリダイゼーション複合物の形成を可能にする（または、促進させる）条件下でＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ（８ｐ２４）、ＬＰＬ（８ｐ２２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）に対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを単独で、またはｐ１６（９ｐ２１）、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１遺伝子座）、３番染色体に対するセントロメアプローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ、１０番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブの１つ以上と更に組み合わせて含む検出可能に標識されているプローブのセットと接触させることを含み、前記検出可能に標識されているプローブのセットはｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上を含み得る。前記方法は、更にハイブリダイゼーション複合物の形成を検出し、ハイブリダイゼーション複合物の数をカウントすることを含む。ＭＹＣ（８ｐ２４）、ＬＰＬ（８ｐ２２）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）及び８番染色体を含むハイブリダイゼーション複合物の数を単独でまたはｐ１６（９ｐ２１）、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１）、３番染色体、７番染色体、８番染色体、１０番染色体及び１７番染色体の１つ以上のハイブリダイゼーション複合物の数と更に組合せて、或いは単独でまたはｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上を含むハイブリダイゼーション複合物の数を更に考慮して、前記方法は更にＭＹＣ（８ｐ２４）、ＬＰＬ（８ｐ２２）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３；例えば、米国特許Ｎｏｓ．６，２６２，２４２；６，４８２，７９５；及び７，２１７，７９５を参照されたい）、及び８番染色体のコピー数を単独でまたはｐ１６（９ｐ２１）、３番染色体、７番染色体、１０番染色体及び１７番染色体、並びにＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１）及びその欠失及び／または転座の１つ以上のコピー数と更に組み合わせて、或いは単独でまたはｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上のコピー数と更に組合せて測定することを含む。所望ならば、コピー数を所定のカットオフと比較し得、所定のカットオフよりも高いコピー数（すなわち、増加に対して）及び所定のカットオフ未満のコピー数（すなわち、損失に対して）は患者が前立腺癌を有していることを示す。患者からの検査した前立腺細胞の約２０％以上がＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１）を含む転座及び／または欠失を有しているときには、患者は前立腺癌を有していると見なされる。

【0054】

脱パラフィン、前処理、染色及びルーチンのスライド洗浄も当業界で公知の方法に従って実施され得るが、ＶＰ ２０００ Ｐｒｏｃｅｓｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．，イリノイ州デスプレーンズ）のような自動化システムを使用すると評価のためのスライドを作成するために必要な時間が短縮される。標準のコプリンジャーをハイブリダイゼーション後洗浄のために使用するときには、スライドは小バッチ（例えば、４スライド）とは対照的に大バッチ（例えば、５０スライド）で作成され得る。加えて、スライドの採点は自動化イメージングを用いて完全自動化され得、これにより標本分析のために必要に実地時間を短くすることができる。完全自動化により、より多くの異常細胞をより高頻度で着実に捕捉することができるイメージングアルゴリズムを使用することもできる。また、当業界で公知のスライド作成の適当な方法を使用できるが、細胞のより均一で安定した単層を生成するＴｈｉｎＰｒｅｐ ２０００（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いてスライドを作成することが好ましい。

【0055】

当業界で既に公知であるかまたは現在開発中の他の方法は、ホルマリン固定・パラフィン包埋されている細胞以外の前立腺細胞、例えば前立腺細胞からの新鮮または凍結細胞、ホモジナイズした細胞、溶解した細胞、または単離または精製した核酸（例えば、ＤＮＡのような「核酸サンプル」）を使用することが必要であったり、好ましいことがある（本明細書中で使用されている「前立腺細胞のサンプル」はコピー数及び増加／損失を調べることができるすべての形態の前立腺細胞のサンプルを包含すると意図される）。核は、打ち切りアーティファクトを減らし、埋め込まれている異物をなくすためにパラフィン包埋標本の厚い切片から抽出することもできる。典型的には、一度得た生物学的サンプルを収集し、プロセッシングした後、当業界で公知の標準方法を用いてハイブリダイズする。前記プロセッシングは典型的にはプロテアーゼ処理及びアルデヒド溶液（例えば、ホルムアルデヒド）中での追加の固定を含む。

【0056】

本発明において使用され得る方法の例には、場合によりコピー数を測定しようとする遺伝子及び／または染色体領域の前増幅との定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）、ＰＣＲ産物のデンシトメトリースキャニング、デジタルＰＣＲ（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９６：９２３６−９２４１（１９９９）；米国特許出願公開Ｎｏ．２００５／０２５２７７３；及び米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／００６９１９４を参照されたい）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：８１８−８２１（１９９２）；及び国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９３／１８１８６を参照されたい）、マイクロサテライトまたはサザンアレロタイプ解析、ドットプロット、アレー、マイクロアレー（Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，３９：Ｓ１６−Ｓ２１（Ｊｕｌｙ ２００７））、多重増幅可能プローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０：ｅ５７（２００２）を参照されたい）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ；Ｋｕｍａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４（３）：２２６−２３４（２００５））、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、櫛分けしたゲノムＤＮＡ上の蛍光プローブ長さの測定（Ｈｅｒｒｉｃｋら，ＰＮＡＳ，９７（１）：２２２−２２７（２０００））、リファレンスクエリパイロシーケンシング（ＲＱＰＳ；Ｌｉｕら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４９１（２０１０））、フォスミド末端の参照配列へのマッピング（キャピラリーに基づく技術）、微量電気泳動及びナノポアシーケンシング（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１１：１５４４−１５４６（２００６）；及びＳｈｅｎｄｕｒｅら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５：３３５−３４４（２００４）を参照されたい）等が含まれるが、これらに限定されない。

【0057】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び類似方法による分析のための核酸標的の変性は典型的には細胞形態を維持するように実施する。例えば、染色体ＤＮＡは高ｐＨ、加高温（例えば、約７０〜９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）及びその組合せにより変性され得る。一方、プローブは数分程度の加熱により変性され得る。

【0058】

変性後、ハイブリダイゼーションを実施する。プローブをその核酸標的に対して特異的にハイブリダイズさせるための条件には通常特定ハイブリッドを産生するための所与のハイブリダイゼーション手順において使用可能な条件の組合せが含まれ、これらの条件は当業者により容易に決定され得る。前記条件には、典型的には制御された温度、液相、及びプローブと標的間の接触が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的長さ、標的及びプローブＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度及びインキュベーション時間を含めた多くの要因に応じて異なる。少なくとも１つの変性ステップはプローブの標的との接触に先行し得る。或いは、プローブと標的を相互に接触させながら、またはその後プローブを生物学的サンプルと接触させて一緒に変性条件にかけられ得る。ハイブリダイゼーションは、その後プローブ／サンプルを例えば約５０：５０容量比の２〜４×ＳＳＣとホルムアミドの混合物の液相中、約２５〜約５５℃の範囲の温度で、例えば約０．５〜約９６時間の範囲の時間、またはより好ましくは約３２〜約４０℃の温度で約２〜約１６時間の範囲の時間インキュベートして達成し得る。特異性を高めるために、米国特許Ｎｏ．５，７５６，６９６（全文を参照することにより、特にブロッキング核酸の使用の説明のためにその内容を本明細書に組み入れる）に記載されている非標識ブロッキング核酸を使用してもよい。当業者に容易に自明であるように、プローブをサンプル中に存在するその核酸標的に対して特異的にハイブリダイズするために他の条件が容易に使用され得る。ハイブリダイゼーションプロトコルは、例えばＰｉｎｋｅｔら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；及びＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。

【0059】

適当なインキュベーション時間が終了したら、染色体プローブのサンプルＤＮＡに対する非特異的結合は一連の洗浄により除去され得る。所望のストリンジェンシーのために温度及び塩濃度が適当に選択される。必要なストリンジェンシーのレベルはゲノム配列に対する特定プローブ配列の複雑さに依存し、公知の遺伝組成のサンプルに対してプローブを系統的にハイブリダイズすることにより決定され得る。一般的に、高ストリンジェンシー洗浄は約０．２×〜約２×ＳＳＣ及び約０．１％〜約１％の非イオン性洗浄剤（例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ４０））を用いて約６５〜約８０℃の範囲の温度で実施され得る。低ストリンジェンシー洗浄が必要ならば、洗浄は塩濃度を高めてより低い温度で実施され得る。

【0060】

蛍光体標識したプローブまたはプローブ組成物を使用する場合、検出方法は蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを調べるための他の手段を含み得る。適当な顕微鏡イメージング方法が複数の蛍光体を観察するために本明細書中に記載されている方法と一緒に使用され得る。蛍光顕微鏡法を使用する場合には、ハイブリダイズしたサンプルを各蛍光体の励起に適した光の下で１つ以上の適当なフィルターを用いて調査することができる。或いは、シグナル計数及びデータ獲得アルゴリズムと一緒にＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇシステムのような自動化デジタルイメージングシステムを使用し得る。

【0061】

使用する方法に応じて、結果の表示を容易にし、蛍光強度の小さな違いを検出する感度を改善するためにデジタル画像解析システムを使用することができる。例示のシステムは、自動化ステージ、焦点コントロール及びフィルターホイールを備えた標準蛍光顕微鏡（Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，ニューヨーク州ホーソーン）に基づく自動画像解析システムであるＱＵＩＰＳ（定量画像プロセッシングシステムの頭文字）である。フィルターホイールは、励起波長を選択するために顕微鏡の蛍光励起路中に置かれている。二色性ブロック中の特殊フィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ハーモント州ブラトルボロ）により、画像表示シフトなしに複数の染料を励起させることができる。顕微鏡は２つのカメラポートを有しており、その１つは高感度の高速ビデオ画像表示のための強化ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サニーベール）を有しており、これはスライド上の関心エリアを見つけ、焦点を合わせるために使用される。他のカメラポートは冷却ＣＣＤカメラ（モデル２００，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｌｔｄ．，アリゾナ州ツーソン）を有しており、これは実際の画像を高い解像度及び感度で獲得するために使用される。冷却ＣＣＤカメラはＶＭＥバスを介してＳＵＮ ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州マウンテンビュー）とインターフェース接続されている。多色画像の全獲得は画像加工ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，オランダ国デルフト）を用いてコントロールされる。

【0062】

アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、プローブを基質上の離れた位置で固定化し、標識されていない（例えば、国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ ９６／１７９５８を参照されたい）。代わりに、標的核酸を含むサンプル核酸が標識されている。ハイブリダイゼーション前にサンプル核酸を標識し、またはハイブリダイゼーション複合物を検出可能に標識する。二色または多色ａＣＧＨでは、プローブアレイを別々に標識されている標的核酸の２つ以上のコレクションに対して同時にまたは順次ハイブリダイズする。

【0063】

好ましくは、ＦＩＳＨによる分析のためのエリアを位置決めするためにバイオマーカー発現を免疫蛍光法（ＩＦ）により評価する。ＩＦ結果は本明細書中に記載されているプローブを用いて同定されるＦＩＳＨ異常及び腫瘍の形態学的評価と密接に相関している。

【0064】

上記方法は、患者を反復生検または集中的なフォローアップを必要とする患者及びその必要がない患者に層別化するために使用され得る。上記方法は前立腺癌を良性状態、例えば前立腺肥大症（ＢＰＨ）から区別するためにも使用され得る。前記方法は組織学的組織組織、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検出、ノモグラム（例えば、カタンノモグラム）、メチル化及び突然変異のような他の方法と一緒に使用され得る。これに関して、方法は根治的前立腺摘除術後に診断を確認するために、前立腺癌を前立腺中の前癌病変（例えば、前立腺の非定型小腺房増殖（ＡＳＡＰ）、低悪性度前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び高悪性度ＰＩＮ）から区別し、前立腺の前癌病変を良性状態、例えばＢＰＨから区別するためにも使用され得る。方法は生検、経尿道的切除（ＴＵＲＰ）または手術（例えば、根治的前立腺摘除術）により得た標本中の腺癌の診断を助けることができる。上記方法の特に検出及び診断の関係での利点は、前立腺癌を示す染色体異常を腫瘍の周囲の細胞中で検出できることである（すなわち、「フィールド効果」細胞）。よって、たとえ生検中に腫瘍を見落としても、その存在は上記方法に従って検出され得、これにより偽陰性の結果が減り、反復生検の必要性が減る。方法は前立腺癌の予測、前立腺癌の予防または治療的処置（例えば、ホルモンまたは放射線療法）の有効性のモニタリング、及び前立腺癌の再発のモニタリングにおいても使用され得る。方法は尿または血液を用いる検出方法で得られた結果を確認するために使用され得る。前癌病変を有する患者における癌のリスク及び癌の病原力（例えば、フィールド効果細胞中のより多い染色体異常及び／またはより広がった染色体異常）を前記方法を用いて評価し得る。前記方法は、積極的サーベイランス、手術、ホルモンまたは放射線を用いる治療のような治療決定、及び例えば根治的前立腺摘除術に関連して補助治療決定を助けるためにも使用され得る。

【0065】

よって、方法は検査サンプルを採取した患者の治療／予防処置の有効性を診断、予測または評価することを含み得る。方法が更に検査サンプルを採取した患者の治療／予防処置の有効性を評価することを含むならば、その方法は場合により更に有効性を改善するために必要に応じて患者の治療／予防処置を修飾することを含む。方法は自動化システムまたは半自動化システムで使用するために改変され得る。

【0066】

通常、所定レベルをベンチマークとして使用し、このベンチマークに対して前立腺細胞のサンプルを染色体異常についてアッセイして得た結果を評価し得る。通常、前記比較を行う際、所定レベルは特別のアッセイを十分な回数、特別の染色体異常（存在またはレベル）を疾患、障害または状態（例えば、子癇前症または心血管疾患）の特別ステージまたはエンドポイント、或いは特別の兆候と連結または関係づけ得るような適切な条件下で実施することにより得られる。典型的には、所定レベルは参照被験者（または、被験者の集団）のアッセイで得られる。

【0067】

特に、疾患の進行及び／または治療をモニターするために使用される所定レベルに関して、染色体異常（存在またはレベル）は「未変化」、「有利」（または、「有利に変化している」）、または「不利」（または、「不利に変化している」）であり得る。「上昇した」または「増加した」は、前立腺細胞のサンプル中の染色体異常のレベルが典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）よりも高い、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、以前のまたは基準サンプル）よりも高いことを指す。用語「損失した」または「減少した」は、前立腺細胞のサンプル中の染色体異常のレベルが典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）よりも低い、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、以前のまたは基準サンプル）よりも低いことを指す。用語「変化した」は、前立腺細胞のサンプル中の染色体異常のレベルが典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）に比して変化している（増加しているまたは減少している）、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、以前のまたは基準サンプル）に比して変化していることを指す。

【0068】

所与の染色体異常についての典型的または正常のレベルまたは範囲は標準プラクティスに従って規定される。幾つかの例での染色体異常のレベルは非常に低いので、典型的または正常のレベルまたは範囲、或いは参照レベルまたは範囲と比較したときに実験誤差またはサンプル分散により説明できない正味の変化があるときには所謂変化したレベルまたは変化が生じたと見なされ得る。よって、特定のサンプルで測定されたレベルを所謂正常な被験者からの類似サンプルで測定されたレベルまたはレベルの範囲と比較する。これに関連して、「正常な被験者」は検出可能な疾患を持たない個人であり、「正常」または「対照」患者または集団は例えばそれぞれ検出可能な疾患を示さないものである。更に、染色体異常が日常的にヒト集団の大多数で高レベルで見られないならば、「正常な被験者」は実質的な検出可能な増加レベルの所与の染色体異常を持たない個人であると見なされ得、「正常」（時に、「対照」と称される）患者または集団は実質的な検出可能な増加レベルの所与の染色体異常を示さないものである。「見かけ上正常な被験者」は染色体異常が評価されていなかったかまたは評価されていないものである。所与の染色体異常のレベルは、染色体異常が通常検出不能であるが検査サンプル中で検出されたときに、またはアナライトが検査サンプル中に正常レベルより高いレベルで存在しているときに「高い」と言われる。よって、特に、本発明は、前立腺癌を有しているかまたは前立腺癌を有するリスクがある被験者のスクリーニング方法を提供する。

【0069】

方法は他のマーカー等の検出をも含み得る。例えば、方法は例えば前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検出をも含み得る。

【0070】

本明細書中に記載されている方法は、被験者が前立腺癌を有しているかまたは前立腺癌を発症するリスクがあるか否かを調べるためにも使用され得る。具体的には、この方法は、
（ａ）被験者からの前立腺細胞のサンプル中の染色体異常を（例えば、本明細書中に記載されているかまたは当業界で公知の方法を用いて）測定するステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で測定された染色体異常のレベルを所定レベルと比較するステップ；
を含み、ステップ（ａ）で測定された染色体異常のレベルが所定レベルに比して有利であるならば、被験者は前立腺癌を有していないかまたは前立腺癌のリスクがないと断定される。しかしながら、ステップ（ａ）で測定された染色体異常のレベルが所定レベルに比して不利であるならば、被験者は前立腺癌を有しているかまたは前立腺癌のリスクがあると断定される。

【0071】

加えて、本発明は、被験者の前立腺癌の進行のモニタリング方法を提供する。最適には、この方法は、
（ａ）被験者からの前立腺細胞のサンプル中の染色体異常を測定するステップ；
（ｂ）被験者からの前立腺細胞のより最近のサンプル中の染色体異常を測定するステップ；及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された染色体異常のレベルをステップ（ａ）で測定された染色体異常のレベルと比較するステップ；
を含み、ステップ（ｂ）におけるレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して未変化または不利であるならば、被験者の前立腺癌は継続、進行または悪化していると断定される。反対に、ステップ（ｂ）におけるレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルと比較して有利であるならば、被験者の前立腺癌は停止、寛解または改善されていると断定される。

【0072】

場合により、方法は更にステップ（ｂ）で測定された染色体異常のレベルを例えば所定レベルと比較することを含む。更に、場合により、比較によりステップ（ｂ）で測定されたレベルが例えば所定レベルに比して不利に変化していることが示されたならば、方法は被験者を例えば１つ以上の医薬組成物、放射線及び／またはホルモン療法で一定時間治療することを含む。

【0073】

なお更に、方法は例えば１つ以上の医薬組成物、放射線及び／またはホルモン療法で治療を受けている被験者の治療をモニターするために使用され得る。具体的には、この方法は、被験者が治療を受ける前に該被験者から得た前立腺細胞の第１サンプルを用意することを含む。次に、前立腺細胞の第１サンプル中の染色体異常のレベルを（例えば、本明細書中に記載されているかまたは当業界で公知の方法を用いて）測定する。染色体異常のレベルを測定したら、場合によりそのレベルを所定レベルと比較する。前立腺細胞の第１サンプル中の測定されたレベルが所定レベルよりも低いならば、被験者は治療を受けない。しかしながら、前立腺細胞の第１サンプル中の測定されたレベルが所定レベルより高いならば、被験者は一定期間治療を受ける。被験者が治療を受ける期間は当業者により決定され得る（例えば、期間は約７日間〜約２年間、好ましくは約１４日間〜約１年間であり得る）。

【0074】

治療中、前立腺細胞の第２及びその後のサンプルを被験者から得る。サンプルの数及びサンプルを被験者から得る時期は重要でない。例えば、第２サンプルは被験者がまず治療を受けてから７日後に得られ得、第３サンプルは被験者がまず治療を受けてから２週間後に得られ得、第４サンプルは被験者がまず治療を受けてから３週間後に得られ得、第５サンプルは被験者がまず治療を受けてから４週間後に得られ得る等々。

【0075】

第２またはその後のサンプルの各々を被験者から得た後、第２またはその後のサンプル中の染色体異常のレベルを（例えば、本明細書中に記載されているかまたは当業界で公知の方法を用いて）測定する。次いで、第２及びその後のサンプルの各々で測定されたレベルを第１サンプル（例えば、元々場合により所定レベルと比較したサンプル）で測定されたレベルと比較する。ステップ（ａ）で測定されたレベルと比較したときにステップ（ｃ）で測定されたレベルが有利であるならば、前立腺癌は停止、寛解または改善していると断定され、被験者は治療を継続しなければならない。しかしながら、ステップ（ａ）で測定されたレベルと比較したときにステップ（ｃ）で測定されたレベルが未変化または不利であるならば、前立腺癌は継続、進行または悪化していると断定され、被験者は例えば高用量の医薬組成物、放射線またはホルモンで治療されなければならず、または被験者は別の方法で治療されなければならない。

【0076】

通常、反復検査（例えば、疾患の進行及び／または治療に対する応答をモニターする）を行い得るアッセイのために、第２またはその後の試験サンプルを第１試験サンプルを被験者から得た後ある期間で得る。具体的には、被験者からの第２試験サンプルを第１試験サンプルを被験者から得た後数分間、数時間、数週間または数年間後に得られ得る。例えば、第２試験サンプルは被験者から第１試験サンプルを得てから約１分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３．０年間、約３．５年間、約４．０年間、約４．５年間、約５．０年間、約５．５年間、約６．０年間、約６．５年間、約７．０年間、約７．５年間、約８．０年間、約８．５年間、約９．０年間、約９．５年間または約１０．０年間後に被験者から得られ得る。

【0077】

更に、本発明は、前立腺癌に罹りやすいかまたは罹っている被験者が治療の恩恵を受けるかどうかを調べる方法にも関する。特に、本発明はコンパニオン診断方法及び製品に関する。よって、本明細書中に記載されている「被験者の疾患の治療をモニターする」方法は更に場合により治療候補者を選択または同定することを含み得る。

【0078】

よって、特定の実施形態では、本発明は、前立腺癌を有しているかまたは前立腺癌のリスクがある被験者が治療候補者であるかどうかを調べる方法をも提供する。通常、被験者は疾患の幾つかの症状を経験しているもの、または前記疾患を有しているかまたはそのリスクがあると実際診断されたもの、及び／または本明細書中に記載されている不利なレベルの染色体異常を示すものである。

【0079】

方法は場合により、染色体異常のレベルを被験者が治療を受ける前及びその後に評価する本明細書中に記載されているアッセイを含む。治療後に不利なレベルの染色体異常が観察されると、被験者は更なるまたは継続治療を受ける恩恵を受けないことが確認され、治療後に有利なレベルの染色体異常が観察されると被験者は更なるまたは継続治療を受ける恩恵を受けることが確認される。この確認は臨床研究の管理及び改善された患者ケアの提供を助ける。

【0080】

プローブ
プローブのセットをも提供する。１つの実施形態では、プローブのセットはＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ；１０ｑ２３）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含み、このプローブのセットは場合により更に検出可能に標識され得る抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体を含む。別の実施形態では、プローブのセットはＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ；８ｐ２２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む。このプローブのセットは場合により更に検出可能に標識され得る抗−ＡＭＡＣＲ抗体を含む。ＭＹＣ（８ｑ２４）に対する遺伝子座特異的プローブは、好ましくはＭＹＣ遺伝子の中心にあるおおよそ８２０ｋｂ（例えば、８２１ｋｂ）をカバーし、全ＭＹＣ遺伝子及び隣接領域を含む（上記の方法欄中の「ＭＹＣ」の検討を参照されたい）。ＬＰＬ（８ｐ２２）に対する遺伝子座特異的プローブは、好ましくはＬＰＬ遺伝子の中心にあるおおよそ１７０ｋｂをカバーし、全ＬＰＬ遺伝子及び隣接領域を含む（上記の方法欄中の「ＬＰＬ」の検討を参照されたい）。ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）に対する遺伝子座特異的プローブは、好ましくはＰＴＥＮ遺伝子の中心にあるおおよそ３６５〜３７０ｋｂ（例えば、３６８ｋｂ）をカバーし、全ＰＴＥＮ遺伝子及び隣接領域、例えばセントロメア側のＳＴＳマーカーＤ１０Ｓ２１５及びテロメア側のＲＨ９３６２６を含む（上記の方法欄中の「ＰＴＥＮ」の検討を参照されたい）。このプローブのセットは場合により更に、ｐ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１遺伝子座）、３番染色体に対するセントロメアプローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ、１０番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブの１つ以上を含む。このプローブのセットは更に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）に対する遺伝子座特異的プローブ、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上を含み得る。

【0081】

遺伝子座特異的プローブとして使用するに適したプローブは、遺伝子を含有している染色体上の特定領域に対してハイブリダイズする。遺伝子ＭＹＣ（８ｐ２４）に対する遺伝子座特異的プローブは８番染色体上のｐ２４（すなわち、８ｐ２４）のＭＹＣ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。遺伝子ＬＰＬ（８ｐ２２）に対する遺伝子座特異的プローブは８番染色体上のｐ２２（すなわち、８ｐ２２）のＬＰＬ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。遺伝子ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）に対する遺伝子座特異的プローブは１０番染色体上のｑ２３（すなわち、１０ｑ２３）のＰＴＥＮ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。同様に、ｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体４上のｑ４３（すなわち、４ｑ４３）のｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１２上のｑ１３（すなわち、１２ｑ１３）のＣＤＫ２遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１９上のｑ１２のＣＣＮＥ１遺伝子のすべてまたは一部、または８番染色体上のｑ２２のＣＣＮＥ２遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１３上のｑ１４のＲｂ１遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブは８番染色体上のｐ２１．２のＮＫＸ３．１遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブは７番染色体上のｐ１１のＥＧＦＲ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブは３番染色体上のｑ２６のＰＩ３Ｋ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１４上のｑ３２のＡｋｔ１遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１３上のｑ１４．１１のＦＯＸＯ１遺伝子すべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１２上のｑ１４．３−ｑ１のＭＤＭ２遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブは１７番染色体上のｐ１３．１のｐ５３遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１２上のｐ１２．１のＫＲＡＳ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブは７番染色体上のｑ３４のＢＲＡＦ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１１上のｑ１３のＣＣＮＤ１遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体１８上のｑ２１．３−ｑ２１．３３のＢＣＬ２遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得、アンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブは染色体Ｘ上のｑ１２のＡＲ遺伝子のすべてまたは一部に対してハイブリダイズし得る。

【0082】

離脱プローブとして使用するのに適したプローブはＴＭＰＲＳＳ２（２１ｑ２２）に対してハイブリダイズし、これにより転座及び／または欠失を検出することができる。

【0083】

染色体プローブとして使用するのに適したプローブは染色体のセントロメアに関係する反復ＤＮＡとハイブリダイズする。霊長類染色体のセントロメアは、α−サテライトＤＮＡと称される約１７１塩基対（ｂｐ）のモノマー反復長から構成されているＤＮＡの長タンデムリピートの複合ファミリーを含有している。染色体プローブは典型的には約５０〜１×１０^５ヌクレオチド長である。より長いプローブは典型的には約１００〜６００ヌクレオチド長に断片化される。３番染色体に対するプローブは３番染色体のセントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得、７番染色体に対するプローブは７番染色体のセントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得、８番染色体に対するプローブは８番染色体のセントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得、１０番染色体に対するプローブは１０番染色体のセントロメアに位置しているα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得、１７番染色体に対するプローブは１７番染色体のセントロメアに位置するα−サテライトＤＮＡに対してハイブリダイズし得る。前記プローブの例には、ＣＥＰ３、ＣＥＰ７、ＣＥＰ８、ＣＥＰ１０及びＣＥＰ１７が含まれる。

【0084】

染色体領域または小領域を標的とする染色体エニュメレータープローブ（ＣＥＰ）及び遺伝子座特異的プローブは市販されているかまたは当業者により容易に作成され得る。前記プローブはＡｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デスプレーンズ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（英国オックスフォードシャー）から入手可能である。染色体プローブは、例えばタンパク質核酸（ＰＮＡ）、クローン化ヒトＤＮＡ（例えば、プラスミド）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、及びヒトＤＮＡ配列のインサートを含有しているＰｌ人工染色体（ＰＡＣ）から作成できる。関心領域はＰＣＲ増幅またはクローニングにより得られ得る。別の実施形態では、染色体プローブはオリゴプローブであり得る。或いは、染色体プローブは当業界で公知の方法に従って合成的に作成され得る。

【0085】

特定の遺伝子座のターゲッティングが所望される場合には、必須ではないが、標的される遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが好ましい。遺伝子座特異的プローブは、その遺伝子異常が転移と相関している癌または腫瘍抑制遺伝子、例えばＭＹＣにハイブリダイズするように設計され得る。

【0086】

プローブは当業界で公知の方法により作成され得る。プローブは合成しても、組換え産生させてもよい。プローブの長さは約２５，０００塩基対〜約８００，０００塩基対の範囲であり得る。

【0087】

好ましくは、プローブは検出可能に標識されており、各プローブは別個に標識されている。好ましくは、プローブは蛍光体で検出可能に標識されており、各プローブは別個に標識されている。好ましい蛍光体の例には、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシファーイエロー及びＣＡＳＣＡＤＥブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない。使用する特定標識は重要でない。しかしながら、特定標識がプローブのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他のプローブ上の標識の検出を妨害しないことが望ましい。標識がアッセイの感受性を最大限とし、バックグラウンドシグナルを超えて検出され得るようにできるだけ少ないコピー数で検出され得ることが望ましい。また、標識が高局在シグナルを与え、これにより高度の空間分解能を与えることが望ましい。

【0088】

核酸プローブへの蛍光体の結合は当業界で公知であり、利用可能な手段により実行され得る。蛍光体は例えば特定ヌクレオチドに共有結合され得、標識されているヌクレオチドは標準技術、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲラベリング、エンドラベリング、シトシン残基のような特定残基の化学修飾による直接ラベリング（米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４）等を用いてプローブに取り込まれ得る。或いは、蛍光体は、例えばアミノ交換されているプローブのデオキシシチジンヌクレオチドに対してリンカーを介してプローブに取り込まれている活性化リンカー腕を用いてヌクレオチドに共有結合され得る。プローブのラベリング方法は米国特許Ｎｏ．５，４９１，２２４及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ”，ｐｐ．２１−４０，Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００２）に記載されており、これらはいずれもプローブのラベリングの説明のために参照により本明細書に組み入れられる。

【0089】

当業者は他の物質または染料が標識含有部分として蛍光体の代わりに使用され得ることを認識している。発光物質は、例えば放射線発光性、化学発光性、生物発光性及び燐光性標識含有部分を含んでいる。可視光で検出可能な物質にはシアニン染料が含まれる。或いは、間接手段により可視化される検出部分を使用してもよい。例えば、プローブは当業界で公知のルーチンな方法を用いてビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、その後検出のために更に加工され得る。ビオチン含有プローブの可視化はその後検出可能なマーカーにコンジュゲートしたアビジンを結合することにより実行され得る。検出可能なマーカーは蛍光体であり得、この場合プローブの可視化及び識別は下記するように実行され得る。

【0090】

標的領域にハイブリダイズした染色体プローブは、標識部分を不溶の着色生成物を生じさせるために適当な基質と酵素反応させることにより可視化され得る。各プローブは別個の標識部分を選択することによりセット内の他のプローブから区別され得る。セット内のビオチン含有プローブは、その後アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたアビジン及び適当な基質とインキュベートすることにより検出され得る。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）がアルカリホスファターゼに対する基質として役立ち、ジアミノベンゾエートがＨＲＰに対する基質として役立つ。

【0091】

キット
キットも提供される。１つの実施形態では、キットは、（ａ）ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）に対する遺伝子座特異的プローブ、８番染色体に対するセントロメアプローブ及び７番染色体に対するセントロメアプローブを含む患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、及び（ｂ）患者から得た前立腺細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌を診断するための説明書を含む。患者の前立腺の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）または良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（２〜５０の範囲で）３５を超えるＭＹＣの増加％（増加％はＭＹＣ ＞２シグナルの細胞の％である）、（２９〜３３の範囲で）３３を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、（３２〜３４の範囲で）３４を超える８番染色体の増加％（増加％は＞２シグナルの細胞の％である）、及び（２４〜２９の範囲で）２８を超える７番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。別の実施形態では、キットは、（ａ）患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、及び（ｂ）患者の前立腺癌の治療／予防処置を診断、予測または評価するための説明書を含む。よって、キットは（ａ）ＭＹＣに対する遺伝子座特異的プローブ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＰＴＥＮに対する遺伝子座特異的プローブ及び８番染色体に対するセントロメアプローブを含む患者の前立腺癌を診断できるプローブのセット、及び（ｂ）患者から得た前立腺細胞のサンプル中の染色体異常の存在を調べることを含む患者の前立腺癌を診断するための説明書を含む。患者の前立腺の腫瘍ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜２２の範囲で）１４を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％（増加％はＭＹＣ／ＬＰＬ ＞１の細胞の％である）、（２６〜４０の範囲で）３４を超える８番染色体の異常％（異常％は＞２または＜２シグナルの細胞の％である）、（２２〜５４の範囲で）４４を超えるＰＴＥＮの損失％（損失％は＜２シグナルの細胞の％である）、または（１０〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％（増加％はＭＹＣ／８番染色体 ＞１の細胞の％である）は該患者が前立腺癌を有していることを示す。患者の前立腺の良性ＲＯＩからの前立腺細胞のサンプル中の（１２〜１９の範囲で）１８を超えるＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、（２５〜３４の範囲で）３２を超える８番染色体の異常％、（２２〜２８の範囲で）２６を超えるＰＴＥＮの損失％、または（９〜１８の範囲で）１６を超えるＭＹＣ／８番染色体の増加％は該患者が前立腺癌を有していることを示す。プローブのセットは更に、ｐ１６（９ｐ２１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合（２１ｑ２２；７ｐ２１遺伝子座）、３番染色体に対するセントロメアプローブ、７番染色体に対するセントロメアプローブ、１０番染色体に対するセントロメアプローブ及び１７番染色体に対するセントロメアプローブの１つ以上を含み得る。プローブのセットは更に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐ１（４ｑ４３）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＣＤＫ２（１２ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＥ（ＣＣＮＥ１；１９ｑ１２及びＣＣＮＥ２；８ｑ２２）に対する遺伝子座特異的プローブ、網膜芽細胞腫１（Ｒｂ１；１３ｑ１４）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＮＫ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３．１；８ｐ２１．２）に対する遺伝子座特異的プローブ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；７ｐ１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；３ｑ２６）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＡＫＴ１キナーゼ（Ａｋｔ１；１４ｑ３２）に対する遺伝子座特異的プローブ、ＦＫＨＲ（ＦＯＸＯ１；１３ｑ１４．１１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３結合タンパク質ホモログ（ＭＤＭ２；１２ｑ１４．３−１２ｑ１５）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｐ５３（１７ｐ１３．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌ホモログ（ＫＲＡＳ；１２ｐ１２．１）に対する遺伝子座特異的プローブ、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌ホモログＢ１（ＢＲＡＦ；７ｑ３４）に対する遺伝子座特異的プローブ、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１；１１ｑ１３）に対する遺伝子座特異的プローブ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２；１８ｑ２１．３／１８ｑ２１．３３）に対する遺伝子座特異的プローブ及びアンドロゲン受容体（ＡＲ；Ｘｑ１２）に対する遺伝子座特異的プローブの１つ以上を含み得る。キットは更に、染色体異常の存在を調べる前に、患者からの前立腺の切片を形態学的に評価し、少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩ、少なくとも１つの良性ＲＯＩ、または少なくとも１つの腫瘍ＲＯＩと少なくとも１つの良性ＲＯＩを同定するための説明書を含む。

【0092】

或いは、キットは更に、染色体異常の存在を調べる前に、患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価し、腫瘍ＲＯＩの存在を同定することを含む説明書を含み、この場合キットは更に検出可能に標識され得る抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体を含み、患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価するための説明書は更に該切片を検出可能に標識されている抗−ＡＭＡＣＲ抗体と接触させ、ＡＭＡＣＲの過剰発現を検出することを含み、該切片の領域中のＡＭＡＣＲの過剰発現は腫瘍ＲＯＩの存在を示す。説明書は更に患者からの前立腺の切片を免疫蛍光法により評価する前に、切片を熱誘導エピトープ賦活化で処理することを含む。前記キットは更にブロッキング剤または他のプローブ、プローブの検出を容易とするための各種標識またはラベリング剤、ハイブリダイゼーションのための試薬（例えば、緩衝液）、中期スプレッド等を含んでいてもよい。

【実施例】

【0093】

下記実施例は本発明を説明するのに役立つ。実施例は特許請求されている発明の範囲を限定すると決して意図されない。

【0094】

［実施例１］
本実施例は、プローブの各種組合せ及び蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いる前立腺標本の分析を記載する。

【0095】

前立腺の腺癌を患っている１６人の患者からの根治的前立腺摘除標本をイリノイ州シカゴのＲｕｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで集めた。２組のホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドが９人の患者から使用可能であった。１組は病理医がスクライブした腫瘍エリア（腫瘍関心領域（ＲＯＩ））を含んでおり、他の組は腫瘍から離れているエリア（遠隔ＲＯＩ）を含んでいた。前立腺肥大症（ＢＰＨ）を患っている１１人の患者からのスライドを前立腺の経尿道的切除（ＴＵＲＰ）により集め、対照として使用した。

【0096】

スライドを１×ＳＳＣ（１５ｍＭ クエン酸及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中でインキュベーションした後、ペプシン消化することにより前処理した。スライドを以下のプローブセット：ＭＹＣ、ＬＰＬ及び染色体エニュメレータープローブ（ＣＥＰ）８；ＰＴＥＮ、ＣＥＰ１０（登録商標）及びＣＥＰ７（登録商標）；ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧまたはＥＴＶ１融合；及びＣＥＰ３（登録商標）、ＣＥＰ７（登録商標）、ＣＥＰ１７（登録商標）及びｐ１６を用いて多色ＦＩＳＨによりハイブリダイズした。幾つかのフィールドを評価した。セット中の各プローブについて２５〜５０細胞／標本の蛍光シグナルの数を計数した。ＴＭＰＲＳＳ２離脱プローブについて再配列のすべてのパターン及びコピー数変化を観察し、記録した。遠隔ＲＯＩからのスライドを最も異常なＦＩＳＨシグナルパターンについてスキャンし、これらのパターン及び隣接領域を含んでいる視野数を計数した。

【0097】

根治的前立腺摘除術からの標本中の腫瘍ＲＯＩはＭＹＣ増幅／増加、ＬＰＬ損失、ＰＴＥＮ損失、ＴＭＰＲＳＳ２再配列及び異数染色体を含めた染色体異常を呈していた。遠隔ＲＯＩを含んでいる良性のスライドでも重要な染色体異常が観察された。エニュメレーション結果を分析して、個々のプローブまたは誘導分類子（例えば、２つのプローブの比）についてのカットオフを決定し、癌に関係する異常のパターンがＢＰＨ標本中の見かけ上良性の組織のパターンと最もうまく識別される。カットオフはゲノム異常を含んでいる細胞のパーセンテージに基づいていた。良性平均シグナルカウント−３標準偏差未満のシグナルカウントの固定カットオフを損失を確定するために使用し、良性平均シグナルカウント＋３標準偏差よりも大きい固定カットオフを増加を確定するために使用した。ＴＭＰＲＳＳ２再配列についてのカットオフは再配列を含んでいる評価した領域内の細胞の約２０％以上であった。固定カットオフに基づいて、ＭＹＣの増加及び異数染色体が１５／１６ 腫瘍ＲＯＩで見られ、ＴＭＰＲＳＳ２再配列が１１／１６ 腫瘍ＲＯＩで見られたのに対して、ＭＹＣの増加及び異数染色体が２／９ 遠隔ＲＯＩで見られ、ＴＭＰＲＳＳ２再配列が５／９ 遠隔ＲＯＩで見られた。分析の結果から、選択したカットオフでの幾つかの染色体異常の検出が腺癌患者からの標本に対して非常に特異的であったことが更に立証された。

【0098】

［実施例２］
本実施例は、プローブの各種組合せを用いるＦＩＳＨによる前立腺標本の分析を記載する。

【0099】

評価のために全部で６個のプローブを使用した。これら６個のプローブは、３個の７番、８番及び１０番染色体に対するセントロメアプローブ（ＣＥＰ（登録商標））及び３個の遺伝子座特異的同定子（ＬＳＩ（登録商標））プローブ（ＭＹＣ（８ｑ２４）、ＬＰＬ（８ｐ２１−２２）及びＰＴＥＮ（１０ｑ２３））から構成した。プローブは前立腺癌における頻繁な異常を明らかにした文献レビュー（Ｂｏｖａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：３８６９−３８７３（１９９３）；Ｋａｇａｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１１：２１２１−２１２６（１９９５）；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２９５９−２９６２（１９９５）；上掲のＹｏｓｈｉｍｏｔｏら（２００７）；及びＫａｚｕｎａｒｉら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９（１８）：１５７４−１５８０（１９９９））に基づいて選択した。ＬＳＩ（登録商標）及びＣＥＰ（登録商標）プローブはＶｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（イリノイ州デスプレーンズ）から入手した。その後の評価のために含めたプローブを組み合わせて２つのプローブセットとした。第１プローブセットは、ＭＹＣ ８ｑ２４（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標））、ＬＰＬ ８ｐ２１−２２（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標））及びＣＥＰ８（登録商標）（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標））から構成されているＰｒｏＶｙｓｉｏｎ（登録商標）であった。第２プローブセット（ＰＴＥＮセット）はＰＴＥＮ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標））、ＣＥＰ７（登録商標）（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ）及びＣＥＰ１０（登録商標）（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）を含んでいた。

【0100】

前立腺の腺癌を患っている患者からの３３個の根治的前立腺摘除（ＲＰ）標本はイリノイ州シカゴのＲｕｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。標本毎に、４〜６μｍの組織切片を病理医がスクライブして、腫瘍領域をマークした。３３ＲＰ症例のうち１７症例について、組織学的に良性の組織しか有していない第２切片を得た。２６個の前立腺肥大症（ＢＰＨ）標本は対照として使用した（Ｎａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１（３）：５４０−５５２（２００４））。６プローブの各々についてのＦＩＳＨシグナルを５０〜１００細胞／切片で計数した。

【0101】

標本毎に、５μｍの組織切片を病理医がスクライブして、存在するならば腫瘍領域をマークした。ＦＦＰＥ組織切片スライドを５６℃で２〜２４時間焼き、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）を用いて室温で５分間ずつ３回前処理し、１００％ エタノールを用いて室温で１分間ずつ２回濯ぎ、４５％ ギ酸／０．３％ 過酸化水素中、室温で１５分間インキュベートした後、脱イオン水を用いて３分間濯いだ。次いで、スライドを前処理溶液（１×ＳＳＣ，ｐＨ６．３）中、８０℃で３５分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３分間濯ぎ、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中０．１５％ ペプシン中で３７℃で２２分間インキュベートし、脱イオン水を用いて再び３分間濯いだ。スライドを７０％、８５％及び１００％ エタノールを用いて１分間ずつ脱水した後、風乾させた。１０μＬのそれぞれのプローブハイブリダイゼーションミックス（ＬＳＩ（登録商標）緩衝液、ブロッキングＤＮＡ及び標識したプローブ）を標本に添加し、カバーガラスを被せ、ラバーセメントでシールした、スライドを７３℃で５分間共変性し、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ（Ｖｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて３７℃で１６〜２４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを外し、スライドを２×ＳＳＣ／０．３％ ＮＰ−４０を用いて７３℃で２分間、続いて２×ＳＳＣ／０．１％ ＮＰ−４０を用いて室温で１分間洗浄した。１０μＬのＤＡＰＩ Ｉ対比染色液をスライド上に置き、カバーガラスを被せた。

【0102】

ハイブリダイゼーション後、ＦＩＳＨシグナルエニュメレーションを実施した。各標本をＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ（商標）及びＳｐｅｃｔｒｕｍ Ａｑｕａ（商標）に対して特異的なシングルバンドパスフィルター（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，イリノイ州デスプレーンズ）を用いて蛍光顕微鏡下で分析した。プローブ毎のＦＩＳＨシグナルの数を対応するＨ＆Ｅ−染色した組織に対して核のＤＡＰＩ染色により同定した関心エリア中の最低５０個の連続の非重複無傷の中間期核（例えば、約５０〜１００細胞の核）において記録した。プローブ毎に考慮した異常パラメーターは次の通りである：増加：［シグナルカウント］＞２、損失：［シグナルカウント］＜２、及び異常：［シグナルカウント］＞２または＜２。固定カットオフは、「２６個のＢＰＨ標本中の異常細胞カウント％の平均＋３Ｓ．Ｄ．」として計算した。標本異常は「細胞の異常％≧カットオフ」として定義した。

【0103】

異常ＦＩＳＨシグナルがＭＹＣ、ＬＰＬ、ＣＥＰ８（登録商標）、ＰＴＥＮ、ＣＥＰ１０（登録商標）及びＣＥＰ７（登録商標）についてスライド上で観察された。ＭＹＣの増幅／増加、ＬＰＬ及びＰＴＥＮ損失、及び異数染色体についての染色体異常が根治的前立腺摘除術からの標本の腫瘍関心領域（ＲＯＩ）において観察されただけでなく、幾つかの良性ＲＯＩでも観察された。表１はエニュメレーションデータの要約を示す。３３個の標本中の２２個がＰｒｏＶｙｓｉｏｎ（登録商標）プローブセットで検出された異常（６６．７％）を有しており、３３個の標本中の２０個がＰＴＥＮプローブセットで検出された異常（６０．６％）を有していた。腫瘍ＲＯＩに対してＰｒｏＶｙｓｉｏｎ（登録商標）＋ＰＴＥＮプローブセットで検出された全異常は２３／３３、すなわち６９．７％であった。より重要なことは、腫瘍から遠隔のＲＯＩ（「遠隔ＲＯＩ」）を含んでいる１７個のスライドのうちの８個で有意な数の染色体異常が観察された（８／１７＝４７．１％；ＰｒｏＶｙｓｉｏｎ（登録商標）の場合４／１７＝２３．５％；ＰＴＥＮプローブセットの場合６／１７＝３５．３％）（表１）。分析した多くの前立腺癌症例の中で１個の標本で８番染色体の増加及び損失が同時に観察された。

【0104】

【表1】

【0105】

エニュメレーション結果を更にＳＡＳバージョン８．２（ＳＣＡ＃Ｓ０５０２０００２）を用いて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線により分析した。プローブを選択し、最高の感受性及び特異性を与える最適ＦＩＳＨ分析アルゴリズムを決めるために、プローブ毎に次のパラメーターを考慮した。
・増加％、＞２シグナルの細胞のパーセント、
・損失％、＜２シグナルの細胞のパーセント
・異常％、＞２または＜２シグナルの細胞のパーセント、
・２プローブ比（プローブＡ／プローブＢ）の場合、増加％はＡ／Ｂ比＞１の細胞のパーセントであり、損失％はＡ／Ｂ比＜１の細胞のパーセントであった。

【0106】

スクライブされた腫瘍領域内のＭＹＣ／ＬＰＬの増加％、ＰＴＥＮの損失％、ＭＹＣ／ＣＥＰ８（登録商標）の増加％及びＣＥＰ８（登録商標）異常％パラメーターの組合せにより、ＲＰ標本の９７．１％（３３／３４）でＢＰＨ（χ２ ｐ＜０．００１）に対して９６．２％（２５／２６）の特異性で腺癌が同定された。正常な組織を有する領域で検出されると、これらの異常は８２．４％（１４／１７ ＲＰ標本，ＢＰＨに対してχ２ ｐ＜０．００１）で腺癌と相関していた。表２は、各プローブ及びプローブ組合せについてのＡＵＣ（曲線下面積）、最良の特異性及び感受性のＲＯＣ分析要約である。

【0107】

【表2】

【0108】

我々は、まず異なる標本群（腫瘍ＲＯＩ対ＢＰＨ、及び良性ＲＯＩ対ＢＰＨ）を２サンプルｔ検定を用いて比較することにより潜在的に重要なＦＩＳＨプローブをスクリーニングしようとするデータ組を分析するために別の方法も使用した。ｔ検定から有意なｐ値（ｐ値＜０．０５）を有するＦＩＳＨパラメーターを更なる試験のために選択した。

【0109】

ＦＩＳＨにより検出されたゲノムコピー数から誘導される１６個のパラメーターを評価した。これらのパラメーターはＣＥＰ１０の異常％、ＣＥＰ１０の増加％、ＣＥＰ７の異常％、ＣＥＰ７の増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＣＥＰ８の増加％、ＣＥＰ８の損失％、ＭＹＣの増加％、ＬＰＬの異常％、ＬＰＬの損失％、ＰＴＥＮの損失％、ＰＴＥＮ／ＣＥＰ１０の損失％、ＣＥＰ７／ＣＥＰ１０の増加％、ＬＰＬ／ＣＥＰ８の損失％、ＭＹＣ／ＣＥＰ８の増加％及びＭＹＣ／ＬＰＬの増加％であった。ｔ検定分析の結果から、１６個のＦＩＳＨパラメーターのすべてについてその平均値は腫瘍群とＢＰＨ群の間で統計上異なっていた（表３）。

【0110】

【表3】

【0111】

良性ＲＯＩ及びＢＰＨデータのｔ検定の結果は、表４に示す１０／１６パラメータはフィールド効果について統計上異なっていることを示している。これら１０個のＦＩＳＨパラメーターはＣＥＰ１０の異常％、ＣＥＰ１０の増加％、ＣＥＰ７の異常％、ＣＥＰ７の増加％、ＣＥＰ８の異常％、ＣＥＰ８の増加％、ＭＹＣの増加％、ＬＰＬの異常％、ＰＴＥＮの損失％及びＰＴＥＮ／ＣＥＰ１０の損失％であった。

【0112】

【表4】

【0113】

２サンプルｔ検定に基づいてＢＰＨ群と腫瘍または良性ＲＯＩ群間で有意な差を示した１０個のＦＩＳＨパラメーターを更なる評価のために選択した。ＲＯＣ方法を適用して、これらＦＩＳＨパラメーターについての最適カットオフ値を同定した。表５は、腫瘍ＲＯＩとＢＰＨを区別するとき及び良性ＲＯＩとＢＰＨを区別するときのこれら１０個のＦＩＳＨパラメーターの各々についての感受性、特異性及びＡＵＣを要約する。上５個のＦＩＳＨ単一パラメーターをフィールド効果について良性ＲＯＩ標本対ＢＰＨを区別するときのＡＵＣ値に基づいて選択した。これらは表５に示すようにＰＴＥＮ／ＣＥＰ１０の損失％、ＰＴＥＮの損失％、ＣＥＰ７の異常％、ＭＹＣの増加％及びＣＥＰ８の増加％であった。

【0114】

【表5】

【0115】

上５個の単一プローブパラメーターを４プローブセットのすべての考えられる組合せに分類した後、カットオフ値、ＡＵＣ及び最低ＤＦＩについて良性の標本に対して１％毎に５％〜３５％の範囲のカットオフでＳＡＳを用いて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線により分析した。複数プローブ組合せについて、パラメーター毎に独立してカットオフを変化させてグラフ上に点のフィールドを生じさせ、各特異性値で最高の感受性値を有する点を用いてＲＯＣ曲線を規定した。統計方法を用いて考えられる組合せ及びカットオフ値が得られるが、科学的判断を用いて各種トレードオフを荷重して、カットオフ値及びプローブ組合せを最終決定した。

【0116】

表６における分析は、プローブセット３が０．９３８の最大ＡＵＣを有し、プローブセット１のＡＵＣは最低のＤＦＩ、及び最良の感受性及び特異性で０．９１７の２番目に最大であった。プローブセット３は１個のＬＳＩプローブ、すなわちＰＴＥＮのみを有しており、プローブセット１は２個のＬＳＩプローブ、すなわちＰＴＥＮ及びＭＹＣを有している。ＣＥＰプローブは異数染色体を検出するために使用され、ＬＳＩプローブは通常特定遺伝子の欠失、複製または増幅を検出するために使用されている。この分析に基づいて、ＰＴＥＮの損失％、ＣＥＰ７の異常％、ＭＹＣの増加％及びＣＥＰ８の増加％を含むプローブセット１を選択した。プローブセット１の対応する感受性及び特異性はそれぞれ０．８８２、０．８４６である。

【0117】

【表6】

【0118】

最良の４プローブ組合せ、及びＰＴＥＮの損失％、ＣＥＰ７の異常％、ＭＹＣの増加％、ＣＥＰ８の増加％を含めた４個の単一ＦＩＳＨパラメーターについてのＲＯＣ曲線プロットを図４に示す。データは、１７個の良性ＲＯＩ及び２６個のＢＰＨ標本のＦＩＳＨ評価から得た。３３個の腫瘍ＲＯＩ及び２６個のＢＰＨ標本の４プローブ組合せの計算もＲＯＣプロット上に示す。ＲＯＣ曲線のＡＵＣをＲＯＣプロットの下の表に示す。

【0119】

表７は４プローブ組合せ性能の要約であった。４個の個々のプローブパラメーターについて選択したカットオフ値はＰＴＥＮの損失％＞３３、ＣＥＰ７の異常％＞２８、ＭＹＣの増加％＞３５及びＣＥＰ８の増加％＞３４であった。４プローブ組合せの感受性は１００％であり、腫瘍ＲＯＩ対ＢＰＨに対する特異性は８４．６％であった。良性ＲＯＩをＢＰＨと比較すると、プローブ組合せにより８８．２％の感受性及び８４．６％の特異性が生じた。

【0120】

【表7】

【0121】

図５に示すＲＯＣ分析から、選択したプローブセットの各単一ＦＩＳＨパラメータについてのカットオフ範囲が規定された。

【0122】

ＰＳＡ検査と比較すると、４．０ｎｇ／ｍＬを超える血清ＰＳＡレベルを有する患者に対する感受性はコンテンポラリーシリーズで約２０％であり、ＰＳＡ検査の特異性はおおよそ６０％〜７０％（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ，２００９ Ｕｐｄａｔｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）である。この研究で選択した４プローブセットを用いるＦＩＳＨ検査では、腫瘍標本について１００％の感受性及び８４．６％の特異性が達成された、よって、ＦＩＳＨアッセイがＰＳＡ検査よりも性能が優れている可能性を有している。高い感受性で、陰性結果は癌の可能性を排除することができ、追加の生検を避けることができる。更に、ＰＳＡはＢＰＨの兆候を有している男性を区別する能力が低い（Ｍｅｉｇｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１：５０５（１９９６））が、本明細書中に記載されているＦＩＳＨアッセイはフィールド効果に基づいて良性ＲＯＩを８８．２％の感受性及び８４．６％の特異性で検出する可能性を有している。

【0123】

前立腺癌診断のために使用されている別のアッセイはＰＣＡ３検査である（Ｖｌａｅｍｉｎｃｋ−Ｇｕｉｌｌｅｍら，Ｕｒｏｌｏｇｙ，７５：４４７（２０１０））。不確定のＰＳＡ（２．５〜１０．０ｎｇ／ｍＬ）を有している患者を評価する４つの研究では、感受性は５３〜８４％の範囲であり、特異性は７１〜８０％の範囲であった。以前の陰性生検後にＰＣＡ３の性能データを与えた少なくとも２００人の患者を用いた３つの研究では、感受性は４７〜５８％の範囲であり、特異性は７１〜７２％の範囲であった。陽性の生検を独立して予測するときにＰＣＡ３はＰＳＡよりもうまく機能しているが、本明細書中に記載されている４プローブＦＩＳＨアッセイの性能はＰＳＡ及びＰＣＡ３検査のいずれよりも良好であり、腫瘍標本の場合１００％の感受性及び８４．６％の特異性、良性ＲＯＩの場合８８．２％の感受性及び８４．６％の特異性であった。

【0124】

上記に加えて、ＦＩＳＨアッセイは凍結標本または細胞標本からの細胞に対しても使用され得る。評価は顕微鏡または画像獲得を介するシグナル検出、シグナルエニュメレーション及びその後のデータ解析アルゴリズムを含む。ＦＩＳＨアッセイは大きな染色体変化（欠失、増幅、異数染色体及び転座）を検出するために安定なＤＮＡを使用しており、分子評価を組織形態と組み合わせることができ、多病巣性及び異質な癌中のまれな異常を検出することができ、組織学的評価により見つけられる実際の腫瘍を含んでいない生検標本中の癌の存在を検出することができ、独立型検査または他の検査（例えば、組織学、ＰＳＡ、ノモグラム、メチル化及び突然変異）に対する補助として使用され得、プローブを組み合わせることにより単一アナライトアッセイよりも感受性及び特異性の向上を実現することができる。

【0125】

方法は、癌を難しい良性の状態（ＢＰＨ）と区別するために、良性組織を前癌病変と区別するために組織学的組織評価を助けることができ、生検、経尿道的切除（ＴＵＲＰ）または外科的（根治的前立腺摘除術）標本中の腺癌の診断を助けることができる。

【0126】

ＲＰ標本組を用いるこの研究では、染色体異常が腫瘍領域内でも、組織学的に明白な腫瘍を超えて広がっている正常な組織の領域内でも観察され、前立腺癌の広域癌化作用が確認された。広域癌化のＦＩＳＨ検出は、生検で見落とされた存在している癌から離れている広域細胞中の染色体異常を発見することにより診断生検サンプリングを減らすことができる。従って、ＭＹＣ、ＣＥＰ８、ＰＴＥＮ及びＣＥＰ７を測定するためのＦＩＳＨに基づく分子検査により、そうでなければ病理組織学的検査により見落とされる癌を検出することができ、よって前立腺針生検のサンプリングエラーを減らすことにより前立腺癌の診断を向上させることができる。

【0127】

［実施例３］
本実施例は、プローブの各種組合せを用いる免疫蛍光法（ＩＦ）及びＦＩＳＨによる前立腺標本の分析を記載する。

【0128】

同一ＦＦＰＥ前立腺固形腫瘍組織スライド（Ｋｏｒａｃら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，５８：１３３６−１３３８（２００５））を免疫蛍光法及びＦＩＳＨにより分析した。標本前処理／抗原賦活化プロトコルを開発し、ＦＦＰＥ組織に対する最良の結果のために最適化した。

【0129】

この手順の第１ステップは熱誘導エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）であった。ＦＦＰＥスライドをＨｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，テキサス州ケラー）で１０分間、Ｄ−リモネンで１０分間、１００％ エタノールで２分間を２回、８５％ エタノールで２分間、７０％ エタノールで２分間、５０％ エタノールで２分間、３０％ エタノールで２分間、及び水で５分間処理した。その後、スライドをクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１００℃で３０分間加熱し、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて２０分間冷却し、水中に５分間浸漬した後、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に５分間浸漬した。

【0130】

第２ステップは抗−α−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）抗体（Ｚｈｏｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２３：２３１−２３６（２００５））及びチラミドシグナル増幅アッセイ（Ｓｏｋｏｌｏｖａら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇ．，９（５）：６０４−６１１（２００７））を用いるＩＦであった。チラミド溶液アッセイキット及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＴＳＡ（商標）（チラミドシグナル増幅）キット番号２（カタログＮｏ．Ｔ２０９１２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン）を製造業者の指示に従って使用した。３％ Ｈ_２Ｏ_２中、室温で３０分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ブロッキング試薬（１００μＬ／スライド）を添加し、スライドを加湿ボックスにおいて室温で３０分間インキュベートした。希抗−ＡＭＡＣＲ抗体（１００μＬ；家兔；Ｐ５０４Ｓ；クローン１３Ｈ４；Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）（１％ ブロッキング試薬を用いて１：１００希釈した）を添加し、スライドを室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄した。ストックＨＲＰコンジュゲート溶液を１％ ブロッキング溶液で１：１００希釈した。１００μＬ容量のこの作業溶液で標準２２×２ｍｍカバーガラスは十分覆われた。スライドを室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄し、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。チラミド溶液（１００μＬ／スライド）を各スライドに添加した後、スライドを暗所において室温で１０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳを用いて５分間、次いでミリＱ水を用いて５分間洗浄した。

【0131】

第３ステップはＦＩＳＨであった。スライドをアルコール（７０％、８５％及び１００％，１分間ずつ）を用いて脱水し、完全に風乾させた。各スライドにプローブ溶液（１０μＬ）を添加し、カバーガラスをスライド上にラバーセメントでシールした。プローブ及び標的ＤＮＡを７３℃で５分間共変性し、スライドに対して３７℃で一晩ハイブリダイズした。２×ＳＳＣ／０．１％ ＮＰ−４０中に室温で浸漬させることによりカバーガラスを外した。スライドを２×ＳＳＣ／０．３％ ＮＰ−４０を用いて７３℃で２分間、２×ＳＳＣ／０．１％ ＮＰ−４０を用いて室温で１分間、次いで水で洗浄した後、暗所において完全に風乾させた。スライドをＤＡＰＩで対比染色した。

【0132】

抗−ＡＭＡＣＲ抗体をＰＴＥＮ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標））及びＣＥＰ７（登録商標）（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標））ＦＩＳＨプローブと一緒に用いるチラミド媒介ＩＦにより７個の標本を処理し、評価した。ＡＭＡＣＲは癌細胞に対する特異的マーカーである。これは常に前立腺癌上皮において過剰発現する。その発現は前癌状態病変（前立腺上皮内腫瘍）でも増加する（上掲のＺｈｏｎｇら，２００５）。ＡＭＡＣＲ染色は腫瘍ＲＯＩにおいて強陽性であり、これはＡＭＡＣＲタンパク質が過剰発現されていることを示す。この領域のみの多くの細胞がＦＩＳＨアッセイによりＰＴＥＮ欠失を示すＰＴＥＮの１個の対立遺伝子を有しており、７番染色体が無傷であることを示すＣＥＰ７の２個の対立遺伝子を有している。７個の標本の分析の結果を表８に示す。この表は、ＩＦ染色（ＡＭＡＣＲ陽性＋または陰性−）の７個の標本からの１４エリア中の１２（１２／１４＝８５．７％）は検査したプローブのＦＩＳＨシグナル異常及び訓練された病理医による腫瘍の形態学的評価と相関していたことを示す。異種及び多病巣性前立腺癌では、ＡＭＡＣＲ抗体染色によりＦＩＳＨ評価のための関心エリアが同定された。

【0133】

【表8】

【0134】

［実施例４］
本実施例は、前立腺癌に対する組織学的サンプル前処理及びハイブリダイゼーションの方法を記載する。

【0135】

ＦＦＰＥ（ホルマリン固定・パラフィン包埋）組織学的標本スライド（切片）を５６℃で２〜２４時間焼き、次いでＨｅｍｏ−Ｄｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓａｆｅｔｙ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ）またはＸｙｌｉｎｅを用いて室温で５〜１０分間ずつ２〜３回前処理した後、１００％ エタノールを用いて室温で１分間の濯ぎを２回実施し、４５％ ギ酸／０．３％ 過酸化水素中、室温で１５分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３〜１０分間濯いだ。次いで、スライドを前処理溶液（１×ＳＳＣ，ｐＨ６．３）中８０±５℃で３５〜５０分間インキュベートし、脱イオン水を用いて３分間濯ぎ、０．１Ｎ ＨＣｌ溶液中０．１５％ ペプシン中３７℃で２２±５分間インキュベートし、再び脱イオン水を用いて３分間濯いだ。スライドを７０％、８５％及び１００％ エタノールを用いて１分間ずつ脱水した後、風乾させた。１０μＬのそれぞれのプローブハイブリダイゼーションミックス（ＬＳＩ（登録商標）緩衝液、ブロッキングＤＮＡ、標識したプローブ）を標本に添加し、カバーガラスを被せ、ラバーセメントでシールした。スライドを７３±２℃で５分間共変性し、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ（Ｖｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて３７℃で１０〜２４時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを外した。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成した洗浄溶液中に入れ、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させた。次いで、サンプルを有している基質を溶解状態の核ＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し、またはサンプルを暗所で乾燥させた。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩを用いて対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せた。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存した。

【0136】

［実施例５］
本実施例は、前立腺ＦＦＰＥスライドＩＦ−ＦＩＳＨ手順の方法を記載する。

【0137】

同一ＦＦＰＥ前立腺固形腫瘍組織スライドに対する同時ＦＩＳＨ及び免疫蛍光法（ＩＦ）のアッセイのために、標本前処理／抗原賦活化プロトコルを開発し、ＩＦ−ＦＩＳＨ用ＦＦＰＥ組織に対する最良の結果のために最適化した。

【0138】

この手順の第１ステップは抗原賦活化である。前立腺癌ＦＦＰＥスライドを５６℃で２時間〜一晩焼いた。次いで、スライドをＨｅｍｏ−Ｄｅ中に１０分間ずつ２回浸漬することにより脱パラフィン化した。次いで、スライドを１００％ エタノール中で２分間ずつ２回インキュベートした。８５％、７０％、５０％及び３０％ エタノール中に２分間ずつ入れることによりスライドを水和した。最後に分子グレードのミリＱ水中に５分間浸漬した。温度が９６±４℃に達するまで水浴をクエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ クエン酸ナトリウム，０．０５％ トゥイーン２０，ｐＨ６．０）を含んでいるコプリンジャーを用いて前加熱した。スライドを２０〜６０分間インキュベートした。スライドをベンチ上で室温で２０〜４０分間冷却した。スライドをミリＱ水を用いて５分間洗浄し、ＰＢＳを用いて５分間１回濯いだ。

【0139】

第２ステップはＡＭＡＣＲ抗体及びチラミドシグナル増幅アッセイを用いる免疫蛍光法（ＩＦ）である。チラミド溶液アッセイ（ＴＳＡ）キット及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ＴＳＡ（チラミドシグナル増幅）キット番号２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を製造業者の指示に従って使用した。３％ Ｈ_２Ｏ_２中、室温で３０分間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ブロッキング試薬（１００μＬ／スライド）を添加し、加湿ボックスにおいて室温で３０分間インキュベートした。１００μＬの希ＡＭＡＣＲ家兔抗体（１％ ブロッキング試薬で１：１００希釈した）を添加し、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄した。ストックＨＲＰコンジュゲート溶液を１％ ブロッキング溶液で１：１００希釈した。１００μＬ容量のこの作業溶液で標準２２×２ｍｍカバーガラスは十分覆われる。スライドを室温で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳ／０．１％ トゥイーン２０を用いて５分間ずつ３回洗浄した後、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。１００μＬ／スライドのチラミド溶液を添加した後、暗所において室温で１０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳを用いて５分間、ミリＱ水を用いて５分間洗浄した。

【0140】

第３ステップはＦＩＳＨアッセイである。スライドをアルコール（７０％、８５％及び１００％，１分間ずつ）を用いて脱水し、完全に風乾させた。各スライドに１０μＬのプローブの溶液を添加し、カバーガラスをスライド上にラバーセメントでシールした。プローブ及び標的ＤＮＡを７３℃で５分間変性した後、３７℃で一晩ハイブリダイズした。サンプルを０．３×〜２×ＳＳＣ及び０．３％〜０．５％ ＮＰ−４０から構成した洗浄溶液中に入れ、サンプルの温度を約７３℃に約２〜５分間上昇させた。次いで、サンプルを有している基質を溶解状態の核ＤＮＡ結合ステイン（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ））を用いて対比染色し、またはサンプルを暗所で乾燥させた。後者の場合、サンプルを約１０μＬのＤＡＰＩを用いて対比染色し、新しいカバーガラスをサンプル上に載せた。その後、サンプルを調査し、または例えば約−２０℃で保存した。

【0141】

明細書中に挙げられているすべての特許明細書、出願公開明細書、論文、教科書及び他の刊行物は本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。前記刊行物はすべて、各刊行物が具体的に、個々に参照により組み入れられると示されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。

【0142】

好適には、本明細書中に例示的に記載されている発明は本明細書中に具体的に開示されていない要素または限定なしで実施され得る。よって、例えば、用語「含む」、「本質的に構成される」及び「構成される」の各々は他の２つの用語のいずれかで置換され得る。同様に、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明白に反対の指示がない限り複数も含む。よって、例えば、「方法」に対する言及は本明細書中に記載されている及び／または開示内容を読んだときに当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法及び／またはステップを含む。

【0143】

使用されている用語及び表現は説明の点で使用されており、限定的でない。これに関して、ある用語が「定義」の欄で定義されており、「詳細説明」中の他のところで他の方法で規定、記載または検討されている場合、これらの規定、記載及び検討のすべてが前記用語に属していると意図される。示され、記載されている要件の均等物またはその一部を除外する前記用語及び表現の使用も意図していない。更に、副題、例えば「定義」が「詳細説明」中に使用されているが、その使用は単に参照を容易とするためであり、１つの欄でなされている開示をその欄のみに限定すると意図していない。むしろ１つの副題の下でなされている開示内容は他の副題のそれぞれの下でなされている開示内容を構成すると意図される。

【0144】

各種修飾が特許請求されている発明の範囲内で可能であることが認識されている。よって、本発明は好ましい実施態様及び任意の要件との関連で具体的に開示されているが、当業者は本明細書中に開示されている概念の修飾及び変更を用いることができる。前記修飾及び変更は本明細書中で特許請求されている発明の範囲内であると見なされる。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5】