特許 6203846 腸細胞バリア機能不全を検出するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6203846

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】腸細胞バリア機能不全を検出するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20170914BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20170914BHJP

   G01N 1/30 20060101ALI20170914BHJP

   A61B 1/00 20060101ALI20170914BHJP

   C12Q 1/00 20060101ALI20170914BHJP

   C07K 5/107 20060101ALN20170914BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 Y

   G01N33/48 P

   G01N33/483 C

   G01N33/543 575

   G01N1/30

   A61B1/00 550

   C12Q1/00 Z

   !C07K5/107ZNA

【請求項の数】2

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-530160(P2015-530160)

(86)(22)【出願日】2013年9月5日

(65)【公表番号】特表2015-528573(P2015-528573A)

(43)【公表日】2015年9月28日

(86)【国際出願番号】US2013058296

(87)【国際公開番号】WO2014039699

(87)【国際公開日】20140313

【審査請求日】2016年8月4日

(31)【優先権主張番号】61/697,190

(32)【優先日】2012年9月5日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】515057908

【氏名又は名称】リウ， ジュリア

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】アービン， ランダル トーマス

(72)【発明者】

【氏名】デイビス， エリザベス メリカ

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０５４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１３６４９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 KNODLER LA，Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia.，Proc Natl Acad Sci U S A，米国，２０１０年１０月１２日，Vol.107,No.41，Page.17733-17738

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ａ６１Ｂ １／００

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｇ０１Ｎ １／３０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出を補助するための方法であって、該方法は、
（ａ）患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した検出可能なマーカーを有するプローブで染色する工程、および
（ｂ）該染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、該患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と関連したカスパーゼ−１の正常以上のレベルの証拠として、それぞれ正常な個体に由来する同様に染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と比較して上昇したレベルの検出可能なマーカーの存在について試験する工程
を包含し、
ここでカスパーゼ−１について陽性染色される正常な個体に由来する腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞の数と比較した、カスパーゼ−１について陽性染色される該患者に由来する腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞の数の上昇は、該患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する細胞バリア機能不全の指標であり、
該プローブは、テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素との結合体であり、
該プローブは、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有し、そして、カスパーゼ−１染色が、カスパーゼ−１に対するプローブの結合によって検出される、方法。

【請求項2】

腸細胞バリア機能不全を検出することにおいて使用するためのプローブ組成物であって、該プローブ組成物は、
（ａ）カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した第１の検出可能なマーカーを含む第１のプローブ、および
（ｂ）カスパーゼ−３＆７インヒビターに結合体化した、該第１のマーカーとは異なる第２の検出可能なマーカーを含む、第２のプローブ、
を含み、
該第１のプローブは、テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素との結合体であり、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有し、
該第２のプローブは、カスパーゼ−３＆７インヒビターとＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫの結合体であり、そして
腸細胞バリア機能不全が、蛍光分析によって検出される、プローブ組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（発明の分野）
本発明は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する細胞バリア機能不全を検出するための方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

（発明の背景）
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、便通が頻繁であること（ｂｏｗｅｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、軟らかさおよび腹部不快感の変化によって特徴付けられる一般的な臨床状態である。Ｒｏｍｅ ＩＩ基準を使用した疫学研究から、ＩＢＳの有病率は、北米で５％〜１２％、アジアで１％〜２２％、および欧州で１〜８％まで変動することが示されている。女性に多いことが、大部分の研究（特に、西洋諸国の）において認められる。ＩＢＳの主要な要因（ｄｒｉｖｅｒ）のうちの１つは、異常な腸上皮細胞（ＩＥＣ）押し出しであり得る。

【0003】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸および小腸の一群の炎症状態である。ＩＢＤの主なタイプは、クローン病および潰瘍性大腸炎である。ＩＢＳおよびＩＢＤは両方とも、患者における細胞バリア機能不全をもたらす異常な腸上皮細胞（ＩＥＣ）押し出しに起因し得るか、またはそれによって悪化し得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

発明の概要
本発明は一実施形態において、患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検出するための方法であって、該方法は、（ａ）患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した検出可能なマーカーを有するプローブで染色する工程、および（ｂ）該染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、該患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と関連したカスパーゼ−１の正常以上のレベルの証拠として、それぞれ正常な個体に由来する同様に染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と比較して上昇したレベルの検出可能なマーカーの存在について試験する工程による、方法を包含する。

【0005】

該患者の腸上皮細胞（ＩＥＣ）、中咽頭上皮細胞（ＯＥＣ）、もしくは口腔上皮細胞（ＢＥＣ）におけるカスパーゼ−１の上昇したレベルは、該患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する細胞バリア機能不全の指標である。

【0006】

一実施形態において、患者のＩＥＣは、その患者の腸の内層からの生検もしくは吸引によって得られ、蛍光マーカーを用いてインビトロで染色され、蛍光レベルについて分析される。別の実施形態において、患者のＯＥＣは、その患者における中咽頭細胞の歯科生検もしくは吸引から得られ、蛍光マーカーを用いてインビトロで染色され、蛍光レベルについて分析される。第３の実施形態において、患者のＢＥＣは、例えば、口腔粘膜（cheek）を穏やかにぬぐうことによって得られ、蛍光マーカーによってインビトロで染色され、蛍光レベルについて分析される。蛍光検出は、蛍光顕微鏡法、蛍光プレートリーダー、フローサイトメトリー、または蛍光レベルを検出および測定するために適した他の方法によってであり得る。

【0007】

別の一般的な実施形態において、ＯＥＣもしくはＢＥＣにおけるカスパーゼ−１の上昇したレベルは、ＩＢＤの一つの主なタイプであるクローン病の診断である。

【0008】

プローブは、カスパーゼ−１インヒビター（例えば、テトラペプチドＹＶＡＤ）と蛍光色素との結合体であり得る。例示的なプローブは、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有する。

【0009】

例示的な実施形態において、細胞は、（ａ）カスパーゼ−１インヒビターと結合体化した第１の検出可能なマーカーを含む第１のプローブ、および（ｂ）カスパーゼ−３＆７インヒビターに結合体化した、上記第１のマーカーとは異なる第２の検出可能なマーカーを含む第２のプローブ、で染色される。上記細胞は、カスパーゼ−１と関連（associate）したマーカー 対 カスパーゼ−３＆７と関連したマーカーの比を決定するために分析される。カスパーゼ−１マーカー 対 カスパーゼ−３＆７マーカーの比は、ＩＢＳもしくはＩＢＤを有する被験体においてよりも健康な被験体において有意に低い、例えば、少なくとも４０％低い。例示的な第２のプローブは、カスパーゼ−３／７ インヒビターＩと、ピーク吸収波長および発光波長が上記第１のプローブの蛍光色素のものとは異なっている蛍光色素との結合体である。

【0010】

上記方法は、ＩＥＣにおけるカスパーゼ−１のレベルが正常よりも高く、有意に上昇したレベルである場合に、カスパーゼ−１インヒビター、抗炎症剤、プロバイオティクス因子もしくはこれらの因子の組み合わせによる患者処置を示すために使用され得る。

【0011】

別の一般的な実施形態において、上記ＩＥＣ、ＯＥＣ、もしくはＢＥＣは、インサイチュで染色され、プローブベースの共焦点レーザー内視鏡検査法（ｐＣＬＥ）によって調べられる。

【0012】

他の局面において、本発明は、プローブベースの共焦点レーザー内視鏡検査法（ｐＣＬＥ）によって患者のＩＥＣのインサイチュ画像を得る工程、および上記画像においてＩＥＣを計数して、上記画像化したＩＥＣにおけるギャップ数を決定する工程によって、患者における腸細胞バリア機能不全を検出する方法を包含する。細胞１００個あたり約２より大きなギャップ密度は、細胞バリア機能不全を示し、（例えば、プロバイオティクス因子による）患者処置の指標として使用され得る。

【0013】

腸細胞バリア機能不全を検出することにおける使用のためのプローブ組成物もまた、開示される。上記組成物は、（ａ）カスパーゼ−１インヒビターに結合体化された第１の検出可能なマーカーを含む第１のプローブ、および（ｂ）カスパーゼ−３／７インヒビターに結合体化された、上記第１のマーカーとは異なる第２の検出可能なマーカーを含む第２のプローブ、を含む。上記第１のプローブは、テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素との結合体（例えば、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有するプローブ）であり得る。上記第２のプローブは、カスパーゼ−３／７インヒビターＩと上記第１のプローブにおけるものとは異なる蛍光色素との結合体であり得る。

【0014】

本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読めばより完全に明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した検出可能なマーカーを有するプローブで染色する工程、および
（ｂ）該染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、該患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と関連したカスパーゼ−１の正常以上のレベルの証拠として、それぞれ正常な個体に由来する同様に染色された腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞と比較して上昇したレベルの検出可能なマーカーの存在について試験する工程
を包含し、
（ｃ）ここで該患者の腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞におけるカスパーゼ−１の上昇したレベルは、該患者における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）もしくは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連する細胞バリア機能不全の指標である、
方法。
（項目２）
前記染色する工程は、（ｉ）前記患者から、生検もしくは吸引によって患者の腸上皮細胞を得る工程、および（ｉｉ）該細胞をインビトロで染色する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記染色する工程は、（ｉ）前記患者から、歯科生検によって中咽頭上皮細胞を得る工程、および（ｉｉ）該細胞をインビトロで染色する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記染色する工程は、（ｉ）前記患者の口腔粘膜スワブから、口腔上皮細胞を得る工程、および（ｉｉ）該細胞をインビトロで染色する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記検出可能なマーカーは蛍光性であり、前記試験する工程は、蛍光顕微鏡法、蛍光プレートリーダー、もしくは蛍光フローサイトメトリーによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記染色する工程は、前記検出可能なマーカーを、前記患者の腸内の腸上皮細胞に適用する工程を包含し、および前記試験する工程は、前記染色した細胞を内視鏡で可視化する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記染色する工程は、前記検出可能なマーカーを前記患者の中咽頭内の中咽頭上皮細胞に適用する工程を包含し、前記試験する工程は、前記染色した細胞を、該患者の中咽頭の蛍光検出によって可視化する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記染色する工程は、前記検出可能なマーカーを、前記患者の口内の口腔上皮細胞に適用する工程を包含し、前記試験する工程は、前記染色した細胞を、該患者の口の蛍光検出によって可視化する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記プローブは、テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素との結合体の口である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記プローブは、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記腸上皮細胞、中咽頭上皮細胞、もしくは口腔上皮細胞を、カスパーゼ−３＆７に対して特異的な第２の検出可能なプローブで染色する工程、ならびにカスパーゼ−１と関連するマーカー 対 カスパーゼ−３＆７と関連するマーカーの比を決定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第２のプローブは、カスパーゼ３／７インヒビターＩと蛍光色素との結合体である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
カスパーゼ−１マーカー 対 カスパーゼ−３＆７マーカーの比は、ＩＢＳもしくはＩＢＤを有する被験体においてよりも健康な被験体において有意に低い、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
カスパーゼ−１マーカー 対 カスパーゼ−３＆７マーカーの比は、ＩＢＳもしくはＩＢＤを有する被験体においてよりも健康な被験体において少なくとも約４０％低い、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
カスパーゼ−１の上昇したレベルは、カスパーゼ−１インヒビターもしくは抗炎症剤による患者処置の指標として使用される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
患者における腸細胞バリア機能不全を検出する方法であって、該方法は、
プローブベースの共焦点レーザー内視鏡検査（ｐＣＬＥ）によって患者のＩＥＣのインサイチュ画像を得る工程、
該画像中のＩＥＣを計数して、該画像化したＩＥＣにおけるギャップ数を決定する工程であって、ここで細胞１００個あたり２より大きいギャップ数は、細胞バリア機能不全を示す、工程
を包含する、方法。
（項目１７）
細胞１００個あたり３より大きなギャップ数は、細胞バリア機能不全を示す、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
１００個あたり約２より大きいＩＥＣのレベルは、プロバイオティクス因子による患者処置の指標として使用される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
腸細胞バリア機能不全を検出することにおいて使用するためのプローブ組成物であって、該プローブ組成物は、
（ａ）カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した第１の検出可能なマーカーを含む第１のプローブ、および
（ｂ）カスパーゼ−３＆７インヒビターに結合体化した、該第１のマーカーとは異なる第２の検出可能なマーカーを含む、第２のプローブ、
を含む、プローブ組成物。
（項目２０）
前記第１のプローブは、前記テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素との結合体である、項目１９に記載のプローブ組成物。
（項目２１）
前記第１のプローブは、構造Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫを有する、項目２０に記載のプローブ組成物。
（項目２２）
前記第２のプローブは、カスパーゼ−３／７インヒビターＩと前記第１のプローブ蛍光色素のものとは異なる蛍光色素との結合体である、項目１９に記載のプローブ組成物。
（項目２３）
患者におけるクローン病を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）患者の中咽頭上皮細胞もしくは口腔上皮細胞を、カスパーゼ−１インヒビターに結合体化した検出可能なマーカーを有するプローブで染色する工程、および
（ｂ）該染色された中咽頭上皮細胞を、該患者の中咽頭上皮細胞と関連したカスパーゼ−１の正常以上のレベルの証拠として、正常な個体に由来する同様に染色した中咽頭上皮細胞と比較して上昇したレベルの検出可能なマーカーの存在について試験する工程、
を包含し、
（ｃ）ここで該患者の中咽頭上皮細胞におけるカスパーゼ−１の上昇したレベルは、クローン病の指標である、
方法。
（項目２４）
前記染色する工程は、（ｉ）前記患者から、歯科生検によって中咽頭上皮細胞を得る工程、および（ｉｉ）該細胞をインビトロで染色する工程を包含する、項目２３に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】極性化したＴ８４単層におけるＩＥＣ誘発性細胞押し出しのカスパーゼ−１活性化。（ａ）ニゲリシン（ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）処理（５０μＭ）した培養Ｔ８４細胞における活性化カスパーゼ−１の代表的ＦＬＩＣＡ １染色（緑色）。赤色、ＺＯ−１染色；青色、ＤＡＰＩ、緑色、ＦＬＩＣＡ １染色（スケールバー５０μｍ）。（ｂ）ニゲリシン処理（５０μＭ）したＴ８４細胞における増大した活性カスパーゼ−１（ｐ１０）発現。（ｃ）ニゲリシンで処理したＴ８４細胞のＴＥＭ像：核膜の周りのクロマチン凝集、細胞質中の濃密体を有する小さなおよび大きな透明液胞、ならびにマトリクス密度の増大を伴う無傷のミトコンドリア。Ａ、頂端表面；Ｂ、基底表面；Ｎ、核（スケールバー２μｍ）。

【図2】カスパーゼ−１活性化後の極性化した単層の変化した透過性。（ａ）Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（ニゲリシン ２５μＭにおいて）で逆転した、ニゲリシンで処理したＴ８４単層のＴＥＲにおける用量依存性低下（±Ｓ．Ｄ．）。（ｂ）ニゲリシンで処理したＴ８４単層をＥＣＩＳによって測定した場合の、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫで逆転した（ニゲリシン ２５μＭにおいて）、ＴＥＲにおける時間依存性低下。（ｃ）ニゲリシン １０μＭで一晩処理した単層を横断するＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ＹＧミクロスフェアおよびＥ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７の動き。赤色、ＺＯ−１染色；中央画像緑色、１μｍ ミクロスフェア；右側画像緑色、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７（スケールバー５０μｍ）。データは、３回の独立した実験の代表である。^＊Ｐ＜０．０５。

【図3】ＷＴマウスと比較してＩＬ−１０ ＫＯにおいて増大したカスパーゼ−１活性化。（ａ）ウェスタンブロット分析によるＩＬ−１０ ＫＯにおいて増大した活性カスパーゼ−１（ｐ１０）発現。（ｂ）ＩＬ−１０ ＫＯ（Ｎ＝５）の腸組織において増大した活性ＩＬ−１β。（ｃ）ＷＴマウスおよびＩＬ−１０ ＫＯマウスに由来するＰＣＮＡ染色した腸切片の代表画像（スケールバー５０μｍ）。（ｄ）齧歯類の腸組織の陰窩１つあたりの陽性のＰＣＮＡ染色細胞の数。^＊Ｐ＜０．０５。

【図4】ＩＬ−１０ ＫＯマウスにおける管腔の微粒子および微生物への増大した透過性。（ａ）血液サンプル（Ｎ＝４）への経口投与したＦＩＴＣ−デキストランの透過性。（ｂ）血液サンプル（Ｎ＝６）中の経口投与した０．５μｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ミクロスフェアの存在。（ｃ）肝臓および脾臓（Ｎ＝４）へのＥ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７の移動。（ｄ）マウス腸において押し出しゾーンに入っているＥ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７の代表画像。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図5】ＩＥＣ押し出しおよびインビボでのミクロスフェアの透過に関するカスパーゼ−１の調節。（ａ）共焦点内視鏡検査法を使用して上皮ギャップ密度を経時的に測定した場合の、ＩＬ−１０ ＫＯマウスにおけるＩＥＣ押し出しに関するＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ １０ｍｇ／ｋｇでの処置（Ｎ＝５）。（ｂ）ＩＬ−１０ ＫＯマウスの血液サンプル（Ｎ＝６）中の経口投与した０．５μｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ミクロスフェアの存在。（ｃ）ギャップ密度によって測定した場合の、ＷＴマウス（Ｎ＝３）におけるＩＥＣ押し出しに関する１日についての０．３３ｍｇ／ｋｇのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＶ型ピリ線毛の強制経口投与（ｏｒｏｇａｖａｇｅ）。^＊Ｐ＜０．０５。

【図6】患者におけるＩＥＣのカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３＆７の活性化。（ａ）粘膜生検サンプルの代表的な活性化カスパーゼ−１およびカスパーゼ−３＆７染色。白抜き矢尻は、陽性染色されたＩＥＣを示す（スケールバー５０μｍ）。（ｂ）コントロール患者（Ｎ＝３）およびＩＢＤ患者（Ｎ＝３）の粘膜生検サンプル中の上皮細胞総数に対して正規化したＦＬＩＣＡ １もしくは３＆７染色細胞（±Ｓ．Ｄ．）。（ｃ）ＩＢＤ患者の管腔吸引物から調製された細胞学的ブロック（ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｂｌｏｃｋ）に由来する代表的な上皮細胞および免疫細胞（Ｈ＆Ｅ染色、倍率４００×）。（ｄ）コントロール患者（Ｎ＝７）およびＩＢＤ患者（Ｎ＝１１）の管腔吸引物中の押し出されたＩＥＣの数（±Ｓ．Ｄ．）。（ｅ）管腔吸引物中のカスパーゼ−３＆７陽性の押し出された細胞に対する活性化カスパーゼ−１の比。^＊Ｐ＜０．０５。

【図7】無症候性コントロール患者（Ｎ＝３）およびＩＢＤ患者（Ｎ＝３）の粘膜組織における活性化カスパーゼ１およびＩＬ−１β発現。（ａ）ＥＬＩＳＡによって測定した場合の、コントロール患者と比較してＩＢＤにおいて増大した活性ＩＬ−１β発現。（ｂ）ＩＢＤ患者の回腸末端部における活性ＩＬ−１βの増大した発現を確認するウェスタンブロット分析。（ｃ）ウェスタンブロット分析による、ＩＢＤ患者において増大した活性カスパーゼ−１（ｐ１０）発現。^＊Ｐ＜０．０５。

【図8】上皮細胞およびギャップを計数するために使用される、患者由来の回腸末端部の代表的ｐＣＬＥ画像。この画像中でギャップは認められなかった。白抜き矢印は、細胞の計数で使用される個々の上皮細胞を示す。

【図9】患者の回腸末端部のｐＣＬＥ画像。ａ）健康なコントロール患者（左）およびＩＢＳを有する患者（右）の回腸末端の代表的画像。粘膜固有層および絨毛の管腔が標識される。白抜きの矢尻は、上皮内層において非常に密な領域として現れる２つの隣り合う上皮ギャップを示す。ｂ）コントロール患者の分析に使用される３つの連続したｐＣＬＥ画像。Ｃ）ＩＢＳ患者の分析に使用される３つの連続したｐＣＬＥ画像。スケールバー：２０μｍ。

【図10】コントロール患者およびＩＢＳ患者の回腸末端部における上皮ギャップ密度の比較（メジアン±四分位数範囲）。上皮ギャップ密度は、計測した細胞１０００個あたりの上皮ギャップ数として表される。^＊は、ｐ＜０．００１を示す。

【図11】図１１は、ウェスタンブロット分析によって決定した場合の、正常な患者およびクローン病患者での歯科生検由来の中咽頭上皮細胞におけるカスパーゼ−１発現のレベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（発明の詳細な説明）
Ａ．カスパーゼ−１染色によって細胞バリア機能不全を検出する方法
Ａ１．カスパーゼ−１媒介性ＩＥＣ押し出しは、上皮単層の破れ目を生じる

【0017】

カスパーゼ−１誘発性ＩＥＣ押し出しの形態を調査するために、本発明者らは、ニゲリシン（十分に確立されたＮｌｒｐ３依存性インフラマソーム活性化因子）を極性化されたＴ８４単層に適用した。ＦＬＩＣＡ １染色を使用して、本発明者らは、処理後３時間で単層において増大した活性化カスパーゼ−１および細胞押し出しを観察した（図１ａ）。ニゲリシン処理Ｔ８４細胞における活性カスパーゼ−１発現を、ウェスタンブロット分析によって確認した（図１ｂ）。走査型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による単層から押し出された細胞の形態学的外見から、核における明瞭なクロマチン凝集、無傷のミトコンドリアおよび細胞質中の小さなもしくは大きな透明な液胞が明らかになった（図１ｃ）。

【0018】

細胞押し出しのこの形態がバリア機能の喪失を生じるか否かを決定するために、本発明者らは、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。ニゲリシン曝露後に、用量依存性バリア機能不全が発生し、これは、３時間で（図２ａ）および一晩の処理後（図２ｂ）に、選択的で強力かつ不可逆性のカスパーゼ−１インヒビターＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫでの予備処理によって排除された。Ｔ８４単層における破れ目がＴＥＭ画像上、直径１〜２μｍであると思われると仮定すると、本発明者らは、最低用量のニゲリシン処理を使用して、微粒子（１μｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ミクロスフェア）および微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７）に対する上皮完全性を評価した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上側のチャンバから単層を通って下側のチャンバへのミクロスフェアおよびＥ．ｃｏｌｉの移動が観察された（図２ｃ）。ＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅミクロスフェアおよびＥ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７を、基底側面のウェルの培地中で回収した。

【0019】

Ａ２．インビボでの細胞押し出しおよび上皮完全性に関するカスパーゼ−１の調節
インビボでの腸の透過性に対するカスパーゼ−１誘発性ＩＥＣ押し出しの効果を理解するために、本発明者らは、１２９／ＳｖＥｖ（ＷＴ）マウスと比較して、（上皮ギャップの増大した密度によって測定される場合の）ＩＬ−１０ ＫＯにおいて認められた増大した細胞押し出しが、増大したカスパーゼ−１活性化に起因するか否かを最初に試験した。ＩＬ−１０ ＫＯマウスの小腸における活性カスパーゼ−１発現の増大は、ウェスタンブロット分析（図３ａ）で認められ、ＥＬＩＳＡによる増大した活性ＩＬ−１β発現（図３ｂ）とともに確認された。ＩＬ−１０ ＫＯにおける低下した細胞増殖が、観察された上皮ギャップ密度の差異に寄与したか否かを決定するために、本発明者らは、２種類のマウス系統に由来する腸サンプルをＰＣＮＡで染色した。ＩＬ−１０ ＫＯは、ＷＴマウスと比較して、細胞増殖において３８％低下を有した（図３ｃおよび図３ｄ）。

【0020】

腸の透過性に対する増大したＩＥＣ押し出しの効果を、ＩＬ−１０ ＫＯマウスおよびＷＴマウスにおいて、高分子（デキストラン）および微粒子（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ミクロスフェア）の血液への透過、ならびに肝臓および脾臓への微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７）の移動に関して調査した。増大したＩＥＣ押し出しは、血液へのデキストラン（図４ａ）および０．５μｍ ミクロスフェア（図４ｂ）の増強された透過、ならびに組織培養によって決定した場合のＥ．ｃｏｌｉの移動（図４ｃ）と相関した。ＧＦＰ標識Ｅ．ｃｏｌｉを強制投与したマウスに由来する回腸組織を共焦点顕微鏡法で検鏡すると、ＩＬ−１０ ＫＯの腸における押し出しゾーン付近に細菌が存在していることが明らかになった（図４ｄ）。

【0021】

インビボでのＩＥＣ押し出しに対するカスパーゼ−１阻害の効果を経時的に評価するために、本発明者らは、選択的カスパーゼ−１インヒビターＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（１０ｍｇ／ｋｇ）で４日間、７日間および１０日間（齧歯類腸細胞の平均寿命の５倍^４０）にわたって腹腔内注射によってＩＬ−１０ ＫＯマウスを処置した。コントロールＩＬ−１０ ＫＯ群には、等容積の２％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯを１０日間与えた。上皮ギャップ密度の低下によって測定した場合に、ＩＥＣ押し出しの時間依存性低下が、ＹＶＡＤで処置したＩＬ−１０ ＫＯマウスで生じた（図５ａ）。ギャップ密度の低下は、７日目に、強制経口投与した（ｏｒｏｇａｖａｇｅｄ）０．５μｍ 不活性ラテックスミクロスフェアの血液への透過を正規化することを伴った（図５ｂ）。

【0022】

ＩＥＣ押し出しおよび上皮完全性に対するカスパーゼ−１活性化の効果を、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＶ型ピリ線毛（カスパーゼ−１活性化を誘発するために経口で与えられ得るＩＣＥプロテアーゼ活性化因子（ＩＰＡＦ）インフラマソームアクチベーター）の投与を用いて試験した。ニゲリシンは経口投与できず、顕著な全身毒性と関連したので、本発明者らはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＶ型ピリ線毛を選択した。ＩＶ型ピリ線毛（０．３３ｍｇ／ｋｇ）を１日間強制経口投与したＷＴマウスにおいて、本発明者らは、等容積の食塩水を経口投与したコントロールマウス（図５ｃ）と比較して、より高い上皮ギャップ密度によって測定した場合に、ＩＥＣ押し出しの増大に向かう傾向を認めた。

【0023】

Ａ３．ヒト腸における非アポトーシス性のＩＥＣ押し出しは、カスパーゼ−１活性化によって媒介される
ＩＥＣのカスパーゼ−１活性化がヒトにおける細胞押し出しの主要な機構を代表するか否かを調査するために、本発明者らは、ＩＢＤ患者および無症候性コントロール患者の正常に見える回腸末端部から、粘膜生検物および管腔吸引物を集めた。粘膜生検サンプルを、ＦＬＩＣＡ−１および３＆７で染色して、活性化カスパーゼ−１染色（ピロトーシス性）もしくはカスパーゼ−３＆７染色（アポトーシス性）に対して陽性のＩＥＣを同定した（図６ａ）。コントロールにおける陽性染色されたカスパーゼ−１細胞 対 カスパーゼ−３＆７細胞の比は、１．１６：１であった；これは、ＩＢＤ患者では１．７：１に増大していた（図６ｂ）。管腔吸引物の分析に関しては、コントロール患者は、細胞学的ブロック（ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｂｌｏｃｋ）調製のための材料を不十分にしか有しなかった。ＩＢＤ患者では、細胞学的ブロックで見られた有核細胞の総数は、１２〜１５５個の細胞に及び、ＩＥＣは、上記細胞のうちの４１〜１００％を占めた（図６ｃ）。本発明者らは、フィルター上に集められた管腔吸引物中の押し出された細胞の総数を定量した：コントロール患者と比較してＩＢＤ患者由来の管腔吸引物では、有意により多い細胞数が認められた（図６ｄ）。押し出された細胞および細胞破片を、活性化カスパーゼ−１および３＆７に関してＦＬＩＣＡで染色した。ＦＬＩＣＡ染色した管腔吸引物の画像を、組織サンプルに使用される等級付けスケールと同様に、２つの膜上に存在する細胞および細胞破片のカスパーゼ染色の強度に基づいてスコア付けした。各画像に、染色強度および染色された細胞もしくは細胞破片の数に応じて、スコア０〜４を割り当てた。このスコア付けシステムを使用して、コントロールにおける陽性染色されたカスパーゼ−１細胞 対 カスパーゼ−３＆７細胞の比は、約１：１であった。これは、ＩＢＤ患者では２：１へと増大した（図６ｅ）。

【0024】

粘膜生検サンプル中の活性ＩＬ−１βの発現をＥＬＩＳＡで測定したところ、ＩＢＤ患者において有意に高かった（図７ａ）。粘膜生検サンプルにおける活性カスパーゼ−１およびＩＬ−１βの増大した発現は、ウェスタンブロット分析で確認された（図７ｂおよび図７ｃ）。まとめると、これら結果は、カスパーゼ−１活性化が健康なヒトの腸におけるＩＥＣ押し出しの重大な機構を表し、ＩＢＤ患者において認められる細胞押し出しにおける増大の大部分の原因であると思われることを示唆する。この研究では、本発明者らは、インビトロおよびインビボで上皮の破れ目をもたらす、カスパーゼ−１活性化によって媒介されるＩＥＣ押し出しの炎症形態を記載した。ＩＥＣ押し出しのこの形態は、極性化した単層を横断する微粒子および微生物の移動を可能にした。齧歯類の腸におけるＩＥＣ押し出しは、カスパーゼ−１酵素の活性化もしくは阻害によって調節され得る。ＩＬ−１０ ＫＯマウスにおける増大したＩＥＣ押し出しは、高分子（デキストラン）、微粒子の増大した透過および共生細菌の移動と関連した。インビボでのカスパーゼ−１活性の調節は、ＩＥＣ押し出しの変化とともに、不活性なラテックスミクロスフェアの透過によって測定される場合、上皮完全性における付随する変化を生じた。患者において、カスパーゼ−１媒介性ＩＥＣの脱落は、健康な患者およびＩＢＤ患者の小腸において観察され得るが、ＩＢＤ患者ではその増大が顕著であった。本発明者らの実験結果は、上皮完全性を損なうと以前に報告された^７ＩＥＣ押し出しの根底にある機構に根本的な新たな見識を提供する。

【0025】

ピロトーシスおよびアポトーシスの特徴を有する押し出された細胞を示す十二指腸吸引物の以前の形態分析と一致して、本発明者らの管腔吸引物研究から、押し出された細胞におけるカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３＆７の両方の活性化が明らかになった。本発明者らの粘膜生検分析の知見は、ヒト腸標本の活性化カスパーゼ−３染色を使用して、脱落したＩＥＣのうちの４４％でアポトーシスが見いだされた以前の研究と一致している。この研究では、本発明者らは、押し出されているＩＥＣのうちの４６％でカスパーゼ−３＆７活性化を認めた。

【0026】

患者由来の押し出された細胞および生検サンプルの本発明者らの分析結果は、補完的かつ首尾一貫しており、押し出されたＩＥＣの以前の研究とも一致している。管腔吸引物分析は、押し出されたＩＥＣが脱落後に断片へと分解し得るので、粘膜生検分析結果は、カスパーゼ−１陽性細胞およびカスパーゼ３＆７陽性細胞の相対比を確認するために必須であったという事実によって制限され得る。カスパーゼ−１媒介性細胞押し出しゾーンは微生物に対して透過性であり得るので、ＩＢＤ患者におけるその劇的な上昇は、以前の研究で認められた増大した粘膜内およびリンパ節関連細菌負荷に寄与し得る。患者におけるバリア機能は、現在の研究では試験されなかった。上皮の欠陥が微粒子および微生物の侵入を許すようであるので、上皮完全性を調べるための患者における適切な試験は、厳格な検証研究を要する。さらに、本発明者らは、観察された上皮完全性の喪失を定義するために重要なカスパーゼ−１媒介性細胞脱落後の押し出しゾーンの終結機構も回復機構も調査しなかった。アポトーシス誘発性細胞押し出しにおいて、周りの細胞の収縮およびタイトジャンクションの再組織化は、バリア機能の喪失を防止するために必要とされる。ピロトーシスにおける細胞脱落プロセスの生化学的事象を詳細に示すためのさらなる研究は、タイトジャンクション調節、押し出しに関与する収縮タンパク質、および細胞押し出しのこの形態における終結機構の役割の我々の理解を促進する。カスパーゼ（ｃａｓｐｓｅ）−１媒介性細胞押し出し後の終結機構の基本的な理解は、適切な試験の開発を促進して、患者における上皮完全性を評価するために必要とされ得る。

【0027】

透過型顕微鏡法（ＴＥＭ）による押し出された細胞の形態的な外見は、ピロトーシス細胞の以前の報告と一致し（図１ｃ）、ヒトにおける損なわれた上皮完全性と関連したＩＥＣ押し出しの形態の説明に合う。ＴＥＲ研究結果は、細胞押し出しのこの形態によって誘発される上皮内層における破れ目がカスパーゼ−１依存性であることを示唆する。本発明者らのデータは、カスパーゼ−１活性化から生じる細胞押し出しゾーンが管腔の微生物および抗原の侵入部位を提供し得ることをさらに示唆する。微生物侵入の部位としての細胞内空間は、代謝的ストレスを受けている上皮において、ならびに腸細胞、単球および樹状細胞の三次元共存培養システムにおいて、観察された。ここで、本発明者らは、ＩＥＣのみでのインフラマソーム／カスパーゼ−１活性化を有する上皮における類似のバリア欠損の発生を観察した。

【0028】

齧歯類モデルでは、カスパーゼ−１活性の調節は、上皮内層の完全性における関連した変化とともに、ＩＥＣ押し出しを変化させた。上皮のバリア機能が保存されるアポトーシス媒介性細胞押し出しと比較したところ、本発明者らは、ピロトーシス媒介性ＩＥＣ押し出しが粘膜への微生物および微粒子の進入に好都合な上皮の破れ目を導入することを見いだした。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＩＶ型ピリ線毛での一晩処理を伴うピロトーシスの誘発は、ＷＴマウスにおいてミクロスフェアの透過の増大を付随する、より高いＩＥＣ押し出しを生じた。逆に、ＩＬ−１０ ＫＯマウスにおけるカスパーゼ−１活性の阻害は、上皮ギャップ密度によって測定した場合に、ＩＥＣ押し出しの時間依存性低減を生じた。これら観察に基づいて、本発明者らは、大腸炎の定常状態の薬理学的活性（半減期の５倍）を達成する時間が、ＩＬ−１０ ＫＯマウスに関しては約３５日間であると概算した。従って、本発明者らは、低減した細胞押し出しの生理学的効果を研究するために、通常の臨床エンドポイント（大腸炎スコアにおける改善）ではなく、強制経口投与したラテックスミクロスフェアの透過（代理エンドポイントとしての上皮完全性の評価）を使用することを選択した。本発明者らの研究において、強制投与したミクロスフェアの透過の正規化を、７日間の処置の後に行った。

【0029】

ＩＬ−１βの上流で、Ｎｌｒｐ３は、免疫細胞および上皮細胞の両方で発現され、腸のホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすようである。Ｎｌｒｐ３−／−マウスは、ＤＳＳ、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）、もしくはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染によって誘発される実験的大腸炎により罹りやすい。以前の研究と一致して、本発明者らの結果は、Ｎｌｒｐ３もしくは他の経路のいずれかによって媒介されるカスパーゼ−１活性化誘発性ＩＥＣ押し出しが、健康上、腸のホメオスタシスに非常に重要であり得ることを示す。カスパーゼ−１活性化から生じるＩＬ−１βおよびＩＬ−１８生成は、いくつかの報告において腸の炎症に寄与することが示された。その一方で、より近年の研究から、カスパーゼ−１が大腸炎および大腸炎関連がんに対する保護を与えたことが示唆される。実験結果の矛盾は、遺伝的バックグラウンドにおける差異、使用される動物の性別、もしくは動物施設の微生物叢の変動に一部起因し得る。

【0030】

まとめると、本発明者らの研究結果は、ＩＥＣのカスパーゼ−１活性化が、粘膜への微生物侵入に都合がよいと思われる腸上皮のバリア機能不全の発生に寄与する細胞押し出しを誘発し得ることを示す。細胞押し出しのこの形態は、上皮内層に破れ目を導入すると以前に観察された脱落事象の原因となる機構であるようである。

【0031】

Ａ４．ＯＥＣおよびＢＥＣにおいて上昇したカスパーゼ−１レベルは、クローン病の診断である。
ＯＥＣのカスパーゼ−１活性化がクローン病の診断であるか否かを決定するために、本発明者らは、標準的手順を使用して、正常個体およびクローン病個体の中咽頭領域の歯科生検物を得た。生検で得られた上皮細胞を、上記のように、カスパーゼ−１マーカーを用いてインビトロで染色し、蛍光顕微鏡法によって検鏡して、カスパーゼ−１レベルを決定した。図１１における棒グラフから認められるように、クローン病患者におけるカスパーゼ（ｃａｐａｓｅ）−１レベルは、正常レベルの約２倍に上昇した。

【0032】

データは、染色したＯＥＣのインビトロ検出によってヒトにおけるカスパーゼ−１レベルをアッセイすることが、クローン病を検出する単純な方法を提供することを実証する。ＯＥＣを必要とする診断法は、ＢＥＣ（例えば、穏やかな口腔粘膜スワブによって得られる）で行われ得、他のＩＢＤおよびＩＢＳ状態にも適用可能であり、ＯＥＣもしくはＢＥＣのインビボ染色、続いて、例えば、口腔での染色した細胞の蛍光レベルを決定するためのＸ線透視ツールを使用して、インサイチュでの検出によって行われ得る。

【0033】

Ｂ．ｐＣＬＥによる細胞バリア機能不全を検出する方法
合計３５名の患者（ＩＢＳを有する１７名および１８名のコントロール）を研究に採用し、ＩＢＳを有すると考えられた１名の患者を、大腸生検での顕微鏡的大腸炎（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）の存在に起因して、さらなる分析から排除した。ベースラインの患者特徴を、表１に示す。１６名のＩＢＳ患者の平均年齢は、４２．８±１８．５歳であった。７名の女性患者および９名の男性患者がいた。コントロール患者（ｎ＝１８）は、平均年齢４７．４±１０．１歳であり、１０名の女性患者および８名の男性患者がいた。コントロールにおける結腸内視鏡検査の適応症は、結腸直腸がんスクリーニング（ｎ＝９）および直腸出血もしくは便潜血検査陽性（ｎ＝９）であった。ＩＢＳ群は、１２名の下痢型ＩＢＳ患者および４名の便秘型ＩＢＳを含んでいた。彼らの症状の他の原因の評価に関しては、本発明者らは、全ての患者に対して詳細な病歴を訊いて、ラクトース／フルクトース不耐症を排除した。１名の下痢型ＩＢＳ患者を除く他のすべての患者については、血清抗体（抗ｔＴＧもしくは抗筋内膜抗体）もしくは生検を伴うＥＧＤを行って、セリアック病を除外した。血清検査もＥＧＤも行わなかった１名の患者は、セリアック病の低リスク群にいた。２名の患者を除く他のすべての患者については、血清ＴＳＨをチェックして、彼らの症状の原因として甲状腺機能障害を排除した。通常の大腸内視鏡検査は、ＩＢＳ患者およびコントロール患者の両方における最も一般的な内視鏡検査所見であった。他の所見は、ポリープ（ｎ＝８）、憩室症（ｎ＝４）および痔（ｎ＝８）であった。全てのＩＢＳ患者およびコントロールで行った回腸末端部および結腸のランダム生検は、正常範囲内であった。計数において使用した３連続の視野でのコントロール患者およびＩＢＳ患者の代表的なｐＣＬＥ画像を、図２に示す。

【0034】

ＩＢＳ患者は、コントロールと比較して有意に高いギャップ密度を有した（図３）：コントロールについて細胞１０００個あたり６つ（０〜１３）のギャップに対して、ＩＢＳ患者のメジアンギャップ密度は、細胞１０００個あたり３２（１７〜４２）個のギャップであった（ｐ＜０．００１）。ギャップ密度値は正規分布ではなかった（ｐ＝０．００５、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定）ので、本発明者らは、メジアン回帰分析を使用して、群間の差異を定量した。ＩＢＳとコントロールとの間のギャップ密度における概算のメジアン差異は、細胞１０００個あたり２６（９５％ ＣＩ：１２，３９）個のギャップであった。年齢および性別を調整しても、メジアンギャップ密度値は、細胞１０００個あたり２５（９５％ ＣＩ：１８，３２）個のギャップという概算のメジアン差異を伴って、コントロール群と比較してＩＢＳ群で有意により高いままであった（ｐ＜０．００１）。

【0035】

本発明者らは、性別、年齢、およびＩＢＳのサブタイプに関して上皮ギャップ密度の関係性を調べた。コントロール患者では、本発明者らは、−０．４３というＳｐｅａｒｍａｎの相関係数（ρ）（ｐ＝０．０７）で上皮ギャップ密度と年齢との間の負の相関に向かう傾向に注目した。さらに、本発明者らは、男性と比較して、女性においてより高いメジアンギャップ密度に向かう傾向を見いだした（細胞１０００個あたり０個のギャップに対して１１個のギャップ，ｐ＝０．０７）。ＩＢＳ患者では、これら傾向が認められなかった。ＩＢＳのサブタイプに関しては、下痢型ＩＢＳを有する患者（ｎ＝１２）は、便秘型ＩＢＳ患者（ｎ＝４）と比較して、類似のメジアンギャップ密度を有した：それぞれ、細胞１０００個あたり３２個のギャップと３８個のギャップ。

【0036】

健康なコントロール群からのギャップ密度値の概算９０パーセンタイルは、細胞１０００個あたり３０個のギャップであった。異常なギャップ密度に関するカットオフとして細胞１０００個あたり３０個のギャップを使用すると、ＩＢＳのギャップ密度の診断感度は６２％であり、特異度は８９％である（陽性的中率８３％および陰性的中率７３％）。ＩＢＳに関するギャップ密度の診断精度を表２に示す。

【0037】

この研究では、本発明者らは、ＩＢＳ患者が、ｐＣＬＥによって測定した場合に、健康なコントロールと比較して、回腸末端部における上皮ギャップの有意により高い密度を有することを見いだした。この知見は、ＩＢＳ患者の腸において上昇した上皮ギャップ（小腸において増大した上皮細胞押し出しの代理マーカー）が、ＩＢＳにおいて以前報告されたバリア機能不全および低グレードの粘膜炎症に寄与し得ることを示唆する。本発明者らの結果は少数の患者に基づいているものの、それは、疾患の病因への潜在的な機械論的見識を提供する。

【0038】

ＩＢＳにおいて増大した腸透過性が上皮のタイトジャンクションの変化およびサイトカインプロフィールの変化と関連するという証拠は増えつつある。タイトジャンクションタンパク質（クローディン−１およびオクルディンを含む）の変化した発現および細胞分布が、ＩＢＳ患者で報告された。サイトカインプロフィールの変化は、ＩＢＳ患者において増強した腸透過性という概念をさらに裏付ける。本発明者らの研究の知見は、増大した上皮細胞押し出しがＩＢＳ患者において認められるバリア機能不全および粘膜炎症に関する潜在的機構であり得ることを示す。

【0039】

本発明者らの二次的な分析では、本発明者らは、女性のコントロール患者が男性より高いギャップ密度に向かう傾向を有することを見出した。この知見は、女性におけるＩＢＳのより高い有病率のあり得る説明を提供し得る。ベースラインでのより高い上皮ギャップがあることから、女性は、疾患をより発症しやすい。さらに、本発明者らは、健康なコントロールにおいて、ギャップ密度と年齢との負の相関という傾向を観察した。これは、これまで報告されていない。これらの知見は、より大規模な研究においてさらに調査されるべきである。本発明者らは、下痢型ＩＢＳと便秘型ＩＢＳとの間の上皮ギャップ密度における差異を観察しなかった。しかし、この研究に含めたのは、便秘型ＩＢＳを有するわずか４名の患者であった。下痢型ＩＢＳ患者の腸透過性の有意な変化は以前に報告されており、便秘型ＩＢＳ患者では報告されていない。

【0040】

これまでに、ＩＢＳを健康な患者から鑑別し得る具体的な内視鏡検査による所見はない。現在、ＩＢＳ患者のうちの最大で５０％までが彼らの評価の間に結腸内視鏡検査を受けているが、米国でＩＢＳ関連症状のために行われたのは、結腸内視鏡検査のうちの２５％である。大部分の結腸内視鏡検査は、他の下痢の原因（例えば、顕微鏡的大腸炎）を除外するために行われる。本発明者らの研究では、ＩＢＳ患者および健康なコントロール患者の小腸における上皮ギャップを位置決めおよび定量するために慣用的な結腸内視鏡検査の間にｐＣＬＥを使用して、本発明者らは、ＩＢＳ患者が上皮ギャップの有意により高い密度を有することを実証できた。小腸において増大した上皮ギャップの本発明者らの知見は、ＩＢＳの病因の可能性のある機構のみならず、上記疾患の診断の考えられる内視鏡検査による基準をも提供する。この研究において、上昇したギャップ密度は、ＩＢＳの診断に関して感度６２％および特異度８９％を有した。ＩＢＳ病因の本発明者らの理解が進んだので、ｐＣＬＥは、この複雑な疾患グループをさらに定義し得る別の診断試験であり得る。ギャップ密度は、本発明者らの現在の研究においてコントロールと比較するとＩＢＳ患者において有意により高いが、ギャップ密度の増大は、本発明者らの以前の報告でのＩＢＤ患者と比較すると遙かにより低い。コントロール患者、ＩＢＳ患者およびＩＢＤ患者におけるギャップ密度の比較は、補足図１に示される。

【0041】

本発明者らの研究には多くの制限がある。これは、共焦点レーザー内視鏡検査および上皮ギャップの定量の専門技術を有するたった１箇所の三次医療機関での３４名の患者という小規模研究である。本発明者らの研究におけるＩＢＳ患者は、不均一な患者群を示す。本発明者らは、研究の被験体を下痢型ＩＢＳ患者にも便秘型ＩＢＳ患者にも限定しなかった。研究の目的は、ＩＢＳ患者とコントロール患者との間のギャップ密度における任意の差異を同定することであった。ｐＣＬＥ画像を使用した上皮ギャップおよび細胞の定量には誤差があった可能性がある。しかし、評価者は手順の表示については盲検であったので、これら誤差は、ＩＢＳ患者とコントロール患者との間で等しく分布したはずである。本発明者らの現在の研究の予備的な知見を確認するためには、さらに大きな多施設研究が必要とされる。この研究では、本発明者らは、上皮ギャップ密度を定量するために小腸をｐＣＬＥで画像化したのみであった。本発明者らは、齧歯類モデルを使用して、回腸末端部の上皮ギャップ密度の観察者間変動性および観察者内変動性を特徴付ける確証研究を以前に行った。本発明者らは、結腸のＣＬＥ画像化のこのような確証研究を認識していない。

【0042】

結論として、本発明者らは、回腸末端部の上皮ギャップ密度が、結腸内視鏡検査の間にｐＣＬＥによって決定した場合に、健康なコントロールよりＩＢＳ患者において有意により高いことを示した。この知見は、上皮ギャップ密度によって測定した場合に増大した上皮細胞押し出しが、ＩＢＳ患者において認められる変化した腸透過性の考えられる機構を表し得ることを示唆する。

【0043】

Ｃ１．実験：カスパーゼ−１の方法
マウス
少なくとも１０世代にわたって本発明者らの動物施設で交配した、２４〜２８週齢の間のＩＬ−１０ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍａｉｎｅ）およびバックグラウンド１２９／ＳｖＥｖマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ Ｉｎｃ． Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｉｔｙ， Ｉｎｄｉａｎａ）を、全ての実験に使用した。マウスを従来の明暗サイクルの飼育施設の中で飼育した。動物プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌｂｅｒｔａのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって承認された。

【0044】

患者サンプル
研究プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａのｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって検討および承認され、その研究は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．Ｇｏｖ（ＮＣＴ００９８８２７３）で登録された。結腸内視鏡検査を受ける患者は、上記研究に参加する書面によるインフォームドコンセントを提供した。結腸内視鏡検査を受けるＩＢＤ患者（Ｎ＝１１、６人のクローン病患者、５人の潰瘍性大腸炎患者）および無症候性コントロール患者（Ｎ＝８）において、正常に見える回腸末端部からの管腔吸引物を、以前に記載された方法^７を使用して０．９％ ＮａＣｌ溶液で腸表面を穏やかに洗浄した後に集め、直ぐに（＜１５分）分析した。細胞学的ブロックを、食塩水洗浄後に集めた２５ｍＬの管腔吸引物から調製し、上皮細胞もしくは免疫細胞の形態同定のために、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。ＦＬＩＣＡ染色のために、吸引液のうちの５ｍＬに由来する細胞を、５．０μＭ 孔サイズを有する２５ｍｍポリカーボネートＭｅｍｂｒａ−ｆｉｌ Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（Ｗｈａｔｍａｎ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上に、真空濾過を使用して固定化し、０．５％（ｗ／ｖ） ＢＳＡを含むさらに２０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）の濾過によって洗浄した。蛍光活性な部位特異的不可逆的インヒビター特異的活性化カスパーゼ−１およびカスパーゼ−３＆７（カルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡアポトーシス検出キット；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ， Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＮ）を使用して、Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜上で吸引した細胞を直接染色した。固定化した吸引細胞を有する膜を、半分にカットし、ＦＡＭ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（ＦＬＩＣＡ−１）染料の１：７００希釈物で染色して、活性化カスパーゼ−１を検出するか、またはＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（ＦＬＩＣＡ ３＆７）染料の１：７００希釈物で染色して、活性化カスパーゼ−３＆７を検出した。正常に見える回腸末端部に由来する４つの粘膜生検サンプルを、分析のために得（コントロール Ｎ＝３， ＩＢＤ Ｎ＝３）、２つの生検サンプルを、液体窒素の中に入れ、サイトカインアッセイに使用するまで−８０℃で貯蔵した。２つの生検サンプルを、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ， Ｔｏｒｒｅｎｃｅ， ＣＡ）の中に包埋し、液体窒素の中に入れ、切片を調製するまで−８０℃で貯蔵した。

【0045】

試薬
ニゲリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ， ＮＹ）、種々の直径（０．５〜６μｍ）のＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ^ＴＭ Ｙｅｌｌｏｗ Ｇｒｅｅｎ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ）を購入した。ＩＶ型ピリ線毛を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｋ株から以前に記載された方法で調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度、アシアロ−ＧＭ１に結合するがＧＭ１には結合しない能力、およびステンレス鋼に結合する能力に関して特徴付けした。上記ピリ線毛調製物は、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出可能でなかった少量のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ血清型０５ ＬＰＳを含んだ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７は、Ｄｒ． Ｍ． Ｇａｎｔｚｌｅの厚意であったプラスミドｐＱＢＩ−６３上に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９誘導体であった。

【0046】

細胞培養およびインビトロ透過性の測定
Ｔ８４ヒト結腸がん上皮細胞を、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２、１０％ （ｖ／ｖ） 熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％（ｗ／ｖ） ペニシリン−ストレプトマイシン中で、組織培養プレート（１０ｃｍ）で維持した。その細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌｓ（２×１０^５ 細胞／ウェル、６．５ｍｍ直径； ０．４μｍ孔サイズ； Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ， ＭＡ）にプレートし、研究のために頂端細胞接着複合体（ａｐｉｃａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）（経上皮抵抗＞２，０００Ω・ｃｍ^２によって示される場合）の発生まで増殖させた。カスパーゼ−１阻害実験に関しては、ニゲリシン処理前に、組織培養培地を除去し、５０□Ｍ カスパーゼ−１インヒビター（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ）を含む新たな培地を導入した。ニゲリシン（１０、２５、５０□Ｍ）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの頂端側および基底側の両方に添加した。経上皮抵抗（ＴＥＲ）を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ Ｖｏｌｔｍｅｔｅｒおよび箸型電極（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を使用して、ニゲリシン処理の前および処理３時間後に測定した。ミクロスフェアおよびＥ．ｃｏｌｉ実験のために、ニゲリシンとともに一晩インキュベートした後、１０^７／ｍｌの１μｍ ミクロスフェアもしくは１０^９／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＭＷ２．４９７を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの頂端側に添加した。ミクロスフェアもしくはＥ．ｃｏｌｉとともにインキュベートして１時間後、細胞を冷メタノール中で５分間固定した。次いで、細胞を０．２％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過性にし、０．２％ （ｖ／ｖ） ヤギ血清および１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１時間ブロックした。

【0047】

タンパク質抽出
ヒト生検サンプルおよび齧歯類回腸組織を、溶解緩衝液（０．０１Ｍ ＰＢＳ、０．５％ （ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＨａｌｔプロテアーゼインヒビター（ジメチルスルホキシドおよび４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を含む））中、氷の上でタンパク質抽出のためにホモジナイズした。タンパク質含有上清を、１３，０００ｇで３０分間、４℃での遠心分離によって分離し、分析まで−７０℃で貯蔵した。

【0048】

サイトカイン発現アッセイ
ヒトサンプル由来の活性ＩＬ−１βの濃度を、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１β Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で測定した。マウス腸組織における活性ＩＬ−１β発現を、Ｍｏｕｓｅ ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ７−Ｐｌｅｘ Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で測定した。得られたサイトカインを、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）によって決定される場合の各個々のサンプルの総タンパク質含有量に対して正規化した。

【0049】

ウェスタンブロット分析
ヒト生検組織、マウス回腸粘膜をこすり取ったものおよびＴ８４細胞を、プロテアーゼインヒビターを含むＭ−ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）中に溶解した。総細胞溶解物（サンプルに対して正規化した５０μｇ タンパク質）を、１５％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに載せ、その後、ニトロセルロース膜へのタンパク質の電気泳動転写を行った。膜をＯＤＹＳＳＥＹブロッキング緩衝液（Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ， ＯＨ）で１時間、室温（ＲＴ）においてブロックし、ローディングコントロールとして働くβ−アクチン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ）とともに、４℃において一晩、ＩＬ−１β抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ）もしくはカスパーゼ−１抗体（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）でプローブした。洗浄後、膜を蛍光二次抗体とともに１時間ＲＴにおいてインキュベートし、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ^＊（Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ， ＯＨ）によって分析した。

【0050】

細胞培養物および腸サンプルの免疫蛍光分析
カスパーゼ−１活性化および透過性実験からの細胞培養サンプルを、冷メタノール中で５分間固定し、ウサギ抗ＺＯ−１一次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）とともに一晩、４℃においてインキュベートした。洗浄後、細胞を、カスパーゼ−１活性化に関するＦＬＩＣＡ−１染料もしくはヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘ５４６抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）いずれかの１：１５０希釈物とともにインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。次いで、単層を支持している膜を切り出し、スライドガラス（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ， ＣＡ）に載せた。凍結ヒト生検サンプルを、５μｍの切片にし、風乾し、アセトン固定し、その後、活性化カスパーゼ１に関してはＦＬＩＣＡ−１の１：５０希釈物で、および活性化カスパーゼ−３＆７に関してはＦＬＩＣＡ ３＆７（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ， Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＮ）の１：５０希釈物で染色した。次いで、切片を４％ パラホルムアルデヒドで１５分間、ＲＴにおいて後固定し、Ｆ−アクチンに関してはローダミン−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）で、および核に関してはＤＡＰＩで染色した。

【0051】

齧歯類腸凍結組織ブロックを、クリオスタットを使用して５μｍの切片にし、ＲＴにおいて３０分間静置し、ＰＢＳ中にあらたに調製した４％ パラホルムアルデヒドの中で３０分間固定した。そのスライドをＰＢＳで１０分洗浄し、ＰＢＳ中の２％ ヤギ血清および１％ ＢＳＡで１時間ＲＴにおいてブロックし、ＰＢＳ中２％ ヤギ血清および１％ ＢＳＡの中の０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で３０分間透過性にした。スライドを、ＰＢＳ中１：４０希釈したＡｌｅｘａ５６８結合ファロイジンとともに１時間インキュベートすることによって染色し、過剰な蛍光色素を５０ｍｌ ＰＢＳでの３×１５分のすすぎによって除去し、ＤＡＰＩで対比染色した。そのスライドを、封入剤としてＦｌｕｏｒＳａｖｅ試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して検鏡用に固定した。

【0052】

増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色
マウス回腸末端部組織を、以前に公開された方法を使用して、ウサギ抗ＰＣＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）で染色した。ＰＣＮＡに関する染色後に、その切片をＤＡＰＩで染色し、Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）で画像化した。ＰＣＮＡ陽性細胞を、最低限でも動物１匹あたり５つのピリ絨毛において２名の盲検状態の評価者に計数させた。

【0053】

インビボ透過性アッセイ
インビボ透過性を、ＦＩＴＣ−デキストランの透過、蛍光ミクロスフェアおよび細菌移動研究で評価した。デキストラン研究のために、自由に水を利用させて一晩絶食させた後、マウスに０．６μｇ／ｋｇ ＦＩＴＣ−デキストラン（ＦＤ−４， ４ｋＤ； Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を強制投与した。心臓穿刺後４時間で血液サンプルを集め、血清を１，９５７×ｇで４℃において２０分間遠心分離にかけた。上清の蛍光発光を、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｍｏｄｅ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）で４８８ｎｍレーザーを使用して測定した。

【0054】

ミクロスフェア研究のために、マウスに、２００μｌ 溶液中に０．５μｍ、１．０μｍ、２．０μｍ、３．０μｍ、および６．０μｍの直径を有する１０^７ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ＹＧミクロスフェアを含む混合物を、一晩の絶食後に以前に記載されるように強制投与した。上記ビーズの投与後４時間で血液サンプルを集めた。次いで、予めヘパリン処理したチューブの中で全血混合物を１，２５０×ｇで１０分間、ＲＴにおいて遠心分離にかけ、そのサンプルの血漿部分を取り出し、フローサイトメトリー分析の前に、１，２５０×ｇで５分間遠心分離にかけた。上記サンプルの残ったバフィーコートおよびヘマトクリットを、５ｍＬの溶解緩衝液（４．１５ｇ ＮＨ_４Ｃｌ、０．８４ｇ ＮａＨＣＯ_３、１ｍｌ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、および５００ｍＬのｄｄＨ_２Ｏ）でＲＴにおいて溶解し、混合し、１，２５０×ｇで５分間、４℃において３回遠心分離にかけた。上清を廃棄した。ＷＢＣペレットを、ウシ胎仔アルブミンを含む０．０３％ ＰＢＳの４００μｌ中で、再懸濁した。血漿サンプルおよびＷＢＣペレットサンプルを、ミクロスフェア数を決定するためにフローサイトメトリーで分析した。

【0055】

細菌移動研究のために、マウスに、０．１７ｍＬのＬＢブロス中に懸濁した１×１０^１０ ＣＦＵのＧＦＰ標識Ｅ．ｃｏｌｉを強制投与した。２０時間後、脾臓および肝臓のサンプルを、無菌手術条件下で集めた。器官を、予め秤量したＬＢブロス入りチューブ中で懸濁し、無菌ＲＮＡａｓｅ非含有プラスチック乳棒で５〜１０分間ホモジナイズした。そのホモジネートを遠心分離にかけ、その上清を種々の希釈度で培養のために４枚のプレートにプレートした。

【0056】

共焦点レーザー内視鏡検査および共焦点顕微鏡検査
マウス回腸の共焦点レーザー内視鏡検査および上皮ギャップ密度の決定のためのホールマウントマウス腸組織の共焦点顕微鏡検査を、以前に記載された方法を使用して行った。細胞培養、ヒトおよびマウスの腸スライドを、スピニングディスク型共焦点顕微鏡（Ｑｕｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， Ｇｕｅｌｐｈ， ＯＮ）を使用して、以前に記載された方法を使用して画像化した。

【0057】

電子顕微鏡検査
コントロールおよびニゲリシン処理したＴ８４細胞を、０．１Ｍ カコジル酸−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で一晩４℃において緩衝化した２％（ｖ／ｖ） グルタルアルデヒドを用いて固定化した。固定の後、それらをカコジル酸緩衝液中で洗浄し、１％（ｗ／ｖ） 四酸化オスミウム中で２時間後固定し、次いで、カコジル酸緩衝液で再洗浄した。段階的な一連のエタノール濃度で脱水した後、標本をプロピレンオキシドのいくつかの洗浄液中に入れ、その後、エポキシ樹脂（ＥＰＯＮ １２）に包埋した。超薄切片を、酢酸ウラシルおよびクエン酸鉛でコントラストを上げ、加速電圧６０ｋＶでＨｉｔａｓｈｉ ７６５０透過型電子顕微鏡で検鏡した。視野を記録し、１０００〜４８００の最終倍率でプリントし、カーボン格子レプリカの助けを借りて較正した。

【0058】

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） Ｐｒｉｓｍ ４によって計算したＷｉｌｃｏｘｏｎランクサム検定を使用して、サンプルを比較した。０．０５未満の両側Ｐ値を、有意とみなした。多重比較のためにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整を行った。

【0059】

Ｃ２．実験：ＩＥＣギャップ法
方法
これは、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．Ｇｏｖ （ＮＣＴ００９８８２７３）で登録された前向きコホート研究であった。研究プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌｂｅｒｔａのＨｕｍａｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって検討および承認された。研究群は、Ｒｏｍｅ ＩＩＩ基準に基づいて、ＩＢＳと一致する症状を有する患者からなった。コントロール群は、他の適応症について結腸内視鏡検査を受けており、ＩＢＳの症状、最も一般的には、結腸直腸がんスクリーニングおよび便潜血検査陽性を有しない患者からなった。研究の包含基準は、以下であった：１８歳齢より上で書面によるインフォームドコンセントを与える能力がある患者。排除基準は、以下を含んだ：フルオレセインもしくは貝類に対するアレルギーのあることが既知、腎臓機能が損なわれている（血清クレアチニンが１．５ｍｇ／ｄＬを超える）、および妊娠もしくは授乳している患者。全ての患者は、研究参加への書面によるインフォームドコンセントを与えた。患者の人口統計学、病歴、身体検査所見、および内視鏡検査所見を、前向きデータベースに記録した。

【0060】

本発明者らは、全ての患者において、回腸末端部の挿管によって標準結腸内視鏡検査を行った。患者に標準心肺機能モニタリングを行い、ミダゾラムおよびフェンタニルでの静脈内鎮静を与えた。蠕動および移動人工産物（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を低減するために必要な場合、鎮痙剤（グルカゴン）を使用した。回腸末端部の挿管後に、５ｍＬの１０％ フルオレセイン溶液を静脈内投与した。回腸末端部の共焦点画像を、以前に報告されたプロトコルに従って、超高分解能（ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ−ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）プローブベースの共焦点レーザー内視鏡検査（ｐＣＬＥ）プローブ（ＵＨＤ Ｃｏｌｏｆｌｅｘ， Ｍａｕｎａ Ｋｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）で得た。回盲弁に対して近位約１０ｃｍにある回腸末端部のコマ毎の共焦点画像を集め、分析のためにデジタル保存した。回腸末端部において最低５つの異なる部位を、ｐＣＬＥを使用して画像化した。ｐＣＬＥ画像化は通常、回盲弁から１０ｃｍ近位側で始められ、その後、画像化の開始部位に対して５〜１０ｃｍの間で近位にある腸表面から、５から１０部位のサンプリングを行った。ｐＣＬＥビデオ画像の連続記録を、全ての患者で約１０分間行い、患者１名あたり４０００枚超の画像を記録した。ｐＣＬＥを行う内視鏡検査医は、患者の状態について盲検状態でなかったが、ｐＣＬＥ画像の評価者は、患者の状態および結腸内視鏡検査の適応症について盲検状態であり、バイアスを最小限にした。

【0061】

ｐＣＬＥ画像の検討および分析を、以前に記載されたように事後様式で行った。適切に画像化された絨毛は、ｐＣＬＥ画像で可視化された７５％ 表面積を覆う絨毛として定義され、最低でも、見られる絨毛の３連続視野を、上皮細胞およびギャップの分析に選択した。これら絨毛画像のうち、 任意の個々の患者で見られる（範囲：患者１名あたり３〜１０の絨毛）ギャップの最高頻度を有した絨毛における上皮細胞およびギャップを計数した。計数した絨毛の代表画像を図１に示す。上皮細胞およびギャップを、絨毛で手動で計数し、任意の個々の患者に関する上皮ギャップの最高頻度を使用して、ギャップ密度を決定した（範囲：患者１名あたり３〜１０の絨毛を評価）。ギャップ密度を、適切に画像化した絨毛で計数した上皮細胞１０００個あたりの上皮ギャップの数として計算した。

【0062】

初期研究エンドポイントは、ＩＢＳ患者およびコントロール患者においてｐＣＬＥによって決定される場合の上皮ギャップ密度のコホート比較であった。本発明者らはまた、上皮ギャップ密度と、性別、年齢およびＩＢＳのサブタイプ（ＩＢＳ−下痢型 対 ＩＢＳ−便秘型）との間の関連性を調べるために探査分析を行った。

【0063】

統計分析
サンプルサイズ計算：
サンプルサイズ計算を、本発明者らの以前の研究^２４からの無症候性患者およびＩＢＳ患者の上皮ギャップ密度データに基づいて行った。１０ギャップ／１０００細胞という平均ギャップ密度の差異および１０ギャップ／１０００細胞という標準偏差を想定すると、合計３２名の患者（１群あたり１６名）が、タイプＩ誤差（α）０．０５で８０％ 検出力を達成するために必要とされる。ノンパラメトリック法が使用されると予測されたので、患者登録を、合計３５名の患者に対して約１０％増やした。

【0064】

研究の初期エンドポイントは、上皮ギャップ密度であり、コントロール患者とＩＢＳ患者との間の比較は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎランクサム検定を使用して行った。正規分布した連続変数を、平均±標準偏差として表した一方で、正規分布しなかった連続変数を、メジアン（四分位数範囲）として表した。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定を使用して、上皮ギャップ密度の分布の正規性を評価した。さらなる分析に、ノンパラメトリック法（Ｗｉｌｃｏｘｏｎランクサム検定、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関、およびメジアン回帰を含む）を使用した。初期分析のために、０．０５未満の両側Ｐ値を有意とみなした。全ての分析を、ＳＴＡＴＡデータ分析および統計ソフトウェア（ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ， Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｔｅｘａｓ）を使用して行った。

【0065】

本発明は、具体的な局面、実施形態、および適用に関して記載されてきたが、特許請求されるとおりの本発明から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得ることは、認識される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]