特許 6204130 ペプチド、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、白血病ワクチン、及び白血病受動免疫療法剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6204130

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】ペプチド、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、白血病ワクチン、及び白血病受動免疫療法剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20170914BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20170914BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170914BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20170914BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170914BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C12N5/0784

   C12N5/0783

   C12N15/00 A

   A61K39/00 H

   A61P35/02

   A61K39/39

【請求項の数】7

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-194119(P2013-194119)

(22)【出願日】2013年9月19日

(65)【公開番号】特開2015-71543(P2015-71543A)

(43)【公開日】2015年4月16日

【審査請求日】2016年8月9日

(31)【優先権主張番号】特願2013-185727(P2013-185727)

(32)【優先日】2013年9月6日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】松下 麻衣子

(72)【発明者】

【氏名】河上 裕

(72)【発明者】

【氏名】服部 豊

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 大塚洋平 他，新規がん抗原PEPP2を用いたペプチドワクチン療法の開発，日本薬学会第133年会，2013年3月，30pmC-383

【文献】 NCBI, RHXF2_HUMAN, ACCESSION No.Q9BQY4, 24-JUL-2013，[retrieved on 2017.06.21]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/37537987?sat=17&satkey=37414760

【文献】 Oncology Report, 2011, vol.25, p.469-476

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１の２番目アミノ酸がＹ、Ｗ、Ｍのいずれかに置換され且つ／又は９番目のアミノ酸がＦ、Ｌ、Ｗのいずれかに置換されたアミノ酸配列、からなる単離されたペプチド。

【請求項2】

請求項１記載のペプチドでパルスされた樹状細胞。

【請求項3】

請求項１記載のペプチド又は請求項２記載の樹状細胞を有効成分として含む白血病ワクチン。

【請求項4】

請求項１記載のペプチド又は請求項２記載の樹状細胞に反応する、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。

【請求項5】

請求項４記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含む白血病受動免疫療法剤。

【請求項6】

脱ＤＮＡメチル化剤と併用される、請求項３記載の白血病ワクチン又は請求項５記載の白血病受動免疫療法剤。

【請求項7】

放射線療法又は化学療法後の白血病患者に投与される、請求項３記載の白血病ワクチン又は請求項５記載の白血病受動免疫療法剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチド、樹状細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、白血病ワクチン、及び白血病受動免疫療法剤に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、がん治療においては分子標的薬を含む薬物療法や、手術療法・放射線治療により予後の改善がなされているが、これらの治療をもってしても再発を来し死に至る症例が存在する。そこで、正常組織には発現していないが癌細胞に高発現している分子を標的として免疫細胞により癌細胞を排除するという免疫療法が、既存の治療法にならぶ第４の治療法として注目を浴びている。

【0003】

免疫療法の標的として、これまでに多くのヒトがん抗原が発見されてきたが、その中にがん精巣抗原（Ｃａｎｃｅｒ ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ）がある。がん精巣抗原とは、がん細胞と正常組織においては精巣にのみ発現している抗原群であり、ＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）や、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ−１）などが知られている（非特許文献１，２）。精巣では抗原をＴ細胞に提示するＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）が存在していないため、Ｔ細胞が精巣細胞を攻撃することはない。一方でがん細胞、がん組織においては、産生されたがん抗原蛋白質が、細胞質中でプロテアソームにより分解され、９〜１０ｍｅｒのアミノ酸からなるペプチド断片として、ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ分子とともに細胞表面に提示される。それらをＴ細胞が認識し、がん細胞を殺傷する免疫反応が起こる。

【0004】

これにより、がん精巣抗原は、がん細胞特異的な免疫反応を引き起こすことができる。このようにがん精巣抗原を用いてＣＴＬを誘導する治療法は、がん細胞特異的という点から、副作用の少ない理想的な治療法であると考えられており、皮膚悪性黒色腫や非小細胞肺がんなど固形癌患者を対象にした臨床試験が行われている（非特許文献３，４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９１；２５４：１６４３−１６４７．

【非特許文献2】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９７； ９４：１９１４−１９１８．

【非特許文献3】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９７； ９７：１２１９８−２０３

【非特許文献4】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． ２００９； １０： ３７１−７４．

【非特許文献5】Ｇｅｎｅ． ２００２； ３０１：１−１１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

がん精巣抗原を用いた免疫療法は、白血病を初めとする造血器腫瘍においても有効であると考えられている。しかしながら、白血病細胞に発現する癌精巣抗原は、その一部に限られており、このことが、がん精巣抗原を用いた免疫療法の白血病治療への適用の広がりの制約になっている。

【0007】

ところで、ＰＥＰＰ２遺伝子は、２００２年にＷａｙｎｅらにより、マウスのホメオボックス遺伝子であるＰｅｍ遺伝子のホモログとして報告され、Ｘ染色体上に存在する（非特許文献５）。ＰＥＰＰ２は転写因子と推察されるものの、ヒトでの機能の詳細は不明である。また、ＰＥＰＰ２は、正常細胞においては精巣に発現し、また前立腺癌細胞株などにおいても発現していることも報告されている（非特許文献５）。

【0008】

しかし、これらは癌細胞株を用いた検討に基づく報告であって、白血病など癌患者の検体でＰＥＰＰ２が高発現しているという報告は、ない。また、ＰＥＰＰ２タンパク質において、Ｔ細胞に認識されるエピトープも、全く見つかっていない。

【0009】

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、免疫療法の白血病治療への適用に寄与し得る新規な手段及びそのスクリーニング方法の提供を第１の目的とする。また、本発明の第２の目的は、被験者の白血病の病勢を試験する簡便な方法の提供である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、ＰＥＰＰ２が白血病など癌患者の検体で選択的に高発現し、また、ＨＬＡに結合して細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるエピトープを有することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下を提供する。

【0011】

（１） （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１の２番目アミノ酸がＹ、Ｗ、Ｍのいずれかに置換され且つ／又は９番目のアミノ酸がＦ、Ｌ、Ｗのいずれかに置換されたアミノ酸配列、からなる単離されたペプチド。

【0012】

（２） （ｉ）（１）記載のペプチド、又は（ｉｉ）配列番号２と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、でパルスされた樹状細胞。

【0013】

（３） （１）記載のペプチド又は（２）記載の樹状細胞を有効成分として含む白血病ワクチン。

【0014】

（４） （１）記載のペプチド又は（２）記載の樹状細胞に反応する、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。

【0015】

（５） （４）記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含む白血病受動免疫療法剤。

【0016】

（６） 脱ＤＮＡメチル化剤と併用される、（３）記載の白血病ワクチン又は請求項５記載の白血病受動免疫療法剤。

【0017】

（７） 放射線療法又は化学療法後の白血病患者に投与される、（３）記載の白血病ワクチン又は（５）記載の白血病受動免疫療法剤。

【0018】

（８） 配列番号２と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から、ＨＬＡとの結合性に基づき、ＨＬＡに対するエピトープ配列を選抜する工程を有する、前記エピトープ配列からなる白血病治療のための候補物質のスクリーニング方法。

【0019】

（９） 被験者から採取した血液における、配列番号２と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質の含有量、又は前記アミノ酸配列をコードする核酸の含有量を測定し、その測定値を、白血病の罹患が疑われる基準としての前記タンパク質又は前記核酸の量と比較することで、前記被験者の白血病の病勢を試験する方法。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、免疫療法の白血病治療への適用に寄与し得る新規な手段及びそのスクリーニング方法が提供される。また、本発明によれば、被験者の白血病の病勢を試験する簡便な方法も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】正常な各組織及び各種がん細胞株におけるＰＥＰＰ２の発現を示す図である。

【図2】正常な各組織、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）細胞および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞におけるＰＥＰＰ２の発現を示す図である。

【図3】健常人血液細胞、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）患者および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者骨髄におけるＰＥＰＰ２の発現を示す図である。

【図4】白血病幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−分画）とそれ以外の細胞（ＣＤ３４−分画）におけるＰＥＰＰ２の発現を示す図である。

【図5】脱ＤＮＡメチル化剤を併用したときの白血病細胞におけるＰＥＰＰ２の発現変化を示す図である。

【図6】脱ＤＮＡメチル化剤を併用したときの正常細胞におけるＰＥＰＰ２の発現変化を示す図である。

【図7】ＰＥＰＰ２の各ペプチド断片のＨＬＡ−Ａ２４：０２との結合性を示す図である。

【図8】図７で選抜された候補物質による細胞傷害活性の誘発効果を示す図である。

【図9】図８で選抜された候補物質による細胞傷害活性の誘発効果を示す図である。

【図10】図８で選抜された候補物質の使用量に伴う細胞傷害活性の誘発効果の変化を示す図である。

【図11】図８で選抜された候補物質の細胞傷害活性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明の実施形態を説明するが、これが本発明を限定するものではない。

【0023】

本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１の２番目アミノ酸がＹ、Ｗ、Ｍのいずれかに置換され且つ／又は９番目のアミノ酸がＦ、Ｌ、Ｗのいずれかに置換されたアミノ酸配列、からなる単離されたペプチドを包含する。

【0024】

後述のとおり、ＰＥＰＰ２は、正常組織では精巣（ＨＬＡを有しないので、免疫細胞の攻撃を受けない）で選択的に高発現される一方、白血病細胞株でも高発現することが分かった。しかも、ＰＥＰＰ２は白血病幹細胞でも高発現することが分かり、白血病の再発防止の観点でも、好ましい標的であることが期待される。

【0025】

配列番号１は、このようなＰＥＰＰ２のヒトタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）中の９アミノ酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドは、後述のとおり、ＨＬＡ−Ａ２４：０２に結合し、細胞傷害性Ｔ細胞の標的になるエピトープであることが確認されている。そして、エピトープにおける２番目アミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はメチオニン、９番目アミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン又はトリプトファンであることが、ＨＬＡ−Ａ２４との結合に重要であることは、一般的に知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９５， １５５： ４３０７−４３１２．）。このため、上記各ペプチドは、いずれも、ＨＬＡ−Ａ２４：０２に結合し、細胞傷害性Ｔ細胞の標的になり得るものである。

【0026】

かかるペプチドは、必要に応じて適宜修飾を含んでもよい。また、ペプチドは、従来のペプチド合成方法に従い、製造されてよい。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードする核酸を調製し、組換えDNA技術を用いて調製することも可能である。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置）による合成も可能である。

【0027】

かかるペプチドは、それ自体が白血病ワクチンの有効成分として用いられ、あるいは、樹状細胞のパルスに用いることもできる。

【0028】

従って、本発明は、上記いずれかのペプチドを有効成分として含む白血病ワクチンも包含する。白血病ワクチンは、経口又は非経口で投与され、その剤型に応じて、上記ペプチドの他、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等、適宜の任意成分を含んでもよい。また、ワクチンの調製方法は、常法に従えばよい。

【0029】

本発明は、上記のペプチド、又は配列番号２と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、でパルスされた樹状細胞も包含する。このような樹状細胞は、患者体内のＨＬＡ−Ａ２４：０２及び配列番号１のペプチド（エピトープ）の複合体に対し反応するＴ細胞を産生するため、白血病細胞を攻撃することができる。

【0030】

パルスされた樹状細胞の調製は、常法に従えばよい。また、パルスされた樹状細胞は、白血病ワクチンの有効成分として使用される。

【0031】

従って、本発明は、上記のパルスされた樹状細胞を有効成分として含む白血病ワクチンも包含する。白血病ワクチンは、上記樹状細胞の他、適宜の任意成分を含んでもよい。

【0032】

また、本発明は、上記のペプチド又は樹状細胞に反応する、単離された細胞傷害性Ｔ細胞も包含する。このような細胞傷害性Ｔ細胞は、患者体内のＨＬＡ−Ａ２４：０２及び配列番号１のペプチド（エピトープ）の複合体に対し結合し得るため、白血病細胞を攻撃することができる。

【0033】

細胞傷害性Ｔ細胞の調製方法は、常法に従えばよく、例えば、上記のペプチド又は樹状細胞により末梢血リンパ球を刺激して得てもよく、患者体内のＨＬＡ−Ａ２４：０２及び配列番号１のペプチド（エピトープ）に結合するＴ細胞受容体を遺伝子導入することで得てもよい。

【0034】

細胞傷害性Ｔ細胞は、白血病受動免疫療法剤の有効成分として使用される。

【0035】

従って、本発明は、上記の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含む白血病受動免疫療法剤も包含する。白血病受動免疫療法剤は、経口又は非経口で投与され、その剤型に応じて、上記細胞傷害性Ｔ細胞の他、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等、適宜の任意成分を含んでもよい。

【0036】

上記の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は、広く種々の白血病の治療又は予防に使用することができる。中でも、ＰＥＰＰ２の発現率が高く、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤による治療効果が高確率で期待できる点で、急性骨髄性白血病（特に、急性前骨髄球性白血病）、慢性骨髄性白血病の治療又は予防に好適に使用される。

【0037】

白血病細胞は、ＰＥＰＰ２を基本的に高発現するものであるが、ある確率で、発現が弱い又は発現していない場合がある。そこで、より多くの白血病細胞を標的とする観点で、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は、脱ＤＮＡメチル化剤と併用することが好ましい。後述のとおり、ＰＥＰＰ２の発現が、脱ＤＮＡメチル化剤を与えられた白血病細胞では亢進する一方、通常細胞では亢進しないことを本発明者らが発見した。このような脱ＤＮＡメチル化剤としては、特に限定されないが、５−アザ−２’−デオキシシチジンが挙げられる。

【0038】

なお、本明細書における併用とは、治療手段として組み合わせて使用されることを指し、同時に投与されること、同経路で投与されることに限定されない。

【0039】

また、ＰＥＰＰ２が白血病幹細胞において特に強い発現を示す場合があることから、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は、がん幹細胞特異的抗原を標的とした免疫療法に使用することができる。がん幹細胞は、微小残存病変からの白血病の再発原因、転移先での新たな腫瘍形成の原因であり、このような問題を本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は解決することができる。

【0040】

また、化学療法や放射線療法はがん幹細胞から発生した細胞を攻撃できる一方、がん幹細胞は化学療法や放射線療法に抵抗性であるため、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は化学療法や放射線療法後の白血病患者に投与されることが好ましい。ただし、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は、がん幹細胞から発生した細胞も攻撃し得るため、化学療法や放射線療法と組み合わせなくてもよい。

【0041】

なお、本発明のペプチドは、少なくともＨＬＡ−Ａ２４：０２に結合することが確認されている。このため、本発明の白血病ワクチン及び白血病受動免疫療法剤は、ＨＬＡ−Ａ２４：０２の発現が予め確認された患者に投与されることが好ましい。また、上記患者はＰＥＰＰ２の発現を予め確認されていることも好ましい。なお、ＨＬＡ−Ａ２４：０２は、日本人の約６０％が発現するＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉである。ただし、本発明のペプチドはそれ以外のＨＬＡにも結合し得、幅広い患者に投与されてよい。

【0042】

本発明は、白血病治療のための、エピトープ配列からなる候補物質のスクリーニングも包含する。この方法は、配列番号２（ヒトＰＥＰＰ２のアミノ酸配列）と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（相同性は好ましくは９５％以上、より好ましくは１００％。あるいはＰＥＰＰ２の他動物種におけるホモログのアミノ酸配列）から、ＨＬＡとの結合性に基づき、ＨＬＡに対するエピトープ配列を選抜する工程を有する。前述のとおり、ＰＥＰＰ２が正常組織では精巣で特異的に高発現し、かつ白血病細胞で高発現することから、ＨＬＡに結合するエピトープ配列を有するペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞の標的になり得る。

【0043】

配列番号１のアミノ酸配列は、ＨＬＡ−Ａ２４：０２に結合することに基づき選抜されたエピトープ配列の一つであるが、ＰＥＰＰ２内には、他にも同様の機能を有するアミノ酸配列が存在し得る。また、ＨＬＡ−Ａ２４：０２以外のＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＲ−ＤＱ、ＨＬＲ−ＤＰ）に結合することに基づき選抜することも可能である。一般的には、当該候補物質の投与が想定される対象において高確率で発現するＨＬＡを用いることが好ましい。

【0044】

また、この方法は、上記工程で選抜された物質について、上記用いたＨＬＡとの複合体を提示した細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を生じることに基づき、更に選抜する工程を有してもよい。これにより、白血病治療物質としての有用性をより高い確率で保証することができる。同じ観点で、この方法は、候補物質について、他の白血病治療効果又はそれに相関する効果を評価する工程を更に有してもよい。

【0045】

本発明は、被験者の白血病の病勢を試験する方法も包含する。この方法は、被験者から採取した血液における、配列番号２と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質の含有量、又はこのアミノ酸配列をコードする核酸の含有量を測定し、その測定値を、白血病の罹患が疑われる基準としての前記タンパク質又は核酸の量と比較する工程を有する。前述のとおり、ＰＥＰＰ２は正常血液細胞では発現が小さい又はない（即ち、これが基準になるタンパク質又は核酸の含有量である）ため、この基準に比べて血液中のタンパク質又は核酸の量が有意に高ければ、被験者の白血病への罹患のおそれが疑われる（なお、本発明の試験方法は、診断工程を含むものではない）。

【0046】

また、本発明は、上記試験方法の工程に加え、さらに白血病マーカーを測定し評価する工程を有する診断方法も包含する。

【実施例】

【0047】

（試験例）
本発明者らは、ヒト癌細胞株およびヒト正常組織のパネルを用いてジーンチップ解析により、がんに高発現する遺伝子を網羅的に解析した結果、ＰＥＰＰ２遺伝子が、正常組織の精巣と、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）で高発現していることを見出した（図示せず）。

【0048】

この結果を踏まえ、種々の正常組織、固形腫瘍、造血器腫瘍細胞について、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＰＥＰＰ２遺伝子の発現量を評価することにした。手順は次の通りである。
図１に示される正常な各組織及び各種がん細胞株からＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン，東京，日本）を用いてＲＮＡを抽出した。具体的には、５．０×１０^６個の細胞を、ＰＢＳを用いて２５０Ｇ、５分間の条件で遠心分離し洗浄した。その後、上清を取り除いた沈殿物にＩｓｏｇｅｎ １ｍＬを加え５分間室温に静置した。次に、クロロホルムを０．２ｍ 加え１５秒間撹拌し、室温で３分間静置した。その後、１２０００Ｇ，１５分，４℃で遠心し、水相を分離した後、イソプロパノールを０．５ｍＬ加え１０分間室温に静置し、１２０００Ｇで１０分間、４℃で遠心した。上清を取り除いた沈殿物に７０％エタノールを１ｍＬ加えて撹拌し、７５００Ｇ，５分間，４℃で遠心し、エタノールを捨て沈殿物を風乾した。風乾後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ加えて混和して溶解し、トータルＲＮＡストックとした。これを使用するまで、ストックは−８０℃で保存した。

【0049】

なお、図１に示される各がん細胞株のうち、ヒト多発性骨髄腫ＫＭＳ１１、ＫＭＳ２１は川崎医科大学衛生学 大槻剛巳教授より供与を受けた。ＨＬ６０、Ｕ９３７は慶應義塾大学薬学部病態生理学講座 服部豊教授より供与を受けた。ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２，ＫＵ８１２及びヒト急性骨髄性白血病細胞株ＴＨＰ−１、ＰＬ２１は、ＨＳ研究資源バンク（泉南市， 大阪）から購入した。ＨＬＡ−Ａ２４：０２遺伝子をＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ遺伝子と共に導入したＣ１ＲＡ−２４は慶應義塾大学医学部先端医科学研究所細胞情報部門 河上裕教授より供与を受けた。また、急性前骨髄球性白血病細胞株ＮＢ４は、慶應義塾大学医学部血液内科 中島秀明准教授より供与を受けた。

【0050】

上記のトータルＲＮＡ ２μｇを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡを作成した。この際、用いたプライマーの配列は、下のとおりである。

【0051】

遺伝子：ＧＡＰＤＨの逆転写に用いたプライマー
Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧ−３’
Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’

【0052】

遺伝子：ＰＥＰＰ２
Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡ−３’
Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡ−３’

【0053】

逆転写反応は、下記の組成、条件で行った。トータルＲＮＡ ２μｇに、ＤＥＰＣ水とランダムプライマーを１μＬ加えて全量５μＬとし、７０℃で５分間，その後４℃で５分間置き、ランダムプライマーを加えた。ＤＥＰＣ水 ６．５μＬ， ＧｏＳｃｒｉｐｔ ５ ×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ， ＭｇＣｌ_２（２５ｍＭ） ２μＬ， ＰＣＲ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ １μＬ， ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）０．５μＬ， ＧｏＳｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）１μＬを加え、２５℃で５分間（アニーリング）、４２℃で６０分間（伸長反応）、７０℃で１５分間（逆転写酵素の失活）の順に、逆転写反応を行い、４℃でｃＤＮＡ検体を保存した。その後、ｃＤＮＡ１μＬをテンプレートとして、ＰＣＲ反応を行った。

【0054】

作成したｃＤＮＡについて、ＰＥＰＰ２、及び内因性コントロールとしてハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨの発現を、ＰＣＲ法で確認した。具体的には、上記ｃＤＮＡを２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ， １０μＭのプライマー及び０．６２５ＵのＴａｋａｒａ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，滋賀，日本）を含む２５μＬのＰＣＲ反応液を用い、ＰＥＰＰ２遺伝子については９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子については、９４℃で１分間，５８℃で２分間，７２℃で２分間を１サイクルとし、２５サイクルのＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応により、ＰＥＰＰ２遺伝子においてはエクソン３及びエクソン４を含む１９１ｂｐの断片が増幅され、ＧＡＰＤＨ遺伝子においては、エクソン８及びエクソン９を含む３０４ｂｐの断片が増幅された。この結果を図１に示す。

【0055】

図１に示されるように、ＰＥＰＰ２は、正常組織では精巣のみに強発現、脳組織にごくわずかな発現があり、一方、癌細胞株では急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に強発現を認めた。なお、脳腫瘍、膀胱癌細胞株に弱い発現は認められた。

【0056】

次に、図１で強発現が確認されたＫ５６２（ＣＭＬ）及びＮＢ４株（ＡＰＬ）、並びに対照として健常人２名の血液細胞を用い、４×１０^５／ｍＬの細胞液を、ＣＹＴＯＳＰＩＮ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ ）を用いて３５０ｒｐｍ，５分間でスライドガラスに固定した。４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水に１０％ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１／１０希釈で作成したもので５分間洗浄した。０．５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標） （ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ）で２０分間細胞膜を破壊し、上記同様の洗浄をした。１０％ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ で３０分間ブロッキングした後、１／３００希釈したＭｏｎｏ Ａｎｔｉ−ＰＥＰＰ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ （ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を４℃で一晩反応させた。洗浄した後、１０％ Ｇｏａｔ ＳｅｒｕｍにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ １／１０００希釈し、室温で２時間処理し、洗浄した。消光防止剤（１ｍＭ ｐ−フェニレンジアミン，１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４， ９０％ グリセリン）を滴下し、カバーガラスで封入した。ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ Ｊａｐａｎ， 大阪、日本）で観察した。この結果を図２に示す。

【0057】

図２に示されるように、健常人の血液細胞では、いずれにもＰＥＰＰ２タンパク質の発現が確認されなかった一方、Ｋ５６２及びＮＢ４では、いずれも、ＰＥＰＰ２タンパク質の発現が確認された。なお、ＤＡＰＩにより示される細胞核でＰＥＰＰ２タンパク質の蛍光が確認され、このことは、従来知られる転写因子としてのＰＥＰＰ２の機能とも整合する。

【0058】

次に、複数のＡＰＬ患者及びＣＭＬ患者から骨髄血を採取するとともに、ＨＬＡ−Ａ２４：０２陽性の健常人から末梢血及び骨髄を採取し、ＰＥＰＰ２の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法で検出した。なお、これらの検体は、書面によるインフォームドコンセントを得て、使用したものである。

【0059】

手順としては、前述の要領でｃＤＮＡを作成し、ＰＥＰＰ２、及び内因性コントロールとしてハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨの発現をＣＦＸ ９６／３８４ リアルタイムＰＣＲシステム（ＢＩＯ ＲＡＤ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使い、確認した。プライマー、プローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０（Ｉｎｆｏｒｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を使用して設計し、次の配列を有するものである。

【0060】

遺伝子：ＧＡＰＤＨ
Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＡ −３’
Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ −３’
Ｐｒｏｂｅ ：６ ＡＣＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣ ＢＨＱ−２
※ ６ ⇒シークエンスコード ６ − ＦＡＭ

【0061】

遺伝子：ＰＥＰＰ２
Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ：５’− ＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡ −３’
Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ：５’− ＴＧＣＣＡＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧ −３’
Ｐｒｏｂｅ ： ６ ＴＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＴＧＧＡＧＧ ＢＨＱ−２

【0062】

定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応は、上記ｃＤＮＡをＳｓｏＦａｓｔ ｐｒｏｂｅｓ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）１０μＭ、プライマー及び Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（ＳＩＧＭＡ）を含む２０μＬのＰＣＲ反応液を用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子については、９５℃で５秒間，５７℃で１０秒間を１サイクル、ＰＥＰＰ２遺伝子については９５℃で５秒間、５５．１℃で１０秒間、を１サイクルとして、共に４０サイクルのＰＣＲを行った。
この反応により、ＧＡＰＤＨ遺伝子においてはエクソン８を含む断片が増幅され、ＰＥＰＰ２遺伝子においてはエクソン３及びとエクソン４を含む断片が増幅された。この結果を図３に示す。

【0063】

図３に示されるように、ＰＥＰＰ２の発現は、健常人の末梢血及び骨髄では弱い又はなかったのに対し、ＡＰＬ及びＣＭＬ患者の骨髄では、それぞれ８９％、７０％という高割合で発現が確認された。このことは、ＰＥＰＰ２が白血病治療の標的として有用であることを示唆する。

【0064】

次に、白血病細胞群を、フローサイトメトリーによるＣＤ３８及びＣＤ３４の陽陰性に基づき、白血病幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）とそれ以外の細胞（ＣＤ３４−）とに分画し、それぞれの画分におけるＰＥＰＰ２の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。この結果を図４に示す。なお、図４の縦軸は、検量線の作成に用いたＫ５６２細胞の発現を１としたときの相対値である。

【0065】

このフローサイトメトリーは、次の手順で行った。つまり、ＰＢＳと０．５％ＦＢＳで作製した溶液をＦＡＣＳ溶液として細胞を懸濁させ、１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。この細胞浮遊液に抗ヒトＣＤ３４抗体および抗ヒトＣＤ３８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を加え、４℃で３０分反応させた。ＰＢＳを加えて４℃、１３００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を吸引した後、ＦＡＣＳ溶液に再懸濁させた。細胞懸濁液をフィルターに通し、セルソーター（ＭｏＦｌｏ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）により細胞を分取した。

【0066】

図４に示されるように、ＰＥＰＰ２は、白血病幹細胞及びそれ以外の白血病細胞の双方で発現していたが、特に白血病幹細胞において強発現していた。これにより、ＰＥＰＰ２を標的とする免疫療法は、白血病幹細胞を効果的に攻撃することができるため、放射線療法又は化学療法後の白血病患者に実施されると好ましいことが示唆された。

【0067】

図３のとおり、ＰＥＰＰ２の発現は、ＡＰＬ及びＣＭＬ患者の骨髄では高割合で確認されたが、中には、強くない場合もあった。そこで、脱ＤＮＡメチル化剤として知られる５−アザ−２’−デオキシシチジンを白血病細胞に与えることで、ＰＥＰＰ２の発現が亢進されるか否か、確認を行った。具体的には、ＨＬ６０（ＡＰＬ）を５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、健常人末梢血単核球を３．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整し、６穴プレートにまいた。５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）は、がん細胞株においてはＲＰＭＩ−１６４０ ｍｅｄｉｕｍ （ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を用いて、健常人末梢血単核球はＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍ （ＧＩＢＣＯ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で濃度を２００ｎＭに調整し、２４時間ごとに３日間連続で添加した。その後、細胞を回収し、前記した要領で発現量解析（ＨＬ６０について図５Ａ〜Ｂ、健常人細胞について図６）及び、蛍光免疫染色（図５Ｃ〜Ｄ）を行った。なお、図５Ｄは、撮像機器により検出された各細胞の輝度を定量化した平均値を示すグラフである。また、図５Ｄの縦軸は、１細胞あたりの平均輝度（Ａｒｖｉｔａｒｙ ｕｎｉｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である。図５Ｂ、図６の縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量で補正したＰＥＰＰ２遺伝子の相対的な発現量である。

【0068】

図５に示されるように、５−アザ−２’−デオキシシチジンの使用により、非使用時に比べ、ＡＰＬ細胞におけるＰＥＰＰ２の発現量が著明に増加し、タンパク質量も増加することが分かった。他方、図６に示されるように、健常人の細胞におけるＰＥＰＰ２の発現量は、５−アザ−２’−デオキシシチジンの使用にかかわらず、変化しないことが分かった。これにより、脱ＤＮＡメチル化剤を併用すると、白血病のＰＥＰＰ２の発現量が増すため、ＰＥＰＰ２エピトープを標的とする免疫療法が、一層効果的になることが示唆された。

【0069】

＜実施例＞ エピトープ配列の選抜
ＰＥＰＰ２の全アミノ酸配列から、ＢＩＭＡＳ（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）及びＳＹＦＰＡＴＨＩ（http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com）の２つのコンピュータアルゴリズムを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４：０２に結合すると予測されるペプチドを２４種類抽出した（表１）。

【0070】

【表1】

【0071】

Ｃ１ＲＡ−２４細胞をＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍ （ＧＩＢＣＯ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で洗浄し、最終濃度１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／２０ｍＬとして２４時間培養した。Ｐｅｐｔｉｄｅ１〜２４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を５０ｍｇ／ｍＬになるようにＤｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）で調整し、Ｃ１ＲＡ−２４細胞を洗浄後２４穴プレートに１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでまき、さらにβ２ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）１を５μＬ、Ｐｅｐｔｉｄｅ１〜２４、ＥＢＶ Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を１μＬ添加し２４時間培養した。ＰＢＳ５０ｍＬあたり１ｇのＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）を混合し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡとした。細胞をＰＢＳ中２％ＢＳＡで洗浄し、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ，ＵＳＡ）またはＡｎｔｉ−ＨＬＡＡ−２４抗体（ＭＢＬ， Ｎａｇｏｙａ， Ｊａｐａｎ）を２μＬ添加し、３０分間氷上で反応させた。再び洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでとき、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を用いて解析を行った。ペプチドとして、表１に示す２４ペプチドを用いた。この結果を図７（Ａ）に示す。なお、図７の縦軸は、平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）であり、ここでは抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体を標識しているＦＩＴＣ色素の強度を示す。

【0072】

Ｃ１ＲＡ−２４細胞をＡＩＭ−Ｖｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で洗浄し、最終濃度１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／２０ｍＬとして２４時間培養した。Ｐｅｐｔｉｄｅ１〜２４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を５０ｍｇ／ｍＬになるようにＤｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）で調整し、Ｃ１ＲＡ−２４細胞を洗浄後２４穴プレートに１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでまき、さらにβ２ミクログロブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を５μＬ、Ｐｅｐｔｉｄｅ１〜２４、ＥＢＶ Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を１μＬ添加し、２４時間培養した。ＰＢＳ中２％ＢＳＡで洗浄し、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）を５μＬ添加し、４時間培養した。４時間後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡで洗浄し、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ，ＵＳＡ）またはＡｎｔｉ−ＨＬＡＡ−２４抗体（ＭＢＬ， Ｎａｇｏｙａ， Ｊａｐａｎ）を２μＬ添加し、３０分氷上で反応させた。再び洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでとき、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を用いて解析を行った。この結果を図７（Ｂ）に示す。

【0073】

図７（Ａ）〜（Ｂ）より、Ｐｅｐ６、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ２３の３つのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４：０２との結合性に優れることが分かった。そこで、これら３つのペプチドを候補物質として、更なる評価を行うこととした。

【0074】

ペプチド刺激を行ったＣＴＬの標的細胞に対する反応性を評価するため、ＥＬＩＳＰＯＴ法を行いＩＦＮ−γ産生細胞数を評価した。具体的な手順は次の通りである。

【0075】

プレートのコーティング
Ｄａｙ１ に９６ｗｅｌｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳプレート （ＭＩＬＩＰＯＲＥ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）上に３５％エタノールを１５μＬ／ｗｅｌｌで加え、１分間インキュベート後、超純水２００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄した。その後、Ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １−Ｄ１Ｋ」（ＭＡＢＴＥＣＨ， Ｎａｃｋａ， Ｓｗｅｄｅｎ）とＰＢＳとを１５０μＬ：１１ｍＬの比で混合した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、４℃で遮光し一晩静置した。

【0076】

標的細胞の調製
Ｄａｙ２に標的細胞をＰＢＳで２回遠心洗浄後、必要細胞数を血球計算盤で計測した。ＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍ １ｍＬ中で、コントロールとしてのＤＭＳＯ １μＬまたは、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）を１μＬ加え、３７℃、２時間で反応させた。その後、ＰＢＳで遠心洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍで調節した。

【0077】

プレートのブロッキング
Ｄａｙ２にコーティングしたプレートをＰＢＳ ２００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉｕｍを１００μＬ／ｗｅｌｌ加えた後、遮光して１時間後室温に放置した。

【0078】

ＣＴＬの調製
次にＣＴＬをＰＢＳで遠心洗浄し、必要細胞数に調節した。その後、上記プレートにＣＴＬを１００μＬ／ｗｅｌｌでまき、その上に上記の方法で調製した標的細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌで加えて、５％ ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間培養した。

【0079】

発色
Ｄａｙ３にプレートから細胞を取り除き、ＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ「Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ７−Ｂ６−１」（ＭＡＢＴＥＣＨ， Ｎａｃｋａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で遮光し２時間反応させた。
その後、ＰＢＳ ２００μＬ／ｗｅｌｌでプレートを５回洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （ＭＡＢＴＥＣＨ， Ｎａｃｋａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で遮光し１時間反応させた後、ＰＢＳ ２００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄し、ＡＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｕｂｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて作成した溶液０．４５μｍのフィルターにかけ、１００μＬ／ｗｅｌｌで加え発色させた。発色後、超純水２００μＬ／ｗｅｌｌを加えて、遮光して乾燥させた後、スポットを測定した。

【0080】

測定解析
スポットの解析には、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ５（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｏｈｉｏ， ＵＳＡ）を使用した。スポット数の統計解析では、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行い、統計学的有意差をＰ＜０．０５とした。この結果を図８に示す。

【0081】

図８Ａ〜Ｃに示されるように、３種のペプチドのうちＰｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）のみが、ＤＭＳＯや、ネガティコントロールであるＨＩＶペプチドと比較し、有意にＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導することが分かった。これにより、Ｐｅｐ６を最も有望な候補物質であると判断し、更なる評価試験を行うことにした。

【0082】

ＣＴＬの細胞傷害活性を^５１Ｃｒ細胞傷害性試験にて評価した。標的細胞を３０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｕｔａｈ， ＵＳＡ）を含むＩＭＤＭ ｍｅｄｉｕｍ （ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡ）中で１００μＣｉの^５１Ｃｒにて３７℃で１時間標識した。細胞を２％のＦＢＳを含むＩＭＤＭ ｍｅｄｉｕｍ、１５００ｒｐｍ、５分間の条件で洗浄後、１０％のＡＢ血清（ＬＯＮＺＡ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＩＭＤＭ ｍｅｄｉｕｍに浮遊させた９６穴プレート上に、細胞２．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／５０μＬでまき、１０μｇ／ｍＬのペプチド液を５０μｇ／ｗｅｌｌでまき、室温にて１時間反応させた。その後、ＰＥＰＰ２特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を種々の割合で加え、３７℃インキュベーター内で４時間共培養し、上清を回収した後、Ｎａシンチレーションカウンターでβ線を測定した。標的細胞及びＣＴＬの比は、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比＝１，３，１０，３０，１００で求めた。つまり、測定したβ線から以下の式を用いて細胞傷害活性を算出した。この結果を図９に示す。
＜細胞傷害活性の算出式＞
％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝［ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ^５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ）−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ^５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ （ｃｐｍ）］／ｍａｘｉｍｕｍ ^５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ）−ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ^５１Ｃｒ ｒｅｌｅａｓｅ（ｃｐｍ） ×１００（％）

【0083】

図９に示されるように、ＣＴＬについて、Ｐｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）でパルスしたＣＩＲ−Ａ２４細胞を、ＤＭＳＯや、ネガティコントロールであるＨＩＶペプチドでパルスしたＣＩＲ−Ａ２４細胞と比較し、有意に高い細胞傷害活性を示すことが分かった。

【0084】

次に、Ｐｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）の濃度を、０．００５μｇ、０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇ、５０μｇ／μＬに設定し、それぞれの場合における細胞傷害活性を算出した。この結果を図１０に示す。

【0085】

図１０に示されるように、細胞傷害活性は、Ｐｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）の量に依存的に変化した。また、図１０の量／％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙの推移は、従来のがん抗原ペプチドと同等であったことから、白血病治療におけるＰｅｐ６の用量も、従来のがん抗原ペプチド薬と同等の用量になることが推察された。

【0086】

次に、ＨＬＡ−Ａ２４：０２及びＰＥＰＰ２のそれぞれが陽性又は陰性である各種がん細胞株、及び健常人の単核球を用意し、図９の要領で、Ｐｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）で誘導したＣＴＬによる細胞傷害活性を算出した。この結果を図１１に示す。

【0087】

図１１に示されるように、Ｐｅｐ６（ＰＥＰＰ２−Ａ２４−２７１）で誘導したＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４：０２及びＰＥＰＰ２の双方が陽性であるＫＭＳ２１に対してのみ、細胞傷害活性を呈し、健常人単核球、及びＨＬＡ−Ａ２４：０２又はＰＥＰＰ２が陰性であるがん細胞株に対しては、強い細胞傷害活性を呈しなかった。これにより、Ｐｅｐ６は、ＨＬＡ−Ａ２４：０２及びＰＥＰＰ２の双方が陽性である白血病細胞に特異的に細胞障害活性を誘発することができ、副作用が小さいことが示唆された。なお、用いた健常人単核球は、ＰＥＰＰ２陽性ではあったものの、その発現が極めて弱かったため、Ｐｅｐ６に基づく細胞傷害活性が呈されなかったと推測される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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