特許 6204912 グリセロールの有機酸発酵

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6204912

(24)【登録日】2017年9月8日

(45)【発行日】2017年9月27日

(54)【発明の名称】グリセロールの有機酸発酵

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20170914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170914BHJP

   C12P 7/46 20060101ALI20170914BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N15/00 A

   C12P7/46

【請求項の数】9

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-521601(P2014-521601)

(86)(22)【出願日】2011年7月22日

(65)【公表番号】特表2014-521318(P2014-521318A)

(43)【公表日】2014年8月28日

(86)【国際出願番号】US2011045001

(87)【国際公開番号】WO2013015770

(87)【国際公開日】20130131

【審査請求日】2014年7月18日

【審判番号】不服2016-10288(P2016-10288/J1)

【審判請求日】2016年7月7日

(73)【特許権者】

【識別番号】512129033

【氏名又は名称】ミリアント・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＭＹＲＩＡＮＴ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】アール・ロジャース・ヨキュム

(72)【発明者】

【氏名】セロン・ハーマン

(72)【発明者】

【氏名】ユ・シャオホイ

【合議体】

【審判長】 大宅 郁治

【審判官】 松田 芳子

【審判官】 長井 啓子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５５７１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１８７５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６，Ｖｏｌ．１７８，ｐｐ．２８４６−２８５２．

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/09

C12P1/00-41/00

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

最少培地中の炭素源としてのグリセロールから少なくとも２０ｇ／Ｌの力価のコハク酸を４８時間よりも少ない時間で生産するために遺伝子改変された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ）であって、該大腸菌は、フィードバック耐性グリセロールキナーゼ、ならびに、ｇｌｐＦＫＸオペロン、ｇｌｐＡＢＣオペロンおよびｇｌｐＤ遺伝子からなるグリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性の実質的な低下をもたらす、ｇｌｐＲ遺伝子の変異を含み、５０ｇ／Ｌグリセロール含有培地での継代培養を経た、大腸菌。

【請求項2】

ｇｌｐＲ遺伝子の変異が欠失である、請求項１に記載の大腸菌。

【請求項3】

ｇｌｐＫ遺伝子によってコードされるフィードバック耐性グリセロールキナーゼが、フルクトース−１，６−二リン酸による阻害に対して実質的に耐性である、請求項１に記載の大腸菌。

【請求項4】

ｇｌｐＫ遺伝子によってコードされるフィードバック耐性グリセロールキナーゼが、ホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃによる阻害に対して実質的に耐性である、請求項１に記載の大腸菌。

【請求項5】

ｇｌｐＫ遺伝子によってコードされるフィードバック耐性グリセロールキナーゼが、フルクトース−１，６−二リン酸による阻害およびホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃによる阻害に対して実質的に耐性である、請求項１に記載の大腸菌。

【請求項6】

ｇｌｐＤ、ｇｌｐＦＫＸ、およびｇｌｐＡＢＣからなる群より選択される１つ以上の遺伝子またはオペロンのネイティブプロモーターを、構成的に活性なプロモーターで置き換える変異をさらに含む、請求項１に記載の大腸菌。

【請求項7】

少なくとも２０ｇ／Ｌの力価のコハク酸を最少培地中のグリセロールから生産するための方法であって、グリセロールを炭素源とする発酵槽中で請求項１〜６のいずれか１項に記載の大腸菌を増殖させ、該発酵槽からコハク酸を収穫することを含む方法。

【請求項8】

通気速度がブロス１リットルあたり毎分０．１５リットル未満の酸素を供給する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

通気速度がブロス１リットルあたり毎時２０ｍｇを上回る酸素を供給する、請求項７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本特許出願は、遺伝子改変微生物を使った発酵によるグリセロールからの有機酸の生産に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
脂肪酸のグリセロールエステル（グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドとも呼ばれている）をメタノール、エタノール、または他のアルコールのグリセロールエステルに転化するために、大規模プロセスが開発され、商業的に使用されている。その結果生じる脂肪酸エステル（脂肪酸メチルエステルについてはＦＡＭＥ、脂肪酸エチルエステルについてはＦＡＥＥとも呼ばれている）は、一般に「バイオディーゼル」として知られている。なぜなら、それらは、単独で、または従来の炭化水素と配合して、ディーゼルエンジン用の燃料として使用することができるからである。バイオディーゼルを合成するための原材料には、植物油、動物脂、および廃食用脂を含めることができる。バイオディーゼルプロセスの大量副産物は、グリセロール（グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎまたはｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）とも呼ばれている）である。バイオディーゼルの生産量１キログラムにつき約０．１キログラムのグリセロール副産物が生成する。

【0003】

バイオディーゼル合成のための触媒が水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである場合、グリセロール副産物は典型的には重量で約８０％〜９０％グリセロールであり、副産物の残りは、大部分が水、メタノールまたはエタノール（エステル交換に使用したアルコールに依存する）、種々の塩、および低レベルの他の有機化合物である。そのままのグリセロール副産物はアルカリ性であり、粘稠であるので、通常は、それを硫酸、塩酸または他の酸で中和してｐＨを約４または５まで下げる。これにより、粘度が低下し、生成した塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムなどが残ることになる。ここで、正確な組成がプロセスに使用した化合物に依存することは明らかである。アルコール類は、典型的には、その多くまたは全てを、蒸留によって粗グリセロールから除去し、回収することができる。このタイプのプロセスにおいて使用される水酸化ナトリウム触媒や水酸化カリウム触媒は均一系触媒と呼ばれる。

【0004】

バイオディーゼルを生産するためのもう一つのプロセスは「不均一系触媒」によるものである。その一例はＥｓｔｅｒｆｉｐ−Ｈと呼ばれ、フランス企業Ａｘｅｎｓによって商業化されている。この触媒の正確な性質は社外秘であるが、２つの非貴金属のスピネル型混合酸化物であるとされ、均一系触媒よりもはるかにきれいなグリセロール副産物を与えるとされている。不均一系触媒からのグリセロール副産物は、純度９８％であり、塩類を含まないとされている（Ｏｎｄｒｅｙ，２００４）。

【0005】

バイオディーゼルビジネスの成長に伴い、必然的に、グリセロール副産物の量も並行して増加している。バイオディーゼル産業からの粗グリセロール副産物の一部は蒸留によって精製され、伝統的にグリセロールを供給材料として使用してきたさまざまな産業において使用されるが、バイオディーゼル産業からのグリセロールの残りの部分は、厄介な廃棄物であるとみなされている。その結果、近年、粗グリセロールの価格は＄０．０５／ｌｂ以下まで暴落している（Ｄｅ Ｇｕｚｍａｎ，２０１０）。したがってグリセロールは、燃料および化学品を生産するための発酵供給材料として、糖類および他の糖質、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、デンプン、およびイヌリンなどに代わる、潜在的に安価な代替物になっている（Ｃｌｏｍｂｕｒｇ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ， ２０１０；Ｙａｚｄａｎｉ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ，２００７）。本明細書の執筆時点で、グルコースおよびスクロースの価格は約＄０．１５〜＄０．２５／ｌｂであるから、グリセロールを他の糖類の代わりに使用することができる発酵プロセスは、著しい経済的利点をもたらしうるであろう。

【0006】

再生可能な糖類を使った発酵による有用化学品の商業的生産のために、多くの微生物が開発されている。炭素源としてさまざまな糖類を使用して有機酸を多量に生産する能力を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ． ｃｏｌｉ）株は、当技術分野ではよく知られている。例えば米国特許出願公開第２００９／０１４８９１４号は、化学的に純粋なアセテートおよび／またはピルベートを生産するためのバイオ触媒として、大腸菌の株を提供している。米国特許第７，６２９，１６２号は、乳酸の生産用に構築された大腸菌ＫＯ１１株の派生株を提供している。特許協力条約に基づいて公開された国際公開第２００８／１１５９５８号および同第２０１０／１１５０６７号は、ｐＨ制御されたバッチ発酵においてグルコースを炭素源として含有する最少塩培地中でスクシネートおよびマレートを生産するように改変された微生物を提供している。米国特許第７，２４１，５９４号および同第７，４７０，５３０号ならびに国際公開第２００９／０２４２９４号は、炭素源として糖類を使用するコハク酸の発酵生産に有用なルーメン細菌マンハイミア・スクシニプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）を提供している。米国特許第５，０００，０００号、同第５，０２８，５３９号、および同第５，４２４，２０２号は、エタノールを生産するための大腸菌株を提供している。米国特許第５，４８２，８４６号、同第５，９１６，７８７号、および同第６，８４９，４３４号は、エタノール生産用のグラム陽性微生物を提供している。米国特許第７，０９８，００９号は、Ｌ（＋）乳酸を生産するためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株を提供している。米国特許第７，２２３，５６７号、同第７，２４４，６１０号、同第７，２６２，０４６号、および同第７，７９０，４１６号は、コハク酸を生産するための大腸菌株を提供している。

【0007】

燃料および化学品を生産するためにバイオテクノロジー産業において現在使用されている微生物の大半は、グリセロール資化のための専用の代謝経路を持っている。しかし、これらの産業用微生物の中に、供給材料としてのグリセロールを商業的製造にとって魅力的な生産パラメータで使用する能力を持つことが示されたものはまだない。このように産業用微生物が有用化学品の製造においてグリセロールを商業的供給材料として利用することができないのは、微生物細胞内で作動する一定の調節的代謝フィードバック制御機序に原因があると考えられる。

【0008】

微生物によるグリセロールの取り込みと代謝は、特に大腸菌では、詳しく研究されている（Ｌｉｎ， １９９６；Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）。図１に示すように、大腸菌では、グリセロールは、ｇｌｐＦ遺伝子がコードする促進拡散タンパク質によって細胞内に進入する。「古典的」グリセロール代謝経路では、グリセロールは、ｇｌｐＫ遺伝子がコードするグリセロールキナーゼによってリン酸化されて、グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を与える。次にＧ３Ｐは、ｇｌｐＤがコードするＧ３ＰデヒドロゲナーゼまたはｇｌｐＡＢＣがコードする３サブユニットＧ３Ｐデヒドロゲナーゼによって、ジヒドロキシアセトンリン酸に還元される。ＧｌｐＫ−ＧｌｐＤ／ＧｌｐＡＢＣ経路は電子受容体を必要とするので呼吸経路であるとみなされ、好気条件下で、またはナイトレートやフマレートなどの代替的電子受容体が存在する場合に、作動すると考えられる。

【0009】

微生物細胞内でのグリセロール代謝のためのもう１つの経路は非古典的経路と呼ばれ、嫌気条件下で作動すると考えられている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）。この第２の経路では、細胞内に輸送されたグリセロールが、ｇｌｄＡがコードするグリセロールデヒドロゲナーゼによってジヒドロキシアセトンに還元される。次にジヒドロキシアセトンは、ｄｈａＫＬＭがコードするホスホエノールピルビン酸依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼによってリン酸化される。これらの経路のいずれかによって生じたジヒドロキシアセトンリン酸は、ｔｐｉがコードするトリオースリン酸イソメラーゼによって、解糖経路に入ることができる。トリオースリン酸イソメラーゼはジヒドロキシアセトンリン酸をグリセルアルデヒド−３−リン酸に転化するが、これは、グリセリン酸−１，３−二リン酸に変換され、それがさらにホスホエノールピルビン酸に変換された後に、トリカルボン酸経路に入ることができる。

【0010】

グリセロールからの発酵によるさまざまな化合物の微生物生産を開示している報告はいくつかある。一般に、グリセロールから微生物発酵によって生産される化学品は、スクシネート、エタノール、１，２−プロパンジオール、水素、およびホルメートを含めて、これらの化合物を生産するための他の既知の商業的プロセスと競合できるほど高いとは思われない力価で生産される（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｕｒｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｙａｚｄａｎｉ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ，２００８）。

【0011】

Ｂｌａｎｋｅｎｓｃｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、ΔａｄｈＥ、Δｐｔａ、ΔｐｏｘＢ、ΔｌｄｈＡ、Δｐｐｃと、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のピルビン酸カルボキシラーゼを過剰発現するプラスミドｐＺＳ−ｐｙｃとを含有する改変大腸菌株を記述している。予備実験では、このΔａｄｈＥ、Δｐｔａ、ΔｐｏｘＢ、ΔｌｄｈＡ、Δｐｐｃ、［ｐＺＳ−ｐｙｃ］株中の別個のベクターから発現したＧｌｄＡ−ＤｈａＫＬＭは、スクシネート生産の改良を示さなかった。大腸菌のこのグリセロール資化株には一定の欠点がある。固有の名前を与えられていないこの株は、７２時間で１４ｇ／ｌのスクシネートしか生産せず、収量は０．６９ｇ／ｇ−グリセロールであった。その上、プラスミドｐＺＳ−ｐｙｃは、維持にはクロラムフェニコールを、また誘導にはアンヒドロテトラサイクリンを必要とし、これらはどちらも大規模発酵には望ましくない。

【0012】

Ｙａｚｄａｎｉ ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ（２００８）は、それぞれエタノール＋水素またはホルメートを生産するように設計された、２つの大腸菌株ＳＹ０３およびＳＹ０４を記述している。これら２つの株はプラスミドｐＺＳＫＬＭＧｌｄＡも必要とする。このプラスミドは、大腸菌ｄｈａＫＬＭオペロンとｇｌｄＡとを過剰発現するように設計されており、それはおそらく「非古典的」グリセロール経路によるフラックスを増加させるだろう。掲載されている最も好ましい例では、ｐＺＳＫＬＭＧｌｄＡを含有するＳＹ０４が、約２２ｇ／ｌのグリセロールから、１００時間で、約１０ｇ／ｌのエタノールおよび９ｇ／ｌのホルメートを生産した。これらの発酵パラメータは、競争力のある商業的プロセスと言えるほど高くはない。その上、ｐＺＳＫＬＭＧｌｄＡプラスミドは、維持にはクロラムフェニコールを、また誘導にはアンヒドロテトラサイクリンを必要とし、これらはどちらも大規模発酵には望ましくない。

【0013】

国際公開第２０１０／０５１３２４号には、それぞれＤ−ラクテートおよびＬ−ラクテートを生産するためにｇｌｐＫおよびｇｌｐＤ遺伝子を過剰発現するプラスミドＬＡ０１（ｐＺＳｇｌｐＫｇｌｐＤ）およびＬＡ２０（ｐＺＳｇｌｐＫｇｌｐＤ）を持つ大腸菌株が開示されている。

【0014】

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）には、ｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域中の変異（ｐｃｋ＊という）、ΔｐｔｓＩ、およびΔｐｆｌＢを含有する改変大腸菌株ＸＺ７２１が記述されている。発酵槽では、グリセロールを炭素源として使用する株ＸＺ７２１が、６日で、１２ｇ／ｌのスクシネートを生産し、収量は０．８０ｍｏｌ／ｍｏｌ−使用グリセロールであった。これは１．０２ｇ／ｇ−使用グリセロールに等しい。ｐｃｋ＊バックグラウンドにおけるｇｌｄＡまたはｄｈａＭの欠失が、より高いスクシネート力価（それぞれ１３．２ｇ／ｌおよび１２．７ｇ／ｌ）につながったことから、ＧｌｄＡ−ＤｈａＫＬＭ経路は使用した発酵条件下でのスクシネート生産には好ましい経路でないかもしれないことが示唆された。

【0015】

最近、Ｓｃｈｏｌｔｅｎらは、ＤＤ１またはバスフィア・スクシニシプロデュランス（Ｂａｓｆｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）と名付けられたパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）科の新規反芻動物細菌を単離した。このＤＤ１細菌は、グリセロールから嫌気的にスクシネートを生産する（米国特許出願公開第２０１１／０００８８５１号）。しかしバスフィア・スクシニシプロデュランスは、栄養素を添加していない最少培地では増殖せず、報告されている最大の力価は、唯一の炭素源としてのグリセロールから、３５ｇ／ｌのスクシネートであった。マルトースを培地に加えると、力価は５８ｇ／ｌに改良されるが、かなりの量のグリセロールが使用されないまま残った。

【0016】

Ｔｒｉｎｈ ａｎｄ Ｓｒｉｅｎｃ（２００９）は、基準モード解析（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｏｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使って最適な大腸菌株を設計することによる、グリセロールからのエタノール生産の改良を報告した。ここでは、Δｚｗｆ、Δｎｄｈ、ΔｓｆｃＡ、ΔｍａｅＢ、ΔｌｄｈＡ、ΔｆｒｄＡ、ΔｐｏｘＢ、Δｐｔａ、およびΔｍｄｈの遺伝子型を持つ最適株ＴＣＳ０９９が構築された。代謝的進化（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）後に、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）エタノール生産遺伝子を発現するプラスミドｐＬＯＩ２９７を含有するＴＣＳ０９９は、理論収量の最大９７％、および４０ｇ／ｌグリセロールから約１７ｇ／ｌの力価で、エタノールをグリセロールから生産することができた。しかしこのプロセスにもやはり、他の現行プロセスとの経済的競争力はないだろう。著者らは、１９７０年には知られていたように（Ｚｗａｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９７０）、グリセロールキナーゼの変異が、グリセロールでの株の比増殖速度を増加させる場合があると指摘しており、彼らは、進化処理に付した彼らの株が、変異によって、グリセロールキナーゼによるフラックスの増加を生じたのかもしれないことを示唆しているが、彼らは彼らの進化株におけるグリセロールキナーゼ遺伝子を配列決定も特性解析もしておらず、グリセロールを炭素源とした場合に、変異型グリセロールキナーゼの意図的な導入が、エタノール生産の速度を増加させるであろうことも、より高いエタノール力価につながるであろうことも示唆しなかった。

【0017】

バイオ燃料および有機化学品の産業的規模での微生物生産は嫌気性発酵条件下で行われるので、微生物にグリセロールを供給材料として使用させるために、微生物細胞内の嫌気性グリセロール資化経路を活性化することは論理的である。しかし上述のように、嫌気性グリセロール資化経路の遺伝子操作は、唯一の炭素源としてグリセロールを用いる所望の化学品の生産に、予想される改良をもたらしていない。先行技術では、ｇｌｐＫのフィードバック耐性アレルと、ｇｌｐＲ遺伝子がコードするリプレッサータンパク質による好気性グリセロール資化経路におけるグリセロール資化遺伝子の発現の調節とが開示されている。しかし、生産株における野生型ｇｌｐＫアレルをフィードバック耐性ｇｌｐＫアレルで置き換えることによって、またはグリセロール資化のリプレッサー（例えば大腸菌ｇｌｐＲ遺伝子）を欠失させることによって、またはこれら２つのアプローチの組み合わせによって、グリセロールからの商業上有用な化学品の生産を改良する努力は、かつてなされたことがない。驚いたことに、本発明者らは、コハク酸生産用に選択した微生物細胞において、グリセロール資化のためのＧｌｐＫ−ＧｌｐＤ／ＧｌｐＡＢＣルートを改変し、次に代謝的進化のプロセスを行うことにより、元のコハク酸生産能を保ったまま、グリセロールを炭素源として利用する能力を付与することが可能であることを見いだした。炭素源としてグリセロールを使用するコハク酸の商業的生産に適した大腸菌株の構築によって本発明を詳しく説明するが、本発明の一般主題および本旨は、微生物発酵プロセスにおいて炭素源としてグリセロールを使用して他の多くの商業上有用な化学品を生産するための微生物株の構築に応用することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

発明の概要
本発明は、炭素源としてグリセロールを用いる生物学的発酵によって、商業上関心が持たれる１つ以上の化学品を生産するための微生物およびプロセスを提供する。炭素源としてのグリセロールと、本発明の微生物およびプロセスとを使って、商業上関心が持たれるさまざまな化学品、例えば限定するわけではないが、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、エタノールおよび酢酸などを製造することができる。

【課題を解決するための手段】

【0019】

好ましい一実施形態では、本発明に適したグリセロールはバイオディーゼル産業に由来する。最も好ましい一実施形態において、本発明は、バイオディーゼル産業に由来するグリセロールであって、夾雑化合物が除去されたものを使用する。ある態様では、バイオディーゼル産業由来のグリセロールは、メタノールやエタノールなどの夾雑化合物を含まない。本発明のもう一つの態様では、バイオディーゼル産業に由来するグリセロールは、夾雑イオン、例えば限定するわけではないがナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、およびそれらの混合物などを含まない。

【0020】

もう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを用いて、商業上関心が持たれる１つ以上の化学品を製造するのに適した微生物であって、該微生物が調節解除されたグリセロール資化経路を含み、そのグリセロール資化経路が促進拡散因子、グリセロールキナーゼ、およびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを含む微生物を提供する。

【0021】

本発明の一態様では、グリセロール資化経路の調節解除は、グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性の本質的低下をもたらす、ｇｌｐＲ遺伝子または他の調節遺伝子中の変異を伴う。

【0022】

本発明のもう一つの態様では、グリセロール資化経路の調節解除は、ｇｌｐＫ、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＤおよびｇｌｐＡＢＣ遺伝子のプロモーター領域を、構成的プロモーターとして作用するであろうＤＮＡ配列で置き換えることを伴う。

【0023】

さらにもう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる１つ以上の化学品を生産するための微生物であって、ｇｌｐＫ遺伝子中またはグリセロールキナーゼをコードする他の遺伝子中に、フィードバック阻害に対する耐性を付与する変異を有する微生物を提供する。

【0024】

ある態様において、本発明は、グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース−１，６−二リン酸による阻害に対して実質的に耐性にする変異を、ｇｌｐＫ遺伝子中に含む微生物を提供する。

【0025】

もう一つの態様において、本発明は、グリセロールキナーゼの比活性を、ホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃによる阻害に対して実質的に耐性にする変異を、ｇｌｐＫ遺伝子中に含む微生物を提供する。

【0026】

さらにもう一つの態様において、本発明は、２つ以上の変異を含み、変異の一つが、グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性を実質的に低下させ、もう一つが、グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース−１，６−二リン酸による阻害および／またはホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃによる阻害に対して実質的に耐性にするものである、微生物を提供する。

【0027】

もう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる１つ以上の化学品を生産する方法であって、マイクロエアレーション（ｍｉｃｒｏａｅｒａｔｉｏｎ）を含む方法を提供する。

【0028】

ある態様において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる化学品を生産する方法であって、発酵ブロスに、ブロス１リットルあたり毎分０．１５リットル未満の酸素が供給される方法を提供する。

【0029】

もう一つの態様において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる化学品を生産する方法であって、発酵ブロスに、ブロス１リットルあたり毎時少なくとも２０ｍｇの酸素が供給される方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】微生物におけるグリセロール資化のための代謝経路。外部環境から微生物細胞内へのグリセロールの輸入はｇｌｐＦ遺伝子がコードする促進拡散タンパク質によって媒介される。ひとたび細胞内に入れば、グリセロールはジヒドロキシアセトンリン酸に代謝されうる。２つの経路のうち、嫌気条件下で作動すると考えられるものには、ｇｌｄＡおよびｄｈａＫＬＭ遺伝子によってコードされるタンパク質が関与する。この経路を図解では破線で示す。微生物細胞におけるグリセロール代謝のための他方の経路は、一般に、好気条件下にあるか、ナイトレートやフマレートなどの代替的電子受容体が存在する場合に活性であると考えられており、グリセロール資化のための古典的経路と呼ばれる。微生物細胞内でのグリセロール資化のための古典的経路を、図解では実線で示す。遺伝子ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、ｇｌｐＤおよびｇｌｐＡＢＣは、古典的経路での作動に関与するタンパク質をコードしている。図示されていないのはｇｌｐＸ遺伝子であり、これはｇｌｐＦおよびｇｌｐＫと共に一つのオペロン（ｇｌｐＦＫＸオペロン）内にあって、細胞がグリセロールで増殖する際に糖新生の一因となるフルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードしている。図には、グリセロール代謝のための古典的経路の作動に関与するタンパク質を制御する調節機序も示されている。ｇｌｐＲ遺伝子がコードするリプレッサータンパク質は、ｇｌｐＦＫＸＸ、ｇｌｐＡＢＣおよびｇｌｐＤ遺伝子／オペロンの転写を制御する。ｇｌｐＫ遺伝子がコードするグリセロールキナーゼは、フルクトース−１，６−二リン酸（ＦＢＰ）によるフィードバック阻害、およびホスホトランスフェラーゼ糖類輸送系の一構成要素である非リン酸化型ＥＩＩＡ^ｇｌｃによるフィードバック阻害も受ける。グリセロール代謝の最終産物であるジヒドロキシアセトンリン酸は、ｔｐｉ遺伝子がコードするトリオースリン酸イソメラーゼの作用によってグリセルアルデヒド−３−リン酸に転化される。グリセルアルデヒド−３−リン酸は、微生物細胞内でバイオ燃料および有機酸を生産するための出発点として作用する。

【0031】

【図2】ＫＪ１２２大腸菌株からのグリセロール資化性ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４株の構築。この図解には、大腸菌株ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４を構築する際に辿ったステップが記載されている。ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４の構築の第１段階では、ＫＪ１２２株中の野生型ｇｌｐＫ遺伝子を、２つのアミノ酸置換につながる２つの点変異を含有する変異型のｇｌｐＫ遺伝子で置き換えた。第２段階では、カナマイシン耐性遺伝子カートリッジの挿入によってｇｌｐＲ遺伝子を不活化することで、大腸菌のＲＹ８１９Ｊ株を生成させる。第３段階では、大腸菌のＲＹ８１９Ｊ株を代謝的進化に付すことで、大腸菌のＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４株を得る。ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４を得るためのＲＹ８１９Ｊの代謝的進化には、本明細書で説明するように、１４回の継代が必要であった。

【0032】

【図3】グリセロール資化性大腸菌株ＭＨ２８の構築。代謝的進化の最後に得られた大腸菌のＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４株のｇｌｐＦＫ領域におけるＤＮＡ配列決定により、ｇｌｐＫ遺伝子のオープンリーディングフレーム内の２つのアミノ酸置換（Ａｌａ５５Ｔｈｒ；Ａｒｇ１５７Ｈｉｓ）と、ｇｌｐＦ遺伝子のオープンリーディングフレーム内の１つのアミノ酸置換（Ｐｒｏ２７４Ｌｅｕ）とが明らかになった。ｇｌｐＦ領域内の変異を２ステッププロセスによって取り除いた。第１ステップでは、アミノ酸置換（Ｐｒｏ２７４Ｌｅｕ）を持つｇｌｐＦ遺伝子を、ｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子カートリッジの挿入によって不活化した。次のステップでは、ｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子カートリッジを野生型ｇｌｐＦ遺伝子配列で置き換えることにより、大腸菌のＭＨ２８株を生成させた。ｇｌｐＦおよびｇｌｐＫに見いだされる３つの変異はドナー株ＢＢ１４−２０にも見いだされた。

【0033】

【図4】コハク酸を含有する発酵ブロスの代表的ＨＰＬＣプロファイル。名目上１０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含有する培地中で増殖させた大腸菌株のＭＨ２８株から得た発酵ブロスを、本明細書において説明する手順に従って加工した。加工された試料を、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムを装着したＨＰＬＣ装置にかけた（実施例２参照）。

【0034】

【図5】大腸菌のＫＪ１２２株によるグリセロール資化の動態。ＫＪ１２２株を、本明細書において説明するように、微好気条件下、７Ｌ発酵槽において、１０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含む最少培地中で増殖させた。発酵槽を５２時間稼働し、グリセロール消費と、コハク酸、ピルビン酸、および酢酸の蓄積とを、本明細書において説明するようにＨＰＬＣ装置を使って監視した。

【0035】

【図6】大腸菌のＭＨ２８株によるグリセロール資化の動態。ＭＨ２８株を、本明細書において説明するように、微好気条件下、７Ｌ発酵槽において、１０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含む最少培地中で増殖させた。発酵槽を５２時間稼働し、グリセロール消費と、コハク酸、ピルビン酸、および酢酸の蓄積とを、本明細書において説明するようにＨＰＬＣ装置を使って監視した。

【発明を実施するための形態】

【0036】

好ましい実施形態の詳細な説明
本発明を使って、商業上関心が持たれる工業的に有用な化学品を数多く製造することができる。これら商業上関心が持たれる化学品の大半は微生物代謝における中間体である。本発明では、これらの微生物中間体の１つ以上が、有意な量かつ商業的に好都合な形で生産されるように、微生物ゲノムおよび増殖条件が適切に操作される。そのような化学品の例には、エタノール、ブタノール、ラクテート、スクシネート、フマレート、マレート、スレオニン、メチオニンおよびリジンなどがあるが、これらに限るわけではない。有機酸は遊離酸としても塩（例えば限定するわけではないがナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムなどの塩）としても存在することができるので、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、スレオニン、メチオニン、およびリジンなどの化学名は、遊離酸とその任意の塩との両方を包含するものとする。同様に、スクシネート、フマレート、マレート、アスパルテートなどの任意の塩も、遊離酸を包含するものとする。

【0037】

本発明は、炭素源としてのグリセロールを含む無機塩培地における嫌気性または微好気性増殖条件下でのコハク酸生産について、高い収量、力価および容積生産性を示す株を得るために、特異的遺伝子修飾の技法を、代謝的進化のプロセスと組み合わせる。

【0038】

本発明の説明では、以下の定義を使用することとする。

【0039】

本発明において使用する用語「力価」は、発酵ブロスにおける特定化合物の１リットルあたりのグラム数またはモル濃度を意味する。したがって、本発明によるコハク酸生産用の発酵プロセスにおいて、１００ｍＭのコハク酸力価とは、測定時の発酵ブロスが、発酵ブロス中に、１リットルあたり１００ミリモルまたは１リットルあたり１１．８グラム（１１．８ｇ／ｌ）のコハク酸を含有したことを意味することになる。

【0040】

本発明において使用する用語「収量」は、発酵プロセス中に消費された炭素源１モルあたりの、生産された特定化合物のモル数、または発酵プロセス中に消費された炭素源１グラムあたりの、生産された特定化合物のグラム数を指す。したがって、炭素源としてグリセロールを用いてコハク酸を生産するための発酵プロセスにおいて、収量という用語は、消費されたグリセロール１グラムあたりの、生産されたコハク酸のグラム数を指す。

【0041】

本発明において使用する用語「容積生産性」は、単位時間あたり単位容積あたりの、グラム数で表した特定化合物の生産量を指す。したがって、コハク酸の場合、０．９ｇ・Ｌ^−１ｈ^−１の容積生産性値とは、１時間の増殖中に発酵ブロス１リットルに０．９グラムのコハク酸が蓄積することを意味することになる。

【0042】

本発明において使用する用語「遺伝子」は、あるＤＮＡ配列の１つまたは複数のオープンリーディングフレームならびに上流および下流調節配列を包含する。上流調節領域はその遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流調節領域はターミネーター配列領域とも呼ばれる。

【0043】

「機能的に類似する」という表現は、本明細書に開示する方法によって同じ生物または異なる生物に見いだされる任意の野生型または変異型のＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質と等価であるか類似した生物学的機能を有する、任意の生物に由来する任意の野生型または変異型のＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質を広く意味する。機能的類似性は配列相同性を必ずしも必要としない。アレルは、特定遺伝子のＤＮＡ配列の２つ以上の形態のうちの１つである。各遺伝子は、変異により、異なるアレルを有しうる。変異を何も持たない遺伝子を、変異を有する対応遺伝子と比較して、野生型アレルという。

【0044】

ホモログとは、共通する祖先ＤＮＡ配列からの出自によってもう一つの遺伝子と関係づけられる遺伝子である。ホモログという用語は、種分化の事象によって分離された遺伝子間の関係にも適用できるし、遺伝子重複の事象によって分離された遺伝子間の関係にも適用できる。オルソログとは、種分化によって共通する先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保つ。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測にとって極めて重要である。種分化は、新しい生き方をすることができる新しい種が、その起源となる種から発生することである。このプロセスの一部として、これは、親種との遺伝子交換に対する何らかの障壁も獲得している。パラログは、ゲノム内での重複によって関係づけられる遺伝子である。オルソログは進化の過程で同じ機能を保つが、パラログは、元の機能に関係するとはいえ、新しい機能を進化させる。

【0045】

「変化した活性」を有する遺伝子またはタンパク質は、関連する野生型遺伝子または野生型タンパク質と比較した場合に測定可能な性質に測定可能な相違を生じる遺伝子またはタンパク質と広く定義される。変化した活性は、一般的に、変化した遺伝子またはタンパク質を含有する株の増殖速度またはスクシネート生産効率の増加または減少として現れうる。他の測定可能な性質には、例えば酵素活性、酵素の基質特異性、酵素の速度論的パラメータ、例えば基質に対するアフィニティまたは速度、酵素の安定性、酵素の調節的性質、遺伝子発現レベル、さまざまな条件下での遺伝子発現の調節、１つ以上の阻害剤に対する感受性などがあるが、これらに限られるわけではない。

【0046】

本発明において使用される変異という用語は、オープンリーディングフレーム、上流調節領域および下流調節領域を含む遺伝子に対してなされる遺伝子修飾を指す。遺伝子変異は、その遺伝子のオープンリーディングフレームの転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションもしくは完全な阻害をもたらすか、変異型遺伝子がコードするタンパク質の活性の変化をもたらしうる。遺伝子変異は、遺伝子の全コード領域またはコードヌクレオチド配列の一部を欠失させるか、フレームシフト変異、ミスセンス変異、および挿入を導入するか、停止コドンを導入することによって、またはそれらの組み合わせによって達成することができる。変異は、酵素反応または細胞膜を横切る有機分子の輸送などといった生物学的機能に直接関与するタンパク質をコードする構造遺伝子中に存在しうる。あるいは、変異は、生物学的機能に直接関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする調節遺伝子中に存在しうる。他の遺伝子の発現を制御するタンパク質は調節タンパク質と呼ばれ、これらの調節タンパク質をコードする遺伝子は調節遺伝子と呼ばれる。

【0047】

「変異」には、関連する野生型生物と比較したＤＮＡ配列のいかなる変化も含まれるものとする。例えば、ＫＪ１２２株に見いだされる変異は、変異した領域のＤＮＡ配列をＡＴＣＣ８７３９としても知られる親野生型株大腸菌Ｃと比較した場合に見いだすことができるＤＮＡ配列の任意の変化である。変異は、任意の塩基対数の追加ＤＮＡの挿入、または任意の塩基対数のＤＮＡの欠失であることができる。挿入変異の一特定タイプは遺伝子重複である。遺伝子は自然変異事象によって重複されうるか（この場合、遺伝子の第２のコピーは元のコピーに隣接して配置されうる）、遺伝子は遺伝子工学によって重複されうる（この場合、遺伝子の第２のコピーは、元のコピーとは遠く離れたゲノム中の部位に配置されうる）。変異はある塩基タイプからもう一つの塩基タイプへの変化、例えばアデニンからグアニン塩基への変化であることができる。遺伝学の言葉でいうと、変異は、ミスセンス（これはあるコドンがコードするアミノ酸を変化させる）であるか、ノンセンス（これはあるコドンを停止コドンに変える）であるか、フレームシフト（これは、３の倍数ではないくつかの塩基の挿入または欠失であり、読み枠を変化させ、変異の下流でコードされているアミノ酸配列を変え、しばしば変異の下流に停止コドンを導入する）であるか、逆位（これは、ＤＮＡ配列が欠失するのではなく極性を入れ換えることによって起こる）であることができる。遺伝子名の前につく記号「Δ」は、その遺伝子のコード配列が完全にまたは部分的に排除されており、その遺伝子が機能的に不活性であることを示している。

【0048】

「ヌル変異」は、関連遺伝子の全オープンリーディングフレームの欠失と実質的に同一な表現型を付与する変異、または関連遺伝子の測定可能な活性を全て除去する変異である。

【0049】

「変異体」は、１つ以上の変異を含有するゲノムを持つ微生物である。

【0050】

本発明において使用する用語「外因性」は、細胞の外側に由来する分子または活性が宿主微生物中に導入されていることを意味するものとする。微生物細胞中に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立したプラスミドとして存在してもよいし、宿主染色体DNA中に組み込まれてもよい。タンパク質をコードする外因性核酸は、それ自身の調節配列、例えばプロモーター配列およびターミネーター配列と共に、発現可能な形態で微生物細胞中に導入することができる。あるいは、外因性核酸分子は、宿主染色体DNA中に組み込まれて、宿主調節配列の制御を受けることもできる。「内在性」という用語は、宿主細胞内に存在する分子および活性を指す。生合成活性に関して使用する場合、「外因性」という用語は、宿主参照生物中に導入された活性を指す。供給源は、例えば、宿主微生物への導入後に当該活性を発現する相同コード核酸または異種コード核酸であることができる。タンパク質をコードする核酸が同じ種の微生物から得られる場合、それを相同DNAという。核酸が異なる微生物種に由来する場合、それを異種DNAという。DNAの性質とは無関係に、それが相同であれ異種であれ、宿主細胞に導入された場合は、そのDNA、ならびに導入されたDNAに由来する活性を、外因性であるという。それゆえに、本発明のコード核酸の外因性発現には、異種コード核酸および相同コード核酸のどちらか一方または両方を利用することができる。

【0051】

本発明は、商業上有用な化学品の製造においてグリセロールを炭素源として使用することができる微生物を提供する。大腸菌細菌を使って本発明を実証するが、本発明は、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・アサイイ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｓａｉｉ）、アクロモバクター・デルマルヴェ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｌｍａｒｖａｅ）、アクロモバクター・ビスコーサス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アクロモバクター・ラクチカム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌａｃｔｉｃｕｍ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルスロバクター・ツメセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｍｅｓｃｅｎｓ）、アルスロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、オーレオバクテリウム・サペルダエ（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｐｅｒｄａｅ）、アゾトバクター・インディカス（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ジバリカタム（ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・グロボスム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ブレビバクテリウム・フスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ヘルコラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｌｃｏｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・プシラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｓｉｌｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・テスタセウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロセウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ）、ブレビバクテリウム・プロトファルミアエ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｐｈａｒｍｉａｅ）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・フカタム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｃａｔｕｍ）、フラボバクテリウム・アウランチナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・レナナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｅｎａｎｕｍ）、フラボバクテリウム・セワネンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｗａｎｅｎｓｅ）、フラボバクテリウム・ブレベ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ミクロコッカス属ＣＣＭ８２５（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＣＣＭ８２５）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ノルカジア・オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｐａｃａ）、ノルカジア・ルゴサ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｇｏｓａ）、プラノコッカス・ユーシナツス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｃｉｎａｔｕｓ）、プロテウス・レッゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、シュードモナス・シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｌａｎｓ）、シュードモナス・ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・テストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス属ＡＴＣＣ１５５９２（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ １５５９２）、ロドコッカス属ＡＴＣＣ１９０７０（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ １９０７０）、スポロサルチーナ・ウレエ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｕｒｅａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・メチニコフィイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）、ビブリオ・チロゲネス（Ｖｉｂｒｉｏ ｔｙｒｏｇｅｎｅｓ）、アクチノマヅラ・マヅレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）、アクチノミセス・ビオラセオクロモゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、キタサトスポリア・パルローサ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｐａｒｕｌｏｓａ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・フラベラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｅｌｕｓ）、ストレプトミセス・グリセオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ストレプトミセス・タナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・バージニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）、ストレプトミセス・アンチビオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・カカオイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｃａｏｉ）、ストレプトミセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・チアミノリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクイファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、エシェリキア・フロインデイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・シュトムレリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）およびキサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）を含む、広範な細菌種に応用することができる。本発明は、商業上有用な化学品の生産のために選択される酵母株、例えば限定するわけではないが、次に挙げる属から選択される酵母において、グリセロールを炭素源として使用する能力を付与するのにも有用である：サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルロスポラ（Ｔｏｒｕｌｏｓｐｏｒａ）、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）、クリプトカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｃｕｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サッカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）など。

【0052】

本発明において供給材料として使用されるグリセロールは、バイオディーゼル産業に由来するものであることができる。バイオディーゼル産業由来のグリセロールは、商業上有用な化学品を生産するための発酵プロセスにおけるその使用に先だって、その夾雑物を除去しておくことが好ましい。好ましい一実施形態では、グリセロールが、夾雑構成要素がごく少量であるグリセロールの生産につながる不均一系触媒が使用されるバイオディーゼル産業に由来する。エタノールやメタノールなどの一部の夾雑物は蒸留によって除去することができる。元のグリセロール原液の希釈は、夾雑物の効果を低減するもう一つのアプローチである。

【0053】

バイオディーゼル製造からのグリセロール副産物は、水、メタノールまたはエタノールなどのいくつかの少量夾雑化合物ならびにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン、硫酸イオン、およびリン酸イオンなどの塩イオンを含有することが知られている。この「粗」グリセロールを約５倍〜１０倍希釈すれば、夾雑化合物は、本発明の微生物を含む微生物が耐容性を示すはずの濃度にまで希釈されるであろう。それでもなお、発酵に先だって夾雑化合物を少なくとも部分的には除去することが好ましい。グリセロールは大量副産物であり、２つ以上のバイオディーゼル製造施設に由来するかもしれないので、バッチ間には何らかの予測不可能な変動性が存在するかもしれないし、そうであれば、一部のバッチまたはロットでは夾雑物のレベルが望ましくないものであるかもしれない。加えて、イオン性夾雑物は、発酵後の除去と比較して、発酵前に除去した方が費用がかからないかもしれない。所望の生成物（例えば有機酸）が夾雑物のうちの１つ以上を含まないことが望まれる場合は、その夾雑物を発酵前か発酵後のどちらかに除去しなければならない。例えば、生産される有機酸が化学修飾（例えば水素化）され、かつ／またはプラスチックに重合される予定である場合は、触媒を被毒から守るために、あらゆる形態の硫黄およびリンを、少なくとも部分的には除去しなければならない。もう一つの例として、メタノールまたはエタノールは、反応性基を一つしか持たないので、重合中に連鎖停止剤としても作用するかもしれない。

【0054】

メタノールやエタノールなどの低級アルコールは、蒸留および／または減圧によって除去することができる。イオン性夾雑物はイオン交換樹脂によって除去することができる。グリセロールは極端なｐＨでなければ無荷電であるから、粗グリセロールを、水素（Ｈ^＋）型で始まる陽イオン交換樹脂に通し、次に水酸化物（ＯＨ⁻）型で始まる陰イオン交換樹脂に通すか、その逆を行うことができる。あるいは、２タイプの樹脂の混合物を含んでいる混床式イオン交換樹脂に粗グリセロールを通すこともできる。２つの異なる樹脂を直列に使用することの方が混合床より好ましい。そのほうが樹脂の再生が容易だからである。イオン交換はカラムを使って行うか、バッチ式に行うことができる。グリセロールは、どちらのタイプの樹脂にも結合しないはずであるが、イオンは樹脂によって保持されるはずである。

【0055】

イオンは、他の周知の方法、例えば電気透析によって、またはグリセロールと望ましくない夾雑物とを識別することができる荷電膜もしくは非荷電膜を介したろ過によって、粗グリセロールから除去することもできる。グリセロールは蒸留または減圧蒸留によって精製することもできる。

【0056】

商業上有用な化学品の生産に適した微生物は、いくつかの異なる方法で得ることができる。好ましい一実施形態では、グリセロール以外の炭素源、例えばグルコースなどを使って特定の商業上有用な化学品を生産するために遺伝子工学と代謝的進化との混合プロセスによって得られた微生物細胞を、親株として使用する。例えば、コハク酸の商業的生産においてグリセロールを炭素源として使用することができる株を得るために、詳しく記述されている大腸菌のＫＪ１２２株（Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ｂ）を、親株として使用することができる。炭素源としてグリセロールを用いるコハク酸の生産に有用な株を作出するための第１段階では、ＫＪ１２２株を、グリセロールの取り込みおよび代謝を強化するための特異的遺伝子操作に付す。グリセロール代謝経路の遺伝子操作の後に、炭素源としてグリセロールを用いるコハク酸の生産に関して、商業的に魅力的な収量、力価、および生産性を持つ細菌株が得られるように、代謝的進化のプロセスを行うことができる。

【0057】

微生物細胞内でのグリセロール代謝経路に関する我々の現在の理解によれば、グリセロール代謝経路内で、遺伝子操作の適当なターゲットを同定することができる。図１に、微生物細胞内でのグリセロール代謝経路に関する我々の現在の理解の概要を示す。

【0058】

培養培地から微生物細胞中へのグリセロールの進入は、ｇｌｐＦ遺伝子がコードする促進拡散タンパク質によって媒介される。ひとたび細胞に入れば、グリセロールは、ジヒドロアセトンリン酸の形成につながる２つの異なるルートによって代謝される。嫌気条件下で活性であると考えられる一方の経路では、ｇｌｄＡ遺伝子がコードするグリセロールデヒドロゲナーゼによる作用を、グリセロールが受ける。グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールの酸化は、ＮＡＤＨの形成を伴って、ジヒドロキシアセトンを与える。次の段階では、ｄｈａＫＬＭがコードするホスホエノールピルビン酸依存性またはＡＴＰ依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼによって、ジヒドロキシアセトンがリン酸化される。このリン酸化反応は、ジヒドロキシアセトンリン酸の形成につながる。グリセロール代謝のためのこの経路は、グリセロール代謝のための非古典的経路と呼ばれる。

【0059】

好気条件下またはナイトレートもしくはフマレートなどの代替的電子受容体が存在する嫌気条件下で作動すると考えられる微生物細胞内のグリセロール代謝のためのもう一つのルートでは、グリセロールがリン酸化されてグリセロール−３−リン酸を生じる。次のステップでは、ＧｌｐＤまたはＧｌｐＡＢＣがコードするグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼによってグリセロール−３−リン酸が酸化されて、ジヒドロキシアセトンリン酸が形成されることになる。グリセロール代謝のためのこの経路は、グリセロール代謝のための古典的経路と呼ばれる。

【0060】

グリセロール代謝のための古典的経路と非古典的経路の両方によって生じたジヒドロキシアセトンは、トリオースリン酸イソメラーゼの作用を受けて、グリセルアルデヒド−３−リン酸が形成されることになる。こうして形成されたグリセルアルデヒド−３−リン酸は、解糖経路の残りの部分を通って、最終的にトリカルボン酸サイクルに入り、解糖、発酵およびトリカルボン酸サイクル経路中で起こった遺伝子変化の性質に基づいていずれかの代謝中間体の蓄積をもたらしうる。

【0061】

グリセロール代謝のための古典的経路と非古典的経路は、関与する酵素および補因子の性質の相違だけでなく、これらの２つのグリセロール代謝経路の作動を制御する調節の性質も互いに異なる。

【0062】

古典的グリセロール経路は２つの異なる方法で調節される。第１に、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、ｇｌｐＤ、およびｇｌｐＡＢＣの発現は、全て、中間体Ｇ３Ｐの存在下で、ｇｌｐＲがコードするタンパク質によって抑制される。第２に、ＧｌｐＫ酵素は、フルクトース１，６二リン酸によって阻害され、またホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の構成要素である酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃ（ＥＩＩＡ^Ｇｌｃとも呼ばれ、以前は酵素ＩＩＩ^ＧｌｃまたはＥＩＩＩ^Ｇｌｃと呼ばれた）（これは大腸菌の場合であればｃｒｒ遺伝子によってコードされる）の非リン酸化型によって阻害される。これらの調節機序の結果は、培地中にグルコースが存在する場合には、グリセロールの利用が強く阻害されるということである。細胞をグルコースの存在下で増殖させると、ＧｌｐＫの阻害剤の濃度はどちらも増加する。この特許出願においては、フルクトース１，６二リン酸またはＥＩＩＡ^ＧｌｃによるＧｌｐＫ活性の阻害をフィードバック阻害または負の調節機序という。「調節解除されたグリセロール経路」という用語は、グリセロール資化のための経路であって、グリセロール資化経路に対して作動する１つ以上の負の調節機序が、宿主生物における遺伝的変化によって、機能低下しているか、または完全に除去されているものと定義される。そのような遺伝的変化には、例えば１）ＧｌｐＲなどのリプレッサーの機能に関する減少または排除、２）フルクトース−１，６−二リン酸などの代謝中間体による、または酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃなどのホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）構成要素の非リン酸化型などといったタンパク質による、ＧｌｐＫなどのグリセロールキナーゼの阻害の一部または全部の軽減、３）例えばグルコースを輸入または代謝する細胞の能力を減少させることなどによる、グリセロール資化のグルコース阻害の減少、および／または４）ｇｌｐＤ、ｇｌｐＦＫＸおよび／またはｇｌｐＡＢＣなどのグリセロール資化遺伝子またはオペロンのネイティブプロモーターを、ｇｌｐＲ遺伝子がコードするＧｌｐＲタンパク質による抑制を受けない、より強いまたはより構成的なプロモーターで置き換えることなどがあるが、これらに限られるわけではない。いくつかの構成的に活性なプロモーターが当技術分野ではよく知られており、本発明では、それらをどれでも、野生型細菌細胞においてＧｌｐＲタンパク質の制御下にあるｇｌｐＦＫＸ、ｇｌｐＤ、およびｇｌｐＡＢＣ遺伝子／オペロンのネイティブプロモーターを置き換えるために使用することができる。構成的に活性なプロモーターによる任意の遺伝子のネイティブプロモーターの置き換えは、微生物遺伝子工学の分野においてよく知られているいずれかの遺伝子工学技法を使って、例えばｃａｔ，ｓａｃＢカセットの挿入によってネイティブプロモーターを置き換え、次にそれを、当技術分野において周知の構成的に活性なプロモーター配列で置き換える、実施例６に記載の２ステップアレル置換法などを使って、達成することができる。

【0063】

Ｇ３Ｐもしくは非リン酸化酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃまたはその両者によるフィードバック阻害に対して耐性なｇｌｐＫの変異体アレルの報告はいくつかある（Ｂｅｌｌ，１９７４；Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。これらのアレルの一部は、元々は、グルコース＋グリセロールでの増殖に関する選択によってＧ３Ｐ栄養要求体から得られたＢＢ２０−１４およびＢＢ２６−３６と呼ばれる株において、ＣｒｏｎａｎおよびＢｅｌｌによって分離されたものである（Ｃｒｏｎａｎ ａｎｄ Ｂｅｌｌ， １９７４ａ；Ｃｒｏｎａｎ ａｎｄ Ｂｅｌｌ，１９７４ｂ）。これらの株は、フィードバック耐性グリセロールキナーゼを含有すると推定された。これらの株からのｇｌｐＫ遺伝子のＤＮＡ配列は、今までのところ公表されていない。エール大学（米国コネチカット州ニューヘブン）のＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）は、これら２つの株を提供することができ、キュレーターは、これら２つの株のアレルを、それぞれｇｌｐＫ１５（ｆｂＲ）およびｇｌｐＫ１４（ｆｂＲ）と名づけている。簡単にするために、本明細書では、これらのアレルをそれぞれｇｌｐＫ^ｉ１５およびｇｌｐＫ^ｉ１４と呼ぶことにする。ここで、上付きの「ｉ」は、フィードバック阻害に対する非感受性を表す。

【0064】

ｇｌｐＫ^ｉ２２と名付けられたｇｌｐＫのもう一つのフィードバック耐性アレルは、Ｌｉｎ４３と名付けられた株において、ＺｗａｉｇおよびＬｉｎが初めて分離したものであり（Ｚｗａｉｇ ａｎｄ Ｌｉｎ，１９６６）、後にＰｅｔｔｉｇｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６）らによって特徴づけられ、配列決定された。この変異体は、グルコースの存在下で放射性グリセロールを取り込むその能力によって同定された。

【0065】

ｇｌｐＫのフィードバック耐性アレルを分離する際にとられたもう一つのアプローチは、一定のＰＴＳ変異の抑制について選択することであった（Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎ，１９７１）。このアプローチにより、フルクトース１，６−二リン酸による阻害に対して耐性であるグリセロールキナーゼを含有するＬｉｎ２２５株が生じたが、この株からのｇｌｐＫ遺伝子が特徴づけられることはなかった。Ｌｉｎ２２５株中のｇｌｐＫアレルは、エール大学のＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒにより、ｇｌｐＫ^ｉ３１と名付けられた。

【0066】

グリセロールに基づく増殖培地への適応中に選択的増殖優位性を伝達する変異の獲得および固定を監視するための大腸菌の全ゲノム配列決定により、グリセロールキナーゼの遺伝子における一連の変異が同定された（Ｉｂｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｈｏｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。変異体ｇｌｐＫ遺伝子を発現する細胞からの部分精製タンパク質は、グリセロールキナーゼ酵素に関して野生型より５１％〜１３３％高い反応速度を示し、一部の変異体は、フルクトース−１，６−二リン酸によるグリセロールキナーゼの阻害に低減を示した（Ｈｅｒｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0067】

本発明において、フィードバック耐性グリセロールキナーゼは、フルクトース１，６−二リン酸の存在下もしくは同じ生物に由来するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）構成要素である酵素ＩＩＡ^Ｇｌｃの非リン酸化型の存在下または両阻害剤の存在下で、関連する野生型酵素よりも高い比活性を有するグリセロールキナーゼと定義される。フィードバック耐性は、グリセロールキナーゼ酵素、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、またはグリセロールキナーゼのアレルを議論する際に言及することができる。

【0068】

このように、当技術分野では、フィードバック耐性ｇｌｐＫアレルを分離するための方法が４つ知られている：（１）グルコース＋グリセロールにおけるＧ３Ｐ栄養要求体の増殖に関する選択、（２）グルコースの存在下での放射性グリセロールの取り込み、（３）ＰＴＳ酵素Ｉ変異体の抑制、（４）最少グリセロール培地におけるより迅速な増殖についての選択（Ｂｅｌｌ，１９７４；Ｚｗａｉｇ ａｎｄ Ｌｉｎ，１９６６；Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎ，１９７１；Ｈｏｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）。フィードバック耐性ｇｌｐＫアレルを分離する際に、本発明では、これら４つの方法をどれでも使用することができる。本発明において提供される例は大腸菌に基づくが、任意の細菌種、特にクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、およびシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属の他の任意の細菌種において、同様のアプローチをとることができる。

【0069】

これらのｇｌｐＫのフィードバック耐性アレルはどれでも、特定の商業上重要な化学品の生産用に既に開発されている細菌株における野生型ｇｌｐＫ遺伝子を置き換えるために使用することができる。コハク酸の商業的生産用に既に開発されている大腸菌のＫＪ１２２株中の野生型ｇｌｐＫ遺伝子を、フィードバック阻害に対して耐性である変異体ｇｌｐＫアレルで置き換えることができる。あるいは、ｇｌｐＫの変異体アレルによる野生型ｇｌｐＫ遺伝子の置き換えを野生型大腸菌で行い、その結果生じたｇｌｐＫの変異体アレルを持つ細菌株を、コハク酸の商業的生産のための株を開発する際の親株として使用することができる。

【0070】

ｇｌｐＫの変異体アレルによるｇｌｐＫの野生型アレルの置き換えは、微生物遺伝子工学の分野においてよく知られているいずれかの遺伝子工学技法を使って達成することができる。一般的には、親株中の野生型ｇｌｐＫ遺伝子をまず、その座位に抗生物質マーカー遺伝子を挿入することによって置き換える。第２段階では、その抗生物質マーカー遺伝子を、ｇｌｐＫの変異体アレルで置き換える。ｇｌｐＫの変異体アレルは、バクテリオファージを介した形質導入プロセスを使って、ｇｌｐＫの変異体アレルを有するとされる株から受容株へと移すことができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、受容株からプラスミドベクター中に、または直接、染色体中に、変異体アレルをクローニングすることもできる。その場合は、変異体ｇｌｐＫアレルを持つプラスミドベクターを使って、受容細菌株を形質転換することができる。本発明のもう一つの態様では、ｇｌｐＫ遺伝子中の変異の性質がヌクレオチドレベルでわかっている場合に、合成オリゴヌクレオチドによるインビトロ変異導入を使って、プラスミドベクター中に変異体ｇｌｐＫアレルを作製する。プラスミドベクターからの変異体ｇｌｐＫアレルを使って、形質転換によって野生型ｇｌｐＫアレルを置き換え、次に二重組換えを行うことができる。あるいは、線状ＤＮＡフラグメント上に含まれる変異体ｇｌｐＫアレルを使って、形質転換によって野生型ｇｌｐＫアレルを置き換え、次に二重組換えを行うこともできる。

【0071】

本発明のもう一つの実施形態では、グリセロール経路の調節解除が、ｇｌｐＲ遺伝子がコードするリプレッサータンパク質ＧｌｐＲによるｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、およびｇｌｐＡＢＣ遺伝子の発現の抑制を克服することによって付与される。ＧｌｐＲタンパク質の抑制効果は、２つの異なる方法によって克服することができる。第１の方法では、ＧｌｐＲタンパク質がｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、およびｇｌｐＡＢＣ遺伝子の発現抑制にはもはや有効でなくなるように、ｇｌｐＲ遺伝子配列が改変される。好ましい実施形態では、ＧｌｐＲタンパク質の合成そのものが阻害される。ＧｌｐＲタンパク質合成の阻害は、ｇｌｐＲ遺伝子配列の挿入不活化によって達成することができる。例えば、抗生物質マーカーカートリッジを、ＧｌｐＲタンパク質がもはや生産されなくなるように、ｇｌｐＲオープンリーディングフレームに挿入することができる。最も好ましい実施形態では、ｇｌｐＲオープンリーディングフレームが正確に除去され、この座位には外来ヌクレオチド配列が残っていない。

【0072】

微生物細胞内のグリセロール資化経路が完全に調節解除されていることを確実にするには、機能的なｇｌｐＲ遺伝子を完全に排除することに加えて、フィードバック耐性ｇｌｐＫアレルを持っておくことが好ましい。これら２つの遺伝子修飾を野生型細菌株で行うことにより、完全に調節解除されたグリセロール資化経路を持つ親細菌株を作出することができる。次に、グリセロール資化経路が完全に調節解除されている親細菌株を、さらに特異的遺伝子修飾と代謝的進化とに付して、コハク酸や乳酸などの特定代謝産物の生産に関して高い収量および生産性を有する細菌株を得ることができる。好ましい実施形態では、ｇｌｐＲ遺伝子の不活化およびｇｌｐＫのフィードバック耐性アレルの導入が、特定の商業上有用な化学品を生産するために既に遺伝子改変され代謝的に進化させた株で行われる。例えば、ｇｌｐＲ遺伝子の不活化およびｇｌｐＫ遺伝子のフィードバック耐性アレルの導入は、炭素源としてグルコースを用いるコハク酸生産のために既に開発されている大腸菌のＫＪ１２２株で行うことができる。

【0073】

もう一つの実施形態では、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、およびｇｌｐＡＢＣ遺伝子発現のＧｌｐＲによる抑制が、ＧｌｐＲリプレッサータンパク質による調節に対して感受性であるｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ、およびｇｌｐＡＢＣ遺伝子のネイティブプロモーター領域を、ＧｌｐＲタンパク質による抑制に対して感受性でない構成的プロモーターで置き換えることによって克服される。好ましい一実施形態では、ＧｌｐＲによる抑制に対して感受性でない構成的プロモーターを持つ細菌株において、ｇｌｐＫ遺伝子の野生型アレルを、フィードバック耐性ｇｌｐＫアレルで置き換える。グリセロール資化経路の調節解除につながるこれら２つの遺伝子修飾は、野生型細菌株において行うことができ、それにより、調節解除されたグリセロール資化経路を持つ親株の形成がもたらされる。グリセロール資化経路が調節解除されているそのような親株を、遺伝子操作および代謝的進化にさらに付して、炭素源としてグリセロールを用いて商業上有用な化学品を生産する能力を有する細菌株を作出することができる。あるいは、具体的化学品の商業的生産のために既に開発されている細菌株において、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫおよびｇｌｐＡＢＣ遺伝子のネイティブプロモーターを、詳細の明らかな、構成的に活性なプロモーターで置き換えること、およびｇｌｐＫの野生型アレルをフィードバック耐性ｇｌｐＫアレルで置き換えることもできる。

【0074】

本発明の微生物は、マイクロエアレーションを行っている発酵培地中で増殖させる。本発明における好ましい酸素の供給速度（３Ｌの出発体積において空気の形態で４０ｍｌ／分）は、発酵槽中の培地の出発体積に基づいて、約０．００２６／分であり、これは、約２２８ｍｇ／リットル−時の酸素に相当する。この速度は、ＴｒｉｎｈおよびＳｒｉｅｎｃの先行技術（２００９）が提唱している至適速度（０．１５／分であると述べられている）よりかなり低く、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＣａｍｐｂｅｌｌの先行技術（ＷＯ／２０１０／０５１３２４）が提唱している至適濃度（１〜２０ｍｇ／リットル−時と報告されている）よりかなり高い。

【0075】

本明細書において使用する用語「遺伝子改変」または「遺伝子工学」は、微生物のゲノムＤＮＡまたはプラスミドを操作することによって微生物中の１つ以上の酵素の発現を改変させる行為を指す。ゲノム操作は、特異的ＤＮＡ配列の改変、付加またはゲノムＤＮＡからの除去を伴う。遺伝子操作は、微生物のゲノムＤＮＡ配列への外来ＤＮＡ配列の挿入も伴う。本発明の最も好ましい実施形態では、遺伝子操作の一部が、外来ＤＮＡを何も導入することなく微生物のゲノムＤＮＡから特異的ＤＮＡ配列を除去することによって達成される。特定タンパク質産物をコードする遺伝子の発現を不活化するために必要な一定の遺伝子操作は、微生物のゲノムへの外来ＤＮＡ配列の挿入を必要とする。本発明の最も好ましい実施形態では、遺伝子工学プロセスが終わった時点で微生物がその元のゲノムＤＮＡ中に外因性ＤＮＡを何も持たないように、導入された外因性ＤＮＡ配列は、最終的には、微生物のゲノムＤＮＡから除去される。本発明の好ましい実施形態の目的を達成するために必要なさまざまな技法は、代謝的進化のためのプロセスを含めて、Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ（２００８ａ，２００８ｂ）に詳述されている。米国特許第７，６２９，１６２号および米国特許出願公開第２００９／０１４８９１４号ならびに特許協力条約に基づいて国際公開第２００８／１１５９５８号および同第２０１０／１１５０６７号として公開された国際特許出願にも、本発明のさまざまな実施形態を実施する際に役立つ遺伝子工学技法が記述されている。言及したこれらの科学文献ならびに特許文書は、本発明に役立つ遺伝子光学技法に関する詳細を提供する目的で、引用により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0076】

実施例1
ＫＪ１２２株におけるグリセロール取り込みおよびグリセロール資化の負の調節の除去
細菌株の平板選択、試験管におけるスクシネート生産、またはｐＨ制御発酵槽におけるスクシネート生産には、３つの異なる最少培地を使用することができる。最少培地を表１に列挙する。リッチなブロスまたはプレートは「ＬＢ」とも呼ばれるルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロスとした（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム）。以下の株をエール大学（コネチカット州ニューヘブン）のＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から入手した：ＪＷ３３８６−１（ΔｇｌｐＲ：：ｋａｎ）およびＪＷ３８９７−１（ΔｇｌｐＫ：：ｋａｎ）。Ｐ１ｖｉｒによる普遍ファージ形質導入を使って、ＪＷ３８９７−１からのΔｇｌｐＫ：：ｋａｎアレルをＫＪ１２２に組み入れて、ＬＢ中の５０ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン＋２５ｍＭクエン酸ナトリウムを使ってカナマイシン耐性について選択し、グリセロールを唯一の炭素源とする最少プレートでの増殖の欠如によってΔｇｌｐＫ：：ｋａｎの正しい組み入れを確認した（図２）。結果として生じた株をＲＹ８１２と名づけた。並行して、ＢＢ２０−１４株（イリノイ大学シャンペーン−アーバナ校（イリノイ州）のＪｏｈｎ Ｃｒｏｎａｎから入手）中に存在する野生型ラムダプロファージを、選択用のＮ：：ｋａｎを含む欠損ラムダプロファージを含有する供与株としてのＴＡＰ１０６株（ＡＴＣＣ４７０７５としても知られている）からのＰ１ｖｉｒ形質導入によって取り除き、上述のようにカナマイシン耐性について選択することによってＲＹ８０８株を得た。第２ステップでは、ｇｌｐＫ^ｉ１５アレルを含有するＲＹ８０８からのｇｌｐＫ領域をＲＹ８１２に形質導入し、最少ＳＳグリセロールプレート（表１参照）での増殖について選択し、カナマイシン耐性の喪失について確認することにより、ＲＹ８２９Ｃ株を得た。第３ステップでは、ＪＷ３３８６−１のΔｇｌｐＲ：：ｋａｎアレルをＲＹ８２９Ｃに形質導入し、上述のようにカナマイシン耐性について選択することで、ＲＹ８１９Ｊ株を得た。これは、隣接するｐｃｋ＊アレルを保っていることが示される分離株であった（Ｚｈａｎｇら ２００９ａ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ｂ）。
実施例２
試験管におけるグリセロールからのスクシネートの生産
ＫＪ１２２株およびＲＹ８１９Ｊ株をルリアブロス中で好気的に終夜増殖させた後、スクリューキャップ付き１５ｍｌポリプロピレン試験管中の、２０ｇ／ｌグリセロールを含有する１２．５ｍｌのＮＢＳ培地に、ＯＤ_６００が０．０５になるように接種した。管に固く蓋をして、３７℃、約６０ｒｐｍで４８時間、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃローラードラム上で転がした。Ｃｏｓｔａｒスピンフィルターによる遠心分離で細胞を除去することによって培養試料を調製し、必要に応じて０．００８Ｍ硫酸に希釈し、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔモデル１２００装置を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。カラムを５０℃で稼働し、０．００８Ｍ硫酸を溶媒とし、検出は屈折率と２１０ｎｍにおける吸収との両方によった。試料を、コハク酸、グリセロール、グルコース、アセテート、および他の副産物の濃度について分析した。各化学品の濃度は純粋な市販化合物で作成した標準曲線を使って算出した。ＫＪ１２２は０．０６ｇ／ｌのスクシネートを生産したが、ＲＹ８１９Ｊは０．６１ｇ／ｌのスクシネートを生産し、出発株からの改良は明白だった。

【0077】

実施例３
ＲＹ８１９Ｊの代謝的進化
ＲＹ８１９Ｊ株を、１０ｇ／ｌグルコースおよび１０ｇ／ｌグリセロールを含有するＮＢＳ培地中で好気的に終夜増殖させてから、５０ｇ／ｌグリセロールおよび５０ｇ／ｌグルコースを含有する３００ｍｌのＡＭ１培地（表１参照）が入っている作業容積５００ｍｌの有蓋発酵槽に、出発ＯＤ_６００が０．２になるように接種した。磁気撹拌子を使って発酵槽を１５０ｒｐｍで撹拌したが、意図的な通気は行わなかった。このように発酵槽は厳密な嫌気性ではなかった。試料採取中に、また塩基添加から、多少の空気は入ることができるからである。ｐＨは３Ｍ炭酸カリウムの添加によって６．５に制御し、温度は４０℃に維持した。スクシネートを約４８時間生産した。グリセロールとグルコースは並行して消費されたが、４８時間後は、グリセロールの一部が残っていた。最終細胞密度は約３．０のＯＤ_６００であった。同じ培地を使用し、第１発酵槽からの試料を使って、出発ＯＤ_６００が０．２になるように第２発酵槽に接種し、増殖とスクしネート生産を再開した。この再接種手順を本明細書では「継代（ｔｒａｎｓｆｅｒ）」と呼ぶことにする。スクシネート生産が止まった後に、第３発酵槽への接種物の２回目の継代を上述のように行い、その後、さらに数回の継代を行った。最初の数回の継代中は、増殖を刺激するために、グルコースが培地中に存在した。一般に、最初の数回の継代では、ある程度のグルコースまたは硝酸カリウムが存在しない限り、増殖が遅かったので、後続の継代のために十分な増殖が得られるように、グルコースまたは硝酸塩をさまざまな時点で発酵槽に加えて、増殖を増強した。最初の４回の継代は５０ｇ／ｌグルコース＋５０ｇ／ｌグリセロールで開始した。第５〜９継代は５０ｇ／ｌグリセロールだけで開始し、グルコースを含まなかったが、次の継代のために十分な増殖が得られるように、発酵中に１０ｇ／ｌグルコースを加えた。第１０継代では、まず１ｇ／ｌ硝酸カリウムを補足し、後に１０ｇ／ｌグルコースを補足した。添加物および発酵槽への添加の時点を、表２に要約する。１１回目の継代からは、グルコースも硝酸塩も培地に加えず、唯一の炭素源を５０ｇ／ｌグリセロールとした。それでも、ようやく、継代を行うのに十分な増殖が得られた。試料をさまざまな時点で、上述のようにＨＰＬＣで、分析した。第１１継代では、３８４時間後に、グリセロールの全てが消費されており、スクシネート力価は４２５ｍＭであった。これは、塩基による希釈後に、消費されたグリセロール１グラムあたり１．０８グラムのスクシネートという収量を与えることになると計算された。さらに３回の継代を行ったが、コハク酸生産に関して株の性能のさらなる有意な改良は見られなかった。１４回目の継代から単一コロニーを分離し、その分離株をＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４と名づけた（図２）

【0078】

実施例４
さまざまなｇｌｐＫアレルのＤＮＡ配列決定
ここで使用した株の多くの元となった大腸菌Ｃ（ＡＴＣＣ８７３９）および大腸菌Ｋ−１２のｇｌｐＦＫＸオペロンの野生型ＤＮＡ配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセッション番号ＮＣ＿０１０４６８およびＮＣ＿０００９１３に、それぞれ見出すことができる。

【0079】

ｇｌｐＦ遺伝子のほぼ半分とｇｌｐＸ遺伝子の半分とに囲まれたｇｌｐＫ遺伝子を、次の大腸菌株からのゲノムＤＮＡを使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：ＢＢ２０−１４、ＢＢ２６−３６、Ｌｉｎ２２５およびＬｉｎ２９８。最後の３株は全て、エール大学（コネティカット州ニューヘブン）のＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から入手した。ＣＧＳＣによれば、これら４つの株、すなわちＢＢ２０−１４、ＢＢ２６−３０、Ｌｉｎ２２５およびＬｉｎ２９８はそれぞれ、なかんずく、ｇｌｐＫ^ｉ１５、ｇｌｐＫ^ｉ１４、ｇｌｐＫ^ｉ３１、およびｇｌｐＫ^ｉ２２を含有している。これらのうち、ｇｌｐＫ^ｉ２２だけが配列決定されいて、Ｇ３０４Ｓアミノ酸変化が明らかになっていた（Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗら， １９９６；Ｈｏｎｉｓｃｈら， ２００４）。しかしこの配列は、ＣＧＳＣからは入手できないＬｉｎ４３株に由来するものであった。そこで本発明者らは、入手可能であってＬｉｎ４３に由来するとされているＬｉｎ２９８を使用した。増幅に使用したＰＣＲプライマーは、ＢＹ１９（配列番号１）およびＢＹ４４（配列番号２）である。ＰＣＲプライマーおよびシークエンスプライマーのＤＮＡ配列を表３に掲載する。ＰＣＲ用の試薬類はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓのＰｈｕｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘであり、これらを供給者の推奨どおりに使用した。その結果生じた、ＢＢ２０−１４、ＢＢ２６−３０、Ｌｉｎ２２５およびＬｉｎ２９８からの平滑末端ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、それをｐＲＹ５２１（配列番号１０）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングすることで、それぞれプラスミドｐＭＨ４−２０、ｐＭＨ４−２６、ｐＭＨ４−２２５、およびｐＭＨ４−２９８を得た。

【0080】

これらのプラスミドのそれぞれからのｇｌｐＫ遺伝子および隣接配列を、シークエンスプライマーＢＹ１５（配列番号３）、ＢＹ１６（配列番号４）、ＢＹ１９（配列番号１）、ＢＹ３０（配列番号６）、およびＢＹ４４（配列番号２）を用いるサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）チェーンターミネーション法によって配列決定した。４つのプラスミドのうちの３つがｇｌｐＫコード領域に変異を含有していた。本明細書に掲載するＤＮＡ配列位置情報は全て、オープンリーディングフレームの最初の塩基を１と数え、アミノ酸位置情報は全て開始コドンを１と数えている。３文字アミノ酸コードについては、２００７−２００８ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇの３６１頁を参照されたい。ｐＭＨ４−２０はｇｌｐＫ中に２つの点変異（Ｇ１６３Ａ；Ａｌａ５５ＴｈｒおよびＧ４７０Ａ；Ａｒｇ１５７Ｈｉｓ）を持ち、意外にも、ｇｌｐＦ中に単一の点変異（Ｃ８２１Ｔ；Ｐｒｏ２７４Ｌｅｕ）を持っていた。

【0081】

ｐＭＨ４−２６は、ｇｌｐＫ中に単一の点変異（Ｃ１６４Ｔ；Ａｌａ５５Ｖａｌ）を持ち、意外にもｇｌｐＦ中に単一の点変異（Ｇ７２４Ａ；Ｖａｌ２４２Ｉｌｅ）を持っていた。ｐＭＨ４−２２５は、ｇｌｐＫ中に単一の点変異（Ｃ１７６Ａ；Ｓｅｒ５９Ｔｙｒ）を持っていたが、ｇｌｐＦ中には変異を持っていなかった。ｐＭＨ４−２９８は配列決定した領域には変異を持っていなかった。最後の結果は、Ｌｉｎ２９８株がＬｉｎ４３と同じｇｌｐＫ変異（上記参照）を持つはずであることを暗示する公表文献と矛盾する。本発明者らが使用したＬｉｎ２９８の分離株はどういうわけかｇｌｐＫ^ｉ２２アレルを失っていたか、あるいは本発明者らの分離株が実際にはＬｉｎ２９８株ではなかったか、あるいはＬｉｎ２９８は実際にはＬｉｎ４３に由来していなかったと思われる。

【0082】

上記の結果の最も可能性が高い解釈は、ｇｌｐＫ遺伝子中の点ミスセンス変異が、コードされているＧｌｐＫ酵素の実証されたフィードバック耐性または推定されるフィードバック耐性の説明になるということである。ｇｌｐＫ^ｉ１５アレルは２つの別個の変異を含有したので、どちらか一方の変異が単独でフィードバック耐性表現型を付与しうることが考えられるが、いずれにせよ、本発明者らは、ＢＢ２０−１４におけるグリセロールキナーゼのフィードバック耐性表現型にはこれら２つの変異の組み合わせで十分であると結論付けることができた。

【0083】

上記プラスミドに加えて、２つの類似プラスミドをＫＪ１２２およびＲＹ８１９ＪのｇｌｐＫ領域から構築することで、それぞれｐＭＨ４−ＫＪおよびｐＭＨ４−ＲＹ８１９を得た。クローニングされたインサートのＤＮＡ配列は予想どおりだった。ｐＭＨ４−ＫＪは野生型ｇｌｐＫおよびｇｌｐＦ配列を含有し、一方、ｐＭＨ４−ＲＹ８１９は、ｇｌｐＫ中の２つの点変異およびｇｌｐＦ中の単一の点変異を含めてｐＭＨ４−２０と同一の配列を含有していた。

【0084】

実施例５
ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４からのカナマイシン耐性遺伝子の除去
ＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４株は、「Ｋｅｉｏ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」のメンバーであるＪＷ３３８６−１株（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）から形質導入されたΔｇｌｐＲ：：ｋａｎアレルを含有している。したがって、ヘルパープラスミドｐＣＰ２０をこの株に通すことによって、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎを除去して、短いＤＮＡ「痕（ｓｃａｒ）」を残すことができる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ， ２０００）。このプロセスをＲＹ８１９Ｊ−Ｔ１４で行ったところ、カナマイシン感受性誘導体ＭＨ２３株が生じた。

【0085】

実施例６
ＲＹ８１９Ｊおよび子孫のｇｌｐＦ遺伝子に見いだされる変異の矯正
ＢＢ２０−１４株のｇｌｐＦ遺伝子には点変異が見つかった。この変異はｇｌｐＫ遺伝子と密に連鎖しているので、ＲＹ８１９Ｊに組み入れられることになり、ＭＨ２２株にも伝達された（実施例１および５参照）。Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００８ａ，２００８ｂ）に記載されているものと類似する２ステップ遺伝子置換法を使ってこの領域を野生型ＤＮＡ配列で置き換えることにより、ｇｌｐＦ中の変異を取り除いた。第１ステップでは、テンプレートとしてのｐＣＡ２（配列番号１１）とプライマーＢＹ７１（配列番号６）およびＢＹ７２（配列番号７）とを用いるＰＣＲによって、ｃａｔ，ｓａｃＢカセットを増幅した。その結果生じた３．２キロベースＤＮＡフラグメントを、ヘルパープラスミドｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，２０００）を含有するＭＨ２３株に形質転換し、ＬＢ＋３０ｍｇ／ｌクロラムフェニコール上でクロラムフェニコール耐性について選択することで、ＭＨ２７株（ｇｌｐＦ：：ｃａｔ，ｓａｃＢ）を得た。第２ステップでは、テンプレートとしての大腸菌Ｃ（ＡＴＣＣ８７３９）ＤＮＡとプライマーＢＹ７３（配列番号８）およびＢＹ７４（配列番号９）とを用いるＰＣＲによって、野生型ｇｌｐＦ領域を増幅した。その結果生じた１．７キロベースＤＮＡフラグメントをＭＨ２７に形質転換し、ＬＢ＋６％スクロース上でスクロース耐性について選択し、ＬＢ＋３０ｍｇ／ｌクロラムフェニコール上でクロラムフェニコール感受性について確認した。その結果生じた株を、ｐＫＤ４６の除去後に、ＭＨ２８と名づけた（図３）。ＭＨ２８のｇｌｐＦおよびｇｌｐＫ領域を配列決定することで、野生型ｇｌｐＦが組み入れられていること、およびｇｌｐＫ中のフィードバック耐性変異が、株構築の全ステップを通して保持されていることを確認した。

【0086】

実施例７
ｐＨ制御発酵槽におけるＫＪ１２２およびＭＨ２８によるグリセロールからのスクシネートの生産
出発株ＫＪ１２２および派生株ＭＨ２８を、７リットルＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ発酵槽におけるスクシネート生産について、接種物を含む３．１５リットルの出発容積で評価した（図５および６）。２０ｇ／ｌグリセロールと０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）とを含有するＮＢＳ培地（表１参照）を使って、１５０ｍｌの接種物を、振とうフラスコ中で好気的に終夜増殖させた。その接種物を、名目上１２０ｇ／ｌグリセロール（Ａ．Ｃ．Ｓ．グレード、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号５０９２−０２、ＣＡＳ番号５６−８１−５）を唯一の炭素源として含む３リットルの発酵培地（表１参照）が入っている発酵槽に加えた。時刻０および発酵の終了時におけるグリセロール濃度の測定値については表４を参照されたい。温度は３９℃に保ち、必要に応じて３Ｍ炭酸カリウムをポンプ注入することによってｐＨを７．０に保った。マイクロエアレーションは、空気を４０ｍｌ／分の速度（この速度は、通気速度を体系的に変化させることによって、魅力的なスクシネート生産レベルにとって十分であることが示された）でポンプ注入することによって一定にした。インペラー速度は７５０ｒｐｍとした。

【0087】

試料を採取し、上述のようにＨＰＬＣを使って、有機酸およびグリセロールについてアッセイした。ＭＨ２８株では、４８時間までに、グリセロールが完全に消費されたが、親株ＫＪ１２２ではそうならなかった（表４参照）。ＭＨ２８は８４．３ｇ／ｌのスクシネートを生産し、収量は１．０ｇ／ｇ−消費グリセロールであった。唯一際立った副産物は３．３ｇ／ｌのアセテートであった。対照的に、出発株であるＫＪ１２２は１８．９ｇ／ｌのスクシネートしか作らず、４８時間の時点で最終ブロスに８３．５ｇ／ｌのグリセロールが残ったので、スクシネート収量は０．６ｇ／ｇ−消費グリセロールになった。試験した条件では、ＭＨ２８株が、スクシネート生産に関して、ＫＪ１２２株よりはるかに改良されていることは明らかである。

【0088】

当技術分野の科学者であれば、本明細書に記載した方法を使って、ＭＨ２８に類似しているが、フィードバック耐性グリセロールキナーゼをコードするｇｌｐＫ遺伝子の他のアレルを含有する株を、構築することができるであろう。考えられるアレルは、例えばｇｌｐＫ^ｉ１４、ｇｌｐＫ^ｉ２２、およびｇｌｐＫ^ｉ３１アレル、ならびにＨｏｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）に記載のアレルなど、上でいくつか言及した。例えば、グリセロールキナーゼにおけるアミノ酸変化：Ｇｌｎ２８Ｐｒｏ、Ｔｒｐ５４Ｇｌｙ、Ｖａｌ６２Ｌｅｕ、Ａｓｐ７３Ａｌａ、Ａｓｐ７３Ｖａｌ、Ｇｌｙ２３１Ａｓｐ、および２３５ＧｌｙＧｌｙＬｙｓの挿入を引き起こす変異を、フィードバック耐性表現型を付与するために使用することができる。

【0089】

当業者であれば、ここに開示した方法を使って、グリセロールを発酵させて、商業上関心が持たれる他の有機酸、例えばラクテート、マレート、およびフマレートなどにする株を構築できることも、わかるであろう。

【0090】

本明細書に記載する具体例では生産生物として大腸菌を使用し、実施例で使用した遺伝子には、大腸菌命名法を使用したが（例えばｇｌｐＲ（グリセロール−３−リン酸依存性リプレッサー）、ｇｌｐＫ（グリセロールキナーゼ）、ｇｌｐＡＢＣ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、およびｇｌｐＦ（グリセロール促進拡散因子））、他の微生物における発酵による商業上関心が持たれる化学品の生産について、グリセロール利用の強化を達成するために、他の微生物に由来するこれらの構成要素の機能的類似体および構造的ホモログである遺伝子およびタンパク質を、本明細書に教示されているように改変しうることは、当業者であればわかるだろう。

【0091】

［参考文献］
読者の便宜のために、参考文献を全てここに列挙する。各文献はそのまま本明細書に組み込まれる。
米国特許第５，０００，０００号
米国特許第５，０２８，５３９号
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国際公開第２００９／０４８２０２号
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・Ｈｅｒｒｉｎｇ， Ｃ． Ｄ．， Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ， Ａ．， Ｈｏｎｉｓｃｈ， Ｃ．， Ｐａｔｅｌ， Ｔ．， Ａｐｐｌｅｂｅｅ， Ｍ． Ｋ．， Ｊｏｙｃｅ， Ａ． Ｒ．， Ａｌｂｅｒｔ， Ｔ． Ｊ．， Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｆ． Ｒ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ， Ｄ．， Ｃａｎｔｏｒ， Ｃ． Ｒ．， ａｎｄ Ｐａｌｓｓｏｎ， Ｂ． Ｏ． （２００６） Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｌｌｏｗｓ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｉｍｅｓｃａｌｅ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８： １４０６−１４１２．
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・Ｊａｎｔａｍａ， Ｋ．， Ｈａｕｐｔ， Ｍ． Ｊ．， Ｓｖｏｒｏｎｏｓ， Ｓ． Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｈａｎｍｕｇａｍ， Ｋ． Ｔ．， ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， Ｌ． Ｏ． （２００８） Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｎｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ａｎｄ ｍａｌａｔｅ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９： １１４０−１１５３．
・Ｊａｎｔａｍａ， Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｈａｎｍｕｇａｍ， Ｋ． Ｔ．， Ｓｖｏｒｏｎｏｓ， Ｓ． Ａ．， ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， Ｌ． Ｏ． （２００８） Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｙｉｅｌｄｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０１： ８８１−８９３．
・Ｉｂａｒｒａ， Ｒ． Ｕ．， Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｊ． Ｓ．， ａｎｄ Ｐａｌｓｓｏｎ， Ｂ． Ｏ． （２００２） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ． Ｎａｔｕｒｅ ４２０： １８６−１８９．
・Ｌｉｎ， Ｅ． Ｃ． （１９９６）， ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ： ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐｐ ３２５−３２６．
・Ｏｎｄｒｅｙ， Ｇ． （２００４） Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｏｃｔｏｂｅｒ， ２００４， ｐ． １３）．
・Ｐａｌｓｓｏｎ， Ｂ． Ｏ． （２０１１） Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｍｉｃｒｏｂｅ ６， ６９−７４．
・Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ， Ｄ． Ｗ．， Ｌｉｕ， Ｗ． Ｚ．， Ｈｏｌｍｅｓ， Ｃ．， Ｍｅａｄｏｗ， Ｎ． Ｄ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｍａｎ， Ｓ． （１９９６） Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７８． ２８４６−２８５２．
・Ｔｒｉｎｈ， Ｃ． Ｔ．， ａｎｄ Ｓｒｉｅｎｃ， Ｆ． （２００９） Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５． ６６９６−６７０５．
・Ｙａｚｄａｎｉ， Ｓ． Ｓ．， ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． （２００７） Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ： ａ ｐａｔｈ ｔｏ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｉｎｄｕｓｔｒｙ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８： ２１３−２１９．
・Ｙａｚｄａｎｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｒ． ． （２００８） Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０： ３４０−３５１．
・Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｊａｎｔａｍａ， Ｋ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｃ．， Ｊａｒｂｏｅ， Ｌ． Ｒ．， Ｓｈａｎｍｕｇａｍ， Ｋ． Ｔ．， ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， Ｌ． Ｏ． （２００９） Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ−ｃｏｎｓｅｒｖｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６： ２０１８０−２０１８５．
・Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｊａｎｔａｍａ， Ｋ．， Ｓｈａｎｍｕｇａｍ， Ｋ． Ｔ．， ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， Ｌ． Ｏ． （２００９） Ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓａｌｔｓ Ｍｅｄｉｕｍ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５： ７８０７−７８１３．
・Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｓｈａｎｍｕｇａｍ， Ｋ． Ｔ．， ａｎｄ Ｉｎｇｒａｍ， Ｌ． Ｏ． （２０１０） Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｔｏ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７６：２３９７−２４０１．
・Ｚｗａｉｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｌｉｎ， Ｅ． Ｃ． （１９６６） Ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ， ａ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３： ７５５−７５７．
・Ｚｗａｉｇ， Ｎ．， Ｋｉｓｔｌｅｒ， Ｗ． Ｓ．， ａｎｄ Ｌｉｎ， Ｅ． Ｃ． （１９７０） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ， ｔｈｅ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １０２： ７５３−７５９．

【0092】

【表1】

【0093】

【表2】

【0094】

【表3】

【0095】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]