特許 6205621 抗体を有するインターフェロンλでの標的化は抗腫瘍および抗ウイルス活性を大きく増強する

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6205621

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】抗体を有するインターフェロンλでの標的化は抗腫瘍および抗ウイルス活性を大きく増強する

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/21 20060101AFI20170925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170925BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20170925BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/21ZNA

   A61K39/395 L

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P31/12

   A61P31/14

   A61P11/06

   A61P25/00

   A61P37/00

【請求項の数】17

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2014-554843(P2014-554843)

(86)(22)【出願日】2013年1月25日

(65)【公表番号】特表2015-511225(P2015-511225A)

(43)【公表日】2015年4月16日

(86)【国際出願番号】US2013023093

(87)【国際公開番号】WO2013112801

(87)【国際公開日】20130801

【審査請求日】2015年12月2日

(31)【優先権主張番号】61/591,087

(32)【優先日】2012年1月26日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/412,816

(32)【優先日】2012年3月6日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510116495

【氏名又は名称】アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(74)【代理人】

【識別番号】100165526

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チエン−シン

(72)【発明者】

【氏名】ゴールデンバーグ，デイビッド エム．

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ドンリン

【審査官】 安藤 公祐

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０２５９０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５４２１９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Clin. Devel. Immun.，２０１１年，2011，1-11

【文献】 Viruses，２０１０年，2，1589-602

【文献】 EMBO，２０１１年，3，348-61

【文献】 Bioconjugate Chem.，２０１２年，23，309-23

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／２１

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ １１／０６

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ３１／１２

Ａ６１Ｐ ３１／１４

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）ヒトプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）ＲＩ、ＲＩβ、ＲＩＩまたはＲＩＩβからの二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に結合したインターフェロンλを含む第一の融合蛋白質と；
ｉｉ）ＡＫＡＰ蛋白質からのアンカードメイン（ＡＤ）に結合した抗体または抗原結合抗体フラグメントを含む第二の融合蛋白質と；
を含むインターフェロン−抗体複合体であって、
前記ＤＤＤ部分の２コピーが、前記ＡＤ部分に結合する二量体を形成して、前記複合体を形成しており、
前記ＡＤ部分が、前記抗体または抗原結合抗体フラグメントのＣ末端に結合しており、前記ＤＤＤ部分が、前記インターフェロンλのＣ末端又はＮ末端に結合している複合体を含み、
前記抗体またはその抗体フラグメントが、ＴＲＯＰ−２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＥＧＦＲ、ムチン、αフェト蛋白質、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＴＮＦおよびＭＩＦからなる群より選択される抗原に結合する、
癌、ウイルス感染、喘息または多発性硬化症の治療剤。

【請求項2】

前記インターフェロンλが、ヒトインターフェロンλ１、インターフェロンλ２およびインターフェロンλ３からなる群より選択される、請求項１に記載の治療剤。

【請求項3】

前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびｄＡｂからなる群より選択される、請求項１または２に記載の治療剤。

【請求項4】

追加の治療薬を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項5】

前記治療薬が、二次抗体、二次抗体フラグメント、二次インターフェロン、薬物、毒素、酵素、ホルモン、免疫調整物質、サイトカイン、ケモカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、放射性核種、ホウ素化合物、光活性剤、抗血管新生薬およびアポトーシス促進剤からなる群より選択される、請求項４に記載の治療剤。

【請求項6】

前記薬物が、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブルトン型キナーゼ阻害剤、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイルＦｕｄＲ、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、パクリタキセル、テマゾロミド、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、チロシンキナーゼ阻害剤、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、ＬＦＭ−Ａ１３、ダサチニブ、イマチニブおよびニロチニブからなる群より選択される、請求項５に記載の治療剤。

【請求項7】

前記毒素が、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルス蛋白質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素からなる群より選択される、請求項５に記載の治療剤。

【請求項8】

前記抗血管新生薬が、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦ抗体、ラミニン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連蛋白質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、多硫酸ペントサン、アンギオポエチン２、インターフェロンα、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、バクリタキセル、アクチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４およびミノサイクリンからなる群より選択される、請求項５に記載の治療剤。

【請求項9】

前記ＡＤ部分のアミノ酸配列が、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、配列番号：６６、配列番号：６７、配列番号：６８、配列番号：６９、配列番号：７０、配列番号：７１、配列番号：７２、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８１、配列番号：８２、配列番号：８３および配列番号：８４からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項10】

前記ＤＤＤ部分のアミノ酸配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０および配列番号：３１からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項11】

前記インターフェロン−抗体複合体が、前記インターフェロン単独、前記抗体単独、またはコンジュゲートされていないインターフェロンと抗体との組み合わせよりも効果的である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療剤。

【請求項12】

前記癌が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項１に記載の治療剤。

【請求項13】

前記ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス哺乳動物腫瘍ウイルス、バリセラ・ゾスターウイルス、デングウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、およびブルータングウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の治療剤。

【請求項14】

前記ウイルス感染が、慢性Ｃ型肝炎感染である、請求項１３に記載の治療剤。

【請求項15】

喘息または多発性硬化症の治療剤である、請求項１に記載の治療剤。

【請求項16】

喘息の治療剤であり、前記複合体が、鼻腔内投与により投与されるためのものである、請求項１５に記載の治療剤。

【請求項17】

前記抗体または抗体フラグメントが、抗ＴＮＦ、抗ＣＤ７４、または抗ＭＩＦ抗体または抗体フラグメントである、請求項１６に記載の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、米国特許法３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）の下で、２０１２年１月２６日出願の米国特許仮出願第６１／５９１，０８７号、および２０１２年３月６日出願の米国特許仮出願第１３／４１２，８１６号の利益を主張するものである。先に引用された各優先権出願の本文は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｓｔｉｎｇ
本願は、ＦＥＳ−Ｗｅｂにより寄託され、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｓｔｉｎｇを含む。２０１３年１月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、 ＩＢＣ１３６ＷＯテキストと称され、サイズが５０，７５３バイトである。

【背景技術】

【0003】

発明の分野
本発明は、抗体または抗原結合抗体フラグメントに結合されたインターフェロンλ（ＩＦＮ−λ）、より好ましくはＩＦＮ−λ１を含むＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体の治療的使用の組成物および方法に関する。好ましい実施形態において、抗体は、抗ＴＲＯＰ−２、抗ＣＥＡＣＡＭ５、抗ＣＥＡＣＡＭ６、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ムチン、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ７４、抗ＡＦＰ、または抗ＣＤ２２抗体であってもよい。しかし当業者は、本発明がそれに限定されず、抗体−インターフェロン複合体をより広く網羅することを認識するであろう。好ましくはＤＮＬ（商標）複合体は、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５５０，１４３号および同第７，６６６，４００号に例示された組成および技術を用いて作製され、それらの特許それぞれの実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる。抗体コンジュゲートインターフェロンは、インビトロ活性を保持し、実質的に高いインビボ有効性および長い血清半減期を示す。ＤＮＬ（商標）生成物の追加的利点としては、より低い免疫原性、少ない投薬回数、高い溶解度、高い安定性、および低い腎クリアランスを挙げることができる。

【0004】

関連技術
インターフェロンα（ＩＦＮα）は、癌の動物モデル（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：４６０４−１５）およびヒト癌患者（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ９３：３９９−４０６）の両方において抗腫瘍活性を有することが報告された。ＩＦＮαは、癌遺伝子のダウンレギュレーション、腫瘍抑制因子のアップレギュレーション、腫瘍表面のＭＨＣクラスＩ蛋白質の発現の増加を介した免疫認識の増強、アポトーシスの増強、および化学療法剤に対する感作をはじめとし、種々の直接的な抗腫瘍効果を発揮し得る（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：１１９８−２０５；Ｍａｔａｒｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６０：１５０７−２０；Ｍｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１６７−７９；Ｓａｂａａｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ １４：１１４３−５１；Ｔａｋａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ ４２４：５１６−２３）。一部の腫瘍については、ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１の活性化により直接的かつ強力な抗増殖効果を有し得る（Ｇｒｉｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９１：３０１７−２７）。

【0005】

間接的には、ＩＦＮαは、血管新生を阻害すること（Ｓｉｄｋｙ ａｎｄ Ｂｏｒｄｅｎ，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：５１５５−６１）、および宿主免疫細胞を刺激することができるが、このことは、抗腫瘍応答全体にとって重要であり得るにもかかわらず、正しく評価されていない（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：３６９−７２）。ＩＦＮαは、骨髄細胞（Ｒａｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：２５０７−１２；Ｌｕｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：１９４７−５３）、Ｔ細胞（Ｃａｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３：９３３−４０；Ｐｉｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｏｌ ２９：１０４１−５０）およびＢ細胞（Ｌｅ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：４６１−７０）への作用を介した、免疫応答に対する多面的な影響を有する。自然免疫系の重要なモジュレーターとして、ＩＦＮαは、樹状細胞の急速な分化および活性化を誘導し（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：６８２７−３０；Ｐａｑｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ６４：３５８−６７；Ｓａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１：１７７７−８８）、ＮＫ細胞の細胞毒性、遊走、サイトカイン産生および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強する（Ｂｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：１８９−２２０；Ｂｒｕｎｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４４：５９７−６０１）。

【0006】

ＩＦＮの治療効果は、へアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、尖圭コンジローム、エイズ関連カポジ肉腫、ならびに慢性Ｂ型およびＣ型肝炎を処置するためのＩＦＮ−α２；多発性硬化症を処置するためのＩＦＮ−β；ならびに慢性肉芽腫症および悪性大理石骨病のためのＩＦＮ−γの認可により今日まで検証されてきた。オートクリンおよびパラクリンのサイトカインのこの群に関する膨大な文献にもかかわらず、健康および疾患におけるそれらの機能は、臨床に導入されるより効果的で新規な形態をはじめとし、依然として解明の途上にある（Ｐｅｓｔｋａ，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８２：２００４７−５１；Ｖｉｌｃｅｋ，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２５：３４３−４８）。

【0007】

インターフェロンは、抗腫瘍および抗菌的宿主防御において重大な役割を担い、癌および感染性疾患の治療薬として詳細にわたり探求されてきた（Ｂｉｌｌｉａｕ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １７：３８１−４０９；Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０２：８−３２）。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／βおよびγ）による少なからぬ努力にもかかわらず、短い循環半減期、全身毒性、および患者における最適に満たない応答のために、臨床設定における使用が限られてきた（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０２：８−３２；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１８２：６９−７９）。２００３年初頭のＩＦＮ−γファミリーの発見が、これらの対処されていない臨床適応に向けた代替的ＩＦＮ剤を開発するための期待に満ちた新しい好機となった（Ｋｏｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６９−７７；Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６３−８）。

【0008】

ＩＩＩ型インターフェロンと称されるＩＦＮ−λは、第１９染色体に位置する３種の異なる遺伝子により遺伝子コードされたＩＦＮ−λ１、２、３（それぞれインターロイキン−２９、２８Ａおよび２８Ｂとも呼ばれる）からなる新たに記載されたサイトカイン群である（Ｋｏｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６９−７７；Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６３−８）。その蛋白質レベルでは、ＩＦＮ−λ２および−λ３は、高度に相同性で９６％のアミノ酸同一性を有するが、ＩＦＮ−λ１は、ＩＦＮ−λ２および−λ３とおよそ８１％の相同性を有する （Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６３−８）。ＩＦＮ−λは、ＪＡＫ１およびＴＹＫ２キナーゼの活性化、ＳＴＡＴ蛋白質のリン酸化、およびＩＦＮ−刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）の転写複合体の活性化をはじめとし、Ｉ型ＩＦＮにより誘発されるものと同様のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達を活性化する（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２１：２３７−５１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：７７４９−５８）。

【0009】

ＩＩＩ型ＩＦＮシステムとＩ型ＩＦＮシステムの主要な差異は、それらの各受容体複合体の分布である。ＩＦＮ−α／βは、２種の広範に発現されるＩ型インターフェロン受容体を通してシグナル伝達し、その結果生じたＩＦＮ−α／β投与に関連する全身毒性が、治療薬としてのそれらの使用を限定してきた（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２００４７−５１）。これに対しＩＦＮ−λは、独特のＩＦＮ−λ受容体１（ＩＦＮ−λＲ１）およびＩＬ−１０受容体２（ＩＬ−１０Ｒ２）からなるヘテロ二量体の受容体複合体を通してシグナル伝達する。過去に報告された通り（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：７０２−１４）、ＩＦＮ−λＲ１は、非常に限定された発現パターンを有し、上皮細胞、メラニン形成細胞、および肝細胞では最高レベルで、一次中枢神経系（ＣＮＳ）細胞では最低レベルである。血中免疫系細胞は、ＩＦＮ−λ作用を阻害する短いＩＦＮ−λ受容体スプライスバリアント（ｓＩＦＮ−λＲ１）を高レベルで発現する。ニューロン細胞および免疫細胞のこの限定的応答性から、ＩＦＮ−α療法に関連することの多い重度毒性が、ＩＦＮ−λを用いれば存在しない、または有意に低減される可能性が示唆される（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：７０２−１４； Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２１：２３７−５１）。近年の発行物で、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−λが肝細胞におけるＩＳＧ（インターフェロン刺激遺伝子）の共通の組み合わせの発現を誘導するが、ＩＦＮ−αとは異なりＩＦＮ−λの投与は、精製リンパ球または単球におけるＳＴＡＴ活性化またはＩＳＧ発現を誘導しないことが報告された（Ｄｉｃｋｅｎｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．９３，２０１２年１２月２０日ウェブ出版）。ＩＦＮ−λはＩＦＮ−α療法に関連することの多い白血球減少症を誘導する可能性が低いため、慢性ＨＣＶ感染の処置についてＩＦＮ−αよりも優れている可能性が示唆された （Ｄｉｃｋｅｎｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0010】

ＩＦＮ−λは、ＩＬ−１０関連サイトカインに類似した構造特性を示すが、機能的にはＩ型ＩＦＮ様抗ウイルスおよび抗増殖活性を有する（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：７０２−１４；Ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：４５０１−９；Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−４）。ＩＦＮ−λ１および−２は、ＤＮＡウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス（Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−４，Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，４４：８９６−９０６）および単純ヘルペスウイルス２型（Ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：２４７４−８５））、ｓｓ（＋）ＲＮＡウイルス（ＥＭＣＶ；Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６３−８）およびＣ型肝炎ウイルス（Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−４，Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，４４：８９６−９０６；Ｍａｒｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １３１：１８８７−９８；Ｐａｇｌｉａｃｃｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：３００７９−８９）、ｓｓ（−）ＲＮＡ ウイルス（水疱性口炎ウイルス；Ｐａｇｌｉａｃｃｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：３００７９−８９）およびインフルエンザＡ型ウイルス（Ｊｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：１ １５１５−２２）および二本鎖ＲＮＡウイルス、例えばロタウイルス（Ｐｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８：７９４４０４９） をはじめとし、様々なウイルスのウイルス複製または細胞変性作用を低減することが実証された。ＩＦＮ−λ３は、ＨＣＶ感染における重要なサイトカインとして遺伝子試験から同定され（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：３９９−４０１）、ＥＭＣＶに対抗する強力な活性も示した（Ｄｅｌｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：１２５−３１）。ライノウイルスにより誘導されたＩＦＮ−λ産生の欠如が、ライノウイルス誘導性喘息増悪の重症度と高度に相関することが報告され（Ｃｏｎｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １２：１０２３−２６）、ＩＦＮ−λ療法が、アレルギー性喘息の処置の新規なアプローチとして示唆された（Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，２０１１，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３：３０６−８；Ｋｏｌｔｓｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３：３４８−６１）。

【0011】

ＩＦＮ−λの抗増殖活性が、神経内分泌癌腫ＢＯＮ１（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，３４４：１３３４−４１）、膠芽腫ＬＮ３１９（Ｍｅａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３１：１０９−１８）、不死化ケラチノサイトＨａＣａＴ （Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ７：１１０９−１５）、黒色腫Ｆ０１（Ｇｕｅｎｔｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ９：５１０−２０）、および食道癌ＴＥ−１１（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：１８０−９０）をはじめとする複数のヒト癌細胞株において確立された。動物モデルにおいて、ＩＦＮ−λは、自然および適応免疫応答を通して腫瘍のアポトーシスと崩壊の両方を誘導し、ＩＦＮ−λの局所送達がヒト悪性腫瘍の処置において有用な付加的方策となり得ることが示唆される （Ｎｕｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：５０８６−９８）。

【0012】

臨床設定において、ＰＥＧ化されたＩＦＮ−λ１（ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１）が、慢性Ｃ型肝炎感染患者に暫定的に用いられてきた。第Ｉｂ層試験（ｎ＝５６）において、ＩＦＮ−α療法後に再発したジェノタイプ１型ＨＣＶ患者にＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１を投与すると、抗ウイルス活性が、全ての用量レベル（０．５−３．０ μｇ／ｋｇ）で観察され、ウイルス量が２．３ｌｏｇから４．０ｌｏｇに低下した（Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５２：８２２−３２）。第ＩＩｂ相試験（ｎ＝５２６）で、ジェノタイプ１型および４型ＨＣＶ患者が、ＰＥＧ−ＩＦＮ−αに比較してＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１の処置への有意に高い応答率を有することが示された。同時に、Ｉ型インターフェロン処置に共通して関連する有害事象の割合が、ＰＥＧ−ＩＦＮ−αよりもＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１で低くなった。好中球減少症および血小板減少症が、稀にしか観察されず、インフルエンザ様症状、貧血、および骨格筋症状の割合が、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α処置で観察された割合の約１／３に減少した。しかし、重篤な有害事象、うつ病および他の共通の有害事象の割合（＞１０％）は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１とＰＥＧ−ＩＦＮ−αの間で類似していた。ＰＥＧ−ＩＦＮ−αに比較して、より高い割合の肝毒性が、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１の最高用量で観察された（”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＰＥＧ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｌａｍｂｄａ Ａｃｈｉｅｖｅｄ Ｈｉｇｈｅｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｆｅｗｅｒ Ｆｌｕ−ｌｉｋｅ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｅｎｉａｓ Ｔｈａｎ ＰＥＧ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｆａ ｉｎ Ｐｈａｓｅ ＩＩｂ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ５２６ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−Ｎａｉｖｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ａｐｒｉｌ ２，２０１１，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂからのプレスリリース）。

【0013】

非修飾インターフェロンの生物活性を保持しながら改善されたインビボ有効性、低い毒性および／または優れた薬物動態特性を示す、インターフェロンλ−抗体複合体を含む組成物および方法が、求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

発明の概要
本発明は、抗体または抗原結合抗体フラグメントに結合されたインターフェロン、好ましくはインターフェロンλ、より好ましくはＩＦＮ−λ１を含むＤＮＬ（商標）複合体を製造するための方法および組成物を開示する。インターフェロン部分は、ヒトプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）調節サブユニットＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩαもしくはＲＩＩβからの二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分、あるいはＡ−キナーゼアンカー蛋白質（ＡＫＡＰ）からのアンカードメイン（ＡＤ）部分にコンジュゲートされ得る。抗体または抗体フラグメント部分は、相補性ＡＤまたはＤＤＤ部分にコンジュゲートされている。ＤＤＤ部分は、ＡＤ部分への高い親和力によって結合する二量体を自発的に形成するため、ＤＮＬ（商標）複合体は、それぞれがＤＤＤ部分またはＡＤ部分に結合されているインターフェロン、抗体または抗体フラグメントなどのエフェクターから組織化されていてもよい。ＤＤＤ部分に結合されたエフェクターをＡＤ部分に結合されたエフェクターと混合することにより、事実上任意のエフェクターをＤＮＬ（商標）複合体に組み込むことができる。

【課題を解決するための手段】

【0015】

ＤＮＬ（商標）複合体は、好ましくは抗体またはフラグメントに結合されたインターフェロン部分を１、２、または４コピー含む。しかし当業者は、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５５０，１４３号および同第７，６６６，４００号に開示される通り、異なる構造および異なるインターフェロン対抗体比を有する別のタイプのＤＮＬ（商標）複合体が請求された方法および組成物の範囲内で構築および使用され得ることを、認識するであろう。より好ましい実施形態において、ＤＮＬ（商標）複合体は、ＤＤＤおよびＡＤ配列内の適切な位置にシステイン残基を導入して、複合体を安定化するジスルフィド結合を形成することにより、共有結合で安定化させてもよい。

【0016】

他の好ましい実施形態において、インターフェロンでコンジュゲートされた抗体を含むＤＮＬ（商標）複合体は、非コンジュゲートインターフェロンよりも少なくとも一桁緩やかな、血清からのクリアランス速度を示す。

【0017】

当業者は、その技術がインターフェロンλに限定されず、むしろ、非限定的に酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体およびそのフラグメントをはじめとし、種々の治療薬の標的送達に適用され得ることを、認識するであろう。例示的薬剤としては、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−１（高移動度群ボックス蛋白質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンλ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ｈＧＨ、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｐ１ＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびＬＩＦが挙げられる。

【0018】

請求された方法および組成物の範囲内の癌の標的治療に用いられ得る抗体としては、非限定的に、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２およびＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖蛋白質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ４およびＫＣ４（両者とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅとしても公知）、ＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異性抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ−３１（抗α−フェト蛋白質）、抗ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、抗Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異性膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；リツキシマブ（抗ＣＤ２０）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）；ならびにトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられる。そのような抗体は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０；同第７，６４２，２３９号；ならびに米国特許出願公開第２００４０２０２６６６号（現在は放棄されている）；同第２００５０２７１６７１号；および同第２００６０１９３８６５号であり、それらの実施例の節は参照により本明細書に組み入れられる）。使用される具体的な公知抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬｌ（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲｌ（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号。ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４０５およびＰＴＡ−４４０６として寄託）およびＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５号）が挙げられ、各引用された特許または特許出願の本文は、図面および実施例の節に関する参照により本明細書に組み入れられる。

【0019】

抗ＴＮＦ−α抗体は、当該技術分野で公知であり、喘息などの免疫疾患を処置するのに用いられ得る（例えば、Ｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７４：７５３−６２参照）。ＴＮＦ−αに対する公知抗体としては、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：８８１−８５）；ネズミ抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２ＢおよびＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，イリノイ州ロックフォード所在）；インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，ペンシルバニア州マルバーン所在）；セルトリズマブペゴール（ＵＣＢ，ベルギー ブリュッセル所在）；およびアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，イリノイ州アボットパーク所在）が挙げられる。これらおよび他の多くの公知抗ＴＮＦ−α抗体は、請求された方法および組成物中で用いられ得る。使用される他の抗体としては、非限定的に、抗Ｂ細胞抗体、例えばベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブまたはｈＬ２４３；トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）；バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）；ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）；エファリズマブ（抗ＣＤｌｌａ）；ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）；抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，ベルギー ブリュッセル所在）；ナタリズマブ（抗α４インテグリン）およびオマリズマブ（抗ＩｇＥ）が挙げられる。

【0020】

マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）は、自然および適応免疫ならびにアポトーシスの重要な調節物質である。ＣＤ７４が、ＭＩＦの内因性受容体であることが、報告された（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦを介した細胞内経路での拮抗性抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、膀胱、前立腺、乳房、肺、結腸および慢性リンパ性白血病などの癌（例えば、 Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４， ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ ＆ Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ５２：１４４６−５４）；腎臓同種移植片拒絶などの腎疾患（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９−８３）；および数多くの炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ｅｐｕｂ Ｍａｒｃｈ ２２，２００９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １０：３３）などの広範囲の疾患状態の処置に使用されてもよく；ミラツズマブ（ｈＬＬｌ）は、ＭＩＦを介した疾患の処置に治療使用される例示的抗ＣＤ７４抗体である。

【0021】

本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する対象を処置するのに用いられ得る。バピネオズマブは、アルツハイマー病の治療に向けた臨床試験の最中である。アルツハイマー病の治療に提案された他の抗体としては、Ａｌｚ ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：７９４３−４７）、ガンテネルマブ、およびソラネズマブが挙げられる。抗ＴＮＦ−α抗体であるインフリキシマブは、アミロイド斑を減少させて認知を改善することが報告された。アルツハイマー病患者の脳の神経原線維タングルにおけるＣＤ７４の存在（Ｂｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２００８；３：１３ ｄｏｉ：ｌ ０．１１８６／１７５０−１３２６−３−１３）から、ＣＤ７４がペプチドもしくは抗体治療のターゲット、または治療薬にアルツハイマー病患者の脳のこれらの領域を標的化させるためのターゲットとなり得ることが示唆される。

【0022】

用いられ得る他の抗体としては、感染性疾患病原体、例えばバクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、または他の病原に対する抗体が挙げられる。そのような感染性病原体に対する多くの抗体は、当該技術分野で公知であり、任意のそのような公知抗体は、請求された方法および組成物中で用いることができる。例えばヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０糖蛋白質抗原に対する抗体は、公知であり、そのような抗体の特定のものは、ヒトにおいて免疫防御的役割を有し得る。例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：８０５５−８０５８，１９９０を参照されたい。公知の抗ＨＩＶ抗体としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６ Ｏｃｔ ３；２０（１５）：１９１１−５）により記載された抗エンベロープ抗体に加え、Ｐｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）により記載および販売され、米国特許第５，８３１，０３４号、同第５，９１１，９８９号およびＶｃｅｌａｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０ およびＪｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９（全てが参照により本明細書に組み入れられる）にも記載された抗ＨＩＶ抗体が挙げられる。

【0023】

マラリア原虫に対する抗体は、スポロゾイト、メロゾイト、シゾントおよびガメトサイト期を対象とし得る。モノクローナル抗体が、スポロゾイトに対して生成され（サーカムスポロゾイト抗原）、インビトロで、そしてげっ歯類において、スポロゾイトを中和することが示された（Ｎ．Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０７：７１−７３，１９８０）。複数のグループが、トキソプラズモーシスに関与するプロトゾアン寄生虫であるＴ．ｇｏｎｄｉｉへの抗体を開発した（Ｋａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：１６９４−１６９９，１９８２；Ｉｄ．，３０：２４０７−２４１２，１９８３）。抗体が、シストソミュラ表面抗原に対して開発され、インビボまたはインビトロでシストソミュラに対して作用することが見出された（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８３：１６３−１７７，１９８１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８４：８３−９１，１９８２：Ｇｒｙｚｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２７３９−２７４３，１９８２；Ｚｏｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２３２６−２３２８，１９８２；Ｄｉｓｓｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２２３２−２２３４，１９８２）。

【0024】

トリパノゾーマ・クルージは、シャーガス病の原因物質であり、吸血昆虫により伝搬される。インビトロでその寄生虫の１つの形態から別の形態（エピマスチゴート期からトリポマスチゴート期）への分化を特異的に阻害し、細胞表面糖蛋白質と反応する抗体が作製されたが；この抗原は寄生虫の哺乳動物（血流）形態が存在しない（Ｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３００：６３９−６４０，１９８２）。

【0025】

抗真菌抗体、例えば抗スクレロチニア抗体（米国特許第７，９１０，７０２号）；抗グルクロノキシロマンナン抗体（Ｚｈｏｎｇ ａｎｄ Ｐｒｉｏｆｓｋｉ，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５８−６４）；抗カンジダ抗体（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｂｕｒｎｉｅ，２００１，２：４７２−７６）；および抗グリコスフィンゴリピッド抗体（Ｔｏｌｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０：４７）が、当該技術分野で公知である。

【0026】

適切な抗体が、ヒトにおける感染の大部分を担う微生物（バクテリア、ウイルス、原生動物、真菌、他の寄生虫）のほとんどに対して開発され、多くはこれまでにインビトロ診断の目的で用いられてきた。非常に様々な病原に対する市販の抗体が公知であり、使用することができる。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ州所在）の例示的抗病原抗体としては、抗Ｅ．コリ（ＭＡＢ８２７２）、抗サルモネラ（ＭＡＢ７４８−ＭＧ−Ｋ）、抗リステリア・モノサイトゲネス（ＭＡＢ８００１）、抗ヘリコバクター・ピロリ（ＩＨＣ２１４０−６）、抗スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＡＢ９３０）、抗クラミジア・トラコマチス（ＡＢ１１２０Ｆ）、抗マイコプラズマ・ボビス（ＭＡＢ９７０）、抗ジアルジア・ムーリス（ＭＡＢ１０２４２）、抗デングウイルス（ＭＡＢ１０２２６）、抗フラビウイルス（ＭＡＢ１０２１６）、抗Ｌ．ニューモフィラ（ＭＡＢ１０２２３）、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＭＡＢ１０２０１）、抗デングウイルス（ＭＡＢ１０２１７）、抗単純ヘルペス（ＭＡＢ８６８５）、抗エプスタイン・バーウイルス（ＭＡＢ１０２１９）、抗コクサッキーウイルス（ＭＡＢ１０２２０）、抗呼吸器多核体ウイルス（ＭＡＢ８２６２−ＫＣ）、抗アデノウイルス（ＭＡＢ８０４３−ＫＣ）、抗インフルエンザウイルス（ＭＡＢ８６６１−ＫＣ）、抗ＲＳＶ（ＭＡＢ８５９４）、抗乳頭腫ウイルス（ＭＡＢ８３７）、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＡＢ３０７）、抗エンテロウイルス７１（ＭＡＢ９７９−Ｋ）、抗麻疹ウイルス（ＭＡＢ８９０５−Ｋ）、抗サイトメガロウイルス（ＭＡＢ８１４０−ＫＣ）、抗黄熱ウイルス（ＭＡＢ９８４−Ｋ）、抗狂犬病ウイルス（ＭＡＢ８７２４）、抗ヘルペスウイルス６（ＭＡＢ８５３５）、抗ポリオウイルス（ＭＡＢ８５６６）、抗ＳＡＲＳ（ＭＡＢ８７８５）、抗ニューカッスル病ウイルス（ＭＡＢ８０１４４）および抗西ナイルウイルス（ＭＡＢ８１５０）が挙げられる。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州所在）からの例示的抗病原抗体としては、抗デングウイルス（ｓｃ−３２５０１８、抗ワクシニアウイルス（ｓｃ−６９９４９）、抗ポリオーマウイルス（ｓｃ０６５９２５）、抗ルベラウイルス（ｓｃｌ０１３６４）、抗エボラウイルス（ｓｃ−５１８７２）、抗ＥＢＶ（ｓｃ−１７５００）、抗麻疹ウイルス（ｓｃ−５８１６７）、抗ムンプスウイルス（ｓｃ−５７９１８）、抗ハンタウイルス（ｓｃ−５７７５５）および抗マイコプラズマ・ホミニス（ｓｃ−５８１７１）が挙げられる。ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ポーウェイ所在）からの例示的抗病原抗原としては、抗アスペルギルス（３５−５９５）、抗カンジダ・アルビカンス（３５−１２１）および抗サッカロマイセス・セレビシエ（３５−３６１）が挙げられる。ＫＰＬ（メリーランド州ゲイザーズバーグ所在）からの例示的抗病原抗体としては、抗スタフィロコッカス・アウレウス（０１−９０−０５）、抗ボレリア・ブルグドルフェリ（０１−９７−９１）、抗ヘリコバクター・ピロリ（０１−９３−９４）、抗レジオネラ属菌種（０１−９０−０３）および抗エルシニア属菌種（０１−９０−０４）が挙げられる。当該技術分野で周知の商業的な抗病原抗体には多くの他の供給元がある。当業者は、該当する事実上任意の病原への抗体が市販され、および／または公的に入手でき、任意のそのような公知抗体は、以下に記載される方法および組成物を用いるＤＮＬ（商標）複合体に組み込み得ることを認識するであろう。

【0027】

ＤＮＬ（商標）複合体は、非常に様々な治療的および診断的適用における使用に適する。ＤＮＬ（商標）複合体の使用方法としては、疾患または他の医療的状態の検出、診断、および／または処置を挙げることができる。そのような状態としては、非限定的に、癌、過形成、喘息、多発性硬化症、感染性疾患、慢性ウイルス性肝炎、ヘルペスウイルス感染、Ｂ型またはＣ型肝炎への慢性的感染、慢性肉芽腫症、悪性大理石骨病、カポジ肉腫、ヒト乳頭腫ウイルス感染、インフルエンザ、慢性骨髄性白血病、へアリー細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、転移性腎細胞癌、血管腫、血液癌、尖圭コンジロームおよび悪性黒色腫を挙げることができる。

【0028】

処置され得る腫瘍の例示的タイプとしては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、および膀胱癌が挙げられる。

【0029】

非限定的に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス哺乳動物腫瘍ウイルス、バリセラ・ゾスターウイルス、デングウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、およびブルータングウイルスをはじめとする様々なウイルス感染を処置することができ、またはバクテリアは、ストレプトコッカス・アガラクチエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、エシェリヒア・コリ、ナイセリア・ゴノルヘア、ナイセリア・メニンギチディス、ニューモコッカス、ヘモフィルス・インフウエンザＢ、トレポネマ・パリズム、ライム病スピロヘータ、シュードモナス・エルギノサ、マイコバクテリウム・レプラエ、ブルセラ・アボルツス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、もしくはクロストリジウム・テタニからなる群より選択される。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】サイトカインＤＤＤ２（Ｃ）およびＩｇＧ−ＡＤ２（Ｄ）ＤＮＬモジュールの発現のための遺伝子構造（ＡおよびＢ）を表す図案である。モジュールを組み合わせて、ＩｇＧ（Ｅ）に融合された４つのサイトカインからなるＤＮＬ構造を形成する。

【図2】ＰＥＧ化またはネイティブＩＦＮａに比較した、サイトカイン−ＭＡｂ ＤＮＬ構築物におけるインビトロＩＦＮα活性を示す。比活性（ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、実施例に記載された通り測定した。各被験物質の既知濃度の活性を、ｒｈＩＦＮα２ｂ標準曲線から外挿した。培養物を、増加濃度の２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）、ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（□）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（▲）またはＩＲ−２ｂ（▽）の存在下で発育させ、相対的な生存細胞の密度を、ＭＴＳで測定した。未処置細胞から得られたシグナル％を、モル濃度のｌｏｇに対してプロットした。用量反応曲線およびＥＣ_５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを利用して作成した。誤差範囲、ＳＤ。

【図2(A)】細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイ。

【図2(B)】ＥＭＣウイルスおよびＡ５４９細胞を用いたウイルス防御アッセイ。

【図2(C)】Ｄａｕｄｉ細胞を用いたインビトロリンパ腫増殖アッセイ。

【図2(D)】Ｊｅｋｏ−１細胞を用いたインビトロリンパ腫増殖アッセイ。

【図3】Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける薬物動態分析の結果を示す。マウスに、２０−２ｂ、α２ｂ−４１３、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮまたはＰＥＧＡＳＹＳを投与して、血清試料を９６時間にわたるＥＬＩＳＡによるＩＦＮα２ｂ濃度について分析した。血清消失曲線を示す。血清半減期（Ｔ_１／２）消失速度および平均保持時間（ＭＲＴ）を、挿入図に要約する。

【図4(A)】２０−２ｂのＡＤＣＣエフェクター機能を示す。ＤａｕｄｉまたはＲａｊｉ細胞を、新たに単離されたＰＢＭＣの存在下、５μｇ／ｍｌの２０−２ｂ、２２−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、エプラツズマブ（ｅ−ｍａｂ）、またはｈ７３４と共に４時間インキュベートした後、細胞溶解物を定量した。

【図4(B)】２０−２ＢのＣＤＣエフェクター機能を示す。Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下、２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）またはｖ−ｍａｂ（○）の系列希釈物と共にインキュベートした。％補体対照（補体のみで処置された細胞と比較した、被験試料中の生存細胞数）を、ｎＭ濃度のｌｏｇに対してプロットした。誤差範囲、ＳＤ。

【図5】２０−２ｂにより全血からのＮＨＬ細胞の消失増加を示す。新たなヘパリン付加ヒト血液を、Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｍｏｓ細胞のいずれかと混合して、０．０１、０．１または１ｎＭの２０−２ｂ（●）、ｖ−ｍａｂ（○）、７３４−２ｂ（■）またはｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（□）と共に２日間インキュベートした。リンパ腫および末梢血リンパ球に対する示された処置の影響を、フローサイトメトリーを利用して評価した。誤差範囲、ＳＤ。

【図6(A)】播種性バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）キセノグラフトモデルにおける２０−２ｂの治療有効性を示す生存曲線を示す。０日目に、雌Ｃ．Ｂ．１７ ＳＣＩＤマウスにＤａｕｄｉ細胞を静脈内投与した。処置は、単一皮下用量として与えられた２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）または生理食塩水（×）からなった。処置日を矢印で示す。生存曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて解析した。早期Ｄａｕｄｉモデルにおいて、１日目にマウス１０匹の群に０．７ｐｍｏｌ（実線）または０．０７ｐｍｏｌ（破線）の単一用量を与えた。

【図6(B)】進行Ｄａｕｄｉモデルであること以外は図６（Ａ）と類似の試験を示す。７日目に、マウス１０匹の群に、０．７ｐｍｏｌ（実線）、７ｐｍｏｌ（破線）または７０ｐｍｏｌ（灰色線）の単一用量を与えた。

【図7(A)】播種性バーキットリンパ腫（ＲａｊｉおよびＮＡＭＡＬＷＡ）キセノグラフトモデルにおける２０−２ｂの治療有効性を示す生存曲線を表す。０日目に、雌Ｃ．Ｂ．１７ ＳＣＩＤマウスにＮＨＬ細胞を静脈内投与した。処置は、皮下用量として与えられた２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）または生理食塩水（×）からなった。処置日を矢印で示す。生存曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて解析した。進行Ｄａｕｄｉモデルにおいて、５、７、９、１２、１４および１６日目に１０匹の群が２５０ｐｍｏｌ用量を受けた。

【図7(B)】早期ＮＡＭＡＬＷＡモデルであること以外は図７（Ａ）と類似の試験を示す。６匹の群が、１、３、５、８、１０および１２日目に２０−２ｂまたは７３４−２ｂの２５０ｐｍｏｌ用量を受け、１、５、９、１３、１７、２１および２５日目にｖ−ｍａｂの３．５ｎｍｏｌ用量を受けた。

【図8(A)】ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１発現モジュールの略図。図は、出現の順に、配列番号：９９〜１００をそれぞれ開示する。

【図8(B)】インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）モジュールの構造を示す略図。

【図9】様々な細胞株における抗原の細胞表面発現。

【図10】ＡＤ２−λ１モジュールと比較した、（Ａ）ＭＥ−１８０細胞への（Ｅ１）−λ１、（Ｂ）ＨｅｐＧ細胞への（１５）−λ１および（Ｃ）Ａ３７５細胞への（Ｃ２）−λ１、の結合活性の上昇。

【図11】ＭＥ−１８０細胞への（Ｅ１）−λ１の細胞毒性作用。

【図12】ＭＥ−１８０細胞への（１５）−λ１の細胞毒性作用。

【図13】抗ウイルス作用。（Ａ）Ｈｕｈ−７細胞における（ｃ２２５）−λ１の抗ＨＣＶ力の上昇。ホタルルシフェラーゼを発現するＨＣＶジェノタイプ１ｂ Ｃｏｎ１レプリコンを有するＨｕｈ−７安定細胞株を、（ｃ２２５）−λ１、（Ｃ２）−λ１またはｒｈＩＦＮ−λ１剤の示された濃度で処置した。３日後に、ルシフェラーゼ活性を測定して、抗ウイルス効果を、未処置細胞に対する％活性低下により決定した。データを、シグモイダルフィット（変動性勾配）を利用したＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍにより解析した。試料を二重測定で独立して２回実験した。（Ｂ）Ａ５４９細胞における（１５）−λ１の抗ＥＭＣＶ力の上昇。Ａ５４９細胞を、（１５）−λ１、（Ｃ２）−λ１、ｒｈＩＦＮ−λ１、またはｈＭＮ１５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２の系列希釈と共にインキュベートした後、ＥＭＣＶでチャレンジした。視覚的細胞変性作用（ＣＰＥ）の決定を実施して、データを、シグモイダルフィット（変動性勾配）を利用したＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍにより解析した。試料を二重測定で独立して２回実験した。

【発明を実施するための形態】

【0031】

詳細な記載
定義
他に断りがなければ「ａ」または「ａｎ」は、「１以上」を意味する。

【0032】

本明細書で用いられる用語「および」および「または」は、分離または結合のいずれかを意味する。即ち、両用語は、他に断りがなければ、「および／または」と等しいと理解されなければならない。

【0033】

「治療薬」は、疾患の処置において有用な原子、分子、または化合物である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調整物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性剤、染料、および放射性同位体が挙げられる。

【0034】

「診断薬」は、疾患を診断する上で有用な原子、分子、または化合物である。有用な診断薬としては、非限定的に、放射性同位体、染料（ビオチン−ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用の増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。

【0035】

本明細書で用いられる「抗体」は、完全長の（即ち、天然由来の、または正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換え工程により形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の（即ち、特異的に結合する）部分を指す。「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体が挙げられる。

【0036】

「裸の抗体」は、治療薬または診断薬に結合されていない抗体またはその抗原結合フラグメントである。インタクトの裸の抗体のＦｃ部分は、補体固定およびＡＤＣＣなど、エフェクター機能を提供することができる（例えば、Ｍａｒｋｒｉｄｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ５０：５９−８７，１９９８参照）。裸の抗体が細胞死を誘導する他のメカニズムとしては、アポトーシスを挙げることができる。（Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８１：１０５−１１９，１９９８．）

【0037】

「抗体フラグメント」は、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂなどのインタクト抗体の一部である。構造に関係なく抗体フラグメントは、完全長抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば抗体フラグメントとしては、可変領域からなる単離されたフラグメント、例えば重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖ蛋白質」）が挙げられる。「ｓｃＦｖ」と略されることの多い「一本鎖抗体」は、抗原結合部位を形成するために相互作用するＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの両方を含むポリペプチド鎖からなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、通常、１〜２５のアミノ酸残基のペプチドにより連結される。抗体フラグメントは、ジアボディー、トリアボディーおよび単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）も包含する。

【0038】

本明細書に記載された抗体または免疫コンジュゲートの調製物または組成物は、投与される量が生理学的に有意である場合「治療有効量」で投与されると言われる。薬剤の存在が、レシピエント対象の生理学的状態に検出可能な変動をもたらす場合、その薬剤は、生理学的に有意である。特定の実施形態において、抗体調製物の存在が、抗腫瘍反応を惹起するか、または疾患状態の兆候および症状を軽減する場合、その抗体調製物は、生理学的に有意である。生理学的に有意な作用は、レシピエント対象において体液性および／または細胞性免疫反応の誘起にもなり得、標的細胞の増殖阻害または死滅をもたらし得る。

【0039】

ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））
好ましい実施形態において、インターフェロン−抗体複合体は、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成される（例えば、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；７，５５０，１４３号、および同第７，６６６，４００号参照。それらそれぞれの実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる）。一般にその技術は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、種々のＡＫＡＰ蛋白質のいずれかから得られたアンカードメイン（ＡＤ）配列と、の間に生じる特異的で高親和力の結合相互作用の利益を受けている（Ｂａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４． Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤおよびＡＤペプチドは、任意の蛋白質、ペプチドまたは他の分子に結合されていてもよい。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化してＡＤ配列に結合するため、その技術は、ＤＤＤまたはＡＤ配列に結合され得る任意の選択された分子の間に複合体を形成させる。

【0040】

標準のＤＮＬ（商標）複合体は、１つのＡＤ結合分子に結合された２つのＤＤＤ結合分子を有するトリマーを含むが、複合体構造の変動性により、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、および他の多量体が形成される。幾つかの実施形態において、ＤＮＬ（商標）複合体は、同じ抗原決定因子または２つ以上の異なる抗原に結合する２つ以上の抗体、抗体フラグメント、または融合蛋白質を含み得る。ＤＮＬ（商標）複合体は、１つ以上の他のエフェクター、例えば蛋白質、ペプチド、免疫調整物質、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合蛋白質、ペプチドリガンド、キャリア蛋白質、毒素、オンコナーゼなどのリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチド、抗原または異種抗原、ＰＥＧなどのポリマー、酵素、治療薬、ホルモン、細胞毒性剤、抗血管形成薬、アポトーシス促進剤、または任意の他の分子もしくは凝集体も含み得る。

【0041】

セカンドメッセンジャーｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合により惹起される最もよく研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的役割を担うＰＫＡは、最初、１９６８年にウサギ骨格筋から単離された（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態で保持された２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは、Ｒサブユニットの２つのタイプ（ＲＩおよびＲＩＩ）と共に見出され、各タイプは、αおよびβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。つまりＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームが、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩαおよびＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定した二量体のみが単離され、二量体ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４のアミノ酸末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。以下に議論される通り、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の同様の部分が、二量体化およびドッキングに関与し、そのそれぞれは調節サブユニットのＮ末端付近に位置する。ｃＡＭＰのＲサブユニットへの結合により、使用範囲の広いセリン／トレオニンキナーゼ活性のための活性触媒サブユニットが放出され、それらのサブユニットはＡＫＡＰとのドッキングを介したＰＫＡのコンパートメント化により、選択された基質に向かって配置される（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。

【0042】

最初のＡＫＡＰである微小管結合蛋白質−２が、１９８４年に特徴づけられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、原形質膜、アクチン細胞骨格、核内ミトコンドリア、および小胞体をはじめとする様々な細胞小器官の部位に局在化する５０種を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトまでの種で多様な構造によって同定された（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． ＭｏＬ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００４；５：９５９）。ＰＫＡのためのＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８の残基からなる両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰのうちでも極めて多様であり、ＲＩＩ二量体について報告された結合親和力は、２〜９０ｎＭの範囲内である（Ａｌｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットに結合するに過ぎない。ヒトＲＩＩαの場合、ＡＤは、２３のアミノ末端残基により形成された疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。つまりヒトＲＩＩαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインは、両者とも同じＮ末端の、本明細書ではＤＤＤと称される４４のアミノ酸配列内に位置する（Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１；２０：１６５１）。

【0043】

本発明者らは、以後ＡおよびＢと称される任意の２つの物体を非共有結合性の複合体内にドッキングするための優れたリンカーモジュール対として、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤとＡＫＡＰのＡＤを利用し、戦略的位置にあるＤＤＤおよびＡＤの両方にシステイン残基を導入することによりＤＮＬ（商標）複合体に更にロックしてジスルフィド結合の形成を促進する、プラットフォームテクノロジーを開発した。そのアプローチの一般的方法論は、以下の通りである。物体Ａは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に結合させることにより構築され、以後ａと称される第一の成分が得られる。ＤＤＤ配列は、二量体の自発的な形成を実行するため、つまりＡは、ａ_２で構成される。物体Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体に結合させることにより構築され、以後ｂと称される第二の成分が得られる。ａ_２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を生成し、こうしてａ_２とｂとの急速な会合が促進されて、ａ_２ｂで構成された二成分トリマー複合体を形成させる。この結合事象は、ジスルフィド架橋を介して２つの物体を共有結合により固定する次なる反応で不可逆性になるが、それは最初の結合相互作用がＤＤＤおよびＡＤの両方に配置された反応性チオール基を接近させて（Ｃｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするはずであるため、効果的局所濃度の原理の基づいて非常に効率的に起こる。リンカー、アダプターモジュールおよび前駆体の様々な組み合わせを利用すれば、異なる反応速度の非常に広範囲のＤＮＬ（商標）構築物を製造および使用することができる（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号および同第７，６６６，４００号参照）。

【0044】

ＤＤＤとＡＤを２つの前駆体の官能基から離して結合させることにより、そのような部位特異性ライゲーションは、２つの前駆体の本来の活性を維持することも予測される。このアプローチは、本質的にモジュラーであり、広範囲の活性を有するペプチド、蛋白質、抗体、抗体フラグメント、および他のエフェクター部分をはじめとする広範囲の物質を、部位特異的および共有結合的に結合させるために適用され得る。以下の実施例に記載されるＡＤおよびＤＤＤコンジュゲートエフェクターを構築する融合蛋白質法を利用すれば、事実上任意の蛋白質またはペプチドを、ＤＮＬ（商標）構築物に組み込むことができる。しかしその技術は限定的ではなく、他のコンジュゲーション方法を用いてもよい。

【0045】

該当する融合蛋白質をコードする合成二本鎖核酸を生成するための核酸合成、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅をはじめとし、融合蛋白質を生成するための種々の方法が公知である。そのような二本鎖核酸は、標準の分子生物学的技術により、融合蛋白質生成用の発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄＥｄ，１９８９参照）。そのような好ましい実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分は、エフェクター蛋白質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合し得る。しかし当業者は、ＡＤまたはＤＤＤ部分のエフェクター部分への結合部位が生理学的活性に関与するエフェクター部分およびエフェクター部分の一部（複数可）の化学的性質に応じて変動し得ることを、認識するであろう。種々のエフェクター部分の部位特異的結合は、当該技術分野で公知の技術、例えば二価架橋試薬の使用および／または他の化学的コンジュゲーション技術を利用して実施され得る。

【0046】

ＡＤ部分およびＤＤＤ部分における構造−機能関連性
異なるタイプのＤＮＬ（商標）構築物の場合、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列が用いられ得る。例示的ＤＤＤおよびＡＤ配列を、以下に示す。

【化1】

【0047】

当業者は、ＤＤＤ１およびＤＤＤ２が、プロテインキナーゼＡのヒトＲIIαアイソフォームのＤＤＤ配列に基づいていることを、認識するであろう。しかし代替実施形態において、ＤＤＤおよびＡＤ部分は、以下のＤＤＤ３、ＤＤＤ３ＣおよびＡＤ３に例示される通り、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列、および対応するＡＫＡＰ配列に基づくことができる。

【化2】

【0048】

他の代替実施形態において、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分の他の配列変異体を、ＤＮＬ（商標）複合体の構築に用いてもよい。例えばＰＫＡ ＲＩα、ＲIIα、ＲＩβおよびＲIIβのＤＤＤ部分に対応するヒトＰＫＡ ＤＤＤ配列には４つの変異体しか存在しない。ＲIIα ＤＤＤ配列が、先に開示されたＤＤＤ１およびＤＤＤ２の基礎である。４種のヒトＰＫＡ ＤＤＤ配列を、以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲIIαの残基１〜４４、ＲＩαの残基１２〜６１、およびＲＩβの残基１３〜６６を表す。（ＤＤＤ１の配列がヒトＰＫＡ ＲIIα ＤＤＤ部分からわずかの修飾されていることに留意されたい。）

【化3】

【0049】

ＡＤドメインとＤＤＤドメインとの構造−機能的関連性は、研究の対象であった。（例えば、それぞれの全体的本文が参照により本明細書に組み入れられる、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｎｕｒｏ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６：２９７−３０６； Ｓｔｏｋｋａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３９７−４０８を参照されたい。）

【0050】

例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３９７−４０８）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を検査して、ヒトＤＤＤ配列が、以下の配列番号：１に下線が引かれた、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかにおいて重要となる複数の保存されたアミノ酸残基を含むと結論づけた。（参照により本明細書に組み入れられる、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６の図１を参照されたい。）当業者は、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する上で、所望なら、保存的アミノ酸置換を二量体化およびＡＫＡＰ結合にとってあまり重大でない残基について実施しながら、下線が引かれた残基のいずれかの変動を回避することを、認識するであろう。

【化4】

【0051】

以下により詳細に議論される通り、保存的アミノ酸置換が、２０種の共通するＬ−アミノ酸のそれぞれについて特徴づけられた。つまりＫｉｎｄｅｒｍａｎ（２００６）のデータおよび保存的アミノ酸置換に基づいて、配列番号：１に基づく潜在的な代替ＤＤＤ配列を、表１に示す。表１を案出するにあたり、高度に保存的なアミノ酸置換のみを考慮した。例えば帯電された残基は、 同じ電荷の残基のみで置換され、小さな側鎖を有する残基は、類似サイズの残基で置換され、ヒドロキシル側鎖は、他のヒドロキシルのみで置換されるなどである。アミノ酸の二次構造に対するプロリンの特有の影響により、他の残基がプロリンを置換することはなかった。わずかな数のそのような潜在的な代替ＤＤＤ部分配列を、以下の配列番号：１２〜配列番号：３１に示す。当業者は、ＤＤＤ部分の部類のほとんど非制限的数の代替種が、標準的技術、例えば商業的なペプチド合成装置の使用により、または周知の部位特異的突然変異誘発技術により構築され得ることを、認識するであろう。ＡＤ部分結合に対するアミノ酸置換の影響は、例えばＡｌｔｏら（２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５−５０）に開示される通り、標準の結合アッセイにより即座に決定され得る。

【表1】

【0052】

Ａｌｔｏら（２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５−５０）は、様々なＡＫＡＰ蛋白質のＡＤ配列の生物情報分析を実施して、ＤＤＤへの結合定数を０．４ｎＭとしてＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号：３）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡに結合したＡＫＡＰのペプチドアンタゴニストとして設計された。置換によりＤＤＤへの結合を減少させる傾向があったＡＫＡＰ−ＩＳ配列内の残基を、以下の配列番号：３において下線を引いている。当業者は、ＡＤ配列の配列変異体を設計する上で、所望なら保存的アミノ酸置換をＤＤＤ結合にとってあまり重大でない残基について実施しながら、下線が引かれた残基のいずれかの変動が回避されることを、認識するであろう。表２は、先の表１におけるＤＤＤ１（配列番号：１）について示されたものと類似のＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号：３）の配列における潜在的な保存的アミノ酸置換を示す。

【0053】

限られた数のそのような潜在的な代替ＡＤ部分配列を、以下の配列番号：３２〜４９に示す。同じく、可能なＡＤ部分配列の部類の非常に多数の種が、Ａｌｔｏら（２００３）のデータに基づいて当業者により生成、試験および使用することができる。実際の結合実験に基づき、Ａｌｔｏ（２００３）の図２が、ＤＤＤ部分への結合活性を保持しながら、実施され得る多数の潜在的アミノ酸置換を示すことに留意されたい。

【化5】

【表2】

【0054】

Ｇｏｌｄら（２００６， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３８３−９５）は、クリスタログラフィーおよびペプチドスクリーニングを利用してＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号：５０）を開発し、ＲＩアイソフォームと比較してＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対して５桁高い選択性を示した。下線の引かれた残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合を増大させたアミノ酸置換の位置を、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に相対的に示している。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基は、残基番号４として番号付けされ、Ｃ末端Ａ残基は、残基番号２０である。ＲＩＩαへの親和力に影響を及ぼすように置換が施され得る残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９および２０であった（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）。特定の代替実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列が、ＡＫＡＰ−ＩＳ ＡＤ部分に置換されて、ＤＮＬ（商標）構築物を調製し得ることが、企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ ＡＤ配列に置換され得る他の代替配列を、配列番号：５１〜５３に示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関する置換に、下線が引かれている。配列番号：４に示されたＡＤ２配列と同様に、ＡＤ部分が、追加のＮ末端残基システインおよびグリシン、ならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインを含み得ることが、予期される。

【化6】

【0055】

Ｇｏｌｄらの図２には、以下に示す種々のＡＫＡＰ蛋白質からの付加ＤＤＤ結合配列が開示される。

【化7】

【0056】

Ｓｔｏｋｋａら（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４００：４９３−９９）も、配列番号：６４〜６６に示される、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチド拮抗物質を開発した。そのペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号：６４）、ＲＩＡＤ（配列番号：６５）およびＰＶ−３８（配列番号：６６）と称される。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和力を示したが、ＲＩＡＤおよびＰＶ−３８は、ＲＩに対してより高い親和力を示した。

【化8】

【0057】

Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６：２９７−３０６）は尚も、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対して０．４ｎＭという低い結合定数を有する、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合についての他のペプチド拮抗物質を開発した。様々なＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に示されており、それを以下の表３に再現する。ＡＫＡＰ ＩＳは、合成ＲＩＩサブユニット結合ペプチドを表す。他のペプチドは全て、示されたＡＫＡＰのＲＩＩ結合ドメインから得られる。

【表3】

【0058】

異なるＡＫＡＰ蛋白質のＡＤドメインの間で高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ ＩＳ配列（配列番号：３）を参照しながら下線により以下に示す。残基は、Ａｌｔｏら（２００３）による観察と同様であり、Ｃ末端アラニン残基が付加されている（参照により本明細書に組み入れられる、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４参照）。ＲＩＩ ＤＤＤ配列に対して特に高い親和力を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐおよびＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐのものであった。

【化9】

【0059】

Ｃａｒｒら（２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７３３２−３８）は、ヒト蛋白質と非ヒト蛋白質との、異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列の配列相同性の度合いを検査し、異なるＤＤＤ部分のうちで最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号：１のヒトＰＫＡ ＲＩＩａ ＤＤＤ配列を参照しながら以下に下線を引いて示す。特に保存された残基を、更に斜体により示す。その残基は、ＡＫＡＰ蛋白質への結合にとって重要であることがＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）により示唆されたものと重複しているが、同一ではない。ＤＤＤの配列変異体を設計する上で、最も保存された残基（斜体）の変動を回避することが最も好ましく、保存された残基（下線）の変動を回避することも好ましいが、保存的アミノ酸置換を下線のものまたは斜体のもののいずれでもない残基について考慮され得ることを、当業者は認識するであろう。

【化10】

【0060】

Ｃａｒｒら（２００１）のデータに基づく、ＤＤＤ１（配列番号：１）についての保存的アミノ酸置換の改変された組み合わせを、表４に示す。この置換配列の組み合わせを減少させても、６５，０００を超える可能な代替ＤＤＤ部分配列が存在し、それは過度の実験を行わずとも当業者により製造、試験および使用され得る。当業者は、表１および表２について先に開示されたそのような代替ＤＤＤアミノ酸配列を即座に誘導することができる。

【表4】

【0061】

当業者は、ＤＤＤまたはＡＤアミノ酸配列におけるこれらおよび他のアミノ酸置換を用いて、当該分野において標準の技術とわずかな日常的実験法を利用してＡＤまたはＤＤＤ部分の部類の代替種を製造し得ることを、認識するであろう。

【0062】

インターフェロンおよび他の免疫調整物質
特定の好ましい実施形態において、エフェクター部分は、免疫調整物質である。免疫調整物質は、存在すると、身体の免疫系を変化、抑制または刺激する物質である。使用される免疫調整物質としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびそれらの組み合わせを挙げることができる。特に有用なものは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンフォトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγまたはインターフェロンλなどのインターフェロン、および「Ｓ１因子」と称されるものなどの幹細胞増殖因子を挙げることができる。

【0063】

より好ましい実施形態において、エフェクター部分は、サイトカイン、例えばリンフォカイン、モノカイン、増殖因子および伝統的ポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖蛋白質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；胎盤成長ホルモン（ＰｌＧＨ）、肝細胞増殖因子；プロスタグランジン、繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトーゲン、ＯＢ蛋白質；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミューラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン、例えばインターフェロンα、β、γおよびλ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、Ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えばＴＮＦ−α）およびＬＴである。特に好ましい実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮ−α２ｂである。

【0064】

蛋白質またはペプチドの免疫調整物質、例えばサイトカインのアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、任意のそのような公知の配列は、本発明の実践において用いられ得る。当業者は、サイトカイン配列に関する数多くの公的情報源を知っている。例えばＮＣＢＩデータベースは、多数のサイトカインおよび免疫調整物質、例えばエリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ０００７９９）、ＩＬ−１β（ＧｅｎＰｅｐｔ ＡＡＨ０８６７８）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎＰｅｐｔ ＡＡＡ５２５７８）、ＴＮＦ−α（ＧｅｎＰｅｐｔ ＣＡＡ２６６６９）、インターフェロンα （ＧｅｎＰｅｐｔ ＡＡＡ５２７１６．１）、インターフェロンα２ｂ（ＧｅｎＰｅｐｔ ＡＡＰ２００９９．１）、インターフェロンλ（ＧｅｎＰｅｐｔ ３０Ｇ６＿Ｂ；３ＨＨＣ＿Ａ；３ＨＨＣ＿Ｂ；３ＨＨＣ＿Ｃ；３ＨＨＣ＿Ｄ；ＥＡＷ５６８７０．１；ＥＡＷ５６８６９．１；ＡＡＩ４０８７３．１）と、事実上任意の先に列挙されたペプチドまたは蛋白質免疫調整物質の蛋白質およびコード化核酸配列の両方を含む。該当する本質的に任意の蛋白質またはペプチドエフェクター部分にとって適切なアミノ酸および／または核酸配列を同定することは、当業者にとって日常的なことである。サイトカインの商業的供給元も利用可能であり、例えば完全長ヒトＩＦＮ−α２ｂ ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦヒトクローン ｃａｔ＃ ＨＯＲＦ０１ Ｃｌｏｎｅ ＩＤ ＩＯＨ３５２２１）などを使用してもよい。

【0065】

抗体
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、サイトカインの標的送達のための抗体または抗体フラグメントのインターフェロンまたは他のサイトカインへの結合などにより、ＤＮＬ（商標）構築物に組み込まれ得る。任意の公知抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＤＮＬ（商標）構築物に組み込まれ得る。好ましい実施形態において、該複合体は、癌治療に使用され、該抗体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する。非限定的に炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物をはじめとする、種々の腫瘍関連抗原が、当該技術分野において公知である。他のタイプの標的抗原が、異なる疾患状態の抗体を基にした治療に用いられ、任意のそのような代替抗原を標的とする抗体を組み込んだＤＮＬ（商標）構築物が、使用され得る。

【0066】

ＤＮＬ（商標）構築物において用いられ得る例示的抗癌性抗体としては、非限定的に、ｈＲｌ（抗ＩＧＦ−１Ｒ、２００９年１月２０日出願の米国特許仮出願第６１／１４５，８９６号）、ｈＰＡＭ４ （抗ＭＵＣｌ、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬＩ（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許出願第１０／６７２，２７８号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）およびｈＭＮ−３（抗ＣＥＡ、米国特許第７，５４１，４４０号）が挙げられ、それらの各引用特許または出願の実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる。当業者は、この列挙が非限定的であり、任意の他の公知抗ＴＡＡ抗体がＤＮＬ（商標）構築物に組み込まれ得ることを、認識するであろう。

【0067】

抗原結合抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどは、当該技術分野で周知であり、任意のそのような公知フラグメントが用いられ得る。本明細書で用いられる抗原結合抗体フラグメントは、インタクトまたは親抗体により認識される同じ抗原と結合する抗体の任意フラグメントを指す。事実上任意の該当する抗体またはフラグメントのＡＤおよび／またはＤＤＤコンジュゲートを調製する技術は、公知である（例えば、米国特許第７，５２７，７８７号）。

【0068】

使用され得て、治療薬にコンジュゲートされていない抗体またはそのフラグメントは、「裸の」抗体またはそのフラグメントと呼ばれる。代替実施形態において、抗体またはフラグメントは、１種以上の治療薬および／または診断薬にコンジュゲートされていてもよい。非常に様々なそのような治療および診断薬が、以下により詳細に議論される通り、当該技術分野で公知であり、任意のそのような公知治療または診断薬が、用いられ得る。

【0069】

事実上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製する技術が、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５（１９７５）、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）を参照されたい。簡潔に述べると、マウスに抗原を含む組成物を注射し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得て、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、ハイブリドーマをクローニングして、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選別し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。

【0070】

ＭＡｂは、種々の確立された技術によりハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。そのような単離技術としては、プロテインＡ−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えばＣｏｌｉｇａｎのｐ２．７．１−２．７．１２およびｐ２．９．１−２．９．３を参照されたい。同じく、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐ７９−１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）のＢａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”を参照されたい。

【0071】

免疫原に対する抗体の初回産生の後、抗体を配列決定し、次に組換え技術により調製することができる。ネズミ抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体から得られる抗体成分の使用により、ネズミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的問題を未然に防ぐ。

【0072】

キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の、可変領域によって置き換えられた組換え蛋白質である。キメラ抗体は、対象に投与されると、免疫原性の低下および安定性の上昇を示す。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。例として、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９（１９９４）では、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるネズミＬＬ２のＶ_ＫおよびＶ_ＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのヒトκおよびＩｇＧ_１定常領域ドメインと組み合わせることによりＬＬ２キメラを生成した。

【0073】

ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを生成する技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）参照）。キメラまたはネズミモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽鎖可変ドメイン由来のマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに転移することにより、ヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置き換えられる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に転移すると、多くの場合、抗体親和力の低下または喪失も起こるため、ネズミ抗体の本来の親和力を回復するためには、更なる改変が必要とされる。このことは、ＦＲ領域における１個以上のヒト残基を、それらのネズミ対応部分と置き換えて、エピトープに対する良好な結合親和力を有する抗体を得ることにより達成され得る。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。一般にネズミ対応物とは異なっていて、１つ以上のＣＤＲアミノ酸残基に接近して配置されるか、またはそれに接触している、それらのヒトＦＲアミノ酸残基が、置換の候補物質となろう。

【0074】

ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチ、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを用いる完全ヒト抗体を生成する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；Ｃｏｎｒａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ ａｎｄ Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイ技術によっても構築することができ、それらは全てが当該技術分野で公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりも更に少ない副作用を示すこと、およびインビボにおいて実質的に内因性ヒト抗体として機能することが予測される。特定の実施形態において、請求された方法および手順は、そのような技術により生成されたヒト抗体を利用し得る。

【0075】

１つの代替例において、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）を生成することができる。ヒト抗体は、正常なヒト、または癌などの特定の病的状況を示すヒトから生成され得る（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。罹患した個体からヒト抗体を構築する利点は、循環する抗体レパートリーが疾患関連抗原への抗体に偏り得ることである。

【0076】

この方法論の１つの非限定的な例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリを構築した。概して、全ＲＮＡが、循環血リンパ球から得られた（同上）。組換えＦａｂが、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリ内に挿入された（同上）。ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、重および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特異的なプライマーを用いて、Ｆａｂ ｃＤＮＡライブラリを作製するのに用いられた（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１^ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ｐ９．１−９．２２）に従い実施された。最終的なＦａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによって消化し、バクテリオファージゲノム内に挿入して、ファージディスプレイライブラリを作製した。そのようなライブラリは、当該技術分野で公知の標準的なファージディスプレイ方法によってスクリーニングされ得る（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２参照）。

【0077】

ファージディスプレイは、種々の形式で実施することができ、レビューについては、例えばＪｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成することもできる。全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい。当業者は、これらの技術が例示的なものであり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製およびスクリーニングするための任意の公知の方法が利用され得ることを、認識するであろう。

【0078】

別の代替例において、遺伝子操作されてヒト抗体を生成したトランスジェニック動物を用いて、標準的な免疫化プロトコルを用いて本質的に任意の免疫原性標的に対する抗体を生成することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により開示されている。そのような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（カリフォルニア州フリーモント所在）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似の動物において、マウス抗体遺伝子は、不活性されて機能的なヒト抗体遺伝子によって置き換えらたが、マウス免疫系の残りの部分はインタクトのままである。

【0079】

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の一部をアクセサリー遺伝子および調節配列と共に含有する、生殖系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）によって形質転換された。ヒト可変領域レパートリーが用いられて、抗体産生Ｂ細胞を生成してもよく、該細胞は公知の技術によってハイブリドーマに処理されてよい。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生し、この抗体は、先で議論された標準的な技術によって採取および／または産生されてよい。種々の系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が利用可能であり、それらのそれぞれが、異なるクラスの抗体を産生することが可能である。トランスジェニックにより産生されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保持しながら、治療的能力を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。当業者は、請求された組成物および方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するよう遺伝子操作された任意のトランスジェニック動物を利用してヒト抗体を産生し得ることを、認識するであろう。

【0080】

抗体フラグメント
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により生成され得る。抗体フラグメントは、抗体、例えばＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって生成され得る。あるいはＦａｂ’発現ライブラリが構築されて（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にすることができる。Ｆ（ａｂ）_２フラグメントは、抗体のパパイン消化により生成され得、Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィドの還元により得られる。

【0081】

一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。該ＶＬドメインとＶＨドメインとが会合して、標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）により更に共有結合で連結される。ｓｃＦｖ分子を作製し適切なペプチドリンカーを設計する方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ ａｎｄ Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，”Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ．”ＦＡＳＥＢ Ｖｏｌ ９：７３−８０（１９９５）、およびＲ．Ｅ． Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，”Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ，”ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ ９：１３２−１３７（１９９１）に記載される。

【0082】

単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）の作製技術も、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｏｓｓｉｎｓら（２００６，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ ５１：２５３−２５９）により開示される通り、当該技術分野で公知である。

【0083】

抗体フラグメントは、完全長抗体の蛋白質分解性の加水分解、またはフラグメントをコードするＤＮＡのＥ．コリもしくは別の宿主における発現により、調製され得る。抗体フラグメントは、従来の方法により完全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにこれらに包含される参考資料に記載される。同じくＮｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ．１，ｐ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）およびＣｏｌｉｇａｎのｐ２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４を参照されたい。

【0084】

公知の抗体
使用される抗体は、非常に様々な公知供給元から商業的に得ることができる。例えば種々の抗体分泌ハイブリドーマ株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス所在）から入手可能である。非限定的に腫瘍関連抗原をはじめとする様々な疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されており、そして／または可変領域配列を公開しており、請求された方法および組成物における使用に利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２，８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０号；同第６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６号；同第６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号、同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８号を参照されたい。これらは例示に過ぎず、広範の他の抗体およびこれらのハイブリドーマが当該分野において公知である。当業者は、ほとんどの任意の疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマが、該当する選択された疾患関連標的への抗体に関するＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースの簡単検索によって入手し得ることを認識するであろう。クローニングされた抗体の抗原結合ドメインは、当該分野で周知の標準的な技術を用いて増幅、切除され、発現ベクター内にライゲートされ、適合した宿主細胞内にトランスフェクトされ、蛋白質産生に用いられ得る。

【0085】

請求された方法および組成物の範囲内の癌の治療に使用され得る特定の抗体としては、 ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、エプラツズマブ（ＬＬ２）、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖蛋白質−１（ＥＧＰ−１）または抗ＴＲＯＰ−２）、ＰＡＭ４およびＫＣ４（両者とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡＣＡＭ５。ＣＤ６６ｅとしても公知）、Ｍｕ−９（抗結腸特異性抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ−３１（抗αフェト蛋白質）、抗ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、抗Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異性膜抗原））、ＡＢ−ＰＧｌ−ＸＧｌ−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシツズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；リツキシマブ（抗ＣＤ２０）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）；ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ならびにトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられる。そのような抗体は、当該分野において公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６４２，２３９号および米国特許出願公開第２００４０２０２６６６号（現在は放棄されている）；同第２００５０２７１６７１号；および同第２００６０１９３８６５号であり、それらの実施例の節は参照により本明細書に組み入れられる）。使用される具体的な公知抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲ１（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４０５およびＰＴＡ−４４０６として寄託）およびＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５号）が挙げられ、引用された各特許または出願の本文は、図および実施例の節に関する参照により本明細書に組み入れられる。

【0086】

抗ＴＮＦ−α抗体は、当該技術分野で公知であり、喘息などの免疫疾患を処置するのに用いられ得る。ＴＮＦ−αに対する公知抗体としては、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：８８１−８５）；ネズミ抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２ＢおよびＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード所在）；インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルバニア州マルバーン所在）；セルトリズマブペゴール（ＵＣＢ、ベルギー、ブリュッセル所在）； およびアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、イリノイ州アボットパーク所在）が挙げられる。これらおよび多くの他の公知抗ＴＮＦ−α抗体が、請求された方法および組成物において用いられ得る。使用される他の抗体としては、非限定的に抗Ｂ細胞抗体、例えばベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブまたはｈＬ２４３；トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）；バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）；ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）；エファリズマブ（抗ＣＤｌｌａ）；ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）；抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、ベルギー、ブリュッセル所在）；ナタリズマブ（抗α４−インテグリン）およびオマリズマブ（抗ＩｇＥ）が挙げられる。

【0087】

マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）は、自然および適応免疫ならびにアポトーシスの重要な調節物質である。ＣＤ７４が、ＭＩＦの内因性受容体であることが、報告された（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦを介した細胞内経路での拮抗性抗ＣＤ７４抗体の治療作用は、膀胱、前立腺、乳房、肺、結腸および慢性リンパ性白血病などの癌（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ ＆ Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ５２：１４４６−５４）；腎臓同種移植片拒絶などの腎臓疾患（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９−８３）；および数多くの炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ｅｐｕｂ Ｍａｒｃｈ ２２，２００９； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １０：３３）などの広範囲の疾患状態の処置に使用されてもよく；ミラツズマブ（ｈＬＬｌ）は、ＭＩＦを介した疾患の処置に治療使用される例示的抗ＣＤ７４抗体である。

【0088】

本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する対象を処置するのに用いられ得る。バピネオズマブは、アルツハイマー病の治療に向けた臨床試験の最中である。アルツハイマー病の治療に提案された他の抗体としては、Ａｌｚ ５０（Ｋｓｉｅｚａｋ−Ｒｅｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：７９４３−４７）、ガンテネルマブ、およびソラネズマブが挙げられる。抗ＴＮＦ−α抗体であるインフリキシマブは、アミロイド斑を減少させて認知を改善することが報告された。アルツハイマー病患者の脳の神経原線維タングルにおけるＣＤ７４の発現（Ｂｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２００８；３：１３）から、ＣＤ７４が、抗ＣＤ７４拮抗性ペプチドまたは抗体を介してこの疾患を処置するための別のターゲットであり、単独で、または本明細書に記載されたＤＮＬ構築物を介して用いられる。

【0089】

用いられ得る他の抗体としては、感染性疾患病原体、例えばバクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、または他の病原に対する抗体が挙げられる。そのような感性性病原体に対する多くの抗体は、当該技術分野で公知であり、任意のそのような公知抗体は、請求された方法および組成物中で用いることができる。例えばヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０糖蛋白質抗原に対する抗体は、公知であり、そのような抗体の特定のものは、ヒトにおいて免疫防御的役割を有し得る。例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：８０５５−８０５８，１９９０を参照されたい。公知の抗ＨＩＶ抗体としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６ Ｏｃｔ ３；２０（１５）：１９１１−５）により記載された抗エンベロープ抗体、およびＰｏｌｙｍｕｎ（オーストリア、ビエナ所在）により記載および販売され、米国特許第５，８３１，０３４号、同第５，９１１，９８９号、Ｖｃｅｌａｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＩＤＳ ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０およびＪｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９（全てが参照により本明細書に組み入れられる）にも記載された抗ＨＩＶ抗体が挙げられる。

【0090】

マラリア原虫に対する抗体は、スポロゾイト、メロゾイト、シゾントおよびガメトサイト期を対象とし得る。モノクローナル抗体が、スポロゾイトに対して生成され（サーカムスポロゾイト抗原）、インビトロで、そしてげっ歯類において、スポロゾイトを中和することが示された（Ｎ．Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０７：７１−７３，１９８０）。複数のグループが、トキソプラズモーシスに関与するプロトゾアン寄生虫であるＴ．ゴンジイへの抗体を開発した（Ｋａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：１６９４−１６９９，１９８２；同上，３０：２４０７−２４１２，１９８３）。抗体が、シストソミュラ表面抗原に対して開発され、インビボまたはインビトロでシストソミュラに作用することが見いだされた（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８３：１６３−１７７，１９８１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，８４：８３−９１，１９８２：Ｇｒｙｚｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２７３９−２７４３，１９８２；Ｚｏｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２３２６−２３２８，１９８２；Ｄｉｓｓｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２２３２−２２３４，１９８２）。

【0091】

トリパノソーマ・クルージは、シャーガス病の原因病原体であり、吸血昆虫により伝搬される。インビトロでその寄生虫の１つの形態から別の形態（エピマスチゴート期からトリポマスチゴート期）への分化を特異的に阻害し、細胞表面糖蛋白質と反応する抗体が生成されたが、この抗原は該寄生虫の哺乳動物（血流）形態が存在しない（Ｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３００：６３９−６４０，１９８２）。

【0092】

抗真菌抗体、例えば抗スクレロチニア抗体（米国特許第７，９１０，７０２号）；抗グルクロノキシロマンナン抗体（Ｚｈｏｎｇ ａｎｄ Ｐｒｉｏｆｓｋｉ，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：５８−６４）；抗カンジダ抗体（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｂｕｒｎｉｅ，２００１，２：４７２−７６）；および抗グリコスフィンゴリピッド抗体（Ｔｏｌｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １０：４７）が、当該技術分野で公知である。

【0093】

適切な抗体が、ヒトにおける感染の大部分を担う微生物（バクテリア、ウイルス、原生動物、真菌、他の寄生虫）のほとんどに対して開発され、多くはこれまでにインビトロ診断の目的で用いられてきた。従来の方法により生成され得るこれらの抗体、およびより新しい抗体が、本発明の使用に適する。

【0094】

抗体のアロタイプ
治療抗体の免疫原性は、インヒュージョンリアクションのリスク増大および治療的応答の持続期間短縮に関連する （Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２−０８）。治療抗体が宿主における免疫反応を誘導する度合いは、一部として抗体のアロタイプにより決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３−２１）。抗体のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特異的位置のアミノ酸配列変異に関係する。重鎖γ型定常領域を含むＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプと称される（１９７６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１７：１０５６−５９）。

【0095】

一般的なＩｇＧ１ヒト抗体の場合、最も多くを占めるアロタイプは、Ｇ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１ １ ， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３−２１）。しかし、Ｇ１ｍ３アロタイプも、コーカサス人種において頻繁に生じる（同上）。Ｇ１ｍ１抗体が非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）レシピエント、例えばＧ１ｍ３患者に投与されると免疫反応を誘導する傾向があるアロタイプ配列を含むことが、報告された（同上）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与されると免疫原性にはならない（同上）。

【0096】

ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列内のカバット位置３５６にアミノ酸であるアスパラギン酸を、そしてカバット位置３５８にロイシンを含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、カバット位置の３５６にアミノ酸であるグルタミン酸を、そしてカバット位置の３５８にメチオニンを含む。Ｇ１ｍ１およびｎＧ１ｍ１のアロタイプは両者とも、カバット位置３５７にグルタミン酸残基を含み、それらのアロタイプは、時としてＤＥＬおよびＥＥＭアロタイプと呼ばれる。Ｇ１ｍ１およびｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体の重鎖定常領域配列の非限定的例を、例示的抗体リツキシマブ（配列番号：８５）およびベルツズマブ（配列番号：８６）において示す。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号：８５）

【化11】

【0097】

ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ １：１−７）は、ＩｇＧアロタイプの配列変異特性および免疫原性への影響をレビューした。彼らは、Ｇ１ｍ１７アロタイプのカバット位置２１４のリジン残基に比較して、Ｇ１ｍ３アロタイプがカバット位置２１４のアルギニン残基により特徴づけられることを報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、カバット位置３５６のグルタミン酸、カバット位置３５８のメチオニン、およびカバット位置４３１のアラニンにより特徴づけられた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、カバット位置３５６のアスパラギン酸、カバット位置３５８のロイシン、およびカバット位置４３１のグリシンにより特徴づけられた。ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｅｆｒａｎｃ（２００９）は、重鎖定常領域の配列変異に加えて、カバット位置１５３のバリンおよびカバット位置１９１のロイシンにより特徴づけられるＫｍ１アロタイプ、カバット位置１５３のアラニンおよびカバット位置１９１のロイシンにより特徴づけられるＫｍ１，２アロタイプ、ならびにカバット位置１５３のアラニンおよびカバット位置１９１のバリンにより特徴づけられるＫｍ３アロタイプを含む、κ軽鎖定常領域内のアロタイプ変異体を報告した。

【0098】

治療抗体に関連して、ベルツズマブおよびリツキシマブは、それぞれ非常に多様な血液悪性腫瘍の治療のために使用されるＣＤ２０に対するヒト化抗体およびキメラＩｇＧ１抗体である。表５で、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表５に示す通り、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、ベルツズマブ内のアルギニンに対してリツキシマブ内ではリジンの、カバット位置２１４（重鎖ＣＨ１）の付加配列変異を有する。ベルツズマブがリツキシマブよりも対象における免疫原性が低いことが報告され（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：３３４６−５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｂｌｏｏｄ １１３：１０６２−７０； Ｒｏｂａｋ ＆ Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２５：１３−２５参照）、その作用はヒト化抗体とキメラ抗体の間の差異に起因した。しかしＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプの間のアロタイプにおける差異も、ベルツズマブのより低い免疫原性の原因をなす可能性がある。

【表5】

【0099】

ｎＧ１ｍ１ジェノタイプそれぞれにおける治療抗体の免疫原性を低減するためには、カバット位置２１４のアルギニンにより特徴づけられるＧ１ｍ３アロタイプ、ならびにカバット位置３５６のグルタミン酸、カバット位置３５８のメチオニンおよびカバット位置４３１のアラニンにより特徴づけられるｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプ（ｎｕｌｌ−ａｌｌｏｔｙｐｅ）に対応する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。意外にも、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復皮下投与が、有意な免疫反応をもたらさないことが、見出された。代替実施形態において、Ｇ１ｍ３アロタイプと共通するヒトＩｇＧ４重鎖が、カバット位置２１４にアルギニン、カバット位置３５６にグルタミン酸、カバット位置３５９にメチオニンおよびカバット位置４３１にアラニンを有する。免疫原性が、それらの位置の残基に少なくとも一部関係すると思われるため、治療抗体のためのヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列の使用も、好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３ ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との組み合わせも、治療的投与に使用され得る。

【0100】

アミノ酸置換
特定の実施形態において、開示された方法および組成物は、１つ以上の置換されたアミノ酸残基を有する蛋白質またはペプチドの製造および使用を包含し得る。非限定的例において、ＤＮＬ（商標）構築物の作製に用いられるＤＤＤおよび／またはＡＤ配列は、例えばＤＤＤ−ＡＤ結合親和力を増大させるように、更に最適化されてもよい。

【0101】

一般に、アミノ酸置換が通常、あるアミノ酸を、特性が比較的類似した別のアミノ酸と置き換えること（すなわち、保存的アミノ酸置換）を包含することを、当業者は認識するであろう。様々なアミノ酸の特性、ならびにアミノ酸置換の蛋白質の構造および機能に及ぼす影響は、当該技術分野における広範な研究および知識の主題であった。

【0102】

例えば、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が、得られた蛋白質の二次構造に寄与し、それにより蛋白質と他の分子との相互作用が決定される。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づきハイドロパシー指標が割り当てられ（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）、である。保存的置換を生成する場合、ハイドロパシー指標が±２以内のアミノ酸の使用が好ましく、±１以内のアミノ酸の使用がより好ましく、±０．５以内のアミノ酸の使用が更により好ましい。

【0103】

アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮され得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン （０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５ ±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）のように、アミノ酸残基に親水性値が割り当てられた。アミノ酸と親水性が類似した他のアミノ酸との置換が、好ましい。

【0104】

その他の考慮事項としては、アミノ酸側鎖のサイズが挙げられる。例えば、グリシンまたはセリンのような小型の側鎖を有するアミノ酸を、大型の側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファンまたはチロシンと置換するのは、一般に好ましくなかろう。蛋白質の二次構造に及ぼす様々なアミノ酸残基の影響も、考慮事項である。実証研究により、蛋白質ドメインがα−へリックス、β−シートまたはリバースターン二次構造を採用する傾向に及ぼす異なるアミノ酸の影響が決定されており、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｏｕ ＆ Ｆａｓｍａｎ、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−２４５；１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４参照）。

【0105】

そのような考慮事項および広範な実証研究に基づいて、保存的アミノ酸置換表が作成されており、当該分野で公知である。例えば、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシン。あるいは、Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｈｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。

【0106】

アミノ酸置換に関するその他の考慮事項としては、残基が蛋白質の内側にあるか否か、あるいは溶媒に暴露されているか否かがある。内側の残基に関しては、保存的置換として、ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＨｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐが挙げられる（例えば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのウェブサイトＰＲＯＷＬ参照）。溶媒に暴露されている側鎖に関しては、保存的置換として、 ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＨｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒが挙げられる（同上）。アミノ酸置換の選択を支援するように、ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックスなどな様々なマトリックスが作成された（同上）。

【0107】

アミノ酸置換を決定する上で、正に帯電した残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に帯電した残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間のイオン結合（塩橋）、または隣接するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成など、分子間または分子内結合の存在も考慮され得る。

【0108】

コードされた蛋白質配列において任意のアミノ酸を他の任意のアミノ酸と置換する方法は周知で、当業者にとっては日常的実験方法であり、例えば部位特異的突然変異誘発技術によるか、またはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成および組織化して、発現ベクター構築物内にスプライスすることによる。

【0109】

アプタマー
特定の実施形態において、使用される標的部分は、アプタマーであってもよい。アプタマーの結合特性を構築および決定する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、そのような技術は、米国特許第５，５８２，９８１号、同第５，５９５，８７７号および同第５，６３７，４５９号に記載され、それぞれの実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる。該当する特定の標的に結合するアプタマーの調製およびスクリーニングの方法は、周知であり、例えば米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号であり、それぞれの実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0110】

アプタマーは、合成、組換え、および精製方法をはじめとする任意の公知方法により調製され得、単独で、または同一の標的に対して特異的な他のリガンドと組み合わせて使用され得る。一般に、最低約３つのヌクレオチド、好ましくは少なくとも５つのヌクレオチドが、特異的結合を実行するのに必要となる。１０塩基よりも短い配列のアプタマーも実行可能であるが、１０、２０、３０、または４０のヌクレオチドのアプタマーが好ましくなり得る。

【0111】

アプタマーを、単離、配列決定、および／もしくは増幅するか、または従来のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子として合成し得る。あるいは該当するアプタマーは、修飾されたオリゴマーを含有し得る。通常、アプタマー中に存在する任意のヒドロキシル基が、ホスホン酸基、リン酸基により置換されても、標準の保護基により保護されても、もしくは他のヌクレオチドに追加の結合を調製するために活性化されてもよく、または固体支持体にコンジュゲートされてもよい。１つ以上のホスホジエステル結合は、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＮＲ２により置換されるＰ（Ｏ）Ｏ（ここでＲは、Ｈまたはアルキル（１〜２０Ｃ）であり、Ｒ’は、アルキル（１〜２０Ｃ）である）など、代替的な結合基により置き替えられてもよく、加えてこの基は、ＯまたはＳを介して隣接するヌクレオチドに結合されてもよい。オリゴマー内の全ての結合が同一である必要はない。

【0112】

ＡｆｆｉｂｏｄｙおよびＦｙｎｏｍｅｒ
特定の代替的実施形態で、抗体の代わりにＡｆｆｉｂｏｄｙを使用してもよい。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ（スウェーデン、ソルナ所在）から市販される。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、抗体模倣体として機能し、標的分子との結合に使用される小蛋白質である。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、α−ヘリックス蛋白質スカフォールド上でのコンビナトリアルエンジニアリングにより開発された （Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ８：６０１−８；Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：７７２−７７）。Ａｆｆｉｂｏｄｙの設計は、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインを含む３ヘリックスバンドル構造に基づく （Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５；１９９７）。広範囲の結合親和力を有するＡｆｆｉｂｏｄｙが、バクテリア蛋白質のＦｃ結合活性に関与する１３のアミノ酸の無作為化により製造され得る （Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５； １９９７）。無作為化の後、ＰＣＲ増幅されたライブラリーが、突然変異蛋白質のファージディスプレイによるスクリーニングのために、ファージミドベクターにクローニングされた。ファージディスプレイライブラリーは、標的抗原に対する１種以上のＡｆｆｉｂｏｄｙを同定するために、ファージディスプレイスクリーニング技術を用いて、任意の公知抗原に対してスクリーニングされ得る（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｑｕａｒｔ．Ｊ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２）。

【0113】

ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な^１７７Ｌｕ標識Ａｆｆｉｂｏｄｙが、インビボでＨＥＲ２発現キセノグラフトを標的化することが実証された（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：２７７３−８２）。低分子量放射性標識化合物の蓄積による腎毒性が、初期に問題となったが、アルブミンへの可逆的結合が、腎蓄積を減少させるため、標識Ａｆｆｉｂｏｄｙを用いた放射性核種ベースの治療が可能になった（同上）。

【0114】

インビボ腫瘍画像のために実行可能性放射性標識Ａｆｆｉｂｏｄｙを使用することの実行可能性が、近年になり実証された（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：２７７３−８２）。マレイミド由来ＮＯＴＡを、抗ＨＥＲ２Ａｆｆｉｂｏｄｙにコンジュゲートして、^１１１Ｉｎで放射性標識した（同上）。ＨＥＲ２発現ＤＵ−１４５キセノグラフを含むマウスに投与し、次にγカメラで造影することにより、キセノグラフトの視覚化が可能になった（同上）。

【0115】

Ｆｙｎｏｍｅｒも、抗体に対する同様の親和力および特異性で標的抗原に結合することができる。Ｆｙｎｏｍｅｒは、結合分子の組織化のためのスカフォールドとしてのヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインに基づく。Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインは、高い収率でバクテリア内で産生され得る、全てがヒトの、６３アミノ酸蛋白質である。Ｆｙｎｏｍｅｒは、共に結合して、２種以上の異なる抗原標的への親和力を有する多重特異性結合蛋白質を生成し得る。Ｆｙｎｏｍｅｒは、ＣＯＶＡＧＥＮ ＡＧ（スイス、チューリッヒ所在）から市販される。

【0116】

当業者は、ＡｆｆｉｂｏｄｙまたはＦｙｎｏｍｅｒが、請求された方法および組成物の実践において標的分子として用いられ得ることを認識するであろう。

【0117】

二重特異性および多重特異性抗体
二重特異性抗体は、複数の生物医学的適用例において有用である。例えば腫瘍細胞表面抗原およびＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特異性腫瘍細胞の溶解を誘導し得る。神経膠腫およびＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体を用いて、ヒト患者における脳腫瘍の処置に成功した（Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８−３７１）。特定の実施形態において、本明細書に開示された治療薬コンジュゲーションのための技術および組成物を、標的部分としての二重特異性または多重特異性抗体と共に用いてもよい。

【0118】

二重特異性抗体を製造する数多くの方法が公知であり、例えば米国特許第７，４０５，３２０号に開示され、その実施例の節は、参照により本明細書に組み入れられる。二重特異性抗体は、異なる抗原部位を認識するモノクロナル抗体をそれぞれ産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を含む、クアドローマ法により製造することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。

【0119】

二重特異性抗体を製造する別の方法では、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、２つの異なるモノクローン抗体を化学的につなぐ（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体は、二つの親モノクローナル抗体のそれぞれを、各半分子に縮小し、その後、それらを混合し再酸化してハイブリッド構造を得ることによっても製造することができる（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替法は、２つまたは３つの別個に精製されたＦａｂ’フラグメントを適切なリンカーを用いて、化学的に架橋することを含む。（例えば、欧州特許出願０４５３０８２号参照）。

【0120】

他の方法は、各親ハイブリドーマにレトロウイルス由来シャトルベクターを介して別の選択マーカーを遺伝子導入し、続いて融合するか（ＤｅＭｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）、または別の抗体の重および軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドを用いて、ハイブリドーマ細胞株をトランスフェクトすること、によりハイブリッドハイブリドーマ産生の効率を改善することを含む。

【0121】

同族のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、適切な組成および長さのペプチドリンカー（通常１２を超えるアミノ酸残基からなる）により結合し、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成させることができる。ｓｃＦｖの製造法は、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，１３２，４０５号に開示され、それらの実施例の節は参照により本明細書に組み入れられる。該ペプチドリンカーのアミノ酸残基を１２未満に縮小させると、同一鎖上のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの対合が阻止され、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインと他の鎖上の相補的ドメインとの対合が促されて、機能的な多量体が形成される。３〜１２のアミノ酸残基のリンカーで結合したＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインのポリペプチド鎖は、主として二量体（ダイアボディーと称される）を形成する。０〜２のアミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディーと称される）および四量体（テトラボディーと称される）に傾くが、オリゴマー化の厳密な様式は、リンカーの長さに加えて、Ｖドメイン（Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈ）の組成および方向に依存すると思われる。

【0122】

多重特異性または二重特異性抗体を生成するためのこれらの技術は、低い収率、精製の必要性、低い安定性または大きな労作が必要な技術であることに関連する様々な難題を呈する。より近年になり、「ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）」として公知の技術を利用して、事実上任意の所望の抗体、抗体フラグメントおよび他のエフェクター分子の組み合わせを生成した（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号および米国特許出願第１１／９２５，４０８号参照。これらの各実施例の節は参照により本明細書に組み入れられる）。この技術は、たがいに結合して二量体、三量体、四量体、五量体および六量体の範囲内で複合体構造を組織化することができる、アンカードメイン（ＡＤ）、ならびに二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれる相補的蛋白質結合ドメインを利用する。これらは安定した複合体を高収率で形成させ、大規模な精製を必要としない。ＤＮＬ技術は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体の組織化を可能にする。二重特異性または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野で公知の技術のいずれも、本発明で請求された方法の実践に用いることができる。

【0123】

プレターゲッティング
二重特異性または多重特異性抗体は、プレターゲッティング技術において用いられ得る。プレターゲッティングは元々、骨髄などの正常組織への不適切な毒性に寄与する、直接標的抗体の緩やか血中クリアランスを解決するために開発された多段階の工程である。プレターゲッティングにより、放射性核種または他の治療薬は、血液から数分以内に排出される小さな送達分子（標的化可能な構築物）に結合する。標的化可能な構築物および標的抗原の結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性または多重特異性抗体が、最初に投与され、遊離抗体を循環から排出させ、その後、標的化可能な構築物が投与される。

【0124】

プレターゲッティング法は、例えばＧｏｏｄｗｉｎらの米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；同第７，０１１，８１２号；同第７，３００，６４４号；同第７，０７４，４０５号；同第６，９６２，７０２号；同第７，３８７，７７２号；同第７，０５２，８７２号；同第７，１３８，１０３号；同第６，０９０，３８１号；同第６，４７２，５１１号および同第６，９６２，７０２号に開示され、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。

【0125】

対象における疾患または障害を処置または診断するプレターゲッティング法は、（１）二重特異性抗体または抗体フラグメントを対象に投与すること；（２）場合によりクリアランス組成物を対象に投与し、該組成物により抗体を循環から排出させること；および（３）インターフェロンλなどの１種以上のキレート化または化学結合された治療または診断薬を含有する標的化可能な構築物を対象に投与すること、により提供される。

【0126】

標的化可能な構築物
特定の実施形態において、プレターゲッティングにおいて使用される１種以上の治療または診断薬で標識された標識化可能な構築物ペプチドを選択して、標的化可能な構築物ペプチドの１つ以上の結合部位および疾患または状態に関連する標的抗原の１種以上の結合部位を有する二重特異性抗体に結合させることができる。二重特異性抗体は、抗体が最初に対象に投与され得るプレターゲッティング技術において用いることができる。二重特異性抗体が標的抗原に結合して、非結合抗体が循環から排出されるのに十分な時間が与えられ得る。その後、標的化可能な構築物、例えば標識ペプチドが対象に投与され、二重特異性抗体と結合されて、罹患した細胞または組織に局在化され得る。

【0127】

そのような標的化可能な構築物は、多様な構造であることができ、高親和力で標的化可能な構築物と結合する抗体またはフラグメントの利用可能性に関してだけでなく、プレターゲッティング法および二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体内で用いられる場合、迅速なインビボクリアランスに関しても選択される。強力な免疫応答を惹起するには疎水性薬剤が最良であるが、迅速なインビボクリアランスのためには親水性剤が好ましい。つまり疎水性の特性と親水性の特性とに平衡が確立される。これは、多くの有機部分の生来の疎水性を相殺するために親水性キレート化剤を用いることにより、部分的に成し遂げられ得る。同じく、逆の溶液特性を有する標的化可能な構築物のサブユニット、例えば一部が疎水性であり一部が親水性であるアミノ酸を含有するペプチドが選択され得る。

【0128】

わずか２個のアミノ酸残基、好ましくは２〜１０個の残基を有するペプチドが用いられてよく、キレート化剤などの他の部分にカップリングされていてもよい。リンカーは、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量コンジュゲートでなければならない。より通常には標的化可能な構築物ペプチドは、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（配列番号９８）など、４つ以上の残基を有し、ここでＤＯＴＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン１，４，７，１０−四酢酸であり、ＨＳＧは、ヒスタミンスクシニルグリシン基である。あるいはＤＯＴＡは、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル］−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）または他の公知のキレート化部分で置き換えられていてよい。キレート化部分を用いて、例えば治療および／または診断用放射性核種、常磁性イオンまたは造影剤に結合させてもよい。

【0129】

標的化可能な構築物は、インビボでのペプチドの安定性を上昇させるために、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸を骨格構造に含んでいてもよい。代替実施形態において、非天然アミノ酸またはペプトイドから構築されるような他の骨格構造が、用いられてよい。

【0130】

標的化可能な構築物として用いられるペプチドは、簡便には固相支持体ならびに反復直交脱保護およびカップリングの標準的技術を用いて、自動ペプチド合成装置で合成される。後にキレート化部分または他の物質のコンジュゲーションに用いられるペプチド内遊離アミノ基は、有利にはＢｏｃ基などの標準的保護基で遮断される一方で、Ｎ−末端残基は、血清安定性を上昇させるためにアセチル化され得る。そのような保護基は、当業者に周知である。Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ペプチドが、後の使用のために二重特異性抗体系内で調製される際、有利にはインビボでのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、Ｃ−末端アミドを生成する樹脂から切断される。ペプチド合成の例示的方法は、以下の実施例に開示される。

【0131】

二重特異性抗体とのプレターゲッティングが利用される場合、抗体は、標的組織によって産生される抗体、またはこれに関連する抗原のための第１の結合部位と、標的化可能な構築物におけるハプテンのための第２の結合部位と、を含有する。例示的なハプテンとしては、非限定的にＨＳＧおよびＩｎ−ＤＴＰＡが挙げられる。ＨＳＧハプテンに対する抗体は、公知であり（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体に容易に組み込まれ得る（例えば、実施例の節に関して参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，９６２，７０２号；同第７，１３８，１０３号および同第７，３００，６４４号参照）。しかし、これらに結合する他のハプテンおよび抗体は、当該技術分野において公知であり、Ｉｎ−ＤＴＰＡおよび７３４抗体などが用いられてよい（例えば、実施例の節が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，５３４，４３１号）。

【0132】

治療薬
様々な実施形態において、治療薬、例えば細胞毒性薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、または他の物質を、本明細書に記載されたインターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物に付加治療薬として用いられ得る。使用される薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生薬、アポトーシス促進剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される医薬特性を有し得る。

【0133】

使用される例示的薬物としては、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シトシンアラビノシド、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイルＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼおよびブルトン型キナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイドを挙げることができる。

【0134】

使用されるチロシンキナーゼ阻害剤としては、ＬＦＭ−Ａ１３、ダサチニブ、イマチニブ、またはニロチニブを挙げることができる。

【0135】

使用される毒素としては、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばオンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルス蛋白質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素を挙げることができる。

【0136】

使用されるケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＤＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＰ−１０を挙げることができる。

【0137】

特定の実施形態において、抗血管新生薬、例えばアンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連蛋白質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、多硫酸ペントサン、アンギオポエチン２、インターフェロンα、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、バクリタキセル、アクチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンが、用いられ得る。

【0138】

他の有用な治療薬は、好ましくはｂｃｌ−２またはｐ５３などの癌遺伝子および癌遺伝子産物を対象とするオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。治療用オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。

【0139】

診断薬
診断薬は、好ましくは放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤、および光活性剤からなる群より選択される。そのような診断薬は周知であり、任意のそのような公知診断薬を使用することができる。診断薬の非限定的な例としては、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、または他のガンマ−、ベータ−、またはポジトロン−放射体などの放射性核種を挙げることができる。使用される常磁性イオンとしては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、またはエルビウム（ＩＩＩ）を挙げることができる。金属造影剤としては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、またはビスマス（ＩＩＩ）を挙げることができる。超音波造影剤は、ガス封入リポソームなどのリポソームを含んでいてもよい。放射線不透過性診断薬は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物から選択されてもよい。非限定的にフルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリテリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒドおよびフルオレサミンをはじめとする非常に様々な蛍光標識が、公知である。使用される化学発光標識としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルを挙げることができる。

【0140】

コンジュゲーション技術
特定の実施形態において、ＤＮＬ（商標）構築物は、１つ以上の治療薬または診断薬にコンジュゲートされていてもよい。例えば、^１３１Ｉを蛋白質またはペプチドのチロシンに組み込むか、または薬物をリジン残基のεアミノ基に結合することができる。治療薬および診断薬を、例えば還元型ＳＨ基に結合させることもできる。治療薬または診断薬と蛋白質またはペプチドとの共有結合または非共有結合性コンジュゲートを生成するための多数の方法が、当該技術分野で公知であり、任意のそのような公知方法を使用することができる。

【0141】

治療薬または診断薬は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えばＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）を使用して結合させることができる。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲーションの一般的技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐ１８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）内のＵｐｅｓｌａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”；ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）内のＰｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”を参照されたい。

【0142】

幾つかの実施形態において、キレート化剤を、蛋白質またはペプチドに結合させ、放射性核種などの治療薬または診断薬をキレート化することができる。例示的なキレート化剤としては、非限定的に、ＤＴＰＡ（Ｍｘ−ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡが挙げられる。金属または他のリガンドを蛋白質またはペプチドに結合させるためのキレート化剤のコンジュゲーションおよび使用の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、実施例の節が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６３，４３３号参照）。特定の有用な金属キレート化剤の組み合わせとしては、放射性イメージングでは、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^１８Ｆ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^９４ｍＴｃ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、または^７６Ｂｒなどの６０〜４，０００ｋｅＶの一般的エネルギー範囲内の診断用同位体と共に使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート化剤が、マンガン、鉄、およびガドリニウムなどの非放射性金属と錯化させると、ＭＲＩに有用となる。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡなどの大環状キレート化剤は、それぞれ、種々の金属および放射性金属と共に、最も特にはガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種と共に使用される。そのような金属−キレート化剤錯体は、環サイズを該当する金属に合わせることにより非常に安定化され得る。ＲＡＩＴ用の^２２３Ｒａなどの核種に安定して結合することについて該当する大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート化剤が、包含される。

【0143】

より近年になり、例えばＦ−１８をアルミニウムなどの金属または他の原子と反応させることによる、ＰＥＴ走査技術に使用される^１８Ｆの標識方法が開示された。^１８Ｆ−Ａｌコンジュゲートは、抗体に直接結合されるか、またはプレターゲッティング法で標的化可能な構築物を標識するために使用されるＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、またはＮＥＴＡ等のキレート基と錯化させてもよい。そのようなＦ−１８標識技術は、米国特許第７，５６３，４３３号に開示される。

【0144】

処置の方法
様々な実施形態は、治療有効量のインターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物を対象に投与することを含む、ヒト、家畜また愛玩動物、例えばイヌまたはネコをはじめとする哺乳動物などの対象における癌を処置する方法に関する。インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物の投与は、標的細胞の表面で抗原と結合または反応する治療有効量の抗体を同時にまたは順次投与することにより、補足することができる。好ましい付加ＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ−３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応するＭＡｂからなる群より選択される少なくとも１つのヒト化ＭＡｂ、キメラＭＡｂ、またはヒトＭＡｂを含む。

【0145】

インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物治療は、少なくとも１つの治療薬の同時投与または順次投与のいずれかで更に補足することができる。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ^２のシクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ^２のエトポシド、および１５０〜２００ｍｇ／ｍ^２のカルマスティン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するために使用されるレジメンである。Ｐａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の適切な多剤併用化学療法のレジメンは、当業者に周知である。例えば、ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬＵＭＥ ２、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐ２０２８−２０６８（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９３）内のＦｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，”を参照されたい。例示として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための第一世代化学療法レジメンとしては、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）であり、適切な第三世代レジメンは、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）である。追加的な有用薬物としては、フェニルブチラート、ベンダムスチン、およびブリオスタチン１が挙げられる。

【0146】

インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知方法により配合させることができ、それによりインターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、薬学的に適切な賦形剤との混合物と混和される。滅菌リン酸緩衝生理食塩水が、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤が、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。

【0147】

インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、例えばボーラス注入または持続注入による静脈内投与用に配合させることができる。好ましくは、インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたり注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを、３０分以内に、好ましくは１５分以内でさえ注入することができ、残りを次の２〜３時間にわたり注入することができる。注射用配合剤は、単位投与剤形で、例えばアンプルまたは複数回投与容器で、防腐剤を添加して提供することができる。組成物は、懸濁剤、溶液、または油性もしくは水性媒体中のエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいは有効成分は、使用前に適切なベヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であってもよい。

【0148】

追加的な薬学的方法を利用して、インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物の作用持続時間を制御することができる。制御放出性調製物は、インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物を複合体化または吸着するポリマーの使用により調製することができる。例えば生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックス、ならびにステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２）。そのようなマトリックスからの放出速度は、ＤＮＬ（商標）構築物の分子量、マトリックス内のＤＮＬ（商標）構築物の量、および分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，上記。他の固形投与剤形は、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにその改訂版に記載される。

【0149】

インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、哺乳動物に皮下投与してもよく、または他の非経口経路でさえも投与することができる。好ましくは、該構築物は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたり注入される。

【0150】

より一般的には、ヒトに投与されるインターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的健康状態および過去の病歴に応じて変動する。非限定的例において、投薬量は、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、４００μｇ、 ５００μｇ、７５０μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇまたは１００ｍｇであってもよい。当業者は、毒性の兆候が観察されれば投薬量を減少させるか、または処置を中止してもよいことを、認識するであろう。投薬は、必要に応じて、例えば週２回で４〜１０週間、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間、または週１回で４週間、反復されてもよい。それは、より少ない回数で、例えば１週間おきに数ヶ月間、または月１回もしくは３ヶ月間隔で数ヶ月間、必要に応じて持続療法において与えられてもよい。あるいはインターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、２または３週間に１回の投薬を、合計で少なくとも３回反復して投与されてもよい。あるいは該構築物は、週２回で４〜６週間投与されてもよい。投薬計画は、場合により他の間隔で反復することができ、投薬量は、用量および計画を適切に調整しながら、様々な非経口経路で与えられてもよい。

【0151】

好ましい実施形態において、インターフェロン−抗体ＤＮＬ（商標）構築物は、癌の治療に使用される。癌の例としては、非限定的に、癌腫、リンパ腫、膠芽腫、黒色腫、肉腫ならびに白血病、骨髄腫またはリンパ性腫瘍が挙げられる。そのような癌のより特定の例が以下に記載され：扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌腫、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌腫、陰茎癌および頭頸部癌が挙げられる。用語「癌」は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外の対象の身体部位に細胞が遊走していないもの）および続発性の悪性腫瘍細胞または腫瘍（例えば、転移、つまり悪性腫瘍細胞または腫瘍細胞が元の腫瘍部位と異なる第二の部位へ遊走することから生じるもの）を包含する。

【0152】

癌または悪性腫瘍の他の例としては、非限定的に、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂・尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌、転移性原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経細胞芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌、中咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、異常蛋白血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上原始性神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂・尿管移行細胞癌、移行性腎盂・尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍および先に列挙された臓器系に存在する新生物以外の任意の他の高増殖性疾患が挙げられる。

【0153】

本明細書において記載および請求された方法および組成物は、非限定的に上記の障害を含む悪性または前悪性状態を処置するため、および新生物性または悪性状態への進行を阻止するために使用され得る。そのような使用は、上記の腫瘍または癌への進行が公知である、または疑われる状態、特に、過形成、化生または最も特別には異形成からなる非新生物性の細胞増殖が起こった状態では必要とされる（そのような異常な増殖状態のレビューについて、Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐ６８−７９（１９７６）参照）。

【0154】

異形成は、癌の前兆である場合が多く、主として上皮に見出される。異形成は、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する部位に特徴的に生じる。処置され得る異形成障害としては、非限定的に、無汗性外胚様異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨線維性異形成、開花性骨性異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖端セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成が挙げられる。

【0155】

処置され得る追加的な新生物発生前障害としては、非限定的に、良性の異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腸腺腫および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光角化症が挙げられる。

【0156】

好ましい実施形態において、本発明の方法は、癌、特に先に列挙された癌の増殖、進行および／または転移を阻害するために使用される。

【0157】

追加的な高増殖性疾患、障害および／または状態としては、非限定的に、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに非限定的に線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経細胞芽腫および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫をはじめとする固形腫瘍など、悪性腫瘍および関連の障害の進行および／または転移が挙げられる。

【0158】

更に別の実施形態において、ペグ化ＤＮＬ（商標）複合体が、病原性生物体、例えばバクテリア、ウイルスまたは真菌に感染された対象を処置するのに有用となり得る。処置され得る例示的真菌としては、ミクロスポルム、トリコフィトン、エピデルモフィトン、スポロトリックス・シェンキイ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラスマ・カプスラツム、ブラストマイセス・デルマチチディスまたはカンジダ・アルビカンスが挙げられる。例示的ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス哺乳動物腫瘍ウイルス、バリセラ・ゾスターウイルス、デングウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、またはブルータングウイルスが挙げられる。例示的バクテリアとしては、バチルス・アントラシス、ストレプトコッカス・アガラクチエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、エシェリヒア・コリ、ナイセリア・ゴノルヘア、ナイセリア・メニンギチディス、ニューモコッカス菌種、ヘモフィルス・インフルエンザＢ、トレポネマ・パリヅム、ライム病スピロヘータ、シュードモナス・エルギノサ、マイコバクテリウム・レプラ、ブルセラ・アボルツス、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコプラズマが挙げられる。

【0159】

キット
様々な実施形態が、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関し得る。例示的なキットは、本明細書に記載された少なくとも１つまたは複数のインターフェロン−抗体構築物を含み得る。投与のための成分を含有する組成物が、経口送達など、消化管を介した送達のために配合されていない場合、他の何らかの経路を通してキット成分を送達することが可能なデバイスが含まれ得る。非経口送達などの適用のためのデバイスのタイプの１つは、組成物を対象の身体に注入するために使用される注射器である。吸入用デバイスも、使用され得る。特定の実施形態において、治療薬を、滅菌された液剤または凍結乾燥調製物を含むプレフィルドシリンジまたは自己注射ペンの形態で提供し得る。

【0160】

キット成分が、一緒に、または２つ以上の容器に分けて収容されていてもよい。幾つかの実施形態において、容器は、再構成に適した組成物の、滅菌された凍結乾燥配合剤を含むバイアルであってもよい。キットは、再構成および／または他の試薬の希釈に適した１つ以上の緩衝剤も含有し得る。使用され得るその他の容器として、非限定的にパウチ、トレイ、箱、チューブなどが挙げられる。キット成分を、容器内に収容して滅菌状態を維持してもよい。含まれ得る他の成分は、キットを使用する者のための使用説明書である。

【0161】

実施例
以下の実施例は、本発明の請求を限定するのでなく、例示するために示されている。

【0162】

実施例１．Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ発現ベクター
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターが、組換えＩｇＧの発現に用いられてきた（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，３６：８４−９５）。任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターのＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を促進するために、プラスミドシャトルベクターを作製した。Ｆｃ（Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメイン）の遺伝子を、鋳型としてのｐｄＨＬ２ベクターおよび以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：

【化12】

【0163】

アンプリマーを、ｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でクローニングした。Ｆｃ挿入フラグメントを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩでｐＧｅｍＴから切り出し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによるｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２の消化により調製したＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクター（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３：６８４１−６）とライゲートして、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片を前者から切り出し、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐの ＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限酵素断片と置き換えた。以下は、組換えヒト化ＩｇＧ−ＡＤ２モジュール作製のために生成および使用されたＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターの一部の列挙である：

【化13】

【0164】

実施例２．Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧの産生
トランスフェクションおよび安定したＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ分泌細胞株の選択
全ての細胞株をハイブリドーマＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド所在）中で増殖させた。Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクター（３０μｇ）をＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化により直線化し、エレクトロポレーション（４５０ボルト、２５μＦ）によりＳｐ２／０−Ａｇ１４（２．８×１０^６細胞）内にトランスフェクトした。ｐｄＨＬ２ベクターは、クローン選択およびメソトレキサート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅を可能にする、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を含む。

【0165】

トランスフェクションの後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、０．２μＭのＭＴＸを含む培地中でトランスジェニッククローンを選択した。特異的抗イディオタイプＭＡｂでコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、クローンをＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ産生能についてスクリーニングした。推定クローンからの条件培地をマイクロプレートウェルに移し、融合蛋白質の検出を、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ所在）を用いて成し遂げた。最も高いシグナルを発するウェルを増殖させて、最終的に産生に用いた。

【0166】

Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの産生および精製
融合蛋白質製造のために、ローラーボトル培養物を２×１０^５細胞／ｍｌで播種し、細胞生存率が２５％を下回るまで（約１０日）、ローラーボトルインキュベーター中で５％ＣＯ_２の下、３７℃でインキュベートした。培養ブロスを遠心分離により透明化して濾過し、限外濾過により５０倍にまで濃縮した。Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュール精製のために、濃縮した上清液をプロテインＡ（ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ）アフィニティーカラムにロードした。カラムをＰＢＳでベースラインまで洗浄し、融合蛋白質をｐＨ２．５の０．１Ｍグリシンで溶出した。

【0167】

実施例３．複数の抗体からのＡＤ−およびＤＤＤ−結合ＦａｂおよびＩｇＧ融合蛋白質の生成
先の実施例において記載された技術を利用して、表６に示されたＩｇＧおよびＦａｂ融合蛋白質を構築して、ＤＮＬ構築物に組み込んだ。親抗体およびＤＮＬ構築物の抗原結合特性を保持した融合蛋白質が、組み込まれた抗体または抗体フラグメントの抗原結合活性を示した。

【表6】

【0168】

実施例４．インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂに基づくＤＤＤモジュール生成
哺乳動物細胞内で発現するＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ＩＦＮ−α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅して、以下の特色を含む配列を得た：ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩが制限部位であり、シグナルペプチドがＩＦＮ−α２ｂ由来であり、６Ｈｉｓがヘキサヒスチジンタグ：ＸｂａＩ−シグナルペプチド−ＩＦＮα２ｂ−６Ｈｉｓ−ＢａｍＨＩ（６Ｈｉｓは配列番号：９２で開示される）である。得られた分泌蛋白質は、そのＣ末端で、以下の配列のポリペプチドに融合したＩＦＮ−α２ｂで構成されていた。

【化14】

【0169】

鋳型としての完全長ヒトＩＦＮα２ｂのｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦ ヒトクローン、カタログ番号ＨＯＲＦ０１クローンＩＤ ＩＯＨ３５２２１）およびプライマーとしての以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ増幅を成し遂げた。

【化15】

【0170】

ＰＣＲアンプリマーをｐＧｅｍＴベクター内にクローニングした。ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＩＦＮ−α２ｂとのライゲーション用に以下の通り調製した。Ｃ_Ｈ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：６８４１−６）ベクターを、ＤＤＤ２コード配列を残しＦａｂ遺伝子配列を全て除去するＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ＩＦＮ−α２ｂアンプリマーを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩでｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクター内にライゲートして、発現ベクターＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。

【0171】

哺乳動物細胞によるＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２発現
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２をＳａｌＩで消化して直線化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ骨髄腫細胞内へ安定にトランスフェクトした（実施例の節が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１１／８７７，７２８号参照）。２つのクローンが、ＥＬＩＳＡ法により検出可能なレベルのＩＦＮ−α２ｂを有することが見出された。２つのクローンのうち９５と称する一方のクローンが、実質的に産生能を低下させることなく、無血清培地での増殖に適応した。次いで５週間にわたり、ＭＴＸ濃度を０．１から０．８μＭに増加させて、このクローンを増幅した。この段階で、クローンを限界希釈によりサブクローニングし、最も産生能の高いサブクローン（９５−５）を拡大させた。振盪フラスコ中で発育させた９５−５の産生能は、市販のｒＩＦＮ−α２ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＩＦ００７、ロット番号０６００８０３９０８４）を標準として用いると２．５ｍｇ／Ｌであると推定された。

【0172】

ローラーボトル中で増殖したバッチ培養物からのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の精製
クローン９５−５を、０．８μＭのＭＴＸを含有する無血清ハイブリドーマＳＦＭ全２０Ｌを含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養まで培養した。培養ブロスを処理して、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により以下の通り精製した。上清液を遠心分離により透明化し、０．２μＭで濾過し、１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ ７．５）中へ透析濾過して、３１０ｍＬに濃縮し、最終濃度０．１％になるまでＴｗｅｅｎ２０を添加し、３０ｍＬ Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードした。試料ロードの後、カラムを、１×結合緩衝液中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ ５００ｍＬ、その後、３０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ ７．５の溶液２９０ｍＬで洗浄した。生成物を、２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５ １１０ｍＬで溶出した。約６ｍｇのＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を精製した。

【0173】

Ｅ．コリにおけるＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の産生
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２は、Ｅ．コリにおいても、微生物発酵により、可溶性蛋白質として発現された。コード配列を、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより増幅した。アンプリマーを、Ｎｄｅ ＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、ｐＥＴ２６ｂ Ｅ．コリ発現ベクター内にクローニングした。１００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ振盪フラスコでの１８℃で１２時間の誘導により、蛋白質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞において細胞内発現させた。可溶性ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を、上記ＩＭＡＣにより細胞溶解物から精製した。

【0174】

実施例５．Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧと結合した４つのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬコンジュゲートの生成
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧに結合した４つのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬ複合体（図１）を、以下の通り作製した。簡潔に述べると、選別したＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧを約２モル当量のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２と混和し、この混合物に１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２ｍＭ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加した後、穏やかな条件下、室温で一場還元した。酸化型グルタチオンを２ｍＭになるまで添加し、この混合物を更に１２〜２４時間、室温で保持した。ＤＮＬコンジュゲートをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した。それぞれＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０（ＣＤ２０に対する特異性を有する）、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ２（ＣＤ２２に対する特異性を有する）、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１（ＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を有する）およびＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬ２４３（ＨＬＡ−ＤＲに対する特異性を有する）にアンカーリングされた、４コピーのＩＦＮ−α２ｂを含む、２０−２ｂ、２２−２ｂ、ｈＲ１−２ｂおよび２４３−２ｂと称されるそのような４つのＤＮＬコンジュゲートを調製した。哺乳動物（ｍ）またはＥ．コリ（ｅ）産生ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２から生成された２０−２ｂのＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、それぞれが１つのＩｇＧおよび４つのＩＦＮ−α２ｂグループからなる共有結合性複合体と一致した保持時間を有する主要ピークを示した（図示しない）。同様のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルが、他の３つのＩＦＮ−ＩｇＧコンジュゲートに関して観察された。

【0175】

実施例６．ＩＦＮ−ＩｇＧコンジュゲートのインビトロ活性
２０−２ｂのインビトロでのＩＦＮα生物学的活性を、細胞ベースのレポーター、ウイルス防御およびリンパ腫増殖のアッセイを用いて、市販のペグ化ＩＦＮα２剤であるＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）およびＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）の生物学的活性と比較した。インターフェロン刺激応答要素に融合されたレポーター遺伝子を含有するトランスジェニックヒト前単球細胞株を用いる細胞ベースのキットを使用して、比活性を測定した（図２Ａ〜２Ｄ）。２０−２ｂの比活性（５３００ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、ＰＥＧＡＳＹＳ（１７０ＩＵ／ｐｍｏｌ）およびＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（３４００ＩＵ／ｐｍｏｌ）の両方よりも高かった（図２Ａ）。２０−２ｂと同様に作製された７３４−２ｂ、１Ｒ−２ｂおよび更に５つのＭＡｂ−ＩＦＮα構築物（データは示さない）は、それぞれ同様の比活性（４０００〜８０００ＩＵ／ｐｍｏｌ）を示しており、そのような構造物を生成するためのＤＮＬ法に一貫性があることが実証された（図２Ａ）。４つのＩＦＮα２ｂグループを有することが、ＭＡｂ−ＩＦＮαの効能増強に寄与した。ＩＦＮα当量に正規化すると、比活性／ＩＦＮαは、ＰＥＧＡＳＹＳよりも約１０倍高く、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮよりも約２倍だけ低かった。

【0176】

インビトロでのウイルス防御アッセイにおけるＭＡｂ−ＩＦＮα、ＰＥＧＡＳＹＳおよびＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎの比較により、ＭＡｂ−ＩＦＮαがＩＦＮα２ｂ抗ウイルス活性を保有し、比活性がＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎと同等でＰＥＧＡＳＹＳよりも１０倍高いことが実証された（図２Ｂ）。

【0177】

ＩＦＮα２ｂは、一部の腫瘍株に対して直接的な抗増殖性または細胞毒性作用を有し得る。２０−２ｂの活性を、ＩＦＮαに対して高感受性であるバーキットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）を用いたインビトロ増殖アッセイで測定した（図２Ｃ）。各ＩＦＮα２剤は、インビトロにおいて高い能力（ＥＣ_５０＝４〜１０ｐＭ）で効率的にＤａｕｄｉを阻害した（＞９０％）。しかし、２０−２ｂ（ＥＣ_５０＝Ｏ．２５ｐＭ）は、非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα構築物よりも約３０倍強力であった。２０−２ｂの親抗ＣＤ２０ＭＡｂは、Ｄａｕｄｉをはじめとする多くのリンパ腫細胞株に対して、かなりより高濃度で（ＥＣ_５０＞１０ｎＭ）インビトロでの抗増殖性活性を有する（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：８３８４−９２）。２０−２ｂのインビトロ活性を、ＩＦＮαおよび抗ＣＤ２０の両方に対してより低感受性を有するマントル細胞リンパ腫株であるＪｅｋｏ−１も用いて評価した（図２Ｄ）。Ｊｅｋｏ−１は、親抗ＣＤ２０ＭＡｂに対してわずかに感受性があり、ＥＣ_５０がほぼ１ｎＭで最大阻害率（Ｉ_ｍａｘ）が１０％である。７３４−２ｂで示される通り、Ｊｅｋｏ−１（Ｉ_ｍａｘ＝４３％；ＥＣ_５０＝２３ｐＭ）は、Ｄａｕｄｉ（Ｉ_ｍａｘ＝９０％；ＥＣ_５０＝７．５ｐＭ）よりもＩＦＮα２ｂに対する応答が小さい。７３４−２ｂに比較して２０−２ｂは、Ｊｅｋｏ−１をより高い程度（Ｉ_ｍａｘ＝６５％）で阻害し、二相性の用量反応曲線を示した（図２Ｄ）。１０ｐＭ未満において、ＩＦＮα２ｂ活性に起因する低濃度の応答が観察され、７３４−２ｂと同様にＩ_ｍａｘ＝４３％でプラトーに達する。高濃度の応答は、１００ｐＭを超えると明白になり、Ｉ_ｍａｘは６５％に達した。２０−２ｂの低濃度のＩＦＮα２ｂの応答（ＥＣ_５０＝Ｏ．９７ｐＭ）は、７３４−２ｂよりも２５倍強力であり、Ｄａｕｄｉでの結果と同様であった。

【0178】

２０−２ｂの効力増大が、ＣＤ２０およびＩＦＮαシグナル伝達の相加／相乗作用によるものかを解明するために、親抗ＣＤ２０抗体と７３４−２ｂとの組み合わせ（ベルツズマブ＋７３４−２ｂ）をアッセイした。ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂの用量反応曲線は、１ｎＭを超える部分を除けば７３４−２ｂ単独と大きく類似しており、１ｎＭを超える部分では、前者では増加したが、後者では増加しなかった。これらの結果は、ＭＡｂ標的化が２０−２ｂの低いＥＣ_５０を担うが、そのより大きいＩ_ｍａｘが見かけ上、ＩＦＮα２ｂおよびＣＤ−２０シグナル伝達の相加活性によることを示している。ＣＤ２０シグナル伝達の作用は、２０−２ｂに対する高濃度の応答（ＥＣ_５０＝０．８５ｎＭ）においてのみ明らかであり、これはｖ−ｍａｂに対する応答（ＥＣ_５０＝１．５ｎＭ）に匹敵する。ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂに関しては、２つの応答が重複するため、二相性の用量反応曲線が明白ではなかった。しかし、１ｎＭを超える濃度では相加作用が明らかであった。２０−２ｂのＩ_ｍａｘ（６５％）は、ＩＦＮα２ｂ の反応（Ｉ_ｍａｘ＝４３％）とベルツズマブ（Ｉ_ｍａｘ＝１０％）の応答を加えたものよりも大きいため、ＩＦＮα２ｂとｖ−ｍａｂの作用間の相乗性の可能性が示唆される。

【0179】

ＡＤＣＣ活性
ＩＦＮαは、ＮＫ細胞およびマクロファージを活性化することにより、抗ＣＤ２０免疫療法の基本的な作用機序（ＭＯＡ）であるＡＤＣＣ活性を増強し得る。本発明者らは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用して、２つのＮＨＬ細胞株で２０−２ｂとｖ−ｍａｂとでＡＤＣＣを比較した。複数のドナー由来のＰＢＭＣを用いた反復アッセイにより、ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ細胞の両方について示すように、２０−２ｂの方が、ｖ−ｍａｂに比較してＡＤＣＣをより増強することが実証された（図４Ａ）。この作用は、抗ＣＤ２２ＭＡｂであるエピラツズマブを含み、ＡＤＣＣをわずかに示す、ＭＡｂ−ＩＦＮαである２２−２ｂでも示された（Ｃａｒｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：１３３１−４１）。

【0180】

ＣＤＣ活性
ＣＤＣは、Ｉ型抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｖ−ｍａｂおよびリツキシマブを含む）の重要なＭＯＡであると考えられている。しかし、トシツモマブに代表されるＩＩ型ＭＡｂには、この機能が欠如している（Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５１：１５−２４）にもかかわらず、抗リンパ腫活性を有する。ｖ−ｍａｂとは異なり２０−２ｂは、インビトロでのＣＤＣ活性を示さない（図４Ｂ）。これらの結果は、補体結合がおそらく立体的干渉により見かけ上、阻害されている、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂモジュールに基づく他のＤＮＬ構造物の結果（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：８３８４−９２）と一致する。

【0181】

実施例７．２０−２ｂの薬物動態（ＰＫ）解析
雄Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける２０−２ｂの薬物動態（ＰＫ）特性を評価し、ＰＥＧＡＳＹＳ、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮおよびα２ｂ−４１３（ＤＮＬにより作製されたペグ化ＩＦＮ、米国特許出願第１１／９２５，４０８参照）のものと比較した。様々な時間における血清試料中のＩＦＮ−α濃度を、製造業者による使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ法により決定した。簡潔に述べると、血清試料を、キットに備付けのヒトＩＦＮ−α標準に従って適切に希釈した。マイクロタイタープレートウェルに結合した抗体は、インターフェロンを捕捉する。その後、二次抗体を用いて、結合したインターフェロンを明らかにし、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗二次抗体により定量した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。図３は、ＰＫ解析の結果を表し、２０−２ｂは他の薬剤と比較して、消失が有意に緩やかで、血中保持時間が有意に長いことを示した。２１０ｐｍｏｌの注射用量において、時間単位で算出される薬物動態的な血清中半減期は、８．０時間（２０−２ｂ）、５．７時間（α２ｂ−４１３）、４．７時間（ＰＥＧＡＳＹＳ）および２．６時間（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）であった。消失速度（１／ｈ）は、０．０８７（２０−２ｂ）、０．１２１（α２ｂ−４１３）、０．１４９（ＰＥＧＡＳＹＳ）および０．２６５（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）であった。算出されたＭＲＴ_０．０８→∞（時間）は、２２．２（２０−２ｂ）、１２．５（α２ｂ−４１３）、１０．７（ＰＥＧＡＳＹＳ）および６．０（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）であった。薬物動態パラメーターは、個々の抗体またはサイトカインよりも複合体の性質により決定されるため、サイトカイン−ＤＮＬ複合体のＰＫ特性は、他のサイトカイン部分および抗体部分に一般化可能であり、先に議論された特定の２０−２ｂ構築物に限定されないことが予測される。

【0182】

実施例８．２０−２ｂのインビボ活性
血清安定性
２０−２ｂは、３７℃ではヒト血清中（≧１０日）または全血中（≧６日）で安定であった（図示しない）。２０−２ｂ複合体の濃度を、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。アッセイ時間では、全血または血清中における血中２０−２ｂレベルの検出可能な変化は、本質的に存在しかった。

【0183】

ヒト全血由来のリンパ腫細胞に対する２０−２ｂのエクスビボ有効性
本発明者らは、２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、７３４−２ｂまたはｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂが、エクスビボ設定で全血からリンパ腫または正常なＢ細胞を排除する能力を比較した（図５）。裸の抗ＣＤ２０ＭＡｂの治療有効性は、３つの作用機序（ＭＯＡ）、すなわちシグナル伝達誘導性アポトーシスもしくは増殖停止、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介して実現されると考えられている（Ｇｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：３８２３−３７）。このアッセイにおいて、ｖ−ｍａｂは、３つのＭＯＡ全てを利用し得るのに対し、インビトロの知見では、２０−２ｂは、シグナル伝達およびＡＤＣＣの増強において潜在的に有利となり得るが、ＣＤＣは増強されない。この短期モデルにおいて、２０−２ｂおよび７３４−２ｂのＩＦＮα２ｂ群は、腫瘍細胞に直接作用し、ｖ−ｍａｂのＡＤＣＣ活性を増強して、おそらく若干の免疫刺激作用を有し得る。しかし、インビボで生じ得る自然および適応免疫系の、ＩＦＮαを介した活性化の全領域は、この２日間のエクスビボアッセイでは実現されない。

【0184】

０．０１ｎＭでは、２０−２ｂ（６０．５％）が、ｖ−ｍａｂ（２２．８％）、７３４−２ｂ（３８．６％）またはｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（４１．７％）よりも有意にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させた（図５）。０．１ｎＭでは、２０−２ｂおよびｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂが同程度（８８．９％）にＤａｕｄｉ細胞を枯渇させ、これは、ｖ−ｍａｂ（８２．４％）または７３４−２ｂ（４０．７％）よりも多かった（図５）。１ｎＭでは、７３４−２ｂ（５５．７％）以外では、各薬剤が９５％を超えてＤａｕｄｉを枯渇させた（図５）。示された差異はそれぞれ、統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。

【0185】

Ｒａｍｏｓは、ＩＦＮα２ｂおよびｖ−ｍａｂの両方に対してＤａｕｄｉよりも低感受性である。７３４−２ｂの作用は中等度に過ぎず、各濃度でのＲａｍｏｓ枯渇は２０％未満であった（図５）。０．０１および０．１ｎＭの両方で、２０−２ｂの方が、ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂよりもＲａｍｏｓを枯渇させ、そしてｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂは、ｖ−ｍａｂよりも多くの細胞を除去した（図５）。１ｎＭでは、７３４−２ｂを除く全ての処置により、同様のＲａｍｏｓ枯渇（７５％）が得られた（図５）。示された差異はそれぞれ、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０２）。

【0186】

７３４−２ｂで実証された通り、このアッセイでは、ＩＦＮα２ｂ単独では正常なＢ細胞を枯渇させない。これらの低濃度では、２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂおよびｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂはそれぞれ、同様の用量反応的なＢ細胞枯渇を示し、これはＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓの枯渇よりも著しく低い。いずれの処置でもＴ細胞の有意な枯渇は得られなかった（データは示さない）。

【0187】

ＳＣＩＤマウスにおける２０−２ｂのインビボ有効性
マウスモデルの限界は、ネズミ細胞がヒトＩＦＮα２ｂに対して非常に低感受性であるということである。ヒトにおいて実現され得る２０−２ｂの全般的な治療利益として、自然および適応免疫の両方の増強を挙げることができる。これらの限界を考慮して、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスにおける播種性のバーキットリンパ腫モデルに対する、２０−２ｂの抗リンパ腫性インビボ有効性を試験した。初めに本発明者らは、高感受性の初期Ｄａｕｄｉモデルを試験した（図６Ａ）。接種の１日後に、各群に１低用量の２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂまたは７３４−２ｂを投与した。ｖ−ｍａｂ（ベルツブマブ）または７３４−２ｂの１単一用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、生理食塩水と比較した場合の生存率において、ｖ−ｍａｂに関しては有意な改善が得られた（Ｐ＜０．０００１）が、無関係な対照ＭＡｂ−ＩＦＮαである７３４−２ｂでは得られなかった（図６Ａ）。この改善はわずかであり、生存期間中央値（ＭＳＴ）は生理食塩水での２７日からｖ−ｍａｂでの３４日に増加した。しかし、２０−２ｂの単一用量０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）では、ＭＳＴにおいて、生理食塩水およびｖ−ｍａｂ群の両方を１００日よりも多く上回る改善が得られた（ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ａ）。１９週間後にこの実験を終了し、その時点で、０．７ｐｍｏｌの２０−２ｂ処置群中の長期生存例７匹を剖検したところ、疾患の目に見える証拠は見出されなかった（治癒した）（図６Ａ）。注目すべきことに、最低用量０．０７ｐｍｏｌ（１７ｎｇ）の２０−２ｂでさえも、ＭＳＴが２倍を超えて増加させた（図６Ａ）。

【0188】

次に発明者らは、マウスにおいて処置前に実質的により多くの腫瘍量を発現させる、より困難な進行Ｄａｕｄｉモデルにおいて、２０−２ｂの有効性を評価した（図６Ｂ）。腫瘍接種の７日後、各群に単一低用量（０．７、７．０または７０ｐｍｏｌ）の２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、７３４−２ｂまたはＰＥＧＡＳＹＳを投与した。生理食塩水対照マウスのＭＳＴは、２１日であった（図６Ｂ）。それぞれ（組換えＩＦＮαと比較して）ＰＫを増強するが、腫瘍を標的化しない最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳまたは７３４−２ｂでは、ＭＳＴが倍加した（４２日；ｐ＜Ｏ．０００１）（図６Ｂ）。１００倍低い用量（０．７ｐｍｏｌ）での２０−２ｂ処置では、最高用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳまたは７３４−２ｂと同様の結果（３８．５日）が得られた（図６Ｂ）。１０倍低い用量（７ｐｍｏｌ）の２０−２ｂ処置では、７０ｐｍｏｌのＰＥＧＡＳＹＳまたは７３４−２ｂ処置よりも、有意な生存率改善（８０．５日、２０％ＬＴＳ）が得られた（ｐ＜Ｏ．００１２）（図６Ｂ）。試験した最高用量（７０ｐｍｏｌ）では、２０−２ｂにより１０５日を超えてＭＳＴが改善され、ＬＴＳは１００％であった（図６Ｂ）。本発明者らはこれまでに、ｖ−ｍａｂが比較的低用量（３．５ｐｍｏｌ）でＤａｕｄｉ担持マウスの生存率を増加させ得ると共に、より高用量でＬＴＳが得られることを、早期腫瘍モデルを用いて実証した。しかし、今回の進行腫瘍モデルでは、単一用量７０ｐｍｏｌのｖ−ｍａｂの生存率に対する効果は、有意ではあるがほんのわずかであった（ＭＳＴ＝２４日、ｐ＝０．０００１）（図６Ｂ）。

【0189】

次いで本発明者らは、ＩＦＮαによる直接的阻害に対してＤａｕｄｉよりも低感受性であり、ｖ−ｍａｂによる免疫療法に対して低応答性である、より困難なモデルにおいて２０−２ｂをアッセイした。Ｒａｊｉは、ＩＦＮα２ｂの直接作用に対してＤａｕｄｉに比較して約１０００倍低感受性である。しかしＲａｊｉは、Ｄａｕｄｉと同様のＣＤ２０抗原密度を有し（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，１０８：２７３６−４４）、Ｄａｕｄｉにはかなり劣るものの、ｖ−ｍａｂに対して応答性がある（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｂｌｏｏｄ、１１３；１０６２−７０）。腫瘍接種５日後に治療を開始する進行Ｒａｊｉモデルにおいて、２０−２ｂの有効性を試験した（図７Ａ）。各群に、２週間にわたり計６回（各２５０ｐｍｏｌ）注射を施した。７３４−２ｂでは、生理食塩水よりも生存率が改善されず（ＭＳＴ＝１６日）、ＲａｊｉのＩＦＮαに対する非感受性と一致した（図７Ａ）。ｖ−ｍａｂでは、生理食塩水よりも生存率が有意に改善された（ＭＳＴ＝２６日、ｐ＜Ｏ．０００１）（図７Ａ）。２０−２ｂは、他の全ての処置を上回っていた（ＭＳＴ＝３３日、ｐ＜ＰＯ．０００１）（図７Ａ）。

【0190】

最後に本発明者らは、ＩＦＮαの直接作用に対して低感受性で、ＣＤ２０抗原密度がＤａｕｄｉまたはＲａｊｉに比較して約２５倍低いヒトリンパ腫であり、抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であると考えられている（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）ＮＡＭＡＬＷＡを用いて、２０−２ｂの有効性を調べた（図７Ｂ）。各群に、計６用量（各２５０ｐｍｏｌ）の２０−２ｂまたは７３４−２ｂを投与した。別の１群に、計７用量（各３．５ｎｍｏｌ）のｖ−ｍａｂを投与した。生理食塩水で処置した群のＭＳＴは１７日であった（図７Ｂ）。７３４−２ｂによる処置では、有意ではあるが、非常にわずかな生存率の改善が見られた（ＭＳＴ＝２０日、ｐ＝０．００１２）（図７Ｂ）。２０−２ｂ（ＭＳＴ＝３４日）は、７３４−２Ｂ（Ｐ＝０．０００４）および１４倍高い用量で投与したｖ−ｍａｂ（ＭＳＴ＝２４日、Ｐ＝０．００２６）を上回っていた（図７Ｂ）。

【0191】

結論
結果は、抗ＣＤ２０ＭＡｂを用いたＩＦＮαの標的化により、単独の薬剤または薬剤の組み合わせよりも、免疫サイトカインがより強力で効果的になることを明白に実証している。腫瘍に対するＭＡｂによるＩＦＮα標的化は、単一薬剤の投与計画の頻度を減らし、ＩＦＮ療法に付随する副作用を低減または除去し、非常に増大した有効性をもたらし得る。更に標的化ＩＦＮαは、腫瘍に対する急性免疫応答を誘導し、おそらくは自然および適応免疫の多面的な刺激を介して免疫記憶を誘発することができる（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，１２：１１９−３４）。別のグループは、化学的コンジュゲーションにより作製されるＭＡｂ−ＩＦＮαを産生し、そのような構築物の潜在的な臨床利益を明らかにした（Ｐｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８３、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１５：２１０−１６；Ｏｚｚｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，４８：１３５−４７）。ネズミＩＦＮαおよび抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＭＡｂを含む組換えＭＡｂ−ＩＦＮαは、免疫適格性マウスにおいて、トランスジェニック（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）ネズミＢ細胞リンパ腫の強力な阻害を示し、免疫記憶による防御的な適応免疫応答の誘導も可能であった（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７９：６８８１−８８）。

【0192】

本発明者らは、２０−２ｂによる治療が、ＮＫ、Ｔ４、Ｔ８および樹状細胞をはじめとする複数の免疫細胞の局在的動員および活性化を刺激して、細胞毒性およびＡＤＣＣの増強をもたらし、腫瘍に関する免疫記憶を潜在的に誘導し得ると予測する。しかし、ネズミ細胞は、ヒト細胞よりもヒトＩＦＮα２ｂに対して極めて低感受性（約４ｌｏｇ）である（Ｋｒａｍｅｒｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，３：４２５−３５；Ｗｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５７：２３３−３７）。それゆえ、上記マウスモデルのインビボ試験における２０−２ｂの抗リンパ腫活性は、マウス免疫応答のＩＦＮα２ｂ活性化に起因し得たとしても極わずかである。むしろ殺傷は、主としてリンパ腫細胞に対するＩＦＮα２ｂの直接作用によるものである。

【0193】

本発明者らは、２０−２ｂが、抗ＣＤ２０免疫療法の最も重要なＭＯＡであり得るＡＤＣＣを増強することを示した。しかし、ヒトＩＦＮα２ｂは、マウス宿主の免疫エフェクター細胞の非常に弱い刺激物質であるため、ＩＦＮαに増強されたＡＤＣＣは、おそらくヒトおけるほどは認められないであろう。これらの制限に関わらず、インビボでの結果により、２０−２ｂが、非常に効果的な抗リンパ腫薬剤となる可能性があり、ＩＦＮα感受性のＤａｕｄｉモデルにおいて、ｖ−ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαの１００倍を超える効力を示すことが実証された。ＩＦＮαの直接作用に対して比較的非感受性であるリンパ腫モデル（Ｒａｊｉ／ＮＡＭＡＬＷＡ）または抗ＣＤ２０免疫療法に対して耐性であるリンパ腫モデル（ＮＡＭＡＬＷＡ）に対してさえも、２０−２ｂは、ｖ−ｍａｂまたは非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαよりも優れた有効性を示した。

【0194】

ＩＦＮα２ｂをｖ−ｍａｂに融合することで、循環時間が延長されて腫瘍標的化が可能となることにより、そのインビボでの効力が増大する。Ｄａｕｄｉモデルにおいて、Ｐｋの治療意義が実証され、ここでは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）を緩やかに排出する方が、より高い比活性を有するＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎの急速な排出するよりも優れていた（データは示さない）。２０−２ｂは、ＰＥＧＡＳＹＳまたは７３４−２ｂよりもかなり強力であり、抗ＣＤ２０ＭＡｂを介したリンパ腫標的化が、２０−２ｂの優れた効力および有効性にとって重要であることが示唆される。驚くべきことに、標的化の影響は、インビトロアッセイにおいてさえも明らかであった。シグナル伝達を介したリンパ腫阻害のみが可能なインビトロ増殖実験において、２０−２ｂは、単独またはｖ−ｍａｂと組み合わせた場合の非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαに比較して２５倍低い濃度で活性を示した。エクスビボ設定においては、３つの抗ＣＤ２０ ＭＯＡ全ての関与が可能である。２０−２ｂは、ＣＤＣ活性が無くても、血液由来リンパ腫の枯渇において、単独のＩＦＮαまたはｖ−ｍａｂならびにその組み合わせよりも効果的であり、標的化の重要性が実証される。ＭＡｂ、エフェクターおよび標的細胞は全て、実験を通して制限されていたため、インビボ／エクスビボ試験におけるＭＡｂ標的化の影響は、幾分か意外である。本発明者らは、２０−２ｂが、インビボでのヒト患者において実質的により大きな影響を有すると予測される。

【0195】

２０−２ｂのＩＦＮα２ｂおよびｖ−ｍａｂ成分は、見かけ上は相加的または相乗的に作用して２０−２ｂの効力増強に寄与している可能性がある。インビトロ増殖アッセイでは、少なくとも１つの相加効果が示唆され、これはｖ−ｍａｂおよび７３４−２ｂの組み合わせが、どちらの薬剤単独よりも優れているというエクスビボ実験の結果により裏付けられた。この効果は、２０−２ｂの一部としてのｖ−ｍａｂのＡＤＣＣ活性増加を介して、または７３４−２ｂと組み合わされた場合に、実現され得るが、ＡＤＣＣはインビトロ増殖アッセイにおいては機能せず、更なるメカニズムの存在が示唆される。ｖ−ｍａｂ結合ＣＤ２０により伝達されるシグナルが、ＩＦＮαシグナルを増強することで、効力増大が生じる可能性がある。あるいは、徐々に内部移行するＭＡｂであるｖ−ｍａｂの結合が、Ｉ型ＩＦＮ受容体の内部移行／ダウンレギュレーションを妨げることで、より持続的かつ効果的なＩＦＮα誘導性シグナルが生じる可能性がある。

【0196】

実施例９．（Ｆａｂ）_２−インターフェロンλ１のＤＮＬ構築物は標的化細胞において強力な生物活性を示す
要約および緒言
インターフェロンλ１（ＩＦＮ−λ）は、ＩＩＩ型インターフェロンであり、近年になり抗ウイルスおよび抗腫瘍活性ならびに免疫系調節に関する治療可能性を有するクラスＩＩＩサイトカインファミリーの１種として記載された。ＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの両方を含むＩ型ＩＦＮと同様に、ＪＡＫ１およびＴＹＫ２キナーゼの活性化、ＳＴＡＴ蛋白質のリン酸化、およびＩＦＮ刺激遺伝子因子３の転写複合体の活性化を含むＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達を惹起する（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２１：２３７−５１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：７７４９−５８）。

【0197】

ＩＩＩ型ＩＦＮとＩ型ＩＦＮとの主要な差異は、それぞれの受容体複合体の分布である。ＩＦＮ−α／βは、２種の広範囲に発現されるＩ型インターフェロン受容体を介してシグナル伝達し、ＩＦＮ−α／β療法に関連する全身毒性を少なくとも部分的に担う（Ｐｅｓｔｋａ，２００７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２００４７−５１）。これに対してＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ受容体１（ＩＦＮ−λＲ１）およびＩＬ−１０受容体２（ＩＬ−１０Ｒ２）を含むヘテロ二量体受容体複合体を介してシグナル伝達する。ＩＬ−１０Ｒ２は、造血細胞および非造血細胞の間で遍在的に発現されるが、ＩＦＮ−λＲ１は、高度に限定された発現パターンであり、上皮細胞、メラニン形成細胞および血液細胞内では最高レベルで、一次中枢神経系細胞内では最低レベルである（Ｗｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ ６：８−１８）。血中免疫細胞は、ＩＦＮ−λＲ１を発現するが、それらの細胞は、ＩＦＮ−λの作用を阻害するＩＦＮ−λＲ１の短いスプライスバリアントの分泌によりＩＦＮ−λへの応答の障害を示す（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：７０２−１４）。神経細胞および免疫細胞の応答性が低いことも、Ｉ型ＩＦＮと比較したＩＦＮ−λの毒性低下に寄与している（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：７０２−１４）。

【0198】

ＩＦＮ−λは、ＩＬ−１０に関係するサイトカインと類似の構造特性を示しながら、Ｉ型ＩＦＮと同様の抗ウイルスおよび抗増殖活性を呈する（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ ２１：２３７−５１； Ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：４５０１−９；Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−５４）。例えば複数の試験で、ＩＦＮ−λ１およびＩＦＮ−λ２が、ＤＮＡウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルス（Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−５４；Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４：８９６−９０６）および単純ヘルペスウイルス２型（Ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：４５０１−９）； プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：６３−６８）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Ｒｏｂｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：３８５１−５４；Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４：８９６−９０６）；マイナスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば水疱性口炎ウイルス（Ｋｏｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：６９−７７；Ｐａｇｌｉａｃｃｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：３００７９−８９）およびインフルエンザＡ型ウイルス（Ｊｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：１１５１５−２２）ならびに二本鎖ＲＮＡウイルス、例えばロタウイルス （Ｐｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１ １，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８：７９４４−４９）をはじめとする様々なウイルスのウイルス複製または細胞変性作用を低減し得ることが実証された。ＩＦＮ−λ３は、ＨＣＶ感染における重要なサイトカインとして遺伝子試験より同定され（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：３９９−４０１）、ＥＭＣＶに対して最も強力な活性を有する（Ｄｅｌｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １０：１２５−３１）。

【0199】

ＩＦＮ−λの抗増殖活性は、神経内分泌癌ＢＯＮ１（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＢＢＲＣ ３４４：１３３４−４１）、膠芽腫ＬＮ３１９（Ｍｅａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３１：１０９−１８）、不死化ケラチノサイトＨａＣａＴ（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ７：１１０９−１５）、黒色腫Ｆ０１（Ｇｕｅｎｔｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ９：５１０−２０）、および食道癌ＴＥ−１１（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：１８０−９０）をはじめとする複数のヒト癌細胞株においても確立されている。動物モデルにおいて、ＩＦＮ−λは、自然および適応免疫応答の両方を通して腫瘍のアポトーシスおよび排出を誘導することから、ＩＦＮ−λの局所送達がヒト悪性腫瘍の処置に有用な方策となり得ることが示唆される（Ｎｕｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：５０８６−９８；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：７６８６−９４）。

【0200】

２０ｋＤａポリエチレングリコールにコンジュゲートされたヒトＩＦＮ−λ１（ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１）は、慢性ＨＣＶ感染の処置に関して現在、臨床開発の最中である。第Ｉｂ相試験において、ＩＦＮ−α療法後に再発したジェノタイプ１型ＨＣＶ患者にＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１を投与すると、抗ウイルス活性が、各用量（０．５−３．０μｇ／ｋｇ）で観察され、ウイルス量が２．３ｌｏｇから４．０ｌｏｇに低下した（Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５２：８２２−３２；Ｒａｍｏｓ，２０１０，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３０：５９１−９５）。第ＩＩｂ相試験（Ｚｅｕｚｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５４：５５３８−３９）では、ＨＣＶ患者（ジェノタイプ１および４型）が、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａに対してＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１での処置に有意に高い応答率と、有害事象の頻度減少、インフルエンザ様症状、貧血および骨格筋症状の減少、ならびに好中球減少症および血小板減少症の稀な観察をはじめとし、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａを超えるＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１の追加的利点を有することが報告された。しかし、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａに比較して最高用量のＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１で、より高い割合の肝毒性が認められた（Ｚｅｕｚｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５４：５５３８−３９）。ＩＦＮ−λ１の能力および安全性プロファイルを改善するために、本発明者らは、Ｆａｂ蛋白質の安定した二量体の形式でこのサイトカインを標的抗原につなぐモジュラーＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体を構築した。

【0201】

ヒト化抗体ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）、ｈＭＮ１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）またはｃ２２５（キメラ抗ＥＧＦＴ）から得られたＦａｂ−ＤＤＤ２モジュールは、二量体化してＡＤ２−ＩＦＮ−１に結合し、それぞれイムノサイトカイン（Ｅ１）−λ１、（１５）−λ１、（Ｃ２）−λ１および（ｃ２２５）−λ１を生成した。当業者は、本発明が例示的抗体に限定されず、任意の公知抗体で実施されることを認識するであろう。インターフェロン−抗体構築物の生物活性を評価し、標的化および非標的化細胞株における組換えヒトＩＦＮ−λ１（ｒｈＩＦＮ−λ１）と比較した。本発明者らは、（Ｅ１）−λ１におけるｈＲＳ７ Ｆａｂ二量体が、ヒト子宮頸癌ＭＥ−１８０（ＥＣ_５０＜０．１ｐＭ）、肺扁平上皮癌ＳＫ−ＭＥＳ−１（最大６０％の阻害）、および食道癌ＴＥ−１１（最大４５％の阻害）をはじめとし、複数のＴｒｏｐ２陽性細胞株に対してＩＦＮ−λ１のインビトロ能力が劇的に増加すること（約１０００倍）を観察した。同様にＩＦＮ−λ１を介した増殖抑制が、ＣＥＡＣＡＭ６陽性ＭＥ−１８０細胞（ＥＣ_５０＜１ｐＭ）およびＴＥ−１１細胞におけるｈＭＮ１５ Ｆａｂ二量体により著しく増強された（およそ１００倍）が、ＣＥＡＣＡＭ６陰性ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞においては増強されなかった。

【0202】

（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λｌの抗ウイルス活性を検査するために、本発明者らは、 ＣＥＡＣＡＭ６を発現するがＨＬＡ−ＤＲを発現しないＡ５４９細胞における脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の感染および複製に及ぼすｒｈＩＦＮ−λ１、（１５）−λ１、および（Ｃ２）−λ１の影響を比較した。結果から、ｒｈＩＦＮ−λ１および（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−ｌの両方が、ＥＭＣＶにより誘導された細胞変性作用を効率的に阻止し得るが、（１５）−λ１が、ｒｈＩＦＮ−λ１よりも６倍高く（Ｃ２）−λ１よりも１０倍高い抗ウイルス能を示すことが明らかとなった。更なる研究から、標的細胞において、（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λｌが、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の活性化における重要な事象であるシグナル伝達兼転写活性因子（ＳＴＡＴ）１、２、および３のリン酸化、ならびに抗原表示を促進する腫瘍組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）の細胞表面発現を促進し得ることが示された。これらのデータは総合的に、Ｆａｂ抗体フラグメントの標的結合により介されるＩＦＮ−λ１の細胞表面固定、標的細胞におけるその能力を有意に増強し得て、インビボ安全性プロファイルを改善し得ることを示している。当業者は、これらの作用がＦａｂ抗体フラグメントに限定されず、インタクト抗体または他の抗体フラグメントにおいても起こることを認識するであろう。これらの結果から、ＩＦＮ−λ１に結合した標的抗体または抗体フラグメントを含むＤＮＬ（商標）複合体が、癌、感染性疾患、喘息、または多発性硬化症の処置の治療薬として発揮され得ることが示される。

【0203】

材料と方法
抗体および試薬ヒト化抗体ｈＡ２０−ＩｇＧ（抗ＣＤ２０）、ｈＲＳ７−ＩｇＧ（抗Ｔｒｏｐ−２）、ｈＭＮ１５−ＩｇＧ（抗ＣＥＡＣＡＭ６）およびｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）は、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃから得た。組換えヒトＩＦＮ−λ１、ヒトＩＦＮ−λ１に対するマウスｍＡｂ 、およびヒトＨＬＡ−ＡＢＣに対するマウスＦＩＴＣ−ＩｇＧｌｋは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃから購入した。ＡＤ２部分を含む融合蛋白質のアミノ酸配列および突然変異体（Ｃ１７ ＩＳ）または野生型ＩＦＮλ１に結合したポリ−Ｈｉｓ配列を、以下に示す。ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ｐＹ−ＳＴＡＴｌおよびｐＹ−ＳＴＡＴ３に対するウサギ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃから購入した。ＳＴＡＴ２抗体は、 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。ｐＹ−ＳＴＡＴ２抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。
野生型：ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１

【化16】

【0204】

ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１の発現および精製ＤＮＬ（商標）複合体形成のためのＩＦＮ−λ１モジュールを生成するために、Ｅ．コリ内での発現用に最適化されたＡＤ２、ヒンジリンカーおよびヒトＩＦＮ−λ１（Ｃ１７１Ｓ）を含む合成ＤＮＡ配列を合成し（図８Ａ）、ｐＥＴ−２６ベクターのＭｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングした。プラスミドで形質転換されたＲｏｓｅｔｔａ−ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、１００μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充されたＤｉｆｃｏ ２×ＹＴブロス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で３７℃で増殖させた。細胞密度がＯＤ_６００で１．０に達したら、ＩＰＴＧを０．５ｍＭになるまで添加して、蛋白質発現を３０℃で４時間誘導した。細胞を遠心分離により回収して、−８０℃で一晩凍結させた。ペレットを解凍して、溶解緩衝液（２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１０単位／ｍｌ ベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１００μＭ ＡＥＢＡＳＦ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中でホモジナイズした。ホモジネートを１８，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離して、ペレットをＰＢＳ／１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に再度ホモジナイズし、その後、再度ペレット化した。ペレットを６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０ ２０ｍｌに可溶化して、Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔアフィニティーカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、６Ｍグアニジン、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０で引き続き洗浄した。蛋白質を４Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＨ_２Ｐ０_４、ｐＨ４．５で溶出して、３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６ ２００μｌの添加により中和して、ＤＴＥを６０ｍＭになるまで添加して、溶液を室温に一晩保持した。還元された変性蛋白質溶液を、０．５Ｍアルギニン、２０ｍＭ酸化グルタチオン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に迅速に希釈し、その後、復元緩衝液（０．５Ｍアルギニン、２ｍＭ酸化グルタチオン、０．６ｍＭ ＤＴＥ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）５Ｌで透析して、４℃で７２時間保持した。その後、溶液をＰＢＳ−ＡＧ−２緩衝液 （３５．２ｍＭ Ｎａ_２Ｐ０_４．７Ｈ_２０；０．４Ｍ ＮａＣｌ；６．５ｍＭ ＮａＨ_２Ｐ０_４．Ｈ_２０；１５０ｍＭアルギニン；１５０ｍＭグルタミン酸、ｐＨ ８．０）で透析した。最終生成物を約０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

【0205】

ＤＮＬ（商標）構築物 過去に記載された通り、（Ｅ１）−λ１、（１５）λ１、および（Ｃ２）−λ１をはじめとする（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λｌコンジュゲートを、ｈＲＳ７−、ｈＭＮ１５−、またはｈＬ２４３−Ｆａｂ−ＤＤＤ２モジュレートとＡＤ２−ＩＦＮ−λ１との融合により生成させて、ＤＮＬ（商標）複合体を形成させた（図８Ｂ）（例えば、実施例の節が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５５０，１４３号；同第７，５３４，８６６号；同第７，６６６，４００号；同第７，８５８，０７０号；同第７，８７１，６２２号；同第７，９０１，６８０号；同第７，９０６，１ １８号；同第７，９０６，１２１号；同第７，９８１，３９８号および同第８，００３，１１１号参照）。ｃ２２５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２モジュールを、ＤｒｕｇＢａｎｋの配列（アクセション番号：ＤＢ００００２）により構築した。生成物をＫａｐｐａ−ｓｅｌｅｃｔおよびＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔカラムで順次精製して、４〜２０％ Ｔｒｉｓ グリシンゲルを用いた還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図示しない）。

【0206】

細胞培養および表面結合ＴＥ−１１は、 Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｎａｋａｇａｗａ博士（ペンシルバニア大学）により授与された。Ｈｕｈ−７およびＴ．Ｔｎは、医薬基盤研細胞バンクから購入した。他の細胞株は全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。 ＭＥ−１８０、ＴＥ−１１およびＡ３７５細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７、およびＳＫ−ＭＥＳ−１細胞 は、１０％ＦＢＳを有するＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で増殖させた。Ａ５４９は、１０％ＦＢＳを有するＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させ、Ｔ．Ｔｎは、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。細胞株は全て、５％ＣＯ_２の加湿条件下、３７℃で培養した。

【0207】

結合アッセイの場合、細胞を簡単にトリプシン処理して、新しい培地で懸濁させてペレット化し、その後、ヒト化ｍＡｂ １０μｇ／ｍｌで再懸濁させるが、またはＩＦＮ−λ１ベースの薬物を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで系列希釈した。４℃で４５分間インキュベートした後、細胞をペレット化して、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄して、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃまたはマウス抗ヒトＩＦＮ−λ１と共に４℃で更に４５分間インキュベートし、その後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃでプローブした。３回洗浄した後、結合をフローサイトメトリーにより測定した。ＭＨＣ １の発現の変動を検査するために、細胞をＩＦＮ−λ１剤に３日間暴露、表面ＭＨＣ １を、ヒトＨＬＡ−ＡＢＣと拮抗したＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１ｋとの結合により検出した。ＦＩＴＣ標識非特異性マウスＩｇＧ１ｋを、陰性対照として使用した。

【0208】

インビトロ増殖 ＭＥ−１８０、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＴＥ−１１、およびＴ．Ｔｎ細胞を、９６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルで播種して、３７℃で一晩インキュベートし、その後、増加濃度のＩＦＮ−λ１剤に４日間暴露した。生存細胞の密度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用して決定した。

【0209】

抗ウイルスアッセイ ＩＦＮ−λ１および２（Ｆａｂ）−λ１の抗ＨＣＶ活性を、Ｈｕｈ−７−Ｃｏｎ１と称されるＨＣＶジェノタイプＩｂ Ｃｏｎ１レプリコンを含む安定したＨｕｈ−７細胞株を用いて、ＨＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（中国）Ｃｏ．，Ｌｔｄ（中国、上海）により測定した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、ウイルスレベルのレポーターとしてこのレプリコンに統合する。３つのＩＦＮ−λ１剤：（ｃ２２５）−λｌ、（Ｃ２）−λ１、およびｒｈＩＦＮ−λ１を、このアッセイに含めた。それらのうち（ｃ２２５）−λｌは、Ｈｕｈ−７細胞表面のＥＧＦＲを特異的に標的化するキメラｍＡｂの２つのＦａｂを含むが、（Ｃ２）−λ１およびｒｈＩＦＮ−λ１は、２つの非標的化対照であった。Ｈｕｈ−７−Ｃｏｎ１細胞を、３種の薬剤で３日間処理して、ウイルス複製レベルをルシフェラーゼ活性を測定することにより決定した。その間に、これらの薬剤の細胞毒性も、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、親Ｈｕｈ−７細胞で評価した。

【0210】

別のアッセイにおいて、（１５）−λ１の抗ウイルス活性を、ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）により実施された細胞変性作用阻害アッセイを利用して、ＥＭＣＶでＡ５４９細胞にて測定した。このアッセイに含まれるのは、陰性対照としてのｈＭＮ−１５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２、陽性対照としてのｒｈＩＦＮ−λ１標準（ＰＢＬ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）、および構造コンパートメント用の非標的化対照としての（Ｃ２）−λ１であった。

【0211】

ウェスタンブロット ＭＥ−１８０、ＨｅｐＧ２、およびＡ３７５細胞を、６ウェルプレートに５×ｌ０^５細胞／ウェルで播種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＳＴＡＴ活性化を評価するために、細胞を減少濃度の示されたＩＦＮ−λ１剤で１時間処理し、その後、ＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ（商標）抽出試薬（ＥＭＤ）で溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解して、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に移動させ、その後、全ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、またはＳＴＡＴ３に対するウサギ抗体、およびホスホチロシン特異性抗体ｐＹ−ＳＴＡＴ１、ｐＹ−ＳＴＡＴ２、またはｐＹ−ＳＴＡＴ３と共にブロットして、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギ抗体で検出した。βアクチン抗体を、ローディングコントロールに用いた。

【0212】

８週齢雌胸腺欠損ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン所在）の４群に、（Ｅ１）−λ１ ２．４ｎｍｏｌを皮下注射して、６、１６、２４、および４８時間目に採血した。インタクトの（Ｅ１）−λ１の血清濃度を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して測定した。薬理学的パラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ Ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３， Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州セントルイス所在）を用いて計算した。ＥＬＩＳＡの結果と協調させるために、選択的血清試料中のＩＦＮ−λ１の生物活性も、（Ｅ１）−λ１を標準として使用するＭＥ−１８０細胞のエクスビボ増殖アッセイにより評価した。

【0213】

ＲＴ−ＰＣＲ解析 ＨｅｐＧ２細胞を、ＩＦＮ−λ１剤で２４時間処理し、全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。ミクソウイルス耐性Ａ（ＭｘＡ）遺伝子のｍＲＮＡ発現を、フォワードおよびリバースプライマーと共に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡ合成−５５℃／３０分で１サイクル、そしてＰＣＲ−９４℃／１５秒 、６２℃／３０秒、６８℃／３０秒で２５サイクル、という条件で単離した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡの４５２ｂｐフラグメントを、内部対照として同様の条件下で増幅させた。

【0214】

マウスにおける薬物動態性 ８週齢雌胸腺欠損ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン所在）の４群に、２．４ｎｍｏｌ（Ｅ１）−λ１を皮下注射して、６、１６、２４、および４８時間目に採血した。インタクトの（Ｅ１）−λ１の血清濃度を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して測定した。薬理学的パラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ Ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３， Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ミズーリ州セントルイス所在）を用いて計算した。ＥＬＩＳＡの結果と協調させるために、選択的血清試料中のＩＦＮ−λ１の生物活性も、（Ｅ１）−λ１を標準として使用したＭＥ−１８０細胞のエクスビボ増殖アッセイにより評価した。

【0215】

統計解析 統計学的有意差（ｐ＜０．０５）を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアパケージ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，カリフォルニア州ランチョサンタフェ所在）を用いて全ての結果のＦ検定で決定した。

【0216】

結果
（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１の生成および特徴づけ 点突然変異（Ｃ１７１Ｓ）を、野生型ＩＦＮ−λ１配列に導入して、ＤＮＬモジュールのリフォールディングおよび組織化を有する非対合システイン残基の潜在的干渉を排除した。ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１モジュールの組換え形態を、Ｅ．コリ内で産生して、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により変性条件下で封入体から精製した。蛋白質をジチオトレイトール（ＤＴＥ）で還元し、その後、酸化グルタチオンを含むリフォールディング緩衝液中でリフォールディングして、ジスルフィド結合を形成させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された通り（図示しない）、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１蛋白質が高度に精製されて、主に単量体状態で存在した。最終生成物の収率は、約６ｍｇ／ｍｌＥ．コリ細胞培養物であった。

【0217】

図８Ｂに示される通り、（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１コンジュゲートを、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１モジュールとＦａｂ−ＤＤＤ２モジュールとの組み合わせにより生成させた。この試験において、ｈＲＳ７、ｈＭＮ１５、またはｈＬ２４３のＦａｂ−ＤＤＤ２モジュールを、過剰モル量のＡＤ２−ＩＦＮ−λ１と混合して、１ｍｍｏｌ／Ｌ 還元グルタチオンと共に一晩インキュベートした後、酸化グルタチオン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。反応混合物をＫａｐｐａ−ｓｅｌｅｃｔカラムで精製して、４つのコンジュゲート：（Ｅ１）−λ１、（１５）−λ１、（Ｃ２）−λ１および（ｃ２２５）−λｌの生成に成功した。これらのコンジュゲートの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示し、還元ゲル内で３つのバンド（Ｆａｂ ＤＤＤ２重鎖、Ｆａｂ軽鎖およびＡＤ２−ＩＦＮ−λ１）に、そして非還元ゲル内で主要な高分子量バンドに分解した（図示しない）。

【0218】

抗原の細胞表面発現 ７種のヒト癌細胞株（子宮頸部、ＭＥ−１８０；食道、ＴＥ−１１；肺、Ａ５４９、ＳＫ−ＭＥＳ−１；肝臓、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７；および黒色腫−皮膚、Ａ３７５）の細胞表面のＴｒｏｐ−２、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＥＧＦＲの発現レベルを、フローサイトメトリーにより決定した。図９に示す通り、Ｔｒｏｐ−２は、ＭＥ−１８０およびＴＥ−１１細胞上で高度に発現され、ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞上で中等度に発現された。Ａ３７５およびＳＫ−ＭＥＳ−１を除き、ＣＥＡＣＡＭ６は、他の全ての細胞株で発現され、Ａ５４９およびＨｅｌｐＧ２細胞で最高レベルだった。Ａ３７５細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲの高い発現を示した。ＥＧＦＲの高い発現が、Ｈｕｈ−７、ＭＥ−１８０、ＴＥ−１１、ＳＫ−ＭＥＳ−１およびＡ５４９に対して観察された。これらのデータは、（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１の細胞特異性標的化の更なる試験の基本原理を提供した。

【0219】

細胞表面での（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１の固定化促進 ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１モジュールと比較すると、（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１は、標的細胞への結合親和力の有意な増大を示した。マウス抗ヒトＩＦＮ−λ１ ｍＡｂにより検出された８ｎＭの濃度では、結合シグナルは、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１モジュールに比較して、ＭＥ１８０に対して（Ｅ１）−λ１で１０７倍高く（図１０Ａ）、ＨｅｐＧ２に対して（１５）−λ１で１５倍高く（図１０Ｂ）、Ａ３７５細胞に対して（Ｃ２）−λ１で５０８倍高かった（図１０Ｃ）。これらのデータから、（Ｆａｂ）_２とコンジュゲートされたＩＦＮ−λ１が、標的細胞表面において劇的に高い固定化を呈することが示される。

【0220】

インビトロ増殖抑制および細胞毒性 子宮頸癌ＭＥ−１８０は、ＩＦＮ−λ１に対して高度に感受性のある細胞株として同定された。その細胞増殖は、１０ｎＭを超える濃度のｒｈＩＦＮ−λ１によりほぼ完全に抑制され、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１モジュールは、ｒｈＩＦＮ−λ１と等しい活性を示した（ＥＣ_５０＝０．１ｎＭ、データは示さない）。ＭＥ−１８０に対するＩＦＮ−λ１の比活性は、標的コンジュゲート（Ｅ１）−λ１において有意に高くなっており（ＥＣ_５０＜０．１ｐＭ）、それはＡＤ２−ＩＦＮ−λ１またはＡＤ２−ＩＦＮ−λ１とＡＤ２−ｈｒＳ７−Ｆａｂとの組み合わせよりも１００倍を超える高さである（図１１）。ＭＥ−１８０と比較して、肺扁平上皮癌ＳＫ−ＭＥＳ−１および食道癌ＴＥ−１１細胞は、ＩＦＮ−λ１に対する感受性が低く、最高濃度のＩＦＮ−λ１で、それぞれ最大６０％および４５％の増殖阻害を示すに過ぎなかった（図示しない）。しかし（Ｅ１）−λ１の活性上昇が、これらの２種の細胞株において観察され、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１またはＡＤ２−ＩＦＮ−λ１とＡＤ２−ｈｒＳ７−Ｆａｂとの組み合わせよりも約１０００倍高かった（図示しない）。更に本発明者らは、ＣＥＡＣＡＭ６陽性ＭＥ１８０およびＴＥ−１１細胞株に対する（１５）−λ１の活性を評価した。図１２に示す通り、（１５）−λ１は、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１またはＡＤ２−ＩＦＮ−λ１とｈＭＮ１５−ＩｇＧ−ＡＤ２との組み合わせよりも１００倍高い活性を示した。ＭＥ−１８０に対する（１５）−λ１のＥＣ_５０は、約１ｐＭであり、（Ｅ１）−λ１よりも１０倍高い。

【0221】

抗ウイルス活性 選択的２（Ｆａｂ）−λ１構築物の抗ウイルス活性を、それぞれＨｕｈ−７およびＡ５４９細胞におけるＨＣＶおよびＨＭＣＶに対して測定した。ＥＧＦＲ発現Ｈｕｈ−７細胞において、（ｃ２２５）−λ１（ＥＣ_５０＝０．５６ｐＭ）は、ＨＣＶ複製阻害について、それぞれ非標的化（Ｃ２）−λ１（ＥＣ_５０＝９１．２ｐＭ）および市販のｒｈＩＦＮ−λ１（ＥＣ_５０＝６９．２ｐＭ）よりも１６３倍および１２３倍強力であった（図１３Ａ）。ＣＥＡＣＡＭ６発現Ａ５４９細胞において、（１５）−λ１は、非標的化（Ｃ２）−λ１およびｒｈＩＦＮ−λ１に比較して、それぞれ１０倍および６倍高い抗ＥＭＣＶ活性を示した（図１３Ｂ）。注目すべきこととして、（Ｃ２）−λ１は、ｒｈＩＦＮ−λ１の６５〜７５％の抗ウイルス活性を保持した。これらの結果から、ＩＦＮ−λ１の細胞表面標的化が、抗ウイルス活性を効果的に増強し得ることが示される。

【0222】

細胞シグナル伝達（Ｆａｂ）_２により増強されたＩＦＮ−λ１活性のメカニズムを理解するために、本発明者らは、３つの細胞株において（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１とＡＤ２−ＩＦＮ−λ１のシグナル伝達活性を比較した。リン酸化アッセイにより、１５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２がＨｅｐＧ２細胞において任意のＳＴＡＴリン酸化を誘導しないが、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１は、０．１ｎＭ濃度で検出可能なリン酸化を誘導した（図示しない）。比較において、（１５）−λ１は、３つのＳＴＡＴ、特にＳＴＡＴ１の、有意により大きなリン酸化を誘導し、０．１ｎＭ ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１とほぼ等しい０．０１ｎＭ（１５）−λ１のシグナル伝達活性を示した（図示しない）。ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１に対比して増強された（Ｆａｂ）_２−ＩＦＮ−λ１のＳＴＡＴリン酸化は、（Ｅ１）−λ１標的ＭＥ−１８０および（Ｃ２）−λ１標的Ａ３７５細胞においても実証された（データは示さない）。

【0223】

ＭＨＣクラスＩ抗原（ＭＨＣ−１）の細胞表面発現をアップレギュレートする（１５）−λ１の能力も、フローサイトメトリーによりＨｅｐＧ２細胞において研究した（図示しない）。３日間の１ｎＭまでのｈＭＮ−１５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２でのＨｅｐＧ２細胞の処理は、ＭＨＣ−１（ＭＦＩ〜５０）の表面レベルにおける変化をもたらさなかったが、ＭＦＩ（〜１７０）における３倍を超える増加が、１ｐＭという低濃度の（１５）−λ１で処理された細胞で観察された。ＭＨＣ−１の発現は、１００ｐＭの（１５）−λ１で最大レベル（ＭＦＩ〜２７０）に達した。ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１は、ＭＨＣ−１をアップレギュレートすることが可能であったが、効果的になるにはより高濃度（１００ｐＭ）が必要であった（図示しない）。

【0224】

本発明者らは、ＩＦＮ生物活性の信頼できるマーカーであるミクソウイルス耐性Ａ（ＭｘＡ）遺伝子の発現を（１５）−λ１が誘導する能力も検査し、その結果をＲＴ−ＰＣＲにより決定した。未処理またはｈＭＮ−１５−Ｆａｂ−ＤＤＤ２−処理ＨｅｐＧ２細胞において、ＭｘＡのｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出できなかった（図示しない）。ＭｘＡ遺伝子の誘導は、０．１ｐＭの（１５）−λ１または１０ｐＭのＡＤ２−ＩＦＮ−λ１で処理された細胞において明白であり（図示しない）、つまりＡＤ２−ＩＦＮ−λ１を超える（１５）−λ１の利点、詳細には一般にＩＦＮ−λ１を超える２（Ｆａｂ）−λ１の利点が更に証明された。

【0225】

マウスにおける薬物動態 単一用量（２．４ｎｍｏｌ）の皮下投与の後、インタクトの（Ｅ１）−λ１の平均血清濃度は、６時間で高レベルに達し、４８時間でＥＬＩＳＡ検出の限界未満に降下した（図示しない）。ノンコンパートメント解析から得られた薬物動態（ＰＫ）パラメータは、平均保持時間１２時間と、Ｔ_１／２ ８．６時間およびクリアランス２．２ｍｌ／ｈを示した。血清中の（Ｅ１）−λ１の濃度をＭＴＳアッセイを用いたＭＥ−１８０細胞上での阻害活性によっても測定すると、結果が大きく一致した（図示しない）。

【0226】

組換えＩＦＮ−αは、マウスにおいて非常に急速なクリアランスを有し、わずか０．７時間の平均保持時間を示す。つまり２（Ｆａｂ）−λ１は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α［３７］およびＰＥＧ−ＩＦＮ−λに匹敵する有意に改善されたＰＫを示す（図示しない）。

【0227】

議論
ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、およびＩＦＮ−λ３を含むＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウイルス、抗腫瘍、および抗免疫調整活性の誘発においてＩＦＮ−αと同様に挙動する。より制限された細胞標的物のために、ＩＦＮ−λ１は、ＩＦＮ−αに基づく既存の治療レジメンの潜在的代替法として興味を集めている。本発明者らは、抗体コンジュゲートＩＦＮ−λ１を含むＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）複合体を生成し、ｈＲＳ７（ヒト化抗Ｔｒｏｐ−２）、ｈＭＮ−１５（ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＬ２４３（ヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ）、およびｃ２２５（キメラ抗ＥＧＦＲ）から得られた安定したＦａｂ二量体をＩＦＮ−λ１に部位特異的につないで、それぞれ（Ｅ１）−λ１、（１５）−λ１、（Ｃ２）−λ１および（ｃ２２５）−λ１と称される新規な免疫サイトカインを得ることにより、標的癌細胞株においてＩＦＮ−λ１の抗増殖能を最大１，０００まで改善した。（１５）−λ１または（ｃ２２５）−λ１を介したＩＦＮ−λ１の、各抗原発現細胞への標的送達も、脳心筋炎ウイルスに対して（１５）−λ１によるヒト肺腺癌上皮細胞株Ａ５４９（ＥＣ_５０＝２２．２ｐＭ対２２３ｐＭ）、およびＣ型肝炎ウイルスに対して（ｃ２２５）−λ１によるヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ−７（ＥＣ_５０＝０．５６ｐＭ対９１．２ｐＭ）において実証された通り、非標的（Ｃ２）−λ１と比較すると抗ウイルス活性も有意に上昇させた。これらの意外で予測されなかった結果は、マウスにおける（Ｅ１）−λ１の好適な薬物動態プロファイル（Ｔ_１／２ ８．６時間）と共に、抗体−標的細胞へのＩＦＮ−λ１のより良好な局在化およびより強力な結合に起因する。

【0228】

Ｔｒｏｐ−２およびＣＥＡＣＡＭ６は、標的細胞上でＩＦＮ−λ１の受容体よりも高レベルで発現される（図示しない）。その結果、１０倍多いＩＦＮ−λ１分子が、ＤＮＬコンジュゲートにより標的細胞に結合され得る。Ｔｒｏｐ−２またはＣＥＡＣＡＭ６とＩＦＮ−λ１のヘテロ二量体受容体とのコライゲーションも、ＭＥ−１８０における（Ｅ１）−λ１について示された通り、ＩＦＮ−λ１の結合強度をほぼ１００倍増加させ得る。免疫コンジュゲートされたＩＦＮ−λ１の標的送達は、単独または組み合わせとして別個に投与された抗体およびインターフェロンよりも、腫瘍および感染疾患治療に有意に大きな生物活性をもたらす。

【0229】

ＩＦＮ−αの治療代替物としてのＩＦＮ−λの能力は、臨床試験においてＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ａを超える改善された安全性プロファイルを示すＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１によって探索の最中である（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１８２：８０−８７； Ｒａｍｏｓ，２０１０，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ３０：５９１−９５）。しかし用量限定的な肝毒性をはじめとする若干の重篤な有害事象の割合は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１およびＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ａで処置された患者では同様であり、最高用量のＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１で処置された患者ではより頻度が高い（Ｚｅｕｚｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５４：５５３８−３８）。その一方で、ＩＦＮ−λは、特定の癌（Ｍｅａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３１：１０９−１８）またはウイルス（Ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ ２６：３７３−７９）に対してＩ型インターフェロンよりも効果が低かった。本発明者らは、多量に発現された表面抗原に特異的な抗体にＩＦＮ−λを結合させると、標的細胞での局在化が増加し得て、より大きな能力と、うまくいけば非標的細胞へのより低い毒性をもたらすと推定している。したがって本発明者らは、Ｆａｂの安定化二量体に部位特異的にコンジュゲートされたＩＦＮ−λ１をそれぞれが含む、ＩＦＮ−λに基づく免疫サイトカインの４つのプロトタイプを開発し、コンジュゲートされていない親モジュールを単独または組み合わせで比較して、それらの優位性を実証した。改善された効果が、抗腫瘍および抗ウイルスアッセイの両方で示され、構成的抗体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）により可能になる細胞表面結合およびシグナル伝達の上昇と一致する。

【0230】

抗腫瘍試験において、本発明者らは、最大阻害が８０％を超えＥＣ_５０が文献で報告された他の細胞株よりも２０倍低いＩＦＮ−λ１に対して最も感受性のある細胞株として、ＭＥ−１８０を樹立した（Ｚｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＢＢＲＣ ３４４：１３３４−４１；Ｍｅａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３１：１０９−１８；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２−８，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ７：１１０９−１５；Ｇｕｅｎｔｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ９：５１０−２０）。その上、ＭＥ−１８０上でのＴｒｏｐ−２の豊富な発現により、これらの腫瘍細胞は（Ｅ１）−λ１に対して高度に感受性になり、増殖阻害は１ｆＭで検出可能であり、ＥＣ_５０（＜０．１ｐＭ）はＡＤ２−ＩＦＮ−λ１（ＥＣ_５０〜１００ｐＭ）よりも１０００倍低い。阻害能の同様の増強が、ＴＥ−１１、ＳＫ−ＭＥＳ−１および他の癌細胞株においても観察された。本明細書では評価していないが、ＩＦＮ−λは、自然および適応免疫反応も誘導すること、ならびにＢ１６黒色腫、ＢＮＬヘパトーマ、およびＭＣＡ２０５線維肉腫をはじめとする複数のネズミ癌細胞株におけるＩＦＮ−λの構成的発現が、インビトロ抗増殖活性の欠如にもかかわらず、免疫細胞および関連のサイトカインを動員することによりシンジェニックマウスモデルにおける腫瘍の増殖および転移を著しく抑制したことを示す近年の試験の見地から（Ｎｕｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：５０８６−９８；Ａｂｕｓｈａｈｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５９：１０５９−７１；Ｌａｓｆａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：４４６８−７７）、本発明者らは、ＩＦＮ−λの標的送達が癌細胞におけるＩＦＮ−λの構成的発現癌に類似し、癌の免疫療法における局所免疫反応および細胞毒性増大をもたらすと仮定する（Ｐａｒｄｏｌｌ ａｎｄ Ｄｒａｋｅ，２０１２，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０９：２０１−９）。

【0231】

抗ウイルス試験において、ＨＣＶジェノタイプ１ｂ Ｃｏｎ１レプリコンの宿主となるＥＧＦＲ陽性Ｈｕｈ−７細胞に対する（ｃ２２５）−λ１の特異的標的化は、非標的化ｒｈＩＦＮ−λ１および（Ｃ２）−λ１よりも抗ウイルス能のそれぞれ１２３倍および１６３倍の増強を示した。別のアッセイにおいて、ＥＭＣＶでチャレンジされたＣＥＡＣＡＭ６陽性Ａ５４９細胞に対する（１５）−λ１の標的化は、非標的化ｒｈＩＦＮ−λ１および（Ｃ２）−λ１よりも抗ウイルス防御性のそれぞれ６倍および１０倍の改善を示した。（ｃ２２５）−λ１と（１５）−λ１の間の能力差は、標的細胞／ウイルス系のＩＦＮ−λに対する異なる感受性による可能性がある。過去の試験（Ｍａｒｃｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １３１：１８８７−９８）において、ｒｈＩＦＮ−λ１は、Ｈｕｈ−７／ＨＣＶ系のｒｈＩＦＮ−αよりも１０倍低かったが、Ａ５４９／ＥＭＣＶでは２１０倍低い（Ｍｅａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３１：１０９−１８）。（１５）−λ１に誘導された抗ウイルス活性の増強は、（ｃ２２５）−λ１と比較して、標的細胞においては高くないが、それでもペグ化ＩＦＮが非ペグ化ＩＦＮの約３０％以下の活性しか保持しないことを考慮すると、意義深い知見であり（Ｇｒａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：６３２７−３６）、ＡＤ２−ＩＦＮ−λ１の比活性は、ｒｈＩＦＮ−λ１と類似していた。つまり２（Ｆａｂ）λ１は、現行の臨床試験で用いられるＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１と同じまたはそれよりも少ない投与計画で、より少ない用量を可能にし得る。

【0232】

治療薬としての組換えＩＦＮは、非常に急速なクリアランス速度によって限定される。本発明者らの過去の試験に基づけば、組換えＩＦＮ−α−２ｂ、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ａ、およびＰＥＧ−ＩＦＮ−α−２ｂは、それぞれ０．７、１４．９、および９．３時間の半減期を示した（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９，Ｂｌｏｏｄ １１４：３８６４−７１）。つまりマウスにおいてＰＥＧ−ＩＦＮ−αと同等の半減期（８．６時間）が、インビボ治療使用で見込まれる。

【0233】

実施例１０．アルツハイマー病の処置のための（Ｆａｂ）_２−インターフェロンλ１のＤＮＬ構築物
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の記憶障害、錯乱、緩やかな身体機能の悪化、そして最終的に死を迎える変性性脳障害である。世界中でおよそ１５００万の人々が、 アルツハイマー病に罹患している。組織学的に該疾患は、主として連合皮質、大脳辺縁系および大脳基底核に見出される、老人斑により特徴づけられる。これらの斑の主要な構成成分は、アミロイドβペプチド（Ａβ）であり、それはβアミロイド前駆蛋白質（βＡＰＰまたはＡＰＰ）の切断生成物である。

【0234】

Ａβは、アルツハイマー病の神経病理における中心的役割を有するようである。該疾患の家族性形態は、ＡＰＰおよびプレセニリン遺伝子における突然変異に関連づけられた（Ｔａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３：１５９−１６８；Ｈａｒｄｙ，１９９６，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２８：２５５−２５８）。これらの遺伝子における疾患関連の突然変異は、アミロイド斑中に見出される主な形態であるＡβの４２アミノ酸形態の産生増加をもたらす。ＡＰＰの疾患関連突然変異体を過剰発現するトランスジェニックマウスをヒトＡβで免疫化すると、プラークバーデンおよび関連の病態が減少する （Ｓｃｈｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−１７７；ＷＯ９９／２７９４４号）。Ａβを対象とする抗体の末梢投与も、脳のプラークバーデンを減少させる（Ｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６（８）：９１６−９１９；ＷＯ２００４／０３２８６８号；ＷＯ００／７２８８０号）。

【0235】

抗体療法は、アルツハイマー病の処置および予防の有望なアプローチを提供する。しかし、Ａβ１−４２を含むワクチンを用いたヒト臨床試験は、患者の亜集団における髄膜脳炎により一時中断された。Ｏｒｇｏｇｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｒｕｏｌｏｇｙ ６１：７−８（２００３）；Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１４：１１−２０（２００４）。Ｎ末端特異性抗Ａβ抗体による受動免疫化は、トランスジェニックマウスにおいて、拡散アミロイドを有意に減少させたが、脳内微小出血の頻度が増加した。Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１３７９ （２００２）。低い毒性でアルツハイマー病を処置する改善された抗体および／または免疫コンジュゲートが、依然として求められている。

【0236】

インターフェロンλ１に結合したアレムツズマブを含むＤＮＬ（商標）複合体を、実施例９に従って調製する。インターフェロン−抗体複合体を、アルツハイマー病と診断されたヒト患者に投与量２ｍｇで週２回４、８、または１２週間にわたり静脈内投与する。有効性を、ＡＤＡＳ−ｃｏｇおよびＣＥＲＡＤ神経精神学的テストバッテリーを含む神経精神学的試験により測定する。

【0237】

ＡＤＡＳ−ｃｏｇにおけるわずかな改善（１５％）が、最低投薬量処置群を除く全ての患者において、処置の１２週間後に観察された。同様の知見が、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）について観察された。視覚的構成能力が、患者１０名中４名で改善される。インターフェロン−抗体投与の重篤な有害作用は、全く観察されない。

【0238】

インターフェロンλ１に結合したミラツズマブ（抗ＣＤ７４ヒト化ＩｇＧ）またはそのＦａｂフラグメントを含むＤＮＬ（商標）複合体を、実施例９に従って調製する。この複合体を、初期アルツハイマー病の７５歳女性に、用量２ｍｇで週２回、８週間にわたり静脈内投与する。軽微な吐気および低血圧の幾つかのエビデンスが、各注入後に認められたが、次の３日間を過ぎると消失する。有効性は、認知機能検査（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）およびＣＥＲＡＤ神経精神学的バッテリーにより、ベースラインならびに治療後２週目および８週目に測定する。その結果は、認知機能ならびに一般的な精神学的状態およびコミュニケーション状態に２０％の改善を示す。処置を４ヶ月後に再度実施したが十分に耐容性があり、患者は視覚的構成能力をはじめとする認知機能の改善維持を示す。

【0239】

インターフェロンλ１に結合したｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲヒト化ＩｇＧ）またはそのＦａｂフラグメントを含むＤＮＬ（商標）複合体を、実施例９に従って調製する。この複合体を、アルツハイマー病の８２歳女性に、用量１ｍｇで週２回、８週間にわたり静脈内投与する。軽微な吐気および低血圧の幾つかのエビデンスが、各注入後に認められたが、次の３日間を過ぎると消失する。有効性は、認知機能検査（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）およびＣＥＲＡＤ神経精神学的バッテリーにより、ベースラインならびに治療後２週目および８週目に測定する。その結果は、認知機能ならびに一般的な精神学的状態およびコミュニケーション状態に１７％の改善を示す。処置を４ヶ月後に再度実施したが十分に耐容性があり、患者は視覚的構成能力をはじめとする認知機能の改善維持を示す。

【0240】

実施例１１．喘息の処置のための（Ｆａｂ）_２−インターフェロンλ１のＤＮＬ構築物
喘息は、刺激物質に対する気管・気管支の過敏反応により特徴づけられる異種起源の疾患群である。臨床的に喘息は、気管・気管支の広範にわたる狭窄、粘稠性分泌物と、呼吸困難、咳および喘鳴の発作により顕在化され、気道抵抗性の上昇、肺およびのどの過膨張、通気および肺血流の異常分布に陥る。該疾患は、無症状期間の間に挟まれた急性症状のエピソード期間において顕在化される。急性エピソードにより低酸素症になり、致命的となる可能性がある。一般的な世界人口のおよそ３％が、該疾患に罹患している。喘息の症状は、 惹起する抗原、環境的要因、職業的要因、身体活動、および情動的ストレスの存在およびレベルにより増悪し得る。喘息は、メチルキサンチン（テオフィリンなど）、βアドレナリン作動薬（カテコラミン、レゾルシノール、サリゲニン、およびエフェドリンなど）、グルココルチコイド（ヒドロコルチゾンなど）、肥満細胞脱顆粒の阻害物質（即ち、クロモリンナトリウムなどのクロモン）、および抗コリン作動薬（ストロピンなど）で処理され得るが、喘息を処置するための改善された方法および組成物が、求められている。

【0241】

８０歳男性気管支喘息患者が、喘息の急性増悪を伴う風邪を発症し、頻回の咳により多量の粘稠性の黄色ムチンを生じる。その患者は、１日２回、６日間にわたりエアロゾル吸入により（１５）−λ１を投与される。抗体−インターフェロン複合体は、実施例９に記載された通り調製する。最初の吸入の２、３時間以内に、呼吸が著しく改善し、咳の回数が減少する。この治療過程の終了時に、呼吸が改善して粘液性の咳が著しく減少することにより、情動的状態と同様に身体運動下での状態が、改善するようである。

【0242】

実施例１２．多発性硬化症の処置のための（Ｆａｂ）_２−インターフェロンλ１のＤＮＬ構築物
多発性硬化症（ＭＳ）は、自己反応性Ｔ細胞が血液脳関門を横断して髄鞘を攻撃し、炎症を起こして脱髄および軸索変性に至る、自己免疫疾患である。青少年期の予測不能な神経障害エピソードに続き、離散的攻撃（再発型）により、または時間の経過と共に徐々に、身体的および認知的障害が増えていく。治癒は知られていないが、インターフェロンβ療法が、再発寛解型多発性硬化症の現在の最前線処置であり、再発率の低下に関する有効性が実証されている。しかしＩＦＮ療法は、インフルエンザ様症状、骨髄抑制、自己免疫疾患の発症または増悪、好中球減少症、血小板減少症、および神経精神学的作用などの副作用による著しい病的状態を伴う。

【0243】

インターフェロンλ１に結合したアレムツズマブを含むＤＮＬ（商標）複合体を、実施例９に開示された通り調製する。該複合体を、再発性多発性硬化症（ＲＭＳ）の６４歳女性に４週間毎に２ｍｇ投与する。処置の１２ヶ月後に、年間再発率の減少および障害の持続的進行リスクの低下が、該複合体により観察される。ベースライン測定と比較して、Ｔ１強調ＭＲＩスキャンあたりのガドリニウム増強病変が有意に少ないことが、認められる。副作用には、グレード１／２のインヒュージョンリアクション、グレード１の低血圧、および若干の過敏性が挙げられ、全てがコルチコステロイドにより良好に管理される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]