特許 6207119 核酸の精製法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6207119

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】核酸の精製法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/04 20060101AFI20170925BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170925BHJP

【ＦＩ】

   C07H21/04 A

   C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2011-541519(P2011-541519)

(86)(22)【出願日】2009年12月23日

(65)【公表番号】特表2012-513385(P2012-513385A)

(43)【公表日】2012年6月14日

(86)【国際出願番号】EP2009067878

(87)【国際公開番号】WO2010072821

(87)【国際公開日】20100701

【審査請求日】2012年12月20日

【審判番号】不服2016-749(P2016-749/J1)

【審判請求日】2016年1月18日

(31)【優先権主張番号】102008063003.9

(32)【優先日】2008年12月23日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ファビス， ローラント

(72)【発明者】

【氏名】ペッツェル， ヤン

(72)【発明者】

【氏名】イエンリッヒ， ザビーネ

【合議体】

【審判長】 守安 智

【審判官】 齊藤 真由美

【審判官】 冨永 保

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５２１８８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４３９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２０５４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３７３０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０１０５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１０４９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−５０２０５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０９７３４２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２００６−１７６５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平９−３２７２９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，２００５年，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．９／１０，ｐｐ．４６５−４７０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C07H, G01N

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を核酸含有試料から精製する方法であって、少なくとも以下の工程、
ａ．該核酸含有試料を支持体に共有結合で結合した核酸結合基を有する核酸結合相と接触させる工程であって、該核酸結合基が、９から１２のｐＫａを有する少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する、スペルミンおよびスペルミジンからなる群から選択される工程、
ｂ．該プロトン化可能な基の少なくとも１個の該ｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨ（結合ｐＨ）で、該核酸を該核酸結合相に結合させる工程、
ｃ．該結合ｐＨを超えるが、該プロトン化可能な基の少なくとも１個の該ｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨで、該核酸を溶出させる工程であって、溶出が塩濃度１Ｍ未満で実施されることを特徴とする、工程
を有する方法であって、該核酸結合相が、該支持体および／または該核酸結合基に結合する官能基をさらに含み、該官能基が、溶出の間に負電荷を有する陽イオン交換体である、方法。

【請求項2】

結合がｐＨ３から８で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

結合が塩濃度１Ｍ未満で実施されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

溶出がｐＨ７．５から１０で実施されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記プロトン化可能な基が１０から１２のｐＫａを有するアミノ基であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

核酸を精製するための、固体支持体に結合した、少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する核酸結合基を有する核酸結合相の使用であって、該核酸結合基は、９から１２のｐＫａを有する少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する、スペルミンおよびスペルミジンからなる群から選択され、溶出ｐＨが、結合ｐＨを超えるが該プロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低く調節され、溶出が塩濃度１Ｍ未満で実施されることを特徴とする、使用であって、
該核酸結合相が、該固体支持体および／または該核酸結合基に結合する官能基をさらに有することを特徴とし、該官能基が、溶出の間に負電荷を有する陽イオン交換体である、使用。

【請求項7】

核酸を精製するためのキットであって、
ａ．請求項６に規定された核酸結合相、
ｂ．該核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨを有する結合バッファー、かかるｐＨを試料中で調節できるようにする結合バッファー、またはこれらの混合物、並びに
ｃ．該核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより１ｐＨ単位低いｐＨを有する溶出バッファー、かかるｐＨを該試料中で調節できるようにする溶出バッファー、またはこれらの混合物
を有することを特徴とする、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸を核酸含有試料から精製する方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

核酸を精製及び単離する種々の方法が従来技術で開示されてきた。これらは、フェノールクロロホルムの使用、塩析方法、イオン交換体及びシリカ粒子の使用などである。

【0003】

公知の核酸精製方法は、「電荷切り換え法（ｃｈａｒｇｅ ｓｗｉｔｃｈ ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）」である。これは、核酸結合相が陽電荷を有する第１のｐＨで核酸結合相を核酸含有試料と接触させることを含む。これは、負に帯電した核酸と前記相の結合を促進する。核酸は、陽電荷を反転又は中和するために、電荷切り換え原理に従って、核酸結合相のｐＫａより高い第２のｐＨを調節することによって、放出／溶出される。これは、核酸結合相からの結合核酸の脱離を促進する。

【0004】

従来技術は、可溶相（例えば、特許文献１参照）と固相（例えば、特許文献２参照）の両方を開示している。例えば増幅反応又は制限酵素による消化において、精製核酸を即時に更に処理できるようにするために、種々の溶液、例えば極めて高いｐＨを有する溶液さもなければ生物学的バッファー、特に例えばＴｒｉｓバッファーなどの低塩バッファーが溶出に使用される。

【0005】

核酸を精製する公知の方法が適切であるときでも、既存の方法を改善すること、特に核酸を特に穏やかな方法で精製することが必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】欧州特許第０７０７０７７号明細書

【特許文献2】国際公開第９９／２９７０３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、本発明の一目的は、核酸を精製する既存の方法を改善することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

この目的は、本発明に従って、核酸を核酸含有試料から精製する方法であって、少なくとも以下の工程を有する方法によって達成される：
ａ．該核酸含有試料を核酸結合基を有する核酸結合相と接触させる工程であって、前記核酸結合基が、９から１２のｐＫａを有する少なくとも１個のプロトン化可能な基（ｐｒｏｔｏｎｉｅｒｂａｒｅ ｇｒｕｐｐｅ）を有する工程、
ｂ．該プロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨ（結合ｐＨ）で、該核酸を該核酸結合相に結合させる工程、
ｃ．該結合ｐＨを超えるが、該プロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨ（溶出ｐＨ）で、該核酸を溶出させる工程。

【0009】

本発明は、核酸結合基をそれに対応して有する核酸結合相による核酸の精製に関する。かかる核酸結合基は、ｐＫａが９から１２である少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する。核酸は、これらのプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより低いｐＨで結合する。プロトン化可能な基は、プロトンを引き抜き、その結果、正に帯電し、核酸結合相を負に帯電した核酸に結合させる。溶出は、より高いｐＨで実施され、それによって核酸結合相の陽電荷を減少させる。しかし、本発明によれば、溶出ｐＨは、プロトン化可能な基のｐＫａより低く、特に少なくとも１ｐＨ単位低く、好ましくは少なくとも２ｐＨ単位低い。これは、穏やかな条件下でも溶出を実施することができる重要な利点を有する。したがって、従来技術とは対照的に、本発明は、プロトン化可能な基のｐＫａより低いｐＨで溶出させることができる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
核酸を核酸含有試料から精製する方法であって、少なくとも以下の工程、
ａ．該核酸含有試料を核酸結合基を有する核酸結合相と接触させる工程であって、該核酸結合基が、９から１２のｐＫａを有する少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する工程、
ｂ．該プロトン化可能な基の少なくとも１個の該ｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨ（結合ｐＨ）で、該核酸を該核酸結合相に結合させる工程、
ｃ．該結合ｐＨを超えるが、該プロトン化可能な基の少なくとも１個の該ｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨで、該核酸を溶出させる工程
を有する方法。
（項目２）
前記核酸結合基が支持体に結合していることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記支持体及び／又は前記核酸結合基が、前記溶出ｐＨにおける前記核酸の放出を促進する官能基を有することを特徴とする、項目２に記載の方法。
（項目４）
陽イオン交換体が、官能基、特に、好ましくはカルボキシル基などの、酸性基を介して存在することを特徴とする、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記支持体が核酸結合基と希釈基の混合物で被覆されることを特徴とする、項目２から４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
結合が以下の特徴、
ａ．結合がｐＨ３から８で実施される、及び／又は
ｂ．結合がｐＨ４から７．５で実施される、及び／又は
ｃ．結合がｐＨ４．５から７で実施される、及び／又は
ｄ．結合がｐＨ５．５から７で実施される、及び／又は
ｅ．結合がｐＨ６．５から７で実施される、及び／又は
ｆ．結合が塩濃度１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満又は０．１Ｍ未満で実施される、特徴、
のうちの少なくとも１つを含む条件下で実施されることを特徴とする、項目１から５の一項または複数の項に記載の方法。
（項目７）
溶出が、以下の特徴、
ａ．溶出がｐＨ７．５から１０で実施される、及び／又は
ｂ．溶出がｐＨ８から９で実施される、及び／又は
ｃ．溶出がｐＨ８．２から８．８で実施される、及び／又は
ｄ．溶出が塩濃度１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、２５ｍＭ未満、１５ｍＭ未満又は１０ｍＭ未満で実施される、及び／又は
ｅ．溶出が、水、生物学的バッファー及び有機バッファーからなる群から選択される溶液を使用して実施される、特徴、
のうちの少なくとも１つを含む条件下で実施されることを特徴とする、項目１から６の一項または複数の項に記載の方法。
（項目８）
洗浄工程が結合後及び溶出前に実施されることを特徴とする、項目１から７の一項または複数の項に記載の方法。
（項目９）
以下の特徴、
ａ．前記洗浄工程が、低塩濃度の水又は水溶液を使用して実施される、及び／又は
ｂ．低塩濃度の水溶液が使用され、該塩濃度が４００ｍＭ未満、２００ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満及び／又は２５ｍＭ未満である、特徴、
のうちの１つまたは複数を有する洗浄溶液が使用されることを特徴とする、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記核酸結合相が固体である、又は水溶液に可溶であることを特徴とする、項目１から９の一項または複数の項に記載の方法。
（項目１１）
前記プロトン化可能な基が以下の特徴、
ａ．該プロトン化可能な基がイオン交換体である、又はイオン交換体を有する、及び／又は
ｂ．該プロトン化可能な基がアミノ基である、及び／又は
ｃ．該プロトン化可能な基がｐＫａ１０から１２を有するアミノ基である、及び／又は
ｄ．前記核酸結合基が、基１個当たり１から１０個、好ましくは２から８個、特に好ましくは２から６個のアミノ基を有する、及び／又は
ｅ．該核酸結合基がスペルミン及び／又はスペルミジンから選択される、及び／又は
ｆ．該プロトン化可能な基がアミノ基であり、電子密度低減基と結合していない、特徴、
のうちの１つまたは複数を有することを特徴とする、項目１から１０の一項または複数の項に記載の方法。
（項目１２）
核酸を精製するための、少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する核酸結合基を有する核酸結合相の使用であって、該プロトン化可能な基のｐＫａが９から１２であり、溶出ｐＨが、結合ｐＨを超えるが該プロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低く調節される、使用。
（項目１３）
前記核酸結合相が以下の特徴、
ａ）該核酸結合相が固体又は可溶性である、及び／又は
ｂ）該核酸結合相が、固体支持体に結合した核酸結合基を有する、及び／又は
ｃ）該核酸結合相が、前記溶出ｐＨにおいて前記核酸の放出／溶出を促進する官能基、好ましくは陽イオン交換体、特にカルボキシル基を更に有する、及び／又は
ｄ）特徴ｂ）又はｃ）に従う該核酸結合相が、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート、ポリメタクリラート及びその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、これらの材料のコポリマーなどの有機ポリマー、アガロース、セルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、キトサンなどの多糖及びヒドロゲル、無機支持体、特にシリカゲル、シリカ粒子、ガラス又は別の金属酸化物及び半金属性元素酸化物、酸化ホウ素、金属表面、例えば金を有する支持体、並びに磁性粒子からなる群から選択される支持体を有する、及び／又は
ｅ）該核酸結合相の該核酸結合基がアミン、特に第一級及び第二級アミンを有する、及び／又は
ｆ）特徴ｅ）に従う該核酸結合基がスペルミン及び／又はスペルミジンである、特徴、のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、項目１２に記載の使用。
（項目１４）
核酸を精製するためのキットであって、
ａ．項目１２又は１３に規定された核酸結合相、
ｂ．該核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨを有する結合バッファー、及び／又はかかるｐＨを試料中で調節できるようにする結合バッファー、並びに
ｃ．該核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより１ｐＨ単位低いｐＨを有する溶出バッファー、及び／又はかかるｐＨを該試料中で調節できるようにする溶出バッファー
を有することを特徴とする、キット。
（項目１５）
ａ．前記結合バッファーが以下の特徴、
ｉ．ｐＨが、ｐＨ３から８である、及び／又は
ｉｉ．ｐＨが、ｐＨ４から７．５である、及び／又は
ｉｉｉ．ｐＨが、ｐＨ４．５から７である、及び／又は
ｉｖ．ｐＨが、ｐＨ５．５から７である、及び／又は
ｖ．ｐＨが、ｐＨ６．５から７である、及び／又は
ｖｉ．塩濃度が１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満又は０．１Ｍ未満である、特徴、
のうちの少なくとも１つを有し、及び／又は
ｂ．前記溶出バッファーが以下の特徴、
ｉ．ｐＨが、ｐＨ７．５から１０である、及び／又は
ｉｉ．ｐＨが、ｐＨ８から９である、及び／又は
ｉｉｉ．ｐＨが、ｐＨ８．２から８．８である、及び／又は
ｉｖ．塩濃度１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、２５ｍＭ未満、１５ｍＭ未満又は１０ｍＭ未満である、及び／又は
ｖ．該溶出バッファーが、水、生物学的及び有機バッファーからなる群から選択される、特徴、
のうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、項目１４に記載のキット。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２７）における、５０ｍＭ ＮａＣｌ濃度の結果を、ＡＸ０２６及びＡＸ０２７とで比較して示す。

【図2】図２は、スペルミジン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２６）における結果を示す。

【図3】図３は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２５）における結果を示す。

【図4】図４は、ペンタエチレンヘキサミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２８）における結果を示す。

【図5】図５は、ポリアリルアミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２９）における結果を示す。

【図6】図６は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図7】図７は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図8】図８は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したＲＮＡの精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図9】図９は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したＲＮＡの精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図10】図１０は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した核酸断片の精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図11】図１１は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した核酸断片の精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図12】図１２は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した核酸断片の精製（ＡＸ０３０）における結果を示す。

【図13】図１３は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した血液由来のゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０４０）における結果を示す。

【図14】図１４は、スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した血液由来のゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０４０）における結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の一実施形態によれば、核酸はｐＨ３から８で結合する。この情報は、結合の間のｐＨ、したがって試料中のｐＨに関する。固相の設計に応じて、本発明による方法は、極めて穏やかな条件で実施することもでき、したがってｐＨ４から７．５、好ましくは５から７．５、特に好ましくは５から７、極めて特に好ましくは６．５から７で、したがって実質的に中性範囲で核酸を結合させることができる。核酸結合相のプロトン化可能な基が９から１２のｐＫａを有することから、前記基は、比較的中性のｐＨ値でも、核酸の有効な結合を可能にするのに十分な陽電荷を有する。したがって、結合を極めて穏やかな条件下で実施することができ、核酸を損傷から防ぐことができる。

【0012】

さらに、低塩濃度で結合を実施することが有利であることが判明した。したがって、一実施形態によれば、塩濃度は核酸と核酸結合相の結合の間に１Ｍ未満である。好ましくは、塩濃度は０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満、さらには０．１Ｍ未満でさえある。核酸と固相の結合を最適化するために、低塩濃度が好ましい。高過ぎるイオン濃度は、核酸と核酸結合相のイオン性相互作用に悪影響を及ぼす。本発明者らは、結合バッファーが、例えば、炭水化物、例えば、エタノール、メタノールなどのアルコール、又はアセトン及びアセトニトリドなどのある量の有機物質を含むこともできることを見いだした。これらの物質は、結合を損なわない。

【0013】

本方法の別の重要な一工程は、核酸の溶出である。説明したように、核酸は、結合ｐＨを超えるｐＨで放出される。その結果、プロトン化可能な基は、溶出の間に、より小さい陽電荷を有し、これは、核酸の放出（ｆｒｅｉｓｅｔｚｕｎｇ）を促進する。さらに、溶出の間のｐＨは、核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低い。この結果、上で示したように、溶出を特に穏やかな条件下で実施することができる。

【0014】

使用する核酸結合基又は核酸結合相に応じて、溶出は、好ましくは、ｐＨ７．５から１１、７．５から１０、好ましくはｐＨ８から９、又は８．２から８．８で実施される。これらの低ｐＨ値は、核酸が特に穏やかに放出されるので、特に有利な結果をもたらす。核酸を低ｐＨで特に効率的に放出することができる更なる手段（ｍａｓｓｎａｈｍｅｎ）を以下に記述する。

【0015】

単離核酸を溶出バッファー中で即座に更に処理できるようにするために、溶出バッファーは、好ましくは低塩濃度を有する。したがって、一実施形態によれば、塩濃度は、１Ｍ未満、好ましくは０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、特に好ましくは５０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、または１０ｍＭ未満でさえある。適切な塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属又はアンモニウムの塩化物、鉱酸の他の塩、酢酸塩、ホウ酸塩、及びＴｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓなどの化合物、及び例えば、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ、ＨＥＰＥＳなどの有機バッファー、などとすることができる。さらに、溶出に適切な物質は、従来技術に開示されている。

【0016】

精製を容易にするために、好ましくは少なくとも１回の洗浄工程が、核酸の結合後かつ核酸の溶出前に実施される。洗浄のために、低塩濃度の水溶液を使用することが好ましいが、水の使用も好ましい。洗浄バッファー中に存在する塩は、濃度４００ｍＭ未満、特に好ましくは２００ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、及び／又はさらには２５ｍＭ未満であることが好ましい。洗浄バッファーは、有機成分、例えば、アルコール、ポリオール、ポリエチレングリコール、アセトン、アセトニトリド又は炭水化物を含むことができる。しかし、洗浄バッファーは、例えば、酵素プロセシング、増幅反応などの、あとに続く適用（「下流の」適用）を損なわないようにするため、干渉量の対応する有機成分を含まないようににすることができる。

【0017】

本発明によって使用される核酸結合相は、固体又は可溶性とすることができる。可溶性核酸結合相は、通常、核酸を結合ｐＨで沈殿させ、結合核酸を溶出ｐＨで沈殿から再度放出する。可溶性核酸結合相又は可溶性核酸結合ポリマーは、従来技術、例えばＥＰ０７０７０７７に記載されている。

【0018】

好ましい実施形態によれば、核酸結合相は固相である。調製に関して、プロトン化可能な基は、例えば固体支持体材料に結合させることができる。詳細を本明細書の以下に記述する。固相の使用は、試料からの結合核酸の除去を促進する。したがって、一実施形態によれば、核酸の結合に続いて固相が除去される。

【0019】

一実施形態によれば、プロトン化可能な基は、イオン交換体、好ましくは陰イオン交換体であり、又はイオン交換体、好ましくは陰イオン交換体を有する。核酸の結合に適することが判明した好ましいプロトン化可能な基は、アミノ基であり、第一級及び第二級アミノ基が好ましい。アミノ基は、好ましくは、ｐＫａが９から１２、好ましくは１０から１２を有する。核酸結合基は、好ましくは、１から１０、特に好ましくは２から８、特に２から６個のアミノ基を有する。好ましい核酸結合基の例は、第一級モノアミン及びポリアミン、第二級モノアミン及びポリアミン、及び、第三級モノアミン及びポリアミンである。これらは、置換されていても、置換されていなくてもよい。例は、特に次式のアミンである。

【0020】

【化1】

式中、
ｎ、ｍ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、互いに独立して、２から８までであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９及びＲ_１０は、同一又は異なり、Ｈ、（分枝又は非分枝）アルキル及びアリールからなる群から選択される。

【0021】

好ましい核酸結合基は、特にＮ−プロピル−１，３−プロパンジアミン及びペンタエチレンヘキサミン、そしてまさしく特別にはスペルミン及びスペルミジンである。

【0022】

さらに、環式アミン、芳香族アミン、又はアミノ官能化複素環（ａｍｉｎｏｆｕｎｋｔｉｏｎａｌｉｓｉｅｒｔｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｋｌｅｎ）を使用することもできる。アミンは、置換基、例えば、アルキル置換基、アルケニル置換基、アルキニル置換基又は芳香族置換基を有することができ、さらに炭化水素鎖は環に閉じることもできる。炭化水素鎖は、酸素、窒素、硫黄、ケイ素などのヘテロ原子、又は分枝を有することもできる。

【0023】

別の適切な核酸結合基は、３個のアミノ基のうちの１、２個を有するポリオキシアルキレンアミンである。これらは、例えば、「Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ」ポリオキシアルキレンアミンの名称で利用可能である。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅは、ポリエーテル骨格末端に結合した第一級アミノ基を含む。ポリエーテル骨格は、プロピレンオキシド、エチレンオキシド又はその混合物に基づくことができる。別の骨格セグメントの使用もあり得る。

【0024】

上述したように、アミンのアミノ基は、ｐＫａ値が９から１２、好ましくは１０から１２を有する。

【0025】

本発明によれば、対応する核酸結合基の混合物を使用することもでき、又はそれを支持体に適用することもできる。

【0026】

例えばアミンなどの核酸結合基は、支持体に共有結合で、又は静電相互作用によって、極性相互作用によって若しくは疎水性相互作用によって、結合することができる。それらは、１（例えば、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン）から１０、好ましくは２から８、特に好ましくは２から６個のアミノ基が結合基１個当たり１個のプロトン化可能な基を介して存在するように連結することが好ましい。

【0027】

好ましくは、核酸結合基のアミノ基は、例えば、カルボキシル基、カルボニル基、Ｃ−Ｃ二重結合を有する基、β−ヒドロキシエチル基などの電子密度低減基（ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎｄｉｃｈｔｅ ｖｅｒｒｉｎｇｅｒｎｄｅｎ ｇｒｕｐｐｅ）と結合しておらず、その結果、そのｐＫａは９から１２である。電子密度低減基との結合は、アミノ官能基及び対応する電子密度低減基がわずか３個、２個またはそれ未満の炭素原子を介して結合している場合に、存在するとみなされる。

【0028】

好ましい一実施形態によれば、核酸結合基は、核酸精製に使用される固体核酸結合相用支持体に結合している。適切な核酸結合基用支持体の例は、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート、およびポリメタクリラート、及びその誘導体、又はポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、及びこれらの材料のコポリマーなどの有機ポリマーである。さらに、これらの核酸結合基は、多糖、特にアガロース、セルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、キトサンなどのヒドロゲルに連結することもできる。さらに、核酸結合基は、例えば、シリカゲル、ガラス又は他の金属酸化物及び半金属性元素（ｈａｌｂｍｅｔａｌｌ）酸化物、シリカ、酸化ホウ素、又は例えば金などの金属表面などの無機支持体に結合することもできる。磁性粒子は、取扱いに関して特に有利である。核酸結合基は、前記支持体に直接、さもなければ「スペーサー」を介して結合することができる。それらは、より大きい分子の一部とすることもできる。スペーサーの例は、炭化水素鎖、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、及び官能化シランである。前記スペーサーは、分枝でも非分枝でもよい。

【0029】

核酸結合基を結合するのに使用することができる化学官能基は、酸アミド又は酸無水物、エポキシド、トレシル基、ホルミル基、スルホニルクロリド、マレイミド又はカルボジイミド化学反応活性化（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｃｈｅｍｉｅ ａｋｔｉｖｉｅｒｔｅ）カルボキシラート基である。同様に、例えばアミンなどの核酸結合基を、例えばイオン性相互作用によって又は吸収プロセスによって、非共有結合で結合させることが本発明の範囲内で可能である。核酸結合基は、例えば、チオールを介して金表面に結合することもできる。核酸結合基をカルボキシル化表面に結合させることが好ましい。

【0030】

支持体材料の別の実施形態は、非磁性及び磁性粒子、カラム材料、膜、並びに表面コーティングを含む。チューブ、膜、不織布、紙、ＰＣＲ容器などの反応器、「Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ」、マルチプレート、チップ、マイクロアレイなどの機能性支持体を挙げることもできる。

【0031】

本発明の別の一実施形態は、記載したように、本発明によるプロトン化可能な基を有し、本発明による原理に従って核酸を可逆的に結合可能である、可溶性ポリマーに関する。本発明によって改変することもできる適切な可溶性相の例は、例えばＥＰ０７０７０７７に記載されている。好ましい溶媒は水であるが、本発明によって官能化を持たせた、例えばエタノールなどの有機溶媒に可溶である、ポリマーを使用することもできる。

【0032】

驚くべきことに、本発明者らは、結合及び溶出バッファーにおいて適用可能なｐＨ値及び塩濃度が、核酸結合基１個につき存在するプロトン化可能な基、特にアミノ基の数に相関することを見いだした。すなわち、塩濃度約５０ｍＭでは、核酸は、スペルミンで被覆された表面にｐＨ６でも結合するが、より低いｐＨ５．５、好ましくは５でさえも、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミンで被覆された表面の利用が好ましい。Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン表面からの溶出はｐＨ７．５でも好結果であるが、塩濃度５０ｍＭにおけるスペルミンで被覆された表面ではｐＨ約８．５が必要である。しかし、溶出ｐＨは、支持体を改変することによって、さらに低下させることもできる（下記参照）。

【0033】

効率的溶出及びその結果としての核酸結合相からの結合核酸の脱離は、核酸精製効率に特に重要である。ここで、驚くべきことに、重要であるのは核酸結合基のプロトン化可能な基のｐＫａ値だけではないことが見いだされた。核酸結合相の構造及び別の官能基の存在も、中性又は弱アルカリ性範囲のｐＨ値における溶出の促進及び改善に寄与する。

【0034】

一実施形態によれば、核酸結合相は、例えば反発効果を発揮することによって、溶出ｐＨにおける核酸の溶出を促進する、官能基を更に有する。したがって、これらの官能基は、好ましくは、溶出の間に負電荷を有する。これらの基のｐＫａ値は、例えば０から７、好ましくは１から５の範囲とすることができる。例えば、イオン交換体、特に陽イオン交換体、好ましくは例えばカルボキシル基などの酸性基が適切である。他の適切な基は、ベタイン、スルホナート、ホスホナート及びホスファートである。例えば、固体支持体は、カルボキシル基を用いて官能性を持たせて、核酸結合基が結合できるようにすることができる。結合のための核酸結合基濃度は、カルボキシル基の一部がフリーであり、したがって核酸結合基で官能化されないように、選択される。これらの基は、低ｐＨ値における核酸の結合を損なわない。しかし、より高いｐＨ値では、それらは、好ましくは負に帯電し、その結果、核酸結合基からの核酸の脱離を促進する。この相互作用は、核酸結合基のプロトン化可能な基と例えばカルボキシル基などの陰イオン化可能な基との間の長さ又は距離の選択によって促進することもできる。これは、低ｐＨ値における溶出を有利に促進し、したがってその収率を増加させる。核酸に対して溶出ｐＨで反発効果を発揮する官能基の選択、強度及び長さは、選択する核酸結合基、したがって、特に、核酸結合基１個当たりのプロトン化可能な基数、及び溶出促進官能基までのその距離に応じて変わる。

【0035】

本発明者らは、さらに、核酸結合／プロトン化可能な基が支持体材料上に互いにある距離で配置された、すなわち希釈された場合でも、溶出効率が増加し達成することを実証した。一実施形態によれば、核酸結合基のかかる配置は、少量の核酸結合基のみで支持体をコーティングすることによって得ることができる。したがって、準化学量論的量の核酸結合基を用いて官能基化を実施することが好ましい。その結果、核酸結合基は、基本的に、支持体上で希釈され、その結果、より少ない核酸結合基を利用することができる。これは、核酸がより緩やかに結合し、したがって核酸結合相からより容易に再び脱離することができるので、溶出を促進する。例えば、支持体材料上の官能基のわずか≦５０％、≦２５％、≦１５％、≦１０％又はわずか≦５％を、核酸結合基を用いて官能化することができる。支持体材料が核酸結合基を結合させる適切な官能基を持たない場合、それに適切な官能基を付与するために、支持体材料をまず官能化することができる（上記参照）。このために、準化学量論的量の核酸結合基による支持体材料の適切なプロファイルのコーティングを、前記核酸結合基を結合させるためのより少数の官能基をそれに応じて支持体材料に付与することによって、実施することもできる。

【0036】

別の一実施形態によれば、支持体は、核酸結合基と「希釈基（ｖｅｒｄｕｅｎｎｕｎｇｓｇｒｕｐｐｅｎ）」の混合物で被覆される。「希釈基」という用語は、核酸結合基に関してその機能を示すために本明細書で使用される。その機能は、支持体上の核酸結合基の量を調節すること、さらにそれによって核酸の結合強度に影響を及ぼすことを含む。希釈基の割合が高いほど、より少数の核酸結合基が支持体に適用され、核酸との結合強度が低下する。希釈基は、陰性、陽性若しくは中性電荷、又はイオン化可能基を有することができる。その結果、希釈基は、同時に、溶出を促進する官能基も有することができる（上記参照）。希釈基に対する核酸結合基の割合は、例えば、≦５０％、≦２５％、≦１５％、≦１０％又はわずか≦５％とすることができる。適切な希釈基の例は、アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン及びアンモニアである。好ましい一実施形態によれば、本発明による（従来技術で公知の）一般的なモノアミンとポリアミンの混合物を支持体に適用する。この組合せのポリアミンは核酸の結合に使用され、モノアミンは主に希釈基として作用する。適切な希釈基の一例はエタノールアミンである。

【0037】

核酸結合相のｐＨは、上記パラメータ、特に溶出を促進する官能基、希釈基、及び核酸結合基による希釈、又は核酸結合基との混合を選択／組み合わせることによって、溶出条件に対して最適化することができる。それに応じて、核酸結合相の溶出プロファイル、特に溶出ｐＨを制御又は調節することができる。

【0038】

本発明によるシステムによって精製することができる核酸は、血液、尿、便、唾液、痰などの体液中又は他の体液中、組織、細胞、特に動物細胞、ヒト細胞、植物細胞、細菌細胞など、肝臓、腎臓、肺などの器官などの生物学的源などに存在し得る。さらに、核酸は、スワブ、パパニコラウスメアなどの支持体材料、及びＰｒｅＳｅｒｖＣｙｔ、Ｓｕｒｅｐａｔｈなどの安定化媒体から、さもなければ例えばジュース、水性試料、食品一般などの他の液体から得ることができる。さらに、核酸は、植物材料、細菌溶解物、パラフィン包埋組織、水溶液又はゲルから得ることができる。

【0039】

さらに、本発明は、核酸を精製するための上記核酸結合相の使用に関する。本発明によって使用される核酸結合相は、特に、ｐＫａが９から１２の少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する核酸結合基を有する。好ましい実施形態は、上で詳述されており（上記開示参照）、特に以下の特徴の１つまたは複数によって特徴づけられる：
ａ）核酸結合相が固体又は可溶性である、及び／又は
ｂ）核酸結合相が、固体支持体に結合した核酸結合基を有する、及び／又は
ｃ）核酸結合相が、溶出ｐＨにおいて核酸の放出／溶出を促進する官能基、好ましくは陽イオン交換体、特にカルボキシル基を更に有する、及び／又は
ｄ）特徴ｂ）又はｃ）に従う核酸結合相が、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート及びポリメタクリラート及びその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、これらの材料のコポリマーなどの有機ポリマー、アガロース、セルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、キトサンなどの多糖及びヒドロゲル、無機支持体、特にシリカゲル、シリカ粒子、ガラス又は別の金属酸化物及び半金属性元素酸化物、酸化ホウ素、金属表面、例えば金を有する支持体、並びに磁性粒子からなる群から選択される支持体を有する、及び／又は
ｅ）核酸結合相の核酸結合基がアミン、特に第一級及び第二級アミンである、及び／又は
ｆ）特徴ｅ）に従う核酸結合基が特にスペルミン及び／又はスペルミジンである。

【0040】

本発明は、さらに、核酸を精製するキットであって、
ａ）ｐＫａが９から１２の少なくとも１個のプロトン化可能な基を有する核酸結合基を有する、本発明による核酸結合相、
ｂ）核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いｐＨを有する結合バッファー、及び／又はかかるｐＨを試料中で調節できるようにする結合バッファー、
ｃ）核酸結合相のプロトン化可能な基の少なくとも１個のｐＫａより少なくとも１ｐＨ単位低いが、結合バッファーのｐＨより高いｐＨを有する溶出バッファー、及び／又はかかるｐＨを試料中で調節できるようにする溶出バッファー
を有することを特徴とするキットも提供する。

【0041】

核酸結合相及び溶出条件の詳細は、上述されており、本発明によるキットに関しても当てはまり、その中で使用される成分／バッファーを特徴づける。上記開示を参照されたい。さらに、キットは、他の通例の成分、例えば、溶解剤（ｌｙｓｅ）、洗浄及び／又は中和試薬、及び／又はバッファーを含むことができる。

【0042】

結合バッファーは、好ましくは、以下の特徴の少なくとも１つを有することができる：
ｉ．ｐＨが、ｐＨ３から８である、及び／又は
ｉｉ．ｐＨが、ｐＨ４から７．５である、及び／又は
ｉｉｉ．ｐＨが、ｐＨ４．５から７である、及び／又は
ｉｖ．ｐＨが、ｐＨ５．５から７である、及び／又は
ｖ．ｐＨが、ｐＨ６．５から７である、及び／又は
ｖｉ．塩濃度が１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満又は０．１Ｍ未満である。

【0043】

対応する特徴の利点は、本方法に関連して上述されており、上記開示を参照されたい。

【0044】

本発明による溶出バッファーは、以下の特徴の少なくとも１つを有することができる：
ｉ．ｐＨが、ｐＨ７．５から１０である、及び／又は
ｉｉ．ｐＨが、ｐＨ８から９である、及び／又は
ｉｉｉ．ｐＨが、ｐＨ８．２から８．８である、及び／又は
ｉｖ．塩濃度が１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．２５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、２５ｍＭ未満、１５ｍＭ未満又は１０ｍＭ未満である、及び／又は
ｖ．本発明による溶出バッファーが、水、生物学的バッファー、有機バッファー、特にＴｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ、ＭＥＳ、ＣＨＡＰＳ及びＨＥＰＥＳからなる群から選択される。

【0045】

対応する特徴の詳細及び利点は、本発明による方法に関連して上述されている。上記開示を参照されたい。

【0046】

対応するキットは、特に本発明による方法の枠組み内で適用することができる。本方法、キット及び核酸結合固相は、特に分子生物学、分子診断学、科学捜査、食品分析及び応用試験の分野で使用することができる。

【0047】

溶出核酸が即時に更に処理され、したがって例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、制限酵素による消化、又は転写に使用できるようにすることが好ましい。溶出バッファーが上述したように設計され、好ましくは低塩濃度を有する限り、更なる精製は不要である。

【0048】

精製に適切な核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、特にゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡであり、さらにＰＣＲ断片、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡであり、さらにオリゴヌクレオチド及び例えばＰＭＡ、ＬＭＡなどの改変核酸である。ヒト、動物又は植物起源のウイルスのＲＮＡ及びＤＮＡ又は核酸又はヒト、動物又は植物起源の細菌のＲＮＡ及びＤＮＡ又は核酸を精製することもできる。さらに、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも本発明による精製に適切である。

【0049】

本発明を幾つかの実施例に基づいて以下に説明する。これらの実施例は限定的なものではなく、本発明の好ましい実施形態である。さらに、本明細書で引用するすべての参考文献は、本開示の対象になる。

【実施例】

【0050】

実験に使用された核酸のモデルシステムは、ｐＵＣ２１プラスミドＤＮＡ、非短縮（ｕｎｇｅｓｃｈｎｉｔｔｅｎ）、ＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡである。さらに、大きさの異なる核酸断片の精製を、制限酵素によって断片に切断されたプラスミドＤＮＡを使用して実証した。

【0051】

（実験の部の）手順は、下記調製プロトコルＡ）からＩ）に従った。

【0052】

Ａ）磁性ポリマーとアミンの反応
材料
磁性ポリマー：Ｓｅｒａ−Ｍａｇ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｐｅｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｄｓＭＧＣＭ）カタログＮｏ．６５１５２１０５０５０２５０、５％強度の水性懸濁液、又はＭａｇｎｅｔｉｃ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＭＧ−ＣＭ）、カタログＮｏ．２４１５−２１０５、５％強度の水性懸濁液、Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ。

【0053】

アミン：スペルミン（Ｆｌｕｋａ、８５５９０）、スペルミジン（Ｆｌｕｋａ、８５５６１）、プロピル−１，３−プロパンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．３０８１５３）、ペンタエチレンヘキサミン（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．２９２７５３）ポリ（アリルアミン塩酸塩）、Ｍｗ１５０００（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．２８３２１５）
磁性粒子５００ｍｇを５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ６．１、１０ｍｌ中に再懸濁させ、次いで５０ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド溶液１１．５ｍｌと混合する。ミニ振とう機を使用して混合後、５２μｍｏｌ／ｌの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）溶液１０ｍｌを添加し、続いて更にボルテックス撹拌する。次いで、溶液を回転振とう機（ｕｅｂｅｒｋｏｐｆｓｃｈｕｅｔｔｌｅｒ）上で３０分間放置して反応させ、次いで上清を除去する。５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ６．１、５０ｍｌ中で再懸濁後、懸濁液を１０ｍｌの一定分量で分配する。懸濁液を磁気的に分離し、上清を廃棄する。５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ６．１、１ｍｌに懸濁後、各場合においてアミン２ｍｌを５０ｍＭ ＭＥＳ中１００ｍｇ／ｍｌの濃度及びｐＨ８．５で添加し、続いて徹底的にボルテックス撹拌し、１０分間超音波処理し、懸濁液を回転振とう機上で１時間放置して反応させる。続いて、それぞれの場合において、５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ６．１、１０ｍｌで２回洗浄し、磁気分離し、上清を廃棄する。次いで、粒子を各場合においてｐＨ値４．５から７．０でＭＥＳバッファー２ｍｌに再懸濁させる。

【0054】

Ｂ）Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２７）
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．０又は５．５中の磁性粒子２ｍｇを使用し、各場合において５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ５．０又は５．５、５０μｌと混合する。続いて、バッファー「ＥＢ」（ＱＩＡＧＥＮ、カタログＮｏ．１９０６８）１０μｌ中のプラスミドｐＵＣ２１ １０μｇを添加し、短時間振とうして混合する。次いで、反応混合物を回転振とう機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振とう機上で５分間インキュベートする。試料混合物を磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。次いで、残留物をそれぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで２回洗浄し、磁気的に分離し、上清を廃棄する。続いて、それぞれの場合において、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭを含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．５、５０μｌを添加することによって、２回溶出し、磁気分離によって除去し、溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で調べる。

【0055】

図１に５０ｍＭ ＮａＣｌ濃度の結果を、ＡＸ０２６及びＡＸ０２７とで比較して示す。

【0056】

Ｃ）スペルミジン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２６）
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．２中の磁性粒子２ｍｇを使用し、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ６．２、５０μｌと混合する。続いて、バッファー「ＥＢ」（ＱＩＡＧＥＮ、カタログＮｏ．１９０６８）１０μｌ中のプラスミドｐＵＣ２１ １０μｇを添加し、短時間振とうして混合する。次いで、反応混合物を回転振とう機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振とう機上で５分間インキュベートする。試料混合物を磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。次いで、残留物をそれぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで２回洗浄し、磁気的に分離し、上清を廃棄する。続いて、それぞれの場合において、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭをそれぞれの場合において含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、８．０、８．５、５０μｌを添加することによって、２回溶出し、磁気分離によって除去し、溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で調べる。

【0057】

結果を図２に示す。

【0058】

Ｄ）スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２５）
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．１中の磁性粒子２ｍｇを使用し、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．０、５０μｌと混合する。続いて、バッファー「ＥＢ」（ＱＩＡＧＥＮ、カタログＮｏ．１９０６８）１０μｌ中のプラスミドｐＵＣ２１ １０μｌを添加し、短時間振とうして混合する。次いで、反応混合物を回転振とう機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振とう機上で５分間インキュベートする。試料混合物を磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。次いで、残留物をそれぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで２回洗浄し、磁気的に分離し、上清を廃棄する。続いて、それぞれの場合において、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭをそれぞれの場合において含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、８．０、８．５、５０μｌを添加することによって、２回溶出し、磁気分離によって除去し、溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で調べる。

【0059】

結果を図３に示す。

【0060】

Ｅ）ペンタエチレンヘキサミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２８）
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．１中の磁性粒子２ｍｇを使用し、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．０、５０μｌと混合する。続いて、バッファー「ＥＢ」（ＱＩＡＧＥＮ、カタログＮｏ．１９０６８）１０μｌ中のプラスミドｐＵＣ２１ １０μｇを添加し、短時間振とうして混合する。次いで、反応混合物を回転振とう機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振とう機上で５分間インキュベートする。試料混合物を磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。次いで、残留物をそれぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで２回洗浄し、磁気的に分離し、上清を廃棄する。続いて、それぞれの場合において、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭをそれぞれの場合に含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、８．０、８．５、５０μｌを添加することによって、２回溶出し、磁気分離によって除去し、溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で調べる。

【0061】

結果を図４に示す。

【0062】

Ｆ）ポリアリルアミン官能化磁性ポリマーを使用したプラスミドｐＵＣ２１の精製（ＡＸ０２９）−比較例
５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．１中の磁性粒子２ｍｇを使用し、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．０、５０μｌと混合する。続いて、バッファー「ＥＢ」（ＱＩＡＧＥＮ、カタログＮｏ．１９０６８）１０μｌ中のプラスミドｐＵＣ２１ １０μｇを添加し、短時間振とうして混合する。次いで、反応混合物を回転振とう機又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ振とう機上で５分間インキュベートする。試料混合物を磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。次いで、残留物をそれぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで２回洗浄し、磁気的に分離し、上清を廃棄する。続いて、それぞれの場合において、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ及び４００ｍＭをそれぞれの場合において含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、８．０、８．５、５０μｌを添加することによって、２回溶出し、磁気分離によって除去し、溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で調べる。

【0063】

結果を図５に示す。

【0064】

Ｇ）スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０３０）
精製ごとに、粒子２ｍｇを２５ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．２に懸濁させる。続いて、バッファー「ＥＢ」中の子ウシ胸腺ゲノムＤＮＡ（カタログＮｏ．８９３７０、Ｆｌｕｋａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０μｇを添加し、短時間振とうして混合する。続いて、磁気分離し、そのものの測光検査を行う。残留物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μｌで洗浄し、磁気分離して上清を除去し、続いて、それぞれの場合において、５０ｍＭ及び１００ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含む、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．５、５０μｌで２回溶出する。次いで、個々の溶出物のＤＮＡ含有量を光度計測法で測定する。

【0065】

結果を図６及び図７に示す。

【0066】

Ｈ）スペルミン官能化磁性ポリマーを使用したＲＮＡの精製（ＡＸ０３０）
精製ごとに、粒子２ｍｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ５．５に懸濁させる。続いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ５．５中の１０μｇ／ｐｒｅｐ．ＲＮＡ（１６Ｓ−＆２３ＳリボソームＲＮＡ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ４１−１ｇ／ｌ−ｌｌ）を添加する。続いて、短時間振とうして混合し、磁気分離し、次いで上清をＲＮＡについて光度計測法で調べる。続いて、それぞれの場合において、ＲＮａｓｅを含まない水１００μｌで２回洗浄し、上清を磁気分離によって除去する。続いて、それぞれの場合において、５０ｍＭ及び１００ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれふくむ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ８．５、５０μｌ（ＲＮａｓｅを含まない）を用いて、２回溶出する。次いで、溶出物を個々に光度計測法で調べる。

【0067】

結果を図８及び図９に示す。

【0068】

Ｉ）スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した核酸断片の精製（ＡＸ０３０）
調製
スペルミン官能化磁性ポリマー粒子を、２５ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む結合バッファー、ｐＨ６．２に懸濁密度５０ｍｇ／ｍｌで懸濁させる。次いで、ビーズをこのバッファーでさらに２回洗浄し、上清を磁気分離によって除去する。タイプｐＴＺ１９ＲプラスミドＤＮＡが必要であり、そのＤＮＡ２５μｇを緩衝液１００μｌに対して使用する。まず、反応混合物に対して全量を計算し、続いて損失量の水を導入して加えて１００μｌまでにし、ＤＮＡ、次いで酵素溶液に適合する酵素バッファー（全溶液１０μｌ当たり１μｌ）、次いで最後にＤＮＡ１μｇ当たり３Ｕの制限酵素（ＨｉｎｆＩ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１５５Ｓ）（通常、７５Ｕは酵素溶液７．５μｌに対応する。）を添加する。混合物を水浴又は加熱ブロック中で３７℃で９０分間放置して、インキュベートする。続いて、Ｑｕｉｃｋ−Ｒｕｎを使用して６０００Ｕ／分に短時間遠心分離し、次いで試料を−２０℃で凍結させる。この制限酵素消化ＤＮＡは、ＰＢバッファーを分析するための簡単で迅速なＰＣＲ補完物（ＰＣＲ−ｅｒｓａｔｚ）である。

【0069】

手順
試料ごとに、（ＤＮＡ２μｇに対応する）ＰＣＲ溶液８μｌを９２μｌの２５ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．２と混合し、次いで磁性シリカゲル懸濁液２５μｌと混合し、続いて１０秒間ボルテックス撹拌し、５００μｌの２５ｍＭ ＭＥＳ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．２と混合し、混合する。混合物を振とう機中で２分間インキュベートする。続いて、磁気分離し、上清を廃棄し、それぞれの場合において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水７５０μｌで２回洗浄する。続いて、まず５０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５、次いで３０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５で溶出させる。溶出物を混合し、ＤＮＡ含有量を光度計測法で、さらにゲルによっても、調べる。

【0070】

結果を図１０、図１１及び図１２に示す。

【0071】

Ｊ）スペルミン官能化磁性ポリマーを使用した血液由来のゲノムＤＮＡの精製（ＡＸ０４０）
溶解バッファー（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ９．０）１ｍｌとプロテイナーゼＫ１０μｌを混合する。ビーズ１ｍｇ及び水３．４μｌを結合バッファー（１．５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．０）２００μｌに、懸濁密度２６．６ｍｇ／ｍｌで懸濁させる。（クエン酸塩で安定化された）解凍全血１００μｌを溶解バッファー／プロテイナーゼ混合物とＥｐｐｅｎｄｏｒｆカップ中で混合し、十分混合する。続いて、室温で１０分間インキュベートする。ビーズを結合バッファーに慎重に再懸濁させる。このうち、２４０μｌを溶解血液に添加し、続いてピペット中で上下させて慎重に混合する。続いて、室温で１分間インキュベートする。ビーズを磁気的に分離する。上清を慎重に除去する。洗浄のため、洗浄バッファー（水）１ｍｌを添加し、続いてピペット中で上下させて慎重に混合する。さらに磁気分離後、上清を廃棄する。溶解バッファー１ｍｌ及び結合バッファー５０μｌを添加し、慎重に混合し、室温で１分間インキュベートする。磁気分離後、再度、洗浄バッファー１ｍｌで洗浄し、磁気分離する。

【0072】

溶出バッファー（１０ｍＭ ＴＲＩＳ＊ＨＣｌ ｐＨ８．５）１５０μｌをビーズに添加することによって、精製ＤＮＡを溶出させる。ビーズをピペット中で数回上下させて再懸濁させる。ビーズを磁気的に分離し、上清を除去し、ＤＮＡを光度計測法で定量する。

【0073】

結果を図１３に示す。

【0074】

上で得られた溶出物５μｌをＲＴ−ＰＣＲに供する。このため、ＴａｑＭａｎβ−アクチン対照試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏ．４０１８４６）及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｎｏ．１０１９３３７）を使用し、Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ１２．５μｌ、β−アクチンプローブ（ＦＡＭ）２．５μｌ、β−アクチン順方向プライマー２．５μｌ及びβ−アクチン逆方向プライマー２．５μｌを適用する。

【0075】

結果を図１４に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】