特許 6207501 肺炎球菌性肺炎の重症度判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6207501

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】肺炎球菌性肺炎の重症度判定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20170925BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170925BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALN20170925BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20170925BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 F

   G01N33/53 X

   !C12Q1/04

   !C12Q1/68 A

【請求項の数】4

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-508101(P2014-508101)

(86)(22)【出願日】2013年3月29日

(86)【国際出願番号】JP2013059564

(87)【国際公開番号】WO2013147173

(87)【国際公開日】20131003

【審査請求日】2016年1月28日

(31)【優先権主張番号】特願2012-81038(P2012-81038)

(32)【優先日】2012年3月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000206956

【氏名又は名称】大塚製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】福島 喜代康

(72)【発明者】

【氏名】田中 裕美

【審査官】 加々美 一恵

(56)【参考文献】

【文献】 伊藤 穣他，日本呼吸器学会雑誌 ，２００６年，Vol.44 増刊号，p279 ＰＰ１６５

【文献】 S H Gillespie，J Clin Pathol.，１９９５年，Vol.48，p803-806

【文献】 石川信泰他，日本小児呼吸器疾患学会雑誌，２００７年，Vol.18, No.1，p78-81

【文献】 永田一真他，日呼吸会誌，２０１０年，Vol.48, No.9，p661-667

【文献】 福島喜代康他，第６０回日本化学療法学会西日本支部総会、第５５回日本感染症学会中日本地方会学術集会、第８２回日本感染症学会西日本地方会学術集会 共同開催 2012 年プログラム・講演抄録集，２０１２年１０月，p287 159

【文献】 福島喜代康他，第６１回日本感染症学会東日本地方会学術集会、第５９回日本化学療法学会東日本支部総会 合同学会 プログラム・抄録集，２０１２年 ９月，p298 ，O140

【文献】 Scandinavian Journal of Infectious Diseases，２００６年，Vol.38，p166-171

【文献】 Journal of Internal Medicine，２００６年，Vol.260，p93-101

【文献】 Infection，２００８年，Vol.36, No.3，p213-219

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０４

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者から採取した血液中の肺炎球菌抗原の有無と、血中Ｃ反応性タンパク質濃度（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）及び血中尿素窒素濃度（ＢＵＮ）から選ばれる１種以上の生化学的検査値を測定する、肺炎球菌性肺炎の重症度の判定のためのデータを収集する方法であって、肺炎球菌抗原が陽性で、選択される１種以上の生化学的検査値がそれぞれ以下の場合に、重症又は超重症と評価するためのデータを収集する方法。
ＣＲＰ：１０ｍｇ／ｄL以上
ＷＢＣ：１０，０００個／ｍｍ³以下
ＢＵＮ：２０ｍｇ／ｄL以上

【請求項2】

肺炎球菌抗原が陽性で、選択される１種以上の生化学的検査値がそれぞれ以下の場合に、重症又は超重症と評価するためのデータを収集する方法である、請求項１記載の方法。
ＣＲＰ：２０ｍｇ／ｄL以上
ＷＢＣ：６，０００個／ｍｍ³以下
ＢＵＮ：２０ｍｇ／ｄL以上

【請求項3】

肺炎球菌抗原がＣ−多糖抗原、莢膜抗原及び細胞膜多糖抗原から選ばれる１種以上である請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

肺炎球菌性菌血症を併せて評価するためのデータを収集する方法である、請求項１〜３の何れか１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は被験者の血液より肺炎球菌性肺炎の重症度を判定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肺炎球菌（S.pneumoniae）は、市中肺炎や下気道感染症の原因菌として最も検出頻度の高い菌であり、日本だけではなく全世界においても罹患率、死亡率の高い原因菌の一つである。肺炎球菌感染症は、頻度が高いだけではなく、重症化しやすいため、できる限り原因菌を早期に確定し、的確な治療薬を選択することが予後の改善、医療コストの削減、耐性菌発現防止の点からも重要である。

【0003】

肺炎の診断は、一般に、臨床症状、身体所見、一般検査所見、胸部X線写真等から総合的に行われ、肺炎と診断された患者は引き続き、「成人市中肺炎診療ガイドライン」（非特許文献１）に示されているＡ−ＤＲＯＰシステムに従って重症度の判定が行われ、その結果に基づき外来治療、入院治療、ＩＣＵ治療が選択される。ここで、Ａ−ＤＲＯＰシステムとは、１）男性７０歳以上、女性７５歳以上、２）ＢＵＮが２１ｍｇ／ｄＬ以上又は脱水あり、３）ＳｐＯ₂が９０％以下（ＰａＯ₂が６０Ｔｏｒｒ以下）、４）意識障害あり、５）血圧（収縮期）９０ｍｍＨｇ以下、の５つの指標のうち該当する数で重症度の決定するものである（図１参照）。
そしてその後、起炎菌検査が行われ、検出された起炎菌に応じて治療指針が立てられる。しかしながら、培養検査による起炎菌の同定と薬剤感受性検査の結果が判明するのには数日要することから、最近では、喀痰、上咽頭ぬぐい或いは尿等から肺炎球菌抗原に対する特異的抗体を用いた診断薬（「ラピラン（登録商標）肺炎球菌」（大塚製薬株式会社）、「ラピラン（登録商標）肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）」（大塚製薬株式会社）、「ＢｉｎａｘＮＯＷ（登録商標）肺炎球菌」（アリーア メディカル株式会社））を用いた迅速検査を初期に行い、早期に治療方針を立てることも行われている。

【0004】

また、肺炎では１０％の頻度で菌血症の合併がみられ、特に肺炎球菌では６０％以上に達することが報告されていることから、血液中の菌を検出することが重要である。血液中の菌の検出法としては、血液培養、ＲＴ−ＰＣＲ法、抗原検査が挙げられる。血液培養は肺炎において可能な限り実施されているが、検査結果を得るのに時間がかかること、ＲＴ−ＰＣＲと比較して検出率が２０％前後と低いことから、緊急性を要する際には有効な方法とは言えない。ＲＴ−ＰＣＲは検出率が高いが、専用の器械が必要なこと、高価であることから、臨床では普及するには至っていない。抗原検査に関しては、原理的には血清中のＣ−多糖抗原（Ｃ−ｐｓ）等をＥＬＩＳＡ等で検出する報告はあるが（非特許文献２、３）、前処理法の必要性やＥＬＩＳＡという迅速性に欠ける検出法であることから実用化には至っていないのが現状である。

【0005】

したがって、現行では臨床症状や生化学マーカーの情報のみで判断されている肺炎の重症度の判断を、起炎菌の推定を含めてより客観的に且つ迅速に行うことが可能な手段が望まれている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】日本呼吸器学会「呼吸器感染症に関するガイドライン」成人市中肺炎診療ガイドライン．日本呼吸器学会、2007．p9-12

【非特許文献2】Gillespie SH, et al. 1995, J Clin Pathol ;48 :803-806

【非特許文献3】Coonrod JD, et al. 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 778-786

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、被験者の血液を用いて、より客観的に且つ迅速に、肺炎球菌性肺炎の重症度を判定することが可能な方法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、初期診断時に、肺炎球菌性肺炎の重症度を簡易に且つ客観的に判定できる方法について検討したところ、患者の血液中の肺炎球菌抗原を測定し、当該情報と特定の生化学マーカの測定値（生化学検査値）を組み合わせた場合に、Ａ−ＤＲＯＰシステムによって重症及び超重症と判定される患者と軽症及び中等症と判定される患者を良好に区別でき、肺炎球菌性重症肺炎の判定が可能であることを見出した。また、この方法によれば、血液中の肺炎球菌抗原を測定することから、肺炎球菌性菌血症の判定も同時に可能となる。

【0009】

本発明は、下記１）〜４）に係るものである。
１）被験者から採取した血液中の肺炎球菌抗原の有無と、血中Ｃ反応性タンパク質濃度（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）及び血中尿素窒素濃度（ＢＵＮ）から選ばれる１種以上の生化学的検査値を指標とする肺炎球菌性肺炎の重症度の判定方法。
２）肺炎球菌抗原が陽性で、生化学的検査値が以下の場合に、重症又は超重症と評価する、上記１）の方法。
ＣＲＰ：１０ｍｇ／ｄL以上
ＷＢＣ：１０，０００個／ｍｍ³以下
ＢＵＮ：２０ｍｇ／ｄL以上
３）肺炎球菌抗原がＣ−多糖抗原、莢膜抗原及び細胞膜多糖抗原から選ばれる１種以上である上記１）又は２）の方法。
４）肺炎球菌性菌血症を併せて評価する上記１）〜３）の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明の方法によれば、現行では臨床症状や生化学マーカーの情報のみで判断されている肺炎の重症度、それに基づき決定される治療の場の目安（外来治療、入院治療、ICU治療）の判断を、起炎菌の推定を含めてより客観的に且つ迅速に行うことが可能となる。
これにより、早期に、適切な抗菌剤の選択が可能となり、予後の改善、医療コストの削減、耐性菌発現防止を図ることができる。
また、本発明の方法によれば、ＲＴ−ＰＣＲ法と同程度の感度で血液中の肺炎球菌抗原を検出できることから、肺炎球菌性菌血症の判定も同時に可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】Ａ−ＤＲＯＰシステムによる重症度分類と治療の場の関係を示す図。

【図2】血清希釈倍率ごとのライン強度（肺炎球菌抗原検出感度）を示した図及び表。

【図3】採血法ごとのライン強度（肺炎球菌抗原検出感度）を示した図。

【図4】血中肺炎球菌抗原の検出とＣＲＰとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図5】血中肺炎球菌抗原の検出とＷＢＣとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図6】血中肺炎球菌抗原の検出とＢＵＮとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図7】血中肺炎球菌抗原の検出と好中球との組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図8】血中肺炎球菌抗原の検出とＮａとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図9】血中肺炎球菌抗原の検出とＣｒとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【図10】血中肺炎球菌抗原の検出とＢＮＰとの組み合わせによる重症度との相関を示した図。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の方法が適用される被験者としては、肺炎球菌性肺炎の患者、肺炎球菌性肺炎の罹患が疑われる患者、肺炎球菌性気道感染症が疑われる患者、肺炎球菌性全身感染症が疑われる患者、肺炎球菌性の炎症が疑われる患者、さらに上記を代表とする肺炎球菌性疾患への罹患が疑われる健常者等を挙げることができる。また、ここでいう患者は、ヒトに限定されるものではなく、ヒト以外の哺乳動物も本発明の対象となる。

【0013】

被験者から採取した「血液」には、血液（全血）、血漿、血清が包含される。
肺炎球菌抗原の測定には、血清又は血漿を用いるのが好ましく、１〜１０倍、好ましくは２倍希釈して用いるのが検出感度を高める点で好ましい。

【0014】

本発明の方法に用いられる肺炎球菌抗原としては、細胞壁抗原（Ｃ−多糖抗原（Ｃ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ｃ−ｐｓ））、莢膜抗原（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、細胞膜多糖抗原（Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ；ＬｉｐｏＴｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ／Ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）、等が挙げられ、このうちＣ−ｐｓ、莢膜抗原、細胞膜多糖抗原が好ましく、Ｃ−ｐｓ、莢膜抗原及び細胞膜多糖抗原を共に測定・検出するのがより好ましい。

【0015】

本発明の方法においては、血液中の当該肺炎球菌抗原の有無が測定されるが、測定には、定量的または非定量的な測定が包含される。非定量的な測定としては、例えば、単に肺炎球菌抗原が存在するか否かの測定、肺炎球菌抗原が一定の量以上存在するか否かの測定、肺炎球菌抗原の量を他の試料（例えば、コントロール試料等）と比較する測定等を挙げることができる。定量的な測定としては、肺炎球菌抗原の濃度の測定、肺炎球菌抗原の量の測定等が挙げられる。
本発明において、肺炎球菌抗原が陽性とは、少なくとも血中に肺炎球菌抗原が存在することを意味する。

【0016】

肺炎球菌抗原の測定法としては、上記の肺炎球菌抗原に対する抗体を用いる免疫学的測定法が好適に挙げられる。肺炎球菌抗原に対する抗体としては、肺炎球菌抗原に特異的に結合すればよく、抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体等の公知の抗体を用いることができる。
哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、肺炎球菌抗原を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
また、当該抗体は、肺炎球菌抗原を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物等であってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ等を挙げることができる。

【0017】

肺炎球菌抗原に対する抗体の具体例としては、Ｃ−ｐｓに対する抗体として、例えば、１）Nielsenら，Antibodies against pneumococcal C-polysaccharide are not protective, Microbial Pathogenesis 14:299-305(1993)；２）Gillespieら，Detection of C-polysaccharide in serum of patients with Streptococcus pneumoniae bacteremia，Ｊ Clin Pathol 48:803-806（1995）；３）United States Patent: 6824997（1997）；４）Eharaら，A novel method for rapid detection of Streptoeoccus pneumoniae antigen in sputum and its application in adult respiratory tract infection，Journal of Medical Microbiolog 57：820-82（2008）；に記載の抗体、莢膜抗原に対する抗体として、例えば、１）Coonrodら，Detection of type-specific pneumococcal antigens by counterimmunoelectrophoresis.11.Etiologic diagnosis of pneumococcal pneumonia, J.Lab.Clin.Med.81.778-786(1973)；２）Feiginら，Countercurrent immunoelectrophoresis of urine as well as of CSF and blood for diagnosis of bacterial meningitis，The Journal of Pediatrics 89.773-775 (1976)；３）Ajelloら，Commercial Latex Agglutination Tests for Detection of Haemophilus influenza Type b and Streptococcus pneumoniae Antigens in Patients with Bacteremic Pneumonia，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 25(8);1388-1391(1987)；４）Ballaedら,Comparison of three latex agglutination kits and counterimmunoelectrophoresis for the detection of bacterial antigens in a pediatric populatio，Pediatr.Infect.Dis.J.6(7);630-634(1987)；５）小林ら，肺炎球菌尿中抗原迅速検出キットの市中肺炎における有用性の検討，感染症学雑誌第76巻第12号；995-1002(2002)；に記載の抗体、細胞膜多糖抗原に対する抗体として、例えばHotomiら，Evaluation of a Rapid Immunochromatographic ODK-0901 Test for Detection of Pneumococcal Antigen in Middle Ear Fluids and Nasopharyngeal Secretions.PLoS one, 7(3); e33620(2012) に記載の抗体が挙げられる。

【0018】

肺炎球菌抗原に対する抗体を用いる免疫学的測定法としては、当該分野で公知の任意の免疫測定方法を使用することができる。例示的には、ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等のエンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）、ラテックス凝集法（ＬＴＩＡ）及びイムノクロマトグラフィーが挙げられる。検出感度の向上の点で、サンドイッチ法の使用が好ましい。また、簡便さ及び迅速さの観点では、イムノクロマトグラフィーが好ましい。イムノクロマトグラフィー法を用いる場合、ベッドサイドや患者来院中の短時間での診断が可能となる。

【0019】

上記免疫学的測定において使用される標識としては、当該分野で使用される任意の標識が挙げられる。例示的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフオスファターゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）、ＦＩＴＣ、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、ケミルミネッセンス等の発光物質、及び金コロイド、着色ラテックス粒子等の可視化物質が挙げられる。さらに、ビオチンで一次標識後、上記標識により標識されたアビジンを用いる増感系や、ジゴキシゲニン等の低分子物質で一次標識後、上記標識により標識された抗体等の当該低分子物質に親和性を有する物質を用いる検出法も挙げられる。

【0020】

本発明における肺炎球菌抗原の測定には、市販の肺炎球菌検出キットである、「ラピラン肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）」（大塚製薬株式会社）、「ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌」（アリーア メディカル株式会社）等を使用することもできる。

【0021】

本発明で使用される生化学検査値は、血中Ｃ反応性タンパク質濃度（ＣＲＰ）、白血球数（ＷＢＣ）及び血中尿素窒素濃度（ＢＵＮ）から選ばれる１種以上である。
（１）Ｃ反応性タンパク質（C-reactive protein：ＣＲＰ）
ＣＲＰは、体内で炎症反応や組織の破壊が起きている場合に血中に現れるタンパク質で、肺炎球菌のＣ多糖体と結合する性質を有する。一般に、炎症マーカーとして利用されている。
ＣＲＰは、２０００年に制定された旧ガイドラインにあたる「成人市中肺炎診療の基本的考え方」には肺炎の重症度判定のパラメーターとされていたが、２００７年に制定された「呼吸器感染症に関するガイドライン」の検証において重症度を正確に反映しないとの報告があり、新ガイドラインでは、重症度の判定項目から削除されている（前記非特許文献１参照）。
然るに、ＣＲＰは、肺炎球菌抗原の検出（陽性）と組み合わせることにより、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の判定が可能である（実施例３参照）。この場合のＣＲＰのカットオフ値は１０〜２０ｍｇ／ｄＬである。
すなわち、本発明において、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の指標としてのＣＲＰは１０ｍｇ／ｄＬ以上、好ましくは２０ｍｇ／ｄＬである。

【0022】

本発明において、ＣＲＰの測定は特に限定されないが、例えば、ラテックス免疫比濁法が挙げられる。

【0023】

（２）白血球数（ＷＢＣ）
血液中の白血球数（ＷＢＣ）は、一般に細菌性感染時には上昇するが、重症性肺炎では肺に局在化することで血中濃度が下がることが知られている。ＷＢＣはＣＲＰと同様、過去には肺炎の重症度判定のパラメーターとされていたが、２００７年に制定された新ガイドラインでは、重症度の判定項目から削除されている（前記非特許文献１参照）。
然るに、ＷＢＣについても、肺炎球菌抗原の検出（陽性）と組み合わせることにより、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の判定が可能である（実施例３参照）。この場合のＷＢＣのカットオフ値は１０，０００個／ｍｍ³〜６,０００個／ｍｍ³である。
すなわち、本発明において、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の指標としてのＷＢＣは健常者の分布範囲内もしくは、それ以下の場合、例えば１０，０００個／ｍｍ³以下、好ましくは６０００個／ｍｍ³以下である。

【0024】

本発明において、ＷＢＣの測定は特に限定されないが、例えば、血球計算が可能な自動測定器が挙げられる。

【0025】

（３）血中尿素窒素濃度（ＢＵＮ）
ＢＵＮは、血中の尿素由来の窒素量を表すものであり、腎機能マーカーとして利用されている。
ＢＵＮは、脱水と異化の亢進が大きい重症肺炎の患者で高値になることが知られている。肺炎球菌抗原の検出（陽性）と組み合わせることにより、より精度よく、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の判定が可能である（実施例３参照）。この場合のＢＵＮのカットオフ値は凡そ２０ｍｇ／ｄＬが挙げられる。
すなわち、本発明において、肺炎球菌性肺炎の重症及び超重症の指標としてのＢＵＮは例えば２０ｍｇ／ｄＬ以上が挙げられる。

【0026】

本発明において、ＢＵＮの測定は特に限定されないが、例えば、ウレアーゼＧＬＤＨ法、ウレアーゼＩＣＤＨ法が挙げられる。この中でもウレアーゼＧＬＤＨ法が好適に用いられる。

【0027】

また、本発明の方法によれば、血液中の肺炎球菌抗原を測定することから、肺炎球菌性菌血症の判定も同時に可能となる。ここで、「肺炎球菌性菌血症」とは、血液中に肺炎球菌が存在することである。すなわち、本発明の方法において、血液中肺炎球菌抗原が陽性であれば、肺炎球菌性菌血症であると推測することができる。従来肺炎球菌性菌血症の判定は、血液培養での肺炎球菌の検出で行われていたが、血液培養は肺炎球菌に限らず微生物の検出率が低いと認識されており、近年はＲＴ−ＰＣＲでの検出が用いられるようになってきている（Restiら，Community-Acquired Bacteremic Pneumococcal Pneumonia in Children: Diagnosis and Serotyping by Real-Time Polymerase Chain Reaction Using Blood Samples,Clinical Infectious Diseases.51(9):1042-1049(2010)）。本発明の方法を用いれば、ＲＴ−ＰＣＲを使用せずに簡易に肺炎球菌性菌血症の推測が可能となる。

【実施例】

【0028】

＜材料及び方法＞
インフォームドコンセントを得て、患者から採取した全血を、一般的な遠心分離法または沈降法により血清または血漿に分離した後、−８０℃で保存した。
（１）検体の調製
血清は、血清分離体入りの採血管に血液を採取し、遠心後に血清画分を得た。血漿は、ＥＤＴＡ・２Ｎａまたはヘパリン採血管に血液を採取し、遠心もしくは静置後に上清を採取することで得た。いずれの検体も−８０℃で保存した。
（２）肺炎球菌抗原測定のための血清／血漿の至適希釈率の評価
血清／血漿の至適希釈率の評価には「ラピラン肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）」（大塚製薬株式会社）を用いた。キットに付属の検体抽出試薬を用い血清／血漿を段階希釈し、最も強いテストラインの強度を得られる希釈率を求めた。なお、測定後のラインは市販デジタルカメラで撮影後、デンシトメーター（ＡＴＴＯ社）を用いてその強度を評価した。
（３）肺炎球菌抗原測定
以下に示す市販のキットを使用して、血中の肺炎球菌抗原の有無を測定した。
１）ラピラン肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）（大塚製薬株式会社）
（２）で至適希釈率と判断された２倍希釈血清／血漿をキットに添付のサンプルカップに１５０μＬ分注し、そこにテストスティック（試薬本体）のサンプルアプライ部を浸し、その後は添付文書に従い測定した。
２）「ＢｉｎａｘＮＯＷ^R肺炎球菌」（アリーア メディカル株式会社）
１）にて調製した２倍希釈血清／血漿にキット付属の綿棒を浸し、その後は添付文書に従い評価した。
（４）その他の測定項目
１）生化学マーカー
血清を検体として、ＣＲＰ、ＷＢＣ、好中球、ＢＵＮ、Ｎａ、Ｃｒ、ＢＮＰを日立自動分析装置ＬＡＢＯＳＰＥＣＴ ００８で測定した。
２）培養
起炎菌の推定のために、血液培養および喀痰培養を実施した。各検体の培養はＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、臨床・検査標準協会）の規格に準拠し、行われた。
３）ＰＣＲ
既報（Ehara N, et al. 2008, Journal of Medical Microbiology 57: 820-826）の方法に準じて、肺炎球菌のＰｓｐＡ遺伝子を対象に血清中の肺炎球菌ＰｓｐＡ ＤＮＡの定量を行なった。なお、当該施設における検出感度は２００ｃｏｐｉｅｓ／μｇＤＮＡである。

【0029】

実施例１
（１）重症度判定
成人市中肺炎診療ガイドライン（前記非特許文献１）記載のＡ−ＤＲＯＰシステムを用いて重症度判定を行った下記の症例に対して、生化学マーカーおよび血液中肺炎球菌抗原の評価を実施した。重症度判定ごとの症例数を表１に示した。

【0030】

【表1】

【0031】

（２）至適検体濃度調整
「ラピラン肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）」を指標として、キットに添付されている検体抽出試薬で、異なる５種の血清サンプルを、血清原液（希釈倍率１倍），２倍，６倍，１８倍に希釈後同キットで測定し、ライン強度を比較検討した。希釈倍率ごとのライン強度を図２に示す。

【0032】

図２より、何れの血清検体においても、２倍希釈でライン強度が最高値を示した。なお、血清原液では粘性が高く、流速が遅い傾向が見られており、迅速性、ライン強度共に２倍希釈（原液：検体抽出液＝１：１）が至適検体濃度と考えられた。

【0033】

（３）採血法間差（検体種）
１人の患者から採取した血液から、血清１種類、図３に示す血漿４種類を調製し、「ラピラン肺炎球菌ＨＳ（中耳・副鼻腔炎）」を用いてラインの強度を評価した。結果を図３に併せて示す。
何れの採血法（血清、ＥＤＴＡ−２Ｎａ血漿、ヘパリン血漿）、何れの分離法（遠心法、静置分離法）においてもラインの強度は同等であり、採血法、分離法の影響は受けないと考えられた。よって以後の評価には遠心分離にて調整した血清を用いた。

【0034】

（４）各患者における血中肺炎球菌抗原の検出感度及び特異度
各患者における血中肺炎球菌抗原の検出感度及び特異度を、喀痰培養検査の結果を基準として算出した。感度とは喀痰培養陽性例において、各測定法でも陽性と判定できた例数の割合を示す。また、特異度とは喀痰培養陰性例において、各測定法でも陰性と判定できた例数の割合を示す（表２）

【0035】

【表2】

【0036】

「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」及び「ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌」は、共に肺炎の重症度が上がるに連れて、感度が上昇する傾向が見られ、その検出率は高感度な肺炎球菌検出法として知られる「ＲＴ−ＰＣＲ」と同等であった。

【0037】

実施例２ 重症、超重症例での解析結果
さらに、重症、超重症と判定された肺炎症例を対象に、血液中肺炎球菌抗原を「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」、「ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌」を用いて測定し、血液ＰＣＲの結果と比較検討した。その結果、喀痰培養で肺炎球菌が検出された重症、超重症例の５例は全例が両キットで陽性を示した。また、ＰＣＲでは１例を除く４例が陽性であった。

【0038】

【表3】

【0039】

実施例３ 臨床経過
一人の患者の臨床経過を評価した。検体採取初日時点ではＰＣＲ、「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」、「ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌」の何れも陰性であったが、２日後には何れも陽性に転じており、ＰＣＲ、「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」、「ＢｉｎａｘＮＯＷ肺炎球菌」の検出効率はほぼ同等であると判断された（表４）。

【0040】

【表4】

【0041】

実施例３ 生化学測定値との組み合わせによる重症度との相関
（１）肺炎症例を重症・超重症群と、その他＋中等症以下（軽症含む）群に分類し、さらに各群を「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」（図中ＨＳと表示）の陽性、陰性例に細分化した。そのときの生化学マーカー（ＣＲＰ、ＷＢＣ、ＢＵＮ）の測定値を縦軸にプロットした。

【0042】

１）ＣＲＰ（図４）
ＣＲＰと「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」との組み合わせでは、肺炎球菌ＰＣＲ陽性群を抽出可能であった。この時のＣＲＰのカットオフ値としては２０ｍｇ／ｄＬが最適と考えられた。

【0043】

２）ＷＢＣ（図５）
ＷＢＣと「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」との組み合わせでは、ＰＣＲ陽性例を効率的に検出可能であった。この時のＷＢＣのカットオフ値としては、成人の健常分布幅の上限である１００００個／ｍｍ³を採用できると考えられる。

【0044】

３）ＢＵＮ（図６）
ＢＵＮと「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」との組み合わせでは、ＰＣＲ陽性例を効率的に検出可能であった。この時のＢＵＮのカットオフ値としては、２０ｍｇ／ｄＬを採用できると考えられる。

【0045】

比較例
肺炎症例を重症・超重症群と、その他＋中等症以下（軽症含む）群に分類し、さらに各群を「ラピラン肺炎球菌ＨＳ」（図中ＨＳと表示）の陽性、陰性例に細分化した。そのときの生化学マーカー（好中球、Ｎａ、Ｃｒ、ＢＮＰ）の測定値を縦軸にプロットした。
結果を図７〜１０に示す。好中球、Ｎａを用いた場合、各群間では有意な差が得られなかった。また、ＣｒやＢＮＰでは重症例のラピラン肺炎球菌ＨＳ陽性例において高値例が観察されるものの一部症例に限定されており臨床的な意義は見られなかった。

【産業上の利用可能性】

【0046】

生化学マーカー単独での診断では、肺炎を疑われる症例における重症度の予想はある程度は可能となるが、肺炎球菌に限らず他の感染症との鑑別は不可能である。成人市中肺炎の原因微生物の約５０−８０％が細菌性であり、そのうち１２−２７％が肺炎球菌性肺炎であると報告されているが、肺炎球菌性では特に重症化しやすく他の起炎微生物との鑑別が臨床上重要となる。さらに、各種起炎細菌の耐性化を防御する上で、起炎細菌を迅速に断定し至適な抗菌剤を選択することは治療期間の短期化にとっても重要と考えられる。肺炎球菌ではペニシリン系抗菌剤を第一選択とすることがガイドライン上求められる。したがって生化学マーカーと血液中肺炎球菌抗原検出系との組み合わせでは、生化学マーカー単独では判断できない重症性の肺炎球菌性肺炎を迅速に決定可能であり、また肺炎球菌抗原検出系単独では判定できない肺炎重症度を合わせて判断可能となるため最適な抗菌剤の選択及び入院治療の判断に意義を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】