特許 6207531 放射線感受性を調節するためのＨＥＲ３阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6207531

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】放射線感受性を調節するためのＨＥＲ３阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20170925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170925BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20170925BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20170925BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61P43/00 105

   !C07K16/46ZNA

   !C07K16/30

【請求項の数】12

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2014-558121(P2014-558121)

(86)(22)【出願日】2013年2月22日

(65)【公表番号】特表2015-509944(P2015-509944A)

(43)【公表日】2015年4月2日

(86)【国際出願番号】EP2013053562

(87)【国際公開番号】WO2013124419

(87)【国際公開日】20130829

【審査請求日】2015年7月1日

(31)【優先権主張番号】61/602,239

(32)【優先日】2012年2月23日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】517041992

【氏名又は名称】ダイイチサンキョウヨーロッパ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】ウィーラー デリック エル．

(72)【発明者】

【氏名】ヘットマン トーレ

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０６０２０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第０２１３８５１１（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５１５５１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys.，２０００年，Vol.48, No.5，p.1519-1528

【文献】 JOSEPH N CONTESSA，BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT，KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS，２００６年 １月 １日，V95 N1，P17-27

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

扁平上皮細胞がんの治療のための、ＨＥＲ−３阻害剤を含む医薬組成物であって、前記阻害剤は放射線療法と組み合わせて使用され、前記阻害剤は、配列番号７０の重鎖アミノ酸配列および配列番号７２の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、前記阻害剤は、放射線療法の前に投与される、
医薬組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、多重特異性抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントであることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の医薬組成物であって、
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、または単鎖抗体分子であることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体が、エフェクター基および／または標識基に結合していることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項5】

請求項４に記載の医薬組成物であって、
前記エフェクター基が、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療基、および／または化学療法基であることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項6】

請求項４に記載の医薬組成物であって、
前記標識基は、放射性同位体または放射性核種、蛍光基、酵素基、化学発光基、ビオチニル基、または所定のポリペプチドエピトープであることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体が、ＨＥＲ−３の細胞外ドメインに対して向けられることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記がんが、肺、頭部および／または頚部の、扁平上皮細胞がんであることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記放射線治療が、温熱療法、体外照射療法、近接照射療法および／または放射性同位体療法より選択されることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記放射線治療が、単一線量または分割線量の放射線照射に基づくことを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
化学療法化合物などのさらなる活性化合物と組み合わせることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項12】

請求項１から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、細胞の放射線感受性の調節のためのものである、
医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、放射線治療と組み合わせた、過剰増殖性疾患を治療するためのＨＥＲ−３阻害剤の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ−３、ＥｒｂＢ３としても知られる）は、受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＨＥＲ−１（ＥＧＦＲとしても知られる）、ＨＥＲ−２、およびＨＥＲ−４も含む受容体タンパク質チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）サブファミリーに属する（Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（１９９０），４９０５−４９０９；Ｋｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６（１９８９），９１９３−９１９７；およびＫｒａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１９９３），２９００−２９０４）。プロトタイプの上皮成長因子受容体と同様に、膜貫通受容体ＨＥＲ−３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）およびＣ末端リン酸化ドメインからなる。

【0003】

リガンドであるヘレグリン（ＨＲＧ）は、ＨＥＲ−３の細胞外ドメインに結合して、他のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーメンバーとの二量体化およびその細胞内ドメインのトランスリン酸化を促進することにより、受容体により仲介されるシグナリングパスウェイを活性化する。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ−３のシグナリングの潜在能力を増大させ、シグナルの多様化だけでなくシグナル増幅のための手段となる。例えば、ＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバーの中で最も重要な分裂促進的シグナルのうちの一つを誘導する。

【0004】

ＨＥＲ−３は、乳がん、胃腸がんおよび膵がんなどの様々なタイプのがんで過剰発現されることが見いだされている。興味深いことに、ＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３の発現と非侵襲から侵襲性ステージへの進行との間の相関が示されている（Ａｌｉｍａｎｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０，１８１３−１８２１；ｄｅＦａｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８７，４８７−４９８；Ｎａｉｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８，１３８５−１３９０）。したがって、ＨＥＲ−３により仲介されるシグナリングを妨げる薬剤が望ましい。ミューリンまたはキメラＨＥＲ−３抗体が、例えばＵＳ５９６８５１１、ＵＳ５４８０９６８およびＷＯ０３０１３６０２で報告されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、従来技術で知られているものよりも効果的なＨＥＲ−３の阻害に基づいて、過剰増殖性疾患、特にがんの治療を提供することであった。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本目的は、放射線治療と組み合わせた、過剰増殖性疾患の治療のためのＨＥＲ−３阻害剤の使用により解決される。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】Ａ）多発性がん細胞株でのＨＥＲ３プロファイル ５つのヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２２６、Ｈ２９２、Ｈ３５８、Ｈ５２０およびＡ５４９）、５つの結腸直腸がん細胞株（Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８、ＬＳ１８０、ＬｏｖｏおよびＨＣＴ１１６）、および、５つの頭頸部がん細胞株（ＳＣＣ１、ＳＣＣ６、ＳＣＣ１１Ａ、ＳＣＣ３８およびＳＣＣ１４８３）を、適切な培地中で培養した。全細胞溶解物を溶解バッファーで得た。ブラッドフォード法を用いてタンパク質を定量して、ＳＤＳゲルにより分離し、続いて、指示抗体でのイムノブロットを行なった。 （Ｂ）ＨＥＲ３の基礎活性は、Ｕ１−５９により阻害される。 ｐ−ＨＥＲ３が高い４つの頭頸部がん細胞株（ＳＣＣ６、ＳＣＣ１１Ａ、ＳＣＣ３８、ＳＣＣ１４８３）および２つの肺がん細胞株（Ｈ２２６およびＡ５４９）を、複数回用量のＵ１−５９で２４時間処理した。全細胞溶解物を分離して、続いて、指示抗体でのイムノブロットを行なった。これらの細胞において、Ｕ１−５９は、ＨＥＲ３活性およびその下流のシグナルを、用量依存的な様式で阻害した。

【図2】放射線照射により誘導されるＨＥＲ３活性化は、Ｕ１−５９により阻害される。（Ａ、Ｄ）ＨＥＲ３は、指示時間中、放射線照射により一過的に活性化されて、Ｕ１−５９により阻害された。ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞を、放射線照射の前に、Ｕ１−５９（２０μｇ／ｍｌ）存在下／不存在下で、２４時間インキュベートした。４Ｇｙの放射線に曝した後、指示時間に全細胞溶解物を分離して、続いて、ｐ−ＨＥＲ、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＭＡＰＫ抗体でのイムノブロットを行なった。（Ｂ、Ｅ）Ｕ１−５９は、放射線照射後２４時間および４８時間、ＡＫＴおよびＭＡＰＫの阻害活性化を保った。（Ｃ、Ｆ）ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞において、ＨＥＲ３を示す免疫蛍光は、放射線照射により活性化され、Ｕ１−５９により阻害された（放射線照射後３０分）。

【図3】（Ａ、Ｆ）Ｕ１−５９は、用量依存的な様式で細胞増殖を阻害した。 ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞を９６穴プレートに播いて、複数回用量のＵ１−５９とともに７２時間インキュベートした。ＣＣＫ８を用いて細胞増殖を検出した（７２時間）。 （Ｂ、Ｇ）ＳＣＣ６細胞に対する、放射線に応答したＵ１−５９の増感効果。 ＳＣＣ６およびＨ２２６をＵ１−５９とともに４時間インキュベートして、指示線量で放射線照射した。クローン原性アッセイを記載されるとおりに行なった。コントロール曲線は、Ｕ１−５９処理無しで放射線に曝された。 （Ｃ、Ｈ）細胞周期に対するＵ１−５９の影響。 ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞をＵ１−５９（２０μｇ／ｍｌ）とともに４８時間インキュベートして、続いて、６Ｇｙの放射線に曝した。放射線照射の２４時間後、細胞周期（ＰＩで染色した）を、フローサイトメーターを用いて検出し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。Ｕ１−５９はＧ１停止を引き起こし、放射線照射はＧ２停止を引き起こした。Ｕ１−５９と放射線の組み合わせは、細胞を細胞周期に再分類し、Ｇ１期およびＧ２期の細胞の蓄積を誘導し、そしてＳ期の細胞数を減少させた。 （Ｄ、Ｉ）細胞アポトーシスに対するＵ１−５９の影響 アポトーシス（アネキシンＶ／ＰＩで染色した）を、フローサイトメーターを用いて検出して、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。Ｕ１−５９と放射線の組み合わせは、アポトーシス細胞の割合を増加させた。 （Ｅ、Ｊ）Ｕ１−５９はγ−Η２ΑΧ病巣形成に寄与する。 ４Ｇｙの放射線照射の前に、ＳＣＣ６およびＨ２２６をＵ１−５９とともに２４時間インキュベートした。放射線照射の４時間後、細胞を固定し、免疫蛍光染色を行なった。薬剤または放射線単独と比較して、Ｕ１−５９と組み合わせてＸＲＴで処理した細胞において、γ−Ｈ２ＡＸ病巣数の増加が検出され、Ｕ１−５９によるＤＮＡ損傷の亢進を示した。

【図4】無胸腺マウスでの異種移植片腫瘍に対する、放射線照射と組み合わせたＵ１−５９の抗腫瘍効果。ＳＣＣ６、ＳＣＣ１４８３およびＨ２２６異種移植片を、「材料および方法」に記載のとおりに実行した。（Ａ）マウスを、単回量のＩｇＧ、放射線（１０Ｇｙまたは１６Ｇｙ）、Ｕ１−５９（８ｍｇ／ｋｇ）、または両方の組み合わせで治療した。データポイントは、平均腫瘍サイズ±ＳＤとして表した。結果を腫瘍増殖曲線およびカプランマイヤー生存曲線でグラフ化した。（Ｂ）示されるように、マウスを、分割量のＩｇＧ、放射線、Ｕ１−５９（１００μｇ／マウス）、または両方の組み合わせで、１週間に２回治療した。結果を腫瘍増殖曲線およびカプランマイヤー生存曲線でグラフ化した。

【図5】Ｕ１−５９は、異種移植片腫瘍において、ＨＥＲ３の基礎活性化および放射線照射により誘導される活性化を阻害する。分割治療群でのＳＣＣ６、ＳＣＣ１４８３およびＨ２２６異種移植片腫瘍を、放射線照射の２４時間後または最後の放射線照射後に回収した。腫瘍からタンパク質を分離して、ｐ−ＨＥＲ３をウエスタンブロットにより分析した。放射線照射された腫瘍ではｐ−ＨＥＲ３の増加が見られ、Ｕ１−５９または組み合わせの治療での腫瘍ではｐ−ＨＥＲ３の減少が見られた。

【図6】無胸腺マウスでの異種移植片腫瘍への放射線照射と組み合わせたＵ１−５９は、細胞生存シグナルを阻害し、ＤＮＡダメージを亢進させる。放射線（１６Ｇｙ）、Ｕ１−５９（８ｍｇ／ｋｇ）または両方の組み合わせでの、単回量の治療でのＳＣＣ６異種移植片腫瘍。腫瘍は、治療後２４時間に腫瘍を回収した。ＩＨＣ染色は「材料および方法」に記載のとおりに行なった。Ｕ１−５９または組み合わせの治療での腫瘍では、ｐ−ＭＡＰＫ、ｐ−Ｓ６およびＰＣＮＡ染色の減少、ＰＣＮＡ陽性細胞の減少、およびγ−Η２ΑΧ陽性細胞の増加が検出された。

【発明を実施するための形態】

【0008】

第一の態様によれば、本発明は、放射線治療と組み合わせた、過剰増殖性疾患の治療のためのＨＥＲ−３阻害剤の使用に関する。

【0009】

ＨＥＲ−３阻害剤と放射線療法の組み合わせの治療は、ＨＥＲ−３阻害剤または放射線療法のいずれか単独での治療による利点を超える相乗効果を導く。

【0010】

本発明によるＨＥＲ−３阻害剤は、タンパク質レベルまたは核酸レベルで作用し得る。核酸レベルで作用する阻害剤の例は当業者に公知であり、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子および／またはリボザイムを含む。

【0011】

タンパク質レベルで作用する阻害剤の例は、抗ＨＥＲ−３抗体またはその抗原結合性フラグメント、および、足場タンパク質である。抗ＨＥＲ−３抗体またはそのフラグメント、特にその抗原結合性フラグメントである阻害剤は、本発明の好ましい実施態様を表す。本発明によれば、用語「抗体フラグメント」は、前述の抗体の任意の部分、好ましくはそれらの抗原結合または可変領域を含む。

【0012】

本明細書において用いられる、「足場タンパク質」は、抗体様の結合活性を有するタンパク質、または抗体、すなわち、抗ＨＥＲ−３抗体を表す。本発明の文脈内で、本明細書において用いられる用語「足場タンパク質」は、アミノ酸の挿入、置換または欠失の許容度が高い露出表面領域を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本発明により用いることのできる足場タンパク質の例は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ、オオモンシロチョウ由来のビリン結合タンパク質、または他のリポカリン、アンキリンリピートタンパク質、およびヒトフィブロネクチン（Ｂｉｎｚ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６，４５９−６９でレビューされている）である。加えて、抗体様の結合活性を有する足場タンパク質は、足場ドメインを含むアクセプターポリペプチドから誘導することができ、アクセプターポリペプチドを含む足場ドメインにドナーペプチドの結合特異性を与えるために、ドナーポリペプチドの結合ドメインをグラフト化することができる。

【0013】

本発明による抗ＨＥＲ−３抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであってよい。モノクローナル抗体の使用が特に好ましい。当業者はそのような抗体の生産方法を知っている。モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５；２５６：４９５−４９７）の方法のような任意の適切な方法により生産してよい。

【0014】

本発明による抗体フラグメントは、好ましくは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、または単鎖抗体分子である。「Ｆａｂフラグメント」は、抗体ヒンジ領域由来の１または複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において、少数の残基が付加されている点が、「Ｆａｂ’フラグメント」とは異なる。「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、元来、「Ｆａｂ’フラグメント」のペアとして生産され、それらの間にはヒンジシステインを有する。本発明によれば、「Ｆｖフラグメント」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。

【0015】

本発明により用いられる抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体型であってよい。

【0016】

ヒト化型の抗体はさらに好ましい実施態様を示し、ヒト化またはＣＤＲグラフティングのような当技術分野で知られている方法に従って生産してよい。ヒト化抗体を生産するための代替法は当技術分野でよく知られており、例えば、ＥＰ ０ ２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。ヒト抗体は、異種抗体、例えばミューリンまたはラットの可変および／または定常領域を保有する抗体に関する特定の問題を回避する。モノクローナルヒト化抗ＨＥＲ−３抗体は、本発明の特に好ましい実施態様を表す。

【0017】

さらに好ましい実施態様によれば、抗体は、ＨＥＲ−３の細胞外ドメインに対して向けられる。抗ＨＥＲ−３抗体は、好ましくは、ＨＥＲ−３の細胞外部分の少なくとも１つのエピトープと相互作用する。エピトープは、好ましくは、アミノ末端ドメインであるドメインＬ１（ＡＡ１９−１８４）、２つのシステインリッチドメインであるドメインＳ１（ＡＡ１８５−３２７）およびＳ２（ＡＡ５００−６３２）、または、２つのシステインリッチドメインが隣接するドメインＬ２（３２８−４９９）に存在する。また、エピトープは、制限されないが、Ｌ１とＳ２の部分を含むエピトープなど、任意のドメインの組み合わせに存在してもよい。

【0018】

用いられる抗ＨＥＲ−３抗体は、エフェクターおよび／または標識基に結合されてよい。該当するカップリングおよび／または標識化技術は当業者に公知である。そのようなエフェクターおよび／または標識基は、薬物ターゲッティング、イメージング用途および／または診断用途で付けてよい。

【0019】

本明細書において用いられる用語「標識基」は、検出可能なマーカー、例えば、放射標識アミノ酸または標識アビジンにより検出可能なビオチニル部分をいう（例えば、蛍光マーカーに結合するストレプトアビジン、または、光学的方法または比色法により検出可能な酵素活性）。標識基の適切な例は、限定されないが、以下を含む：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。特定の態様では、立体障害の可能性を減らすために、標識基は、様々な長さのスペーサーアームによって付けられることが望ましい場合がある。

【0020】

あるいは、本発明により用いられる抗ＨＥＲ−３抗体は、エフェクター基に結合されてよい。本明細書において用いられる用語「エフェクター基」は、細胞傷害基、例えば、放射性同位体または放射性核種、毒素、治療基、または当技術分野で知られている他のエフェクター基をいう。適切なエフェクター基の例は、放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、カリケアマイシン、ドラスタチンアナログ、例えばアウリスタチン類、および、化学療法剤、例えば、ゲルダナマイシンおよびメイタンシン誘導体（ＤＭ１を含む）である。特定の態様では、立体障害の可能性を減らすために、エフェクター基は、様々な長さのスペーサーアームによって付けられることが望ましい場合がある。

【0021】

ＨＥＲ−３の阻害に加えて、さらに好ましい実施態様によれば、該当するエフェクター基、例えば上記に概説される放射性同位体または放射性核種で抗ＨＥＲ−３抗体を標識化することにより、放射線治療を行なう、または支持することが可能である。

【0022】

さらに、本発明により用いられるＨＥＲ−３阻害剤、および特に、本発明により用いられる抗ＨＥＲ−３抗体は、ＨＥＲ−３へのその結合により、ＨＥＲ−３が仲介するシグナル伝達が減少することでさらに特徴付けられ得る。本発明によれば、ＨＥＲ−３が仲介するシグナル伝達の減少は、例えば、細胞表面から少なくとも部分的にＨＥＲ−３分子の消失をもたらすＨＥＲ−３の下方制御により、または、細胞表面上のＨＥＲ−３の、実質的に不活性型での安定化、すなわち、非安定化型と比べてより低いシグナル伝達を示す型での安定化により、引き起こされ得る。あるいは、ＨＥＲ−３が仲介するシグナル伝達の減少はまた、リガンドまたは別のＨＥＲファミリーメンバーのＨＥＲ−３への結合、ＧＲＢ２のＨＥＲ−２への結合、またはＧＲＢ２のＳＨＣへの結合に影響を及ぼすことにより、例えば減少させるか阻害することにより、受容体チロシンリン酸化、ＡＫＴリン酸化、ＰＹＫ２チロシンリン酸化またはＥＲＫ２リン酸化を阻害することにより、または、腫瘍侵襲性を減少することにより、引き起こされ得る。あるいは、ＨＥＲ−３が仲介するシグナル伝達の減少はまた、他のＨＥＲファミリーメンバーとの二量体を含むＨＥＲ−３の形成に影響を及ぼすことにより、例えば減少させるか阻害することによっても、引き起こされ得る。一例は、とりわけ、ＨＥＲ３−ＥＧＦＲタンパク質の複合体形成の減少または阻害であり得る。

【0023】

本発明により用いられる好ましい抗ＨＥＲ−３抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１２６３２に記載される。

【0024】

特に好ましい実施態様によれば、抗体は、（ａ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ１；（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ２；および（ｃ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ３からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む重鎖アミノ酸配列、
または、（ａ）〜（ｃ）のＣＤＲのうちの１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を示す重鎖アミノ酸配列を含む。

【0025】

さらに好ましい実施態様によれば、抗体は、（ｄ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ１；（ｅ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ２；および（ｆ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ３からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む軽鎖アミノ酸配列、
または、（ｄ）〜（ｆ）のＣＤＲのうちの１つと少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を示す軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0026】

本発明のさらに別の実施態様では、抗体は、
（ａ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ１；
（ｂ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ２；および、
（ｃ）配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０に示すＣＤＲＨ３、
からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む重鎖アミノ酸配列、および、
（ｄ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ１；
（ｅ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ２；および、
（ｆ）配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２に示すＣＤＲＬ３、
からなる群より選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む軽鎖アミノ酸配列、
を含む。

【0027】

さらに好ましい実施態様によれば、抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。

【0028】

さらに好ましい実施態様によれば、本発明により用いられる抗ＨＥＲ−３抗体は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む。

【0029】

さらに好ましい実施態様は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ−３抗体の使用に関する。

【0030】

さらに別の好ましい実施態様によれば、本発明により使用される抗ＨＥＲ−３抗体は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４６、５０、５４、６０、６２、６６、７０、７４、７８、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６および２３０からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列；および、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、４４、４８、５２、５６、５８、６４、６８、７２、７６、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８および２３２からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0031】

特に好ましい実施態様は、配列番号４２の重鎖アミノ酸配列および配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ−３抗体、または、配列番号５４の重鎖アミノ酸配列および配列番号５６の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ−３抗体、または含む配列番号７０の重鎖アミノ酸配列および配列番号７２の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ−３抗体に関する。

【0032】

特に、抗ＨＥＲ−３抗体は、Ｕ１−１抗体、Ｕ１−２抗体、Ｕ１−３抗体、Ｕ１−４抗体、Ｕ１−５抗体、Ｕ１−６抗体、Ｕ１−７抗体、Ｕ１−８抗体、Ｕ１−９抗体、Ｕ１−１０抗体、Ｕ１−１１抗体、Ｕ１−１２抗体、Ｕ１−１３抗体、Ｕ１−１４抗体、Ｕ１−１５抗体、Ｕ１−１６抗体、Ｕ１−１７抗体、Ｕ１−１８抗体、Ｕ１−１９抗体、Ｕ１−２０抗体、Ｕ１−２１抗体、Ｕ１−２２抗体、Ｕ１−２３抗体、Ｕ１−２４抗体、Ｕ１−２５抗体、Ｕ１−２６抗体、Ｕ１−２７抗体、Ｕ１−２８抗体、Ｕ１−２９抗体、Ｕ１−３０抗体、Ｕ１−３１抗体、Ｕ１−３２抗体、Ｕ１−３３抗体、Ｕ１−３４抗体、Ｕ１−３５抗体、Ｕ１−３６抗体、Ｕ１−３７抗体、Ｕ１−３８抗体、Ｕ１−３９抗体、Ｕ１−４０抗体、Ｕ１−４１抗体、Ｕ１−４２抗体、Ｕ１−４３抗体、Ｕ１−４４抗体、Ｕ１−４５抗体、Ｕ１−４６抗体、Ｕ１−４７抗体、Ｕ１−４８抗体、Ｕ１−４９抗体、Ｕ１−５０抗体、Ｕ１−５１抗体、Ｕ１−５２抗体、Ｕ１−５３抗体、Ｕ１−５５．１抗体、Ｕ１−５５抗体、Ｕ１−５７．１抗体、Ｕ１−５７抗体、Ｕ１−５８抗体、Ｕ１−５９抗体、Ｕ１−６１．１抗体、Ｕ１−６１抗体、Ｕ１−６２抗体、または、前記抗体のうちの１つの、少なくとも１つの重鎖または軽鎖を有する抗体からなる群より選択される。特に好ましいのは、抗体Ｕ１−４９（配列番号４２／４４）、Ｕ１−５３（配列番号５４／５６）およびＵ１−５９（配列番号７０／７２）、または、前記抗体のうちの１つの、少なくとも１つの重鎖または軽鎖を有する抗体である。抗体Ｕ１−５９が特に好ましい。

【0033】

本発明により治療される疾患は、過剰増殖性疾患である。この過剰増殖性疾患は、好ましくは、がん、特に扁平上皮細胞がんである。

【0034】

本発明により好ましく治療されるがんの例は、乳がん、胃腸がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、肺がん、腎臓がん、結腸がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、グリオーマ、メラノーマ、精巣がん、軟組織肉腫、頭頚部がん、ＨＥＲ−３を発現または過剰発現する他のがん、および、腫瘍転移形成からなる群より選択される。

【0035】

特に好ましい実施態様によれば、がんは、肺の、頭部および／または頚部の、扁平上皮細胞がんである。

【0036】

本発明による放射線治療は、好ましくは、温熱療法、体外照射療法、近接照射療法および／または放射性同位体療法から選択される。当業者は、どの種類の放射線治療、および、特に、どの種類の放射線源が、治療される特定の患者に用いられるべきか、決定することができる。

【0037】

体外照射放射線療法は、放射線療法の最も一般的な型である。内部放射線療法（近接照射療法）と対照的に、体外照射放射線療法は、体の外側から放射線を腫瘍に向ける。用いられる電圧は当業者により決定されてよく、とりわけ、治療されるべき腫瘍の種類に依存する。例えば、キロ電圧のＸ線は皮膚がんおよび表面構造の治療に用いてよく、一方で、メガ電圧のＸ線は深部腫瘍（例えば、前立腺、肺または脳）の治療に用いてよい。Ｘ線および電子ビームはとりわけ体外照射放射線療法に最も広く用いられる源であるが、陽子線などの、より重い粒子線を用いてもよい。

【0038】

上記にすでに概説されるように、近接照射療法は、内部放射線療法としても知られている。それは、治療を要する部位の内側または近隣に放射線源が置かれる放射線療法の形態である。近接照射療法では、放射線源は、がん性腫瘍側に直接的に正確に置かれる。これは、放射線が制限された局部にのみ作用することを意味し、Ｘ線照射の放射線療法に勝る利点を提供する。例えば、周囲の健康組織への不必要な損傷の可能性を減らしながら、非常に高い照射量の限局的な放射線で腫瘍が治療され得る。近接照射療法に用いられる放射線源の例は、^１２５Ｉ／^１０３Ｐｄ、^９０Ｙおよび選択的内部照射療法（ＳＩＲＴ）を含む。ＳＩＲＴは、注入などすることのできるミクロスフェアの使用を含む。そのようなミクロスフェアは、レジンまたはガラスで作ることができる。ミクロスフェア内部には、イットリウム−９０などの放射線源を置くことができる。既に使用されているミクロスフェアの例は、ＴｈｅｒｅＳｐｈｅｒｅおよびＳＩＲ−Ｓｐｈｅｒｅｓであり、それらは球体あたりの放射能と塞栓効果が異なる。もちろん、放射線源に連結させた任意のさらなる適切なキャリアを使用することも考えられる。近接照射療法で用いる医薬品のさらなる例は、ＳＡＶＩ、ＭａｍｍｏＳｉｔｅ、Ｃｏｎｔｕｒａ、ＰｒｏｘｃｅｌａｎおよびＩ−Ｓｅｅｄを含む。

【0039】

放射性同位体療法は、標的療法のさらなる形態を示す。標的化は、同位体の化学的特性に起因し得る。放射性同位体は、例えば、注入または経口摂取により送達されてよい。治療に用いられる放射性同位体の例は、ヨウ素−１３１、ルテチウム−１７７およびイットリウム−９０、ストロンチウム−８９およびサマリウム−１５３を含む。

【0040】

本発明に従って用いることができる放射線治療および／または放射線治療は、放射線の単一線量または分割線量に基づいてよい。もちろん、放射線治療の持続時間を変えることも可能である。持続時間は、治療される腫瘍の場所、治療される腫瘍サイズ、および患者の健康状態に依存し得る。

【0041】

本発明による、ＨＥＲ−３阻害剤と放射線療法および／または治療との組み合わせは、ＨＥＲ−３阻害剤と放射線療法での同時の治療、および、時間的に交互の組み合わせを企図している。好ましい実施態様によれば、治療される腫瘍細胞は、放射線治療の前にＨＥＲ−３阻害剤により放射線増感化される、すなわち、ＨＥＲ−３阻害剤が、放射線治療／療法の前に投与される。

【0042】

本発明は、さらなる化学療法化合物のようなさらなる活性化合物、例えば、ドキソルビシン、シスプラチンまたはカルボプラチンなどの細胞傷害性薬物、サイトカイン、または、抗悪性腫瘍薬などと組み合わせて用いることができる。

【0043】

本発明の別の態様は、細胞の放射線感受性の調節のためのＨＥＲ−３阻害剤の使用に関する。

【実施例】

【0044】

（材料および方法）
<細胞培養および薬剤>
５つのヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２２６、Ｈ２９２、Ｈ３５８、Ｈ５２０およびＡ５４９、および５つの結腸直腸がん細胞株（Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８、ＬＳ１８０、ＬｏｖｏおよびＨＣＴ１１６）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）より購入して、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０またはＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に保った。５つの頭頸部がん細胞株（ＵＭ−ＳＣＣ１、ＵＭ−ＳＣＣ４、ＵＭ−ＳＣＣ６、ＵＭ−ＳＣＣ１１Ａ、およびＵＭ−ＳＣＣ１４８３細胞）をミシガン大学から取得し、１％ヒドロコルチゾンで補充されたＤＭＥＤ中の１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に保った。
抗ＨＥＲ−３抗体Ｕ１−５９を用いた。

【0045】

<細胞増殖アッセイ>
細胞を９６穴プレートに播いて、複数回用量のＵ１−５９に７２時間曝露した。細胞増殖を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｙ，ＭＤ，ＵＳＡ）により調べた。

【0046】

<クローン原性アッセイ>
規定数の細胞を、６穴の組織培養プレートの各ウェル中に播いた。細胞が付着する時間（６時間）を与えた後、Ｕ１−５９またはビヒクルコントロール（ＰＢＳ）を規定濃度で加えた。４時間後に、プレートを、２、４、６、８Ｇｙの照射量で照射した。播いてから１０〜１４日後、コロニーをクリスタルバイオレットで染色して、少なくとも５０細胞を含むコロニーの数を判定し、生存率を計算した。Ｕ１−５９単独により産生される細胞毒性に標準化後、生存曲線を作成した。示されるデータは、少なくとも３つの非依存性実験による平均±ＳＤである。

【0047】

<細胞周期の分析>
細胞をＵ１−５９（２０μｇ／ｍｌ）とともに４８時間インキュベートして、その後、６Ｇｙの放射線を照射した。２４時間後、細胞をトリプシン処理してＰＢＳで洗浄し、９０％エタノールに固定して４℃で一晩保管した。遠心分離によりエタノール除去後、細胞をＰＩ染色バッファー（５０μｇ／ｍｌ ＰＩ、１００μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で染色した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターによりソーティングした（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ヒストグラム解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）で行なった。

【0048】

<アポトーシス>
アネキシンＶ／ＰＩキットを用いてアポトーシスを検出した。処理に続いて、１００μｌの染色バッファー中に１×１０^５細胞を含む細胞懸濁液を、５μｌのアネキシンＶおよびＰＩとともにインキュベートした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）により細胞をソーティングした。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで集団解析を行なった。

【0049】

<イムノブロッティング分析>
処理に続いて、バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール、２．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよびアプロチニン）で細胞を溶解した。標準的なブラッドフォード吸光度分析を用いてタンパク質を定量化した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。その後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移して、適切な一次抗体とのインキュベーションにより分析した。ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体とのインキュベーションおよびＥＣＬ化学発光検出システムにより、タンパク質を検出した。ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪプログラムを用いてウェスタンのバンドの濃度測定をした。本試験で用いた抗体は以下であった：ＨＥＲ３、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。ｐ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＭＡＰＫは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）より取得し、α−チューブリンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より取得した。

【0050】

<免疫蛍光アッセイ>
およそ２×１０^３細胞を、４穴のガラスチャンバースライド（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）に播いた。４８時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、室温で１５分間、２％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を氷冷１００％メタノール中で１０分間、−２０℃でインキュベートして、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００溶液を含むＰＢＳ中、５％の正常血清で、室温で１時間ブロッキングして、ｐ−ＨＥＲ３またはλ−Ｈ２ＡＸ抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、ＦＩＴＣがコンジュゲートされた適切な二次抗体とともに２時間インキュベートした。ＰｒｏＬｏｎｇ ｇｏｌｄ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドをマウントした。共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡により写真を取り込んだ。

【0051】

<マウス異種移植片モデル>
無胸腺ヌードマウス（４〜６週齢；雄）を、ハーランラボラトリーズ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から取得した。動物の全手順および維持は、ウィスコンシン大学の施設ガイドラインに従って行なった。０日目に、マウスの背横腹に左右両側に細胞を注入した（２×１０６細胞）。腫瘍が想定量に達した時点で、マウスを、１）ＩｇＧ、２）Ｕ１−５９、３）放射線照射、または、４）組み合わせで、単回量または分割量で処理した。デジタルキャリパーにより測定して、式（π）／６×（大直径）×（小直径）により計算した。

【0052】

<免疫組織化学>
異種移植片腫瘍を中性ホルマリン中に固定して、パラフィン中に包埋した。
免疫組織化学染色を、ＰＣＮＡ、ｐ−ＭＡＰＫ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−Ｓ６およびγ−Ｈ２ＡＸについて行なった。要するに、検体を脱パラフィンして通常どおりに再水和して、続いて、ウォーターバス中で、９８℃で１５分間、シトレートバッファーによりアンチジーン修復して、３％過酸化水素中で１０分間インキュベーションして、３％ＢＳＡブロッキングを３０分間行なった。染色は以下のとおりに行なった：推奨される抗体希釈剤中に希釈した一次抗体中で、４℃で一晩インキュベーションして、ビオチン化二次抗体中で室温で３０分間インキュベーションして、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｃｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてペルオキシダーゼを視覚化して、ヘマトキシリン中で対比染色して、通常どおりに乾燥および洗浄して、カバーガラスをマウントした。

【0053】

<統計解析>
異種移植片腫瘍増殖をグラフ化して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて解析した。

【0054】

（結果）
ＨＥＲ３は様々な固形腫瘍細胞株で発現される。
ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）は、ＨＥＲファミリーにとって重要な二量体化パートナーであり、発がんシグナリングパスウェイを活性化する。多くの固形腫瘍におけるその過剰発現は、予後不良につながっている。図１Ａにおいて、我々は、ＨＥＲ３およびｐ−ＨＥＲ３の両方の発現について、非小細胞肺がん（Ｈ２２６、Ｈ２９２、Ｈ３５８、Ｈ５２０およびＡ５４９）、結腸直腸がん（Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８、ＬＳ１８０、ＬｏｖｏおよびＨＣＴ１１６）および頭頸部扁平細胞がん（ＳＣＣ１、ＳＣＣ６、ＳＣＣ１１Ａ、ＳＣＣ３８およびＳＣＣ１４８３）由来の１５細胞株を特徴づけた。ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株の両方が活性化ＨＥＲ３を含み、ＨＥＲ３が、それらの腫瘍形成表現型を亢進し得ることを示す。

【0055】

Ｕ１−５９は、ＨＥＲ３の基礎活性および放射線照射により誘導されるＨＥＲ３の活性化を阻害することができる。
ＨＥＲ３は、内因性チロシンキナーゼ活性を欠く。しかしながら、ヘレグリン（ニューレグリン−１）などの多様なリガンドに結合する際に、ＨＥＲ３は、他のＨＥＲファミリーメンバー受容体とヘテロ二量体を形成して、細胞の増殖および生存に強く影響を与える様々なシグナリングパスウェイの活性化を開始することができる。Ｕ１−５９は、結合してＨＥＲ３発がんシグナリングパスウェイを不活性化する、完全にヒト化されたモノクローナル抗体である。図１Ｂでは、我々は、様々なＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株を上昇量のＵ１−５９で処理すると、ＨＥＲ３およびＡＫＴの両方の活性化をうまく阻害することができることを示す（図１Ｂ）。加えて、イムノブロッティングおよび免疫蛍光分析を用いて、我々は、ＨＮＳＣＣ細胞株ＳＣＣ６およびＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２２６の放射線治療は、ＨＥＲ３の活性化型を増加させることを見いだした（図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｆ）。また、放射線治療後の一過的なＨＥＲ３活性化は、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞株の両方において、ＥＲＫおよびＡＫＴの両方の活性化の増加も伴った（図２Ａおよび図２Ｄ）。図２Ｂおよび図２Ｅでは、我々は、放射線照射により、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞株の両方において、放射線治療の２４時間後および４８時間後の両方で、ＨＥＲ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫの継続的な活性化をもたらすことができることを示す。我々は続いて、放射線治療の前に、Ｕ１−５９で２４時間、ＳＣＣ６またはＨ２２６細胞株を事前にインキュベーションすると、放射線により誘導されるＨＥＲ３、ＥＲＫ、およびＡＫＴの活性化を防止することができることを示す（図２Ａ、図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｆ）。加えて、Ｕ１−５９は、放射線治療後２４時間および４８時間の両方で、ＨＥＲ３、ＥＲＫ、およびＡＫＴの活性化の継続的な阻害を導くことができた（図２Ｂおよび図２Ｅ）。まとめると、これらのデータは、放射線治療の前にＵ１−５９で細胞を事前にインキュベーションすると、放射線により誘導される細胞生存および増殖パスウェイの活性化を防止することができることを示唆する。

【0056】

Ｕ１−５９は、インビトロで、ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株を放射線増感化することができる。
図２では、我々は、Ｕ１−５９が、放射線により誘導されるＨＥＲ３の活性化および後に続く下流のエフェクターＥＲＫおよびＡＫＴを防止することができることを示し、したがって、我々は、Ｕ１−５９がＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株の両方の放射線感受性を高めることができると仮説を立てた。第一に、我々は図３Ａおよび図３Ｆにおいて、Ｕ１−５９が、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞株の両方の増殖を用量依存的な様式で阻害することができることを示す。放射線と組み合わせたＵ１−５９のインビトロでの効果を評価するために、我々は、クローン原性分析を「材料および方法」に記載のとおりに行なった。我々は、Ｕ１−５９で４時間、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞の両方を事前インキュベートして、続いて、指示照射量で放射線を細胞に当てた。図３Ｂおよび図３Ｇに示すように、Ｕ１−５９は、放射線曲線の傾斜を増大させ、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞の両方に対する、放射線に応じたＵ１−５９の増感効果を示した。コントロール曲線は、Ｕ１−５９処理無しで放射線に曝された。

【0057】

Ｕ１−５９は、インビトロで、放射線治療と組み合わせて、細胞周期の停止およびアポトーシスを促進することができる。
我々はさらに、Ｕ１−５９はまた、ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株の、放射線により誘導される細胞周期の停止およびアポトーシスも亢進させ得ると仮説を立てた。これを調べるために、我々は、ＳＣＣ６およびＨ２２６細胞の両方をＵ１−５９で４８時間事前インキュベートして、続いて、６Ｇｙの放射線に曝した。放射線を照射して２４時間後に、我々は、細胞周期の段階分布およびアポトーシスのレベルをＰＩおよびアネキシンＶ染色により分析した。図３Ｃおよび図３Ｈに示すように、コントロール細胞と比較して、Ｕ１−５９で事前に処理した細胞はＧ１期停止を示し、一方で、放射線により処理した細胞はＧ２期停止を示した。我々は、いずれかの処理でＳ期の減少を観測する。Ｇ１期の細胞は放射線治療により感受性であり、一方でＳ期の細胞はより抵抗性であることが良く知られている。したがって我々は、Ｕ１−５９とともに事前インキュベートして放射線処理した細胞において、アポトーシスが実際に亢進されることを、アネキシンＶ染色を介して示し（図３Ｄおよび図３Ｉ）、これは、Ｕ１−５９により誘導されるＧ１期停止が、ＳＣＣ６およびＨ２２６の両方の放射線感受性を促進した可能性があることを示唆する。加えて我々はさらに、放射線照射の前にＵ１−５９で事前に処理されたＳＣＣ６およびＨ２２６細胞での、ＤＮＡ二本鎖切断レベルの亢進を、γ−Η２ΑΧ染色を介して示す（図３Ｅおよび図３Ｊ）。概して、これらのデータは、放射線と組み合わせたＵ１−５９の亢進した抗腫瘍効果を示す。

【0058】

放射線照射と組み合わせたＵ１−５９は、ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣマウス腫瘍異種移植片において、抗腫瘍効果を有することができる。
Ｕ１−５９と組み合わせた放射線療法の有効性をさらに評価するために、我々は、ＳＣＣ６、ＳＣＣ１４８３およびＨ２２６細胞株を無胸腺マウスに接種した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ^３に達した時点で、腫瘍を単一線量および分割線量の両方の放射線照射に振り分けた。単一線量治療群では、異種移植片マウスは、ＩｇＧ、Ｕ１−５９（８ｍｇ／ｋｇ）、放射線（ＸＲＴ１６ＧｙまたはＸＲＴ１０Ｇｙ）または両方の組み合わせが与えられた（図４Ａ）。分割線量治療群では、異種移植片マウスは、ＩｇＧ、Ｕ１−５９（１００μｇ／マウス）、放射線（指示照射量で１週間に２回）、または組み合わせが与えられた（図４Ｂ）。合計３つの異種移植片モデルは、単一線量で治療されたマウスまたはＩｇＧコントロールで治療されたマウスと比較して、単一線量または分割線量の放射線照射のいずれかとＵ１−５９を組み合わせて治療した両方の場合に、腫瘍体積の著しい減少を示した。したがって、Ｕ１−５９および単一線量または分割線量の放射線照射のいずれかで治療した異種移植片の両方とも、カプランマイヤー生存曲線分析を介して表されるように、明らかな延命効果を示す。

【0059】

Ｕ１−５９が、インビボで、ＨＥＲ３の活性化を効率的に阻害することができることを検証するために、我々は、各治療群由来の様々な腫瘍からタンパク質を分離して、ＨＥＲ３の全ておよび活性化型の両方についてウエスタンブロット分析を行なった。図５Ａでは、我々は、Ｕ１−５９単独、または、単一線量の放射線と組み合わせたＵ１−５９で治療したマウスから分離した腫瘍は、ＨＥＲ３活性化レベルがより低いことを示す。ＳＣＣ１４８３およびＨ２２６異種移植片モデルでは、Ｕ１−５９で治療された腫瘍もまた、より少量のＨＥＲ３タンパク質を含み（図５Ａ）、それは、インビトロでＵ１−５９処理されたこれらの細胞株においては見られないものであった。加えて、図５Ａでの各異種移植片モデルから分離された２つの腫瘍のうち少なくとも１つは、単一線量の放射線照射に対して明らかなＨＥＲ３活性化を示し、それはＵ１−５９で治療された腫瘍では阻止された。図５Ｂでは、我々はさらに、分割線量の放射線と組み合わせてＵ１−５９で治療された腫瘍もまた、活性化レベルおよび全レベルが減少したＨＥＲ３を含み；分割線量の放射線によるＨＥＲ３活性化もまた同様に、Ｕ１−５９により阻害されたことを示す。まとめると、単一線量または分割線量の放射線照射のいずれかと組み合わせたＵ１−５９で治療した異種移植片腫瘍の両方とも、コントロールまたはいずれかの治療単独と比較して、腫瘍体積が著しく減少して明らかな増殖遅延を示し、これは、ＨＥＲ３発現の、活性化レベルおよびトータルレベルの両喪失が、ＨＮＳＣＣおよびＮＳＣＬＣ腫瘍を放射線増感化し得ることを示唆する。

【0060】

放射線照射と組み合わせたＵ１−５９は、インビボにおいて、細胞生存シグナルの活性化を防止してＤＮＡ損傷を亢進させることができる。
放射線治療と組み合わせたＵ１−５９の増殖阻害効果をさらに分析するために、我々は、腫瘍治療されたＳＣＣ６におけるＥＲＫ、ＡＫＴ、Ｓ６キナーゼ、およびγ−Ｈ２ＡＸの活性化を、免疫組織化学により分析した（図６）。我々は、Ｕ１−５９および単一線量の放射線の両方で治療したＳＣＣ６細胞は、下流エフェクター分子ＥＲＫ、ＡＫＴ、およびＳ６キナーゼの活性化レベルを、より低くすることができることを示す。加えて、Ｕ１−５９で治療された腫瘍は、ＰＣＮＡ陽性細胞のレベルの減少を示した。最終的に、Ｕ１−５９および放射線の両方で治療したＳＣＣ６腫瘍において、γ−Ｈ２ＡＸのレベルの増加が見られた。概して、これらのデータは、放射線照射と組み合わせたＵ１−５９は、ＤＮＡ損傷を亢進することに加えて、細胞生存および増殖パスウェイを効率的に阻害することができることを示す。これらのデータは、インビボにおける、放射線治療と組み合わせたＵ１−５９の抗腫瘍効果の亢進に関する機構的証拠を提供する。

【0061】

これらの実験の結果は、単一線量または分割線量の放射線を用いた試験において、Ｕ１−５９と放射線の組み合わせは、腫瘍増殖に対して強い影響を与えたことを示す。腫瘍分析は、放射線治療がＨＥＲ３をインビボで活性化し、そして、Ｕ１−５９がこの活性化を抑止することができることを示した。まとめると、インビトロおよびインビボでの我々の知見は、放射線と組み合わせたＵ１−５９は、細胞周期の進行を遅延させ、アポトーシスが増加して、そしてＤＮＡ損傷が増加することにより、細胞および腫瘍の増殖に影響を与えることを示す。これらの知見は、ＨＥＲ３が、放射線療法に応じて重要な役割を果たし得て、それの活性の阻害は、ヒト腫瘍において強力な治療効果となり得ることを示す。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]