特許 6207708 自動培養装置、及び細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6207708

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】自動培養装置、及び細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20170925BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-204128(P2016-204128)

(22)【出願日】2016年10月18日

(62)【分割の表示】特願2014-532660(P2014-532660)の分割

【原出願日】2012年8月31日

(65)【公開番号】特開2017-6148(P2017-6148A)

(43)【公開日】2017年1月12日

【審査請求日】2016年10月18日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、国立研究開発法人 科学技術振興機構、内閣府最先端研究開発支援プログラムの研究課題「再生医療産業化へ向けたシステムインテグレーション−臓器ファクトリーの創生−」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000005108

【氏名又は名称】株式会社日立製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】591173198

【氏名又は名称】学校法人東京女子医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000350

【氏名又は名称】ポレール特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】宮崎 泰三

(72)【発明者】

【氏名】菅 和俊

(72)【発明者】

【氏名】周 広斌

(72)【発明者】

【氏名】清水 達也

(72)【発明者】

【氏名】岡野 光夫

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０２０４５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０７８７７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−９２２１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／００１００２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０５２７１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−７４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平２−１９０８１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２８５７１０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

平面状の培養面を有する培養容器を使用する自動培養装置であって、
複数の前記培養容器を、前記培養面に垂直な高さ方向において、間隔をおいて保持する複数段の培養容器保持棚と、
前記培養容器保持棚に設けられ、該棚の姿勢や振動を検知するセンサと、
前記培養容器保持棚において少なくとも３つの支持点に連結された、前記培養容器保持棚を略水平状態と傾斜状態の何れかに変更可能な駆動系と、
前記センサの信号に基づき、前記培養容器保持棚の略水平状態を維持するよう前記駆動系を制御する統括制御部と、
を有することを特徴とする自動培養装置。

【請求項2】

請求項１において、
前記センサは三軸加速度センサであることを特徴とする自動培養装置。

【請求項3】

請求項１において、
前記培養容器保持棚は、平面形状が矩形であり、
前記培養容器保持棚において３つの前記支持点に連結された前記駆動系を有し、
２点の前記支持点は、前記矩形の第１の辺の両端に位置し、
他の１点の前記支持点は、前記第１の辺に対向する第２の辺に位置することを特徴とする自動培養装置。

【請求項4】

請求項３において、
前記他の１点の前記支持点は、前記第２の辺の中央付近に位置することを特徴とする自動培養装置。

【請求項5】

請求項３において、
前記センサが、前記第１の辺または前記第２の辺の中央付近に位置することを特徴とする自動培養装置。

【請求項6】

請求項１において、
前記支持点は、前記培養容器保持棚の外側に位置し、
前記支持点において、関節機構及びアクチュエータを介して前記複数段の培養容器保持棚の各段に接続されたプッシュロッドが設けられることを特徴とする自動培養装置。

【請求項7】

請求項１において、
前記培養容器保持棚に、ステージ観察手段が設けられており、
該ステージ観察手段は、前記複数段の培養容器保持棚に保持された前記培養容器のそれぞれを観察可能に構成されることを特徴とする自動培養装置。

【請求項8】

自動培養装置を使用した細胞培養方法であって、
前記自動培養装置は、
平面状の培養面を有する複数の培養容器を、前記培養面に垂直な高さ方向において、間隔をおいて保持する複数段の培養容器保持棚と、
前記培養容器保持棚において少なくとも３つの支持点に連結された、前記培養容器保持棚を略水平状態と傾斜状態の何れかに変更可能な駆動系と、
前記培養容器保持棚に設けられるセンサと、
統括制御部と、を有し、
前記培養容器に細胞懸濁液を注入する工程と、
前記駆動系により、前記培養容器保持棚の姿勢を略水平状態と傾斜状態とに変更することで前記培養容器内の細胞懸濁液をかきまぜる工程と、
細胞懸濁液の播種完了時から細胞静着が完了するまでの期間、前記統括制御部により、前記センサの信号に基づき前記駆動系を制御して、各前記培養容器保持棚を略水平状態に維持する工程と、を含むことを特徴とする細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、接着性の細胞培養を自動で行なう自動培養装置及び自動培養方法に係り、特に、細胞数を増やすための継代操作を行う大量継代培養に好適な自動培養装置に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景技術として、培養容器の振動や傾斜に関しては、特許文献１、特許文献２、特許文献３に記載の例などがある。特許文献１では培養棚の振動なくすため、搬送部を構造的に分離することで振動を低減することが開示されている。特許文献２、特許文献３では、形容容器を傾けることが開示されている。また、庫内温度分布の調整や換気に関しては、特許文献４に記載の例がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００２-７８４７７号公報

【特許文献2】特開２００９-２７９７３号公報

【特許文献3】特開２００３-２３５５４１号公報

【特許文献4】特開平８-３２２５５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

大量継代培養においては、これまで大きな培養容器での培養は行われておらず、高々３０センチメートル程度の大きさの培養容器がこれまでの大きな培養容器といえる。しかし、これでは一度に大量の細胞培養には困難であり、同じ培養操作を繰り返し何回も行う必要があった。

【0005】

本願の発明者は、大きな培養容器を用いて、一度に大量の数の細胞を培養できる自動培養装置を提供することについて検討を重ねてきた。大きな空間での接着性細胞の培養においては、細胞増殖の環境を維持することが重要である。このため、必要な場合には培養容器を傾け、揺動させることができ、かつ培養時は水平平置き状態を維持することが必要である。すなわち、自動培養装置では、培地の排出、注入で容器を傾けたり、均一な播種のため、容器を揺動させたりする一連の操作が必要である。大きな培養容器では、このような一連の操作を行い得ると共に、培養時には培養容器を水平平置き状態に維持できるということが、特に重要な課題となる。

【0006】

さらに、大きな培養容器では、細胞が細胞容器に静着するまでの期間に培養容器が振動を受けると、振動の節部分に細胞が集中し、培養容器の広さを有効に活用できない可能性がある。そのため、細胞播種時から細胞静着までの期間、機械振動を少なくする、ということも重要な課題である。

【0007】

上記特許文献１〜４には、これらの課題や解決策についての開示はない。

【0008】

本発明の主たる目的は、上記の課題を解決し、培養容器の姿勢を制御し、水平平置き時に精度良く水平を保つことのできる自動培養装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の代表的なものを示すと次の通りである。
平面状の培養面を有する培養容器を使用する自動培養装置であって、
複数の前記培養容器を、前記培養面に垂直な高さ方向において、間隔を置いて保持する複数段の培養容器保持棚を有し、
前記各培養容器保持棚は、培養中に前記各培養容器を保持するものであり、
前記各培養容器保持棚毎に設けられ、該棚の姿勢や振動を検知するセンサと、
前記センサの信号により、前記各培養容器保持棚の姿勢を水平状態と傾斜状態の何れかに変更可能であり、細胞の培養中は前記各培養容器保持棚の水平を維持する駆動系とを備えている
ことを特徴とする自動培養装置。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、培養容器を保持する培養容器保持棚に棚の姿勢や振動を検知するセンサを設け、棚板の姿勢や運動を把握し、傾きを検知した場合、その信号により水平に制御することで、水平平置き時に精度良く水平を保つ効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の第一の実施例に係る、大量継代培養装置の構成を示す正面図である。

【図2】第一の実施例に係る恒温培養室の斜視図である。

【図3】第一の実施例に係る、第二ステージ培養機構の一構成例を示す斜視図である。

【図4】第一の実施例に係る、関節機構の一例を示す図である。

【図5】培養中に水平を維持する必要性を示す図である。

【図6】傾斜角センサの取り付け位置に関する説明図である。

【図7A】本発明における、傾斜角センサの「中央配置」の具体的な例を説明する図である。

【図7B】本発明における、傾斜角センサの「中央配置」の具体的な例を説明する図である。

【図7C】本発明における、傾斜角センサの「中央配置」の具体的な例を説明する図である。

【図8】第一の実施例に係る、統括制御部の構成例を示すブロック図である。

【図9】恒温培養室の温度安定化の一構成例を示す図である。

【図10A】第一の実施例に係る、統括制御部による細胞播種時における第二ステージ培養機構の制御動作の一例を示すフローチャートである。

【図10B】第一の実施例に係る、統括制御部による細胞播種時における第二ステージ培養機構の制御動作の他の例を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の代表的な実施例によれば、平面状の培養面を有する培養容器を用いる自動培養装置において、培養容器を保持する棚と、該棚の姿勢や振動を検知する傾斜角センサと、前記傾斜角センサの信号により棚の姿勢を変える駆動系とを有する。傾斜センサは、培養容器棚の概ね中央に配置される。

【0013】

培養容器を保持する培養容器保持棚に加速度センサを設けることにより、棚板の姿勢や運動を把握し、傾きを検知するとその信号により、水平に制御することで、水平平置き時に精度良く水平を保つ効果がある。さらに、棚の姿勢や振動を検知するセンサは培養容器棚の外縁の概ね中央に配置されるようにすることで、正しく培養容器の姿勢を検出でき、培養容器の水平安定に効果がある。

【0014】

さらに、実施例の他の特徴として、自動培養装置は、細胞の静着を判断する静着状態判断部を有し、前記自動培養装置は細胞懸濁液の播種完了時から細胞静着が完了するまでの期間の振動発生動作を抑制する。細胞の静着を判断する静着状態判断部の情報に基づき，細胞懸濁液の播種完了時から細胞静着が完了するまでの期間は、振動発生動作を抑制することにより、この間は静止することができ、静着まで機械振動を低減できる効果がある。

【実施例1】

【0015】

以下、本発明の自動培養装置の第一の実施例を、図面を用いて説明する。
図１は、本実施例の大量継代培養装置の構成を示す正面図である。図２は、図１の大量継代培養装置の主要部の斜視図である。大量継代培養装置１は、設置台７３の上に載置された恒温培養室１０と、設置台７３の下の空間に配置された各種の機器類とを有する。図１では、図２に示した恒温培養室１０の前面のメイン扉７１、内側扉７２の図示を省略している。一方、図２では、図１において設置台７３の下の空間に配置されている各種の機器類の図示を省略している。

【0016】

恒温培養室１０は、その内部に、第一ステージ培養容器収納空間部２０と、第二ステージ培養容器収納空間部３０とを有し、これらの空間が、培養に好適な一定の温度・湿度・ガス濃度に保持される。１１は空気流路、１２は機構系支持手段、１３はヒータである。培養に好適な温度は、通常は外気温より高めの３７℃近辺に設定される。ヒータ１３は通電することにより発熱し、通電および通電中止により恒温培養室１０内の温度を調整する。空気流路１１は、恒温培養室１０の内壁や機構系支持手段１２により構成され、ヒータ１３により昇温された空気の通り道となる。本実施例では、機構系支持手段１２は効率的に昇温された空気を恒温培養室１０内に供給するために、複数個の貫通穴を有する構造部材によって構成される。

【0017】

第一ステージ培養容器収納空間部２０には、平面状の培養面を有する第一ステージ培養容器２１が収納される。第一ステージ培養容器２１は、奥行き方向に、複数個収納される場合もある。２２は第一ステージ培養容器２１に設けられた傾斜角センサ、２３は第一ステージ培養機構である。また、第二ステージ培養容器収納空間部３０には、平面状の培養面を有する第二ステージ培養容器３１（３１ａ〜３１ｎ）が、上下すなわち培養面に垂直な方向に複数段収納される。図１の例では５段の第二ステージ培養容器３１が収納されている。３２（３２ａ〜３２ｎ）は、第二ステージ培養容器の各々に１個ずつ設置された傾斜角センサ、３３は複数段の第二ステージ培養容器を駆動する第二ステージ培養機構である。

【0018】

傾斜角センサは、棚の姿勢や振動を検知するものであり、水銀スイッチ、三軸加速度センサなど様々なものが利用可能である。なお、傾斜角センサは第二ステージ培養容器の各々に複数個設けても良いが、高価なので、第二ステージ培養容器の各々に１個ずつ傾斜角センサを、所定の位置に設置することで、装置全体のコストの上昇を抑えつつ、各段の第二ステージ培養容器の姿勢を正確に制御できる。

【0019】

第一ステージ培養容器２１と第二ステージ培養容器３１は、細胞の導入後は容器を開放しないことが特徴となっている。気相の導入は外界の菌類を通さないフィルタを介して行なわれる。以降、このような培養方法を容器密閉型と称する。また、第一ステージ培養容器２１と各第二ステージ培養容器３１（３１ａ〜３１ｎ）の底板は、各々、大面積平板形状としている。平板を採用したのは、培養中の細胞観察を可能とするためである。

【0020】

図１における傾斜角センサ２２および３２(以降、傾斜角３２を以って代表とする)は、現在の培養容器がどれだけ傾斜しているかを検出する。第一ステージ培養機構２３と第二ステージ培養機構３３は、前記傾斜角センサ３２の情報に基づき、第一ステージ培養容器２１と第二ステージ培養容器３１の水平を維持するように動作する。水平を維持するための機構については後述する。

【0021】

大量継代培養装置１の、設置台７３よりも下側の空間には、第一ステージ培養容器及び第二ステージ培養容器に、培地や酵素、洗浄液などを供給する機能を有する各種の機器類が配置される。４１a、４１bは冷蔵庫であり、培地や酵素、洗浄液などを冷蔵保管する。４２は送液機構であり、前記培地や酵素、洗浄液などを第一ステージ培養容器２１や第二ステージ培養容器３１に送液チューブを介して供給する。送液機構４２はチューブポンプ、弁機構、培地加温手段（いずれも図示せず）などにより構成される。４３は気相調整手段であり、湿度、二酸化炭素濃度などを調整した空気を第一ステージ培養容器２１や第二ステージ培養容器３１に送気チューブを介して供給する。４４は廃液タンクであり、使用後の培地や洗浄液などを送液チューブを介して受け入れ保管する。送液チューブや送気チューブは軟質のシリコンやファーメド、C-Flexチューブが用いられる。なお、送液チューブや送気チューブは図１において図示していない。６０は、大量継代培養装置１の全体を制御する統括制御部である。統括制御部６０と図１内の各コンポーネントとは制御ネットワークや無線LANなど（図示せず）により接続される。

【0022】

４５は第一ステージ観察手段、４６は、第二ステージ観察手段である。これらは細胞の増殖状態を検出し、培養の進行度を判断するための情報を統括制御部６０に送る。第一ステージ観察手段４５や第二ステージ観察手段４６には、例えば位相差顕微鏡やCCDカメラによるマイクロスコープといった光学画像を用いる方法や、電気抵抗変化などによる電気的な方法など、が利用可能である。

【0023】

５１は外気導入ファン、５２は内気撹拌ファン、５３は外気導入口である。これらは恒温培養室１０内の温度を調整するために使用される。本実施例では、培養容器の周囲に空気が効率よく循環する様に、第一ステージ培養容器収納空間部２０と第二ステージ培養容器収納空間部３０との間の通路上部に内気攪拌ファンが配置され、側壁と第二ステージ培養容器収納空間部３０との間の通路状に外気導入ファン５１が配置されている。個々の構成における詳細な動作については後述する。

【0024】

また、機構系支持手段１２を複数個の貫通穴を有する構造部材によって構成することで、昇温された空気を恒温培養室１０内に供給できることは上述したが、上記の外気導入ファン５１、内気撹拌ファン５２、外気導入口５３の動作と相まって恒温培養室内の空気の循環が促進され、さらに効率的に培養容器周辺の温度調整が可能となる。

【0025】

図２の斜視図に示したように、恒温培養室１０は内部温度の保持と培養容器のセッティングの容易さから、前面のメイン扉７１、内側扉７２を開放できる形状としている。メイン扉７１は断熱効果の高い厚板材で作成され、内側扉７２は内部の目視が可能なようにポリプロピレンやアクリルなどの透明樹脂で作成される。内側扉７２を設けることで、恒温培養室１０内の急激な温度低下などを起こさずに機械動作を目視確認することができる。

【0026】

また、恒温培養室１０は設置台７３により廃液タンク４４より高所に配置する。この配置では、送液チューブ内にフィルタにより無菌確保した大気を導入することにより、廃液の自重を用いて移送することが可能となる。このため廃液用ポンプを省略できるという利点がある。

【0027】

図３は、第二ステージ培養機構３３の一構成例の詳細を示す図である。第二ステージ培養機構３３は、複数の培養容器保持棚１２１（１２１ａ〜１２１ｎ）、三個のアクチュエータ１２２a、１２２b、１２２c、三本のプッシュロッド１２３a、１２３b、１２３cを有する。各培養容器保持棚１２１（１２１ａ〜１２１ｎ）は、各々、第二ステージ培養容器３１（３１ａ〜３１ｎ）を固定し、一体で動作する。本図では、第二ステージ培養容器３１が５層重なった配置を例示している。アクチュエータ１２２a、１２２b、１２２cはそれぞれプッシュロッド１２３a、１２３b、１２３cを鉛直方向に駆動させる。プッシュロッド１２３a、１２３b、１２３cにはそれぞれ支持腕１２４が培養容器の段数分取り付けられている。支持腕１２４の一方は、プッシュロッド１２３a、１２３b、１２３cに固定され、アクチュエータ１２２a、１２２b、１２２cの上下動距離と同じ距離だけ上下動する。なお、支持腕の固定位置は上下に微調整可能である。本図では、複数の培養容器保持棚１２１（１２１ａ〜１２１ｎ）のそれぞれに傾斜角センサ３２（３２ａ〜３２ｎ）を有しているため、自動培養の開始前に前記傾斜角センサ３２の出力を用いて各培養容器保持棚１２１の水平位置を手動で調整することが可能である。なお、支持腕固定位置を自動調整するための小型アクチュエータを別途装備することも可能である。

【0028】

支持腕１２４の他方端は、関節機構を介して培養容器保持棚１２１（１２１ａ〜１２１ｎ）に固定される。図４に、関節機構の一例を示す。関節機構は培養容器保持棚１２１の支持部分（１２３a、１２３b、１２３c）の傾きや傾きによるズレを吸収するために設けられたものであり、支持腕１２４の他方端に連結されたリンク機構１２２１、１２２２、球面ジョイント１２２３、及び培養容器保持棚１２１の下面に設けられたスライド機構１２２４、などの組み合わせによって実現される。

【0029】

１２５は、各培養容器保持棚１２１の各々に設けられたカメラ保持腕である。各カメラ保持腕１２５の先端には、第二ステージ観察手段４６としてのCCDカメラ(図示せず)および照明手段（図示せず）が取り付けられ、各第二ステージ培養容器３１（３１ａ〜３１ｎ）の観察を行なう。各培養容器保持棚１２１の外縁部１２１Ｅの上端面には、傾斜角センサ３２（３２ａ〜３２ｎ）が設置されている。すなわち、傾斜角センサ３２は、矩形状の培養容器３１（３１ａ〜３１ｎ）の平面内の中央には配置されておらず、矩形平面の辺（外縁部）の中央若しくはその近傍に取り付けられている。

【0030】

本発明の対象とする、大きな空間での接着性細胞の培養においては、細胞増殖の環境を維持することが重要である。
本発明による大量継代培養装置１の特徴は、培養中に培養容器保持棚の水平を維持する機能を有し、水平を検出するセンサ（傾斜角センサ）が培養容器保持棚の外縁部の中央若しくはその近傍に配置されること、及び、細胞静着フェイズにおいては機構系の動作を停止することである。これにより、接着性細胞の環境が維持される。

【0031】

まず、図５を用いて、培養中に培養容器の水平を維持する必要性について説明する。なお、第一ステージ培養容器２１と第二ステージ培養容器３１の水平維持機構は同様の構成であるので、面積の広い第二ステージ培養容器３１を例として以下説明する。

【0032】

図５の（ａ）において、１００は、第二ステージ培養容器３１内の細胞に栄養や各種増殖因子を提供する液体である培地である。培地は高価であるため、大量に細胞を培養する場合には出来るだけ少量にすることが求められる。また、培地を減らせば容器の厚さを減らすことができ、限られた空間体積における培養容器の段数を増やすことができるため、装置構成上も有利となる。本発明では、各培養容器の平面形状を大型化することにより、同じ接着面積を得るために必要な上下の培養容器の段数を減らし薄型とすることができ、一度に大量の数の細胞を培養できる自動培養装置を提供することが可能になる。例えば、従来、２０〜５０段必要であったものを、大面積でかつ薄型化し、５〜６段程度まで減らすことができる。

【0033】

すなわち、本発明では、絶対数としての細胞数を１０^９乗個まで培養する大きな培養容器を採用する。このとき、培養容器３１としては、平板の培養容器で、一辺が５０センチメートルを超えた、かつ、薄型の構造になる。

【0034】

この場合、平置きしたときに、少しでも水平（θ＝０）が出ていなければ、培地が偏ることになる。すなわち、図５の（ｂ）に示したように、第二ステージ培養容器３１がわずかでも傾斜すると、乾燥領域１０２が出現する。乾燥領域１０２では培地が細胞に行きわたらず、細胞が死滅する恐れが生じる。

【0035】

この傾向は薄型構造に伴い培地量が少なくなる程、また、容器面積が広いほど顕著である。このため、大面積平板構造の培養容器においては、水平を維持することが非常に重要であることがわかる。

【0036】

例えば、培地の深さを２ミリメートルとすると、長さ５０センチメートルの培養容器がθ＝０.１度傾くだけで、培地深さは０.８７ミリメートルずれることになり、培地の量が場所により異なってしまう。薄型構造のため、極端な場合、培地がない部分１０２が生じる。径が１００ミリメートル程度のディッシュであれば、０.２ミリメートル程度であり、これであれば問題にはならないが、長さが長い場合には問題になってくる。一方、平面形が大きな培養容器では、培地の排出、注入で容器を傾けたり、均一な播種のため、容器を揺動させる必要がある。このため、容器を揺動させた後、乾燥領域１０２が出現しないように、培養容器を水平に保つという課題が重要になる。

【0037】

本発明において、培養中に培養容器を水平に保持する機構に関しては、先に述べた通り、図３、図４に示したアクチュエータ（１２２a、１２２b、１２２c）を用いることができる。また、図３、図４に示した関節機構付きのアクチュエータは、水平維持以外に、容器の傾斜や容器に対しての周期的な揺動なども単一の機構で行なうことができるため、全体の機構系が単純となり、低価格化が期待できる。したがって、本実施例の機構は、大量継代培養装置の水平維持機構として好適である。

【0038】

次に、本発明における、傾斜角センサ３２の取り付け位置に関する概念を、図６で説明する。なお、簡単のためここでは培養容器保持棚を一本の梁と仮定して、二次元で説明する。１２２a、１２２bは第二ステージ培養容器３１を駆動するアクチュエータであり、各々、プッシュロッド１２３a、１２３b、１２３cに沿って上下に運動する。３２は傾斜角センサが概中央部に取り付けられた場合の予想配置（以降「中央配置」と記載）であり、３２０は傾斜角センサが中央部から外れて取り付けられた場合の予想配置（以降「端部配置」と記載）である。両端支持された第二ステージ培養容器３１には、培養容器の重量等により、その中央部が垂下する撓みが生じる。この場合、中央配置の傾斜角センサ３２では撓みによる傾斜の感度は低く、端部配置の傾斜角センサ３２０においては撓みによる傾斜の感度が大きい。また、撓みによる影響は容器が大面積になるほど大きくなる。すなわち、大量継代培養装置にあっては、中央配置の方が傾斜角検出に関してはノイズが少なく、正確な値に近いと考えられる。端部配置の場合、正確な傾斜角を検出するためには、撓みによる補正情報をあらかじめ記録しておいて、毎回補正をかける方法が考えられる。しかし、一般的に培養容器は使い捨てを前提として樹脂によって作成されることが多い。樹脂製容器は継続荷重によってクリープ現象が生じ、時間と共に撓みが変化する可能性がある。また、中央配置の傾斜角センサ３２はアクチュエータ１１１a、１１１bの双方から離れているため、アクチュエータ１１１a、１１１bの動作時の振動の影響を受けづらいという特徴も併せ持つ。

【0039】

一方、培養容器保持棚を一本の梁と仮定し、その中央部のみで１点支持することも考えられる。この場合、「中央配置」の傾斜角センサ３２では撓みによる傾斜の感度は低く、端部配置の傾斜角センサ３２０においては撓みによる傾斜の感度が大きい。

【0040】

以上より、大量継代培養装置においては、傾斜角センサ３２は、培養容器保持棚の中央配置を採用した方が有利となる。特に、培養容器保持棚の平面形状に置いて、その中央部に支持枠が有る場合には、この支持枠に傾斜角センサを設置すれば良い。

【0041】

ところで、各培養容器保持棚すなわち各培養容器は、例えば矩形状の平面形状を有し、培養容器の平面形状の少なくとも約半分の領域をテージ観察手段４６で観察可能に構成する必要がある。すなわち、CCDカメラ等の第二ステージ観察手段４６による観察の支障にならないようにするために、培養容器保持棚の支持位置は、培養容器保持棚の外縁付近に設置する必要がある。もし、培養容器保持棚をその中央部で支持すると支持部のプッシュロッド等が観察の障害になり適切ではない。従って、各培養容器保持棚に対応してテージ観察手段４６が設けられている場合には、培養容器保持棚は外縁付近のみで支持するのが望ましい。従って、図６の「中央配置」の概念をそのまま採用し、平面形状の中央に傾斜角センサ３２を設置することは望ましくない。

【0042】

これを解決するために、本発明では、傾斜角センサ３２を平面形状の「辺（外縁）の中央」に配置することに１つの特徴がある。

【0043】

図７（図７Ａ〜図７Ｃ）は、本発明における、傾斜角センサ３２の「培養容器保持棚の外縁の中央配置」の具体的な例を説明する図である。まず、図７Ａの例では、培養容器保持棚１２１が、３つのアクチュエータ１２２a、１２２b、１２２c（換言すると三本のプッシュロッド１２３a、１２３b、１２３c）で三点支持されている。なお、培養容器保持棚は、平面形状が矩形の中央部が打ち抜かれ、培養容器を保持するための外枠部のみを有する、全体として凹型の外形を有している。３つのアクチュエータ１２２a、１２２b、１２２cは、平面形状が矩形（短辺ａ、長辺ｂ）の培養容器保持棚１２１、換言すると、矩形の培養容器３１に面する二等辺三角形の各頂点に位置している。すなわち、矩形の一方の長辺の両端近傍に、２つのアクチュエータ１２２a、１２２bが位置し、矩形の他方の長辺の中央近傍に他のアクチュエータ１２２cが位置している。１２５はカメラ保持腕であり、その先端に第二ステージ観察手段４６が装着され、他端は回転軸１２６に固定されている。第二ステージ観察手段４６は、培養容器３１の上側若しくは下側から、培養容器３１の平面形状の少なくとも約半分の領域を観察可能に構成されている。培養容器保持棚を上記のように三点支持することで、培養容器保持棚を安定的に保持すると共に、第二ステージ観察手段の必要十分な観察領域を確保できる。

【0044】

一方、培養容器保持棚１２１の外縁部で、かつ、アクチュエータ１２２cに近接した位置に、１個の傾斜角センサ３２が設置されている。換言すると、矩形平面の一方の長辺（外縁部）ｂの中央若しくはその近傍で、かつ、１つの頂点のアクチュエータ（換言すると支持部分）付近に傾斜角センサ３２が設置されている。この位置は、三点支持の１つの頂点の近傍であるものの、矩形の培養容器保持棚１２１の長辺ｂの中央、すなわち、「辺（外縁）の中央」配置に相当し、撓みによる傾斜の感度が低い。また、１つのアクチュエータには近接しているものの、他の２つのアクチュエータからは離れており、「辺（外縁）の中央」配置に相当する。そのため、傾斜角センサに近いアクチュエータを駆動した後、残りのアクチュエータを駆動する等の工夫により、全体としては、アクチュエータの動作時の振動の影響を受けにくくすることができるという利点がある。

【0045】

なお、図７Ａに傾斜角センサ３２‘として示したように、傾斜角センサを、矩形の培養容器保持棚１２１の他方の長辺（外縁部）ｂの中央若しくはその近傍で、かつ、２つの頂点のアクチュエータ１２２a、１２２b（換言すると支持部分１２３a、１２３b）の中央若しくはその近傍に設置しても良い。この位置は、図６で述べた中央配置に相当し、保持棚の撓みによる傾斜の感度が低く、また、いずれのアクチュエータからも離れているため、アクチュエータの動作時の振動の影響も受けにくいという利点がある。傾斜角センサを２個設置する場合には、３２、３２‘の位置に設置するのが良い。

【0046】

次に、図７Ｂの例では、１２５はカメラ保持腕が軸１２６と共に、矩形の培養容器保持棚１２１の縁に沿って移動する構成になっている。この例でも、図７Ａの例と同様に、長辺（外縁部）ｂの中央若しくはその近傍に１個の傾斜角センサ３２、傾斜角センサ３２‘が設置されている。この例でも、図７Ａの例と同様な効果が得られる。

【0047】

図７Ａ、図７Ｂの三点支持の例に代えて、矩形の四隅近傍を支持する四点支持としても良く、その場合も、上記「辺（外縁）の中央」配置に相当する長辺（外縁部）ｂの中央若しくはその近傍に１個の傾斜角センサ３２を設置するのが良い。また、矩形は正方形であっても良く、この場合も、傾斜角センサ３２は、「辺（外縁）の中央」配置に相当する外縁部の中央若しくはその近傍に設置される。なお、プッシュロッドの数を４本よりも多くすることも可能であるが、構成が複雑となり、制御が難しくなる難点がある。

【0048】

次に、図７Ｃの例では、培養容器保持棚１２１の平面形状、換言すると各培養容器３１の平面形状が六角形であり、長辺（外縁部）の中央若しくはその近傍に１個の傾斜角センサ３２、傾斜角センサ３２‘が設置されている。この例でも、図７Ａ、図７Ｂの例と同様な効果が得られる。

【0049】

なお、培養容器保持棚の平面形状としては、円やその他の多角形等も考えられ、上記の趣旨に基づき１個の傾斜角センサを設置することが考えられる。しかし、大量継代培養装置１には、矩形（特に長方形）や六角形が適している。

【0050】

図８は、大量継代培養装置１における内部機器を制御するための統括制御部６０の構成例を示すブロック図である。
統括制御部６０は、データや指示を入力するための入力部６１、自動培養装置１０の各動作を制御するＣＰＵ６２、プログラムやパラメータ等を格納したり、一時的にデータや処理結果を格納したり、キャッシュ等の動作を行うための記憶手段やメモリ６３、ユーザーインタフェースとして機能する表示部６４、外部との通信を制御する通信制御部６５、傾斜角センサ３２等の入力をもとに各種アクチュエータ１２２を駆動して培養容器に対する播種タスクを実行する播種タスク制御部６６、大量継代培養装置内の環境保持のために滅菌処理、ヒータやファンの駆動、二酸化炭素の供給、水供給等の制御を行う環境保持装置６７、冷蔵庫内の環境を制御する冷蔵庫制御６８、傾斜角センサ３２等の入力をもとに各種アクチュエータ１２２を駆動して培養容器の培地交換のタスクを実行する培地交換タスク制御部６９、培養容器から細胞を取り出すタスクを実行する細胞取出タスク制御部７０等を備えている。播種タスク制御部６６、培地交換タスク制御部６９、及び、細胞取出タスク制御部７０は、各々、培養容器の水平姿勢保持機能を備え、正しく培養容器の姿勢を水平に安定して保持すると共に、静着状態判断部を備え、細胞静着までの機械振動を低減させる機能を有する。

【0051】

ところで、大量継代培養装置１の恒温培養室１０内は、容器密閉型の培養容器形態であるため、温度環境のみ培養増殖に必要な環境とすれば良い。湿度や気相の炭酸ガス濃度等については、密閉容器の中で確保される。このため、培養環境温度にするために、内部での発熱を外部に拡散させる、あるいは冷却により取り除くことで、温度を一定に保つことができる。

【0052】

図９において、第一ステージ培養機構２３や第二ステージ培養機構３３は各種アクチュエータのモータ等により駆動されるが、それに伴うブレーキの励磁や駆動モータの駆動に伴う発熱により温度上昇がある場合には、これらの温度上昇した空気はダクト３５や３６により、空気流路である下部の空間（空気通路）１１に集められる。この下部空間１１には、大量継代培養装置１の外から外気導入口５３、外気導入ファン５１、ダクト５４により冷気を導入する。この下部空間１１において内気撹拌ファン５２により空気を攪拌し温度を調整することで、恒温培養室１０内を目的とする一定の環境温度に保つ。下部空間１１には、図のように温度センサ１５を設け、温度をモニタするとともに、ヒータ１３の発熱量を一定温度になるように制御系にて制御する。

【0053】

つまり、大きな培養容器を採用することによって生ずる広い培養空間において、熱源（ヒータ１３）を恒温培養室１０の機構系支持手段のさらに下部に配置し、ブレーキの励磁や駆動モータの駆動により発生した熱は、空気ダクトによって養室本体下部の空間に導くことで、下部空間で温度交換がなされ、その上で温度センサによりヒータの調整が行われるため、全体の温度が安定化できる。

【0054】

次に、図１０Ａは、第一の実施例における細胞播種時の第二ステージ培養機構３３の統括制御部６０の動作（播種タスク制御部６６の動作）の一例を示すフローチャートである。なお、本フローチャートは第一ステージ培養機構２３においても全く同様に適用される。

【0055】

図１０Ａにおいて、統括制御部６０は、まず、第二ステージ培養機構３３により培養容器保持棚を傾け（Ｓ０１）、培養容器保持棚の各容器に細胞懸濁液を注入する（Ｓ０２）。細胞懸濁液の注入は、図１に示した送液機構４２および送気機構４３を制御することによって行なう。細胞懸濁液の注入後、第二ステージ培養機構３３がアクチュエータ１２２を協調して動作させることによって、培養容器内の細胞懸濁液を充分かきまぜ、細胞が容器内に均一になるようにする（Ｓ０３）。その後、統括制御部６０は、傾斜角センサ３２の情報に基づき、第二ステージ培養容器３１の水平を維持するように第二ステージ培養機構３３を制御する（Ｓ０４）。すなわち、統括制御部６０は、培養容器保持棚の水平姿勢保持部としての機能を備えている。傾斜角センサ３２から、培養容器保持棚の姿勢に関する正確な情報が得られるため、培養容器保持棚の姿勢が高い精度で水平に安定して保持される。その後、あらかじめ設定した細胞静着時間（例えば、３０分、あるいは、２時間等）だけタイマーをセットし（Ｓ０６）、第二ステージ培養機構３３や振動源となりうる機構系の動作を停止させるようにフラグをセットする（Ｓ０７）。これにより、ファン、アクチュエータ、送液機構等の機構系の動作は停止する。

【0056】

このように、振動源となりうる機構系の動作を停止させるのは、培養容器が振動を受けることによって細胞が容器内に不均一に播種されることを防止するためである。振動が培養容器に伝わると、振動モードに応じて大きく振動する腹部分と全く振動しない節部分とが培養容器底面に出現する。細胞が浮遊状態の場合、前記の節部分に細胞が集まる可能性があり、培養容器内で細胞密度の高い部分と低い部分とが混在する。細胞密度が高い部分では栄養分の供給不足、コンタクトインヒビジョンによる増殖の停止が起こり易く、また細胞密度が低い部分では、細胞外マトリクスの形成が進まず、やはり増殖が悪くなりやすい。

【0057】

機構系の動作の停止から一定時間経過後、細胞が培養容器底面に静着すれば、ある程度の振動では細胞は剥がれず、振動が細胞に与える影響は小さくなる。そのため、細胞静着時間の経過後（Ｓ０８）、フラグをリセットし機構系動作禁止状態を解除する（Ｓ０９）。

【0058】

統括制御部６０が細胞の静着を判断する静着状態判断部としての機能を有することで、前記自動培養装置は細胞懸濁液の播種完了時から細胞静着が完了するまでの期間は、振動発生動作を抑制することにより、この間は静止することができ、静着まで機械振動を低減できる効果がある。

【0059】

図１０Ｂは、第一の実施例における細胞播種時の第二ステージ培養機構３３の統括制御部６０動作（播種タスク制御部６６の動作）の他の例を示すフローチャートである。Ｓ１１〜Ｓ１５は、図１０ＡのＳ０１〜Ｓ０５と同じである。本実施例ではカメラによる細胞観察手段４６を備えているため、細胞が静着しているかどうかを、時間の代わりに、目視、または画像認識により判断できる。したがって、Ｓ０６に相当するステップを省略し、機構系の動作を停止させるようにフラグをセット（Ｓ１６）した後、細胞観察手段４６の出力結果に応じて、機構系動作禁止状態を継続または解除させることが可能である（Ｓ１７、Ｓ１８）。

【0060】

なお、図１０Ａ、図１０Ｂの播種タスク制御部６６の動作と同様な動作は、培地交換タスクや出荷時の細胞取出タスクにおいてもなされる。例えば、細胞取出タスクでは、出荷時に、まず、培養容器から古い培地を吸い出し（Ｓ２１）、酵素を注入し（Ｓ２２）、培養容器内の細胞懸濁液を充分かきまぜ（Ｓ２３）、傾斜角センサ３２の情報に基づき、培養容器の水平を維持するように第二ステージ培養機構３３を制御し（Ｓ２４）、所定時間放置し（Ｓ２５）、培養容器を傾け（Ｓ２６）、酵素を取り出し（Ｓ２７）、培養容器に新しい培地を入れ（Ｓ２８）、培養容器内の細胞懸濁液を充分かきまぜ（Ｓ２９）、傾斜角センサ３２の情報に基づき、培養容器の水平を維持するように第二ステージ培養機構３３を制御し（Ｓ３０）、その後培養容器を傾け（Ｓ３１）、細胞を取出す。この場合も、水平を維持する際には、傾斜角センサ３２から正確な情報が得られるため、培養容器保持棚の姿勢が高い精度で水平に安定して保持される。

【0061】

以上述べた通り、本実施例によれば、培養容器を保持する培養容器保持棚に傾斜角センサを設け、棚板の姿勢や運動を把握し、その出力信号により、培養容器保持棚の姿勢を水平に制御することで、水平平置き時に精度良く水平を保つ効果がある。また、傾斜角センサは培養容器の概ね中央に配置されるようにすることで、正しく培養容器の姿勢を検出でき、水平安定に効果がある。

【0062】

特に、培養容器を大面積でかつ薄型化とした場合に、顕著な効果がある。

【0063】

さらにまた、細胞の静着を判断する静着状態判断部を有し、前記自動培養装置は細胞懸濁液の播種完了時から細胞静着が完了するまでの期間は、振動発生動作を抑制することにより、静着までの機械振動を低減できる効果がある。

【符号の説明】

【0064】

１ 大量継代培養装置
１０ 恒温培養室
１１ 空気流路
１２ 機構系支持手段
１３ ヒータ
１５ 温度センサ
２１ 第一ステージ培養容器
２２ 傾斜角センサ
２３ 第一ステージ培養機構
３１ 第二ステージ培養容器
３２ 第二ステージ培養容器の傾斜角センサ
３３ 第二ステージ培養機構
３５ 第一ステージ機構高温気流ダクト
３６ 第二ステージ機構高温気流ダクト
４１a、４１b 冷蔵庫
４２ 送液機構
４３ 気相調整手段
４４ 廃液タンク
４５ 第一ステージ観察手段
４６ 第二ステージ観察手段
５１ 外気導入ファン
５２ 内気撹拌ファン
５３ 外気導入口
５４ 冷気ダクト
５５ ファン
６０ 統括制御部
７１ メイン扉
７２ 内側扉
７３ 設置台
１００ 培地
１０２ 乾燥領域
１１１a、１１１b アクチュエータ
１１２a 傾斜角センサの中央配置
１１２b 傾斜角センサの端部配置
１２１ 培養容器保持棚
１２２a、１２２b、１２２c アクチュエータ
１２３a、１２３b、１２３c プッシュロッド
１２４ 支持腕
１２５ カメラ保持腕
１２２１、１２２２ リンク機構
１２２３ 球面ジョイント
１２２４ スライド機構。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】