特許 6207745 生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6207745

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物

(51)【国際特許分類】

   A61L 24/00 20060101AFI20170925BHJP

   A61L 24/08 20060101ALI20170925BHJP

   A61L 31/14 20060101ALI20170925BHJP

   A61L 31/16 20060101ALI20170925BHJP

【ＦＩ】

   A61L24/00 240

   A61L24/08

   A61L31/14 300

   A61L31/16

【請求項の数】8

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-538741(P2016-538741)

(86)(22)【出願日】2014年12月12日

(65)【公表番号】特表2017-500113(P2017-500113A)

(43)【公表日】2017年1月5日

(86)【国際出願番号】KR2014012265

(87)【国際公開番号】WO2015088275

(87)【国際公開日】20150618

【審査請求日】2016年6月10日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0155722

(32)【優先日】2013年12月13日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2014-0089173

(32)【優先日】2014年7月15日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515129331

【氏名又は名称】ユタ−イナ ディーディーエス アンド アドバンスト セラピューティクス リサーチ センター

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(72)【発明者】

【氏名】リ・ウネ

(72)【発明者】

【氏名】メン・ジニ

(72)【発明者】

【氏名】キム・グンス

(72)【発明者】

【氏名】リ・ドンヘン

(72)【発明者】

【氏名】パク・ヨンファン

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０７１１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０６７６５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５１３６７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−３３／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

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(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ホルミル基が導入されて酸化された酸化グリコサミノグリカンを含む第１成分と、
（ｂ）２以上のアミノ基を有するポリアミンを含み、水溶液状態におけるｐＨが８．５乃至１１．０である第２成分と、
を含み、
前記酸化グリコサミノグリカンは、酸化ヒアルロン酸、酸化コンドロイチン硫酸、酸化コンドロイチン、酸化デルマタン硫酸、酸化ヘパラン硫酸、酸化ヘパリン及び酸化ケラタン硫酸からなる群から選択され、
前記ポリアミンは、ポリリジン、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、プロタミン及びＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）からなる群から選択されることを特徴とする生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項2】

前記酸化グリコサミノグリカンは、下記式によって計算した酸化度（％）が１０乃至９９．５％である請求項１に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項3】

前記第１成分は、２種類以上の酸化グリコサミノグリカンを含む請求項１に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項4】

前記２種類以上の酸化グリコサミノグリカンは、酸化ヒアルロン酸及び酸化コンドロイチン硫酸である請求項３に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項5】

前記酸化ヒアルロン酸の酸化度は、１０〜４０％であり、前記酸化コンドロイチン硫酸の酸化度は、１０〜５５％である請求項４に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項6】

前記ポリアミンは、ポリリジン、プロタミン及びＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）からなる群から選択される請求項１に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項7】

生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆及び止血からなる群から選択された医療用途を有する請求項１に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【請求項8】

アミン基を有する薬物をさらに含む請求項１に記載の生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホルミル基を有する酸化グリコサミノグリカンとポリアミンとを含む生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）及びシーラントは、手術時、組織を縫合又は組織に塗布するか、出血防止剤（止血）、体液と血液遮断剤などに使用するものであり、皮膚に接触するため、生体適合性が要求され、生体内で毒性と危害性があってはならず、生分解性であり、生体の治癒を邪魔してはいけない。

【0003】

現在、実用化されている医療用接着素材としては、シアノアクリレート系、フィブリングルー系、ゼラチングルー系、ポリウレタン系などがあり、米国のＣｌｏｓｕｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社は、Ｄｅｒｍａｂｏｎｄというオクチルシアノアクリレートの医療用組織接着剤を商品化し、１９９７年８月ヨーロッパ共同体の販売承認を得て、１９９８年米国ＦＤＡから承認を得た。しかし、シアノアクリレート系接着剤は、固化物の柔軟性が不足して硬いため、創傷治癒を妨害する場合があり、また、生体内で分解されにくいため、被包化され、異物になりやすいなどの問題がある。また、フィブリングルーは、接着力が非常に低いため、生成されたフィブリン塊が組織から離れてしまう場合があり、また、血液製剤であるため、ウイルス感染のおそれがあるなどの問題があった。

【0004】

前記医療用接着剤の他に、特許文献１には、凍結乾燥後、機械的に粉砕して製造されたアルデヒド化デキストラン粉末とε−ポリ−Ｌ−リジン粉末とを含む医療用２成分型接着剤（商品名：ＬＹＤＥＸ、ライデキス）が開示されている。前記２成分型接着剤は、粉末状の医療用接着剤という点に特徴があるが、ゲル分解時間が比較的長く、水分吸収力において満足する効果が得られないという問題がある。したがって、分解時間、接着力及び水分吸収力などにおいて、改善された特徴を有する新しい医療用接着剤に対する要求が高まっている。

【0005】

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容をより明確に説明する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】韓国公開特許第１０−２００９−００８３４８４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、体液及び血液が存在する体内部位においても、十分な接着、被覆及び止血を行うことができ、特に、他の生分解性高分子に比べ、多い量の水分を吸収することができて、体内で自ら分解可能な生分解性医療用接着剤及びシーラントを開発するために鋭意研究した。その結果、ホルミル基が導入されて酸化されたグリコサミノグリカンとポリアミンとを一緒に使用することにより、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆、及び止血などを効果的に達成することができることを確認し、本発明を完成した。

【0008】

したがって、本発明の目的は、医療用接着剤又はシーラント（又は医療用接着剤又はシーラント組成物）を提供することにある。

【0009】

本発明の他の目的は、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆又は止血方法を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の一様態によると、本発明は、
（ａ）ホルミル基が導入されて酸化された酸化グリコサミノグリカンを含む第１成分と、
（ｂ）２以上のアミノ基を有するポリアミンを含み、水溶液状態におけるｐＨが８．５乃至１１．０である第２成分と、
を含む生分解性医療用接着剤又はシーラント（又は医療用接着剤又はシーラント組成物）を提供する。

【0012】

本発明の他の一様態によると、本発明は、
（ａ）ホルミル基が導入されて酸化された酸化グリコサミノグリカンを含む第１成分と、
（ｂ）２以上のアミノ基を有するポリアミンを含み、水溶液状態におけるｐＨが８．５乃至１１．０である第２成分と、
を含み、前記第１及び第２成分を混合した場合、ホルミル基／アミノ基のモル比は、０．１乃至５００である生分解性医療用接着剤又はシーラント（又は医療用接着剤又はシーラント組成物）を提供する。

【0013】

本発明のまた他の一様態によると、本発明は、前記生分解性医療用接着剤又はシーラント（又は医療用接着剤又はシーラント組成物）を接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆又は止血の必要な生体組織に適用する工程を含む生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆又は止血方法を提供する。

【0014】

本発明者らは、体液及び血液が存在する体内部位においても、十分な接着、被覆及び止血を行うことができ、特に、他の生分解性高分子に比べ、多い量の水分を吸収することができ、体内で自ら分解可能な生分解性医療用接着剤及びシーラントを開発するために鋭意研究した。その結果、ホルミル基が導入されて酸化されたグリコサミノグリカンとポリアミンとを一緒に使用することにより、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆、及び止血などを効果的に達成することができることを確認した。

【0015】

本明細書において、医療用接着剤又はシーラントと、その組成物とは、相互交換的に使用される。

【0016】

下記実施例で確認したように、本発明の組成物は、既存の医療用２成分型接着剤（ＬＹＤＥＸ）より、ゲル形成時間、粘着力及び水分吸収力において改善された効果を示し（表５乃至７参照）、止血効果においても、既存の止血剤（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）より、さらに優れた効果を示した（図１２参照）。このような結果は、第１成分と第２成分の組合せである本発明の組成物が、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆及び止血などの医療用途において優れた物性を示し、本発明の組成物をこれら医薬用途に使用できることを示す。

【0017】

本発明の組成物は、酸化グリコサミノグリカンを第１成分として含む。前記用語‘酸化グリコサミノグリカン’は、グリコサミノグリカンにホルミル基（−ＣＨＯ）が導入されて酸化されたことを意味する。前記グリコサミノグリカンは、ヘキソサミンを含む２糖の反復構造を有する多糖であるという点で、単糖のＯ−グリコシド結合のグルカンとは区別される。

【0018】

このようなホルミル基の導入は、過ヨウ素酸酸化法で実施できる。例えば、グリコサミノグリカンを過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩で酸化し、無水ブドウ糖単位（糖残基）当たり、滴定数（例えば、０．０１乃至０．９５個）のホルミル基が導入された酸化グリコサミノグリカンを得ることができる。

【0019】

本発明の一具現例によると、前記酸化グリコサミノグリカンの酸化度は、下記式によって計算されて、１０乃至９９．５％の値を有する。このような酸化度を有する酸化グリコサミノグリカンは、第２成分と組み合わせて使用時、体内の血液と体液を迅速に吸収し、速い時間内にゲル化できる。

【0020】

一つの特定例によると、前記酸化グリコサミノグリカンの酸化度は、１０〜６０％であり、他の特定例では、１０〜５５％であって、また他の特定例では、１０〜５０％であり、また他の特定例では、１０〜４５％であって、また他の特定例では、１０〜４０％である。一例として、前記第１成分に１種類以上の酸化グリコサミノグリカンが含まれて、この酸化グリコサミノグリカンが酸化ヒアルロン酸である場合、前記酸化ヒアルロン酸の酸化度は、１０〜２０％であってもよい。

【0021】

前記グリコサミノグリカンの酸化度測定は、ＮａＯＨ滴定法で実施できる。例えば、１７．５ｇのヒドロキシルアミンヒドロクロライドと０．０５％メチルオレンジ６ｍｌを９９４ｍｌの蒸留水に混合し、０．２５ｍｏｌ／ｌのヒドロキシルアミンヒドロクロライド溶液を作って、ｐＨを４に滴定した後、酸化グリコサミノグリカン０．１ｇを２５ｍｌの前記溶液に溶かして、０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを利用して再びｐＨ４に滴定した後、下記式に代入し、酸化度（％）を計算する。

【0022】

本発明の一具現例によると、前記酸化グリコサミノグリカンは、無水ブドウ糖単位（糖残基）当たり、０．０１乃至０．９５個のホルミル基を有する。

【0023】

本発明の一具現例によると、前記酸化グリコサミノグリカンは、酸化ヒアルロン酸、酸化コンドロイチン硫酸、酸化コンドロイチン、酸化デルマタン硫酸、酸化ヘパラン硫酸、酸化ヘパリン及び酸化ケラタン硫酸からなる群から選択される。

【0024】

本発明の一具現例によると、特定分子量のグリコサミノグリカンを使用することにより、接着剤／シーラント組成物のゲル化形成能、ゲル化状態維持時間、ゲルの弾性などを適宜調節することができる。

【0025】

本発明の一具現例によると、前記酸化グリコサミノグリカンを得るために使用されるグリコサミノグリカンは、１，０００乃至５００万の分子量を有する。一例として、前記酸化グリコサミノグリカンを得るために使用されるグリコサミノグリカンは、１万乃至４００万、５万乃至３５０万、１０万乃至３５０万、１０万乃至３００万、１０万乃至２５０万、１０万乃至２００万、又は１０万乃至１６０万の分子量を有することができる。

【0026】

本発明の一具現例によると、前記第１成分には、１０万乃至２００万の分子量を有する酸化ヒアルロン酸が含まれる。一つの特定例によると、前記酸化ヒアルロン酸の分子量は、１０万乃至１６０万である。

【0027】

本発明の一具現例によると、前記第１成分には、２種類以上の酸化グリコサミノグリカンが含まれる。

【0028】

本発明の一具現例によると、これらの酸化グリコサミノグリカンの重量比は、１：０．５〜５である。一つの特定例によると、前記酸化グリコサミノグリカンの重量比は、１：０．５〜４であり、他の特定例では、１：０．５〜３．５であって、また他の特定例では、１：０．５〜３であり、また他の特定例では、１：０．５〜２．５であって、また他の特定例では、１：０．５〜２であり、また他の特定例では、１：０．５〜１．５である。

【0029】

本発明の一具現例によると、前記２種類以上の酸化グリコサミノグリカンは、酸化ヒアルロン酸及び酸化コンドロイチン硫酸である。前記酸化ヒアルロン酸と酸化コンドロイチン硫酸の重量比は、１：０．５〜５、１：０．５〜４、１：０．５〜３．５、１：０．５〜３、１：０．５〜２．５、１：０．５〜２、１：０．５〜１．５又は１：０．８〜１．２である。

【0030】

本発明の一具現例によると、前記酸化ヒアルロン酸の酸化度は、１０〜４０％である。一つの特定例によると、前記酸化ヒアルロン酸の酸化度は、１２〜４０％であり、他の特定例では、１２〜３８％であって、また他の特定例では、１３〜３７％である。

【0031】

本発明の一具現例によると、前記酸化コンドロイチン硫酸の酸化度は、１０〜５５％である。一つの特定例によると、前記酸化コンドロイチン硫酸の酸化度は、１０〜５０％であり、他の特定例では、１０〜４５％であって、また他の特定例では、１０〜４０％であり、また他の特定例では、１０〜３５％である。

【0032】

本発明の一具現例によると、前記第１成分は、粉末状、液状又は固体状（例えば、ペレット形態）である。一例として、粉末状の第１成分は、酸化グリコサミノグリカン含有溶液を乾燥（例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥など）した後、粉砕（例えば、機械的粉砕）して得ることができる。

【0033】

本発明の組成物は、活性成分として第１成分の他に、２以上のアミノ基を有するポリアミンを含む第２成分をさらに含む。前記第２成分は、水溶液状態で８．５〜１１．０のｐＨを示す。下記実施例で確認したように、前記第２成分の水溶液状態におけるｐＨが８．５〜１１．０である場合、数秒内にゲル化がなされる（図７参照）。

【0034】

一つの特定例によると、前記第２成分は、水溶液状態で９．０〜１１．０のｐＨを示す。

【0035】

本発明の一具現例によると、前記ポリアミンは、第２及び／又は第３アミノ基をさらに有することができる。

【0036】

本発明の一具現例によると、前記ポリアミンを含む第２成分は、粉末状、液状又は固体状（例えば、ペレット形態）である。一例として、粉末状の第２成分は、ポリアミン含有溶液を乾燥した後、粉砕して得られる。この際、前記ポリアミン−含有溶液は、第２成分の水溶液状態におけるｐＨ範囲が８．５〜１１．０になるように、ｐＨ調節剤をさらに含むことができる。前記ｐＨ調節剤の例としては、酢酸、クエン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、フマル酸及びマレイン酸のような１価又は多価のカーボン酸化合物又はその無水物などが挙げられる。

【0037】

本発明の一具現例によると、前記ポリアミンは、ポリリジン、キトサン、アルブミン、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、プロタミン及びＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）からなる群から選択される。

【0038】

本発明の一具現例によると、前記ポリアミンは、１００以上の分子量を有する。一例として、前記ポリアミンの分子量は、１，０００乃至２０万である。

【0039】

本発明の一具現例によると、前記ポリアミンは、ポリ−Ｌ−リジンである。前記ポリ−Ｌ−リジンは、微生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）又は酵素を使用して生産されたε−ポリ−Ｌ−リジンである。

【0040】

本発明の一具現例によると、前記第２成分は、ポリアミンの他にｐＨ調節剤をさらに含むことができる。

【0041】

本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、薬物をさらに含むことができる。一例として、前記薬物は、第２成分に含まれる。前記薬物は、１個以上のアミン基を有することができ、このような薬物の例としては、アントラサイクリン系薬物、ゲムシタビン、バンコマイシン、ポリミキシン、メトトレキサート、タンパク質薬物及びペプチド薬物などが挙げられる。この場合、第１成分と第２成分のゲル化時、前記薬物のアミン基も第１成分のホルミル基と作用し、三つの成分が共にゲルを形成することができ、形成されたゲルの崩壊によって薬物が徐々に放出されて、薬理活性を示すことができる。

【0042】

本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、様々な形態で剤形化でき、例えば、粉末状、液状又は固体状（例えば、ペレット形態）の第１成分と、粉末状、液状又は固体状の第２成分との組合せを含むことができる。

【0043】

本発明の一具現例によると、本発明の組成物は、第１成分と第２成分を０．５〜１０：１の重量比で含む。

【0044】

一つの特定例によると、前記第１成分と第２成分は、０．５〜８：１の重量比で含まれ、他の特定例では、０．５〜６：１の重量比、また他の特定例では、０．５〜４：１の重量比、また他の特定例では、０．５〜３：１の重量比、また他の特定例では、０．５〜２：１の重量比、また他の特定例では、０．５〜１．５：１の重量比、また他の特定例では、０．８〜１．５：１の重量比、また他の特定例では、０．８〜１．２：１の重量比で含まれる。

【0045】

本発明によると、前記第１成分のホルミル基と第２成分のアミノ基の比率を調節することにより、ゲルの形成時間、生成ゲルの分解時間などを調節することができる。

【0046】

本発明の一具現例によると、前記第１及び第２成分を混合した場合、ホルミル基／アミノ基のモル比は、０．１〜５００である。

【0047】

一つの特定例によると、前記第１及び第２成分を混合した場合、ホルミル基／アミノ基のモル比は、１〜４００であり、他の特定例では、１〜３５０であって、また他の特定例では、１〜３００であり、また他の特定例では、１０〜３００である。

【0048】

前記第１成分と第２成分は、医療効果（医療用途）のために、同時にあるいは順次、被着体（生体内外の皮膚面）に塗布できる。この際、場合によって、前記第１及び第２成分のゲル化のために、食塩水あるいは蒸留水を噴射することができる。

【0049】

本発明の一具現例によると、前記医療用途は、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆及び止血からなる群から選択される。

【0050】

本発明の組成物は、第１成分と第２成分とを同一な容器に入れて、あるいは、別途の容器に分離した形態で提供する。

【発明の効果】

【0051】

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである：
（ｉ）本発明は、酸化グリコサミノグリカンとポリアミンとを含む生分解性医療用接着剤又はシーラント組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明の組成物は、生分解性、塗布性、ゲル化時間、止血能、接着力及び水分吸収力などにおいて、改善された効果を示す。
（ｉｉｉ）本発明の組成物は、生体組織の接着、充填、塗布、癒着防止、創傷被覆、漏出防止又は止血など、医療用接着剤又はシーラントが使用可能な多様な医療用途に活用できる。

【図面の簡単な説明】

【0052】

【図1】図１は、ＦＴ−ＩＲ分光計を利用して、酸化ヒアルロン酸を分析した結果を示す図である。

【図2】図２は、アミノ基を有する第２成分を利用した混合物のゲル化の様子とゲル化時間を示す写真である。

【図3】図３は、相異なる重量比で混合した第１成分と第２成分混合物のゲル化評価結果を示す写真である。

【図4】図４は、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の接着剤組成物（ライデキス）のゲル化時間を比較して示すグラフである。

【図5】図５は、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の接着剤組成物（ライデキス）の粘着力を比較して示すグラフである。

【図6】図６は、胃粘膜の切除後、出血部位に本発明の接着剤及びシーラント組成物、又は既存の接着剤組成物（ライデキス）を塗布した後の結果（粘膜付着能力と止血能力）を示す写真である。

【図7】図７は、酸化グリコースアミノグリカンとポリアミン混合物のゲル化の様子とゲル化時間、そしてｐＨによるゲル化有無を示す写真である。

【図8】図８は、肝葉切除術モデルを対象に実施した、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の止血剤（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）間の比較実験結果を示す写真である。

【図9】図９は、腎臓切除術モデルを対象に実施した、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の止血剤（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）間の比較実験結果を示す写真である。

【図10】図１０は、胃粘膜切除術モデルを対象に実施した、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の止血剤（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）間の比較実験結果を示す写真である。

【図11】図１１は、血管出血モデルを対象に実施した、本発明の接着剤及びシーラント組成物と既存の止血剤（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）間の比較実験結果を示す写真である。

【図12】図１２は、図８乃至図１１の結果を定量的に示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0053】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

【実施例】

【0054】

実施例１：医療用接着剤の製造１
（１）酸化ヒアルロン酸（ＣＨＯ−ＨＡ；第１成分）の製造
分子量７ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１４００ｋＤａあるいは３０００ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）１ｇ又は３ｇを過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）が溶解されている１５０ｍｌの水に溶かした。この際、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度と反応条件を下記表１乃至４のようにして、酸化度（置換度（ＤＳ）、％）を異なるようにした。反応フラスコを１５〜７０℃で３〜４８時間反応した。反応物を、蒸留水で分画分子量１〜１００ｋＤａの透析膜を利用して２４時間透析した。ここで収得した酸化ヒアルロン酸を４日以上凍結乾燥した後、粉砕して５００μｍサイズのメッシュを通過させることにより、直径約５００μｍ以下の酸化ヒアルロン酸を収得した。

【0055】

酸化ヒアルロン酸

【0056】

酸化ヒアルロン酸をＦＴ−ＩＲ分光計（Ｃａｒｙ ６４０，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）を利用して分析した結果、４０００−４００ｃｍ^−１（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ４ｃｍ^−１）で置換基を確認した（図１）。

【0057】

ヒアルロン酸の酸化度を確認するために、１７．５ｇのヒドロキシルアミンヒドロクロライドと０．０５％メチルオレンジ６ｍｌを９９４ｍｌの蒸留水に混合し、０．２５Ｍヒドロキシルアミンヒドロクロライド溶液を作製し、ｐＨを４に滴定した。酸化ヒアルロン酸０．１ｇを２５ｍｌの前記溶液に溶かし、０．１ｍＭ水酸化ナトリウムを利用して、再びｐＨ４に滴定した。酸化度（％）は、下記の式を利用して計算し、結果を下記表１乃至４に示した。

【0058】

【0059】

【表1】

【0060】

【表2】

【0061】

【表3】

【0062】

【表4】

【0063】

（２）２以上のアミノ基を有する第２成分
多様なアミノ基含有ポリアミンのうち、代表的にキトサン、プロタミン、ＰＥＩ、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン及びアルブミンなどを第２成分として利用し、５重量％以上のポリアミン水溶液から、ｐＨ調節剤（酸、酸塩、塩基、塩基塩など）を利用してｐＨを８．５、９．０、９．５及び１０に調節した後、前記酸化ヒアルロン酸／酸化コンドロイチン硫酸の場合と同様に、凍結乾燥後に収得された粉末を使用した。

【0064】

上述したアミノ基含有ポリアミンのゲル化度とゲル化時間を評価した。その結果、アルブミン、塩基性ポリリジン（ＢＰＬ）、ＰＥＩがゲル化速度とゲルの安定性面で優れていた（図２）。そのうち、ＢＰＬを使用して下記実験を進行した。

【0065】

実施例２．物性評価
（１）ゲル化評価
実施例１で得られた第１及び第２成分を相異なる重量比（１：１、２：１、４：１、８：１）で混合した。混合した成分に水をかけて、ゲル化される程度を確認した。

【0066】

その結果、第１成分と第２成分を８：１で混合した場合は、１０分後に一部が液体に変わって、２；１と４：１で混合した場合は、ゲルの弾性が１：１に比べて比較的劣った（図３）。また、３，０００ｋＤａ分子量のヒアルロン酸を利用した混合製剤は、ゲル化されたが、弾性が劣った。分子量１５０ｋＤａと１，４００ｋＤａのヒアルロン酸の場合は、置換度に関係なくゲル化されたが、置換度１０％台（１０〜１９％）の混合製剤が短いゲル化時間を示し、弾性にも優れていた。

【0067】

以上の結果に基づいて、第１成分（分子量１５０ｋＤａ又は１，４００ｋＤａのヒアルロン酸にアルデヒド基が導入された置換度１０％の酸化ヒアルロン酸）と第２成分を１：１の重量比で混合して、下記の実験を実施した。

【0068】

（２）ゲル化時間評価
２ｍｌチューブに混合した成分を３０ｍｇずつ小分けし、チューブの蓋に集めた。これに１２０μｌの水を１秒以内にかけた後、ゲル化される時間を測定した。ＬＹＤＥＸの場合は、ヒアルロン酸混合製剤に比べ、少ない量（８０μｌ）の水を適用したにもかかわらず、固まったゲルを得るまで１０秒以上が所要された。その反面、酸化ヒアルロン酸の混合製剤の場合は、２〜３秒以内の短いゲル化時間を示した（図４及び表５）。

【0069】

【表5】

【0070】

（３）粘着力評価
１００ｍｇの混合した成分に８００μｌの水をかけた後、Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを利用して粘着力を測定した。その結果、ＬＹＤＥＸは、酸化ヒアルロン酸混合製剤に比べて少ない量（５００μｌ）の水を適用したにもかかわらず、平均粘着力が約５３．６ｇｆであった。その反面、酸化ヒアルロン酸の混合製剤の場合は、平均粘着力がそれぞれ約６５．９及び６７．５ｇｆと測定された（図５及び表６）。

【0071】

【表6】

【0072】

（４）吸収力評価
ＬＹＤＥＸと、第２成分と混合したそれぞれのＣＨＯ−ＨＡ １５０ｋＤａ（ＤＳ １０％）、ＣＨＯ−ＨＡ １，４００ｋＤａ（ＤＳ １０％）の吸収力を評価した。各サンプル３０ｍｇをペトリディッシュ（Ф６０）にのせて、重量を測定した。予め３７℃に温めておいた蒸留水を、製品の吸収力を考慮し、サンプル重量の３０倍（３０ｇ）を添加した。３７℃の恒温器で３０分間放置した後、ペトリディッシュを３０秒間ひっくり返しておいて、その重量を測定した。下記の計算式を利用して吸収力を計算した。

【0073】

【0074】

その結果、既存ＬＹＤＥＸ剤形に比べ、酸化ヒアルロン酸の混合製剤（ＣＨＯ−ＨＡ １，４００ｋＤａ）の吸収力が約５倍程度優れていることを確認した（表７）。

【0075】

【表7】

【0076】

実施例３．生体内評価
（１）実験動物
体重２乃至３ｋｇの３匹の雄性ラビット（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ；オリエントバイオ（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ），ソンナン，大韓民国）を実験に使用した。全ての動物飼育及び試験過程は、インハ大学校の実験動物研究委員会（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針にしたがって行った。

【0077】

（２）胃出血誘発動物モデル
ラビットの粘膜切除（ｍｕｃｏｓｅｃｔｏｍｙ）−誘導胃出血モデルを以下のように制作した。手術前、２４時間ラビットを絶食させて、ケタミン（４．２ｍｇ／ｋｇ）及びシラジン（１１．７ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋肉注射して麻酔した。ラビットの上腹部を切開して胃を露出させて、胃の大湾曲（ｇｒｅａｔｅｒ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ）にそって約５〜７ｃｍ程度切開した。等張生理食塩水２００μｌを胃の粘膜下層（ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ ｌａｙｅｒ）に注射し、膨潤した胃粘膜を、手術ハサミを使用して切除した。切除された部位の直径は、約７〜１０ｍｍであった。

【0078】

（３）粘膜付着能力及び止血能力評価
出血されている切除されたラビットの胃粘膜に約０．５ｇの混合製剤（１：１重量比の第１成分と第２成分との混合物）を塗布した。その結果、図６に示されたように、混合製剤を塗布してからすぐ混合製剤と血液が反応して、混合製剤のゲル化がなされて、非処置群に比べ出血時間が短縮された。また、本発明の組成物の粘膜付着能力を確認した（図６）。

【0079】

実施例４．医療用接着剤の製造２
（１）酸化ヒアルロン酸と酸化コンドロイチン硫酸（第１成分）の製造
分子量１，４００ｋＤａのヒアルロン酸（ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＬＯＯＭＡＧＥ ＦＲＥＤＡ ＢＩＯＰＨＡＲＭ ＣＯ．，Ｌｔｄ）３ｇを１５０ｍｌの蒸留水に溶解させた。その後、表１のように過ヨウ素酸ナトリウム（分子量２１３．８９）を添加して、反応フラスコを４０℃で２４時間攪拌しながら反応した。そして、反応後の溶液を蒸留水で４８時間透析（分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜使用）した後、凍結乾燥した。

【0080】

分子量５，０００〜５０，０００のコンドロイチン硫酸（ＹＡＮＴＡＩ ＤＯＮＧＣＨＥＮＧ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．，Ｌｔｄ）３ｇを１５ｍｌの蒸留水に溶解させた。その後、表２のように過ヨウ素酸ナトリウム（分子量２１３．８９）を添加して、常温で１８時間攪拌しながら反応した。そして、反応後の溶液を蒸留水で４８時間透析（分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析膜使用）した後、凍結乾燥した。

【0081】

以下の実験では、酸化ヒアルロン酸と酸化コンドロイチン硫酸を第１成分として使用した。

【0082】

ＮａＯＨ滴定法によってヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸の置換度（酸化度）を確認した。具体的には、１７．５ｇのヒドロキシルアミンヒドロクロライドと０．０５％メチルオレンジ６ｍｌを９９４ｍｌの蒸留水に混合して０．２５ｍｏｌ／ｌのヒドロキシルアミンヒドロクロライド溶液を作って、ｐＨを４に滴定した。酸化ヒアルロン酸あるいはコンドロイチン硫酸０．１ｇを２５ｍｌの前記溶液に溶かし、０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを利用して、再びｐＨ４に滴定した。置換度（％）は、下記式を利用して計算し、結果は、下記表８及び９の通りであった。

【0083】

【0084】

【表8】

【0085】

【表9】

【0086】

（２）２以上のアミノ基を有する第２成分の製造
多様なアミノ基含有ポリアミンのうち、代表的にキトサン、プロタミン、ＰＥＩ、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン及びアルブミンなどを第２成分として選択し、第２成分としては、ｐＨによるゲル化有無を調べるために、水溶液状態でｐＨを多様な範囲（５．５−６．４，６．５−７．４，７．５−８．４，８．５−９．４，９．５−１０．４，１０．５−１１）に調節した後、前記酸化ヒアルロン酸／酸化コンドロイチン硫酸の場合と同様に、凍結乾燥後に得られた粉末を使用した。前記第１成分の酸化ヒアルロン酸／酸化コンドロイチン硫酸とポリアミンを混合した。その結果、ポリアミンの種類に関係なく、ｐＨが８．５−１１である場合にのみ、ゲル化されることを確認した。一例として、ポリ−Ｌ−リジンのｐＨが８．５である場合は、ゲルが形成されたが、ｐＨ５．６ではゲルが形成されなかった。本実験においてゲルの形成有無は、ゲルの透明度によって決定した（透明：ゲル化、不透明：非ゲル化）（図７）。

【0087】

実施例５．最適の比率確認
（１）分子量、比率別の最適条件の確立
収得された粉末状の酸化コンドロイチン硫酸と分子量１５０〜３，０００ｋＤａの酸化ヒアルロン酸（１：１）を、酸化度によって比率別にポリアミン（ＰＡ；ｐＨ８．５−９．５ ポリリジン選定して使用）と混ぜて物性を確認した。酸化度によって比率別に混ぜた５０ｍｇに滅菌された蒸留水２００μｌを入れて、滅菌された蒸留水を吸収するかどうか、目視でその程度を確認した。粉末が、滅菌された蒸留水を１０秒以内に吸収し始めた時を良好（＋＋＋）、３０秒以内を普通（＋＋）、６０秒以上を不良（＋）と評価し、溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を確認した。また、滅菌された蒸留水を入れた時、ゲル化されるかどうかを確認し、その時間を測定した。このように形成されたゲルが再び液化されるかどうかを確認し、その時間を測定した。このように確認した結果を下記表にまとめて示した（表１０及び１１）。

【0088】

表１１に示されたように、ほぼ全ての第１成分と第２成分との組合せにおいて、水分吸収力とゲル時間において満足する結果が導出されて、そのうち、最上の性能（水分吸収力が＋＋＋、ゲル化時間が３０秒以内）を示したものは、１０〜５０％酸化コンドロイチン硫酸と１０〜４０％酸化ヒアルロン酸（１５０、１，４００又は３，０００ｋＤａ）を、ポリアミンと１：１の比率で混合した混合製剤であって（サンプル番号：３、４、１２、１４、１７、２６、２９）、この結果に基づいて、下記実施例では、＃１４（ＵＩ−ＳＡＨ命名）を使用して実験を進行した。

【0089】

【表10】

【0090】

【表11】

【0091】

実施例６．ラット出血モデルの制作及び止血作用の評価
（１）肝葉切除術モデル
体重２００〜３００ｇの雄性ＳＤラットの腹腔にケタミンとキシラジン混合物を注射して麻酔した後、中央上腹部を縦又は横に約３〜４ｃｍ程度切開した。切開された腹部から、濡れたガーゼを利用して肝葉を露出させて、肝門脈及び肝動脈を血管用クリップで結紮した。肝葉の縁から約１ｃｍ程度離れた箇所を、手術用ハサミを利用して切除し、ＵＩ−ＳＡＨ ５０〜１００ｍｇを塗布した。対照群としては、Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ（Ｍｅｄａｆｏｒ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を塗布した。塗布後、結紮していたクリップを除去した後、出血が発生するかどうか確認し、滅菌ガーゼを利用して出血量を測定した。

【0092】

（２）腎臓切除術モデル
体重２００〜３００ｇの雄性ＳＤラットの腹腔にケタミン及びキシラジンの混合物を注射して麻酔した後、右側腹部を縦に約３〜４ｃｍ程度切開した。切開された腹部から、濡れたガーゼを利用して腎臓を露出させて、腎静脈（ｒｅｎａｌ ｖｅｉｎ）、腎動脈（ｒｅｎａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ）を血管用クリップで結紮した。腎臓の縁から約１ｃｍ程度離れた箇所を、手術用ハサミを利用して切除し、ＵＩ−ＳＡＨ ５０〜１００ｍｇを塗布した。対照群としては、Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ（Ｍｅｄａｆｏｒ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を塗布した。塗布後、結紮していたクリップを除去した後、出血が発生するかどうか確認し、滅菌ガーゼを利用して出血量を測定した。

【0093】

（３）胃粘膜切除術モデル
体重２００〜３００ｇの雄性ＳＤラットを２４時間絶食させた後、腹腔にケタミン及びキシラジンの混合物を注射して麻酔した後、中央上腹部を縦又は横に約３〜４ｃｍ程度切開した。切開された腹部から、濡れたガーゼを利用して胃を露出させて、血管の少ない胃の湾曲部位を水平に約３ｃｍ程度切開して、胃内壁が見えるようにした。胃内壁に注射用生理食塩水１００μｌを注入した後、胃粘膜を手術用ハサミで約５ｍｍ直径の円になるように切除し、ＵＩ−ＳＡＨ ５０〜１００ｍｇを塗布した。対照群としては、Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ（Ｍｅｄａｆｏｒ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を塗布した。塗布部位に出血が発生するかどうか確認し、滅菌ガーゼを利用して出血量を測定した。

【0094】

（４）血管（Ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ）出血モデル
体重２００〜３００ｇの雄性ＳＤラットの腹腔にケタミン及びキシラジンの混合物を注射して麻酔した後、中央上腹部を縦又は横に約５〜６ｃｍ程度切開した。切開された腹部から、他の臓器を左側に移動させた後、門脈を露出させた。門脈の上側と下側の２ヶ所を血管用クリップで結紮した。１８ゲージ針を利用して門脈に穴をあけた後、ＵＩ−ＳＡＨ ５０〜１００ｍｇを塗布した。対照群としては、Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ（Ｍｅｄａｆｏｒ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を塗布した。塗布後、結紮していたクリップを除去した後、出血が発生するかどうか確認し、滅菌ガーゼを利用して出血量を測定した。

【0095】

（５）実験結果
実験結果を、図８乃至１２に示した。図１２に示したように、本発明の組成物の止血効果は、対照群（Ａｒｉｓｔａ^ＴＭ ＡＨ）に比べ、さらに優れていた。

【0096】

以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】