特許 6208864 安定性が改善された抗体−薬物結合体およびこれの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6208864

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】安定性が改善された抗体−薬物結合体およびこれの用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20170925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20170925BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170925BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170925BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170925BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   A61P35/00

   A61P37/06

   A61K45/00

   A61K39/395 T

   A61K39/395 E

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K38/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】16

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2016-523642(P2016-523642)

(86)(22)【出願日】2014年6月24日

(65)【公表番号】特表2016-523900(P2016-523900A)

(43)【公表日】2016年8月12日

(86)【国際出願番号】KR2014005589

(87)【国際公開番号】WO2014208987

(87)【国際公開日】20141231

【審査請求日】2016年2月24日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0072686

(32)【優先日】2013年6月24日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】516207687

【氏名又は名称】エービーエルバイオ

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185915

【弁理士】

【氏名又は名称】長山 弘典

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎 祐朗

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨンミン

(72)【発明者】

【氏名】コ ミンジ

(72)【発明者】

【氏名】キム ジェヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム ジュヒ

(72)【発明者】

【氏名】ムン ギョンドク

(72)【発明者】

【氏名】ソン デヘ

(72)【発明者】

【氏名】オム ジェヒョン

(72)【発明者】

【氏名】チョン ジンウォン

【審査官】 伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３４４２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１２３０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１８７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３８６２９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／３０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の重鎖または軽鎖Ｎ−末端アミノ酸残基に細胞毒性薬物が結合された抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）であって、前記細胞毒性薬物は、前記抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基に結合され、前記細胞毒性薬物は、アルデヒド反応基を持つリンカーを介して前記抗体に結合される、前記抗体−薬物結合体。

【請求項2】

前記抗体は、全長抗体または抗原結合ドメインを含む抗体断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項3】

前記抗体は、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２からなる群から選択された形態を持つことを特徴とする請求項２に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項4】

前記細胞毒性薬物は、マイクロチューブリン構造形成抑制剤、有糸分裂抑制剤、ＲＮＡ重合酵素抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡアルキレーター、リボソーム抑制剤、放射線同位元素および毒素からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項5】

前記細胞毒性薬物は、メイタンシノイド、オリスタチン、トラスタチン、チュブリシン、カリケアミシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、テュオカルマイシン、カルボプラチン（パラプラチン）、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニドラン、窒素マスタード（メクロレタミン塩酸塩）、ブレオマイシン、ミトマイシンＣ、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、トリメトキサート、メトトレキサート、エトポシド、ビンブラスチン、ピノレルビン、アリムタ、アルトレタミン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、トポテカン、イリノテカン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、α−アマニチン、他のエンジイン抗生物質、外毒素および植物毒素からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項6】

前記オリスタチンは、モノメチルオリスタチンＥまたはモノメチルオリスタチンＦであることを特徴とする請求項５に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項7】

前記抗体は、癌細胞表面抗原に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項8】

前記癌細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ２２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、Ｍｕｃ−１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＮＭＢ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭおよびＥＧＦＲからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項9】

前記抗体は、抗−ＨＥＲ２抗体、抗−ＣＤ３０抗体、抗−ＣＤ５６抗体、抗−ＧＰＮＭＢ抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項10】

前記抗体は、トラスツズマブ、ロボツズマブ、ブレンツキシマブ、およびグレムバツムマブからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の抗体−薬物結合体。

【請求項11】

抗体の重鎖または軽鎖Ｎ−末端アミノ酸残基に免疫抑制剤が結合された抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）であって、前記免疫抑制剤は、前記抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基に結合され、前記免疫抑制剤は、アルデヒド反応基を持つリンカーを介して前記抗体に結合される、前記抗体−薬物結合体。

【請求項12】

α−アミン基と反応して架橋できる反応基を含む細胞毒性薬物または免疫抑制剤と抗体を反応させて、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基に細胞毒性薬物または免疫抑制剤を結合させる段階を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体−薬物結合体の製造方法。

【請求項13】

前記製造方法は、結合体を形成しなかった抗体および細胞毒性薬物または免疫抑制剤を含む反応産物から抗体−薬物結合体を分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。

【請求項14】

前記α−アミン基と反応して架橋できる反応基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カルボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、アンハイドライドおよびフルオロフェニルエステルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。

【請求項15】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物結合体を含む、癌治療用薬学的組成物。

【請求項16】

請求項１１に記載の抗体−薬物結合体を含む、自己免疫疾患の治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端アミノ酸残基に薬物が結合された抗体−薬物結合体、これの製造方法及びこれの用途に関する。

【背景技術】

【0002】

最近、様々な疾患に対して抗体を利用した診断または治療方法が研究されている。特に、抗体の標的特異性のために、抗体を利用した様々な治療方法が開発されて、抗体を含む様々な形態の医薬、例えば抗体−薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）などが開発されている。そこで、抗体または抗体−薬物結合体に対して生体内安定性を増加させて、治療効果を最大化する方法が継続的に研究されている。

【0003】

これらのうち抗体−薬物結合体は、一般的に天然抗体に比べて生体内安定性が低い短所があるが、天然抗体が持つ短所である低い治療効果を薬物との結合を介して改善するために開発された。標的特異的抗体にサイトトキシンなど特定薬効を持つ薬物が多様に結合した形態で開発されていて、特に癌細胞特異的抗体にはサイトトキシンを結合させて癌細胞死滅を誘導する方法は実際に現在商用化された方法である。

【0004】

しかし、このような抗体−薬物結合体は、天然抗体に比べて生体内安定性が低くなる傾向があって、さらに、治療効果を高めるために薬物の結合比率（Ｄｒｕｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒａｔｉｏ，ＤＡＲ）を高める場合、解決しなければならない種々の技術的問題が存在する。まず、標的特異的治療のために抗体の抗原結合能およびＦｃ機能を妨害しないようにしなければならず、抗体対薬物の結合比率を高めることによって治療効果も増大する効果が現れなければならなく、抗体対薬物の結合比率に応じて体−薬物結合体の生体内安定性、すなわち血中半減期が減少しないようにしなければならない。上述した技術的問題を考慮して最大限高い抗体対薬物比率を維持することが現在の抗体−薬物結合体製造分野の目標である。特に、癌細胞表面抗原の発現程度が低い場合を考慮すると、高い細胞毒性を維持するためには最大限高いＤＡＲを維持しなければならないが、ＤＡＲが８に達した場合、抗体に結合した疏水性薬物の影響で血中半減期が減少して毒性は増加して、生体内効果（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ）が減少され得る短所がある。

【0005】

このような背景下、本発明者等は、某抗体の抗原結合力を同等に維持して優れた抗癌効果を示しながらも薬物による毒性が少なく生体内効能が優れた抗体−薬物結合体を製造できる技術を開発するために鋭意努力した結果、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に薬物を結合させる場合、既存報告された抗体−薬物結合体と比較しても生体内毒性が少ないながらも血中安定性および抗癌活性が優れることを解明して、本発明を完成した。

【発明の概要】

【0006】

本発明の一目的は、抗体の重鎖または軽鎖Ｎ−末端アミノ酸残基に薬物が結合された抗体−薬物結合体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体−薬物結合体の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体−薬物結合体を含む組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体−薬物結合体を癌の疑いがある個体に投与する段階を含む、癌の治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体−薬物結合体を自己免疫疾患の疑いがある個体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記抗体−薬物結合体で製造するのに適合した抗体を選別する方法を提供することである。

【発明の効果】

【0007】

本発明の抗体−薬物結合体を製造する方法により、より高い生体内効能、安定性および低い毒性を持つ抗体−薬物結合体を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】アルデヒドリンカーが末端に連結された毒素ＭＭＡＦ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）の構造式である。

【図2】遺伝子操作されなかったモノクローナル抗体−サイトトキシン結合体であって、結合された個数と位置が同質性を持つ構造を示す模式図である。

【図3】Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦのＬＣ／ＭＳプロファイルを示した図である。

【図4】製造されたトラスツヅマブ（Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）−Ｎ−ＭＭＡＦ（Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ結合体）で薬物が結合された位置をペプチドマッピングで確認した結果を示した図である。

【図5】製造されたＴ−Ｎ−ＭＭＡＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム結果を示した図である。

【図6】全抗体（Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のラットでの経時的な血中濃度変化を確認した図である。

【図7】結合抗体（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）の経時的な血中濃度変化を確認した図である。

【図8】各ＡＤＣ別ｔｏｔａｌ／ｃｏｎｊｕｇａｔｅのＰＫプロファイルを互いに比較した結果を示した図である。

【図9】ヌードラット異種移植モデルでのＨＣＣ１９５４細胞株によって形成された腫瘍成長曲線を示した図である。

【図10】腫瘍の大きさをエンドポイントで設定したヌードラット異種移植モデル実験での生存曲線を示した図である。

【図11】各ＡＤＣ別投与に伴う体重の変化および相対変化量を示した図である。

【図12】各ＡＤＣ別投与に伴う肝毒性の可否を確認した結果を示した図である。

【図13】各ＡＤＣ別投与に伴う好中球および血小板の変化を示した図である。

【図14】Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥ ＬＣ／ＭＳ分析結果を示した図である。

【図15】Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥのＲａｔ ＰＫプロファイルを示した図である。

【図16】ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）−Ｎ−ＭＭＡＦ（Ｂ−Ｎ−ＭＭＡＦ）のＬＣ／ＭＳプロファイルを示した図である。

【図17】Ｂ−Ｎ−ＭＭＡＦの抗原結合力を分析した結果を示した図である。

【図18】ロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）−Ｎ−ＭＭＡＦ（Ｌ−Ｎ−ＭＭＡＦ）のコンジュゲーションプロファイル（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）を示した図である。

【図19】Ｌ−Ｎ−ＭＭＡＦの抗原結合力を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

一観点では、本発明は、抗体の重鎖または軽鎖Ｎ−末端アミノ酸残基に薬物が結合された抗体−薬物結合体に関する。

【0010】

本発明で、用語「抗体−薬物結合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）」とは、抗体と薬物の生物学的活性を低下させずに薬物と抗体を化学的に連結した形態を指し示す。本発明で、前記抗体−薬物結合体は、抗体の重鎖または／および軽鎖のＮ−末端のアミノ酸残基に薬物が結合された形態、具体的には抗体の重鎖または／および軽鎖のＮ−末端α−アミン基に薬物が結合された形態をいう。本発明では、抗体の様々な部位の中でも重鎖または軽鎖のＮ−末端に薬物を位置特異的に結合させる場合、既に報告されたシステイン結合で形成された抗体−薬物結合体、チオール結合で形成された抗体−薬物結合体およびリシン結合で形成された抗体−薬物結合体と比較した時、生体内効能および安定性友に優れて毒性が少ないことを確認して、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端が効能、安定性および低毒性の利点をいずれも備えた位置になり得ることを解明した。このような本発明に係わる抗体−薬物結合体に対する模式図を図２に示した。

【0011】

本発明で、用語「Ｎ−末端」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端、すなわちＮ−末端で、本発明の目的上薬物と結合できる位置をいう。例えは、これに制限されないが、Ｎ−末端の最末端のアミノ酸残基だけでなくＮ−末端の周囲のアミノ酸残基をいずれも含むことができ、具体的には抗体の重鎖または軽鎖の一番目のアミノ酸残基をいい、さらに具体的には抗体の重鎖または軽鎖の一番目のアミノ酸のα−アミン基をいうが、これに制限されるのではない。

【0012】

本発明の抗体−薬物結合体は、抗体と薬物の位置特異的結合または／および個数特異的結合を介して同質性を保証できる長所を持つ。特に、本発明の最適化過程を介して、各抗体毎にＮ−末端アミノ酸残基に最適なＤＡＲ（ｄｒｕｇ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）に該当する数、例えば、１〜８個の薬物が結合することができる。

【0013】

本発明で、用語「同質性」とは、二つの物質が結合されて形成される結合体において、二つの物質の結合比率および結合位置が均質な場合をいう。但し、結合比率および結合位置が完全に同じ場合だけを含む意味に制限解釈されるのではなく、特定結合比率および結合位置が優位に存在する場合も含む。結合体が同質性を持つようになると、全体的に均質になり投与量に応じた効能を正確に測定できてこれの投与量、投与回数などを標準化できることになる。

【0014】

本発明で、用語「抗体」とは、免疫学的に特定抗原と反応性を持つ免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する抗原のレセプターの役割をするたんぱく質分子を意味して、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）抗体および抗原結合ドメインを含む抗体断片を全て含む。全長抗体は、二つの全体の長さの軽鎖および二つの全体の長さの重鎖を持つ構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合に連結されている。前記全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。前記抗体断片は、抗原結合機能を有する断片を意味して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖおよびＦｖなどを含む。前記Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１）を持つ構造で一つの抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を持つ点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位および軽鎖可変部位だけを持っている最小の抗体フラグメントを意味する。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、たんぱく質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得ることができる）、好ましくは遺伝子組換え技術で作製することができる。

【0015】

また、本発明の抗体は、天然型抗体または組換え抗体であってもよい。天然型抗体とは、遺伝子操作を加えない抗体を意味して、生体内で遺伝子操作された抗体が持つことができる免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の危険性が顕著に低くなり得る。組換え抗体とは、遺伝子操作された抗体を意味して、遺伝子操作を介して抗原結合力や所望の特徴を追加できる特徴がある。

【0016】

本発明で、用語「遺伝子操作」とは、アミノ酸配列を変化させる行為であって、該当アミノ酸配列をコードする本来配列ポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドに対する操作を含む。アミノ酸配列変異体は、本来アミノ酸配列内の特定位置でアミノ酸が置換、欠失された外部挿入されたアミノ酸配列を含有するようになる。

【0017】

本発明の抗体は、特異的に結合する抗原で、抗体と結合時細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）される細胞表面抗原を認識するものであってもよい。本発明の目的上抗原が抗体との結合によって細胞内に内在化される場合には、該当特性によって、抗体に結合された薬物、具体的に細胞毒性薬物が、細胞内に流入して薬物の効能が高いこともあるが、これに制限されるのではない。

【0018】

また、本発明の抗体は、癌細胞表面抗原または自己免疫疾患が発生した組織表面抗原に特異的に結合するものであってもよい。

【0019】

本発明で、用語「癌細胞表面抗原」とは、正常細胞には生成されないか生成されても細胞表面に露出していない物質が癌細胞だけで特異的に細胞表面に露出している物質または正常細胞に比べて癌細胞の表面により多く存在する物質のことをいう。該当物質が抗体によって認識される場合、これを抗原と表現する。

【0020】

具体的には、本発明の癌細胞表面抗原は、本発明の抗体が特異的に認識できる癌細胞表面物質は制限なしに含むが、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ２２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、Ｍｕｃ−１６、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＰＮＭＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＢ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＢＣＭＡ（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）およびＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）からなる群から選択されてもよく、より具体的にＨＥＲ２、ＣＤ３０、ＣＤ５６およびＧＰＮＭＢからなる群から選択されてもよい。しかし、これに制限されるのではない。本発明の一実施例では、Ｈｅｒ２、ＣＤ５６、およびＧＰＮＭＢを認識する抗−ＨＥＲ２抗体の一種であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗−ＣＤ５６抗体の一種であるロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、抗−ＣＤ３０抗体の一種であるブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、そして抗−ＧＰＮＭＢ抗体の一種であるグレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）をモデル抗体として使用した。

【0021】

本発明で、用語「薬物」とは、細胞に特定生物学的活性を持つ任意の物質を意味し、これは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドなどを全て含む概念である。これはα−アミン基と反応して架橋できる反応基を含む形態であってもよく、α−アミン基と反応して架橋できる反応基を含むリンカーが連結されている形態も含む。この場合、リンカーによって薬物が前記抗体のＮ末端アミノ酸残基に位置特異的に結合することができるが、これに制限されない。

【0022】

前記リンカーは、抗体に薬物を共有結合させる原子鎖を含む化学的部分をいう。リンカーは、薬物と連結された形態で製造されて、リンカー末端には抗体と連結させることができる反応基を持つ。

【0023】

前記α−アミン基と反応して架橋できる反応基の例としては、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基と反応して架橋できるならその種類は特に制限されなく、当業界に公知のアミン基と反応する種類を全て含むが、例えば、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、スルホニルクロリド（ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（ｏｘｉｒａｎｅ）、カルボネート（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（ａｒｙｌ ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、アンハイドライド（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）およびフルオロフェニルエステル（ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）等が挙げられて、より好ましい反応基としてはアルデヒドおよびＮＨＳエステルであるが、特にこれに制限されない。このような反応基はアミン基とアシル化またはアルキル化反応に結合されうるが、特にこれに制限されるのではない。

【0024】

特に、本発明の抗体−薬物結合体は、抗体のＮ末端のアミノ酸残基に、アルデヒド反応基を持つリンカーと連結された薬物を位置特異的および個数特異的に結合した免疫結合体であってもよい。

【0025】

アルデヒド反応基は、非特異的反応を最小化して抗体のＮ末端のアミノ酸残基、特に、α−アミンに薬物を位置特異的に結合させるのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒドは、低いｐＨでＮ末端α−アミンと選択的に反応する特性を持つ。これにより、本発明の結合体は、抗体のＮ−末端α−アミンに位置特異的に薬物が連結された同質性を持つことになる。したがって、既存抗体と薬物の結合体の結合の個数および位置の異質性のために生じる一律的な薬効および質を担保できないというとの問題点を克服できたが、特にこれに制限されるのではない。

【0026】

本発明の具体的な一実施例では、本発明者等は、抗体のα−アミンに位置特異的に細胞毒性薬物を連結するために結合反応時ｐＨ６．０以下で反応させる場合、細胞毒性薬物がリシン残基に存在するε−アミンと結合するのを最小化できることを確認した。

【0027】

本発明で薬物は、細胞に細胞死滅、細胞増殖、免疫活性、免疫抑制を含んで特定信号伝達の活性化、または特定信号伝達の抑制などを引き起こすことができる物質を全て含み、前記薬物は特に細胞毒性薬物または免疫抑制剤であってもよい。

【0028】

本発明で、用語「細胞毒性薬物」とは、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を持つ任意の物質、例えば化合物を指し示す。「細胞毒性」とは、細胞の機能を抑制したり低下させて細胞の破壊を引き起こす効果を意味し、「細胞増殖抑制」とは、細胞成長または細胞増殖の制限などのように細胞生長機能を制限する効果を意味する。

【0029】

本発明で細胞毒性薬物は、マイクロチューブリン（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｉｎ）構造形成抑制剤、有糸分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）抑制剤、ＲＮＡ重合酵素抑制剤、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤、ＤＮＡインターカレーター（ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）、ＤＮＡアルキレーター（ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｏｒ）、リボソーム抑制剤などの機能をすることができる化学療法剤、酵素的に機能できるたんぱく質毒素および放射線同位元素を含む。その例として、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、オリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、チュブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、テュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、カルボプラチン（パラプラチン）［Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）］、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニドラン（ｎｉｄｒａｎ）、窒素マスタード（メクロレタミン塩酸塩）［ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ＨＣＬ）］、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ミトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、トリメトキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ピノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、アリムタ（ａｌｉｍｔａ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）、ＣＣ１０６５、α−アマニチン（ａｌｐｈａ−ａｍａｎｉｔｉｎ）、他のエンジイン抗生物質（ｏｔｈｅｒ ｅｎｅｄｉｙｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）および植物毒素（ｐｌａｎｔ ｔｏｘｉｎ）であってもよい。また、化合物である場合、これの立体異性体、誘導体の形態も含む。また、前記オリスタチンは、モノメチルオリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）またはモノメチルオリスタチンＦ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0030】

本発明で、用語「免疫抑制剤」とは、免疫反応を減少させる効果を持つ任意の化合物を指し示す。これは免疫原因になる物質を拮抗したり、免疫反応に関与する物質（インターロイキン等のサイトカイン）を抑制できる物質を意味する。

【0031】

本発明の実施例では、代表的な抗体としてトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、およびグレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）をモデル抗体として使用して、これのＮ−末端に結合させる代表的な細胞毒性薬物としてモノメチルオリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびモノメチルオリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を各々使用した（実施例１および２）。ｐＨ６．０の条件でトラスツズマブとＭＭＡＦまたはＭＭＡＥを反応させてこれのＮ−末端に前記薬物が結合された抗体−薬物結合体を製造して、このような抗体−薬物結合体は、薬物結合後にも抗体の抗原結合能および細胞毒性効能が維持されることを確認した（実施例３〜５）。特に、このような抗体−薬物結合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト血清でもシステイン結合またはリシン結合を持つ他の抗体−薬物結合体（比較結合体）に比べて安定性が優れて、ラットを利用した薬物動態学実験でも優れた薬物動態を示した（実施例６）。また、抗癌動物モデルでも他の比較結合体に比べて抗癌能が優れており、その反面、体重、肝毒性、血液などで毒性数値を検出した時は毒性が対照群と類似する程度の低い毒性を示す結果であった（実施例７および８）。また、このような結果は、ＭＭＡＥのような他の薬物を使用するか、他の抗体、すなわちロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、およびグレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）を使用した場合にも抗原結合能、細胞毒性などの結果で類似する結果を示して（実施例９）、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に薬物を結合させる本発明に係わる技術が、抗体−薬物結合体の製造においてプラットフォーム技術になり得ることを確認した。

【0032】

さらに一つの態様として、本発明は、前記抗体−薬物結合体の製造方法を提供する。
前記抗体−薬物結合体およびこれの構成要素に対しては上述したとおりである。
具体的に、前記製造方法は、α−アミン基と反応して架橋できる反応基を含む薬物と抗体を反応させて、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端のα−アミン基に薬物を結合させる段階を含む。

【0033】

また、前記製造方法は、結合体を形成しなかった抗体および薬物を含む反応産物から抗体−薬物結合体を分離する段階をさらに含んでもよい。
具体的に前記製造方法で抗体と薬物は、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下、より具体的にはｐＨ５．５以上ｐＨ６．５以下で連結され、より具体的にはｐＨ６．０で連結される。上述したとおり、低いｐＨによって薬物、あるいはこれのリンカーに存在するアルデヒド基と抗体のＮ−末端α−アミンとの間の結合が特異的に起きる利点を持つ。

【0034】

前記抗体−薬物結合体の分離過程は、当業界に公知の様々な方法で実行でき、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー工程を介して実行できるが、特にこれに制限されるのではない。

【0035】

さらに一つの態様として、本発明は、前記抗体−薬物結合体を含む組成物を提供する。
前記組成物は、前記抗体−薬物結合体を含む癌または自己免疫疾患治療用薬学的組成物の形態を含む。この場合、前記抗体は、特に癌細胞表面抗原または自己免疫疾患が発生した組織表面抗原に特異的に結合するものであってもよい。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。

【0036】

前記抗体、薬物、癌細胞表面抗原および自己免疫疾患が発生した組織表面抗原は、上述したものと同様である。

【0037】

本発明で、用語「癌」とは、癌の種類を制限されずに含むが、その例として食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキン病、リンパ腫または多発性骨髄血液癌であり得る。前記癌細胞表面抗原に特異的な抗体の種類に応じて治療できる癌を選択することができる。

【0038】

本発明で、用語「自己免疫疾患」とは、本発明の抗体−薬物結合体が標的とする自己免疫疾患であればその種類に関係なく含まれるが、その例としてリューマチ性関節炎、全身性強皮症、全身紅斑性狼瘡、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット病、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、多発性筋炎、強直性脊椎炎、繊維組織炎または結節性多発性動脈炎であり得る。

【0039】

本発明で、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または、希釈剤をいう。液状溶液で製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌数、点滴液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、テキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分中１成分以上を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、浄菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。

【0040】

前記担体は、特にこれに制限されないが、経口投与時には結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などが使用でき、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用でき、局所投与用の場合には基剤、賦形剤、滑剤、保存剤等が使用できる。

【0041】

本発明の組成物の剤形は、上述したことのような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造されることができる。例えば、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤などで剤形化することができる。

【0042】

一方、製剤化に適合した担体、賦形剤又は希釈剤の例としては、ラクトーズ、テキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロフィーヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは、鉱物油などが使用できる。また、前記薬学組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。

【0043】

また、本発明に係る薬学組成物は、各々通常の方法により錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び座薬からなる群から選択されるいずれか一つの剤形をさらに含んでもよい。

【0044】

また、前記組成物は、薬学的分野で通常の方法により患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、好ましくはペプチド医薬物の投与に有用な製剤形態で剤形化させて当業界で通常使用する方法を利用して経口、または、皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹（腔）内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む非経口投与経路によって投与されるが、これらに限定されない。

【0045】

また、前記結合体は、生理食塩水または有機溶媒のように薬剤として許容された様々な伝達体（ｃａｒｒｉｅｒ）と混合して使用してもよく、安定性や吸水性を増加させるために、グルコース、スクロースまたはデキストランといった炭水化物、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）または、グルタチオンといった抗酸化剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、キレーティング物質（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、低分子たんぱく質または、他の安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）が薬剤として使用できる。

【0046】

さらに一つの態様として、本発明は、前記抗体−薬物結合体または前記組成物を利用して癌または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。前記抗体は、特に癌細胞表面抗原に特異的に結合するものであってもよく、前記薬物は、癌治療薬物であり得る。また、前記抗体は、自己免疫疾患が発生した組織表面抗原に特異的に結合するものであってもよく、前記薬物は自己免疫疾患治療薬物であり得る。

【0047】

前記抗体および薬物は前記説明したものと同様である。
前記方法は治療を必要とする個体に前記薬学的組成物を投与する段階を含む癌または自己免疫疾患を治療する方法であってもよく、この時、使用される抗体−薬物結合体および担体の種類は前記説明したものと同様である。

【0048】

前記組成物は、薬学的に有効な量で単一または多重投与されることができる。この時、組成物は液剤、散剤、エアゾール、カプセル剤、腸溶剤またはカプセル剤または座薬の形態で投与することができる。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これらに制限されない。しかし経口投与時、たんぱく質である抗体は消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。また、本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されてもよく従来の治療剤とは順次または同時に投与されてもよい。

【0049】

本発明の前記抗体−薬物結合体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本発明組成物の投与時間、投与経路および排出比率治療期間、使用された本発明の組成物と配合または同時使用される薬物を含んだ要素およびその他医学分野に良く知られた要素により定められる。

【0050】

さらに一つの態様として、本発明は、前記抗体−薬物結合体で製造するのに適した抗体を選別する方法を提供する。

【0051】

本発明に係わる抗体−薬物結合体の製造において、抗体のＮ−末端、具体的にはα−アミンに薬物を結合させて抗体−薬物結合体を効果的に製造するのに適した抗体を検索して選別することができる。

【実施例】

【0052】

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者にとって自明である。

【0053】

実施例１：モデル抗体の選定
本発明の抗体−薬物結合体に対して代表的に抗体−サイトトキシン結合体を製造するために、リンカーが存在するサイトトキシンが位置選択的（Ｓｉｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）に抗体に結合するのか確認するために、抗−ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗−ＣＤ５６抗体であるロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、抗−ＣＤ３０抗体であるブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、および抗−ＧＰＮＭＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＢ）抗体であるグレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）をモデル抗体として使用した。
前記抗体は、公知のアミノ酸配列情報を利用して発現ベクターを構築してＣＨＯ細胞株で安定発現株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）構築、あるいは臨時発現を介して発現させて培養、精製した。

【0054】

実施例２：トキシン（Ｔｏｘｉｎ）の合成
アルデヒドリンカーが末端に連結されたモノメチルオリスタチンＦ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ、ＭＭＡＦ）毒素を合成した（レゴケムバイオサイエンスまたはＸｃｅｓｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（図１）。
また、ＭＭＡＦ外に他の種類の毒素にも本発明に係わるＮ−末端コンジュゲーション方法の適用の可能性を確認するために、モノメチルオリスタチンＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）を合成して比較した（ＸｃｅｓｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）。

【0055】

実施例３：モノクローナル抗体−サイトトキシン結合体製造
３−１．本発明に係わるモノクローナル抗体−薬物結合体の製造
抗体を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ５．４９緩衝溶液に交換して、約７．１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。以後、アルデヒド反応基を持つリンカーと連結されているＭＭＡＦ（レゴケムバイオサイエンス、韓国）を５０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）溶媒に溶かして２．５ｍｇ／ｍＬになるようにした。それから最終７０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、抗体濃度５．０ｍｇ／ｍＬ、１４％ＤＭＳＯ、ＭＭＡＦ濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、抗体のα−アミンとＭＭＡＦのモル比が約１：２．３（または、抗体とＭＭＡＦのモル比が１：９）になるように用意された抗体溶液とＭＭＡＦ溶液を混合した。前記反応溶液にＮａＣＮＢＨ_３（Ｓｉｇｍａ社、米国）を最終２０ｍＭになるべく添加した後、４℃で１２時間徐々に撹はんさせながら反応させた。反応しなかった抗体およびリンカーと連結されたＭＭＡＦを分離するために、セファデックスＧ−２５カラム（ＧＥヘルスケア、米国）またはリソスフェニルカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｈｅ、ＧＥヘルスケア、米国）を使用した。このような過程で抗体一分子に約三つのＭＭＡＦ毒素が抗体のアミノ末端に選択的に結合された形態を製造した（図２）。

【0056】

３−２．対照群抗体−薬物結合体の製造
既存技術で製造した対照群抗体−薬物結合体は、システイン結合（Ｃｙｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，Ｔｈｉｏｍａｂ（ＨＣ−Ａ１１４Ｃ）＋Ｍａｌ−Ｃ６−ＭＭＡＦ）、チオール結合（Ｍａｌ−Ｃ６−ＭＭＡＦ）、およびリシン結合（ＳＭＣＣリンカー、ＳＨ−Ｃ６−ＭＭＡＦ）を介して実現した。
チオール結合抗体は、ｐＨ８．０でＴＣＥＰで抗体を還元させた後、Ｍａｌ−Ｃ４−ＭＭＡＦを入れて０℃で３時間反応させた。反応後システインを入れて追加反応させた後、反応を終結させて、Ｇ２５ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケア、米国）を使用して１Ｘ ＰＢＳで置換して反応を終了した。
システイン結合抗体は、精製された抗体のシステインを活性化させた後、Ｍａｌ−Ｃ６−ＭＭＡＦを入れてチオール結合抗体と類似した過程を行ってコンジュゲーションを行った。
リシン結合抗体の結合体は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社特許（ＷＯ２００５０３７９９２）を参考に製造した。まず抗体とＳＭＣＣリンカーを反応させて、反応しなかったＳＭＣＣをバッファー交換によって除去した。抗体−ＳＭＣＣ結合体は、さらにチオール基を含むＳＨ−Ｃ４−ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）と反応させて抗体−ＳＭＣＣ−ＭＭＡＦ結合体を製作した。
本発明に該当するα−アミン結合によって製造された抗体−サイトトキシン結合体を含んでまとめると、下記表１のとおりである。

【0057】

【表1】

前記方法によって製造した四つの物質を分析して、ＤＡＲ（Ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ）および結合位置を確認した。これは、ＬＣ−ＭＳおよびペプチドマッピングによって確認した。

【0058】

実施例４：物理化学的特性および生物学的活性
４−１．分子量分析
抗体−薬物結合体（Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ）の分子量をＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。使用した薬物（ＭＭＡＦ）の結合時分子量の理論値は、８２４．５４Ｄａで、トラスツズマブの分子量は１４５ｋＤａである。したがって、質量分析によって薬物の抗体結合の有無と抗体一分子に結合した薬物の個数も同時に確認することができた。
実施例３により製造したＴ−Ｎ−ＭＭＡＦに対してＤＡＲを決めるためにＬＣ／ＭＳで分子量を分析した。製造された試料は、ＰＮＧａｓｅＦで糖鎖を除去した後、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ２００ ＳＥＣカラムを介して分離後、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓシステムに試料を注入して質量を分析して、その結果を図３に示した。
その結果、図３に示した通り、薬物が一つも結合しなかった化学種（Ｄ０）から最高７個がついた化学種（Ｄ７）まで検出されて、付着した薬物の個数は各ピーク間分子量差が薬物の分子量と一致するか類似することに基づいて判断して、その相対含有量は下記の表２に示したとおりである。ＤＡＲは、各化学種の加重平均で求めて、その値はＤＡＲ＝３．２であった。

【0059】

【表2】

【0060】

４−２．薬物結合位置
製造されたＴ−Ｎ＿ＭＭＡＦ結合体で薬物が結合された位置は、ペプチドマッピングによって確認した。実施例３で製造したＤＡＲ３．２のＴ−Ｎ−ＭＭＡＦ ＡＤＣをＲａｐｉｇｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ）で変成させた後、トリプシン（Ｒｏｃｈｅ）で反応させて切片を作った。反応物は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＰＳＴ（ＢＥＨ） Ｃ１８カラムで分離して分離した各ピークはＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓ Ｑ／ＴＯＦシステムを介して質量分析してどの配列に該当するのか決めて、その結果を図４に示した。
その結果、図４に示した通り、コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されなかった母抗体では発見されないピークがクロマトグラムで検出された。質量分析結果、該当切片は重鎖Ｎ−末端、軽鎖Ｎ−末端、重鎖一部分、そしてその他の小さい切片と確認されてその比率は下の表３に示したとおりである。したがって、全薬物のうち７５％がＮ−末端に結合されていて、９２％が明確に定義できる三地点であるＮ−末端と重鎖−ＣＨ２領域に選択的に結合されていると言える。

【0061】

【表3】

【0062】

４−３．純度分析
製造したＴ−Ｎ−ＭＭＡＦ結合体の凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）含有量を確認するために、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により純度分析を進行した。ＴＳＫ−Ｇｅｌ３０００ＳＷＸＬカラムにＰＢＳを移動相にしてサイズ排除クロマトグラフィーを行ってＮｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ゲルを利用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。クロマトグラフィー結果について図５に示した。
その結果、図５に示したとおり、単量体の純度は９８．８％であって効力試験に適した純度を確認して、フラグメンテーションや交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）等は観察されなかった。

【0063】

４−４．抗原結合力
薬物結合後にも抗原結合力が維持されるかを確認するために、ピアコア^ＴＭ（Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ）を利用した表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を測定する方法で薬物が結合された抗体の抗原結合力を測定した。対照抗体としては、天然型抗体を使用した。抗原（ＥｒｂＢ２）結合力はピアコアＴ２００を利用して分析してＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア、米国）に各抗体をアミンカップリングキットを利用して固定化させた後、ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を５０、１６．６７、５．５６、１．８５、０．６２、０．２１ｎＭの濃度で３０μＬ／ｍｉｎ速度で注入してｏｎ／ｏｆｆ速度を測定、分析してｋＤ（Ｍ）を求めた。

【0064】

【表4】

その結果、前記表４にまとめられた通り、ＤＡＲと関係なく薬物結合後にも天然型抗体と類似の０．１ｎＭ程度の抗原結合力が維持されることを確認した。

【0065】

実施例５：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析
製造した抗体−サイトトキシン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能を確認するために、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞株であるＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、ＳＫＯＶ−３、ＪＩＭＴ−１細胞株を利用して抗−増殖アッセイを行った。各細胞を培養して１＊１０^５細胞／ｍＬでサスペンションして９６ウェルプレートに１００μＬずつローディングした。細胞培養器で３時間培養後、ウェル当り様々な濃度区間の抗体−サイトトキシン結合体を各々１００μＬずつ入れて細胞培養器で４日間培養する。ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１：１０で希釈して各ウェルに処理後、ホイルで包んで細胞培養器に２〜５時間反応させた後ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0066】

【表5】

その結果、前記表５に示した通り、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦの細胞毒性は計４種の癌細胞株全てにおいてＴ−Ｃ−ＭＭＡＦより若干低い細胞毒性を見せたが、生体内効力に影響を与えることができる有意な細胞毒性減少はなかった。

【0067】

実施例６：安定性試験
６−１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト血清安定性
実施例３で製造したＴ−Ｎ−ＭＭＡＦと天然型抗体、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｔｈｉｏｍａｂ−ＭＭＡＦなどの対照区を使用してＩｎ ｖｉｔｒｏヒト血清安定性試験を行った。抗体−サイトトキシン結合体を１ｘＰＢＳで緩衝液交換して３．３３ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、抗体−サイトトキシン結合体とヒト血清（Ｓｉｇｍａ，米国）の比率（ｖ／ｖ）を１：９で混合して３７℃で７日間静置した。７日後、保管試料はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥヘルスケア、米国）を使用して試料に含まれた抗体−サイトトキシン結合体以外のたんぱく質を除去して、ＬＣ／ＭＳ分析時干渉を最小化した。試験管条件でヒト血清での安定性はＬＣ／ＭＳで分析して結果を下の表６に示した。

【0068】

【表6】

その結果、前記表６に示した通り、７日保管後対照区である天然型抗体と比較してＴ−Ｎ−ＭＭＡＦの含有量およびＤＡＲ変化が観察されなかった。その反面、比較抗体−薬物結合体であるＴ−Ｃ−ＭＭＡＦおよびＴｈｉｏｍａｂ−ＭＭＡＦの場合は、全抗体含有量およびＤＡＲが減少したのを確認することができた。

【0069】

６−２．ラット薬物動力学（Ｒａｔ ＰＫ）
ラットＰＫ実験を介して生体内安定性を比較および確認した。３種ＡＤＣｓ（Ｔ−Ｋ−ＭＭＡＦ、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ）とトラスツズマブを２．５ｍｇ／ｋｇ用量で雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに１回静脈注射した。物質投与後、０．０５時間、０．５時間、１時間、６時間、２４時間、７２時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間後に採血した。血液内ＥｒｂＢ２に結合する全ての抗体を分析する全抗体（Ｔｏｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）分析法と薬物結合が維持されている抗体を分析する結合抗体（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）分析法をＥＬＩＳＡ方法で実施した。
全抗体の含有量は、下記のようなＥＬＩＳＡ法で分析した：
９６ウェルマイクロプレートをＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした後、試料をプレートに入れて３７℃の温度で１時間反応した。ＰＢＳＴを使用して固定されない全ての残余物を洗浄した後に、ＨＲＰ結合された抗−ヒトカッパ軽鎖抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｔ０４４０）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定する方法で試料内全抗体量を決めた。
結合抗体分析法は、前述した方法と類似する方法で進行して抗−ＭＭＡＦ抗体（ＹＯＵＮＧＩＮフロンティア）で９６−ウェルマイクロプレートをコーティングした後、試料をプレートに入れて３７℃の温度で１時間反応した。以後パイオチニル化されたＥｒｂＢ２ （ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、米国）、ストレプトアビジン−ＨＲＰ、ＴＭＢを順に入れて発色後４５０ｎｍで吸光度を測定して結合抗体の濃度を決めて、その結果を図６〜８および下記の表７に示した。

【0070】

【表7】

【0071】

実施例７：抗癌モデル動物で抗癌効果確認実験
互いに異なる技術で製作された３種のＡＤＣの効力と薬物−抗体比率（ＤＡＲ）による効果の差を比較するために、ヌードラットを利用した乳癌（ＨＣＣ １９５４）異種移植モデルでｉｎ ｖｉｖｏ効能テストを行った。
４種のＡＤＣ、すなわちＴ−Ｎ−Ｍ（ＤＡＲ約１．６、３．２）、Ｔ−Ｃ−Ｍ（ＤＡＲ約３．７）、Ｔ−Ｋ−Ｍ（ＤＡＲ約３．９）をＨＣＣ１９５４細胞が移植されたラットに各々１ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈投与した後、各試験群間の移植腫瘍成長抑制程度を比較して、その結果を下記の図９および１０に示した。
その結果、図９および１０に示した通り、本発明に係わる抗体は、対照群および比較抗体結果と比較して抗癌効果が優れている。

【0072】

実施例８：毒性試験
ＡＤＣの製造機法によって変わる安定性が毒性に影響を与えるのかＳＤラットを利用した単回投与毒性試験を行った。３種類のＡＤＣを各々高用量である２００ｍｐｋで静脈を介して単回投与した。比較群として単独抗体とＭＭＡＦも２００ｍｐｋの用量の露出に合わせて投与した。体重は、試験物質投与時点から実験終了時（１２日）まで毎日測定した。血液、生化学分析は、投与後５日に行われた。測定項目は、肝毒性と代表的な血液学的毒性確認のためにＡＳＴとＡＬＴ、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、血小板（Ｐｌａｔｅｌｅｔ）である。

【0073】

８−１．体重変化
体重変化に対する結果を図１１に示した。その結果、図１１に示した通り、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｔ−Ｋ−ＭＭＡＦ群は、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ群および残りの群に比べて明確な体重減少を見せた。特にＴ−Ｃ−ＭＭＡＦ投与群は、８日目以後一匹を除いたすべての個体が死んだ。

【0074】

８−２．生化学検査（肝毒性）
肝毒性誘発の有無を比較してみるために、投与後５日目に採取した血液に対して血液生化学分析を行った。Ａｕ４８０（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）化学分析器を利用して行ってそのうちの肝毒性の指標になるＡＳＴ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＬＴ（Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の役価を図１２に表示した。
その結果、図１２に示した通り、本発明に係わるＴ−Ｎ−ＭＭＡＦ群は、ＰＢＳを含んだ他の対照群と大きい違いが生じない変化を見せて急激かつ深刻な肝毒性を誘発していないことを観察することができた。しかし、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｔ−Ｋ−ＭＭＡＦ群では相当な増加が観察されて薬物投与による肝毒性の発生を観察することができた。

【0075】

８−３．血液学検査（好中球減少症、血小板減少症）
現在許可を受けたＡＤＣの主な臨床的毒性が血液学的特性で現れるので、投与後５日目に採取した血液に対してＨｅｍａｖｅｔ ９５０ ＦＳ血液学分析器（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，米国）を利用して血液学的分析を行って、その結果を図１３に表示した。
その結果、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）の数字の場合、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ投与群はＰＢＳを含んだ対照群に比べて著しい変化を見せなく急激で深刻な血液学的毒性は誘発されなかったと見られた。しかし、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ群では顕著な減少を見せてＴ−Ｋ−ＭＭＡＦ群の場合は顕著に増加した数値を見せたが、投与直後減少して再び上昇したと推定された。したがって、この二つの群に対しては薬物投与によって急激な血液学的毒性が誘発されたと結論を出すことができた。
血小板数値の場合、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＦ投与群は、ＰＢＳを含んだ他の対照群に比べて差を確認できる程度で小幅に減少した。しかし、Ｔ−Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｔ−Ｋ−ＭＭＡＦ群の場合は、顕著な減少を見せて投与物質によって急激な毒性が発生したことを見せた。

【0076】

実施例９：プラットフォーム機能確認
本発明の抗体−薬物結合体製造方法が、様々な抗体−薬物結合体に使用できるか可能性を確認した。これのために、様々な薬物または様々な抗体および様々な抗体形態に適用して機能を確認した。

【0077】

９−１．薬物種類による機能確認
様々な薬物に対して前記本発明の抗体−薬物結合体製造方法が使用できるかを確認するために、代表的にモデル抗体としてトラスツズマブ抗体を利用して、様々な薬物でＮ末端結合を進行した。具体的にはＭＭＡＦとＭＭＡＥの２種の薬物を使用してＭＭＡＦを使用して得た結果は、先立って、いくつかの実施例に記述した。実施例３で記述した方法に従って抗体−薬物結合体を製造して各々製造した抗体−薬物結合体を収得してＤＡＲ分析およびｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性、Ｒａｔ ＰＫを前述した実施例の方法により実施した。

【0078】

９−１−１．Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥの製造
実施例３の方法に従って、ＭＭＡＥ（ＸｃｅｓｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）と抗体との間の結合体を作って、ＤＡＲを決めるためにＬＣ／ＭＳで分子量を分析した結果を図１４および下記の表８に示した。

【0079】

【表8】

【0080】

９−１−２．Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥのヒト血清内安定性確認
実施例６の方法に従って、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥ ＡＤＣの血清内安定性を評価した。各試料でのＡＤＣの濃度は、ＥＬＩＳＡを利用した全抗体分析法により測定してＤＡＲの変化はＬＣ／ＭＳを利用して測定した。

【0081】

【表9】

【0082】

９−１−３．Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥのＲａｔ ＰＫ
製造されたＭＭＡＥ結合体の体内安定性を評価するために、ＳＤラットを利用したＰＫ測定試験を前述した実施例６と類似するように行った。それをまとめると、２．５ｍｇ／ｐｋのＡＤＣを雌ＳＤラットに投与して１２分、３０分、１時間、６時間、２４時間、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日後に採血してその濃度をＥＬＩＳＡ手法を使用して全抗体および結合抗体に分けて前述した方法で測定した。

【0083】

【表10】

その結果、図１５および前記表１０に示した通り、Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥは全抗体および結合抗体共に母抗体と差が大きく出ないプロファイルを見せてＭＭＡＥで抗体−薬物複合体を製作してもＭＭＡＦと類似する安定性を期待することができた。

【0084】

９−１−４．Ｔ−Ｎ−ＭＭＡＥの活性
製作されたＭＭＡＥの生物学的活性を確認するために、４種の腫瘍細胞株を使用してその活性を測定して、その結果を下記の表１１に示した。使用した方法は実施例５と類似している。

【0085】

【表11】

その結果、測定されたＩＣ_５０は０．３３〜３．７６ｎＭ範囲であり、これは文献上で報告されたトラスツズマブ／ＭＭＡＥチオール結合体のＢＴ４７４細胞株に対する活性（０．４７ｎＭ）と類似している。したがって、本発明に係わるα−アミンを利用したＮ末端選択的結合方法が異なる形態の薬物にも適用できると言える。

【0086】

９−２．抗体種類に応じた機能確認
様々な抗体に対して前記本発明の抗体−薬物結合体製造方法が使用できるか確認するために、３種の抗癌抗体（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ、Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）にＮ末端結合を進行して、ＤＡＲ分析およびｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を測定した。

【0087】

９−２−１．ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）
９−２−１−１．ブレンツキシマブ−Ｎ−ＭＭＡＦの製造
ＣＨＯ細胞株から発現させたブレンツキシマブを使用して、実施例３の方法によりブレンツキシマブ−Ｎ−ＭＭＡＦ（Ｂ−Ｎ−ＭＭＡＦ）を製造した。製造されたＡＤＣは、図１６および下記の表１２のようなＬＣ／ＭＳプロファイルを示して、Ｄ０−Ｄ６までの化学種が検出されて、ＤＡＲは２．９０と計算された。

【0088】

【表12】

【0089】

９−２−１−２．リガンド結合アッセイ
コンジュゲーション（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）により抗体の特性が変わるかを判断するために、抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ方法で測定、比較した。抗原であるＣＤ３０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を９６ウェルマイクロプレートに１００μｇコーティングした後、１％ＢＳＡで３７℃、１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、試料をプレートに入れて３７℃、１時間反応した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ツイン２０）で５回洗浄後、ＨＲＰコンジュゲーションされた抗−ヒトカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖抗体を１０００倍希釈してプレートに入れて３７℃、１時間反応した。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を入れて１０分発色した。１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図１７に示した。図１７で、円（○）で表示した線はコンジュゲーションを行わなかったブレンツキシマブに対する結果、四角形（◇）で表示した線はＤＡＲ２．９０のＢ−Ｎ−ＭＭＡＦに対する結果、そして三角形（△）で表示した線はＤＡＲ４．２２のＢ−Ｎ−ＭＭＡＦに対する結果を示したものである。結果からコンジュゲーション実行後にもＤＡＲ値に関係なく抗原に対する結合力は変わらないことが分かった。

【0090】

９−２−１−３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
製造した抗体−サイトトキシン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能を確認するために、ＣＤ３０発現細胞株であるＫａｒｐａｓ−２９９、Ｌ−５４０細胞株を利用して抗−増殖アッセイを行った。
具体的に、各細胞を培養して１＊１０^５細胞／ｍＬでサスペンションして９６ウェルプレートに１００μＬずつローディングした。細胞培養器で３時間培養後、ウェル当り様々な濃度区間の抗体−サイトトキシン結合体を各々１００μＬずつ入れて細胞培養器で４日間培養した。ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１：１０で希釈して各ウェルに処理後、アルミホイルで包んで細胞培養器に２〜５時間反応した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダーを利用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を下記の表１３に示した。

【0091】

【表13】

その結果、Ｋａｒｐａｓ−２９９、Ｌ−５４０二つの細胞株全てにおいて共に４０ｐＭ未満の細胞毒性を観測した。

【0092】

９−２−２．ロボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）
９−２−２−１．ロボツズマブ−Ｎ−ＭＭＡＦの製造
ＣＨＯ細胞から臨時発現したロボツズマブを使用して、前述した実施例３の方法によりロボツズマブ−Ｎ−ＭＭＡＦ（Ｌ−Ｎ−ＭＭＡＦ）を製造した。その結果、製造されたＡＤＣは図１８および下記表１４のようなコンジュゲーションプロファイルを見せて、ＤＡＲは３．３３と決められた。

【0093】

【表14】

９−２−２−２．リガンド結合アッセイ
コンジュゲーションによる抗体の特性変化があるのか調べるために、コンジュゲーション前後抗原に対する結合力が変わるかＥＬＩＳＡ方法を利用してテストした。抗原であるＣＤ５６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２４０８−ＮＣ−０５０）を９６ウェルマイクロプレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコードした後、１％ＢＳＡで３７℃、１時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、試料をプレートに入れて３７℃の温度で１時間反応した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲーションされた抗−ヒトカッパ軽鎖抗体を１０００倍希釈してプレートに入れて３７℃、１時間反応した。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を入れて１０分発色した。１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図１９に示した。図１９で円（○）で表示した線は薬物とコンジュゲーションしていない抗体に対する結果を、三角形（△）で表示した線はＤＡＲ２．５のＬ−Ｎ−ＭＭＡＦに対する結果を、四角形（◇）で表示した線はＤＡＲ３．３のＬ−Ｎ−ＭＭＡＦに対する結果を示したものである。その結果、ＤＡＲ程度に関係なくその結合力が維持されていることが分かった。

【0094】

９−２−２−２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
製造した抗体−サイトトキシン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能を確認するために、ＯＰＭ−２細胞株を利用して抗−増殖アッセイを行った。各細胞を培養して１＊１０^５細胞／ｍＬでサスペンションして９６ウェルプレートに１００μＬずつローディングした。細胞培養器で３時間培養後、ウェル当り様々な濃度区間の抗体−サイトトキシン結合体を各々１００μＬずつ入れて細胞培養器で４日間培養した。ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１：１０で希釈して各ウェルに処理後、ホイルで包んで細胞培養器に２〜５時間反応した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー機を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を表１５に示した。

【0095】

【表15】

その結果、前記表で確認できるように、本発明に係わるＬ−Ｎ−ＭＭＡＦ抗体は、４２〜５３ｎＭ水準の細胞毒性を示した。

【0096】

９−２−３．グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）
９−２−３−１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
製造した抗体−サイトトキシン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効能を確認するために、皮膚癌細胞株であるＳＫ−ＭＥＬ−２細胞株を利用して抗−増殖アッセイを行った。各細胞を培養して１＊１０^５細胞／ｍＬでサスペンションして９６ウェルプレートに１００μＬずつローディングした。細胞培養器で３時間培養後、ウェル当り様々な濃度区間の抗体−サイトトキシン結合体を各々１００μＬずつ入れて細胞培養器で４日間培養した。ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１：１０で希釈して各ウェルに処理後、ホイルで包んで細胞培養器に２〜５時間反応した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー機を利用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を表１６に示した。

【0097】

【表16】

その結果前記表で確認できるように本発明に係わるＧ−Ｎ−ＭＭＡＦは、３〜５ｎＭ水準の細胞毒性を示した。

【0098】

前記のような結果は、本発明で新しく確認した位置特異的、すなわち抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端アミノ酸残基に薬物を結合させた、新しいプラットフォームの抗体−薬物結合体が安定性が高いかつ抗体の標的特異性の阻害がなく、また結合された薬物によって何倍も抗体の治療ができることを示唆するものである。

【0099】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]