特許 6209638 リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物のモニタリング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6209638

(24)【登録日】2017年9月15日

(45)【発行日】2017年10月4日

(54)【発明の名称】リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物のモニタリング

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170925BHJP

   C08L 89/00 20060101ALI20170925BHJP

   C08L 71/02 20060101ALI20170925BHJP

   C08L 29/04 20060101ALI20170925BHJP

   C08L 5/02 20060101ALI20170925BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20170925BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20170925BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N15/00 F

   C08L89/00

   C08L71/02

   C08L29/04 B

   C08L5/02

   !C12Q1/68 AZNA

   !C12M1/00 A

【請求項の数】20

【外国語出願】

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-67727(P2016-67727)

(22)【出願日】2016年3月30日

(62)【分割の表示】特願2014-504020(P2014-504020)の分割

【原出願日】2012年4月6日

(65)【公開番号】特開2016-119912(P2016-119912A)

(43)【公開日】2016年7月7日

【審査請求日】2016年3月30日

(31)【優先権主張番号】61/472,919

(32)【優先日】2011年4月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512051941

【氏名又は名称】アリーア サン ディエゴ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ニアール エー． アームズ

(72)【発明者】

【氏名】オラフ ピーペンブルク

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン ジーン グリーンウッド

【審査官】 松岡 徹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５００８３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、および、第一の検出可能な標識を含む第一のオリゴヌクレオチドを含む、第一の集団の粒子と；
（ｂ）リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、および、第二の検出可能な標識を含む第二のオリゴヌクレオチドを含む、第二の集団の粒子と
を含む混合物、を含む組成物であって、ここで：
前記第一のオリゴヌクレオチドと前記第二のオリゴヌクレオチドとが異なるものであり、
前記第一の検出可能な標識と前記第二の検出可能な標識とが異なるものであり、そして
前記第一の集団の粒子と前記第二の集団の粒子とが、前記混合物において独立的に検出可能である、
組成物。

【請求項2】

前記一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質が、原核生物ＳＳＢタンパク質、または、マイオウイルス科ファージに由来するＳＳＢを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記リコンビナーゼが、ＲｅｃＡまたはＵｖｓＸタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質が、マイオウイルス科ファージに由来するｇｐ３２タンパク質、または、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記粒子が約０．５〜２０μｍのサイズである、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記粒子が約１〜１０μｍのサイズである、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記粒子が１０〜５０００粒子／ｎＬの範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記粒子が１００〜２０００粒子／ｎＬの範囲で存在する、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記第一の検出可能な標識および前記第二の検出可能な標識が蛍光マーカーであり、前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出可能である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記粒子が前記粒子からの蛍光を用いずに検出可能である、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記粒子が、顕微鏡、マイクロ流体デバイス、フローサイトメトリー、カメラ、または、電荷結合素子によって検出可能である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、前記第一のサブセットの粒子は、前記第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出可能であり、そして、前記第二のサブセットの粒子は、前記第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出可能である、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記混合物がさらに、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼローディングタンパク質、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ、核酸プローブ、逆転写酵素、および鋳型核酸のうちの１または複数種を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記混合物がさらに、クラウディング剤を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、および／または、フィコールを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００からなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記混合物がさらに、鋳型核酸を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記粒子が、１または複数種の前記リコンビナーゼ、前記一本鎖結合タンパク質、少なくとも１つの１または複数種のオリゴヌクレオチド、および、鋳型核酸を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項19】

前記第一の検出可能な標識または前記第二の検出可能な標識が、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、蛍光マーカー、クエンチャー、発色団、磁気粒子もしくはビーズ、酸化還元感受性成分、発光マーカー、放射性同位元素、または、結合ペアのメンバーを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記第一の検出可能な標識および前記第二の検出可能な標識が、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、および、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群より選択される蛍光マーカーである、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、核酸検出、増幅および定量化のための方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
特定の等温増幅方法は、僅か数分間以内で微量レベルから非常に高い検出可能レベルへと、特異的な仕方で鋳型（標的）核酸を増幅することができる。このような等温方法、例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（Recombinase Polymerase Amplification）（ＲＰＡ）は、核酸ベースの診断の適用を、ポイントオブケア検査ならびに実地および消費者試験等、新興分野へと広げることができる。この技術の等温的性質および広範な温度範囲により、使用者は、複雑な、電力を必要とする（power-demanding）器具の使用を回避
することができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

概要
本開示は、少なくとも一部には、ＲＰＡ混合物内における粒子の観察に基づく。一部の実施形態において、これらの粒子は、ＲＰＡ反応の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）および／またはタンパク質成分を包含し得る。この発見は、ＲＰＡに関する新たなモニタリングおよび検出方法を提供する。

【0004】

本開示はその一態様において、（ａ）リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および１または複数種の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上または全種）を包含する混合物を提供するステップと、（ｂ）反応混合物における粒子を検出するステップとを包含するプロセスを特色とする。一部の実施形態において、混合物は、クラウディング剤（crowding agent）、例
えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの間の分子量のＰＥＧ化合物またはこれらの組合せ）、ポリビニルアルコール、デキストランおよびフィコールのうちの１または複数種を包含する。一部の実施形態において、クラウディング剤は、反応混合物の重量または容量で１〜１２％の間の濃度、例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％および１２．０％から選択されるいずれか２つの濃度値の間の濃度で反応混合物中に存在する。

【0005】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、リコンビナーゼは、ＲｅｃＡまたはＵｖｓＸリコンビナーゼを包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、原核生物ＳＳＢタンパク質またはｇｐ３２タンパク質を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、１または複数種の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）のうち少なくとも１種は、検出可能な標識を包含する。

【0006】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、および１または複数種の核酸のうち少なくとも１種（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上または全種）を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。

【0007】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、混合物は、リコンビナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、リコンビナーゼローディングタンパク質（recombinase loading protein）、ＡＴＰ、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、
還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶ）、逆転写酵素、核酸プローブ、核酸プライマーおよび鋳型核酸（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上または全種）を包含する。

【0008】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＡＴＰ、ならびにプローブ、プライマー、一本鎖結合タンパク質、ｄｄＮＴＰ、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼおよび逆転写酵素の群から選択される１または複数種（例えば、２、３、４、５または６種）の追加的な薬剤を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。

【0009】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、約０．５〜２０μｍのサイズ、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８および２０μｍから選択されるほぼ任意の２サイズの間（例えば、約１〜１０μｍのサイズ）である。

【0010】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、およそ１０〜５０００粒子／ｎＬ、例えば、１ｎＬ当たり１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００および５０００粒子から選択されるいずれか２つの粒子数の間が検出される。

【0011】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、混合物における粒子を検出するステップは、顕微鏡、マイクロ流体デバイス、フローサイトメトリーおよびカメラのうちの１または複数の使用を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、電荷結合素子（charge-coupled detection）（ＣＣＤ）を用いて検出される。

【0012】

別の一態様において、本開示は、（ａ）リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応混合物を提供するステップと、（ｂ）反応混合物における核酸増幅産物の産生を可能にする条件下で反応混合物を維持するステップと、（ｃ）反応混合物における核酸増幅産物と関連する粒子を検出するステップとを包含するプロセスを特色とする。一部の実施形態において、検出ステップは、維持ステップを始めてから１０分間以内に（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、１．５または１分間以内に）行われる。

【0013】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、クラウディング剤、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの間の分子量のＰＥＧ化合物またはこれらの組合せ）、ポリビニルアルコール、デキストランおよびフィコールのうちの１または複数種を包含する。一部の実施形態において、反応混合物は、クラウディング剤としてポリエチレングリコール（例えば、本明細書に記載されているまたは本技術分野で公知のＰＥＧ化合物のいずれか）を含有する。一部の実施形態において、反応混合物は、クラウディング剤としてポリビニルアルコールを含有する。一部の実施形態において、クラウディング剤は、反応混合物の重量または容量で１〜１２％の間の濃度、例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％および１２．０％から選択されるいずれか２つの濃度値の間の濃度で反応混合物中に存在する。一部の実施形態において、クラウディング剤は、反応混合物における増幅の量を増加させるのに十分な濃度で反応混合物中に存在する。

【0014】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質および１または複数種の核酸のうち少なくとも１種（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上または全種）を包含する。

【0015】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼローディングタンパク質、ＡＴＰ、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶ）、一本鎖結合タンパク質、核酸プライマー、核酸プローブ、逆転写酵素および鋳型核酸（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上または全種）を包含する。

【0016】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質および１または複数種のオリゴヌクレオチドを含有する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。

【0017】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＡＴＰ、ならびにプローブ、プライマー、一本鎖結合タンパク質、ｄｄＮＴＰ、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼおよび逆転写酵素の群から選択される１または複数種（例えば、２、３、４、５または６種）の追加的な薬剤を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、反応混合物は、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸を包含する。あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、約０．５〜２０μｍのサイズ、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８および２０μｍから選択されるほぼ任意の２サイズの間（例えば、約１〜１０μｍのサイズ）である。

【0018】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、およそ１０〜５０００粒子／ｎＬ、例えば、１ｎＬ当たり１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００および５０００粒子から選択されるいずれか２つの粒子数の間が検出される。

【0019】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、検出ステップは、反応混合物における核酸増幅産物に関連する粒子の数または比率を決定するステップと、場合によって、これにより本来の混合物における鋳型核酸の濃度を決定または推定するステップを包含する。一部の実施形態において、検出ステップは、２種以上の別個の核酸増幅産物に関連する単一の粒子を検出するステップを包含する。

【0020】

別の一態様において、本開示は、（ａ）第一のリコンビナーゼ、第一の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および第一のオリゴヌクレオチドを包含する第一の集団の粒子と、（ｂ）第二のリコンビナーゼ、第二の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および第二のオリゴヌクレオチドを包含する第二の集団の粒子とを包含する組成物であって、第一および第二のオリゴヌクレオチドが異なる組成物を特色とする。一部の実施形態において、第一および第二のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、検出可能な標識を包含する。一部の実施形態において、第一および第二のオリゴヌクレオチドは、同一のまたは異なる検出可能な標識を包含する。第一および第二の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、互いに同一であっても異なっていてもよい。第一および第二のリコンビナーゼは、互いに同一であっても異なっていてもよい。

【0021】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、粒子は、約０．５〜２０μｍのサイズ、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８および２０μｍから選択されるほぼ任意の２サイズの間（例えば、約１〜１０μｍのサイズ）である。

【0022】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、およそ１０〜５０００粒子／ｎＬ、例えば、１ｎＬ当たり１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００および５０００粒子から選択されるいずれか２つの粒子数の間が、組成物中に存在する。

【0023】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、組成物は、クラウディング剤、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの間の分子量のＰＥＧ化合物またはこれらの組合せ）、ポリビニルアルコール、デキストランおよびフィコールのうちの１または複数種を包含する。一部の実施形態において、クラウディング剤は、反応混合物の重量または容量で１〜１２％の間の濃度、例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％および１２．０％から選択されるいずれか２つの濃度値の間の濃度で組成物中に存在する。

【0024】

あらゆる態様のうちの一部の実施形態において、組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼローディングタンパク質、ＡＴＰ、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶ）、核酸プローブおよび鋳型核酸（いずれかの組合せの）のうちの１または複数種（例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上または全種）をさらに包含する。

【0025】

一部の態様において、本開示は、本明細書に記載されている１または複数種のオリゴヌクレオチドおよびそれらの変種を包含する組成物を特色とする。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、核酸増幅（例えば、ＲＰＡ等、等温核酸増幅）の方法におけるプライマーおよび／または検出プローブとして用いることができる。本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドは、１または複数種の検出可能な標識を包含することができる。オリゴヌクレオチドが、１または複数種の検出可能な標識を包含するものとして開示されている場合、オリゴヌクレオチド内の同一のポジションまたは異なるポジションに（例えば、開示されているポジションの５’または３’の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０塩基以内のポジションに）代替標識を用いることができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１または複数の脱塩基部位模倣体（abasic site mimics）を包含することができる。オリゴヌクレオチドが、１または複数の脱塩基部位模倣体を包含する場合、代替脱塩基部位模倣体は、オリゴヌクレオチド内の同一のポジションまたは異なるポジションに（例えば、開示されているポジションの５’または３’の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０塩基以内のポジションに）包含され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドの変種は、開示されているオリゴヌクレオチド配列と比較して１２個以下（例えば、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下または１個以下）の挿入、欠失、置換および／または付加を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されているオリゴヌクレオチドの変種は、開示されているオリゴヌクレオチド配列に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％または９５％）同一の配列を有する。

【0026】

一部の実施形態において、粒子は、粒子からの蛍光を用いて検出される。

【0027】

ある特定の実施形態において、粒子は、粒子からの蛍光を用いずに検出される。

【0028】

一部の実施形態において、粒子は、粒子からの蛍光、位相差顕微鏡、発光検出、スペクトル（色）検出、磁気検出、放射性同位元素検出および／または電気化学的検出を用いて検出される。一部の実施形態において、粒子は、粒子からの蛍光、位相差顕微鏡、発光検出、スペクトル（色）検出、磁気検出、放射性同位元素検出および電気化学的検出のうち２種以上（例えば、２種、３種または４種）の組合せを用いて検出することができる。

【0029】

一部の実施形態において、一部の粒子は、これら粒子からの蛍光を用いて検出され、他の粒子は、これら他の粒子からの蛍光を用いずに検出される。例えば、粒子は、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を包含する。第一のサブセットの粒子は、第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され、第二のサブセットの粒子は、第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出される（例えば、位相差顕微鏡、発光検出、スペクトル（色）検出、磁気検出、放射性同位元素検出および／または電気化学的検出）。

【0030】

別の一態様において、本開示は、リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質およびオリゴヌクレオチドを包含する粒子の集団であって、一部の粒子がこれら粒子からの蛍光を用いて検出され、他の粒子がこれら他の粒子からの蛍光を用いずに検出される集団を特色とする。

【0031】

本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて用いるための、リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質およびオリゴヌクレオチドを包含するキットも提供される。本明細書に記載されている粒子または組成物のいずれかと、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うための説明書とを包含するキットも提供される。

【0032】

本明細書に開示されているプロセスおよび組成物は、核酸、例えば、細菌核酸、哺乳動物核酸、ウイルス核酸、真菌核酸または原生動物核酸の検出と、このような核酸に関連する障害または疾患の診断に用いることができる。

【0033】

本明細書において、粒子の「サイズ」は、粒子の最大断面寸法を意味する。

【0034】

本明細書において、「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１０（例えば、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００）塩基単位を含有する核酸ポリマーを意味する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、総計１ｋｂ、９００塩基単位、８００塩基単位、７００塩基単位、６００塩基単位、５００塩基単位、４００塩基単位、３００塩基単位、２００塩基単位または１００塩基単位未満を含有する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下または２０以下の塩基単位を有することができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８または２０塩基単位を有する。

【0035】

本明細書において、「サイトメトリー」は、粒子の特性を検出、可視化および解析するための方法および組成物を意味する。本明細書におけるこの用語は、細胞の存在を表さない。しかし、細胞の特性を検出、可視化および解析するために用いられる方法および組成物は、本明細書に記載されている粒子に適用することができる。

【0036】

本明細書において、「脱塩基部位模倣体」は、糖または修飾糖部分（例えば、グルコースまたはデオキシグルコース）が存在し、糖または修飾糖部分の１’炭素が、環状塩基構造（例えば、アデニン、グアニン、シトシン（cytsosine）、チミン、ウラシルまたはこ
れらの修飾バージョン）と共有結合していない、核酸ポリマー内のサブユニットポジションを意味する。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の１’炭素は、水素（例えば、テトラヒドロフラン）と共有結合している。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の１’炭素は、環状塩基構造に存在しない別の炭素と共有結合している。一部の実施形態において、糖または修飾糖部分の１’炭素は、非環状リンカー構造と共有結合している。一部の実施形態において、脱塩基部位模倣体は、脱塩基部位との構造的類似性（即ち、糖に付着した巨大な（bulky）塩基の化学基（base group）の欠如）により、脱塩基部位模倣体をプロセシングおよび修飾する酵素により認識される。

【0037】

本明細書に記載されているものと同様または均等の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料を下に記す。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全内容を援用する。矛盾が生じる場合、定義を包含する本明細書が調節を行うであろう。加えて、材料、方法および実施例は、単なる説明を目的とし、限定を目的とするものではない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質および１または複数種のオリゴヌクレオチドを含む混合物を提供するステップと、
（ｂ）該混合物における粒子を検出するステップと、
を含むプロセス。
（項目２）
前記混合物が、クラウディング剤を含む、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストランおよび／またはフィコールを含む、項目２に記載のプロセス。
（項目４）
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコールを含む、項目２に記載のプロセス。
項目５）
前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの間の分子量のＰＥＧ化合物およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３または４に記載のプロセス。
（項目６）
前記クラウディング剤が、前記混合物の重量または容量で１〜１２％の間の濃度で前記混合物中に存在する、項目２〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）
前記リコンビナーゼが、ＲｅｃＡまたはＵｖｓＸタンパク質を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目８）
前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、原核生物ＳＳＢタンパク質またはｇｐ３２タンパク質を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目９）
前記１または複数種のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種が、検出可能な標識を含む、項目１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１０）
前記粒子が、前記リコンビナーゼ、前記一本鎖結合タンパク質および前記１または複数種のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種のうちの１または複数種を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１１）
前記混合物が、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼローディングタンパク質、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、還元剤、クレアチンキナーゼ、ヌクレアーゼ、核酸プローブ、逆転写酵素および鋳型核酸のうちの１または複数種をさらに含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１２）
前記粒子が、約１〜１０μｍのサイズである、項目１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１３）
前記混合物における粒子を検出するステップが、顕微鏡の使用を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１４）
前記混合物における粒子を検出するステップが、マイクロ流体デバイスの使用を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１５）
前記混合物における粒子を検出するステップが、フローサイトメトリーの使用を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１６）
前記粒子が、約０．５〜２０μｍのサイズである、項目１〜１０または１２〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１７）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出される、項目１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１８）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１９）
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２０）
（ａ）リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応混合物を提供するステップと、
（ｂ）該反応混合物を、該反応混合物における核酸増幅産物の産生を可能にする条件下で維持するステップと、
（ｃ）該反応混合物における該核酸増幅産物に関連する粒子を検出するステップと、
を含むプロセス。
（項目２１）
前記検出するステップが、前記維持するステップを始めてから１０分間以内に行われる、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）
前記反応混合物がクラウディング剤を含む、項目２０または２１に記載のプロセス。
（項目２３）
前記検出するステップが、核酸増幅産物に関連する粒子の数または比率を決定するステップを含む、項目２０〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２４）
前記検出するステップが、２種以上の別個の核酸増幅産物に関連する単一粒子を検出するステップを含む、項目２０〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２５）
前記粒子が、約０．５〜２０μｍのサイズである、項目２０〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２６）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出される、項目２０〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２７）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目２０〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２８）
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出される、項目２０〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２９）
（ａ）第一のリコンビナーゼ、第一の一本鎖結合タンパク質および第一のオリゴヌクレオチドを含む第一の集団の粒子と、
（ｂ）第二のリコンビナーゼ、第二の一本鎖結合タンパク質および第二のオリゴヌクレオチドを含む第二の集団の粒子と、
を含む組成物であって、該第一のオリゴヌクレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドとが異なる組成物。
（項目３０）
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方が、検出可能な標識を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドが、異なる検出可能な標識を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３２）
前記粒子が、約０．５〜２０μｍのサイズである、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いて検出され得る、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記粒子が、前記粒子からの蛍光を用いずに検出され得る、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記粒子が、第一のサブセットの粒子および第二のサブセットの粒子を含み、該第一のサブセットの粒子が、該第一のサブセットの粒子からの蛍光を用いて検出され得、該第二のサブセットの粒子が、該第二のサブセットの粒子からの蛍光を用いずに検出され得る、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の組成物。

【0038】

本発明の他の特色および利点は、次の発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１Ａ〜１Ｃは、粒子を包含する混合物の１視野を表す顕微鏡写真である。スケールバーは、１００μｍを表示する。１Ａ；微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）。１Ｂ；蛍光。１Ｃ；重ね合わせ。

【図2】図２Ａ〜２Ｃは、粒子および鋳型核酸を包含する混合物の１視野を表す顕微鏡写真である。スケールバーは、１００μｍを表示する。２Ａ；ＤＩＣ。２Ｂ；蛍光。２Ｃ；重ね合わせ。

【図3】図３Ａ〜３Ｈは、表示濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する混合物を表す蛍光顕微鏡写真である。

【図4】図４Ａ〜４Ｆは、粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真である。４Ａおよび４Ｂは、標準混合物である。４Ｃおよび４Ｄは、ＵｖｓＸを除いた標準混合物である。４Ｅおよび４Ｆは、ｇｐ３２を除いた標準混合物である。４Ａ、４Ｃ、４Ｅ；ＤＩＣ。４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ；蛍光。

【図5】図５Ａ〜５Ｈは、粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真である。５Ａおよび５Ｂは、ＵｖｓＹを除いてある以外は４Ａおよび４Ｂと同様の標準混合物である。５Ｃおよび５Ｄは、ポリメラーゼを除いた標準混合物である。５Ｅおよび５Ｆは、クレアチンキナーゼを除いた標準混合物である。５Ｇおよび５Ｈは、エキソヌクレアーゼＩＩＩを除いた標準混合物である。５Ａ、５Ｃ、５Ｅ、５Ｇ；ＤＩＣ。５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ、５Ｈ；蛍光。

【図6】図６Ａ〜６Ｃは、混合物を表す顕微鏡写真のセットである。６Ａ；完全混合物を示す２視野。６Ｂ；ｇｐ３２およびＵｖｓＹを除いた完全混合物を示す２視野。６Ｃ；ｇｐ３２、ＵｖｓＹおよびＥｍｉｘ（５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ）を除いた完全混合物を示す２視野。各セット：上はＤＩＣ；下は蛍光。

【図7】図７Ａ〜７Ｆは、２種の標識オリゴヌクレオチドにより調製された粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真である。７Ａ；Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ蛍光。７Ｂ；重ね合わせＤＩＣおよびＴｅｘａｓ ｒｅｄ。７Ｃ；ＦＡＭ蛍光。７Ｄ；重ね合わせＤＩＣおよびＦＡＭ。７Ｅ；ＤＩＣ。７Ｆ；重ね合わせＴｅｘａｓ ｒｅｄおよびＦＡＭ。

【図8】図８Ａ〜８Ｆは、独立的に調製された後に混合された２種の標識オリゴヌクレオチドによる２セットの粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真である。８Ａ；Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ蛍光。８Ｂ；重ね合わせＤＩＣおよびＴｅｘａｓ ｒｅｄ。８Ｃ；ＦＡＭ蛍光。８Ｄ；重ね合わせＤＩＣおよびＦＡＭ。８Ｅ；ＤＩＣ。８Ｆ；重ね合わせＴｅｘａｓ ｒｅｄおよびＦＡＭ。

【図9】図９は、増幅反応における粒子を表す顕微鏡写真の時間経過である。

【図10】図１０は、増幅反応における粒子を表す顕微鏡写真の時間経過である。

【図11】図１１は、ＤＩＣ／ＦＡＭおよびＤＩＣ／Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄにより可視化された、増幅反応における粒子を表す顕微鏡写真の時間経過である。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｄは、２０×拡大率における粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真のセットである。１２Ａ；Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを包含する混合物。１２Ｂ；ＵｖｓＹなしでＴ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸを包含する混合物。１２Ｃ；Ｔ６ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを包含する混合物。１２Ｄ；ＵｖｓＹなしでＴ６ ＵｖｓＸを包含する混合物。各セット：上はＤＩＣ；下は蛍光。

【図13】図１３Ａ〜１３Ｄは、４０×拡大率における粒子を包含する混合物を表す顕微鏡写真のセットである。１３Ａ；Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを包含する混合物。１３Ｂ；ＵｖｓＹなしでＴ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸを包含する混合物。１３Ｃ；Ｔ６ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹを包含する混合物。１３Ｄ；ＵｖｓＹなしでＴ６ ＵｖｓＸを包含する混合物。各セット：上はＤＩＣ；下は蛍光。

【図14】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）、ＵｖｓＹなしのＴ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）、Ｔ６ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（Ｔ６ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）ならびにＵｖｓＹなしのＴ６ ＵｖｓＸ（Ｔ６ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）を包含する混合物における増幅反応を表す線グラフである。１４Ａ；５００コピーの鋳型。１４Ｂ；５０コピーの鋳型。

【図15】図１５は、Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）、ＵｖｓＹなしのＴ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）、Ｔ６ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（Ｔ６ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）ならびにＵｖｓＹなしのＴ６ ＵｖｓＸ（Ｔ６ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）を包含する混合物における増幅反応を表す線グラフである。

【図16】図１６Ａ〜１６Ｂは、Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）、ＵｖｓＹなしのＴ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ（ｓｔｄ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）、Ｔ６ ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ（Ｔ６ ＵｖｓＸ＋ＵｖｓＹ）ならびにＵｖｓＹなしのＴ６ ＵｖｓＸ（Ｔ６ ＵｖｓＸ−ＵｖｓＹ）を包含する混合物における増幅反応を表す線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0040】

詳細な説明
顕微鏡観察において、ＲＰＡ混合物内に粒子の外観を呈する構造体が観察された。ＲＰＡ核酸増幅反応の進行において、粒子は、活性増幅の座位と関連する。

【0041】

観察された粒子は通常、サイズ１〜１０μｍの範囲内であり、およそ１００〜５００粒子／ｎＬで存在していた。粒子は、混合物中に存在するオリゴヌクレオチドを含有することが判明した。粒子の形成は、マグネシウムの存在を必要としなかった。しかし、リコンビナーゼまたは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の非存在下で形成された粒子は、変化した形態を有していた。リコンビナーゼローディングタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼまたはエキソヌクレアーゼ等、他の薬剤の非存在下における粒子の形成は、粒子形態に有意に影響しなかった。その上、粒子形成は、クラウディング剤の存在下においてより効率的であった。

【0042】

粒子は、溶液において相対的に安定的であることが観察された。別々の集団の粒子を混合し、混合後の一定期間別個のまま維持することができた。

【0043】

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
ＲＰＡは、核酸を増幅（例えば、等温増幅）するための方法である。一般に、ＲＰＡの第一のステップにおいて、リコンビナーゼが、第一および第二の核酸プライマーと接触されて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーを形成する。一般に、第二のステップにおいて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーが、二本鎖鋳型核酸と接触されて、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの３’端が所定のＤＮＡ分子において互いに向かい合うよう方向づけられるように、鋳型核酸の第一の鎖の第一の部分に第一の二本鎖構造と、鋳型核酸の第二の鎖の第二の部分に第二の二本鎖構造とを形成する。一般に、第三のステップにおいて、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーの３’端が、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、第一および第二の二本鎖核酸ならびに第一および第二の置き換えられた核酸鎖を生成する。一般に、第二および第三のステップは、所望の程度の増幅が達成されるまで反復することができる。

【0044】

本明細書に記載されている通り、ＲＰＡは、オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型二本鎖ＤＮＡにおける相同配列とペアリングさせることのできる、リコンビナーゼとして公知の酵素を利用する。このようにして、ＤＮＡ合成は、鋳型二本鎖ＤＮＡにおける規定のポイントに向けられる。２種以上の配列特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマーを用いることにより、鋳型核酸が存在すれば指数関数的増幅反応が開始される。反応は急速に進行し、ほんの数コピーの鋳型ＤＮＡから検出可能レベルに増幅された産物へと、数分間以内に鋳型二本鎖ＤＮＡ内に存在する配列の特異的増幅を生じる。ＲＰＡ方法は、例えば、これら全て本明細書に参照によりその内容を援用する米国特許第７，２７０，９８１号明細書、米国特許第７，３９９，５９０号明細書、米国特許第７，６６６，５９８号明細書、米国特許第７，４３５，５６１号明細書、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号明細書および国際公開第２０１０／１４１９４０号パンフレットにおいて開示されている。

【0045】

ＲＰＡ反応液は、相補的基質とペアリングしたオリゴヌクレオチドの３’端からのＤＮＡ合成を支持するタンパク質および他の因子、ならびにシステムの組換えエレメントの活性を支持するそれらのもののブレンドを含有する。一部の実施形態において、ＲＰＡ反応液は、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、プライマーおよび鋳型核酸の混合物を含有する。一部の実施形態において、ＲＰＡ反応液は、次のうちの１または複数種を包含することができる（いずれかの組合せで）：少なくとも１種のリコンビナーゼ、少なくとも１種の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、クラウディング剤、バッファー、還元剤、ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ、少なくとも１種のリコンビナーゼローディングタンパク質、第一のプライマーと場合によって第二のプライマー、プローブ、逆転写酵素および鋳型核酸分子、例えば、一本鎖（例えば、ＲＮＡ）または二本鎖核酸。一部の実施形態において、ＲＰＡ反応液は、例えば、逆転写酵素を含有することができる。ＲＰＡ反応混合物の追加的な非限定的な例は、本明細書に記載されている。

【0046】

一部の実施形態において、ＲＰＡ反応液は、ＵｖｓＸタンパク質、ｇｐ３２タンパク質およびＵｖｓＹタンパク質を含有することができる。本明細書に記載されているプロセス、組成物または粒子のいずれかは、例えば、ＵｖｓＸタンパク質、ｇｐ３２タンパク質およびＵｖｓＹタンパク質を部分的に含有することができる。例えば、本明細書に記載されているプロセス、組成物または粒子のいずれかは、Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ、Ｒｂ６９ ｇｐ３２およびＲｂ６９ ＵｖｓＹを部分的に含有することができる。

【0047】

一部の実施形態において、ＲＰＡ反応液は、ＵｖｓＸタンパク質およびｇｐ３２タンパク質を含有することができる。例えば、本明細書に記載されているプロセス、組成物または粒子のいずれかは、例えば、ＵｖｓＸタンパク質およびｇｐ３２タンパク質を部分的に含有することができる。

【0048】

ＲＰＡ反応液のタンパク質成分の１種は、原核生物、ウイルスまたは真核生物起源から生じる得るリコンビナーゼである。例示的なリコンビナーゼとして、ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸ（例えば、任意の種から得られるＲｅｃＡタンパク質またはＵｖｓＸタンパク質）ならびにこれらの断片または変異体、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸタンパク質は、任意の種から得ることができる。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸ断片または変異体タンパク質は、利用できるＲｅｃＡおよびＵｖｓＳタンパク質および核酸配列ならびに分子生物学的技法（例えば、米国特許第８，０７１，３０８号明細書に記載されているＵｖｓＸの変異型を参照）を用いて産生することもできる。例示的なＵｖｓＸタンパク質として、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒファージ１３３、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ２５、Ｖｉｂｒｉｏファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３およびファージＬＺ２等、マイオウイルス科ファージに由来するＵｖｓＸタンパク質が挙げられる。追加的な例示的なリコンビナーゼタンパク質として、古細菌ＲＡＤＡおよびＲＡＤＢタンパク質ならびに真核生物（例えば、植物、哺乳動物および真菌）Ｒａｄ５１タンパク質（例えば、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３およびｒｅｃＡ）が挙げられる（例えば、Linら、Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A.、１０３巻:１０３２８〜１０３３３頁、２００６年を参照）。

【0049】

本開示のいずれかのプロセスにおいて、リコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）は、変異体またはハイブリッドリコンビナーゼとなり得る。一部の実施形態において、変異体ＵｖｓＸは、Ｒｂ６９ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１種の変異を包含するＲｂ６９ ＵｖｓＸであり、変異は、（ａ）ポジション６４におけるヒスチジンではないアミノ酸、ポジション６４におけるセリン、Ｃ末端における１または複数個のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１または複数個のアスパラギン酸残基の付加およびこれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態において、変異体ＵｖｓＸは、Ｔ６ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１個の変異を有するＴ６ ＵｖｓＸであり、変異は、（ａ）ポジション６６におけるヒスチジンではないアミノ酸、（ｂ）ポジション６６におけるセリン、（ｃ）Ｃ末端における１または複数個のグルタミン酸残基の付加、（ｄ）Ｃ末端における１または複数個のアスパラギン酸残基の付加および（ｅ）これらの組合せからなる群から選択される。ハイブリッドリコンビナーゼタンパク質を用いる場合、ハイブリッドタンパク質は、例えば、異なるＵｖｓＸ種に由来するアミノ酸配列を包含する少なくとも１個の領域を包含するＵｖｓＸタンパク質となり得る。領域は、例えば、ＵｖｓＸのＤＮＡ結合ループ−２領域となり得る。

【0050】

その上、１または複数種の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、反応において進行中の様々な交換反応において核酸を安定化することができる。１または複数種の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、任意の種、例えば、原核生物、ウイルスまたは真核生物種に由来またはそれから得ることができる。非限定的な例示的な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢならびに、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒファージ１３３、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ２５、Ｖｉｂｒｉｏファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３およびファージＬＺ２等のマイオウイルス科ファージに由来する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の追加的な例として、Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ａｌｉｄｅ＿２０４７、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＢｔｈａＢ＿３３９５１、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｐａｌｌｅｎｓ ＨＭＰＲＥＦ９１４４＿０１２４および真核生物一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質複製タンパク質Ａが挙げられる。

【0051】

ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物または原核生物ポリメラーゼとなり得る。真核生物ポリメラーゼの例として、ｐｏｌ−アルファ、ｐｏｌ−ベータ、ｐｏｌ−デルタ、ｐｏｌ−イプシロンおよびこれらの変異体もしくは断片またはこれらの組合せが挙げられる。原核生物ポリメラーゼの例として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（例えば、クレノー断片）、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼＩ大型断片、Ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ
Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｐｏｌ Ｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＶおよびこれらの変異体もしくは断片またはこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。一部の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置き換え特性、例えば、クラスＩの原核生物ポリメラーゼの大型断片またはｐｏｌ Ｖを有する。

【0052】

本開示のプロセスのいずれかは、クラウディング剤の存在下で行うことができる。一部の実施形態において、クラウディング剤は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）およびアルブミンのうちの１または複数種を包含することができる。一部の実施形態において、クラウディング剤は、２００，０００ダルトン未満の分子量を有する。さらに、クラウディング剤は、例えば、約０．５％〜約１５％重量対容量（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。

【0053】

リコンビナーゼローディングタンパク質を用いる場合、リコンビナーゼローディングタンパク質は、原核生物、ウイルスまたは真核生物起源のものとなり得る。例示的なリコンビナーゼローディングタンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＯ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＲ、ＵｖｓＹおよびこれらの変異体もしくは断片またはこれらの組合せが挙げられる。例示的なＵｖｓＹタンパク質として、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒファージ１３３、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ２５、Ｖｉｂｒｉｏファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３およびファージＬＺ２等、マイオウイルス科ファージに由来するＵｖｓＹタンパク質が挙げられる。本開示のプロセスのいずれかにおいて、リコンビナーゼローディング剤は、マイオウイルス科ファージに由来することができる。マイオウイルス科ファージは、例えば、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒファージ１３３、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、Ａｅｒｏｍｏｎａｓファージ２５、Ｖｉｂｒｉｏファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３またはファージＬＺ２となり得る。

【0054】

さらに、本開示のプロセスのいずれかは、ブロックプライマー（blocked primer）に
より行うことができる。ブロックプライマーは、ポリメラーゼによる延長を行うことができないプライマーである。ブロックプライマーを用いる場合、非ブロック化剤を用いてプライマーを非ブロック化させて、延長させることができる。非ブロック化剤は、プライマーからブロッキング基を開裂させることのできるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとなり得る。例示的な非ブロック化剤として、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶが挙げられる。

【0055】

一部の実施形態において、本開示のプロセスは、リコンビナーゼを、第一および第二の核酸プライマーならびに１または複数個の非相補的または修飾内部残基を含有する第三の伸長ブロックプライマーと接触させて、第一、第二および第三のヌクレオプロテインプライマーを形成するステップと；第一のヌクレオプロテインプライマーおよび第二のヌクレオプロテインプライマーの３’端が同一標的核酸分子において互いに向かい合うよう方向づけられ、標的核酸の第三の部分が第一および第二のプライマーの５’端の間に存在するように、第一および第二のヌクレオプロテインプライマーを二本鎖標的核酸に接触させて、第一のヌクレオプロテインプライマーおよび第一の鎖の第一の部分におけるＤＮＡの第一の鎖の間に第一の二本鎖構造を形成（Ｄループを形成）し、第二のヌクレオプロテインプライマーおよび第二の鎖の第二の部分におけるＤＮＡの第二の鎖の間に第二の二本鎖構造を形成（Ｄループを形成）するステップと；１または複数種のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより、第一のヌクレオプロテインプライマーおよび第二のヌクレオプロテインプライマーの３’端を伸長させて、第一の増幅された標的核酸を生成するステップと；第一の増幅された標的核酸を第三のヌクレオプロテインプライマーに接触させて、ヌクレアーゼの存在下で第一の増幅された標的核酸に第三の二本鎖構造を形成（Ｄループを形成）するステップであって、ヌクレアーゼが、第三の二本鎖構造を形成した後でのみ非相補的内部残基を特異的に開裂して、第三の５’プライマーおよび第三の３’伸長ブロックプライマーを形成するステップと；１または複数種のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより第三の５’プライマーの３’端を伸長させて、第二の二本鎖増幅された核酸を生成するステップとを包含することができる。

【0056】

一部の実施形態において、プロセスは、二本鎖標的核酸内に存在する第一の部分を増幅して、第一の増幅された産物を生成するための第一および第二のプライマーと、第一の増幅された産物内に存在する近接配列を増幅するために用いることのできる少なくとも１種の追加的なプライマー（例えば、第一の増幅された産物内に存在する近接配列を増幅するために、例えば、第一または第二のプライマーと組み合わせて用いることのできる、追加的な第三のプライマー）とを包含する。一部の実施形態において、プロセスは、二本鎖標的核酸内に存在する第一の部分を増幅して、第一の増幅された産物を生成するための第一および第二のプライマーと、第一の増幅された産物内に存在する近接配列を増幅するために用いることのできる第三および第四のプライマーを包含する。

【0057】

一部の実施形態において、プロセスは、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーとを包含することができる。一部の実施形態において、プロセスは、１または複数種の非相補的または修飾内部残基（例えば、ヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ｆｐｇ、Ｎｔｈ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＭ、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＭＵＧ、ヒトＭＵＧ、ヒトＯｇｇ１、脊椎動物Ｎｅｉ様（Ｎｅｉｌ）グリコシラーゼ、Ｎｆｏ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはウラシルグリコシラーゼにより認識されて開裂され得る１または複数種の非相補的または修飾内部残基）を含む少なくとも１種のブロックプライマーを包含することができる。プロセスに包含され得る核酸（例えば、プライマーおよびプローブ）の追加的な非限定的な例は、本明細書に記載されている。

【0058】

一部の実施形態において、プロセスは、ヌクレアーゼ抵抗性のプライマーまたはプローブ、例えば、少なくとも１個の（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７または８個の）ホスホロチオエート結合を含有するプライマーまたはプローブを包含することができる。

【0059】

本開示のプロセスのいずれかは、ヘパリンの存在下で行うことができる。ヘパリンは、非特異的プライマーノイズのレベルを低下させ、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＶの能力を増加させて、３’ブロッキング基または末端残基を組換え中間体から急速に削る薬剤として作用し得る。

【0060】

反応の特定の種類に基づき、混合物は、バッファー、塩およびヌクレオチドのうちの１または複数種を含有することもできる。反応混合物は、反応に適した特異的な温度または温度範囲で維持することができる。一部の実施形態において、温度は、８０℃以下、例えば、７０℃以下、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、３７℃以下、３０℃以下または室温以下で維持される。一部の実施形態において、温度は、４℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、室温以上、２５℃以上、３０℃以上、３７℃以上、４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上または７０℃以上で維持される。一部の実施形態において、反応混合物は、室温または外界温度で維持される。一部の実施形態において、混合物のセ氏目盛り温度は、反応時間を通して２５％未満（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満）変動する、および／または、混合物の温度は、反応時間を通して１５℃未満（例えば、１０℃未満、５℃未満、２℃未満または１℃未満）変動する。

【0061】

例えば、リアルタイムにおける増幅の検出は、本技術分野で公知のいずれかの方法により行うことができる。一部の実施形態において、１または複数種のプライマーまたはプローブ（例えば、分子ビーコンプローブ）は、１または複数種の検出可能な標識で標識される。例示的な検出可能な標識として、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、蛍光マーカー、クエンチャー、発色団、磁気粒子またはビーズ、酸化還元感受性成分（例えば、電気化学的活性を有する成分）、発光マーカー、放射性同位元素（放射性ヌクレオチド（radionucleotide）等）および結合ペアのメンバーが挙げられる。より具体的な例として、フ
ルオレセイン、フィコビリンタンパク質、テトラエチルローダミンおよびベータ−ガラクトシダーゼが挙げられる。結合ペアは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン（strepavidin）、抗原／抗体、リガンド／受容体およびアナログならびに結合ペア
の変異体を包含し得る。

【0062】

検出可能な標識として蛍光クエンチャーも考慮されることに留意されたい。例えば、蛍光クエンチャーを蛍光色素と接触させて、クエンチの量を検出することができる。

【0063】

粒子検出
粒子の検出およびモニタリングは、いずれかの適切な方法を用いて行うことができる。例示的な方法として、顕微鏡、光散乱、フローサイトメトリーおよびマイクロ流体方法が挙げられる。

【0064】

一部の実施形態において、粒子は、顕微鏡、例えば、微分干渉コントラスト法または蛍光顕微鏡を用いて検出して、高い拡大率で粒子を直接的に観察することができる。コンピュータの支援により、顕微鏡画像を自動的に得て、解析することができる。その上、顕微鏡は、粒子を含有する混合物の少なくとも一部の連続的なまたは高頻度のモニタリングを可能にすることができる。

【0065】

一部の実施形態において、粒子は、フローサイトメトリーを用いて検出することができる。フローサイトメトリーにおいて、１または複数の光ビーム、例えば、単一波長のそれぞれは、流体の水力学的に集束した流れに向けられる。ビームを通過する懸濁した粒子は光を散乱し、粒子に存在するまたは粒子に付着する蛍光化学物質が励起され得る。散乱されたおよび／または蛍光の光は、その光から粒子サイズおよび蛍光に関する情報を決定できるデバイス内の検出器により取得される。現代のフローサイトメーターは、「リアルタイム」で毎秒数千個の粒子を解析することができ、指定の特性を有する粒子を能動的に分離および単離することができる。

【0066】

一部の実施形態において、粒子は、米国特許出願公開第２００９／００７９９６３号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１７９０６８号明細書および国際公開第２００９／１１２５９４号パンフレットに開示されているサイトメトリー方法、デバイスおよびシステムを用いて検出することができる。

【0067】

一部の実施形態において、粒子は、マイクロ流体方法、デバイスおよびシステムを用いて検出することができる。例えば、粒子は、ラボオンチップ（lab-on-a-chip）デバイス
またはシステムその他を用いて検出することができる。例えば、米国特許出願公開第２００９／０３２６９０３号および第２００９／０２９７７３３号明細書を参照されたい。

【0068】

一部の実施形態において、粒子は、ポイントオブケア、実地または消費者用途に適切なデバイスまたはシステムを用いて検出することができる。例えば、デバイス（例えば、ラボオンチップ（lap-on-a-chip）デバイス）は、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、一本鎖
結合タンパク質、ＡＴＰ、ｄＮＴＰおよびプライマーまたはプローブを包含することができる。一部の実施形態において、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、ＡＴＰ、ｄＮＴＰおよびプライマーまたはプローブを含有するデバイスであって、リコンビナーゼ、ポリメラーゼ、プライマーもしくはプローブの１種またはリコンビナーゼが、表面に共有結合的に付着または非共有結合的に結合した（例えば、親和性タグの使用により）デバイスを提供することができる。一部の実施形態において、粒子は、マルチウェルプレートにおける複数の単一ウェルに配置することができる。

【0069】

開示されている方法のいずれかにおいて、適宜、粒子は、検出に先立ち固定することができる。例えば、粒子は、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）で処理して、試料におけるタンパク質および核酸を架橋することにより固定し、混合物における反応の進行を効果的に停止し、反応が停止したときの状態における粒子の観察を可能にすることができる。混合物を固定することにより、粒子は、より後の時点で検出することができ、プロセシングおよび検出を潜在的に単純化する。

【0070】

オリゴヌクレオチド
本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーおよび／または検出プローブとして作用することができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、増幅方法（例えば、本明細書に記載されている）において用いるための２種以上（例えば、２、３、４種以上）のオリゴヌクレオチドのセットとして提供される。

【0071】

オリゴヌクレオチドは、標準ホスホロアミド酸（phosphoroamidate）化学反応その他に従って合成することができる。修飾塩基および／またはリンカー骨格化学反応は、一部の事例において望ましく機能的となることができ、合成の際に組み込むことができる。その上、オリゴヌクレオチドは、様々な目的を果たす化学基、例えば、蛍光基、クエンチャー、保護（ブロッキング）基（可逆的または不可逆的）、磁気タグ、タンパク質等で修飾することができる。

【0072】

一部の実施形態において、本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドは、標的核酸内に存在する近接配列に対し少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である近接配列（例えば、少なくとも１０塩基単位）を含有することができる。２配列間のパーセント同一性または相同性は、数理的アルゴリズムを用いて決定することができる。２配列の比較に利用される数理的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul（
１９９０年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻:２２６４〜６８頁のアルゴリズ
ムであり、これは、Karlin and Altschul（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：５８７３〜７７頁として修正されている。このようなアルゴリズムは、Altschulら（１９９０年）;J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴ
プログラムに取り込まれる。比較目的のギャップ付（gapped）アライメントを得るため、Altschulら（１９９７年）Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁に記載されている通りにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、ＮＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。オンラインでncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい
。

【0073】

オリゴヌクレオチドは、１または複数種の検出可能な標識を包含することができる。検出可能な標識は、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、酸化還元感受性成分（例えば、電気化学的に活性のある成分）、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せとすることができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーの両方を包含することができる。クエンチャーは、フルオロフォアの蛍光を抑制するためにフルオロフォアに近づけてよい。例えば、フルオロフォアとクエンチャーとの間の分離間隔は、０〜２塩基、０〜５塩基、０〜８塩基、０〜１０塩基、３〜５塩基、６〜８塩基および８〜１０塩基となり得る。フルオロフォアおよびクエンチャーは、本開示に記載されているフルオロフォアのいずれかのフルオロフォアおよびクエンチャー等が挙げられるがこれらに限定されない、一体に作用することが公知のいずれかのフルオロフォアおよびクエンチャーとなり得る。検出可能な標識がフルオロフォアまたはクエンチャーである場合、これは、それぞれフルオロフォア−ｄＴアミダイト（amidite）残基またはクエンチャー−ｄＴアミダイト残基によりオリゴヌクレオ
チドに付着することができる。他の付着も可能であり、広く公知である。

【0074】

別の一態様において、フルオロフォアまたはクエンチャーのいずれかは、修飾内部残基に付着することができ、フルオロフォアおよびクエンチャーは、ヌクレアーゼにより修飾内部残基の開裂後に分離することができる。

【0075】

本発明の方法のためにいかなるフルオロフォアが機能してもよいが、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが、例示的なフルオロフォアである。例示的なクエンチャーとして、例えば、Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １またはＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２となり得るダーククエンチャーが挙げられる。

【0076】

一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾内部残基を包含することができる。修飾内部残基は、二本鎖核酸構造にその対応する塩基を備えるワトソン・クリック塩基対構造を形成することができない、いずれかの化学構造（残基）となり得る。用語「修飾内部残基」は、ＤＮＡに正常には存在しない少なくともいずれかの残基も包含する −− これは、例えばウラシルまたはイノシン等、「Ａ」、「Ｇ」、「Ｃ」または「Ｔ」ではないいずれかの残基である。一部の実施形態において、修飾内部残基は、イノシン、ウラシル、８−オキソグアニン、チミングリコールまたは脱塩基部位模倣体である。好ましい脱塩基部位模倣体として、テトラヒドロフラン残基またはＤ−スペーサー（オリゴヌクレオチド合成において５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトを利用する産物として産生することができる）が挙げられる。

【0077】

一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、伸長ブロックされる。伸長ブロックされたオリゴヌクレオチドは、その３’端においてブロックされるため、相補的（complimentary）鋳型の存在下であっても、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより正常には延長さ
せることができない。オリゴヌクレオチドをブロッキングする方法は周知のものであり、少なくとも、ブロックされた３’ヌクレオチドの包含を包含する。ブロックされた３’ヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ伸長を妨げるブロッキング基を含有することができる。一般に、ブロッキング基は、３’糖残基の３’または２’部位に付着するが、他の付着位置も可能である。最も一般的な３’ブロッキング方法の一つは、オリゴヌクレオチドの３’端にジデオキシ糖を置くことである。ブロッキング基は、例えば、検出可能な標識となり得る。

【0078】

一部の実施形態において、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、１または複数種の検出可能な標識、修飾残基（例えば、修飾内部残基）およびブロッキング基を取り込むことにより修飾することができる。本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドが、１または複数種の検出可能な標識、修飾残基（例えば、修飾内部残基）およびブロッキング基を包含する場合、このような修飾を持たないまたは追加的な修飾を有するオリゴヌクレオチドも本開示に包含されている。その上、１または複数種の検出可能な標識、修飾残基（例えば、修飾内部残基）およびブロッキング基を包含する、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドは、別の検出可能な標識、修飾残基（例えば、修飾内部残基）またはブロッキング基、例えば、本明細書に開示されている検出可能な標識、修飾残基（例えば、修飾内部残基）またはブロッキング基に交換されるこのような部分を有することができる。

【0079】

応用
本明細書に開示されている方法および組成物は、例えば、標的核酸のコピー数の検出および標的核酸内に存在する配列の増幅のモニターに用いることができる。本方法の一部の実施形態において、標的核酸は、低コピー数の、相対的に粗製試料において検出することができる。一部の実施形態において、検出される核酸は、細菌核酸、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐまたは本明細書に記載されているまたは本技術分野で公知の別の細菌から選択される細菌由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、哺乳動物核酸であり、例えば、核酸は、腫瘍細胞に関連する。一部の実施形態において、検出される核酸は、ウイルス核酸、例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスもしくはデングウイルスまたは別のウイルス由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、真菌核酸、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓまたは別の真菌由来の核酸である。一部の実施形態において、検出される核酸は、原生動物核酸、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓまたは別の原生動物由来の核酸である。本明細書に開示されている方法および組成物は、検出される核酸、例えば、細菌核酸、哺乳動物核酸、ウイルス核酸、真菌核酸または原生動物核酸（例えば、本明細書に開示されている）に関連する障害または状態の診断において用いることができる。例えば、本明細書に提示されている方法および組成物は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症または寄生虫感染症の診断に用いることができる。一部の実施形態において、検出される核酸は、インフルエンザＡもしくはその変種、インフルエンザＢもしくはその変種、メチシリン抵抗性Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えば、ＨＰＶ変種１６型および１８型）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎）または循環癌細胞由来の核酸である。一部の実施形態において、本明細書に提示されている方法および組成物は、ＭＲＳＡ感染症、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、結核、クラミジア感染症、淋病、梅毒、ＨＰＶ感染症、肝炎ウイルス感染症またはＨＰＶ感染症の診断に用いることができる。本明細書に開示されている方法および組成物は、核酸の定量化において用いることができる。核酸増幅／検出反応の「デジタル化」は、鋳型分子の正確な計数を可能にする近年のアプローチである（例えば、Vogelstein、１９９９年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９６巻：９２３６頁を参照）。通常、これらの方法において、要求される微小区画（micro-compartment）（通常、ナノリットル範囲の）への反応混合物の空間的隔離は、例えば、これを圧力下で適切なマイクロ流体カセットへと圧迫することにより、あるいは適切なエマルジョンにおいてこれを分散させることにより、増幅反応物を物理的に分割することにより達成される。理論に縛られることは望まないが、本明細書に開示されている粒子が増幅の活性中心である場合、粒子の存在は、定量化に用いることのできる反応混合物の固有の区画化を構成する。例えば、「活性」ＲＰＡ粒子（例えば、蛍光シグナルの生成に関連する粒子）の数を計数することにより、反応混合物中に存在する鋳型核酸分子の数を測定または推定することができる。

【0080】

方法は、２種以上の核酸の物理的連結の検出に用いることもできる。多くの分子生物学の応用において、所定の試料に存在する２種の異なる遺伝的マーカーの物理的連結の検出は重要である。例えば、所定の試料における細菌種マーカーおよび抗生物質抵抗性マーカーの単なる存在は、両方のマーカーが同一細菌（例えば、同一核酸）に存在するか、あるいはマーカーが別々の同時コロニー形成（co-colonizing）する細菌種に存在するかに関
する情報を届けない。２種のマーカーが、ゲノムＤＮＡの単一小片において連結していることの立証は、抗生物質抵抗性を特定の病原体に関連づける。２種のマーカーの共局在化は、このシナリオにおける生命診断情報を届けることができる。

【0081】

本明細書に記載されている方法および組成物は、２種の核酸に関する２種の増幅事象の部位または位置が重複していることの立証に用いることができ、核酸の物理的連結に関する情報を提供する。対照的に、分離可能な増幅事象は、両方の核酸の存在を表示することができるが、これはＤＮＡの別個のセグメントに存在する（例えば、２種の同時コロニー形成する細菌種における）。一部の実施形態において、２種の核酸配列の連結は、反応混合物における単一粒子に局在化した両方の活性増幅産物を観察することにより検出することができる。他の実施形態において、ＤＮＡの単一セグメントにおける２種の核酸配列の連結は、ＤＮＡセグメントによる、それぞれ核酸の一方を増幅する２個の粒子の「テザリング」を観察することにより検出することができる。

【0082】

一部の実施形態において、本明細書に開示されている粒子の観察は、品質管理の方法において用いることができる。例えば、粒子外観（数、サイズ、密度）およびＲＰＡ成績の間の関係性は、増幅に先立ちＲＰＡ反応品質を予見するための分析的パラメータの作成に用いることができる。これは、一般品質管理目的（例えば、粒子のいかなる型／数が所定の反応混合物に存在するかの点検）または産生手順（例えば、安定化プロセス）もしくは貯蔵条件の変化の効果のモニター等に用いることができる。

【0083】

一部の実施形態において、本明細書に開示されている方法および組成物は、反応開始から数分間以内（例えば、８、７、６、５、４、３、２、１．５または１分間以内）に増幅反応の結果を得るために用いることができる。通常、蛍光シグナルの蓄積を検出することによる増幅反応のモニタリングは、「大量に（in bulk）」行われる、即ち、個々の鋳型分子により生成されたシグナルは、所定の反応容量全体にわたり統合され、５〜８分間で検出可能な蛍光応答を生じる。対照的に、ＲＰＡ粒子において生成される蛍光シグナルの観察も原則として、反応を生じる時間の短縮に用いることができる。この結果は、少なくとも一部には、規定の座位（例えば、粒子）における高い拡大率でのより高い検出感度によるものである。

【0084】

通常「大量に」行われてモニターされる標準ＲＰＡ反応の蛍光シグナル強度は、特に非常に低い量の出発鋳型材料が用いられる場合、インキュベーションにおいて行われる混合ステップからの利益を得る。直接的な粒子における増幅反応の観察は、混合により導入される任意の変動を低下させることができる。

【実施例】

【0085】

（実施例１）
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅混合物における粒子
本実施例は、ＲＰＡ混合物内におけるオリゴヌクレオチドを含有する粒子の観察について記載する。８０μｌの９．３８ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、３．１３ｍＭ ＤＴＴ、２．５％ＰＥＧ、３．７５％トレハロース、３１．３ｍＭクレアチンリン酸、１．５６ｍＭ ＡＴＰ、７５０μＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ１８８μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、３８８ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｆ２（ＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧ ＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧ；配列番号１）、３６３ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｒ２（ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴ ＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＧＴ；配列番号２）および７５ｎＭ Ｓｐｙ１２５８ｅｘｏＰ１（ＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＡＣＡＴＡＧＡＧＡＡＴＱＴＨＦＡＡＣＣＧＣＡＣＴＣＧＣＴＡＣ；Ｆ＝ＦＡＭ−ｄＴ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ＢＨＱ−１−ｄＴ、３’＝ブロックｃ３ｓｐａｃｅｒ；配列番号３）において、２．９６μｇクレアチンキナーゼ、１３．１μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、１８．１μｇ Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ、５．１５μｇ Ｒｂ６９ ＵｖｓＹ、５．３８μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび５．０μｇ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリメラーゼＩの大型断片）を含有する混合物を調製して、０．２ｍＬチューブ内で混合物をフリーズドライすることにより、ＦＡＭ標識したオリゴヌクレオチドを包含するＲＰＡ反応成分のフリーズドライ混合物を得た。乾燥させた試薬を、４６．５μＬの再水和バッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、１３３．８ｍＭ ＫＯＡｃ、２％ＰＥＧ）＋３．５μＬの水に再懸濁し、ボルテックスした。このような混合物は、核酸鋳型またはマグネシウムを含有しなかった。混合物から１０マイクロリットルを顕微鏡スライドに移し、４０×拡大率の微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）および蛍光顕微鏡を用いて画像化した（図１Ａ〜１Ｃ）。ＤＩＣ（図１Ａ）または蛍光（図１Ｂ）を用い、この２画像を重ね合わせて（図１Ｃ）、サイズ約１〜１０ミクロンの粒子を観察した。およそ１００〜５００粒子／ｎＬを観察した（４０×拡大率の視野は、１．５５ｎＬの混合物に相当）。

【0086】

別個の実験において、３．５μＬの水を、２．５μＬの水および１μＬのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡ調製物（１００コピー／μｌ）に置換する以外は、上述の通りに混合物を調製した。上述の通りに混合物をボルテックスし、画像化した（図２Ａ〜２Ｃ）。ＤＩＣ（図２Ａ）または蛍光（図２Ｂ）を用い、この２画像を重ね合わせて（図２Ｃ）、上述と同様の粒子を観察した。

【0087】

本実施例は、ＲＰＡ混合物中に粒子が形成されており、粒子が、鋳型またはマグネシウムの包含に依存しないことを立証する。

【0088】

（実施例２）
クラウディング剤は粒子形成を刺激する
粒子形成におけるクラウディング剤の効果を決定するため、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ、１．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、６％トレハロース、１４ｍＭ ＭｇＡｃ、３０ｎＭ ＨＩＶ ｐ２ＬＦｔｅｘａｓ（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ標識オリゴＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＣＡ５ＡＡＴＴＴＴＣＧＧＧＴＴＴ；３’ｄＡブロック、５’Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、５＝ｄＳｐａｃｅｒ；配列番号４）、４２０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｆ２（ＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧ；配列番号５）および３９０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｒ２（ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＧＴ；配列番号６）において、２．９６μｇクレアチンキナーゼ、１３．１μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、１８．８μｇ Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ、２．５μｇ Ｒｂ６９ ＵｖｓＹ、５．３８μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび５．０μｇ ＤＮＡポリメラーゼを含有する新鮮なＲＰＡ混合物を調製した。各混合物に、０％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、５．５％または８％のＰＥＧが包含された。混合物をピペットにより混合し、それぞれから１０μＬを顕微鏡スライドに移した。４０×拡大率の微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）および蛍光顕微鏡を用いて画像化を行った。観察された粒子の数は、最大５．５％までのＰＥＧ濃度増加と共に増加した（図３Ａ〜３Ｇ）。８％ＰＥＧにおいて、より少ない粒子が観察された（図３Ｈ）。

【0089】

本実施例は、ＰＥＧがＲＰＡ混合物における粒子の形成を増強できることを立証する。

【0090】

（実施例３）
粒子形成に対する混合物成分の寄与
粒子形成に対するＲＰＡ混合物成分の寄与を決定するため、各反応液において個々の成分を除外した以外は、５．５％ＰＥＧを用いた実施例２と同様に混合物を調製した。ＤＩＣおよび蛍光顕微鏡を用いて、上述の通りに混合物を画像化した。全成分が存在する場合、上述の通りに混合物において粒子が形成された（図４Ａ〜４Ｂ）。ＵｖｓＸの非存在下で形成された粒子は、ＵｖｓＸの存在下で形成された粒子とはサイズが異なるように見え、ＤＩＣにより容易には観察できなかった（図４Ｃ〜４Ｄ）。ｇｐ３２の非存在下で形成された粒子は、ｇｐ３２の存在下で形成された粒子とは形状およびサイズが異なるように見えた（図４Ｅ〜４Ｆ）。他のＲＰＡ成分（ＵｖｓＹ、ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）の非存在下で形成された構造は、完全ＲＰＡ反応液において形成された粒子と同様のものに見えた（図５Ａ〜５Ｈ）。ＵｖｓＹの非存在は、粒子数の僅かな減少および粒子サイズの増加をもたらすように見えた（図５Ａ〜５Ｂ）。

【0091】

２または３種の反応成分を除外して、追加的な混合物を調製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ、１．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、６％トレハロース、１４ｍＭ ＭｇＡｃ、５．５％ＰＥＧ、１２０ｎＭ Ｍ２ｉｎｔＦＡＭ（ＦＡＭ標識プローブ５’−ｔｃｃｔｃａｔａｔｃｃａｔｔｃｔｇＴｃｇａａｔａｔｃａｔｃａａａａｇｃ−３’；Ｔ＝カルボキシフルオレセイン−ｄＴ；配列番号１９）、それぞれ４２０ｎＭのＳｐａＦ３（ＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＣ；配列番号７）およびＳｐａＲ１０＋１（ＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＡＡＣＧＴＴＴＴＡ；配列番号８）において、２．９６μｇクレアチンキナーゼ、１３．１μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、１８．８μｇ Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ、５．１５μｇ ＵｖｓＹ、８．２６μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび５．０μｇ ＤＮＡポリメラーゼを含有する対照ＲＰＡ混合物を調製した。（ｉ）ｇｐ３２およびＵｖｓＹ；（ｉｉ）ＵｖｓＸおよびＵｖｓＹ；（ｉｉｉ）ＵｖｓＸおよびｇｐ３２；（ｉｖ）ＵｖｓＸ、ＵｖｓＹおよびｇｐ３２；または（ｉｖ）ｇｐ３２、ＵｖｓＹおよびＥｍｉｘ（クレアチンリン酸およびＡＴＰ）を欠く、平行混合物を調製した。ＵｖｓＸおよび少なくとも１種の他の成分を欠く混合物において、粒子は観察されなかった。ｇｐ３２およびＵｖｓＹを欠く混合物において、大型の不規則な蛍光体が観察された（図６Ａ〜６Ｃ）。

【0092】

本実施例は、ＵｖｓＸまたはｇｐ３２の除外が、粒子形態に最大の効果を有し、続いて、ＵｖｓＹの除外により中程度の効果があり、ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩの除外において有意な効果が観察されないことを立証する。２種以上の成分の除外は、効果を増加させた。

【0093】

（実施例４）
粒子の別個の集団は、混合しても別々のままとなる
各混合物が異なるオリゴヌクレオチドおよび１８．８μｇのＵｖｓＸを包含した以外は、実施例１に記載されている通りに２種のフリーズドライ混合物を調製した。試薬ミックス１は、２９６ｎＭ ＳｐａＦ３（配列番号７）、２９８ｎＭ ＳｐａＲ１０＋１（配列番号８）および１４９ｎＭ ＳｐａＰｒｏｂｅ１（ＣＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＡＴ９ Ａ８Ｇ６ＴＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＣ；３’ビオチン、６＝ＢＨＱ−２ｄＴ、８＝ｄＳｐａｃｅｒ、９＝ＴＭＲｄＴ；配列番号９）を含有した。試薬ミックス２は、２９９ｎＭ ＭｅｃＦ９−８＋２（ＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＡＡ ＴＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＧＴ；配列番号１０）、３００ｎＭ ＭｅｃＲ１ａ（ＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧ ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣ；配列番号１１）および１５０ｎＭ ＭｅｃＰｒｏｂｅ１（ＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴ ＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＦＧＨＧＱＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡ；３’ビオチンＴＥＧ、Ｑ＝ＢＨＱ−１ｄＴ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｆ＝ＦＡＭ−ｄＴ；配列番号１２）を含有した。等容量の２種の試薬混合物を組み合わせ、８０μＬを０．２ｍＬチューブに分注し、フリーズドライした。乾燥した混合物を、４６．５μｌの再水和バッファー（実施例１を参照）、１μＬの水および２．５μＬの２８０ｍＭ ＭｇＡｃに再懸濁した。混合物をボルテックスし、ＤＩＣおよび蛍光を用いた画像化のために１０μＬを顕微鏡スライドに移した。観察された粒子は、赤色（ＴＭＲ）および緑色（ＦＡＭ）蛍光の両方を含有し、両方の標識オリゴヌクレオチドが粒子に存在することを表示した（図７Ａ〜７Ｆ）。

【0094】

別の実験において、一方はＴＭＲ標識Ｓｐａ ＲＰＡプローブ（試薬ミックス１、上述）のみを包含し、もう一方はＦＡＭ標識ＭｅｃＡ ＲＰＡプローブ（試薬ミックス２、上述）のみを包含する、２種の別個のフリーズドライ混合物を上述通りに調製した。再構成後に、２種の再構成した混合物を組み合わせ、ＤＩＣおよび蛍光を用いて画像化した。主に一方のフルオロフォアまたは他方を含有した別個の粒子が混合物において観察された（図８Ａ〜８Ｆ）。これは、各プローブを包含する粒子が、混合後に互いに別個のままとなることができることを表示する。

【0095】

混合された粒子集団の経時的な安定性を決定するため、２種のプライマーなしフリーズドライ反応物を、後述の通りＭｇＡｃおよびオリゴヌクレオチドにより再水和バッファーに再構成した。一方の混合物は、３０ｎＭ ＨＩＶ ｐ２ＬＦｔｅｘａｓ（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識）、４２０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｆ２（配列番号１、非標識）および３９０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｒ２（配列番号２、非標識）を包含した。他方の混合物は、５０ｎＭ Ｍ２ｉｎｔＦＡＭオリゴ（配列番号１９、ＦＡＭ標識）、４２０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｆ２（配列番号１、非標識）および３９０ｎＭ Ｓｐｙ１２５８Ｒ２（配列番号２、非標識）を包含した。５マイクロリットルの各混合物をピペット採取して顕微鏡スライド上に置き、混合し、組合せを２、７および１３分目に画像化した（図９）。１２分間の期間の後の混合物の画像を図９に示す。１３分後に、主にＴｅｘａｓ ＲｅｄまたはＦＡＭ蛍光を包含する粒子が観察可能であった。

【0096】

本実施例は、粒子が、溶液において相対的に安定的であり続け、独立的に標識され得ることを立証する。この観察は、異なる粒子サブセットで起こる、２種以上のＲＰＡ反応の同時モニタリングに役立つ可能性がある。

【0097】

（実施例５）
ＲＰＡ反応は、粒子への局在化が観察される
実施例１と同様にＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドプローブを包含するＲＰＡ反応成分のフリーズドライ混合物を４６．５μｌの再水和バッファーにより再構成し、１μＬの５０，０００コピー／μＬ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡおよび２．５μＬの２８０ｍＭ ＭｇＡｃの添加により増幅反応を始めた。ピペッティングにより反応液を混合し、開始後約２分、４０秒目、続いて８、１２、１４、１５、１６、１８、２０および２２分目に始めるＤＩＣおよび蛍光による画像化のために顕微鏡スライドに移した（図１０）。少なくとも最初は個々の粒子に局在化した、蛍光の増加（増幅を表示）が観察された。

【0098】

別の実験において、フリーズドライしたプライマーなしの反応成分混合物（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、５ｍＭ ＤＴＴ、２．２８％ＰＥＧ、５．７％トレハロース、５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、１２００μＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）における５０μｌ容量の２．９６μｇクレアチンキナーゼ、９．８８μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、１８．８μｇ Ｔ６ Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ、５．３８μｇ ＵｖｓＹ、５．３８μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩおよび５．３４μｇ ＤＮＡポリメラーゼを混合し、０．２ｍＬチューブ内でフリーズドライすることにより調製）を、２９．５μｌのプライマーなし再水和バッファー（４１．７ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、１６７．５ｍＭ酢酸カリウム、５．４％ＰＥＧ、ｐＨ８．３）、３．５μＬの６μＭ Ｓｐａ Ｆ３（配列番号７）、３．５μＬの６μＭ Ｓｐａ Ｒ１０＋１（配列番号８）、１μＬの６μＭ ＴＭＲ標識Ｓｐａ Ｐｒｏｂｅ１（配列番号９）、１μＬの０．６μＭ Ｍ２ｉｎｔＦＡＭオリゴ（配列番号１９、粒子の蛍光マーカーとして用い、ＲＰＡ反応に関与しない）および８μＬの水により再構成した。１μＬの５０，０００コピー／μＬ Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ精製ゲノム鋳型ＤＮＡおよび２．５μＬの２８０ｍＭ ＭｇＡｃを添加し、ピペットで混合することにより反応を開始した。１０マイクロリットルの混合物を顕微鏡スライドに移し、反応開始約３分後に画像化を始めた。３、８、１５、１８、２２および２６分目における反応混合物の時間経過（図１１）は、赤色蛍光の増加を示し（増幅を表示）、これは少なくとも最初は個々の粒子に局在化した。

【0099】

本実施例は、核酸増幅産物が粒子と共局在化して観察され得ることを立証する。

【0100】

（実施例６）
ＵｖｓＸ変種の効果
異なるＵｖｓＸ変種の効果を調査するため、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ、１．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、６％トレハロース、１４ｍＭ ＭｇＡｃ、５．５％ＰＥＧ、１２０ｎＭ Ｍ２ｉｎｔＦＡＭ（配列番号１９）、それぞれ４２０ｎＭのＳｐａＦ３およびＳｐａＲ１０＋１（５０μｌ最終容量）において２．９６μｇクレアチンキナーゼ、１３．１μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、８．２６μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩ、５．０μｇポリメラーゼを含有する混合物を室温にてセットアップした。１８．８μｇ Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸまたは１７．６μｇ Ｔ６ ＵｖｓＸのいずれかを含有する、５．１５μｇ Ｒｂ６９ ＵｖｓＹありまたはなしの４種の異なる混合物を調製した。１０マイクロリットルの各混合物を顕微鏡スライドに移し、セットアップ約５〜２０分後に２０×拡大率で画像化し（図１２Ａ〜１２Ｄ）、セットアップ約５０〜６０分後に４０×拡大率でも画像化した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。一般に、Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ混合物において、Ｔ６ ＵｖｓＸよりも多い粒子が観察された。その上、Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ粒子は多くの場合、彗星様形状等、Ｔ６ ＵｖｓＸによる粒子とは形状が異なり、一方のＴ６ ＵｖｓＸ粒子はより球状であった。ＵｖｓＹを欠くＴ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸ混合物は、より拡散した粒子および拡散した「ハロー」または中央にシグナルを欠く「ドーナツ型」形状を有していた。Ｔ６ ＵｖｓＸにより、逆の効果がしばしば観察された。ＵｖｓＹなしでは、粒子は明るい小球であったが、ＵｖｓＹありでは、粒子はより暗く、よりスメア（smeary）で小さかった。

【0101】

Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸおよびＴ６ ＵｖｓＸを用いたＲＰＡ反応動態におけるＵｖｓＹの効果を調査した。Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸまたはＴ６ ＵｖｓＸにより、Ｒｂ６９ ＵｖｓＹありまたはなしで上述通りに反応液を調製した。異なるプライマーセットおよび鋳型を用いて、３種の別個の実験を行った。第一の実験において、プライマーは、４２０ｎＭ ＦｌｕＡＰＡＦＮＡ５０７（ＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＴＧ；配列番号１３）およびＦｌｕＡＰＡＲＮＡ１０６（ＡＴＧＴＧＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＴ；配列番号１４）であり、１２０ｎＭプローブＦｌｕＡＰＡｅｘｏＰ２．２（ＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡ ＧＣＡＡＴＹＧＡＧＧＡＧＦＨＣＱＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＴ；Ｆ＝ＦＡＭ−ｄＴ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ＢＨＱ−１−ｄＴ、３’＝ブロックｃ３ｓｐａｃｅｒ；配列番号１５）を用いた。各反応において、５００または５０コピーのインフルエンザＡ鋳型ＲＮＡを用いた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＯＡｃ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．２ユニット／μＬ Ｒｉｂｏｌｏｃｋ（商標）ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス（それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）、５０ｍＭクレアチンリン酸、２．５ｍＭ ＡＴＰ、６％トレハロース、５．５％ＰＥＧにおいて、２．９６μｇクレアチンキナーゼ、１３．１μｇ Ｒｂ６９ ｇｐ３２、１８．８μｇ Ｔ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸまたは１７．６ｕｇ Ｔ６ ＵｖｓＸ、８．２６μｇエキソヌクレアーゼＩＩＩ、５．０μｇポリメラーゼ、１．７９μｇ逆転写酵素、５．１５μｇ ＵｖｓＹ（存在する場合は）を含有するＲＰＡ反応液を集合させた。０．２ｍＬチューブ内に４６．５μＬ容量で上述の成分を集合させ、２．５μＬの２８０ｍＭ ＭｇＯＡｃおよび１μＬの５００または５０コピー／μＬのインフルエンザＡ鋳型ＲＮＡの添加により反応を開始させた。反応液をボルテックスし、短時間遠心分離し、Ｔｗｉｓｔａ機器（ＥＳＥ）に移して、２０分間４０℃で２０秒間毎に蛍光をモニターし、５分目に混合ステップ（ボルテックスと短い遠心分離）を行った。ＵｖｓＹとＴ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸの包含は、ＵｖｓＹなしの反応と比べて増幅の遅延をもたらし、Ｔ６ ＵｖｓＸに対し逆の結果が観察された（図１４Ａ〜１４Ｂ）。僅か５０コピーの鋳型が存在する場合であっても、ＵｖｓＹを欠く反応液は、全体により低いシグナルを生じた（図１４Ａ〜１４Ｂ）。プライマーとして４２０ｎＭ ＳｐａＦ３およびＳｐａＲ１０を用い、１２０ｎＭ ＳｐａＰｒｏｂｅ１．２および１０００コピーのＡ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ精製ゲノム鋳型ＤＮＡによる第二の実験において、反応動態における同様の効果が観察された（図１５）。

【0102】

第二の実験において、用いたプライマーは、４２０ｎＭ ＦｌｕＢＮＳＦ１００７（ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴ；配列番号１６）およびＦｌｕＢＮＳＲ７０５（ＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＧＧＡＴＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣ；配列番号１７）であり、１２０ｎＭプローブＦｌｕＢＮＳｅｘｏＰ１（ＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＹＴＣＡＣＴＣＴＴＣＧＡＧＣＧＦＨＴＱＡＡ ＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴＣ；Ｆ＝ＦＡＭ−ｄＴ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ＢＨＱ−１−ｄＴ、３’＝ブロックｃ３ｓｐａｃｅｒ；配列番号１８）を用いた。各反応において、５００コピーのＰＣＲ増幅したインフルエンザＢ鋳型ＤＮＡを用いた。これらの反応において、ＵｖｓＹを欠くＴ６Ｈ６６Ｓ ＵｖｓＸによる増幅は観察されなかった（図１６Ａ〜１６Ｂ）。Ｔ６ ＵｖｓＸにより逆の効果が観察された（図１６Ａ〜１６Ｂ）。

【0103】

本実施例は、異なるＵｖｓＸ変種が、粒子形態および増幅反応動態に関してＵｖｓＹに対し異なる要件を有し得ることを立証する。その上、粒子形態は、増幅反応の動態および／または進行に相関すると思われる。

【0104】

（実施例７）
核酸の定量化
本明細書に開示されている方法は、核酸の定量化に用いることができる。一実験において、鋳型核酸の希釈は、実施例５に開示されているＲＰＡ反応混合物と組み合わせる。核酸増幅の部位に関連する、指定の容量の反応液における粒子の数は、各希釈において決定される。範囲内において、核酸増幅の部位に関連する粒子の数は、反応液における鋳型核酸の濃度と共に変動する。例えば、核酸増幅に関連する粒子の数は、鋳型核酸の濃度に比例し得る、あるいは核酸増幅に関連する粒子の数は、同一容量における鋳型核酸分子の数と等しくなり得る。活性粒子数と鋳型核酸濃度との間の相関に関するこの情報を用いて、実験試料における鋳型核酸の濃度を決定することができる。

【0105】

他の実施形態
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかし一方で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を為し得ることが理解されよう。したがって、他の実施形態も次の特許請求の範囲内に収まる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]