特許 6210004 試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6210004

(24)【登録日】2017年9月22日

(45)【発行日】2017年10月11日

(54)【発明の名称】試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20171002BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20171002BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 525C

   G01N33/53 Y

【請求項の数】8

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2014-59623(P2014-59623)

(22)【出願日】2014年3月24日

(65)【公開番号】特開2014-219384(P2014-219384A)

(43)【公開日】2014年11月20日

【審査請求日】2016年4月25日

(31)【優先権主張番号】特願2013-81122(P2013-81122)

(32)【優先日】2013年4月9日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度 独立行政法人科学技術振興機構 研究成果展開事業（先端計測分析技術・機器開発プログラム）産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】308036402

【氏名又は名称】株式会社ＪＶＣケンウッド

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100101247

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 俊一

(72)【発明者】

【氏名】糸長 誠

(72)【発明者】

【氏名】柳生 慎悟

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 祐一

(72)【発明者】

【氏名】辻田 公二

(72)【発明者】

【氏名】小野 雅之

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０９−１５９６７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２５５７７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０３８５６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１７３６８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１６２５６３（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベース部と、
前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部と、
前記凹部に隣接する凸部と、
を備え、
前記凹部と前記凸部とは前記ベース部上に周期的に配列されており、
前記凸部の幅は、前記エクソソームの平均粒径よりも小さい
ことを特徴とする試料分析用デバイス。

【請求項2】

前記凸部の幅は、前記エクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の試料分析用デバイス。

【請求項3】

前記凹部の幅は、前記エクソソームの平均粒径よりも大きく、前記エクソソームを修飾するビーズの直径の２倍よりも小さいことを特徴とする請求項１または２に記載の試料分析用デバイス。

【請求項4】

前記凹部の幅は、前記エクソソームの平均粒径の４倍よりも小さいことを特徴とする請求項３に記載の試料分析用デバイス。

【請求項5】

ベース部と、
前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部と、
前記凹部に隣接する凸部と、
を備え、
前記凹部と前記凸部とは前記ベース部上に周期的に配列されており、
前記凸部の幅は、前記エクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さい
ことを特徴とする試料分析用デバイス。

【請求項6】

液が注入される凹状の注入部と、
前記注入部の底面上に形成された凹部と、
前記注入部の底面上に形成され、前記凹部に隣接する凸部と、
を備え、
前記凹部と前記凸部とは前記底面上に周期的に配列されており、
前記凸部の幅が検出対象のエクソソームの平均粒径よりも小さい試料分析用デバイスを用い、
前記注入部内に、前記エクソソームに存在する抗原と結合する抗体を含む緩衝溶液を注入して、前記凹部に前記抗体を固定させる抗体固定工程と、
前記注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された前記抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程と、
を含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法。

【請求項7】

前記注入部内に、前記エクソソームが有する抗原と結合する抗体が表面に固定されたビーズを含む緩衝溶液を注入して、前記エクソソームが有する抗原に、前記ビーズに固定された抗体を結合させることにより、前記エクソソームを前記ビーズで修飾する修飾工程をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のエクソソームの捕捉方法。

【請求項8】

液が注入される凹状の注入部と、
前記注入部の底面上に形成された凹部と、
前記注入部の底面上に形成され、前記凹部に隣接する凸部と、
を備え、
前記凹部と前記凸部とは前記底面上に周期的に配列されており、
前記凸部の幅は、検出対象のエクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さい試料分析用デバイスを用い、
前記注入部内に、前記エクソソームに存在する抗原と結合する抗体を含む緩衝溶液を注入して、前記凹部に前記抗体を固定させる抗体固定工程と、
前記注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された前記抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程と、
前記注入部内に、前記エクソソームが有する抗原と結合する抗体が表面に固定された前記ビーズを含む緩衝溶液を注入して、前記エクソソームが有する抗原に、前記ビーズに固定された抗体を結合させることにより、前記エクソソームを前記ビーズで修飾する修飾工程と、
を含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、各種の細胞が分泌するエクソソームを分析するための試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法に関する。

【背景技術】

【0002】

疾病と関連付けられている特定の抗原（または抗体）をバイオマーカとして検出して分析することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析することが広く行われている。近年、エクソソーム（exosome）と称されている微小な膜小胞が新たなバイオマーカとして期待されている。

【0003】

エクソソームは、血液，リンパ液，唾液，尿，母乳，精液等に含まれている。エクソソームは液体中では概略球形であり、直径１００ｎｍ程度を中心として分布している。エクソソームは、脂質二重膜で覆われており、脂質二重膜には、様々な物質、例えば膜たんぱく質が存在している。なお、エクソソームは、マイクロベシクル、細胞外小胞と称されることもあり、複数の呼称が存在している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００９／０９２３８６号

【特許文献2】国際公開第２００６／０１６６１７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１には、免疫学的測定法（イムノアッセイ法）を用いてエクソソームを検出して分析することが記載されている。特許文献１に記載されている免疫学的測定法を用いると、エクソソームの脂質二重膜に存在する膜たんぱく質を抗原とする抗体を認識することによってエクソソームを検出することができる。しかしながら、膜たんぱく質の数はエクソソームの個体で一定ではないため、エクソソームの数を精度よく検出することができない。

【0006】

そこで、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法が求められている。エクソソームを高精度に検出することができれば、エクソソームを高精度に定量的に測定することが可能となる。

【0007】

本発明はこのような要望に対応するため、エクソソームを高精度に検出することができる試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、ベース部と、前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部と、前記凹部に隣接する凸部とを備え、前記凹部と前記凸部とは前記ベース部上に周期的に配列されており、前記凸部の幅は、前記エクソソームの平均粒径よりも小さいことを特徴とする試料分析用デバイスを提供する。
また、本発明は、ベース部と、前記ベース部上に形成され、検出対象のエクソソームに存在する抗原と結合する抗体を固定させ、前記抗体に前記エクソソームを結合させることによって前記エクソソームを固定させる凹部と、前記凹部に隣接する凸部とを備え、前記凹部と前記凸部とは前記ベース部上に周期的に配列されており、前記凸部の幅は、前記エクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さいことを特徴とする試料分析用デバイスを提供する。

【0009】

本発明は、液が注入される凹状の注入部と、前記注入部の底面上に形成された凹部と、前記注入部の底面上に形成され、前記凹部に隣接する凸部とを備え、前記凹部と前記凸部とは前記底面上に周期的に配列されており、前記凸部の幅が検出対象のエクソソームの平均粒径よりも小さい試料分析用デバイスを用い、前記注入部内に、前記エクソソームに存在する抗原と結合する抗体を含む緩衝溶液を注入して、前記凹部に前記抗体を固定させる抗体固定工程と、前記注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された前記抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程とを含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法を提供する。
また、本発明は、液が注入される凹状の注入部と、前記注入部の底面上に形成された凹部と、前記注入部の底面上に形成され、前記凹部に隣接する凸部とを備え、前記凹部と前記凸部とは前記底面上に周期的に配列されており、前記凸部の幅は、検出対象のエクソソームを修飾するビーズの直径よりも小さい試料分析用デバイスを用い、前記注入部内に、前記エクソソームに存在する抗原と結合する抗体を含む緩衝溶液を注入して、前記凹部に前記抗体を固定させる抗体固定工程と、前記注入部内に、前記エクソソームを含む試料液を注入して、前記凹部に固定された前記抗体に前記エクソソームに存在する抗原を結合させて、前記凹部に前記エクソソームを固定させるエクソソーム固定工程と、前記注入部内に、前記エクソソームが有する抗原と結合する抗体が表面に固定された前記ビーズを含む緩衝溶液を注入して、前記エクソソームが有する抗原に、前記ビーズに固定された抗体を結合させることにより、前記エクソソームを前記ビーズで修飾する修飾工程とを含むことを特徴とするエクソソームの捕捉方法を提供する。

【発明の効果】

【0010】

本発明の試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法によれば、エクソソームを高精度に検出することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】第１実施形態の試料分析用デバイスを示す斜視図である。

【図2】図１のＡ−Ａで切断した部分拡大斜視図である。

【図3】第１〜第３実施形態の試料分析用デバイスにおける凹凸構造の寸法的形状を示す拡大断面図である。

【図4】第２実施形態の試料分析用デバイスを示す斜視図である。

【図5】図４のＡ−Ａで切断した部分拡大斜視図である。

【図6】エクソソームの模式的な断面図である。

【図7】エクソソームを修飾するためのビーズを示す断面図である。

【図8】一実施形態のエクソソームの捕捉方法を示すフローチャートである。

【図9】一実施形態のエクソソームの捕捉方法で実行される工程を説明するための部分拡大断面図である。

【図10】一実施形態のエクソソームの捕捉方法で実行される工程によって凹凸構造上に生じている状態を模式的に示す部分拡大断面図である。

【図11】第３実施形態の試料分析用デバイスを示す平面図である。

【図12】第３実施形態の試料分析用デバイスにおける凹凸構造を示す部分拡大断面図である。

【図13】第３実施形態の試料分析用デバイスを示す部分断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、各実施形態の試料分析用デバイス及びエクソソームの捕捉方法について、添付図面を参照して説明する。

【0013】

＜第１実施形態の試料分析用デバイス＞
図１〜図３を用いて、第１実施形態の試料分析用デバイスの構成について説明する。図１において、第１実施形態の試料分析用デバイス１０１は、例えば合成樹脂によって矩形状に形成されている。試料分析用デバイス１０１の外形形状は矩形に限定されず任意である。

【0014】

試料分析用デバイス１０１を、ガラス，金属，半導体基板等を用いて形成してもよい。

【0015】

試料分析用デバイス１０１には、円筒状の凹部であるウェル１０が複数個形成されている。図１では、ウェル１０を８個形成しているが、さらに多くのウェル１０を形成してもよく、ウェル１０の個数は任意である。ウェル１０は、後述する各液を注入する注入部である。

【0016】

ウェル１０を試料分析用デバイス１０１の厚さ方向に直交する方向に切断したときの断面形状を真円としている。ウェル１０の断面形状を、楕円または矩形としてもよい。但し、ウェル１０の断面形状を真円とすることが好ましい。

【0017】

図２は、図１のＡ−Ａ断面を拡大して示している。図２に示すように、ウェル１０の底面には、凹部２０ａと、凹部２０ａに隣接する凸部２０ｂとを周期的に複数配列させた凹凸構造２０が形成されている。試料分析用デバイス１０１では、合成樹脂等で形成される試料分析用デバイス１０１自体が、凹凸構造２０を形成するベース部となっている。

【0018】

凹部２０ａ及び凸部２０ｂは、略直線状に形成されている。凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの側面は傾斜している。凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの側面を、試料分析用デバイス１０１の面に対して略垂直となるように凹凸構造２０を形成してもよい。

【0019】

図３の拡大断面図に示すように、凹部２０ａの深さ（凸部２０ｂの高さ）をＨとし、凹部２０ａ及び凸部２０ｂそれぞれの幅を一点鎖線にて示す底面からＨ／２の位置でのＷａ，Ｗｂとする。凹部２０ａの幅Ｗａと凸部２０ｂの幅Ｗｂとは、Ｗａ＞Ｗｂの関係を満たすことが好ましい。

【0020】

以上のように構成される試料分析用デバイス１０１は、合成樹脂を用いて形成する場合には、一体成形によって容易に作製することができる。

【0021】

＜第２実施形態の試料分析用デバイス＞
図４，図５を用いて、第２実施形態の試料分析用デバイスの構成について説明する。図４，図５において、図１〜図３と実質的に同一部分には同一符号を付し、その説明を適宜省略する。

【0022】

図４において、第２実施形態の試料分析用デバイス１０２は、例えば合成樹脂によって形成された基板１１２と、合成樹脂によって形成され、基板１１２に重ねられたシート１２２とを有する。シートは、例えばシリコーンポリマーシートである。以下、シリコーンポリマーシート１２２と称する。試料分析用デバイス１０２も矩形状に形成されているが、外形形状は任意である。

【0023】

基板１１２に重ねるシートの材料はシリコーンポリマーに限定されない。シートの材料は、シリコーンポリマーより安価な材料、例えばポリスチレン、ＡＢＳ、ポリカーボネート等の樹脂であってもよい。

【0024】

試料分析用デバイス１０２には、試料分析用デバイス１０１と同様、円筒状の凹部であるウェル１０が複数個形成されている。

【0025】

図５は、図４のＡ−Ａ断面を拡大して示している。図５に示すように、基板１１２の表面全体には、凹部２０ａと凸部２０ｂとを複数配列させた凹凸構造２０が形成されている。試料分析用デバイス１０２では、合成樹脂等で形成される基板１１２が、凹凸構造２０を形成するベース部となっている。

【0026】

第１実施形態の試料分析用デバイス１０１においては、ウェル１０の底面のみに凹凸構造２０が形成されているのに対し、第２実施形態の試料分析用デバイス１０２においては、基板１１２の表面全体に凹凸構造２０が形成されている。

【0027】

試料分析用デバイス１０２においては、シリコーンポリマーシート１２２に円筒状の貫通孔１１が形成されている。基板１１２と貫通孔１１を有するシリコーンポリマーシート１２２とを重ね合わせることによって、ウェル１０が形成されている。試料分析用デバイス１０２は、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを重ね合わせた状態で、ウェル１０の底面に凹凸構造２０が形成されている試料分析用デバイス１０１と実質的に同一の構成となる。

【0028】

シリコーンポリマーシート１２２は基板１１２に対して密着するので、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着する必要はない。基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着させなければ、後述するエクソソームの検出工程において、必要に応じてシリコーンポリマーシート１２２を剥がすことができる。勿論、基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを接着させてもよい。

【0029】

基板１１２とシリコーンポリマーシート１２２とを、シリコーンゴム等で形成されたパッキングを介して密着させてもよい。例えば、パッキングは、貫通孔１１と同じ位置に配置された、貫通孔１１と略等しい直径で貫通孔が形成されたシリコーンゴムよりなる平板でよい。

【0030】

パッキングは、貫通孔１１ごとに設けられた、断面が略四角または略円形の環状の部材であってもよい。

【0031】

シリコーンポリマーシート１２２に環状の突起を設け、パッキングに環状の溝を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。シリコーンポリマーシート１２２に環状の溝を設け、パッキングに環状の突起を設けて、突起を溝に嵌め込んでもよい。

【0032】

シリコーンポリマーシート１２２における基板１１２との接合面に、複数のパッキングを設けてもよい。複数のパッキングの直径は貫通孔１１の直径と略等しい。複数のパッキングは、貫通孔１１それぞれに対応して設けられる。

【0033】

＜一実施形態のエクソソームの捕捉方法＞
第１実施形態の試料分析用デバイス１０１または第２実施形態の試料分析用デバイス１０２を用いた一実施形態のエクソソームの捕捉方法について説明する。ここでは、試料分析用デバイス１０１を用いる場合について説明する。

【0034】

図６は、エクソソームの模式的な断面図である。図６に示すエクソソームを検出対象のエクソソーム５０とする。図６に示すように、エクソソーム５０は脂質二重膜５１で覆われている。脂質二重膜５１には、複数の膜貫通型の膜たんぱく質５２が存在している。膜たんぱく質５２の個数や脂質二重膜５１における位置は、エクソソームの種類によって異なる。

【0035】

実施例１では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅを１００ｎｍとする。実施例１では、試料分析用デバイス１０１における凹部２０ａの幅Ｗａを２４０ｎｍ、凸部２０ｂの幅Ｗｂを８０ｎｍ、凹部２０ａの深さＨを５０ｎｍとする。

【0036】

実施例２では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅを７０ｎｍとする。実施例２では、凹部２０ａの幅Ｗａを２６０ｎｍ、凸部２０ｂの幅Ｗｂを６０ｎｍ、凹部２０ａの深さＨを６０ｎｍとする。

【0037】

ところで、エクソソーム５０の平均粒径Ｅとは、エクソソーム５０の粒径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えば、ナノ粒子トラキング法を用いた、エクソソーム５０が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡でエクソソーム５０の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。

【0038】

後者の測定方法では、エクソソーム５０の形態を保ったまま乾式で観測可能とするために、エクソソーム５０を含む試料に対して細胞を観測する手法に準じた処理を施す。

【0039】

具体的には、試料を基体上に固定し、低濃度のエタノールから純度１００％のエタノールまで、ステップごとにエタノールの濃度を高くして数ステップをかけてエタノールの含浸を繰り返す。これによって、試料中の水分がエタノールへと置換されて脱水される。

【0040】

次に、試料を、エタノールに可溶な合成樹脂を含む溶液で含浸することによって、エタノールを合成樹脂に置換する。そして、合成樹脂に置換された試料を薄片化して観測する。

【0041】

また、エクソソーム５０を含む試料を急速冷凍することにより、エクソソーム５０の形態を保ったまま脱水して観測可能とすることもできる。

【0042】

本実施形態のエクソソームの捕捉方法、及び、捕捉したエクソソーム５０を検出する試料分析方法では、後述するように、エクソソーム５０を検出するために図７の（ａ）に示すビーズ７０を用いる。実施例１及び実施例２では、ビーズ７０の直径Ｄを２００ｎｍとする。ビーズ７０は、例えば合成樹脂によって略球形に形成されている。

【0043】

図８は、エクソソーム５０を試料分析用デバイス１０１によって捕捉するための手順の各工程を示している。図８において、試料分析を行うオペレータは、ステップＳ１にて、図９の（ａ）に示すように、抗体６０を適量含む緩衝溶液Ｆ６０をウェル１０に分注する。膜貫通型の膜たんぱく質であるＣＤ６３やＣＤ９等は、エクソソームを識別するための抗原として知られている。

【0044】

ステップＳ１にて用いる抗体６０としては、抗原である膜たんぱく質５２と反応する抗体を用いる。なお、抗原は膜タンパク質５２に限定されず、脂質二重膜５１の表面に存在する、その他の物質であってもよい。

【0045】

オペレータは、ステップＳ１にて、図９の（ａ）に示す状態の試料分析用デバイス１０１を振盪機によって、適切な時間、振盪させる。ステップＳ１の処理によって、凹凸構造２０の表面に抗体６０が固定される。ステップＳ１は、抗体固定工程である。

【0046】

オペレータは、ステップＳ２にて、抗体を含む緩衝溶液Ｆ６０を排出して、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。

【0047】

図１０の（ａ）は、ステップＳ２の後の凹凸構造２０の表面の状態を模式的に示している。抗体６０は、凹凸構造２０の表面に疎水結合によって固着する。抗体６０を凹凸構造２０の表面に固定する方法は、疎水結合に限定されない。凹凸構造２０の表面を適切に化学的に修飾して、共有結合等を用いて抗体６０を凹凸構造２０の表面に固定させてもよい。凹凸構造２０の表面に抗体６０を固定させる方法は、免疫学測定法で一般的に使われている方法を用いればよい。

【0048】

抗体６０の抗原認識部以外に抗原が非特異的に吸着することを防ぐため、オペレータは、ステップＳ３にて、凹凸構造２０の表面をブロッキング処理する。具体的には、オペレータは、緩衝溶液で希釈したスキムミルクをウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を所定の時間、振盪させる。

【0049】

スキムミルクはエクソソーム５０に付着しないたんぱく質を含むので、ブロッキング処理に好適である。同様の効果を奏するものであれば、ブロッキング処理に用いる物質はスキムミルクに限定されない。

【0050】

オペレータは、ステップＳ４にて、スキムミルクを含む緩衝溶液を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝溶液としては、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略することも可能である。図１０の（ｂ）に模式的に示すように、凹凸構造２０の表面には、ステップＳ３，Ｓ４によってブロック層６５が形成されている。

【0051】

次に、オペレータは、ステップＳ５にて、図９の（ｂ）に示すように、検出対象のエクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０をウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を、適切な時間、振盪させる。ステップＳ５では、例えば２時間程度、試料分析用デバイス１０１を振盪させる。

【0052】

ステップＳ５によって、試料液Ｆ５０に含まれるエクソソーム５０の多くは、抗体６０と膜たんぱく質５２との抗原抗体反応によって、凹凸構造２０の凹部２０ａに固定される。ステップＳ５は、エクソソーム固定工程である。

【0053】

ステップＳ５の後、オペレータは、ステップＳ６にて、試料液Ｆ５０を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。ウェル１０を緩衝溶液で洗浄することによって、抗原抗体反応ではなく、非特異な吸着によって凹凸構造２０の表面に付着したエクソソーム５０を排除することができる。

【0054】

図１０の（ｃ）は、凹部２０ａに１つのエクソソーム５０が固定された状態を示している。図１０の（ｃ）に示すエクソソーム５０は、図６に示すエクソソーム５０を簡略化して模式的に示している。図１０の（ｃ）に示す例では、エクソソーム５０は、白抜きの楕円とハッチングを付した楕円とで模式的に示す２種類の膜たんぱく質５２を有する。

【0055】

図１０の（ｃ）に示すように、抗体６０とハッチングを付した楕円で示す膜たんぱく質５２とが抗原抗体反応によって結合し、エクソソーム５０が凹部２０ａに固定されている。なお、膜たんぱく質５２の種類は２種類に限定されない。上記のように、膜タンパク質以外の物質を抗原としてもよい。２種類のモノクローナル抗体を用いてエクソソーム５０を認識し捕捉する場合は、１または２種類の膜たんぱく質５２を認識すればよい。

【0056】

図７の（ｂ）に示すように、ビーズ７０には予め表面に抗体８０が固定されている。抗体８０が固定されていない図７の（ａ）に示すビーズ７０に対して、図７の（ｂ）に示すように抗体８０を固定させる工程は、図８の一連の工程とは別工程で行えばよい。

【0057】

オペレータは、ステップＳ７にて、図９の（ｃ）に示すように、表面に抗体８０が固定されたビーズ７０を含む緩衝溶液Ｆ７０をウェル１０に分注し、ステップＳ１と同様に、試料分析用デバイス１０１を、適切な時間、振盪させる。

【0058】

ステップＳ７によって、図１０の（ｄ）に示すように、エクソソーム５０はビーズ７０で修飾される。エクソソーム５０をビーズ７０で修飾することによって、ビーズ７０をエクソソーム５０の標識とすることができる。ステップＳ７は、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾する修飾工程である。

【0059】

オペレータは、ステップＳ８にて、緩衝溶液Ｆ７０を排出し、ウェル１０を緩衝溶液で洗浄する。以上によって、試料分析用デバイス１０１によってエクソソーム５０を捕捉し、エクソソーム５０をビーズ７０で修飾することができる。

【0060】

本実施形態では、ビーズ７０には、凹凸構造２０の表面に固定した抗体６０とは異なる抗体８０が固定されている。抗体８０と白の楕円で示す膜たんぱく質５２とが抗原抗体反応によって結合し、ビーズ７０がエクソソーム５０に固定されている。

【0061】

凹凸構造２０の表面に固定させる抗体とビーズ７０の表面に固定させる抗体とを異ならせると、２種類の異なる抗原を有するエクソソームを検出することができる。勿論、ビーズ７０に、凹凸構造２０の表面に固定した抗体６０と同じ抗体６０を固定させてもよい。同じ抗体を用いるか異なる抗体を用いるかは、試料を分析する都合によって適宜選択すればよい。

【0062】

上記の説明では、まずエクソソーム５０を凹凸構造２０の凹部２０ａによって捕捉し、次いで、ビーズ７０を投入して、ビーズ７０をエクソソーム５０に固定させたが、エクソソーム５０とビーズ７０とを同時に緩衝溶液中に投じて反応させる手順であってもよい。この場合、液中でエクソソーム５０とビーズ７０の固定反応が生じるため反応速度が促進されるというメリットが生じる。

【0063】

ビーズ７０の内部に、フェライト等の磁性物質を包含させてもよい。磁性物質を包含したビーズ７０とすると、ステップＳ７で、試料分析用デバイス１０１の下面に磁石を配置することによってビーズ７０を迅速に集めることができる。また、磁力によってビーズ７０を効果的に凹部２０ａに向かわせることができる。よって、ステップＳ７に要する時間を短縮することが可能となる。

【0064】

さらに、この場合も、前述のようにエクソソーム５０とビーズ７０とを同時に投入することで、さらなる反応の促進を図ることが可能となる。この場合、エクソソーム５０を凹凸構造２０上に固定するための振盪時間を、数分程度に短縮することも可能である。

【0065】

磁力によってビーズ７０を引き寄せた後、試料分析用デバイス１０１の下面に配置する磁石が電磁石であれば電源を切断し、永久磁石であれば試料分析用デバイス１０１から遠ざけて緩衝溶液Ｆ７０を再攪拌する。これによって、抗原抗体反応によらず固定されているビーズ７０を凹凸構造２０から一旦剥がし、その後再び磁力によってビーズ７０を引き寄せて、反応の収率を高めることも可能である。

【0066】

磁性物質を包含したビーズ７０を用いる場合、振盪による攪拌の他に、磁力が作用する方向と強さを変化させて攪拌させることも可能である。

【0067】

なお、磁力によってビーズ７０が発生する力によりエクソソーム５０が扁平に変更する可能性があるが、一旦、エクソソーム５０が凹部２０ａに捕捉されていれば、凸部２０ｂへと移動することはなく、エクソソーム５０の検出に影響を与えない。

【0068】

図８では、エクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０とビーズ７０を含む緩衝溶液Ｆ７０とを別々にウェル１０に分注しているが、エクソソーム５０を含む試料とビーズ７０とを同時に緩衝溶液に入れてウェル１０に分注し、ステップＳ５，Ｓ７を同時に行うようにしてもよい。この場合でも、磁性物質を包含したビーズ７０を用いることができる。

【0069】

ところで、第１実施形態の試料分析用デバイス１０１及び第２実施形態の試料分析用デバイス１０２では、エクソソーム５０の平均粒径Ｅ、ビーズ７０の直径Ｄ、凹凸構造２０の凹部２０ａの幅Ｗａ及び凸部２０ｂの幅Ｗｂ、凹部２０ａの深さＨを、以下に示す関係とすることが好ましい。

【0070】

試料分析用デバイス１０１，１０２の寸法的な形状と、検出対象のエクソソーム５０や標識として用いるビーズ７０とを以下に示す関係とすることによって、図１０の（ｄ）に示すように、１つのエクソソーム５０に１つのビーズ７０を結合させて、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係を極力１対１に近付けることができる。

【0071】

凹部２０ａの幅Ｗａは、エクソソーム５０の平均粒径Ｅよりも大きく、ビーズ７０の直径Ｄの２倍よりも小さいことが好ましい。即ち、試料分析用デバイス１０１，１０２は、式（１）の関係を有することが好ましい。
Ｅ＜Ｗａ＜２Ｄ …（１）

【0072】

式（１）のＥ＜Ｗａを満たせば、エクソソーム５０を凹部２０ａに固定させることができる。式（１）のＷａ＜２Ｄを満たせば、ビーズ７０が凹部２０ａの幅方向に同時に２つ入りにくくなり、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係が１対１に近付くこととなる。

【0073】

式（２）を満たすことが好ましい。
Ｗｂ＜Ｄ＜Ｗａ＜２Ｄ …（２）
式（２）のＷｂ＜Ｄを満たせば、ビーズ７０は凸部２０ｂ上に位置しにくくなる。式（２）のＤ＜Ｗａを満たせば、ビーズ７０は凹部２０ａに入ることができる。

【0074】

式（３）を満たすことが好ましい。
Ｗｂ＜Ｅ …（３）
式（３）を満たせば、エクソソーム５０は凸部２０ｂ上に位置しにくくなる。

【0075】

式（４）を満たすことが好ましい。
Ｅ＜Ｗａ＜４Ｅ …（４）

【0076】

凹部２０ａに捕捉されたエクソソーム５０は、多くの場合、図１０の（ｃ）に示すように、球形から、接触面積を拡げる方向に変形する。上記のように、磁性物質を包含したビーズ７０を用いると、磁力によってエクソソーム５０の変形が促進される。

【0077】

球形のエクソソーム５０が体積を保って楕円体に変形したと仮定すると、球の直径が５０％変化する場合、回転楕円体の長軸である凹部２０ａとの接触部位の直径は約４０％大きくなる。さらに実際には、回転楕円体形状よりも接触部位の面積が大きくなる方向に変形するので、接触部位の直径は、元の球形のときの直径の５０％以上、ときには１００％以上増大することもありえる。

【0078】

以上のことから、式（４）のＷａ＜４Ｅを満たすことが好ましい。

【0079】

エクソソーム５０の平均粒径Ｅとビーズ７０の直径Ｄとは、式（５）を満たすことが好ましい。
Ｅ＜Ｄ …（５）

【0080】

式（５）を満たせば、凹部２０ａに固定されたエクソソーム５０を複数のビーズ７０で修飾しにくくなり、エクソソーム５０とビーズ７０との数量関係を１対１に近付けることができる。式（５）を満たせば、エクソソーム５０とビーズ７０とが反応的に出会う確率が上がり、結果として反応の収率を上げることができる。

【0081】

凹部２０ａの深さＨは、式（６）を満たすことが好ましい。
（Ｄ＋Ｅ）／８＜Ｈ …（６）

【0082】

式（６）を満たせば、エクソソーム５０は凹部２０ａにほぼ確実に固定され、ビーズ７０の凸部２０ｂへの非特異的な吸着を防ぎ、ビーズ７０はほぼ確実に凹部２０ａに存在するエクソソーム５０に固定される。

【0083】

凹部２０ａの深さＨが式（７）を満たすことはさらに好ましい。
（Ｄ＋Ｅ）／６＜Ｈ …（７）

【0084】

実施例１は、式（１）〜式（６）を満たし、実施例２は、式（１）〜式（７）を満たす。実施例１，２によれば、凹部２０ａに固定されたエクソソーム５０とビーズ７０との数量関係をほぼ１対１とすることができる。１つのエクソソーム５０に２つまたは３つのビーズ７０が結合する場合が僅かにあるが、エクソソーム５０を定量的に検出することにほとんど影響を与えない。

【0085】

式（１）〜式（７）の全てを満たすことが最も好ましいが、式（１）〜式（７）を部分的に満たすだけでもよい。式（１）を満たすだけでも効果的である。式（１）に加えて式（４）を満たすことが好ましい。式（１）に加えて式（３）を満たすことも好ましい。式（１）に加えて式（３）及び式（４）を満たすことはより好ましい。

【0086】

式（１）に加えて、式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすことが好ましい。式（１）に加えて、式（４）及び式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすことはより好ましい。式（１）に加えて、式（３）及び式（２）におけるＷｂ＜Ｄを満たすこともより好ましい。式（１）と、式（２）におけるＷｂ＜Ｄと、式（３）と、式（４）との全てを満たすことはさらに好ましい。

【0087】

ところで、試料分析用デバイスは、試料分析用デバイス１０１，１０２として図１、図４に示した矩形状の他、円形のディスク状であってもよい。この場合であっても、以上説明した免疫学的測定法を用いた反応を同様に行うことができる。試料分析用デバイスを円形のディスク状とした場合には、凹凸構造２０の凹部２０ａ及び凸部２０ｂをスパイラル状または同心円状としてもよい。後述するエクソソーム５０の検出に際して、ディスク状の形状を活かすことができる。

【0088】

さらに、ディスク状の場合は、ディスク状の形状に対応させた送液路の構造を設けることも可能である。図１１〜図１３を用いて、送液路の構造を設けたディスク状の試料分析用デバイスを第３実施形態の試料分析用デバイスとして説明する。第３実施形態において、第１，第２実施形態と実質的に同一の物質や同一の部分には同一の符号を付して説明することとする。

【0089】

＜第３実施形態の試料分析用デバイス＞
図１１において、第３実施形態の試料分析用デバイス１０３は、ブルーレイディスク，ＤＶＤ，コンパクトディスク等の光ディスクと同じ直径の円盤状に形成されている。試料分析用デバイス１０３は、試料分析用ディスクである。図１１は、試料分析用デバイス１０３を透明保護層３６側から見た平面図である。

【0090】

試料分析用デバイス１０３は、光ディスクと同様、ポリカーボネート等の合成樹脂によって形成することができる。

【0091】

試料分析用デバイス１０３の中心部には、円形の開口１０３ａが形成されている。開口１０３ａの周囲には、開口１０３ａを取り囲むように、検出対象のエクソソーム５０を含む試料を滴下させるための注入孔３１が形成されている。

【0092】

それぞれの注入孔３１には、試料を流すための流路３２が連結されている。複数の流路３２は、注入孔３１から試料分析用デバイス１０３の外周端部方向へと放射状に伸びている。流路３２の中間部には、ビーズ７０を充填するためのビーズ充填部３３が設けられている。

【0093】

試料分析用デバイス１０３の外周端部には、扇状に広がった検出領域３４が設けられている。流路３２は検出領域３４と連結されている。注入孔３１から試料を注入して、試料分析用デバイス１０３を回転させると、試料は流路３２を伝わって検出領域３４に到達する。従って、検出領域３４は、各液が注入孔３１及び流路３２を経て注入される注入部である。

【0094】

試料分析用デバイス１０３の外周端部には、図１２の（ａ）に示すように、スパイラル状または同心円状の凹部２０ａと凸部２０ｂとを含む凹凸構造２０が形成されている。検出領域３４は、凹凸構造２０内に設けられている。

【0095】

図１２の（ａ）に示す凹凸構造２０の代わりに、図１２の（ｂ）に示すように、複数の凹状のピット２０ｃがスパイラル状または同心円状に配列されたピット構造２０Ｐとしてもよい。ピット２０ｃを設けていない部分は、ピット２０ｃに対して凸部であるから、ピット構造２０Ｐも凹凸構造である。

【0096】

試料分析用デバイス１０３では、透明保護層３６とは反対側の合成樹脂等で形成される円盤部分が、凹凸構造２０（ピット構造２０Ｐを含む）を形成するベース部となっている。

【0097】

図１１に示すように、凹凸構造２０の検出領域３４以外の部分はトラック領域３５となっている。トラック領域３５にアドレス情報を設けることによって、試料分析用デバイス１０３の半径方向及び周方向の位置を特定することができる。アドレス情報をピットやエンボスで設けてもよく、凹部２０ａまたは凸部２０ｂの側面のウォブリングによってアドレス情報を表すようにしてもよい。

【0098】

図１３は、試料分析用デバイス１０３の部分断面図である。ビーズ充填部３３に充填されているビーズ７０には、図７の（ｂ）と同様に、予め抗体８０が固定されている。実際には、凹凸構造２０に隣接してレーザ光を反射する反射層が設けられているが、図１２及び図１３では図示を省略している。

【0099】

まず、注入孔３１から抗体６０を含む緩衝溶液Ｆ６０を注入して試料分析用デバイス１０３を回転させると、図１０の（ａ）と同様に、凹凸構造２０の表面に抗体６０が固定される。必要に応じて、凹凸構造２０の表面をブロッキング処理すればよい。

【0100】

注入孔３１から検出対象のエクソソーム５０を含む試料液Ｆ５０を注入して試料分析用デバイス１０３を回転させると、エクソソーム５０がビーズ充填部３３を通過する際にビーズ７０で修飾される。ビーズ７０で修飾されたエクソソーム５０は、図１０の（ｄ）と同様に、凹部２０ａに固定される。図１３では、図示の都合上、エクソソーム５０の図示を省略し、ビーズ７０のみを図示している。

【0101】

検出領域３４には、図示していない光ピックアップのレーザ光源から発せられ、対物レンズ４０によって集光されたレーザ光が透明保護層３６を介して照射される。凹部２０ａに固定されたビーズ７０は、照射されたレーザ光の反射光を解析することによって検出できる。

【0102】

第３実施形態の試料分析用デバイス１０３における凹凸構造２０の寸法的な形状と、検出対象のエクソソーム５０や標識として用いるビーズ７０との大きさの関係は、第１，第２実施形態と同じである。

【0103】

＜エクソソームの検出及び試料分析方法＞
次に、第１〜第３実施形態の試料分析用デバイス１０１〜１０３によって、図１０の（ｄ）に示すように捕捉したエクソソーム５０を検出する検出方法について説明する。

【0104】

第１の検出方法として、光学顕微鏡を用いてビーズ７０を検出して、画像処理によってビーズ７０を計数することができる。その結果、エクソソーム５０が定量的に検出される。第１の検出方法は、第１，第２実施形態の試料分析用デバイス１０１，１０２によって捕捉したエクソソーム５０を検出するのに好適である。

【0105】

試料分析用デバイス１０１，１０２を搭載するステージを移動させて大面積でビーズ７０を計数することにより、計測の精度を上げることができる。光学顕微鏡の代わりにレーザ顕微鏡を用いて、検出する解像度を高くし、Ｓ／Ｎを向上させることも可能である。

【0106】

第２の検出方法として、ビーズ７０内に特定の波長の光を照射すると蛍光を発する蛍光物質を包含させて、蛍光を検出することによってビーズ７０を計数することができる。光学顕微鏡を用いて蛍光を発するビーズ７０を計測してもよいし、蛍光の総量を光センサで検出してもよい。第２の検出方法は、第１，第２実施形態の試料分析用デバイス１０１，１０２によって捕捉したエクソソーム５０を検出するのに好適である。

【0107】

第１及び第２の検出方法を用いる場合、ウェル１０を設けていない試料分析用デバイス１０１，１０２の裏面側からビーズ７０を検出するようにすれば、検出装置と試料分析用デバイス１０１，１０２との機械的な干渉を防ぐことができる。また、ウェル１０の形状を顕微鏡対物レンズ等の干渉を避ける形状とすることも可能である。

【0108】

第２実施形態の試料分析用デバイス１０２の場合には、シリコーンポリマーシート１２２を剥がすことができる。シリコーンポリマーシート１２２を剥がして基板１１２のみでビーズ７０を検出すれば、検出装置との機械的な干渉を回避することができる。

【0109】

第３の方法として、ビーズ７０に固定されている抗体８０に特異的に結合する酵素を標識とする２次抗体を用いてビーズ７０を検出し、計数することができる。代表的な２次抗体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）標識抗体やアルカリ・フォスファターゼ（AP）標識抗体である。

【0110】

これらの２次抗体は、酵素に応じた発光基質を加えることによって化学発光を生じる。従って、エクソソーム５０に固定されたビーズ７０を２次抗体で修飾して、発光基質を加えて生じた化学発光の光量を検出することによってビーズ７０を計数することができる。

【0111】

第４の方法として、第３実施形態の試料分析用デバイス１０３の場合には、上記のように、光ピックアップのレーザ光源から発せられたレーザ光で試料分析用デバイス１０３を走査することによって、ビーズ７０を計数することができる。凹凸構造２０の凹部２０ａをトラックとして、サーボ機構を用いてレーザ光のスポットをトラックに沿って走査させることにより、高速かつ高精度にビーズ７０を計数することが可能である。

【0112】

以上のようにして、エクソソーム５０に標識として固定されたビーズ７０を計数することによってエクソソーム５０を高精度に定量的に測定して、試料を分析することができる。

【0113】

本発明は、以上説明した各実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。

【符号の説明】

【0114】

１０ ウェル（注入部）
２０ 凹凸構造
２０ａ 凹部
２０ｂ 凸部
３４ 検出領域（注入部）
５０ エクソソーム
５２ 膜たんぱく質（抗原）
６０，８０ 抗体
７０ ビーズ
１０１〜１０３ 試料分析用デバイス
１１２ 基板（ベース部）
１２２ シート（シリコーンポリマーシート）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】