特許 6222648 腫瘍ワクチン効果を有する複合体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6222648

(24)【登録日】2017年10月13日

(45)【発行日】2017年11月1日

(54)【発明の名称】腫瘍ワクチン効果を有する複合体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20171023BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20171023BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171023BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20171023BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20171023BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/47ZNA

   A61K39/00 H

   A61P35/00

   C07K17/00

   C12N5/09

【請求項の数】15

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-73640(P2013-73640)

(22)【出願日】2013年3月29日

(65)【公開番号】特開2014-198671(P2014-198671A)

(43)【公開日】2014年10月23日

【審査請求日】2016年3月28日

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100122688

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 健二

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】王 継揚

【審査官】 星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０２０８４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００２１４７２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Ann.N.Y.Acad.Sci.，２００５年，Vol.1056，p.344-358

【文献】 Arthritis Res. Ther., 2011, Vol.13, No.2, R60

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫学的非自己細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体であって、
ＭＲＰ８分子が、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合している、複合体。

【請求項2】

免疫学的非自己細胞が腫瘍細胞である、請求項１記載の複合体。

【請求項3】

ＭＲＰ８分子が、ＭＲＰ８又はその機能的断片及び該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む融合分子である、請求項１又は２記載の複合体。

【請求項4】

該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分が、該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基である、請求項３記載の複合体。

【請求項5】

該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドが、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項４記載の複合体。

【請求項6】

固定されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項7】

固定がアルデヒド処理により行われている、請求項６記載の複合体。

【請求項8】

該免疫学的非自己細胞がビオチン化されている、請求項５記載の複合体。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。

【請求項10】

医薬である、請求項９記載の組成物。

【請求項11】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体を含む、ワクチン。

【請求項12】

該免疫学的非自己細胞が投与対象の個体から単離された免疫学的非自己細胞である、請求項１１記載のワクチン。

【請求項13】

腫瘍の治療用である、請求項１１又は１２に記載のワクチン。

【請求項14】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を含むワクチンの製造方法であって、
（ａ）投与対象の個体から単離された免疫学的非自己細胞とＭＲＰ８分子を水性緩衝液中で混合する工程、
（ｂ）（ａ）の混合液中で免疫学的非自己細胞の表面にＭＲＰ８分子を結合させ、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を得る工程、及び
（ｃ）（ｂ）で得られた免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を固定する工程
を含む、方法。

【請求項15】

腫瘍細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む、腫瘍細胞−ＭＲＰ８分子複合体であって、
ＭＲＰ８分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体を含有する腫瘍ワクチンを、腫瘍を有する対象（ヒトを除く）又は腫瘍の罹患暦を有する対象（ヒトを除く）に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫学的非自己細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む複合体、該複合体を含む組成物、医薬組成物、ワクチン等に関する。

【背景技術】

【0002】

摘出された腫瘍組織又は腫瘍細胞を用いた腫瘍ワクチン療法の歴史は古く、１９７８年に最初の動物実験の結果が報告された（非特許文献１、２）。その後１９９３年に最初の臨床試験（非特許文献３）が報告されて以来、膨大な動物実験及び臨床試験が行われてきた（非特許文献４、５）。しかしながら、腫瘍ワクチン療法による明確な治療効果は現在のところ得られていない。

【0003】

最近、腫瘍細胞にサイトカインなどの遺伝子を導入することにより、抗腫瘍効果が上昇するとの報告が数多くなされている。しかしながら、遺伝子導入効率を上げるために使用するウイルスベクターによる副作用の可能性や、長期間の細胞培養を必要とする方法の煩雑さなどの問題もあり、臨床応用には至っていない（非特許文献４、５）。

【0004】

腫瘍細胞にＴＮＦファミリーに属するタンパク質（本明細書中において、ＴＮＦファミリーメンバーとも言う）であるＦａｓリガンド（本明細書中において、ＦａｓＬとも言う）を強制発現させると、腫瘍が速やかに拒絶されることが１９９７年に報告されている（非特許文献６）。本発明者らは、この拒絶現象をさらに詳細に解析した結果、腫瘍細胞にＦａｓＬを発現させることにより、本来拒絶されない腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞依存性の獲得免疫が成立することを示した（非特許文献７−１２）。しかも、この獲得免疫は複数の腫瘍特異的抗原を認識することが示唆された（非特許文献９）。即ち、腫瘍細胞が異物として自身の免疫系に排除されることが判明した。しかしながら、上記のように、発現ベクターを利用する方法は、時間がかかる上にベクターによる副作用の問題があり、実際の臨床においてはほとんど利用されていない。

【0005】

非特許文献１３には、細胞表面をビオチン化した膵臓に、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＦａｓＬ融合タンパク質を結合させ、これをアロのレシピエントに移植すると、該膵臓移植片の拒絶が抑制されたことが記載されている。また、非特許文献１４には、細胞表面をビオチン化したアロの血管内皮細胞に、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＦａｓＬ融合タンパク質を結合させ、これをレシピエントに移植すると、該血管内皮細胞移植片の拒絶が抑制されたことが記載されている。

【0006】

本発明者らは、発現ベクターによらず直接腫瘍細胞表面上にＴＮＦファミリーメンバー（ＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＲＡＮＫＬ）の細胞外領域又はその機能的断片を含む分子を結合させた、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を開発している（特許文献１）。当該複合体は、腫瘍ワクチンとして腫瘍の増殖及び転移を効率よく抑制することができる上に、迅速かつ安定的に調製することができる。一方、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片を含まない他の分子を腫瘍細胞表面上に結合させた場合に同様に腫瘍ワクチンとなるか否かについては、これまで全く知られていない。

【0007】

ＭＲＰ８（骨髄関連タンパク質（myeloid related protein）８）（Ｓ１００Ａ８又はcalgranulin Aとしても知られている）は、ＭＲＰ１４（Ｓ１００Ａ９又はcalgranulin Bとしても知られている）と共に、骨髄由来細胞（単球、顆粒球、分化初期のマクロファージ）などで発現している細胞質タンパク質であり、細胞内において細胞骨格の制御等の役割を担っていると考えられている。ＭＲＰ８及びＭＲＰ１４はいずれもシグナル配列を持たないが、細胞のダメージ又は食細胞の活性化により細胞外に分泌されることが示されている（非特許文献１５）。ＭＲＰ８は、ＭＲＰ１４とのヘテロダイマーとして主に存在し、当該へテロダイマー又はＭＲＰ８は、リポ多糖（ＬＰＳ）の受容体として知られるＴＬＲ４の内因性リガンドであることが示されている（非特許文献１５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１２／０２０８４２号パンフレット

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Cancer Res. 38: 204-209 (1978).

【非特許文献2】Cancer Res. 39:1353-1360 (1979).

【非特許文献3】J. Clin. Oncol. 11: 390-9 (1993).

【非特許文献4】J. Clin. Invest. 114: 450-62 (2004).

【非特許文献5】Rev. Recent Clin. Trials 1: 283-92 (2006).

【非特許文献6】Nat. Med. 3: 165-70 (1997).

【非特許文献7】Int. J. Mol. Med. 9: 281-285 (2002).

【非特許文献8】Anticancer Res. 22: 831-836 (2002).

【非特許文献9】J. Immunol. 169: 2241-2245 (2002).

【非特許文献10】Cancer Gene Ther. 10: 134-140 (2003).

【非特許文献11】Clinical Immunology 39: 532-536 (2003)

【非特許文献12】Cancer Gene Ther. 14: 262-267 (2007).

【非特許文献13】Mol. Immunol. 44(11): 2884-2892 (2007).

【非特許文献14】Circulation 107:1525-1531 (2003).

【非特許文献15】J. Leukoc. Biol. 86: 557-566 (2009).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、投与対象の体内に存在する腫瘍細胞等の免疫学的非自己抗原を有する細胞に対する特異的な免疫反応を活性化させることができるワクチン等を提供すること、及びそれに用いられる有効成分を提供することを目的とする。より具体的には、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片を含む分子以外の分子であって、当該分子を免疫学的非自己細胞表面上に結合させた複合体がワクチンとして機能する分子を見出し、当該分子を利用するワクチン（好ましくは腫瘍ワクチン）及びそれに用いられる有効成分を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者は、上記課題を解決するために、腫瘍細胞を非自己として排除する免疫反応を効率的に誘導するために当該腫瘍細胞表面上に結合させる分子を鋭意検討した。その結果、ＴＬＲ４の内因性リガンドとして知られるＭＲＰ８を結合させた腫瘍細胞が、同質遺伝子的な腫瘍細胞の肺転移に対する抑制効果を有しており、腫瘍ワクチンとして機能を示すことを見出した。ＭＲＰ８は、ＴＮＦファミリーメンバー（ＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＯＸ４０Ｌなど）とは全く異なるカテゴリーに属するタンパク質であるが、ＭＲＰ８を結合させた腫瘍細胞は優れた腫瘍ワクチン効果を発揮した。以上の知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成させるに至った。

【0012】

すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］免疫学的非自己細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体であって、
ＭＲＰ８分子が、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合している、複合体。
［２］免疫学的非自己細胞が腫瘍細胞である、［１］に記載の複合体。
［３］ＭＲＰ８分子が、ＭＲＰ８又はその機能的断片及び該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む融合分子である、［１］又は［２］に記載の複合体。
［４］該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分が、該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基である、［３］に記載の複合体。
［５］該免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドが、アビジン又はストレプトアビジンである、［４］に記載の複合体。
［６］固定されている、［１］〜［５］のいずれかに記載の複合体。
［７］固定がアルデヒド処理により行われている、［６］に記載の複合体。
［８］該免疫学的非自己細胞がビオチン化されている、［５］記載の複合体。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の複合体を含む組成物。
［１０］医薬である、［９］に記載の組成物。
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載の複合体を含む、ワクチン。
［１２］該免疫学的非自己細胞が投与対象の個体から単離された免疫学的非自己細胞である、［１１］に記載のワクチン。
［１３］腫瘍の治療用である、［１１］又は［１２］に記載のワクチン。
［１４］［１］〜［８］のいずれかに記載の免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を含むワクチンの製造方法であって、
（ａ）投与対象の個体から単離された免疫学的非自己細胞とＭＲＰ８分子を水性緩衝液中で混合する工程、
（ｂ）（ａ）の混合液中で免疫学的非自己細胞の表面にＭＲＰ８分子を結合させ、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を得る工程、及び
（ｃ）（ｂ）で得られた免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を固定する工程
を含む、方法。
［１５］腫瘍細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む、腫瘍細胞−ＭＲＰ８分子複合体であって、
ＭＲＰ８分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体を含有する腫瘍ワクチンを、腫瘍患者又は腫瘍の罹患暦を有する患者に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明の複合体、組成物及びワクチン（好ましくは腫瘍ワクチン）を用いることにより、種々の腫瘍、ウイルス感染、細胞内寄生性バクテリア感染など（好ましくは種々の腫瘍）を効果的に予防又は治療することができる。特に本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞として投与対象の個体から単離された腫瘍細胞を用いることにより、腫瘍細胞の持つ多種の腫瘍抗原に対する免疫が成立し、投与対象の個体内に存在する腫瘍細胞が排除される。従って、本発明の複合体、組成物及び腫瘍ワクチンを、外科的手術等により腫瘍除去の治療を受けた患者に対して投与すると、自己の腫瘍細胞に特異的に発現する多種の腫瘍抗原に対する免疫を当該患者の体内で活性化させることができる。その結果、当該患者の体内に残存する可能性がある腫瘍細胞（例えば、微小転移した腫瘍細胞）を排除することができる。従って、本発明の複合体、組成物及び腫瘍ワクチンは、特に腫瘍治療後の腫瘍の再発の防止に有効である。
また発現ベクターを用いて細胞表面にタンパク質を発現させる場合には、発現ベクターによる遺伝子導入に長い時間を要する。加えて、（１）ベクターの細胞への導入効率、（２）細胞内におけるベクターのプロモーター・エンハンサー活性、（３）発現させるタンパク質の細胞毒性、などに起因して、目的のタンパク質を高いレベルで細胞表面に発現させることができないことがある。しかし、本発明の複合体等は、これらの細胞や分子自体の特性による製造工程への影響を受けることなく、非常に短い時間で安定して製造することができる。
従って、本発明により、種々の腫瘍、ウイルス感染、細胞内寄生性バクテリア感染など（好ましくは種々の腫瘍）に対して有効な治療手段及び再発の予防手段を迅速かつ安定的に提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】細胞表面にＭＲＰ８を結合させ固定した腫瘍細胞の転移抑制効果を示す。ＭＲＰ８を細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞、発現ベクターによりＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞、ＦａｓＬ、ＴＮＦ及びＯＸ４０Ｌを結合させ固定した腫瘍細胞、又はＰＢＳをマウス皮下に接種し、２週間後に同質遺伝子的な腫瘍細胞を静脈注射により接種し、その３週間後に肺を摘出して腫瘍転移を調べた。ＭＲＰ８を細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞は、ＦａｓＬ、ＴＮＦ及びＯＸ４０Ｌを結合させ固定した腫瘍細胞と同等の高い転移抑制効果を示した。データは、５個体についての平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。

【図2】細胞表面にＭＲＰ８を結合させ固定した腫瘍細胞の転移抑制効果を示す写真である。ＰＢＳを接種した対照群と比較して、ＭＲＰ８を結合させ固定した腫瘍細胞を接種した群では腫瘍転移の抑制効果が確認された。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体
本発明は、免疫学的非自己細胞及び単離されたＭＲＰ８分子を含む、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体であって、
ＭＲＰ８分子が、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合している、複合体（以下、本発明の複合体とも言う）を提供する。

【0016】

１−１．免疫学的非自己細胞
本明細書において、免疫学的非自己細胞とは、免疫学的非自己抗原を少なくとも１つ発現する細胞を意味する。免疫学的非自己抗原としては、特に限定されないが、例えば、出生後のミスセンス変異により、免疫系が自己と認識するタンパク質（例えば、生殖系列にコードされたタンパク質）とは異なるアミノ酸配列を有する変異タンパク質、ウイルスや細胞内寄生性バクテリアの感染により生体内へ持ち込まれた外来性抗原（ウイルス抗原、バクテリア抗原）等を挙げることができる。また、正常細胞では低い発現量であるか発現していないタンパク質であって腫瘍細胞では発現が有意に上昇しているタンパク質も、本発明の免疫学的非自己抗原に含まれる。例えば、このようなタンパク質では通常は免疫系によって認識されないが、異常な発現量になることで免疫学的非自己抗原となり得る。従って、免疫学的非自己細胞の具体例としては、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細胞内寄生性バクテリア感染細胞等を挙げることができる。腫瘍細胞は、通常、複数の変異遺伝子を発現することが知られている。免疫学的非自己細胞は、好ましくは腫瘍細胞である。

【0017】

本発明の複合体に含まれる細胞としては、本発明におけるワクチン等の投与対象である哺乳動物由来の任意の細胞を使用することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類などが挙げられ、特に限定されないが、好ましくはげっ歯類（マウス等）、イヌ、ネコ又は霊長類（ヒト等）である。

【0018】

腫瘍としては、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍が挙げられる。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍等が挙げられるが、これらに限定されない。造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Ｔリンパ腫、Ｂリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0019】

腫瘍細胞としては、上記の腫瘍を有する個体から摘出した腫瘍組織中に含まれる腫瘍細胞を継代して又は継代することなく使用することができる。腫瘍組織中に含まれる腫瘍細胞を用いる場合には、腫瘍組織自体を用いてもよいし、腫瘍組織をトリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ等のプロテアーゼで処理することにより、細胞を分散し、得られた細胞懸濁液から腫瘍細胞を単離して用いてもよい。

【0020】

本発明に用いる免疫学的非自己細胞は、単離又は精製されていることが好ましい。「単離」又は「精製」とは、目的とする対象物以外のものを除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された細胞に含まれる免疫学的非自己細胞の純度（全細胞数に対する免疫学的非自己細胞数の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。

【0021】

１−２．ＭＲＰ８分子
ＭＲＰ８は、リポ多糖（ＬＰＳ）の受容体であるＴＬＲ４の内因性リガンドとして知られているタンパク質である。本発明は、ＭＲＰ８の機能的断片を含む分子を腫瘍細胞表面に結合させた複合体が、腫瘍転移を効果的に抑制することを見出したことに基づくものである。

【0022】

本発明で使用するＭＲＰ８は、通常、哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類などが挙げられ、特に限定されないが、好ましくはげっ歯類（マウス等）、イヌ、ネコ又は霊長類（ヒト等）であり、より好ましくはヒトである。

【0023】

本発明に用いられるタンパク質について、「生物Ｘ由来」とは、該タンパク質のアミノ酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している該タンパク質のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現しているタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該タンパク質の機能が維持されていることを意味する。

【0024】

主要な哺乳動物のＭＲＰ８のアミノ酸配列は、公知であり、ＮＣＢＩ等のデータベースから入手可能である。例えば、ヒトのＭＲＰ８のアミノ酸配列（配列番号１）はＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＨ０５９２８．１（２００６年９月１４日更新）として、またマウスのＭＲＰ８のアミノ酸配列（配列番号２）はＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＢ０７２２９．１（１９９６年９月４日更新）として公開されている。

【0025】

本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子は、少なくともＭＲＰ８又はその機能的断片を含む。ＭＲＰ８の機能的断片の長さは、該断片を含むＭＲＰ８分子がＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該ＴＬＲ４を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、特に制限されないが、通常、５０アミノ酸以上である。また、ＭＲＰ８のアミノ酸配列における機能的断片の位置は、該断片を含むＭＲＰ８分子がＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該ＴＬＲ４を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、特に制限されない。

【0026】

ＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該ＴＬＲ４を発現する細胞を刺激する活性がより高いＭＲＰ８分子を得ることができることから、本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子は全長のＭＲＰ８を含むことが好ましい。

【0027】

本発明に用いるＭＲＰ８分子は、ＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該ＴＬＲ４を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。ＭＲＰ８分子による刺激とは、具体的にはＴＬＲ４シグナル伝達の活性化を意味する（Vogl et al., Nature Medicine 13:1042-1049 (2007); Loser et al., Nature Medicine 16:713-717 (2010)参照）。

【0028】

ＴＬＲ４シグナル伝達の活性化能は、後述の実施例に記載されるように、ＭＲＰ８分子を含む培地中でＴＬＲ４を発現することが知られているＢ細胞を培養し、^３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定してＢ細胞の増殖促進活性を調べることで、評価することができる。より具体的には、ＭＲＰ８分子を含まない培地中で培養したＢ細胞と比較して^３Ｈ−チミジンの取り込み量が有意に増加した場合に、当該ＭＲＰ８分子がＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該ＴＬＲ４を発現する細胞を刺激する活性を有すると評価することができる。

【0029】

本発明で使用され得るＭＲＰ８分子は、単離又は精製された分子である。「単離」又は「精製」とは、目的とする対象物以外のものを除去する操作が施され、天然に存在する対象物以外の物質との混在状態を脱していることを意味する。具体的には、単離又は精製されたＭＲＰ８分子に含まれるＭＲＰ８分子の純度（全タンパク質重量に対するＭＲＰ８分子の重量割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。従って、本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞内に存在する遺伝子から発現したＭＲＰ８分子は、「単離又は精製されたＭＲＰ８分子」には含まれない。即ち、本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子は、複合体となる前の段階では該免疫学的非自己細胞外に該免疫学的非自己細胞とは独立に存在する分子である。

【0030】

本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子は、該複合体中に含まれる免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、本発明の複合体中に含まれる免疫学的非自己細胞の表面上に結合する。従って、好ましい態様において、本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子は、天然のＭＲＰ８のペプチド部分に加え、免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分をも含み得る。免疫学的非自己細胞表面上の分子と、該分子に親和性を有する部分との組み合わせの例を表１に示すが、これらに限定されない。

【0031】

【表1】

【0032】

免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分は、好ましくは、免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドである。免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドは、好ましくは、アビジン又はストレプトアビジンである。アビジン及びストレプトアビジンは、ビオチン化された免疫学的非自己細胞の表面に強く結合する活性を持つため、本発明に好適に用いられる。

【0033】

ＭＲＰ８又はその機能的断片と免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分との連結の態様は、本発明の複合体を形成した際に、ＭＲＰ８又はその機能的断片と免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分とが分離しない様式で連結され、且つＭＲＰ８分子が、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得る限り限定されないが、例えば、ペプチド結合やジスルフィド結合などの共有結合、或いは水素結合、疎水結合、イオン結合などの非共有結合により両者は連結される。結合の安定性の観点から、両者は好ましくは共有結合（例、ペプチド結合）により連結される。これらの結合様式による両者の結合は当業者であれば適宜なし得るものである。

【0034】

免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分として免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドを用いる場合、本発明において用いられるＭＲＰ８分子は、好ましくは、ＭＲＰ８又はその機能的断片及び免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基を含む融合タンパク質である。該融合タンパク質における、免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基の位置は、該融合タンパク質が該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得る限り、ＭＲＰ８又はその機能的断片のＮ末端側又はＣ末端側のいずれの位置でもよいが、好ましくはＮ末端側である。

【0035】

該融合タンパク質における、ＭＲＰ８又はその機能的断片と免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基との距離は、該融合タンパク質が該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。しかしながら、合成の容易さ及びタンパク質の安定性の観点から、該距離は短いほど好ましく、ＭＲＰ８又はその機能的断片と免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基とは、例えば約１〜１００アミノ酸（好ましくは約１〜５０アミノ酸、より好ましくは約１〜２５アミノ酸、更に好ましくは約１〜１０アミノ酸）からなるリンカーポリペプチド残基又は結合手を介して連結されていることが好ましい。該リンカーポリペプチド残基のアミノ酸配列は、該融合タンパク質が該免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。

【0036】

本発明において用いられる、ＭＲＰ８分子はまた、免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得る限り、任意のアミノ酸配列を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に含んでいてもよい。そのようなアミノ酸配列としては、ＭＲＰ８分子の精製又は検出のためのアフィニティータグを挙げることができる。そのようなアフィニティータグは、当該分野で周知であり、例えば、ＦＬＡＧペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988))、ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｃタグ、ＨＡタグ等を例示することが出来る。

【0037】

ＭＲＰ８分子は、種々の公知の方法により取得することができる。例えばＭＲＰ８分子を天然に発現するヒト、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織、細胞、又は培養上清から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する方法；ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する方法；ＭＲＰ８分子をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を作製し培養する方法；あるいは、ＭＲＰ８分子をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等によって取得することができる。

【0038】

ＭＲＰ８分子を天然に発現する哺乳動物の組織又は細胞から上記ポリペプチドを調製する場合、該組織又は細胞をホモジナイズした後、酸、又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知のタンパク質分離技術（例：塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等）に付すことにより単離・精製することができる。また培養上清からも同様にして単離・精製することができる。

【0039】

化学的なＭＲＰ８分子の合成は、市販のペプチド・シンセサイザーを用いることにより行うことが出来る。

【0040】

ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて上記ポリペプチドを調製する場合、ＭＲＰ８分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。例えば、Molecular Cloning, 2nd ed.; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989) に記載の方法などを参照することができる。ＭＲＰ８分子をコードするポリヌクレオチドは、ＭＲＰ８分子を構成する上述の各構成要素（ＭＲＰ８又はその機能的断片及び免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基）をコードするポリヌクレオチドを、リガーゼなどの適切な酵素を用いて公知の遺伝子組換え技術により連結することにより、製造することが出来る。ＭＲＰ８分子を構成する各構成要素をコードするポリヌクレオチドは、それぞれの公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、各構成要素をコードするＤＮＡクローン等を鋳型として用い、ＰＣＲによって直接増幅することができる。或いは、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により各構成要素をコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。

【0041】

取得されたポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。また、効率的に細胞外へＭＲＰ８分子を分泌させるため、分泌タンパク質（例、ＩＬ−４等）のシグナル配列を５’末端に付加してもよい。このようなシグナル配列は当業者に周知であり、当業者であれば適宜選択することが出来る。これらの翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及びシグナル配列は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。

【0042】

得られたポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより、ＭＲＰ８分子を発現し得る発現ベクターを製造することができる。発現ベクターの種類は、使用する宿主に応じて適宜選択することが出来る。そして、当該発現ベクターを自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体を製造することができる。該形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物からＭＲＰ８分子を単離又は精製することにより、ＭＲＰ８分子を製造することが出来る。

【0043】

無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記と同様、公知のクローニング方法により調製した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ及び基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。

【0044】

１−３．ＭＲＰ８分子と免疫学的非自己細胞との結合
本発明の複合体においては、ＭＲＰ８分子が、免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るように、該免疫学的非自己細胞の表面上に結合している。

【0045】

本明細書において、複合体とは、複数の構成因子が共有結合又は非共有結合することにより得られる物質を意味する。

【0046】

ＭＲＰ８分子が、免疫学的非自己細胞の表面上に結合した状態で、該免疫学的非自己細胞以外の細胞の表面上に発現したＴＬＲ４に結合し、且つ当該ＴＬＲ４を介して当該細胞を刺激し得るか否かは、上記（１−２．ＭＲＰ８分子）の項において詳述した、ＭＲＰ８分子の活性を評価する試験において、ＭＲＰ８分子に替えて、免疫学的非自己細胞及びＭＲＰ８分子を含む複合体を用いることにより評価することが出来る。この評価においては、免疫学的非自己細胞及びＭＲＰ８分子を含む複合体と、ＴＬＲ４を発現する細胞とを、例えば１：１の細胞数の比率で混合する。

【0047】

免疫学的非自己細胞とＭＲＰ８分子との結合は、結合定数が少なくとも１０^７Ｍ、好ましくは１０^９Ｍ以上、より好ましくは１０^１２Ｍ以上となるような態様でなされる。このような結合は、ペプチド結合やジスルフィド結合などの共有結合、水素結合、疎水結合などの非共有結合から選択することができる。

【0048】

上述のように、本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子が本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む場合には、ＭＲＰ８分子に含まれる当該親和性を有する部分が、当該免疫学的非自己細胞表面上の分子に結合することにより、ＭＲＰ８分子が免疫学的非自己細胞の表面上に結合する。免疫学的非自己細胞表面上の分子と、該分子に親和性を有する部分との組み合わせの例は上記表１に示されている。

【0049】

本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子の量は、該複合体がＴＬＲ４を発現する細胞を、当該ＴＬＲ４を介して刺激し得る限り限定されないが、通常１個の免疫学的非自己細胞につき、１，０００〜１００，０００個、好ましくは５，０００〜５０，０００個のＭＲＰ８分子が、細胞表面上に結合している。

【0050】

本発明の複合体は、免疫学的非自己細胞と、ＭＲＰ８分子とを、水性緩衝液中で混合し、ＭＲＰ８分子を免疫学的非自己細胞の表面へ結合させることにより、製造することが出来る。ここで、水性緩衝液としては、ＭＲＰ８分子を製造する際に用いた宿主細胞の培養上清、免疫学的非自己細胞を培養するための細胞培養液又はリン酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

また免疫学的非自己細胞とＭＲＰ８分子との混合比は、得られる本発明の複合体が、ＴＬＲ４を発現する細胞を、当該ＴＬＲ４を介して刺激し得る限り限定されないが、例えば１個の免疫学的非自己細胞当り、１，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、５０，０００個以上、好ましくは１００，０００個以上のＭＲＰ８分子が混合される。

【0052】

免疫学的非自己細胞は、生存状態又は非生存状態で、本発明の複合体の製造に用いられる。生存状態の免疫学的非自己細胞には、個体から摘出した腫瘍組織、腫瘍組織から単離された腫瘍細胞、これらの腫瘍組織又は腫瘍細胞を継代して得られた腫瘍細胞、継代した又は継代していない腫瘍組織又は腫瘍細胞を放射線照射で処理したもの等が含まれる。非生存状態の免疫学的非自己細胞としては、固定された腫瘍組織又は腫瘍細胞、凍結保存された腫瘍組織又は腫瘍細胞、放射線照射処理で致死となった腫瘍組織又は腫瘍細胞等が含まれる。

【0053】

放射線照射による処理を行なう場合、免疫学的非自己細胞の増殖を阻止するのに十分かつ適切な線量が、免疫学的非自己細胞の種類、試料の状態に応じて選択される。例えば放射線に対する感受性の高い免疫学的非自己細胞に対しては２０〜４０Ｇｙの線量を、感受性の低い免疫学的非自己細胞に対しては７０Ｇｙ以上の線量を照射し得る。放射線照射処理で致死となった腫瘍組織又は腫瘍細胞は、細胞の増殖を阻止するのに十分かつ適切な線量が与えられてから６時間以上、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２４時間以上の時間を経過させることで得ることができる。放射線には、Ｘ線、γ線、重粒子線、陽子線等が含まれる。

【0054】

免疫学的非自己細胞の固定は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸などの酸を含む固定液、塩化第二水銀、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの金属塩を含む固定液、メタノール、エタノール、アセトンなどの脱水剤系の固定液を用いて、公知の方法により行なうことができる。中でも、免疫学的非自己細胞に含まれる抗原の立体構造を維持する観点から、アルデヒド系の固定液を用いるアルデヒド処理が好ましく、特にパラホルムアルデヒドを用いることが好ましい。このような免疫学的非自己細胞の固定の方法は当業者に周知である。

【0055】

凍結保存を行なう場合、細胞を培地などの溶媒に懸濁し、耐凍性容器に分注し、０℃以下、好ましくは−２０℃以下、特に好ましくは−７０℃以下で凍結する。また腫瘍細胞などの免疫学的非自己細胞を含む組織、例えば個体から摘出した組織を凍結により固定する場合には、耐凍性容器に入れ、凍結用包埋材と共に、又はそのまま凍結する。凍結は、急速凍結装置、加圧凍結装置などの市販の装置を用いて行なうことができる。

【0056】

本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子が本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む場合には、ＭＲＰ８分子に含まれる当該親和性を有する部分が、当該免疫学的非自己細胞表面上の分子に結合することにより、ＭＲＰ８分子が免疫学的非自己細胞の表面上に結合する。

【0057】

免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分としてアビジン又はストレプトアビジンを用いる場合には、免疫学的非自己細胞の表面を予めビオチン化することが好ましい。免疫学的非自己細胞の表面のビオチン化は、例えば、Sulfo-NHS-biotin（Pierce社製）等のビオチン化試薬で、免疫学的非自己細胞の表面を処理することにより行うことが出来る。

【0058】

本発明の複合体に含まれるＭＲＰ８分子が本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含まない場合には、化学架橋等の方法を用いることにより、ＭＲＰ８分子を免疫学的非自己細胞の表面に結合することが出来る。例えば、Sulfo-NHS-Diazirine（Pierce社製）等の光反応性架橋剤を用いることで、ＭＲＰ８分子を免疫学的非自己細胞の表面に共有結合させることができる。

【0059】

免疫学的非自己細胞の表面へのＭＲＰ８分子の結合は、上記ビオチン-ストレプトアビジン相互作用や化学架橋等の手段に応じて、使用する試薬の製造者の提供するプロトコールに従って、又は自体公知の反応条件で、達成することができる。特に、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用は非常に強いため、このような相互作用を利用すれば、例えば４℃で５分間、ローテーター等で穏やかに撹拌するだけで、免疫学的非自己細胞−ＭＲＰ８分子複合体を得ることができる。

【0060】

ＭＲＰ８分子を免疫学的非自己細胞の表面へ結合させた後に、得られた複合体を適切な緩衝液等で洗浄し、未反応のＭＲＰ８分子を除去することにより、本発明の複合体を単離又は精製することが出来る。単離又は精製された本発明の複合体に含まれる当該複合体の純度（全タンパク質重量に対する当該複合体のタンパク質重量の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。

【0061】

本発明の複合体は、固定されていることが好ましい。本発明の複合体を固定することにより、腫瘍ワクチン効果が高まるためである。本発明の複合体の固定は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸などの酸を含む固定液、塩化第二水銀、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの金属塩を含む固定液、メタノール、エタノール、アセトンなどの脱水剤系の固定液を用いて、公知の方法により行なうことができる。中でも、免疫学的非自己細胞に含まれる抗原の立体構造を維持する観点から、アルデヒド系の固定液を用いるアルデヒド処理が好ましく、特にパラホルムアルデヒドを用いることが好ましい。このような免疫学的非自己細胞の固定の方法は当業者に周知である。

【0062】

２．本発明の複合体の用途
本発明の複合体を用いれば、免疫学的非自己細胞、好ましくは腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応を活性化させることが可能となる。従って、本発明の複合体をワクチン（好ましくは腫瘍ワクチン）として投与することにより、該ワクチンの投与を必要とする対象（好ましくは腫瘍患者又は腫瘍の罹患暦を有する患者）における免疫学的非自己細胞（好ましくは腫瘍細胞）に対する免疫反応を活性化させることができる。好ましい態様において、本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞が腫瘍細胞である場合には、本発明の複合体を腫瘍ワクチンとして投与することにより、腫瘍を治療又は予防し、腫瘍細胞の転移を抑制し、或いは腫瘍の再発を予防することが可能である。

【0063】

腫瘍の種類は、特に限定されないが、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍である。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍が挙げられる。造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Ｔリンパ腫、Ｂリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）が挙げられる。

【0064】

本発明の複合体をワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って医薬組成物として製剤化することができる。本発明の複合体は低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒト等）に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明の複合体は、通常、非経口的に投与される。

【0065】

好ましい態様において、本発明の複合体に含まれる免疫学的非自己細胞は、投与対象の個体から分離された免疫学的非自己細胞である。例えば、腫瘍患者から手術やバイオプシーにより、該患者に含まれる腫瘍組織や腫瘍細胞の一部を分離し、これを用いて、本発明の複合体を製造する。そして、この複合体を同一の腫瘍患者に投与することにより、この腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応が活性化され、この免疫反応が該患者中の腫瘍細胞を攻撃することにより、該患者中の腫瘍が縮小又は消失し、或いは腫瘍細胞が他の部位に転移するのを抑制することができる。患者が腫瘍を有するか否か、及び腫瘍の縮小又は消失は、内視鏡検査、Ｘ線検査、ＣＴ検査、超音波検査、ＭＲＩ検査等の画像診断、細胞診、血液検査、触診など、当分野において公知の方法によって判断され得る。

【0066】

また、別の好ましい態様としては、外科的手術、化学療法、放射線療法等の治療により、腫瘍が縮小又は消失したと判断された患者（腫瘍の罹患歴を有する患者）に、その治療前、あるいはその治療の過程で当該患者から分離された腫瘍細胞を含む本発明の複合体が投与される。この投与により、この腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応が活性化され、当該患者の体内に残存する可能性がある腫瘍細胞（例えば、微小転移）を排除することができるので、治療の対象となった腫瘍が生体内の同じ又は近傍の部位で再発するのを抑制し、腫瘍細胞が他の部位に転移して増殖するのを抑制することができる。

【0067】

本発明のワクチンは、その有効成分である本発明の複合体自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記本発明の複合体と薬学的に許容され得る担体を含むものが挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などが添加され得る。賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野などにおいて通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野などにおいて通常に使用される着色料が挙げられる。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。

【0068】

経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈剤に成分溶解させた液剤、成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に成分を懸濁させた懸濁液剤、成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

【0069】

非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。これらの製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存してもよい。

【0070】

また本発明の医薬組成物は、本発明の複合体及び上記他の成分の他、さらにその使用目的に応じた活性成分を含んでもよい。活性成分としては、免疫賦活剤（アジュバント）などが挙げられる。免疫賦活剤としては水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、カルボキシルビニルポリマー等の沈降性アジュバント、パラフィンとアラセルの混合物である不完全フロイントアジュバント、この不完全フロイントアジュバントに死滅したバクテリア、結核菌等の死菌を加えた完全フロイントアジュバント等の油性アジュバントがあるが、これらに限定されない。

【0071】

医薬組成物中には有効量の本発明の複合体が含まれる。医薬組成物中の本発明の複合体の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。

【0072】

本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

【0073】

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。また本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。

【実施例】

【0074】

実施例１：ストレプトアビジン−ＭＲＰ８融合タンパク質（ＳＡ−ＭＲＰ８）の調製
（１）放線菌（独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門より入手）よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いてストレプトアビジン（ＳＡ）をコードする遺伝子を増幅し単離した。一方、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手）よりメッセンジャーＲＮＡを抽出し、それを鋳型にしてｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ法を用いて、ヒトＭＲＰ８の機能的断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番〜第９３番のアミノ酸からなるポリペプチド）をコードするｃＤＮＡ領域、及びヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ領域を増幅し単離した。
（２）増幅したＤＮＡ断片を遺伝子組み換え技術を用いて連結し、ＩＬ−４シグナルペプチド、ＳＡ、及びＭＲＰ８の機能的断片がＮ末端からこの順番で連結された分泌型ＳＡ−ＭＲＰ８をコードするキメラ遺伝子を構築した。
（３）構築したキメラ遺伝子をpcDNA3（Invitrogen社）に組み込んで得られた発現ベクターを、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣより入手）に一過性に導入した。１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）で細胞を５％ＣＯ_２、３７℃の培養条件で３日間培養した後、培養上清を回収した。
（４）培養上清中にＳＡ−ＭＲＰ８が分泌されていることをウェスタンブロットにより確認した。

【0075】

分泌されたＳＡ−ＭＲＰ８の活性を、Ｂ細胞の増殖誘導能を指標に評価した。Ｂ細胞はＴＬＲ４を発現することが知られており、ＴＬＲ４シグナル伝達の活性化により増殖が促進される。５×１０^５個のＢ細胞を培養培地に播種し、２〜５μｌのＳＡ−ＭＲＰ８を含む上記培養上清及び^３Ｈ−チミジンを加えて２４時間または４８時間培養した後、^３Ｈ−チミジンの取り込み量をharvester (Cambridge Technology, Inc. USA)により測定した。ＳＡ−ＭＲＰ８を加えない場合と比較して、ＳＡ−ＭＲＰ８を加えた場合には、^３Ｈ−チミジンの取り込み量は有意に増加した。この結果より、ＳＡ−ＭＲＰ８がＢ細胞の増殖促進活性を有しており、ＴＬＲ４シグナル伝達の活性化能を有していることが確認された。

【0076】

実施例２：ＳＡ−ＭＲＰ８の腫瘍細胞表面への結合
市販のビオチン化試薬（Sulfo-NHS-Biotin、PIERCE社）を製造者のプロトコールに従って用いて、腫瘍細胞Ａ１１（千葉県がんセンターの竹永博士より分与）の表面タンパク質をビオチン化した。
ビオチン化した細胞（１×１０^６個）と実施例１で得たＳＡ−ＭＲＰ８を含む培養上清（５ｍｌ）とを混合し、ローテーターで攪拌しながら、４℃で５分間反応した後、細胞を１０ｍｌの１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅを含む生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、未反応のＳＡ−ＭＲＰ８を除去した。
ＳＡ−ＭＲＰ８を結合させたＡ１１腫瘍細胞を、抗SA抗体（Santacruz社）で染色した後、ＦＡＣＳでＭＲＰ８の結合を確認した。
ＳＡ−ＭＲＰ８を細胞に結合させた後、室温でローテーターを使用して緩やかに攪拌しながら１％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、１０ｍｌのＰＢＳで細胞を３回洗浄した。上記と同様にして細胞表面におけるＳＡ−ＭＲＰ８の存在量を調べたところ、固定した後２４時間経過しても、結合直後と同レベルのＳＡ−ＭＲＰ８が細胞表面に存在していることが分かった。

【0077】

実施例３：ＳＡ−ＭＲＰ８を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞の野生型Ａ１１細胞に対する転移抑制効果
ＳＡ−ＭＲＰ８を細胞表面に結合させた上で固定した腫瘍細胞の、野生型腫瘍細胞に対する転移抑制効果を検証した。
実験には、実施例２で作製したＳＡ−ＭＲＰ８を細胞表面に結合させ固定したＡ１１細胞、並びにＦａｓＬ、ＴＮＦ及びＯＸ４０Ｌを細胞表面に結合させ固定したＡ１１細胞を用いた。
ＦａｓＬ、ＴＮＦ及びＯＸ４０Ｌを細胞表面に結合させ固定したＡ１１細胞は、WO2012/020842に記載されたように調製した。具体的には以下の通りである：実施例１と同様な手法により、ヒトＦａｓＬ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ５００７１（配列番号３））の細胞外領域（１０３−２８１）、ヒトＴＮＦ−α（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＣＡＡ２５６５０（配列番号４））の細胞外領域（５８−２３３）及びマウスＯＸ４０Ｌ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３３４７８（配列番号５））の細胞外領域（５１−１９８）を用いて、それぞれストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質（ＳＡＦａｓＬ）、ストレプトアビジン−ＴＮＦ融合タンパク質（ＳＡＴＮＦ）及びストレプトアビジン−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＳＡＯＸ４０Ｌ）を作製した。ＴＮＦファミリーメンバー分子を１：１：１（モル比）の割合で混合し、実施例２と同様な手法により、Ａ１１細胞に結合させ固定した。
２×１０^５個の上記３種類の細胞のいずれか又はＰＢＳを、Ｂ６マウスの皮下に接種した。２週間後（ワクチン接種から１４日目）、２×１０^５個の野生型Ａ１１細胞を静脈注射により接種し、その３週間後（ワクチン接種から３５日目）に肺を摘出した。腫瘍をカウントすることにより、肺への腫瘍転移を測定した。
図１、２に示すように、ＳＡ−ＭＲＰ８を結合させ固定したＡ１１細胞を接種することにより、野生型Ａ１１細胞の肺への転移が抑制された。この結果から、ＳＡ−ＭＲＰ８を結合させ固定した腫瘍細胞が高い腫瘍転移抑制効果を有すること、即ち優れた腫瘍ワクチン効果を発揮することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0078】

本発明の複合体は、迅速かつ安定的に調製することができるため、種々の腫瘍、ウイルス感染、細胞内寄生性バクテリア感染など（好ましくは種々の腫瘍）に対する有効な治療剤及び再発予防剤を患者（好ましくは腫瘍患者）に迅速に提供することができる。また本発明の複合体は、このようなワクチン（好ましくは腫瘍ワクチン）の製造を可能とする。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]