特許 6223178 細胞培養モジュール及び細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6223178

(24)【登録日】2017年10月13日

(45)【発行日】2017年11月1日

(54)【発明の名称】細胞培養モジュール及び細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20171023BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20171023BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20171023BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20171023BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

   C12M1/00 A

   C12N5/00

   !C12N5/0775

【請求項の数】3

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2013-270711(P2013-270711)

(22)【出願日】2013年12月27日

(65)【公開番号】特開2015-123028(P2015-123028A)

(43)【公開日】2015年7月6日

【審査請求日】2016年4月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】507182807

【氏名又は名称】クアーズテック株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100101878

【弁理士】

【氏名又は名称】木下 茂

(72)【発明者】

【氏名】武居 俊輔

(72)【発明者】

【氏名】今泉 幸文

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１０４２９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０１−１９６２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０５０４２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 武居俊輔 ほか，ＣＥＲＡＨＩＶＥ培養担体モジュールによる間葉系幹細胞軟骨分化に対する連続培養効果，再生医療増刊号，２０１３年 ２月２８日，Vol. 12, Suppl，p. 256, D-1-6

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ １１／００−１３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

表面に複数のウェルが設けられ、少なくともウェル底面が多孔体からなる細胞培養担体と、
上面に前記細胞培養担体が収容される第１の凹部が形成され、かつ前記第１の凹部に開口した培養液供給流路が形成され、前記第１の凹部底面と収容された細胞培養担体の下面との間に第１の空間が形成される保持部材と、
下面に第２の凹部が形成され、第２の凹部底面と細胞培養担体の上面との間に第２の空間が形成されると共に、前記第２の凹部の底面に開口した第１の流路と前記第２の凹部の側面に開口した第２の流路が形成された、前記保持部材の細胞培養担体載置面に被せられる蓋部材と、
を備え、
前記第１の流路は、前記第２の空間内に細胞を含む培養液を供給する細胞注入機能を、少なくとも有する流路であり、
前記第２流路は、前記培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の空間内の細胞を含まない培養液を排出する培養液排出流路であって、
前記培養液排出流路の開口の下端が、前記細胞培養担体の上面から０ｍｍを超えて５ｍｍ以下の範囲に形成されていることを特徴とする細胞培養モジュール。

【請求項2】

前記ウェル底面の多孔体が、気孔率２０％以上５０％以下、かつ、平均気孔径が０．１μｍ以上５μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養モジュール。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載された細胞培養モジュールを用いた細胞培養方法であって、
前記第１の流路から前記細胞培養担体の上面に未分化細胞を含む培養液を注入し、細胞を播種する細胞播種工程と、
前記細胞播種工程の後、培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の凹部内から前記第２の空間内の培養液の９０％以上９８％以下の前記細胞を除いた前記培養液を、前記第２の流路を介して排出する工程と、
前記排出工程の後、前記培養液供給流路から前記第１の凹部に培養液を供給し、前記細胞培養担体全体を前記培養液に浸漬させて、前記ウェル内で細胞の凝集化を進行させる工程と、
前記凝集化工程の後、培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の凹部内から前記細胞を除いた前記培養液を、前記第２の流路を介して排出する工程と、
前記排出工程の後、凝集化した前記細胞を分化誘導するための培養液を前記培養液供給流路から供給し、前記細胞培養担体全体を分化誘導するための培養液に浸漬させて、前記ウェル内で幹細胞を、組織細胞に分化誘導する工程と、
を含むことを特徴とする細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、培養細胞の分化誘導期間を短縮する細胞培養モジュール及びこれを用いた細胞培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離技術、目的とする組織細胞への分化・誘導技術、三次元培養技術及び足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁及び靭帯等の生体組織を形成することが可能となり、臨床応用も行われている。また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（iＰＳ細胞）に関しても、再生医療への応用に対する注目が高まっている。

【0003】

上記のような細胞の培養は、特許文献１に示すような、基板表面に複数のウェルが設けられた細胞培養担体を容器内に収容し、前記容器内で細胞を培養し、培養された細胞を回収する細胞培養モジュールが用いられる。

【0004】

また、細胞培養モジュールを用いた細胞の培養方法としては、特許文献２に記載されるように、例えば、容器内に前記細胞培養担体の上面を上にして配置した後、前記容器内に第１の培養液を供給し、これを前記細胞培養担体のウェル開口部付近まで毛細管現象により浸透させる工程と、この細胞培養担体の上面に未分化の間葉系幹細胞を含む第２の培養液を滴下して、間葉系幹細胞を培養する工程と、前記容器内に前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記容器内から、前記第１の培養液と、前記間葉系幹細胞を除いた前記第２の培養液とを排出した後、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための第３の培養液を前記容器内に供給し、前記細胞培養担体全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル内で間葉系幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞のうちのいずれかの組織細胞に分化誘導する工程と、を経ることにより行われる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００９／１０４２９６号

【特許文献2】特開２０１２−５０４２６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ところで、基板表面に複数のウェルが設けられた細胞培養担体を用いることで、間葉系幹細胞を培養する工程と、前記ウェル内で間葉系幹細胞の凝集化を進行させる工程と、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導工程を、同一の担体のままで、担体上の細胞を移動させることなく行うことができ、硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞の培養を簡便かつ効率的に行うことができる。

【0007】

しかしながら、凝集化した前記間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための期間が数週間に及ぶという技術的課題があった。
本発明者は、分化誘導するための期間の短縮化について鋭意研究し、未分化の幹細胞を含む培養液を細胞培養担体に注入した後、新たな培養液に入れ替え、幹細胞を培養することにより、分化誘導のための期間を短縮化できることを知見し、本発明を完成するに至った。

【0008】

本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できる細胞培養モジュール及びこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明にかかる細胞培養モジュールは、表面に複数のウェルが設けられ、少なくともウェル底面が多孔体からなる細胞培養担体と、上面に前記細胞培養担体が収容される第１の凹部が形成され、かつ前記第１の凹部に開口した培養液供給流路が形成され、前記第１の凹部底面と収容された細胞培養担体の下面との間に第１の空間が形成される保持部材と、 下面に第２の凹部が形成され、第２の凹部底面と細胞培養担体の上面との間に第２の空間が形成されると共に、前記第２の凹部の底面に開口した第１の流路と前記第２の凹部の側面に開口した第２の流路が形成された、前記保持部材の細胞培養担体載置面に被せられる蓋部材と、を備え、前記第１の流路は、前記第２の空間内に細胞を含む培養液を供給する細胞注入機能を、少なくとも有する流路であり、前記第２流路は、前記培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の空間内の細胞を含まない培養液を排出する培養液排出流路であって、前記培養液排出流路の開口の下端が、前記細胞培養担体の上面から０ｍｍを超えて５ｍｍ以下の範囲に形成されていることを特徴としている。

【0010】

このように、培養液排出流路が第２の凹部の側面に開口し、第２の空間にある培養液を第２の凹部の側面から排出するように構成されているため、ウェル内に存在する細胞の流出を抑制しつつ、培養液を排出でき、新たな培養液に速やかに置換することができ、結果的に、幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できる。

【0011】

ここで、前記培養液排出流路の開口の下端が、前記細胞培養担体の上面から０ｍｍを超えて５ｍｍ以下の範囲内に形成されていることが望ましい。
このように構成されているため、細胞培養担体上面が培養液に浸漬した状態で、第２の空間Ｓ内の培養液の大部分を排出することができる。

【0012】

前記ウェル底面の多孔体が、気孔率２０％以上５０％以下、かつ、平均気孔径が０．１μｍ以上５μｍ以下であることが望ましい。
このように、少なくともウェル底面が特定の気孔率及び特定の平均気孔径を有する多孔体から形成されているため、細胞培養担体の裏面から培養液をウェル内に浸透させることができる。

【0013】

本発明にかかる上記細胞培養モジュールを用いた細胞培養方法であって、前記第１の流路から前記細胞培養担体の上面に未分化細胞を含む培養液を注入し、細胞を播種する細胞播種工程と、前記細胞播種工程の後、培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の凹部内から前記第２の空間内の培養液の９０％以上９８％以下の前記細胞を除いた前記培養液を、前記第２の流路を介して排出する工程と、 前記排出工程の後、前記培養液供給流路から前記第１の凹部に培養液を供給し、前記細胞培養担体全体を前記培養液に浸漬させて、前記ウェル内で細胞の凝集化を進行させる工程と、前記凝集化工程の後、培養液供給流路及び前記第１の流路から培養液が供給されない状態において、前記第２の凹部内から前記細胞を除いた前記培養液を、前記第２の流路を介して排出する工程と、前記排出工程の後、凝集化した前記細胞を分化誘導するための培養液を前記培養液供給流路から供給し、前記細胞培養担体全体を分化誘導するための培養液に浸漬させて、前記ウェル内で幹細胞を、組織細胞に分化誘導する工程と、を含むことを特徴としている。

【0014】

このように、細胞培養方法では、培養液排出流路が第２の凹部の側面に開口し、第２の空間にある培養液を第２の凹部の側面から排出するように構成された細胞培養モジュールが用いられるため、ウェル内に存在する細胞の流出を抑制しつつ、培養液を排出でき、新たな培養液に速やかに置換することができ、結果的には、幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できる。
しかも、このような培養方法によれば、間葉系幹細胞やＥＳ細胞の凝集塊を効率的に形成し、かつ、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できる。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できる細胞培養モジュール及びこれを用いた細胞培養方法を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明にかかる細胞培養モジュールの概略断面図である。

【図2】本発明にかかる細胞培養方法の第１の培養液の供給工程を示す図である。

【図3】本発明にかかる細胞培養方法の細胞播種工程を示す図である。

【図4】本発明にかかる細胞培養方法の培養液排出工程を示す図である。

【図5】本発明にかかる細胞培養方法の細胞凝集化工程を示す図である。

【図6】本発明にかかる細胞培養方法の培養液排出工程を示す図である。

【図7】本発明にかかる細胞培養方法の分化誘導工程を示す図である。

【図8】本発明にかかる細胞培養方法の培養細胞回収工程を示す図である。

【図9】本発明の他の実施形態にかかる細胞培養モジュールを示す図であって、（ａ）はその概略断面図、（ｂ）は蓋部材の底面図である。

【図10】実施例１、比較例１の結果を示す図である。

【図11】参考例１，２，３の結果を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。
図１に、本発明に係る細胞培養モジュールの概略を示す。図１に示した細胞培養モジュールＡは、表面に複数のウェル１ａが設けられた円板状の細胞培養担体１を載置する保持部材２と、保持部材２の細胞培養担体載置面（上面）に被せられる蓋部材３とから構成されている。
前記保持部材２の上面には、円形状の凹部２ａが形成され、その径は、細胞培養担体１の径よりもわずかに大きく形成され、Ｏリング４を介して、前記凹部２ａ内に細胞培養担体１が収容、載置される。
その結果、細胞培養担体１の下面と保持部材２の上面との間に、前記凹部２ａによって第１の空間Ｓ１が形成される。

【0018】

尚、上記説明において、細胞培養担体１が円板状（平面視において円形）の場合を例にとって説明したが、細胞培養担体１が平面視において、例えば矩形状、六角形状等の多角形状であっても良い。また、細胞培養担体１が多角形状の場合には、前記保持部材２の凹部２ａも、前記細胞培養担体１の形状に対応して、同一形状になされる。
また、細胞培養担体１がＯリング４を介して、前記凹部２ａ内に収容、載置される場合を例にとって説明したが、細胞培養担体１が多角形状の場合には、前記細胞培養担体１の形状に対応して、同一形状に形成されたゴム製の枠部材を用いるのが好ましい。

【0019】

また、蓋部材３の下面には細胞培養担体１のサイズに対応した凹部３ａが形成され、蓋部材３の下面は細胞培養担体１上面の外周部及び保持部材２に密着される。
その結果、蓋部材３下面と細胞培養担体１の上面との間に、前記凹部３ａによって第２の空間Ｓ２が形成される。
尚、蓋部材３の凹部３ａも前記保持部材２の凹部２ａと同様に、細胞培養担体１が平面視において、例えば矩形状、六角形状等の多角形状である場合には、前記細胞培養担体１の形状に対応して、同一形状になされる。

【0020】

前記保持部材２の上面と蓋部材３の下面との間にはＯリング５が設けられ、前記第１の空間Ｓ１、前記第２の空間Ｓ２内の培養液が外部に漏れないように構成されている。
このように、前記保持部材２と蓋部材３とによって、内部空間Ｓを有する密閉容器が形成され、また前記内部空間Ｓは、前記細胞培養担体１とによって第１の空間Ｓ１、第２の空間Ｓ２に分けられる。

【0021】

前記蓋部材３の凹部３ａは、前記したように円形状または多角形状に形成され、その径は、細胞培養担体１の径よりもわずかに小さいことが好ましい。ただし、蓋部材３が細胞培養担体１表面のウェル１ａを覆うことがないように形成される。前記蓋部材３をこのように形成することにより、細胞培養担体１から剥離された培養細胞が細胞培養担体１の外縁部や背面側（第１の空間Ｓ１側）に周り込むことを防止することができる。

【0022】

また、前記保持部材２には、前記凹部２ａの底面に一端が開口する流路２ｂが形成されている。この流路２ｂは前記凹部２ａ内に培養液を供給する培養液供給流路であり、この流路２ｂの他端は前記保持部材２の側壁に開口し、図示しない培養液供給源に接続されている。

【0023】

また、前記蓋部材３には、前記凹部３ａの底面に一端が開口する第１の流路３ｂが形成されている。
前記第１の流路３ｂは、細胞注入・培養液排出・細胞回収流路であり、前記凹部３ａ内に幹細胞を含む培養液を供給する細胞注入機能と、前記培養液供給流路２ｂから培養液が供給される状態において、培養液成分のみを前記排出する培養液排出機能と、前記培養液供給流路２ｂから供給される培養液の液圧により、細胞培養担体１から剥離された培養細胞を培養液ごと回収する機能を備えている。
この第１の流路３ｂの他端は前記蓋部材３の上面に開口し、図示しない、細胞注入部、培養液排出部、細胞回収部に、切換弁を介して切換え可能に接続されている。
尚、前記第１の流路３ｂから培養液排出部に排出された培養液は、廃棄されることなく、前記培養液供給流路２ｂを介して、再び前記凹部３ａ内に供給され、前記培養液が循環するように構成しても良い。

【0024】

更に、前記蓋部材３には、前記凹部３ａの側面に一端が開口する第２の流路３ｃが形成されている。
この第２の流路３ｃは、前記培養液供給流路２ｂから培養液が供給されない状態において、前記凹部３ａ（内部空間Ｓ２）内の培養液を排出する培養液排出流路であり、この流路３ｃの他端は前記蓋部材３の上壁に開口し、図示しない培養液排出部と接続されている。
尚、前記第２の流路３ｃから培養液排出部に排出された培養液は、廃棄されることなく、前記培養液供給流路２ｂを介して、再び前記凹部３ａ内に供給され、前記培養液が循環するように構成しても良い。

【0025】

また、前記第２の流路３ｃにおける前記凹部３ａの開口の下端と、細胞培養担体１の上面との距離寸法ｔが０ｍｍを超えて５ｍｍ以下になるように、前記第２の流路３ｃの開口が形成されている。
このような距離寸法ｔの範囲内に、前記第２の流路３ｃの開口を形成することにより、第２の空間Ｓ２に導入された培養液を９０％以上９８％以下排出することができる。言い換えれば、細胞培養担体１上、０ｍｍを超えて５ｍｍ以下の培養液を残して、第２の空間Ｓ２に存在する培養液を排出することができる。

【0026】

前記細胞培養担体１の材質は、特に限定されるものではなく、生体親和性及び生体適合性に優れ、細胞の足場として適しているとされるジルコニア、チタニア、アルミナ、ハイドロキシアパタイトのほか、イットリア、カーボン等のセラミックス、ガラス、樹脂等を用いることができる。
また、細胞培養担体１の全体が多孔体である以外に、一部緻密体であっても良い。特に、三次元細胞塊を効率的に凝集させるためには、細胞培養担体の裏面から培養液をウェル内に浸透可能である多孔体からなる細胞培養担体が好ましい。更に言えば、少なくともウェルの底面が多孔体からなる細胞培養担体であることが好ましい。
尚、前記少なくともウェルの底面とは、ウェルの最底部（最も低い位置）からウェル壁面に沿う壁面長さの５０％以下（壁面長さの１／２以下）の範囲を意味する。

【0027】

この場合の多孔体部分は、培養液等の浸透性や細胞培養担体自体の強度を保持の観点から、気孔率２０〜５０％、かつ、平均気孔径０．１〜５μｍであることが好ましい。より好ましくは、平均気孔径０．１〜１μｍ、さらに好ましくは、０．１〜０．５μｍである。なお、前記気孔率及び平均気孔径は、水銀ポロシメータを用いた水銀圧入法による測定値で表したものである。
さらに前記細胞培養担体は、前記したように、円形状または多角形状であっても良い。特に六角形状の細胞培養担体の場合には、同じ面積の円形状の細胞培養担体に比べより多くのウェルを形成することができるため、より好ましい。

【0028】

また、本発明に係る細胞培養方法は、上面に複数のウェル１ａが設けられた細胞培養担体１を前記保持部材２に載置し、前記保持部材２に蓋部材３を密着固定した後、前記保持部材２の凹部２ａに通じる培養液供給流路２ｂから前記細胞培養担体１の裏面側に第１培養液を供給し、該細胞培養担体１の上面まで浸透させる第１の培養液を供給する供給工程と、第１の培養液の供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に未分化の細胞を含む第２の培養液を注入し、細胞を播種する細胞播種工程と、前記第１の培養液と前記細胞を除いた前記第２の培養液とを第２の流路３ｃを介して排出する工程と、前記凹部２ａに前記第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体１全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル１ａ内で幹細胞の凝集化を進行させる工程と、前記凹部３ａ内から前記細胞を除いた前記第２の培養液を、第２の流路３ｃを介して排出した後、凝集化した前記幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための第３の培養液を前記凹部２ａ，３ａ内に培養液供給流路２ｂを介して供給し、前記細胞培養担体１全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル１ａ内で幹細胞を、組織細胞に分化誘導する工程と、を経ることにより行われる。

【0029】

更に、前記分化誘導する工程の後、前記培養液供給流路２ｂから高液圧の培養液を前記細胞培養担体１の裏面側（凹部２ａ）に供給することにより、分化誘導した培養細胞を培養液とともに第１の流路３ｂから導出し、回収する培養細胞回収工程とを経ることにより行われる。

【0030】

上述した本発明に係る担体を用いて、このような工程を経ることにより、間葉系幹細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の凝集塊を効率的に形成し、かつ、培養された細胞の細胞培養担体からの剥離及び回収までを連続的に簡便に行うことができる。
特に、細胞播種工程の後、前記第１の培養液と、前記細胞を除いた前記第２の培養液とを第２の流路（培養液排出流路）３ｃを介して排出するため、細胞の凝集化の期間を短縮することができる。また、前記幹細胞を除いた前記第２の培養液とを、第２の流路（培養液排出流路）３ｃから排出した後、分化誘導するための第３の培養液が、培養液供給流路２ｂから前記凹部２ａ内（空間Ｓ１，Ｓ２）に供給され、前記第２の培養液と、第３の培養液の置換が速やかに行われるため、分化誘導に要する期間を短くすることができる。

【0031】

以下、上記細胞培養方法を各工程順に、図２乃至図８を参照して詳細に説明する。
まず、図２に示す第１の培養液の供給工程において、表面に複数のウェル１ａが設けられた細胞培養担体１を保持部材２に載置し、細胞培養担体１の上面外周部及び保持部材２に蓋部材３を密着固定する。そして、前記保持部材２の凹部２ａに通じる培養液供給流路２ｂから第１の培養液を供給し、細胞培養担体１の上面まで第１の培養液を十分に浸透させる。
このように、細胞培養の前処理工程として、予め、細胞培養担体１全体に第１の培養液を十分に供給し、細胞培養担体上面まで第１の培養液に浸漬した状態としておく。このような工程を経ることにより培養液に培養の阻害要因となり得る気泡を包含させることなく、複数のウェル内に満遍なく培養液を行き渡らせることができる。
尚、毛細管現象により、細胞培養担体上面まで第１の培養液に浸漬した状態をなすため、細胞培養担体１は、上述したような気孔率及び平均気孔径を備えた少なくともウェルの底面が多孔体により構成することが好ましい。

【0032】

前記第１の培養液（培地）の種類は、特に限定されるものではないが、例えば、ＥＳ細胞を培養する場合は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＤＭＥＭ等が好ましい。さらに、これらの培地に、ＦＢＳ（ウシ血清）、非必須アミノ酸、ピルビン酸、グルタミン酸等の細胞を維持するのに必要な物質が添加される。
また、間葉系幹細胞を培養する場合には、例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好ましい。さらに、これらの培地に、ＦＢＳ（ウシ血清）、グルタミン酸等の細胞を維持するのに必要な物質が添加される。

【0033】

次に、図３に示すように、細胞播種工程において、第１の培養液の供給を停止した後、蓋部材３の第１の流路（細胞注入・培養液排出・細胞回収流路）３ｂから細胞培養担体１上面に未分化の細胞Ｃを含む第２の培養液を注入し、細胞Ｃを播種する。
このような注入による播種においては、ウェル１ａ内外を問わず、細胞培養担体１上面全体に細胞Ｃが播種されるが、細胞培養担体上面まで第１の培養液に浸漬した状態で、５分〜７２時間、好ましくは２４時間以上静置することにより、ウェル外の細胞がウェル１ａ内に移動して付着し、ウェル１ａ内で凝集塊を形成させることができる。
すなわち、第１の培養液と、未分化の細胞を含む第２の培養液とを懸濁させた状態で未分化の細胞Ｃを細胞培養担体１の上面に播種することにより、負荷をかけることなく、播種した細胞Ｃをウェル１ａ内に導入することができ、スムーズな凝集化を促すことができる。

【0034】

前記第２の培養液（培地）の種類は、前記第１の培養液と同様のものでもよい。
また、培養する細胞の種類は、特に限定されるものではないが、本発明に係る培養方法は、特に、ＥＳ細胞や間葉系幹細胞に好適に適用することができる。細胞は、１×１０⁴〜１×１０⁶個／ｃｍ²程度播種することが好ましい。

【0035】

次に、図４に示すように、所定時間静置し、前記播種した細胞が前記細胞培養担体１のウェル内に沈降させる。その後、前記第１の培養液と前記細胞を除いた前記第２の培養液とを第２の流路（培養液排出流路）３ｃを介して排出する。
前記第２の流路３ｃの開口が凹部３ａの側面に設けられ、側方から前記第２の培養液を排出するようになされるため、ウェル１ａ内に存在する細胞の流出を抑制することができる。

【0036】

ここで、第２の流路３ｃにおける前記凹部３ａの開口の下端と、細胞培養担体１の上面との距離寸法が、０ｍｍを超えて５ｍｍ以下になるように、前記第２の流路３ｃの開口が形成されている。そのため、前記開口を介して、第２の空間Ｓ２内の培養液の９０％以上９８％以下を排出することができる。言い換えれば、細胞培養担体上面が第１の培養液及び第２の培養液浸漬した状態で、第２の空間Ｓ２内の第１の培養液及び第２の培養液を排出することができる。

【0037】

次に、図５に示すように、細胞凝集化工程において、培養液供給流路２ｂから凹部２ａ，３ａ（細胞培養担体１の裏面側）に第１の培養液を供給しながら、第１の培養液及び第２の培養液の培養液成分のみを蓋部材３の第１の流路（細胞注入・培養液排出・細胞回収流路）３ｂから排出させ、ウェル内１ａで細胞を凝集化させる。
このように培養液を流通させることにより、細胞培養担体１のウェル１ａ内の細胞は、常に第１の培養液の供給を受けることができるため、ウェル１ａ内での細胞の凝集化が効率的に行われる。
尚、第１の培養液の供給速度は、ウェル１１内で凝集化した細胞が剥離しないように、０．１ｍｌ／時間程度であることが好ましい。

【0038】

そして、図６に示すように、幹細胞を、硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するため、まず前記凹部３ａ内から、前記第１の培養液と、前記細胞を除いた前記第２の培養液とを第２の流路（培養液排出流路）３ｃを介して排出する。
前記したように、第２の流路３ｃにおける前記凹部３ａの開口下端と、細胞培養担体１の上面との距離寸法が、０ｍｍを超えて５ｍｍ以下になるように、前記第２の流路３ｃの開口が形成されているため、前記開口を介して、細胞培養担体上面が第１の培養液及び第２の培養液浸漬した状態で、第２の空間Ｓ２内の第１の培養液及び第２の培養液を排出することができる。

【0039】

前記第１の培養液及び第２の培養液の排出後、図７に示すように、凝集化した前記幹細胞を組織細胞等に分化誘導するための第３の培養液を前記凹部２ａ，３ａ内に培養液供給流路２ｂを介して供給し、前記細胞培養担体１全体を前記第３の培養液に浸漬させて、前記ウェル１ａ内で幹細胞を、組織細胞等に分化誘導する。
このように、幹細胞の培養に用いた担体のままで、第３の培養液に速やかに置換することにより、ウェル１１ａ内において、間葉系細胞から硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞等への分化誘導を行うことができる。

【0040】

前記第３の培養液は、凝集化した間葉系幹細胞を硝子軟骨細胞や脂肪細胞、骨芽細胞等の組織細胞等に分化誘導するための培地であり、基本培地としてはＤＭＥＭを使用することができ、適宜改良して用いてもよい。さらに、ＴＧＦβ、ＢＭＰ等を添加することが好ましく、また、アスコルビン酸、プロリン、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸等の添加剤を添加してもよい。
ＴＧＦβは、ＴＧＦβファミリーに属するものであればいずれでもよいが、ＴＧＦβ−３を用いることが好ましい。また、ＴＧＦβと同様の作用を示す低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＴＧＦβの量は１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
ＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６等が用いられ、ＢＭＰ６を用いることが好ましい。また、低分子化合物を用いて代替することもできる。添加するＢＭＰの量は、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍｌである。
また、添加するアスコルビン酸（好ましくはアスコルビン酸２−リン酸）の量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌである。
また、添加するプロリンの量は、１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約４０μｇ／ｍｌである。また、添加するデキサメタソンの量は、１０〜５００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭである。また、添加するインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸は、市販のＩＴＳ溶液を適正濃度になるように添加する。
なお、間葉系幹細胞から軟骨、脂肪、骨芽細胞に誘導する分化誘導培地が市販されており、これらも使用可能であることはいうまでもない。

【0041】

そして、図８に示すように、前記分化誘導工程の後、前記培養液供給流路２ｂから高液圧の第３の培養液を前記細胞培養担体１の裏面側（凹部２ａ）に供給することにより、分化誘導した第３の培養細胞を細胞培養担体１から剥離し、培養液とともに第２の流路３ｂから導出し、回収することによって培養細胞が回収される。

【0042】

尚、前記培養液供給流路２ｂから高液圧の第３の培養液を前記細胞培養担体１の裏面側（凹部２ａ）に供給することにより、前記細胞培養担体１から細胞を剥離、回収方法のほか、例えば、図９に示すように、第３の培養液を細胞培養担体１上に導入する導入流路３ｄを蓋部材３に設け、導入流路３ｄから第３の培養液を供給することにより、前記細胞培養担体１から細胞を剥離、回収しても良い。
この導入流路３ｄは、図９（ｂ）に示すように、凹部３ａの中心に対して、平面視上１２０度間隔をもって形成され、導入流路３ｄの軸線が中心側に偏る方向に形成されている。更に図９（ａ）に示すように、導入流路３ｄは、蓋部材３の上面から下面に向かって所定の角度θ例えば、２０〜９０°をもって斜めに形成されている。
このように、導入流路３ｄが形成されているため、凹部３ａに導入される第３の培養液は螺旋流となり、細胞培養担体１から細胞を容易に剥離することができる。

【実施例】

【0043】

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により制限されるものではない。
［実施例１］ｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
平均粒子径が０．３μｍのジルコニア原料粉を用いて、開口径及び深さが６００μｍのウェル約３００個が配列した六角形状のジルコニア製の細胞培養担体（直径１５ｍｍ）を成形し、１１５０℃で２時間焼成して、開口径及び深さが４５０μｍの担体を作製し、細胞培養担体とした。
この細胞培養担体を滅菌処理後、図１に示すように保持部材２に載置し、前記細胞培養担体１の上面外周部及び前記保持部材２に蓋部材３を密着固定した後、前記保持部材２の凹部２ａに通じる培養液供給流路２ｂから前記細胞培養担体１の裏面側に第１培養液としてＤＭＥＭを供給し、該細胞培養担体１の上面まで浸透させた。

【0044】

その後、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種し、２４時間静置した。
その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出した。

【0045】

その後、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給し、３７℃、５％ＣＯ^２の条件下で培養した。
そして、播種してから３日目に、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを、前記第２の流路３ｃを介して排出した。

【0046】

その後、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に置換、浸漬して、１週間分化誘導を行った。尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
得られた軟骨細胞のコラーゲン２の発現量を、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を用いて確認した。その結果を図１０に示す。
この図１０における縦軸は、Fold Change (Collagen2/GAPDH)である。

【0047】

［比較例１］ｈＭＳＣの硝子軟骨細胞への分化誘導
実施例１と同様な条件で、細胞培養担体を、図１に示すように保持部材２に載置し、前記細胞培養担体１の上面外周部及び前記保持部材２に蓋部材３を密着固定した後、前記保持部材２の凹部２ａに通じる培養液供給流路２ｂから前記細胞培養担体１の裏面側に第１培養液としてＤＭＥＭを供給し、該細胞培養担体１の上面まで浸透させた。

【0048】

その後、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の幹細胞滴下流路（第１の流路）３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種し、２４時間静置した。
その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出することなく、播種後、３日間、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給し、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で培養した。
そして、播種してから３日目に、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを、前記第２の流路３ｃを介して排出した。

【0049】

その後、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に置換、浸漬して、１週間分化誘導を行った。
尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
得られた軟骨細胞のコラーゲン２の発現量を、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）を用いて確認した。その結果を図１０に示す。

【0050】

図１０に示すように、実施例１のコラーゲン２の発現量は、比較例１に比べて約１．６倍多くなっていることから、幹細胞を硝子軟骨細胞、脂肪細胞及び骨芽細胞等の組織細胞、心筋細胞、神経細胞、肝細胞等に分化誘導するための期間を短縮化できることが確認された。

【0051】

［実施例２］
実施例１と同様に、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種し、３時間静置した。

【0052】

播種してから３時間後に、その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出した。
その後、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給することなく、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に置換、浸漬して、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で、１週間分化誘導を行った。
尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
実施例１と同様にコラーゲン２の発現量を確認したところ、実施例１よりも多いことが確認された。

【0053】

［実施例３］
実施例１と同様に、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の幹細胞滴下流路（第１の流路）３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを滴下して播種し、２４時間静置した。

【0054】

播種してから２４時間後に、その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出した。
その後、前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給することなく、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に置換、浸漬して、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で、１週間分化誘導を行った。
尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記培養液排出流路３ｃから排出することにより行った。
実施例１と同様にコラーゲン２の発現量を確認したところ、実施例１及び２よりも多いことが確認された。

【0055】

［参考例１］
実施例１と同様に、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種した。

【0056】

その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出することなく、更に前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給することなく、播種した直後に、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に浸漬して、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で、１週間分化誘導を行った。
尚、軟骨分化誘導培地の交換は４日おきに行った。培地交換は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
得られた細胞塊を５μｍの厚さにスライスし、サフランニンＯを用いて染色し、分化の指標である軟骨小腔様構造の割合を確認した。その結果を図１１（ａ）に示す。

【0057】

［参考例２］
実施例２と同様に、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種し、３時間静置した。

【0058】

その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出することなく、更に前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給することなく、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に浸漬して、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で、１週間分化誘導を行った。
尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
得られた細胞塊を５μｍの厚さにスライスし、サフランニンＯを用いて染色し、分化の指標である軟骨小腔様構造の割合を確認した。その結果を図１１（ｂ）に示す。

【0059】

［参考例３］
実施例１と同様に、ＤＭＥＭの供給を停止し、前記蓋部材３の第１の流路３ｂから前記細胞培養担体１の上面に不死化されたｈＭＳＣを１×１０⁶個を含むＤＭＥＭを注入して播種し、２４時間静置した。

【0060】

その後、前記第１培養液であるＤＭＥＭと、前記不死化されたｈＭＳＣを除いた前記第２の培養液であるＤＭＥＭを第２の流路３ｃから排出することなく、更に前記ＦＢＳ（ウシ血清）１０％を含むＤＭＥＭを培養液供給流路２ｂから供給することなく、ＴＧＦβ−３を１０ｎｇ／ｍｌ、ＤＥＸを１００ｎＭ、アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ、プロリンを４０μｇ／ｍｌ、ＩＴＳ及びピルビン酸を含むＤＭＥＭ（軟骨分化誘導培地）を、培養液供給流路２ｂから供給し、前記細胞培養担体１全体を前記培養液に浸漬して、３７℃、５％ＣＯ²の条件下で、１週間分化誘導を行った。
尚、培地は、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより行った。
得られた細胞塊を５μｍの厚さにスライスし、サフランニンＯを用いて染色し、分化の指標である軟骨小腔様構造の割合を確認した。その結果を図１１（ｃ）に示す。

【0061】

図１１（ａ）〜（ｃ）において軟骨小腔様構造を矢印で示すが、図１１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順で、軟骨小腔様構造が拡大（成長）していることがわかる。ここで、硝子軟骨組織は成熟すると軟骨小腔とよばれる構造をとることが知られており、また、作製した細胞塊においても分化が進むと軟骨小腔様構造を形成することが分かっている。すなわち、この軟骨小腔様構造が成長し、その割合が大きくなることは、より分化が進んでいることを表している。
したがって、播種した後の静置時間を長く、培地を、新たな培地を培養液供給流路２ｂから連続的に供給し、前記第２の流路３ｃから排出することにより、より分化誘導が進むことが確認された。

【符号の説明】

【0062】

Ａ 細胞培養担体モジュール
１ 細胞培養担体
１ａ ウェル
２ 保持部材
２ａ 凹部
２ｂ 培養液供給流路
３ 蓋部材
３ａ 凹部
３ｂ 第１の流路（細胞注入・培養液排出・細胞回収流路）
３ｃ 第２の流路（培養液排出流路）
４ Ｏリング
５ Ｏリング
Ｓ 内部空間
Ｓ１ 第１の空間
Ｓ２ 第２の空間

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】