特許 6223451 がんの診断及び治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6223451

(24)【登録日】2017年10月13日

(45)【発行日】2017年11月1日

(54)【発明の名称】がんの診断及び治療方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20171023BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20171023BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171023BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20171023BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20171023BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20171023BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12Q1/02ZNA

   C12N15/00 A

   C12N15/00 F

   C07K16/40

   G01N33/53 M

   G01N33/53 D

   G01N33/574 A

【請求項の数】26

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2015-530089(P2015-530089)

(86)(22)【出願日】2013年8月30日

(65)【公表番号】特表2015-528295(P2015-528295A)

(43)【公表日】2015年9月28日

(86)【国際出願番号】US2013057495

(87)【国際公開番号】WO2014036387

(87)【国際公開日】20140306

【審査請求日】2015年9月29日

(31)【優先権主張番号】61/696,002

(32)【優先日】2012年8月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/827,514

(32)【優先日】2013年5月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509001010

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドーベル ロバート シー．

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア マリレイラ ヴァレッラ

(72)【発明者】

【氏名】レ アン ティー．

【審査官】 白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１３６６８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 GENOMICS，１９９５年，vol.28，pp.15-24

【文献】 Molecular and Cellular Endocrinology，２０１０年，vol.321，pp.44-49

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化学療法計画の実施に応答すると予測される肺がん患者を選択する方法であって、
前記患者からの肺腫瘍細胞のサンプルにおいて、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在若しくは非存在を検出することと、
ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体が、肺腫瘍細胞の前記サンプルにおいて検出される場合に、チロシンキナーゼ阻害剤から選択される作用剤を含む化学療法計画の前記実施に応答すると予測されるとして、前記患者を選択すること、又は、 ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体が、肺腫瘍細胞の前記サンプルにおいて検出されない場合に、チロシンキナーゼ阻害剤から選択される作用剤を含む化学療法計画の前記実施に応答しないと予測されるとして、前記患者を選択することと、を含む、化学療法計画の実施に応答すると予測されるがん患者を選択する方法。

【請求項2】

前記検出が、肺腫瘍細胞の前記サンプル中に存在する前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のレベルを検出することと、前記レベルと標準レベル又は基準範囲とを比較することとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記標準レベル又は基準範囲が、リスク予測についての統計学的手法によって決定される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在が、ポリヌクレオチドの存在を検出することによって決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在が、蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）によって決定される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在が、ポリペプチドの存在を検出することによって決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ポリペプチドの存在を、抗体、抗体誘導体、及び前記ポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体断片の少なくとも１つを用いて検出することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体を検出することが、
肺腫瘍細胞の前記サンプルからＲＮＡを得ることと、
前記ＲＮＡからｃＤＮＡを作製することと、
前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体に特異的なプライマーにより前記ｃＤＮＡを増幅することと、
前記増幅されたｃＤＮＡにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在又は非存在を決定することと、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ａ）肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の発現レベルと、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する有益な応答と関連付けられた前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の対照レベル、及び、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する有益な応答の欠如と関連付けられた前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の対照レベルからなる群から選択される前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の対照レベルとを比較することと、
ｂ）肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の前記レベルが、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する感受性と関連付けられた前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の前記対照レベルと統計的に同様若しくは前記対照レベルより統計的に高い場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対して応答すると予測されるものとして前記患者を選択すること、又は、
ｃ）肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の前記レベルが、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する有益な応答と関連付けられた前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の前記対照レベルより統計的に低い場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に応答しないと予測されるものとして前記患者を選択することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のレベルと、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対して応答しないと予測される第２の患者における前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のレベルとを比較することと、
肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の発現レベルが、前記第２の患者における前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の発現のレベルより高い場合に、１若しくは又は複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対して応答すると予測されるものとして前記患者を選択すること、又は、
肺腫瘍細胞の前記サンプルにおける前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のレベルが、前記第２の患者における前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のレベル以下である場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対して応答しないと予測されるものとして前記患者を選択することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記チロシンキナーゼ阻害剤が、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４０１６６）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、ドビチニブ（ＴＫ−２５８）、レバスチニブ（ＤＣＣ−２０３６）、ＣＥＰ−７０１、ＡＺＤ−７４５１、ＡＲＲＹ−４７０、ＡＲＲＹ−５２３、ＡＲＲＹ−７７２及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記チロシンキナーゼ阻害剤がＴｒｋＡ阻害剤である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

チロシンキナーゼ阻害剤療法の実施に対する肺がん患者の応答又は転帰を予測するアッセイシステムであって、
ａ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在、
ｂ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の発現のレベル、
ｃ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質の存在、
ｄ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質のレベル、及び、
ｅ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質の活性、
の少なくとも１つを検出する手段を含み、
前記検出する手段が、
ＡＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号２）、
ＡＣＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣ（配列番号３）、
ＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧ（配列番号４）、
ＧＣＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号５）、
ＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣ（配列番号６）、
ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣＧＧ（配列番号７）、
ＣＧＧＣＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣ（配列番号８）、
ＴＡＴＴＣＣＧＧＣＴＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧ（配列番号９）、
ＣＣＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号１０）、及び、
ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号１１）、からなる群から選択されるＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体を同定するＰＣＲプライマーからなるか、
前記検出する手段が、
染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１遺伝子の切断点から３'側のゲノム領域の３３１．８Ｋｂをカバーする３'ＮＴＲＫ１プローブ、及び
染色体１７におけるＭＰＲＩＰ遺伝子の切断点から５'側のゲノム領域の３４１．４Ｋｂをカバーする５'ＭＰＲＩＰプローブ
から選択されるＦＩＳＨ ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体プローブからなるか、
前記検出する手段が、
染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１の切断点の上流の３３９．４ｋｂをカバーする５' ＮＴＲＫ１プローブ、及び
染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１の切断点の下流の３３１．８Ｋｂをカバーする３'ＮＴＲＫ１プローブ
からなるＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブセットからなるか、又は ＨＡ特異的抗体及びＴＲＫＡ特異的抗体から選択される、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体により発現された１１５ｋＤ〜１２０ｋＤのキメラタンパク質を認識する抗体からなる、
チロシンキナーゼ阻害剤療法の実施に対するがん患者の応答又は転帰を予測するアッセイシステム。

【請求項15】

前記検出する手段が、ＮＴＲＫ１遺伝子の少なくとも１０〜５０個の連続核酸塩基、又はその相補的核酸の配列を含む核酸プローブを含む、請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項16】

チップ、アレイ、又は流動性カードを備えたアッセイ表面を含む、請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項17】

１又は複数のチロシンキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する応答と関連付けられた、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の予め決定された対照レベルを含有する情報、及び
１又は複数のチロシンキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の前記実施に対する応答の欠如と関連付けられた、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の予め決定された対照レベルを含有する情報、
からなる群から選択される対照を更に含む、請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項18】

前記検出する手段が、比色標識を含む請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項19】

前記チロシンキナーゼ阻害剤が、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４０１６６）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、ドビチニブ（ＴＫ−２５８）、レバスチニブ（ＤＣＣ−２０３６）、ＣＥＰ−７０１、ＡＺＤ−７４５１、ＡＲＲＹ−４７０、ＡＲＲＹ−５２３、ＡＲＲＹ−７７２及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項20】

前記チロシンキナーゼ阻害剤がＴｒｋＡ阻害剤である、請求項１４に記載のアッセイシステム。

【請求項21】

対象における肺がんを検出する方法であって、
前記対象からの肺腫瘍細胞のサンプルにおいて、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在を検出することを含み、前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在が前記対象におけるがんを示す、対象におけるがんを検出する方法。

【請求項22】

前記がんが非小細胞肺がんである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在をＲＴ−ＰＣＲにより検出する、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記遺伝子融合体をＦＩＳＨにより検出する、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

前記ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在を該ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるポリペプチドを検出することにより検出する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ポリペプチドを、抗体、抗体誘導体、及び該ポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体断片の少なくとも１つを用いて検出する、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、特定のがん療法に対して応答すると予測される肺がん患者の同定用のマーカー、方法及びアッセイキットに関する。

【背景技術】

【0002】

肺がんは依然として世界的にがんの主な死因であり、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に主に代表される。ＮＳＣＬＣは組織学と分子特性との両方に基づく疾患の異質な（heterogeneous）セットであると認識されつつある。活性化された癌遺伝子を効果的に阻害することができ、患者にとって改善された臨床転帰（outcomes）をもたらす標的療法がますます多くなっているので、これらの分子サブセットの同定は適切である。

【0003】

肺がんにおける最初の重要な発癌性融合体は、Soda及びその同僚らによって２００７年に見出された。未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子（ＡＬＫ）が、棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）との融合によって活性化された。この融合遺伝子は、下流のシグナル伝達経路の活性化と形質転換細胞増殖とを伴うＡＬＫチロシンキナーゼドメインの構成的活性化をもたらした。この発見以降、ＴＦＧ及びＫＩＦ５Ｂも、ＮＳＣＬＣにおいてＡＬＫについての融合パートナーとして同定された。複数の標的を有するチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるクリゾチニブは、ＡＬＫ陽性（ＡＬＫ＋）であることが判明している進行性ＮＳＣＬＣの患者の治療について、米国ＦＤＡにより現在承認されており、ＡＬＫ陽性を同定するためにＦＤＡに承認された唯一の方法は、再編成（rearranged）ＡＬＫにおける共通の切断点の５’領域及び３’領域に特異的なブレイクアパート（break-apart）（ＢＡ）プローブを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）である。ＲＯＳ１は、ＮＳＣＬＣにおける遺伝子融合体（gene fusions）によって活性化されることが最近見出されたもう１つの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＯＳ１が関係する最初のがん関連ゲノム再編成である、ＧＯＰＣの５’領域とＲＯＳ１の３’領域とを融合させる染色体６ｑ２１上の染色体内欠失が、神経膠芽腫において報告された。過去５年間において、ＲＯＳ１を活性化する７つの異なる融合体が同定された。重要なことに、ＲＯＳ１キナーゼドメインはこれらの融合現象のすべてにおいて保持されており、発現される融合遺伝子は発癌性であることが報告されている。ＦＩＳＨは、そのアッセイの性質により、理論的には、ＲＯＳ１遺伝子が再編成を経ているあらゆるすべての場合を検出することが可能であるために、これらの再編成を診断するのに一般的に用いられている技術的基盤である。最近のデータはまた、ＲＯＳ１遺伝子融合体を持つ肺がん患者がクリゾチニブに応答することも支持しており、これら患者の同定における臨床的有用性が支持される。

【0004】

４つの最近の研究が、肺がんにおいて融合により活性化される第３の遺伝子である、ＲＥＴ（Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を記載している。ＲＥＴは、遺伝子融合体（ＲＥＴ−ＰＴＣ）による活性化を介して甲状腺乳頭癌及び甲状腺濾胞癌において発癌性の役割を有する、よく知られているＲＴＫである。その腫瘍がこの融合体を持つ患者は、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする経口ＴＫＩであるバンデタニブに対してよく応答する。全部で３３名の患者が、７つの異なる切断点を伴うＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合体を持つことが報告された。これらの分子再編成は２０００を超える肺腺癌をスクリーニングするのに使用された複数の技術を介して同定された。３つのより大きいスクリーニングされた系列において、おそらく事前選択のレベルがより低いことにより、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合体の頻度は、１％〜２％の範囲であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

この分野において、肺がんのより有効な検出及び治療を促す、発癌性融合体マーカーを含む更なる分子マーカーを同定する必要性が依然として存在している。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、肺がんを示し、かつ、どの患者がチロシンキナーゼ阻害剤の治療的投与を含むがん療法に対して応答することができるかも示す、ＮＴＲＫ１遺伝子を含む新規な遺伝子融合体の発見に基づく。

【0007】

したがって、１つの実施の形態において、本発明は、肺がん患者が化学療法計画（chemotherapeutic regimen）の実施に対して応答すると予測されるかどうかを決定する方法を含む。この方法は、患者からの腫瘍細胞のサンプルにおいて、マーカーの存在又は非存在を検出することを含み、ここで、このマーカーは、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体（ＮＴＲＫ１はＴＲＫＡタンパク質をコードする）を含む遺伝子融合体を含むものであり、ここで、マーカーの存在又は非存在は、がん患者が化学療法計画の実施に対して応答するかどうかを示すものである。

【0008】

様々な実施の形態において、化学療法計画は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤（又はその他のシャペロン阻害剤）、チロシンキナーゼ下流シグナル伝達カスケードを標的とする阻害剤、又はそれらの組合せの１又は複数の投与を含むものとすることができる。かかる阻害剤は当該技術分野においてよく知られており、市販されている。これらすべての阻害剤が本発明に包含される。例えば、いくつかの実施の形態において、チロシンキナーゼ阻害剤はＴｒｋＡ阻害剤とすることができ、ＴｒｋＡ阻害剤の例としては、これらに限定されないが、クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４０１６６）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４）、ドビチニブ（dovitinib）（ＴＫ−２５８）、ＣＥＰ−７０１、又はレバスチニブ（rebastinib）（ＤＣＣ−２０３６）が挙げられる。ＨＳＰ９０阻害剤の例としては、これらに限定されないが、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、１７−ＡＡＧ、ＰＵ２４ＦＣ１、ＳＴＡ−９０９０、ＩＰＩ−５０４、及びＡＵＹ−９２２が挙げられる。チロシンキナーゼ受容体の下流シグナル伝達カスケードを標的とする阻害剤の例としては、限定されないが、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）及びＭＫ２２０６が挙げられる。

【0009】

いくつかの実施の形態において、マーカーのレベルが決定され、標準レベル又は基準範囲と比較される。いくつかの実施の形態において、標準レベル又は基準範囲は、リスク予測についての統計学的手法によって決定される。

【0010】

いくつかの実施の形態において、マーカーの存在は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出することにより、決定することができる。いくつかの実施の形態において、本方法は、ポリペプチド又はその断片に特異的に結合する試薬を用いてポリペプチドの存在を検出することを含むことができる。試薬は、抗体、抗体誘導体、又は抗体断片とすることができる。

【0011】

いくつかの実施の形態において、マーカーの存在は、サンプルからＲＮＡを得ることと、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製することと、マーカーに特異的なプライマーによりｃＤＮＡを増幅することと、増幅されたｃＤＮＡの配列からサンプルにおけるマーカーの存在又は非存在を決定することとによって、決定することができる。いくつかの実施の形態において、マーカーの存在は、蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）により決定することができる。

【0012】

本発明の方法は、ａ）サンプルにおけるマーカーの発現レベルと、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する有益な応答と関連付けられたマーカーの
対照レベル、及び、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する有益な応答の欠如と関連付けられたマーカーの対照レベルからなる群から選択されるマーカーの対照レベルとを比較することと、ｂ）サンプルにおけるマーカーの発現レベルが、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する感受性と関連付けられたマーカーの発現の対照レベルと統計的に同様若しくは対照レベルより統計的に高い場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対して応答すると予測されるものとして上記患者を選択すること、又は、ｃ）サンプルにおけるマーカーのレベルが、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する有益な応答と関連付けられたマーカーの対照レベルより統計的に低い場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に応答しないと予測されるものとして上記患者を選択することとを更に含むことができる。

【0013】

いくつかの実施の形態において、本方法は、サンプルにおけるマーカーの発現レベルと、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対して応答しないと予測される第２の患者におけるマーカーのレベルとを比較することと、サンプルにおけるマーカーの発現レベルが、第２の患者におけるマーカーの発現のレベルより高い場合に、１若しくは又は複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対して応答すると予測されるものとして上記患者を選択すること、又は、サンプルにおけるマーカーのレベルが、第２の患者におけるマーカーの発現のレベル以下である場合に、１若しくは複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対して応答しないと予測されるものとして上記患者を選択することとを更に含むことができる。いくつかの実施の形態において、患者はヒトである。

【0014】

更なる実施形態において、本発明は、チロシンキナーゼ抗がん療法に対する患者の応答又は転帰を予測するアッセイシステムであって、ａ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体を含む遺伝子融合体の存在、ｂ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の発現のレベル、ｃ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質の存在、ｄ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質のレベル、及び、ｅ）ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるタンパク質の活性の少なくとも１つを検出する手段を含む、チロシンキナーゼ抗がん療法に対する患者の応答又は転帰を予測するアッセイシステムを含む。いくつかの実施の形態において、検出する手段は、ＮＴＲＫ１遺伝子の少なくとも１０〜５０個の連続核酸塩基、又はその相補的核酸配列を含む核酸プローブを含む。いくつかの実施の形態において、検出する手段は、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされるポリペプチドを特異的に検出する結合リガンドを含む。いくつかの実施の形態において、アッセイシステムの表面は、チップ、アレイ、又は流動性カード（fluidity card）を備えている。いくつかの実施の形態において、アッセイシステムは、１又は複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する応答と関連付けられた、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の予め決定された対照レベルを含有する情報、及び１又は複数のキナーゼ阻害剤を含む化学療法計画の実施に対する応答の欠如と関連付けられた、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体によりコードされる遺伝子転写産物の予め決定された対照レベルを含有する情報からなる群から選択される対照を更に含む。

【0015】

別の実施の形態において、本発明は、対象における特定のタイプの肺がんを診断する方法を含み、この方法は、対象からの細胞のサンプルにおいて、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーの存在を検出することを含み、ここで、マーカーの存在は、対象が特定のタイプの肺がんを有するかどうかを示す。いくつかの実施の形態において、遺伝子融合体マーカーの存在は、ＲＴ−ＰＣＲ又はＦＩＳＨにより検出される。いくつかの実施の形態において、遺伝子融合体マーカーの存在は、遺伝子融合体マーカーによりコードされるポリペプチドを検出することにより検出される。いくつかの実施の形態において、ポリ
ペプチドは、ポリペプチド又はその断片に特異的に結合する試薬を用いて検出される。

【0016】

本発明のその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から当業者に明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＭＰＲＩＰ遺伝子の染色体マップ及びエクソンマップを示す。

【図2】ＮＴＲＫ１遺伝子の染色体マップ及びエクソンマップを示す。

【図3A】肺がんサンプルにおけるＮＴＲＫ１遺伝子融合体の配置及び肺がんサンプルにおけるＮＴＲＫ１遺伝子融合体を確認するデータを示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰを持つ腫瘍サンプルからのゲノム再編成の模式図である。

【図3B】肺がんサンプルにおけるＮＴＲＫ１遺伝子融合体の配置及び肺がんサンプルにおけるＮＴＲＫ１遺伝子融合体を確認するデータを示す。新規な融合体転写産物のｍＲＮＡ発現を実証するＲＴ−ＰＣＲを示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰを持つホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍サンプルから抽出したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ、次いでアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡシークエンシングに供した。以下の略語が使用される：ＭＰＲＩＰ（Ｍ）、ＣＤ７４（Ｃ）、ＮＴＲＫ１（Ｎ）、及びエクソン（ｅｘ）。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体を有する腫瘍サンプルから単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物のサンガーシークエンシングクロマトグラムを得た。配列番号１はＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体（Ｍ２１；Ｎ１４）の完全なｃＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡをこの融合体が最初に同定された患者からの凍結腫瘍サンプルからクローニングした。大文字はオープンリーディングフレーム内に含有されるヌクレオチドを表す。

【図4A】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の検出のためのＲＴ−ＰＣＲプライマーリード配列を示す。ＭＰＲＩＰ ＣＣ３Ｆ１プライマーによるフォワードリード配列を示す。

【図4B】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の検出のためのＲＴ−ＰＣＲプライマーリード配列を示す。ＮＴＲＫ１ Ｙ４９０Ｒ１プライマーによるリバースリード配列を示す。

【図5】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体ＦＩＳＨプローブの設計を示す。

【図6】染色体１ｑ２３．１のＮＴＲＫ１コード領域に対して整列された５’→３’ＮＴＲＫ１ブレイクアパートＦＩＳＨプローブセットの設計を示す。

【図7】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体プローブを用いて正常細胞株ＧＭ０９９４８から得られたＦＩＳＨ画像を示し、正常細胞株（二倍体、２Ｎ）における単一クローン確証を提供する。図７Ａ：クローンＲＰ１１−１０３８Ｎ１３（３’ＮＴＲＫ１）及びＲＰ１１−１２５１１６（５’ＭＰＲＩＰ）。図７Ｂ：クローンＲＰ１１−１０５９Ｃ２１（３’ＮＴＲＫ１）及びＲｐ１１−７９６Ｊ１９（５’ＭＰＲＩＰ）。

【図8】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体プローブを用いてＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体について陰性である組織切片から得られたＦＩＳＨ画像を示す。図８Ａは、両方の遺伝子についての低コピー数を示す、検体Ｓ−１２−０４７４８６を示す。図８Ｂは、３’ＮＴＲＫ１についての高コピー数及び５’ＭＰＲＩＰについての中程度／低コピー数を示す、検体Ｓ−１２−０４７０９８を示す。

【図9】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体プローブを用いてＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体について陽性である組織切片から得られたＦＩＳＨ画像を示す。図９Ａは、１つの腫瘍細胞あたりおよそ１つの赤色／緑色融合（陽性パターン）を有する両方の遺伝子についての低コピー数を示す。図９Ｂは、１つの腫瘍細胞あたり単一の赤色及び単一の緑色の中程度／低コピー数を有する融合した（fused）赤色／緑色の遺伝子増幅を示す。

【図10】ＮＴＲＫ１ブレイクアパートＦＩＳＨプローブの試験を示す。図１０ａは、中期スプレッド及び間期核を示す正常核型を有する細胞株ＧＭ０９９４８を示し、インタクトなＮＴＲＫ１遺伝子を示す５’シグナルと３’シグナルとの近接を実証している。図１０ｂは、５’シグナルと３’シグナルとの明白な分離を示す、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１遺伝子融合体を持つＫＭ１２細胞を示し、ＮＴＲＫ１遺伝子の再編成を示している。図１０ｃは、ＮＴＲＫ１遺伝子に対応する５’シグナルと３’シグナルとの明白な分離を示す、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰサンプルのブレイクアパートＦＩＳＨ分析を示す。図１０ｄは、ＮＴＲＫ１遺伝子再編成を有さない腫瘍サンプルのブレイクアパートＦＩＳＨ分析を示し、緑色／赤色シグナルの接近を示している（矢印により示される）。

【図11】ＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブを用いてＮＴＲＫ１遺伝子再編成について陽性である組織切片から得られたＦＩＳＨ画像を示す。５’ＮＴＲＫ１／３’ＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブセットとハイブリダイズした検体Ｓ１２−６８８９Ｂ１。細胞は開裂（split）の「陽性」パターンと融合したシグナルの「正常」パターンとの両方を示す。

【図12A】ＴＲＫＡを発現する２９３Ｔ細胞からの細胞溶解液のイムノブロット分析を示す。ＴＲＫＡ（ＨＡタグ付き）又は空ベクターの発現は、ＨＡ特異的抗体（左側、Cell Signaling）及びＴＲＫＡ特異的抗体（右側、Santa Cruz、ＳＣ−１１８）によって検出された約１１５ｋＤ〜１２０ｋＤのタンパク質の発現を実証する。

【図12B】ＴＲＫＡを発現する２９３Ｔ細胞からの細胞溶解液のイムノブロット分析を示す。１μΜの示された阻害剤若しくはＤＭＳＯ（対照）による５時間の処理後の、ＨＡ特異的抗体（Cell Signaling）を用いる免疫沈降、次いで同抗体（左側）又はホスホチロシン特異的抗体（右側、Miilipore、４Ｇ１０）を用いるイムノブロット。

【図12C】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰの発現が、自己リン酸化されるキメラタンパク質を生じることを示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合遺伝子を有する指標患者からの、凍結胸水サンプルからの腫瘍細胞又は培養物中の初期継代細胞（ＣＵＴＯ−３）と比較した、空ベクター（ＥＶ）、全長ＮＴＲＫ１ ｃＤＮＡ、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ ｃＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のイムノブロット分析。

【図12D】予測される融合体タンパク質産物の融合体切断点及び重要なドメインを実証する模式図である。

【図13A】チロシンキナーゼ阻害剤による処理後のＴＲＫＡの下流シグナル伝達のイムノブロット分析を示す。ＮＧＦ（１０分間）の存在下若しくは非存在下、１μΜの示されたチロシンキナーゼ阻害剤の５時間の存在下若しくは非存在下で、ＴＲＫＡ−ＨＡ又は空ベクターを発現させた２９３Ｔ細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。膜を、ＴＲＫＡホスホチロシン４９０、６７４、及び６７５（Cell Signaling）、全ＴＲＫＡ（抗ＨＡ、Cell Signaling）、ＡＫＴホスホセリン４７３（Cell Signaling）、全ＡＫＴ（Cell Signaling）、リン酸化ＥＲＫ ｐ４２／４４（Cell Signaling）、全ＥＲＫ ｐ４２／４４（Cell Signaling）、並びにガンマ−チューブリン（Santa Cruz、ＳＣ−８０３５）に対する抗体でプローブした。

【図13B】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰの発現は、下流のＭＡＰＫ、ＡＫＴ、及びＳＴＡＴ３経路の活性化を誘導することを示す。ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）融合体は自己リン酸化されて重要な下流のシグナル伝達経路を活性化する。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰのタンパク質産物であるがそのキナーゼ活性欠損（kinase dead）（ＫＤ）変異体ではないＲＩＰ−ＴＲＫＡを発現するＢａ／Ｆ３細胞からの細胞溶解液の代表的なイムノブロット分析（ｎ＝３）は、ＩＬ−３の非存在下で重要なチロシン残基のリン酸化並びにｐＡＫＴ、ｐＥＲＫ及びｐＳＴＡＴ３の活性化を示す。

【図14】ＮＴＲＫ１遺伝子融合体はＩＬ−３の非存在下でＢａ／Ｆ３細胞の細胞増殖を支持することを実証する。Ｂａ／Ｆ３のＭＴＳアッセイは、ＲＩＰ−ＴＲＫＡ、ＣＤ７４−ＴＲＫＡ、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、又はＮＧＦを追加した全長ＴＲＫＡを発現する細胞はＩＬ−３の非存在下で増殖し、一方ＥＶ又はＲＩＰ−ＴＲＫＡのキナーゼ活性欠損変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞は増殖しないことを実証する（ｎ＝３）。値は平均±ＳＥＭである。

【図15】ＮＴＲＫ１融合体は足場非依存性増殖を支持することを実証する。軟寒天中でＥＶ、ＲＩＰ−ＴＲＫＡ−キナーゼ活性欠損（ＫＤ）、又はＲＩＰ−ＴＲＫＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存性増殖アッセイからの代表的な画像（ｎ＝４）である。

【図16】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合タンパク質は腫瘍発生を誘導することを示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ（「ＲＩＰ−ＴＲＫＡ」）、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰキナーゼ活性欠損（「ＲＩＰ−ＴＲＫＡ−キナーゼ活性欠損」）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ又は空ベクターを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの側腹部に注射し、腫瘍増殖について観察した。注射を受けた全マウス数と比較した腫瘍を有するマウスの数を示す。

【図17】ＮＴＲＫ１のＲＮＡｉノックダウンはＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１を持つ細胞株における細胞増殖を阻害することを示す。ＫＭ１２細胞をｓｉＲＮＡトランスフェクションの９６時間後にＭＴＳ増殖アッセイによって分析した（ｎ＝３）。ＡＮＯＶＡ分析、次いで、ボンフェローニの多重比較検定は、ｓｉＲＮＡ１により誘導される増殖の有意な阻害を示した（ｐ＜０．０５）。値は平均±ＳＥＭを表す。ＫＭ１２細胞を、ＮＴＲＫ１を標的とするｓｉＲＮＡによりトランスフェクトし、次いで４８時間後に収集した。細胞溶解液をイムノブロットにより分析し、ＴＲＫＡ、ｐＥＲＫ１／２及びＥＲＫ１／２を検出した。

【図18】ＴＲＫＡ及び下流シグナル伝達の活性化の薬物阻害を示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ（ＲＩＰ−ＴＲＫＡ）又は空ベクター（ＥＶ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、示された用量の薬物（ＡＲＲＹ−４７０、クリゾチニブ、ＣＥＰ−７０１、ＡＲＲＹ−７７２、又はＡＲＲＹ−５２３）又はＤＭＳＯ対照（Ｃ）による５時間の処理後に溶解した。

【図19】薬物処理はＮＴＲＫ１融合体に媒介されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を阻害することを示し、指標患者のクリゾチニブによる処理を示す。ＮＴＲＫ１融合体を発現するＢａ／Ｆ３細胞のＴＲＫＡ阻害剤による処理は、ＭＴＳアッセイにより測定した細胞増殖を阻害する（ｎ＝５）。図１９（ａ）：値は平均±ＳＥＭを表す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰを発現するＢａ／Ｆ３細胞は、汎（pan）ＴＲＫ阻害剤である、ＡＲＲＹ−４７０、−５２３、及び−７７２並びに多標的キナーゼ阻害剤である、ＣＥＰ−７０１によって増殖は阻害されるが、ＥＧＦＲ阻害剤であるゲフィチニブによっては、増殖は阻害されないことを実証する。図１９（ｂ）：クリゾチニブは、ＡＬＫ又はＲＯＳ１融合体コンストラクトを発現するＢａ／Ｆ３細胞と同様に、ＮＴＲＫ１融合体を発現するＢａ／Ｆ３の阻害を導く。半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値が列挙される（ｎＭ）。

【図20】ＩＬ−３の存在下でのＢａ／Ｆ３細胞の薬物処理を示す。空ベクターを発現するＢａ／Ｆ３細胞をＩＬ−３の存在下で培養し、広範な用量の、ＡＲＲＹ−４７０、ＣＥＰ−７０１、クリゾチニブ、又はゲフィチニブにより処理した。ＩＣ_５０値が列挙される（ｎ＝３）。値は平均±ＳＥＭを表す。

【図21】ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＴＲＫ１融合体の発現及び薬物阻害を示す。ＲＩＰ−ＴＲＫＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を示された用量の薬物で５時間処理した後、細胞溶解と、ｐＴＲＫＡ、ＴＲＫＡ、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ｐＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ３のイムノブロット分析とを示されたように行った。

【図22】ＴＲＫＡ活性を有する薬物による足場非依存性増殖の阻害を示す。図２２ａ：空ＲＩＰ−ＴＲＫＡを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を３連で軟寒天に播種し、ＤＭＳＯ（対照）又は２００ｎＭの、ＡＲＲＹ−４７０、クリゾチニブ、若しくはＣＥＰ−７０１により２週間処理した（ｎ＝４）。代表的な画像を示す。図２２ｂ：各プレートについての全コロニー面積を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いて定量し、各条件についてプロットした。値は平均±ＳＥＭを表す。

【図23】ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体を示す指標患者からの短期細胞培養物を示す。コロラド大学胸部腫瘍学（Colorado University Thoracic Oncology）（ＣＵＴＯ）３細胞はＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体を持つ指標患者からの胸水に由来するものであった。左側：陽性シグナル（開裂緑色／赤色シグナル）を示すＣＵＴＯ−３細胞のＮＴＲＫ１ ＦＩＳＨ分析。右側：汎ＴＲＫ阻害剤であるＡＲＲＹ−４７０による、ｐＴＲＫＡ及びｐＥＲＫの阻害を実証するＣＵＴＯ−３細胞のイムノブロット分析。

【図24】ＫＭ１２細胞の薬物処理を示す。ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１融合体を持つＫＭ１２細胞を、示された用量の阻害剤による５時間の処理の後に溶解し、イムノブロット分析に供した（ｎ＝３）。

【図25】ＫＭ１２細胞の薬物処理は増殖を阻害することを示す。示された薬物及び用量により処理されたＫＭ１２細胞の増殖を、ＭＴＳアッセイにより細胞増殖についてアッセイした。ＫＭ１２細胞は、ＡＲＲＹ−４７０、ＣＥＰ−７０１、及びクリゾチニブによって阻害されるが、ゲフィチニブによっては阻害されない。

【図26】ＴＲＫＡ阻害の結果、ＫＭ１２細胞のＧ１期における蓄積がもたらされることを示す。ＫＭ１２細胞を示された用量の薬物により２４時間処理した。細胞を次いでヨウ化プロピジウムにより染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＭｏｄＦｉｔ分析を用いて細胞周期プロファイルを定量した（ｎ＝３）。値は平均±ＳＥＭである。

【図27A】ＴＲＫＡ阻害剤による薬物処理は、ＫＭ１２細胞におけるアポトーシスを誘導することを示す。ＫＭ１２細胞を示された薬物及び用量で２４時間処理し、トリプシン処理し、ＹＯ−ＰＲＯ（商標）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アポトーシスを起こしている細胞（ＹＯ−ＰＲＯ（商標）陽性及びＰＩ陰性）のパーセントをプロットしている（ｎ＝４）。値は平均±ＳＥＭを表す。

【図27B】ＴＲＫＡ阻害剤による薬物処理は、ＫＭ１２細胞におけるアポトーシスを誘導することを示す。ＴＲＫＡ阻害剤はＰＡＲＰ−１の切断を誘導する。ＫＭ１２細胞を示された薬物及び用量で２４時間処理した。細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、示された抗体を用いるイムノブロット分析に供した。

【図28】肺腺癌を実証する、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰを持つ指標患者からの病理組織学を示す。図２８（ａ）：腺がんを示す原発性肺左下肺腫瘤のコア針生検材料。図２８（ｂ）：腫瘍細胞を示す、同じ手順からの細針吸引液の細胞塊。図２８（ｃ）：腫瘍細胞における強い核染色を実証するＴＴＦ−１免疫組織化学（ＩＨＣ）。図２８（ｄ）：腫瘍細胞における陰性染色を実証する、サイログロブリンＩＨＣ。代表的な画像を示す。

【図29A】その他の治療選択肢がなく、指標患者（ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ）がクリゾチニブ２５０ｍｇの１日２回経口投与（オフプロトコル（off-protocol）、オフラベル）による治療に同意した場合の治療の結果を示す。クリゾチニブの前及び２８日後の胸部のＣＴスキャン。

【図29B】その他の治療選択肢がなく、指標患者（ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ）がクリゾチニブ２５０ｍｇの１日２回経口投与（オフプロトコル、オフラベル）による治療に同意した場合の治療の結果を示す。クリゾチニブ治療の間の連続的ＣＡ１２５腫瘍マーカーレベル。

【図30】典型的な円形でコンパクトなシグナルである、シグナル配置「ドット」と、その他のシグナルとの比較とを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明者らは、ＭＰＲＩＰ遺伝子とＮＴＲＫ１遺伝子との融合体が特定のタイプの肺がんの存在を示すことを見出した。この遺伝子融合体はまた、チロシンキナーゼ阻害剤による治療に対する患者の臨床応答も示す。この遺伝子融合体、及びこの遺伝子融合体によりコードされるタンパク質のレベルは、臨床パラメーターとともに、特定のタイプの肺がんを診断し、チロシンキナーゼ阻害剤による治療に対するがん患者の応答を評価する、生物学的マーカーとして使用することができる。

【0019】

１つの定義によると、生物学的マーカーは、「正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定及び評価される特徴」である（NIH Marker Definitions Working Group (1998)）。生物学的マーカーはまた、特定の生物学的プロセスを示す特徴のパターン又はアンサンブル（「マーカーのパネル」）も含むことができる。マーカー測定値は、特定の生物学的現象若しくはプロセスを示すために、上昇するものである場合もあり、又は低下するものである場合もある。さらに、
マーカー測定値が特定の生物学的プロセスの非存在下で典型的に変化する場合、一定の測定値が、その生物学的プロセスの出現を示すこともある。

【0020】

マーカー測定値は、絶対値のものである場合もあり（例えば、生物サンプル中の或る分子のモル濃度）、又は相対値のものである場合もある（例えば、生物サンプル中の２種類の分子の相対濃度）。２以上の測定値の商又は積もまた、マーカーとして使用することができる。例えば、冠動脈疾患を発症するリスクのマーカーとして血中総コレステロールを使用する医師もいるが、一方、冠動脈疾患を発症するリスクのマーカーとして総コレステロールとＨＤＬコレステロールとの比を使用する医師もいる。

【0021】

本発明において、マーカーは、診断目的、予後診断目的、治療目的、薬物スクリーニング目的及び患者層別化（例えば、評価についての多数の「サブセット」に患者をグループ化する）目的、並びに、潜在的がん療法の有効性の評価を含む本明細書に記載するその他の目的のために、使用することができる。

【0022】

本発明の実施には、特に断りのない限り、当該技術分野の技術範囲内の一般に既知の技法である、分析生化学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡの従来の方法を用いる。かかる技法は文献に十分に説明されている（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (Hames & Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (Hames & Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (Fields and Knipe, eds.)を参照されたい）。

【0023】

本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものであり、限定する意図のものではない。本明細書において使用される場合、単数形である「或る」、「１つの」及び「その」は、内容及び文脈が明らかに別のことを示さない限り複数の指示物を含む。したがって、例えば、「或るマーカー」についての言及は、２以上のかかるマーカーの組合せを含む。別のように定義されない限り、すべての科学用語及び技術用語はそれらの用語が属する技術分野において一般に使用されている意味と同じ意味を有すると理解すべきである。本発明の目的のために、以下の用語が以下に定義される。

【0024】

本明細書において使用される場合、「マーカー」という用語は、ポリペプチドマーカー及びポリヌクレオチドマーカーを含む。開示の明確性のために、本発明の態様は、「ポリペプチドマーカー」及び「ポリヌクレオチドマーカー」に関して記載する。しかしながら、「ポリペプチドマーカー」に関して本明細書においてなされる記載は、本発明のその他のポリペプチドにも適用する意図である。同様に、「ポリヌクレオチド」マーカーに関して本明細書においてなされる記載はそれぞれ本発明のその他のポリヌクレオチドにも適用する意図である。したがって、例えば、「ポリペプチドマーカー」をコードするとして記載されるポリヌクレオチドは、ポリペプチドマーカー、ポリペプチドマーカーに対してかなりの配列同一性を有するポリペプチド、修飾ポリペプチドマーカー、ポリペプチドマーカーの断片、ポリペプチドマーカーの前駆体及びポリペプチドマーカーの後続体（successors）、並びにポリペプチドマーカー、相同ポリペプチド、修飾ポリペプチドマーカー又は断片、ポリペプチドマーカーの前駆体又は後続体を含む分子（例えば、融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む意図である。

【0025】

本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも５つの連続アミノ酸残基、例えば、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長
、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長又は１２以上のアミノ酸長を有し、各整数からポリペプチドの全長までを含むアミノ酸残基のポリマーのことをいう。ポリペプチドは２以上のポリペプチド鎖から構成されるものとすることができる。ポリペプチドは、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、及びアミノ酸を含む。ポリペプチドは、直鎖状又は分枝状のものとすることができる。ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基、アミノ酸類似体又は非天然アミノ酸残基を含むことができ、非アミノ酸残基によって中断されたものとすることもできる。天然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、糖鎖付加、脂質付加、メチル化、アセチル化、リン酸化によって、又は、標識化成分との接合等の操作によって、修飾されたアミノ酸ポリマーが定義に含まれる。過剰発現されたポリペプチドマーカーに応答して対象によって産生された抗体もまた含まれる。

【0026】

本明細書において使用される場合、ポリペプチドの「断片」とは、１つのアミノ酸又はポリペプチドの配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基、少なくとも１０の連続アミノ酸残基、少なくとも２０の連続アミノ酸残基若しくは少なくとも３０の連続アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む複数のアミノ酸残基のことをいう。本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドの「断片」とは、１つの核酸又はポリヌクレオチドの配列の少なくとも１５の連続核酸残基、少なくとも３０の連続核酸残基、少なくとも６０の連続核酸残基、若しくは少なくとも９０％を有する核酸配列を含む核酸残基のポリマーのことをいう。いくつかの実施形態において、断片は抗原性断片であり、断片のサイズは、抗体によって認識されるエピトープが直鎖状エピトープであるか又は立体構造エピトープであるか等の因子に依存するであろう。したがって、抗原性断片によっては、より長いセグメントからなるものもあるであろうし、一方、より短いセグメント（例えば、各整数からポリペプチドの全長までを含む、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長又は１２以上のアミノ酸長）からなるものもあるであろう。当業者であればタンパク質の抗原性断片を選択する方法に十分に精通している。

【0027】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドマーカーは生物学的経路の成員である。本明細書において使用される場合、「前駆体」又は「後続体」という用語は、生物学的経路においてポリペプチドマーカー又はポリヌクレオチドマーカーの先にある、又は後にある分子のことをいう。したがって、いったんポリペプチドマーカー又はポリヌクレオチドマーカーが、１若しくは複数の生物学的経路の成員であるとして同定されると、本発明は、生物学的経路の更なる前駆体成員又は後続体成員を含むことができる。生物学的経路及びその成員のかかる同定は、当業者の技術範囲内である。

【0028】

本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つのヌクレオチド又はあらゆる長さの核酸残基のポリマーのことをいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類似体を含有することができ、二本鎖若しくは一本鎖とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾核酸（例えば、メチル化）、核酸類似体又は非天然核酸を含むことができ、非核酸残基によって中断されたものとすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、あらゆる配列の、遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、単離されたＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、プラスミド、及びベクターを含む。天然に、又は介入によって、修飾された核酸ポリマーも定義に含まれる。

【0029】

本明細書において使用される場合、２つのサンプルに適用された場合に、成分を検出するのに用いられた方法が異なるレベル又は活性を提供する場合に、成分（例えば、マーカー）は、別のサンプルと比較して１つのサンプルにおいて「示差的に発現されている」といわれる。成分を検出する方法が、成分のレベル若しくは活性が第１のサンプルにおけるほうが第２のサンプルにおけるよりも高いことを示す場合に（又は成分が第１のサンプル
において検出可能であるが、第２のサンプルにおいては検出可能でない場合）、成分は第１のサンプルにおいて「上昇」しているといわれる。逆に、成分を検出する方法が、成分のレベル若しくは活性が第１のサンプルにおけるほうが第２のサンプルにおけるよりも低いことを示す場合に（又は成分が第２のサンプルにおいて検出可能であるが、第１のサンプルにおいては検出可能でない場合）、成分は第１のサンプルにおいて「低下」しているといわれる。特に、マーカーのレベル若しくは活性が、非肺がん対象から得たサンプル（又はサンプルのセット）におけるマーカーのレベル、又は基準値若しくは基準範囲と比較して、それぞれより高い、又はより低い場合に、肺がん対象（又は肺がんを有すると疑われる対象、若しくは肺がんを発症するリスクがある対象）から得たサンプル（又はサンプルのセット）において、マーカーは「上昇」又は「低下」しているといわれる。

【0030】

本発明の新規な遺伝子融合体マーカーは以下のようにして同定された：癌遺伝子ドライバー遺伝子異常の存在を、肺腺癌を有する非喫煙者である患者において調査した。この患者は肺がんと関連する既知の突然変異、遺伝子増幅又は遺伝子融合体の証拠を示さなかった。その他の可能性のある遺伝子標的を探究するために、腫瘍生検サンプルからのゲノムＤＮＡを標的化次世代シークエンシングにより分析し、これにより新規なＮＴＲＫ１遺伝子融合体の存在を同定した。遺伝子融合体マーカーをＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体であると決定した。

【0031】

ＮＴＲＫ１遺伝子はＴＲＫＡ受容体型チロシンキナーゼをコードする。ＮＴＲＫ１遺伝子を、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ及びゼブラフィッシュ等の多数の種から単離し、配列を決定した。これらすべての遺伝子配列は当業者に知られており、本発明に包含されることが意図される。ＮＴＲＫ１が関与する遺伝子融合体は甲状腺乳頭癌において以前に報告されているが、肺がん又はその他の悪性腫瘍においては報告されていない。

【0032】

ＭＰＲＩＰ遺伝子はミオシンホスファターゼＲｈｏ相互作用タンパク質をコードする。ＭＰＲＩＰ遺伝子は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ及びシノラブダイティス・エレガンス（C. elegans：線虫）等の多数の種から単離され、配列が決定されている。これらすべての遺伝子配列は当業者に知られており、本発明に包含されることが意図される。

【0033】

本発明は、あらゆる悪性腫瘍においてＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体を同定する最初の例であると考えられる。新規なプライマーを含む特別注文ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体のｍＲＮＡ転写産物を検出するために開発した。このＲＴ−ＰＣＲでは、ＭＰＲＩＰとＮＴＲＫ１との両方からの配列を含有する小さな産物を増幅することに成功し、ＭＰＲＩＰのエクソン１〜２１及びＮＴＲＫ１のエクソン１４〜２０を含んでいた新規な遺伝子融合体の発現が確認された（実施例１を参照されたい）。新規なＦＩＳＨアッセイもまた、臨床検体においてＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の存在を検出するために開発した（実施例２及び３を参照されたい）。

【0034】

さらに、その特定の５’遺伝子融合体パートナーにかかわらず、その他のＮＴＲＫ１遺伝子融合体を検出するＦＩＳＨプローブもまた開発した（実施例２及び４を参照されたい）。

【0035】

本明細書において同定されたマーカーは生物学的に大変興味深い。ＮＴＲＫ１が関与する遺伝子融合体は甲状腺乳頭癌において以前に報告されているが、肺がん又はその他の悪性腫瘍においては報告されていない。したがってＮＴＲＫ１融合遺伝子は、がんの新規な診断マーカーとして役立つ。ＮＴＲＫ１遺伝子はＴＲＫＡ受容体型チロシンキナーゼをコードする。この遺伝子融合体の存在を、肺がん及び結腸直腸がんを含む様々ながんモデル
から得た腫瘍サンプルにおいて調べ、腫瘍のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を調査した。目的は、この遺伝子融合体マーカーを、チロシンキナーゼ阻害剤治療に対するがん患者の応答の臨床的に関連するマーカーを同定するために使用することであった。使用した方法は本開示の実施例のセクションに詳細に記載されている。限定されないが、クリゾチニブ、ポナチニブ、ドビチニブ、レバスチニブ、ＣＥＰ−７０１、ＡＺＤ−７４５１、ＡＲＲＹ−４７０、ＡＲＲＹ−５２３、及びＡＲＲＹ−７７２並びに当該技術分野において既知のＴＲＫＡを阻害すると予測されるその他のチロシンキナーゼ阻害剤化合物、又はＮＴＲＫ１融合タンパク質等のＴＲＫＡキナーゼドメインを含有する発癌性融合体タンパク質を含むいくつかのチロシンキナーゼ阻害剤が現在臨床開発の様々な段階にある。実施例５に示すデータは低分子チロシンキナーゼ阻害剤が活性化されたＴＲＫＡを阻害することを実証する。

【0036】

がんの診断、予後診断、又はその他の評価若しくは研究に使用することができるＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーの発見に加えて、このマーカーはまた、更に詳細に研究することができ、及び／又は、その他の疾患の修飾薬若しくは治療薬の発見のための標的として使用することができる。

【0037】

ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーを含むＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーは、チロシンキナーゼ阻害剤に対するがん患者の応答の指標であると考えられる。したがって、１つの態様において、本発明は、マーカーの存在又は発現レベルがチロシンキナーゼ阻害剤に対するがん患者の応答を示すマーカーを提供する。

【0038】

別の態様において、本発明の遺伝子融合体マーカーは、ＨＳＰ９０阻害剤（又はその他のシャペロン阻害剤）又は下流シグナル伝達カスケードを標的とする作用剤の投与等のその他の標的化がん療法に対するがん患者の応答の指標として役立つことができる。かかる阻害剤は当該技術分野においてよく知られており、市販されている。かかる阻害剤のすべてが本発明に包含される。ＨＳＰ９０阻害剤の例としては、限定されないが、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、１７−ＡＡＧ、ＰＵ２４ＦＣｌ、ＳＴＡ−９０９０、ＩＰＩ−５０４、及びＡＵＹ−９２２が挙げられる。下流シグナル伝達カスケードを標的とする作用剤の例としては、セルメチニブ（ＡＺＤ−６２４４）及びＭＫ２２０６が挙げられる。

【0039】

マーカーの存在は、ポリヌクレオチドを検出することによって検出することができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＮＴＲＫ１遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし、ＮＴＲＫ１遺伝子が関与する染色体再編成を同定するプローブとすることができる。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーを含む、ＮＴＲＫ１遺伝子が関与する遺伝子融合体の存在を示すポリヌクレオチド配列に特異的に結合し、かかる配列を増幅するプライマーとすることができる。

【0040】

いくらかの変動が本発明のマーカーの物理的及び化学的特徴の測定に固有である。変動の大きさは、分離手段の再現性並びに測定を行うために用いる検出手段の特異性及び感受性に或る程度依存する。マーカーを測定するために使用する方法及び技法は高感度かつ再現性のあるものが好ましい。

【0041】

遺伝子融合体マーカーの存在はまた、ポリヌクレオチドを検出することによっても検出することができる。ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーに対応するポリペプチドは、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーによりコードされるタンパク質の、断片、前駆体、後続体又は修飾型を含むことができる。別の実施形態において、本発明は、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーによりコードされる、断片、前駆体、後続体又は修飾ポリペプチドを含む分子を含む。

【0042】

本発明の別の実施形態は、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーの発現の検出のための、複数の抗体、又はその抗原結合断片、又はアプタマーを含むアッセイシステムに関する。複数の抗体、又はその抗原結合断片、又はアプタマーは、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーによりコードされるタンパク質に選択的に結合する。

【0043】

本明細書において使用される場合、「患者」、「対象」、「がんを有する対象」及び「がん患者」という用語は、がんを有すると診断された対象又はがんを有すると疑われる対象のことをいう意図である。「非対象」及び「がんを有さない対象」という用語は、がんであると診断されたことのない対象、又は１若しくは複数の腫瘍を切除する手術の結果、がんを有さなくなった対象のことをいう意図である。非がん対象は、健康であってその他の疾患を患っていないものであってもよく、又はがん以外の疾患を患うものであってもよい。ＮＴＲＫ１遺伝子は、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、及びゼブラフィッシュ等の多数の種において保存されていることが判明し、それらの配列は既知である。いくつかの実施形態において、患者又は対象は哺乳類とすることができる。好ましい実施形態において、患者又は対象はヒトである。

【0044】

ＮＴＲＫ１遺伝子融合体によりコードされるポリペプチドは、当該技術分野において既知のいずれかの好適な方法によって単離することができる。ＮＴＲＫ１遺伝子融合体によりコードされるネイティブなポリペプチドは、当該技術分野において既知の標準的方法（例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、溶解度差（differential solubility）、イムノアッセイ）により天然源から精製することができる。１つの実施形態において、ポリペプチドは腫瘍サンプルから単離することができる。別の実施形態において、ポリペプチドは、サンプルとマーカーに特異的に結合する基体結合抗体又はアプタマーとを接触させることによりサンプルから単離することができる。

【0045】

本発明はまた、本発明の遺伝子融合体マーカーに関連するポリヌクレオチドも含む。１つの態様において、本発明は、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーを含むポリヌクレオチドを提供する。これらはポリヌクレオチドマーカーと称することができる。ポリヌクレオチドマーカーは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ転写産物とすることができる。別の実施形態において、本発明は、ＮＴＲＫ１−遺伝子融合体マーカーを含む、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカー又はその変異体を含むポリヌクレオチドに対してかなりの配列類似性を有するポリヌクレオチドを提供する。

【0046】

いくつかの実施形態において、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーによりコードされるポリペプチド、即ち、ポリペプチドマーカーは、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体の代替マーカーとして使用することができる。したがって、例えば、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーによりコードされるポリペプチドががん患者中に存在する場合、（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答すると期待されるがん患者を同定するために）ポリペプチドの存在又はレベル又は活性を調べることができる。

【0047】

遺伝子融合体マーカーを含むポリヌクレオチドマーカーは、当該技術分野において既知のいずれかの好適な方法によって単離することができる。ネイティブなポリヌクレオチドマーカーは当該技術分野において既知の標準的方法（例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、溶解度差、イムノアッセイ）によって天然源から精製することができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドマーカーは、混合物とポリヌクレオチドマーカーに相補的な基体結合プローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させることによって、混合物から単離することができる。

【0048】

代替的に、ＮＴＲＫ１遺伝子融合体を含むポリヌクレオチドマーカーは、当該技術分野において既知のいずれかの好適な化学的又は組換え方法によって合成することができる。
１つの実施形態において、例えば、マーカーは、有機化学の方法及び技法を用いて合成することができる。別の実施形態において、ポリヌクレオチドマーカーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生することができる。

【0049】

本発明はまた、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドマーカーに特異的に結合する分子も包含する。１つの態様において、本発明は、ポリペプチドマーカー又はポリヌクレオチドマーカーに特異的に結合する分子を提供する。本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、結合対（例えば、抗体と抗原、又はアプタマーとその標的）の間の相互作用のことをいう。いくつかの実施形態において、相互作用は、最大で１０^−６モル／リットル、最大で１０^−７モル／リットル、又は最大で１０^−８モル／リットルの親和定数を有する。他の実施形態において、「特異的に結合する」という表現は、１つのタンパク質ともう１つのタンパク質との（例えば、抗体、その断片、又は結合パートナーと抗原の）特異的結合であって、ここで、いずれかの標準的アッセイ（例えば、イムノアッセイ）により測定した結合のレベルが、アッセイについてのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高い特異的結合のことをいう。例えば、イムノアッセイを実施する場合、対照は、抗体又は抗原結合断片のみを含有する反応ウェル／チューブを典型的には含み（即ち、抗原の非存在下）、ここで、抗体又はその抗原結合断片による、抗原の非存在下での反応性（例えば、ウェルに対する非特異的結合）の量はバックグラウンドであるとみなされる。結合は、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノブロットアッセイ等）を含む、当該技術分野において標準的な様々な方法を用いて測定することができる。

【0050】

結合分子には、抗体、アプタマー及び抗体断片が含まれる。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗原上に存在するエピトープに結合することができる免疫グロブリン分子のことをいう。この用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等のインタクトな免疫グロブリン分子のみならず、二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、融合タンパク質並びに要求される特異性の抗原認識部位を含む上記のあらゆる修飾体（modifications）も包含する意図である。本明細書において使用される場合、アプタマーは、標的に対する望ましい作用を有する非天然核酸である。望ましい作用としては、これらに限定されないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的又は標的の機能活性を修飾／改変させるように標的と反応すること、自殺型阻害剤におけるように標的に共有結合すること、標的と別の分子との間の反応を促進することが挙げられる。好ましい実施形態において、作用は標的分子についての特異的結合親和性であり、かかる標的分子は、ワトソンクリック塩基対形成又は三重らせん結合に主に依存する機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造のものであり、ここで、核酸リガンドは、標的分子により結合されるという既知の生理機能を有する核酸ではない。

【0051】

本発明のポリペプチドマーカー又はポリヌクレオチドマーカーに特異的に結合する或る特定の抗体は、既知及び／又は市販源から購入して入手することができる。いずれにしても、本発明の抗体は当該技術分野において既知のいずれかの好適な手段によって調製することができる。例えば、抗体は、（必要であれば、担体に接合した）マーカー又はその免疫原性断片によって動物宿主を免疫することによって調製することができる。アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）を任意に使用して免疫応答を上昇させることができる。抗原決定基に対して高い親和性を有するポリクローナル抗体を含有する血清を次いで免疫された動物から単離して、精製することができる。

【0052】

代替的に、免疫された宿主からの抗体産生組織を収集することができ、臓器から調製した細胞ホモジネートを培養がん細胞と融合させることができる。マーカーに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を選択することができる。代替的に、本発明
の抗体は、化学合成又は組換え発現によって産生することができる。例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドを使用して抗体の産生のための発現ベクターを構築することができる。本発明の抗体はまた、当該技術分野において既知の様々なファージディスプレイ方法を用いて作製することもできる。

【0053】

本発明のマーカーに特異的に結合する抗体又はアプタマーは、例えば、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーによりコードされるタンパク質産物を検出する方法において使用することができる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドマーカー又はポリヌクレオチドマーカーに対する抗体又はアプタマーは、マーカーについて、組織サンプル（例えば、薄い大脳皮質スライス）をアッセイするのに使用することができる。抗体又はアプタマーは、存在する場合は、組織切片中に存在するマーカーに特異的に結合することができ、組織におけるマーカーの局在化を可能とする。同様に、放射性同位元素で標識された抗体又はアプタマーは、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング又は治療用途に使用することができる。

【0054】

本発明はまた、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーを検出する方法も提供する。本発明の実施には、特に断りのない限り、当該技術分野の技術範囲内である分析生化学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技法の従来の方法を用いる。かかる技法は文献に十分に説明されている（例えば、Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)を参照されたい）。

【0055】

本発明のマーカーは、限定されないが、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション及び酵素アッセイを含む、当業者に既知のいずれかの方法によって検出することができる。検出は定量的又は定性的とすることができる。質量分析、クロマトグラフィー分離、２Ｄゲル分離、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ）、競合阻害アッセイ等を含む多様な従来の技法が利用可能である。ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの存在／非存在、レベル又は活性を測定する当該技術分野におけるあらゆる有効な方法が本発明に含まれる。どの方法が特定のマーカーを測定するのに最も適切であるかを決定することは当業者の能力の範囲内である。したがって、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは病院における使用に最も適している可能性があり、一方、より複雑な計測手段を必要とする測定は臨床検査室における使用に最も適している可能性がある。選択される方法にかかわらず、測定は再現性のあるものであることが重要である。

【0056】

タンパク質マーカーのためには、定量は、同位体コード化アフィニティータグ（isotope coded affinity tags）（「ＩＣＡＴ」）と称される、同位体標識と組み合わせた誘導体化に基づくものとすることができる。この方法並びにその他の関連する方法において、２つのサンプルにおける特定のアミノ酸が示差的に及び同位体標識され、次いで、ペプチドバックグラウンドから固相捕獲、洗浄及び遊離により分離される。異なる同位体標識を有する２つの源からの分子の強度を次いで互いに関して正確に定量することができる。定量はまた、測定されるものに類似した同位体標識したペプチド又はタンパク質を添加すること（spiking in）による同位体希釈方法に基づくものとすることもできる。さらに、定量は類似のマトリックスにおいて標準の別の測定と比較して分析物の直接強度を用いて同位体標準を用いずに決定することもできる。

【0057】

さらに、一次元及び二次元ゲルが、銀染色、蛍光又は放射性標識によるタンパク質の分離及びゲルスポットの定量に使用されている。これらの異なるように染色されたスポットは質量分析を用いて検出されており、タンデム質量分析技法により同定されている。

【0058】

上記に論じた多数のアッセイは、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーに特異的に結合する試薬を用いる。本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーに特異的に結合することができるあらゆる分子が本発明の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態において、結合分子は抗体又は抗体断片である。他の実施形態において、結合分子は、アプタマー又はヌクレオチドプローブ等の非抗体種である。

【0059】

上記のように、結合分子は当該技術分野に受け入れられているいずれかの方法によって同定及び産生することができる。分析物に特異的な抗体及び抗体断片を同定及び産生する方法はよく知られている。

【0060】

本発明のマーカーはまた、当該技術分野において既知の多数の化学的誘導体化又は反応技法を用いて検出又は測定することもできる。或る特定のクラスの標的分子についてのかかる技法に使用する試薬は当該技術分野において既知であり、市販されている。

【0061】

本発明のＲＮＡ又はタンパク質マーカーの相対量の測定は当該技術分野において既知のいずれかの方法によって行うことができる（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and
Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;及びCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照されたい）。ＲＮＡ検出のための典型的な方法論には、細胞又は組織サンプルからのＲＮＡ抽出、次いで、標的ＲＮＡに特異的な標識化プローブ（例えば、相補的ポリヌクレオチド）と抽出したＲＮＡとのハイブリダイゼーション、及びプローブの検出（例えば、ノーザンブロッティング）が含まれる。タンパク質検出のための典型的な方法論には、細胞又は組織サンプルからのタンパク質抽出、次いで、標的タンパク質に特異的な標識化プローブ（例えば、抗体）とのタンパク質サンプルとのハイブリダイゼーション、及びプローブの検出が含まれる。標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子とすることができる。特異的タンパク質及びポリヌクレオチドの検出はまた、当業者によく知られている多くのその他の技法のなかでも、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、直接シークエンシング、又は定量的ＰＣＲ（ポリヌクレオチドの場合）によって評価することができる。

【0062】

本発明のマーカー遺伝子の全部又は一部の存在又はコピー数の検出は当該技術分野において既知のいずれかの方法を用いて行うことができる。典型的には、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの存在及び／又は量をサザン分析によって評価するのが便利であり、ここで、細胞又は組織サンプルからの全ＤＮＡを抽出し、標識化プローブ（例えば、相補的ＤＮＡ分子）とハイブリダイズさせ、プローブを検出する。標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子とすることができる。ＤＮＡ検出及び／又は定量のその他の有用な方法には、当業者に知られているように、直接シークエンシング、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、及び定量的ＰＣＲが含まれる。

【0063】

ポリヌクレオチド類似性は一本鎖核酸と相補的又は部分的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって評価することができる。かかる実験は当該技術分野においてよく知られている。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書において言及する場合、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするのに使用される核酸分子と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能とする条件（即ち、ヌクレオチドの約２０％以下のミスマッチを許容する条件）をいう。非
常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書において言及する場合、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするのに使用される核酸分子と少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能とする条件（即ち、ヌクレオチドの約１０％以下のミスマッチを許容する条件）をいう。当業者であればこれらの特定のレベルのヌクレオチドミスマッチを達成するのに適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を計算することができる。かかる条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが形成されるか又はＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成されるかに依存して変動するであろう。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについて計算された融解温度はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてよりも１０℃低い。特定の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）のイオン強度で約２０℃〜約３５℃（より低いストリンジェンシー）、より好ましくは約２８℃〜約４０℃（よりストリンジェント）、及び更により好ましくは約３５℃〜約４５℃（更によりストリンジェント）の温度でのハイブリダイゼーションと、適切な洗浄条件とを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）のイオン強度で約３０℃〜約４５℃、より好ましくは約３８℃〜約５０℃及び更により好ましくは約４５℃〜約５５℃の温度のハイブリダイゼーションと、同様にストリンジェントな洗浄条件とが含まれる。これらの値は約１００ヌクレオチドよりも大きい分子、０％ホルムアミド及び約４０％のＧ＋Ｃ含量についての融解温度の計算に基づく。代替的に、Ｔ_ｍは、Sambrook et al., 前掲、9.31〜9.62頁に示されるように経験的に計算することができる。一般に、洗浄条件はできる限りストリンジェントなものとすべきであり、選択したハイブリダイゼーション条件に適切なものとすべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、塩条件と特定のハイブリッドの計算Ｔ_ｍよりおよそ２０℃〜２５℃低い温度条件との組合せを含むことができ、洗浄条件は典型的には塩条件と特定のハイブリッドの計算Ｔ_ｍよりおよそ１２℃〜２０℃低い温度条件との組合せを含むことができる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドでの使用に好適なハイブリダイゼーション条件の一例としては、６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中、約４２℃で２時間〜２４時間のハイブリダイゼーション、次いで、室温で約２×ＳＳＣ中での１回又は複数回の洗浄、次いで、より高い温度及びより低いイオン強度での追加の洗浄を含む洗浄工程（例えば、約３７℃で約０．１×ＳＳＣ〜０．５×ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄、次いで約６８℃で約０．１×ＳＳＣ〜０．５×ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄）が挙げられる。その他のハイブリダイゼーション条件、及び、例えば、核酸アレイに最も有用なハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知であろう。

【0064】

本発明の方法を用いて、化学療法薬又は薬物の組合せの投与を、本発明のアッセイ結果を考慮して評価又は再評価することができる。例えば、チロシンキナーゼ阻害薬（複数の場合もあり）を、試験される対象による腫瘍サンプルにおける本発明のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーの存在に応じて、異なる対象集団に異なるようにして投与することができる。異なる薬物投与計画からの結果はまた、直接的に互いに比較することもできる。代替的に、アッセイ結果は、１つの薬物投与計画の別の薬物投与計画と比べての望ましさを示すことができるか、又は特定の薬物投与計画をがん患者に実施すべきか若しくは実施すべきでないかを示すことができる。１つの好ましい実施形態において、本発明のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーの存在を見出すことは、チロシンキナーゼ阻害剤を含む化学療法薬（「チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬」）による治療に対する応答についての良好な予後を示す。別の好ましい実施形態において、がん患者における本発明のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーの非存在はチロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬による治療に対する応答についての予後不良を示し、チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬薬物投与計画を実施しないことを更に推奨することができる。

【0065】

別の態様において、本発明は、本開示のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカー
の存在又は非存在に基づく、チロシンキナーゼ阻害薬に応答する、又はチロシンキナーゼ阻害薬に応答しないと予測されるがん患者を同定するキットを提供する。

【0066】

本発明のキットは以下の１又は複数を含むことができる：ポリペプチドマーカーに特異的に結合するものである抗体、抗体に対する標識化結合パートナー、抗体又はその結合パートナーが固定化された固相、ポリヌクレオチドマーカーにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブ、（例えば、ＰＣＲによって）適切な反応条件下で遺伝子融合体ポリヌクレオチドマーカーの少なくとも一部の増幅をプライムすることができるプライマー対、キットをどのようにして使用するかについての説明書、及び診断又は治療的使用についての規制当局の承認を示すラベル又は挿入物。

【0067】

本発明は更に、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体等の分子を含む、ポリヌクレオチドマイクロアレイ又はポリペプチドマイクロアレイを含む。本発明のこの態様において、マイクロアレイ技術の標準的技法が、ポリペプチドマーカーの発現の評価及び／又はかかるポリペプチドに結合する生物学的成分の同定に用いられる。タンパク質マイクロアレイ技術は当業者によく知られており、これらに限定されないが、固定基体上の同定されたペプチド又はタンパク質のアレイの取得、標的分子又は生物学的成分のペプチドへの結合、及びかかる結合の評価に基づく。ポリヌクレオチドアレイ、特に本発明のポリペプチドに結合するアレイはまた、ポリペプチドマーカーの発現を特徴とする状態、例えば、がんを有する対象を同定すること等といった診断用途にも使用することができる。

【0068】

本発明のアッセイシステムは、腫瘍細胞のサンプルにおいて、本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーの存在、及び／又は本発明のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーの発現のレベル、及び／又は本発明のＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体マーカーのタンパク質産物のレベルを検出する手段を含むことができる。

【0069】

アッセイシステムはまた、１又は複数の対照も含むのが好ましい。対照は、（ｉ）チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対する感受性を検出するための対照サンプル、（ｉｉ）チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対する耐性を検出するための対照サンプル、（ｉｉｉ）チロシンキナーゼ阻害剤感受性又は耐性に関して測定されるマーカーの予め決定された対照レベル（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対する感受性又はチロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対する耐性と関連付けられた本発明のＮＴＲＫ１遺伝子融合体のマーカーの予め決定された対照レベル）を含有する情報を含むことができる。

【0070】

別の実施形態において、本開示のＮＴＲＫ１遺伝子融合体マーカーを検出する手段は概して、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、抗体及びその抗原結合断片、ペプチド、結合パートナー、アプタマー、酵素、並びに小分子を含むことができるあらゆるタイプの試薬とすることができる。免疫組織化学、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）又は好ましい結合アッセイを実施するための試薬等のかかる検出手段を使用するアッセイの実施に有用な更なる試薬もまた含めることができる。

【0071】

本発明のアッセイシステムの検出する手段は検出可能なタグ又は検出可能な標識と接合させることができる。かかるタグは目的の遺伝子又はタンパク質を検出するために使用される試薬の検出を可能とするいずれかの好適なタグとすることができ、例えば、これらに限定されないが、分光学的、光化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能ないずれかの組成物又は標識が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識化ストレプトアビジン接合体による染色用のビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、又は³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているその他の酵素）、及びコロイド金又は色ガラス又はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ等の比色標識が挙げられる。

【0072】

さらに、本発明のアッセイシステムの検出する手段は基体上に固定化することができる。かかる基体は、以前に記載された検出の方法のいずれかにおいて使用されるであろうもの等の検出試薬の固定化に好適ないずれかの基体を含むことができる。簡単に言えば、検出する手段の固定化に好適な基体としては、所望の標的分子を検出する検出手段の活性及び／又は能力に著しく影響せずに、検出する手段と結合を形成することができるいずれかの固体有機支持体、生体高分子支持体又は無機支持体等のいずれかの固体支持体が挙げられる。例示的な有機固体支持体としては、ポリスチレン、ナイロン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、及びアクリル系共重合体（例えば、ポリアクリルアミド）等のポリマーが挙げられる。キットはまた、試薬の検出及び／又は陽性若しくは陰性対照の標識化に好適な試薬、洗浄溶液、希釈バッファー等を含むこともできる。アッセイシステムはまた、系を使用し、結果を解釈するための記載された説明書のセットも含むことができる。

【0073】

アッセイシステムはまた、サンプリングされる細胞型の特徴である対照マーカーを検出する手段を含むこともでき、概して本明細書において先に記載したマーカーの存在を検出する方法等によるサンプルにおける既知のマーカーの（核酸又はタンパク質レベルでの）存在を検出する方法において使用することができるいずれかのタイプの試薬とすることができる。具体的には、上記手段は、細胞型を陽性に同定する、分析される細胞型の特異的マーカーを同定することを特徴とする。例えば、肺腫瘍アッセイにおいては、マーカー発現及び／又は生物学的活性のレベルについて肺がん細胞をスクリーニングすることが望ましい。それゆえ、対照マーカーを検出する手段は、例えば、肺細胞の特徴であるマーカーを同定することにより、その細胞を結合組織又は炎症細胞等のその他の細胞型から区別する。かかる手段は本発明のアッセイの正確性及び特異性を上昇させる。かかる対照マーカーを検出する手段としては、これらに限定されないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でタンパク質マーカーをコードする核酸分子にハイブリダイズするプローブ、かかる核酸分子を増幅するＰＣＲプライマー、標的分子上の立体構造的に異なる部位に特異的に結合するアプタマー、及び／又はサンプルにおける対照マーカーに選択的に結合する抗体、その抗原結合断片、若しくは抗原結合ペプチドが挙げられる。多くの細胞マーカーについての核酸及びアミノ酸配列は当該技術分野において既知であり、検出のためのかかる試薬を産生するために使用することができる。

【0074】

本発明のアッセイシステム及び方法は、チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対して応答すると予測される患者を同定するのに使用することができるだけでなく、チロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬に対して耐性のがん細胞の応答性を向上させることができる治療を同定すること、及びがん患者のチロシンキナーゼ阻害剤化学療法薬（複数の場合もあり）に対する応答を強化するアジュバント治療を開発することにも使用することができる。
（訂正の理由１の説明に必要な資料 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５７４９５の明細書３５−３６頁の請求項１４−１８の写し）

【0075】

以下の実施例は本発明の特定の実施形態及びそれらの様々な使用を例示するものである。実施例は、説明の目的でのみ示されるものであり、本発明を限定するものとみなしてはならない。

【実施例】

【0076】

実施例１：
本実施例はＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合遺伝子の存在を検出するために行ったＲＴ−ＰＣＲアッセイを説明する。

【0077】

ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍切片サンプルのＲＮＡ抽出の後、遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合遺伝子を同定した。その結果、ＲＴ−ＰＣＲ反応はおよそ２８０ｂｐの断片（図３Ｂを参照されたい）を作製し、このシークエンシングにより、ＭＰＲＩＰのエクソン２１がＮＴＲＫ１のエクソン１４に融合した新規なインフレームのＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合遺伝子の存在が確認された。ＲＴ ＰＣＲ及びクローニングのプライマー配列は以下の通りであった：
プライマー名：プライマー配列（５’→３’）
ＭＰＲＩＰＳｔａｒｔ：ＡＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号２）
ＭＰＲＩＰ ＣＣ１Ｆ１：ＡＣＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣ（配列番号３）
ＭＰＲＩＰ ＣＣ２Ｆ１：ＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧ（配列番号４）
ＭＰＲＩＰ ＣＣ３Ｆ１：ＧＣＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号５）
ＭＰＲＩＰ ＸｈｏＲ１：ＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣ（配列番号６）
ＥｃｏＲＩ ＭＰＲＩＰ−Ｋｏｚａｋ ＡＴＧ：ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＴＣＧＧ（配列番号７）
ＮＴＲＫ１Ｙ４９０Ｒ１：ＣＧＧＣＧＣＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣ（配列番号８）
ＮＴＲＫｌｓｔｏｐＲ１：ＴＡＴＴＣＣＧＧＣＴＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧ（配列番号９）
ＮＴＲＫｌｓｔｏｐＲ２：ＣＣＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号１０）ＮＴＲＫ１ ＨＡｓｔｏｐ Ｎｏｔ１：
ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号１１）

【0078】

ＦＦＰＥ及び凍結組織からのＲＮＡ抽出：ＦＦＰＥからのＲＮＡを、ＲＥＣＯＶＥＲＡＬＬ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ［Ambion（テキサス州オースティン）］を用いて処理した。切片をはじめにキシレン中で脱パラフィンし、１００％エタノールで洗浄した後、プロテアーゼＫ消化に供した。プロテアーゼＫ消化の後、サンプルを製造業者の説明書に従ってＲＮＡ単離のために処理した。

【0079】

ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡサンプルからのＭＰＲＩＰとＮＴＲＫ１との融合体切断点を同定するために、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）をＮＴＲＫ１のエクソン１５に位置するＮＴＲＫ１プライマー（ＮＴＲＫ Ｙ４９０Ｒ１）とともに用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。第１鎖合成のために、ＲＮＡ、ｄＮＴＰ及びＮＴＲＫ１ Ｙ４９０Ｆ１プライマーをはじめに６５℃で５分間変性させ、次いで氷上に２分間置いた。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素、ＲＮａｓｉｎ、ＤＴＴ及び反応バッファーを次いで変性させたサンプルに添加し、第１鎖合成をＰＣＲ装置で以下の条件下で行った：５５℃、ｌ０分；５０℃、１２０分；７０℃、１５分；４℃、保持。第１鎖合成の後、二本鎖ＲＮＡを３７℃で２０分間のＲＮａｓｅＨ消化により除去した。ＲＴ−ＰＣＲを次いで同じＮＴＲＫ１リバースプライマーである、ＮＴＲＫ１ Ｙ４９０Ｒ１及びその第３コイルドコイルドメインに位置するＭＰＲＩＰに対するプライマー（ＭＰＲＩＰ ＣＣ３Ｆ１）を用いて行ってＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体を増幅した。ＮＴＲＫ１融合体を検出するためのＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃、５分の最初の変性；４０サイクルのＰＣＲ（９５℃、３０秒、５８℃、３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長）。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離し、断片をＥＸＯＳＡＰＩＴ（商標
）（Affymetrix）で処理して反応プライマー及び取り込まれていないｄＮＴＰを除いた。ＲＴ−ＰＣＲ産物をＲＴ−ＰＣＲ反応におけるものと同じフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてコロラド大学がんセンターＤＮＡシークエンシング及び分析コア（the University of Colorado Cancer Center DNA Sequencing and Analysis Core）によってシークエンシングした。エクソンアラインメントのために用いた参照配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２５２９．３（ＮＴＲＫ１）及びＮＭ＿０１５１３４．３（ＭＰＲＩＰ）である。

【0080】

実施例２：
本実施例は、ｔ（１；１７）（ｑ２３．１；ｐ１１．２）転座により作られたＮＴＲＫ１遺伝子及びＭＰＲＩＰ遺伝子が関与する染色体再編成を検出するためのＦＩＳＨ遺伝子融合体プローブセット並びに１ｑ２３．１にマッピングするＮＴＲＫ１遺伝子の５’末端及び３’末端が関与する染色体再編成を検出するためのブレイクアパートプローブセットの設計を説明する。ＦＩＳＨ ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体プローブ及びＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブセットを以下に記載するようにして開発し、確証した。

【0081】

【表1】

【0082】

プローブ開発：クローン選択、ＰＣＲ検証、ＤＮＡ抽出、増幅、及び標識化：ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体プローブセットについて、４つのＢＡＣクローンを選択した：２つのＢＡＣクローンは、ＮＴＲＫ１遺伝子のエクソン２０の配列とその下流（３’）の配列とを認識する３’ＮＴＲＫ１プローブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＳＲで標識）用であり（ＲＰ１１−１０３８Ｎ１３及びＲＰ１１−１０５９Ｃ２１）、２つのＢＡＣクローンは、ＭＰＲＩＰ遺伝子のエクソン２９の配列とその上流（５’）の配列とを認識する５’ＭＰＲＩＰプローブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳＧで標識）用であった（ＲＰ１１−７９６Ｊ１９、及びＲＰ１１−１２５Ｉ１６）。ブレイクアパートＮＴＲＫ１プローブセットについて、ＮＴＲＫ１切断点の５’末端とその下流とにマッピングされる２つの更なるＢＡＣ（ＲＰ１１−７１１Ｏ１８及びＲＰ１１−８９１Ｌ１８）を選択した。６つのすべてのクローンについての詳細な情報は表１に列挙し、融合体プローブセット及びブレイクアパートプローブセットの模式表示はそれぞれ図５及び図６に示す。

【0083】

すべてのＢＡＣクローンはＢＡＣＰＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（CHORI、カリフォルニア州オークランド）から購入した。ＢＡＣクローンが関心領域を包含することを検証するために、特異的なプライマーを設計し、Integrated DNA Technologiesにより合成させた。グリセロール穿刺を選択した抗生物質の入った寒天プレートに平板培養し、各ＢＡＣクローンから１０個の単一細胞コロニーをＰＣＲ検証のために選択した。１つのＢＡＣクローンあたり２つのＰＣＲにより確証されたシングルコロニーをグリセロールストック中でアリコートとして−８６℃で凍結した。

【0084】

各ＢＡＣクローンからの１又は２の確証した単一細胞コロニーの微小培養物（Mini-cultures）を抗生物質の入ったＬＢ培地中で培養し、ゲノムＤＮＡをQiagenからのＱＩＡＡＭＰ（商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて抽出し、精製した。各ＢＡＣクローンから精製したゲノムＤＮＡをQiagenからのＲＥＰＬＩ−ｇ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いる全ゲノム増幅に供した。

【0085】

各ＢＡＣクローンから増幅したヒトＤＮＡを、１μｇのアリコート中でＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄと接合したｄＵＴＰ（すべての３’ＮＴＲＫ１プローブクローン）、及びＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎと接合したｄＵＴＰ（すべての５’ＭＰＲＩＰプローブクローン及びすべての５’ＮＴＲＫ１プローブクローン）により、Ｖｙｓｉｓ Ｎｉｃｋ翻訳キット（カタログ番号３２−８０１３００）を用いて、製造業者の説明書に従って標識した。各反応液を次いで単一クローン又は組合せについての確証アッセイにおいて計画した使用に従って処理した。標識化ＤＮＡをキャリア（１：５０）としてのニシン精子ＤＮＡ及び反復配列をブロックするためのヒトＣｏｔ−１ ＤＮＡ（１：１０）と共沈させ、各ペレットをInsitus Biotechnologiesからの１０μｌのＴＤＥＮＨＹＢ（商標）−２ハイブリダイゼーションバッファー中に終濃度が１００ｎｇ／μｌとなるように希釈した。

【0086】

スコアリングシステムの定義：予想されるシグナルパターン：５’ＭＰＲＩＰ−３’ＮＴＲＫ１ ＦＩＳＨ融合体プローブにおいて、３’ＮＴＲＫ１プローブは染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１遺伝子の切断点から３’側のゲノム領域の３３１．８Ｋｂをカバーした。５’ＭＰＲＩＰプローブは染色体１７におけるＭＰＲＩＰ遺伝子の切断点から５’側のゲノム領域の３４１．４Ｋｂをカバーした。正常二倍体（２Ｎ）細胞は、単一の赤色（Ｒ）シグナルの２コピーと、単一の緑色（Ｇ）シグナルの２コピーとを有するはずである。転座ｔ（１；１７）（ｑ２３．１；ｐ１１．２）を担持する細胞において、（Ｇ）プローブによって認識される５’ＭＰＲＩＰ配列は、（Ｒ）プローブによって認識される３’ＮＴＲＫ１配列と分子的に融合し、融合したＲ／Ｇシグナルを生じるはずである。正常細胞において、最終的な物理的共局在により、１コピーのＲシグナルと１コピーのＧシグナルとが互いに隣接する可能性があり、それによりｔ（１；１７）についての陽性シグ
ナルを模倣する融合したＲ／Ｇシグナルが生じる。５’ＮＴＲＫ１−３’ＮＴＲＫ１ ＦＩＳＨブレイクアパートプローブにおいて、５’プローブは染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１の切断点の上流の３３９．４ｋｂをカバーし、３’ＮＴＲＫ１プローブは染色体１ｑ２３．１におけるＮＴＲＫ１の切断点の下流の３３１．８Ｋｂをカバーした。正常二倍体（２Ｎ）細胞は２コピーの融合したＲ／Ｇシグナルを有するはずであり、転座ｔ（１；１７）（ｑ２３．１；ｐ１１．２）を担持する細胞は単一のＧシグナルと単一のＲシグナルの少なくとも１つのコピーを示すはずである。

【0087】

正常検体上のシグナル配置の分析：典型的な蛍光シグナルは円形でコンパクトなスポットとして見られ、「ドット」と名付けた（図３０を参照されたい）。非典型的なシグナルパターンは、技術的変動、プローブの質及びクロマチン伸展により核においてみられる可能性がある。融合体５’ＭＰＲＩＰ−３’ＮＴＲＫ１プローブセットとブレイクアパート５’ＮＴＲＫ１−３’ＮＴＲＫ１プローブセットとは、腫瘍細胞において正常遺伝子と再編成された遺伝子との識別のために設計されているため、あらゆる非定型のシグナル配置又はセットにおける両プローブの間の関連性（シグナルパターン）を正常検体において詳細に評価すべきである。

【0088】

配置「ドット」は上記に記載のように典型的な円形でコンパクトなシグナルである（図３０も参照されたい）。開裂、パッチ状（patchy）、及び紐状（stringy）のその他の分類はコンパクトでないシグナルである：開裂は、通常２又は３の断片に分裂したシグナルであり、パッチ状は、不規則に表れる複数の小さいスポットを有する拡散したシグナルであり、紐状は、細長い線維状のシグナルである。これら４つのシグナル配置すべてが細胞懸濁液アッセイにおいて現れた。シグナルスコアリングのために、１つのドットを１シグナルとカウントし、開裂、パッチ状又は紐状配置を有する１つのシグナルもまた、たとえ２以上の小さなスポットからなる場合であっても、１シグナルとカウントした。

【0089】

実施例３：
本実施例は、ＭＰＲＩＰ／ＮＴＲＫ１遺伝子融合体の検出のためのＦＩＳＨ融合体プローブセットが細胞懸濁液とＦＦＰＥ検体との両方において効率的に働くことを説明する。

【0090】

単一ＢＡＣクローンからのＤＮＡ並びに５’ＭＰＲＩＰ、５’ＮＴＲＫ１及び３’ＮＴＲＫ１のセットのそれぞれについての確証：融合体プローブセットについての単一ＢＡＣクローンの確証のために、二色ＦＩＳＨアッセイを、１つの３’ＮＴＲＫ１プローブと１つの５’ＭＰＲＩＰプローブとの組合せ［クローン（ＲＰ１１−１０３８Ｎ１３＋ＲＰ１１−１２５Ｉ１６）及び（ＲＰ１１−１０５９Ｃ２１＋ＲＰ１１−７９６Ｊ１９）］を用いて細胞株ＧＭ０９９４８（正常核型４６、ＸＹ）において行った。すべてのプローブ混合物は１００ｎｇの関与する各クローンから構成され、全体積はＣＤＥＮＨＹＢ（商標）−２ハイブリダイゼーションバッファーを用いて１１３ｍｍ^２のハイブリダイゼーション面積について４．５μｌとした。

【0091】

ＦＩＳＨアッセイ：細胞懸濁液におけるすべてのＦＩＳＨアッセイは標準的プロトコルに従って行った。簡単に説明すると、スライドを７０％の酢酸溶液中で２０秒間〜３０秒間処理し、０．００８％ペプシン／０．０１Ｍ ＨＣＬ中にて３７℃で３分間〜５分間インキュベートし、１％のホルムアルデヒド溶液中で１０分間固定し、段階的エタノール系列中で脱水した。プローブ混合物を、選択した１２ｍｍ^２の径のハイブリダイゼーション面積に適用し、これにカバーガラスを被せ、ゴム接着剤で密封した。ＤＮＡ共変性（co-denaturation）を８５℃の乾燥機中で８分間行い、ハイブリダイゼーションを湿室中にて３７℃で４０時間起こさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄を、２×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０を用いて７２℃で２分間、２×ＳＳＣを用いて室温で２分間行い、段階的エタノール系列中で脱水した。クロマチンをＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎ
ｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ中０．３μｇ／ｍｌ、Vector Laboratories）で対比染色した。

【0092】

ＦＦＰＥ検体におけるＦＩＳＨアッセイもまた標準的研究室プロトコルに従って行った。検体を５６℃で４時間インキュベートし、ＣｉｔｒｉＳｏｌｖ中で脱脂し、脱水して風乾し、次いでスライドを２×ＳＳＣ中に７５℃で１３分間〜１４分間浸漬し、０．６ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで１４分間〜１６分間消化した。脱水の後、４．５μｌのハイブリダイゼーションバッファー中に４つのＢＡＣクローンのそれぞれを１００ｎｇ含有する融合体プローブセット５’ＭＰＲＩＰ−３’ＮＴＲＫ１を、選択した１１３ｍｍ^２のハイブリダイゼーション面積に適用し、ハイブリダイゼーションを加湿チャンバー中にて３７℃で約４０時間起こさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄を細胞株について上記のようにして行った。

【0093】

非再編成細胞株における単一ＢＡＣクローンプローブの評価
染色体マッピング：標品の質と蛍光シグナルの強度とはすべてのスライドにおいて優れていた。染色体マッピングを２５の核型が正常な中期スプレッドにおいて調査し、個々のＢＡＣクローンのすべてが正しくマッピングされた：３’ＮＴＲＫ１についてのＢＡＣクローンであるＲＰ１１−１０３８Ｎ１３及びＲＰ１１−１０５９Ｃ２１は１ｑ２３．１にマッピングされ、５’ＭＰＲＩＰについてのＢＡＣクローンであるＲＰ１１−７９６Ｊ１９、及びＲＰ１１−１２５Ｉ１６は１７ｐ１１．２にマッピングされ、５’ＮＴＲＫ１についてのＢＡＣクローンであるＲＰ１１−７１１Ｏ１８／ＲＰ１１−８９１Ｌ１８もまた１ｑ２３．１にマッピングされた。ＧＭ０９９４８細胞株は約９９％の二倍体（２Ｎ）染色体含量を有する細胞と１％の四倍体（４Ｎ）染色体含量を有する細胞とを有していた。これらの細胞はそれぞれ、試験したクローンのそれぞれの２コピー及び４コピーを有していた。図７及び図８を参照されたい。

【0094】

シグナル配置の分析：シグナルの質とパターン分類とを１００の二倍体間期核（２Ｎ）において調査し、結果を表２に要約する。

【0095】

【表2】

【0096】

３つの非小細胞肺がん検体をＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体プローブセットを用いて試験し、分析の結果を表３に示す。

【0097】

２つの検体は融合体の存在について陰性であり、それら細胞の８％及び９％が陽性についての典型的なパターンを示した。検体Ｓ−１２−０４７４８６（図８Ａ）は低コピー数の各ＤＮＡ標的を有しており、検体Ｓ−１２−０４７０９８（図８Ｂ）は、ＮＴＲＫ１に
ついての方がＭＰＲＩＰについてよりも多かったが、両方の試験した標的についてかなりより多いコピー数を有していた。逆に、第３の検体Ｓ−１２−６９８８Ｂ１では８８％の細胞がＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ遺伝子融合体についての典型的なパターンを有することを示し、陽性の結果を明確に支持している。興味深いことに、図１０に示されるように、この検体は不均一であり（heterogenous）、腫瘍の核のサイズが中程度から非常に大きい範囲に及び、それぞれ、１コピーのＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体を有する各ＤＮＡ標的の非常に少ないコピーを持つものから、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合体の遺伝子増幅を持つものまでに及んだ。これら２つの極端なパターンをそれぞれ、図９Ａ及び９Ｂに示す。

【0098】

実施例４：
本実施例は、５’ＮＴＲＫ１／３’ＮＴＲＫ１遺伝子再編成の検出のためのＦＩＳＨブレイクアパートプローブセットが細胞懸濁液とＦＦＰＥ検体との両方において効率的に働くことを説明する。

【0099】

各セットの１つのみのクローンを使用すると、開裂シグナルが生じるため、遺伝子融合体プローブについて上記のものと同じ方法論を用いて、５’ＮＴＲＫ１／３’ＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブセットを、２つの３’ＮＴＲＫ１プローブと２つの５’ＮＴＲＫ１プローブとを使用することにより（クローンＲＰ１１−１０３８Ｎ１３／ＲＰ１１−１０５９Ｃ２１＋ＲＰ１１−７１１Ｏ１８／ＲＰ１１−８９１Ｌ１８）、細胞株ＧＭ０９９４８（正常核型４６、ＸＹ）において確証した。図１０ａ〜図１０ｄに結果を示す。５’ＮＴＲＫ１（緑色シグナル）はセントロメアに対して遺伝子の近位端であり、３’ＮＴＲＫ１（赤色シグナル）はセントロメアに対して遺伝子の遠位端である。両方のプローブは１ｑ２３．１に正しくマッピングされた。

【0100】

５’ＮＴＲＫ１／３’ＮＴＲＫ１ブレイクアパートプローブセットをＧＭ０９９４８細胞株及び検体Ｓ１２−６９８８Ｂ１において実施例３に記載したようにして試験した。分析は緑色（ＦＩＴＣ）、赤色（テキサスレッド）及び青色（ＤＡＰＩ）について単色（single）干渉フィルターのセットを用いて落射蛍光顕微鏡にて行った。各干渉フィルターについて、単色光画像を獲得し、ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ（Leica Microsystems Inc）を用いて重ね合わせた。

【0101】

標品の質と蛍光シグナルの強度とはすべてのスライドにおいて適切であった。染色体マッピングを中期スプレッドにて調査し、個々のＢＡＣクローンは１ｑ２３．１に正しくマッピングされた（図１０ａ〜図１０ｄ）。ＦＦＰＥ肺がん切片における評価は検体Ｓ１２−６９８８Ｂ１（実施例３において５’ＭＰＲＩＰ−３’ＮＴＲＫ１再編成を有することが示された検体）を用いて行い、陽性パターンを観察した（図１１）。図１１に示すように、細胞は開裂の赤色及び緑色の「陽性」パターンと、融合した赤色及び緑色シグナルの「正常」パターンとの両方を示す。

【0102】

【表3】

【0103】

実施例５：
本実施例は、活性化ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１遺伝子のタンパク質産物）はいくつかの低分子チロシンキナーゼ阻害剤によって阻害することができることを実証する。

【0104】

遺伝子融合現象は、融合体における５’遺伝子のプロモーターを介する発現上昇を導くことにより、そしてしばしば５’遺伝子融合体パートナー内にコードされる（コイルドコイルドメイン等の）ドメインを介する二量体形成を誘導することによって、融合遺伝子の３’末端にコードされるキナーゼドメインの活性化を導く。この強化された二量体形成は、この場合はＴＲＫＡのキナーゼドメインである、キナーゼドメインの構成的活性化を導く。

【0105】

低分子チロシンキナーゼ阻害剤がＴＲＫＡを阻害するかどうかを決定するために、本発明者らは２９３Ｔ細胞において全長ＴＲＫＡを発現させた（図１２及び図１３）。ＮＴＲＫ１遺伝子をｐＣＤＨ−ＭＣＳ１−ＥＦ１−ｐｕｒｏにクローニングし、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを３’（Ｃ末端側）末端に付加した。このベクターを２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトし、イムノブロット分析においてＨＡ（Cell Signaling、Ｃ２９Ｆ４）とＴＲＫＡ（Santa Cruz、Ｃ−１１８）との両方に対する抗体を用いて、空ベクター対照と比較してのＴＲＫＡの発現を実証した（図１２Ａ）。図１２Ａは、ＨＡ特異的抗体（左側、Cell Signaling）及びＴＲＫＡ特異的抗体（右側、Santa Cruz、ＳＣ−１１８）により検出されるおよそ１１５ｋＤ〜１２０ｋＤのタンパク質の発現を示す。ＨＡ特異的抗体を用いるＴＲＫＡの免疫沈降、次いで抗ホスホチロシン抗体（Millipore、４Ｇ１０）によるイムノブロットは、ＤＭＳＯ処理（対照）サンプルにおけるＴＲＫＡの有意なリン酸化を実証した（図１２Ｂ）。ＴＲＫＡのリン酸化は１μＭのＫ２５２Ａ、クリゾチニブ、又はＣＥＰ−７０１（すべてSelleck Chemicalから購入）のいずれかによる５時間の細胞の処理の後に有意に低下し、ＴＲＫＡ活性の阻害を示した。図１２Ｂは、ＨＡ特異的抗体（Cell Signaling）を用いた免疫沈降、次いで１μＭの示された阻害剤又はＤＭＳＯ（対照）による５時間の処理後の同じ抗体（左側）又はホスホチロシン特異的抗体（右側）を用いるイムノブロットを示す。図１２ＣはＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰの発現により自己リン酸化されるキメラタンパク質が生じることを示す。ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ融合遺伝子を有する指標患者からの凍結胸水サンプルからの腫瘍細胞又は培養物（ＣＵＴＯ−３）中の初期継代細胞と比較しての、空ベクター（ＥＶ）、全長ＮＴＲＫ１ ｃＤＮＡ、ＮＴＲＫ１−ＭＰＲＩＰ ｃＤＮＡにより一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のイムノブロット分析。

【0106】

ＴＲＫＡの発現を細胞溶解液において検出し、このタンパク質は、ＴＲＫＡのアミノ酸位置４９０、６７４及び６７５におけるホスホチロシンに対する抗体（Cell Signaling）を用いたイムノブロット分析により検出したところ、そのリガンドである神経成長因子（ＮＧＦ）の非存在下又は存在下で活性化された（図１３Ａ）。ＴＲＫＡ活性の更なる証拠がＡＫＴ（Cell Signaling、Ｓ４７３）又はＥＲＫ（Cell Signaling）等の下流シグナル伝達経路のリン酸化の上昇によりみられた。細胞の１μＭのＫ２５２Ａ又はクリゾチニブによる処理により、ＴＲＫＡ及びＥＲＫのリン酸化の低下が導かれ、一方、ＣＥＰ−７０１はＴＲＫＡ及びＥＲＫに加えてＡＫＴのリン酸化も阻害した。図１３はＮＧＦの存在下又は非存在下（１０分間）及び１μΜの示されたチロシンキナーゼ阻害剤の５時間の存在下又は非存在下でのＴＲＫＡ−ＨＡ又は空ベクターを発現する２９３Ｔ細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。膜を、ＴＲＫＡホスホチロシン４９０、６７４、及び６７５に対する抗体（Cell Signaling）、全ＴＲＫＡに対する抗体（抗ＨＡ、Cell Signaling）、ＡＫＴホスホセリン４７３に対する抗体（Cell Signaling）、全ＡＫＴに対する抗体（Cell Signaling）、リン酸化ＥＲＫ ｐ４２／４４に対する抗体（Cell Signaling）、全ＥＲＫ
ｐ４２／４４に対する抗体（Cell Signaling）、並びにチューブリンに対する抗体（Sa
nta Cruz、ＳＣ−８０３５）でプローブした。

【0107】

当業者であれば、ルーチン的にすぎない実験を用いて上記の実施形態に基づく本発明の更なる特徴及び利点を理解するであろうし、又は確認することができるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に示されるもの以外には、具体的に示し、記載してきたものに限定されない。すべての刊行物及び引用文献は、引用することにより、それらの全体が明示的に本明細書の一部をなすものとする。

【0108】

1. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 2010;127:2893-917.
2. Wells SA, Jr., Gosnell JE, Gagel RF, et al. Vandetanib for the treatment of patients with locally advanced or metastatic hereditary medullary thyroid cancer. J Clin Oncol 2010;28:767-72.
3. Mok TS, Wu YL, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel
in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med 2009;361:947-57.
4. Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2010;363:1693-703.
5. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature 2007;448:561-6.
6. Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell 2007;131:1190-203.
7. Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res 2009;15:3143-9.
8. Birchmeier C, Sharma S, Wigler M. Expression and rearrangement of the ROS1 gene in human glioblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1987;84:9270-4.
9. Charest A, Lane K, McMahon K, et al. Fusion of FIG to the receptor tyrosine kinase ROS in a glioblastoma with an interstitial del(6)(q21q21). Genes Chromosomes Cancer 2003;37:58-71.
10. Bergethon K, Shaw AT, Ou SH, et al. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers. J Clin Oncol 2012;30:863-70.
11. Rimkunas VM, Crosby K, Kelly M, et al. Analysis of Receptor Tyrosine Kinase ROS1 Positive Tumors in Non-small Cell Lung Cancer: Identification of a FIG-ROS1 Fusion. Clin Cancer Res 2012.
12. Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med 2012;18:378-81.
13. Davies KD, Le AT, Theodoro MF, et al. Identifying and Targeting ROS1 Gene
Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Can Res;In press.
14. Nikiforov YE, Nikiforova MN. Molecular genetics and diagnosis of thyroid cancer. Nat Rev Endocrinol 2011;7:569-80.
15. Herbst RS, Heymach JV, O'Reilly MS, Onn A, Ryan AJ. Vandetanib (ZD6474): an orally available receptor tyrosine kinase inhibitor that selectively targets pathways critical for tumor growth and angiogenesis. Expert Opin Investig Drugs 2007;16:239-49.
16. Doebele RC, Pilling AB, Aisner DL, et al. Mechanisms of resistance to crizotinib in patients with ALK gene rearranged non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2012;18:1472-82.
17. Davies KD, Le AT, Theodoro MF, et al. Targeting ROS1 Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Can Res Submitted.
18. Camidge DR, Kono SA, Flacco A, et al. Optimizing the detection of lung cancer patients harboring anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements potentially suitable for ALK inhibitor treatment. Clin Cancer Res 2010;16:5581-90.
19. Camidge DR, Theodoro M, Maxson DA, et al. Correlations between the percentage of tumor cells showing an ALK (anaplastic lymphoma kinase) gene rearrangement, ALK signal copy number, and response to crizotinib therapy in ALK fluorescence in situ hybridization-positive nonsmall cell lung cancer. Cancer 2012.
20. Pierotti MA, Bongarzone I, Borello MG, Greco A, Pilotti S, Sozzi G. Cytogenetics and molecular genetics of carcinomas arising from thyroid epithelial follicular cells. Genes Chromosomes Cancer 1996;16:1-14.
21. Hondermarck H. Neurotrophins and their receptors in breast cancer. Cytokine Growth Factor Rev 2012.
22. Knezevich SR, McFadden DE, Tao W, Lim JF, Sorensen PH. A novel ETV6-NTRK3
gene fusion in congenital fibrosarcoma. Nat Genet 1998;18:184-7.
23. Tognon C, Knezevich SR, Huntsman D, et al. Expression of the ETV6-NTRK3 gene fusion as a primary event in human secretory breast carcinoma. Cancer Cell 2002;2:367-76.
24. Kralik JM, Kranewitter W, Boesmueller H, et al. Characterization of a newly identified ETV6-NTRK3 fusion transcript in acute myeloid leukemia. Diagn Pathol 2011;6:19.
25. Cui JJ, Tran-Dube M, Shen H, et al. Structure based drug design of crizotinib (PF-02341066), a potent and selective dual inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase and anaplastic lymphoma kinase (ALK). J Med
Chem 2011;54:6342-63.
26. O'Hare T, Shakespeare WC, Zhu X, et al. AP24534, a pan-BCR-ABL inhibitor for chronic myeloid leukemia, potently inhibits the T315I mutant and overcomes mutation-based resistance. Cancer Cell 2009;16:401-12.
27. Karaman MW, Herrgard S, Treiber DK, et al. A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol 2008;26:127-32.
28. George DJ, Dionne CA, Jani J, et al. Sustained in vivo regression of Dunning H rat prostate cancers treated with combinations of androgen ablation and Trk tyrosine kinase inhibitors, CEP-751 (KT-6587) or CEP-701 (KT-5555). Cancer Res
1999;59:2395-401.
29. Wang T, Yu D, Lamb ML. Trk kinase inhibitors as new treatments for cancer
and pain. Expert Opin Ther Pat 2009;19:305-19.

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]