特許 6226869 酵素法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6226869

(24)【登録日】2017年10月20日

(45)【発行日】2017年11月8日

(54)【発明の名称】酵素法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20171030BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20171030BHJP

   G01N 27/02 20060101ALI20171030BHJP

   G01N 27/00 20060101ALI20171030BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20171030BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALN20171030BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20171030BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 ZZNA

   G01N33/50 P

   G01N27/02 D

   G01N27/00 J

   G01N27/00 Z

   C12M1/00 A

   !C12Q1/34

   !C12N15/00 A

【請求項の数】19

【全頁数】81

(21)【出願番号】特願2014-536328(P2014-536328)

(86)(22)【出願日】2012年10月18日

(65)【公表番号】特表2014-534812(P2014-534812A)

(43)【公表日】2014年12月25日

(86)【国際出願番号】GB2012052579

(87)【国際公開番号】WO2013057495

(87)【国際公開日】20130425

【審査請求日】2015年10月19日

(31)【優先権主張番号】61/549,998

(32)【優先日】2011年10月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/599,244

(32)【優先日】2012年2月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511252899

【氏名又は名称】オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】モイズィー，ラス

(72)【発明者】

【氏名】ヘロン，アンドリュー ジョン

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０２１２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０６７５５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／００４２６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Biochem. Soc. Trans., 2011 Jan., vol.39, p.140-144

【文献】 Biochem. Soc. Trans., 2009, vol.37, p.74-78

【文献】 Nat. Struct. Mol. Biol., 2007, vol.14, p.647-652

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

１つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質で、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否か、から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定され、電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間にポアを通過する電流を測定して、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ポアに電圧を印加して、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含み、前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであり、膜貫通タンパク質ポアが、α−ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）７個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ポアを形成する能力を保持しているその変種である、または（ｃ）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または（ｄ）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ポアを形成する能力を保持しているその変種である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（配列番号８）を含み、Ｘ１はＣ、ＭまたはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

Ｘ２が、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、表４もしくは５に示すヘリカーゼの内の１つもしくはその変種である、またはＨｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ａ）配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列、もしくは（ｂ）配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種、もしくは（ｃ）アミノ酸同一性に基づいて配列番号１０の残基２０から２１１もしくは２０から７２７に対して少なくとも９０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持している配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

少なくとも０．３Ｍまたは少なくとも１．０Ｍの塩濃度を用いて実行される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

塩がＫＣｌである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法であって、
ここで、センサーは、膜貫通ポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体であり、前記方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼとを接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップまたは（ｂ）ポアをヘリカーゼに共有結合的に付着するステップによって、膜貫通ポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、方法。

【請求項15】

複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼとを接触させるステップおよび（ｂ）ポアに電位を印加するステップによって形成され、前記電位が、電圧電位または化学電位である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

複合体が、ポアをヘリカーゼに共有結合的に付着するステップによって形成される、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

膜貫通ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＨｅｌ３０８ヘリカーゼの使用。

【請求項18】

（ａ）膜貫通ポアおよび（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。

【請求項19】

試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置であって、
複数の膜貫通ポア；
複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ；
複数のポアを支持でき、前記ポアおよびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；ならびに
各試料を受けるための複数の容器
を含み、前記流体系が前記容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定する新規方法に関する。方法は、ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼまたは標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターを用いる。ヘリカーゼまたは分子モーターは、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。

【背景技術】

【0002】

迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。

【0003】

膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。

【0004】

電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らはＨｅｌ３０８ヘリカーゼが、特に電圧などの電位が印加されている場合に、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御できることを実証した。ヘリカーゼは、印加された電圧から生じる場と反対にまたはそれに沿って制御された段階的な様式で標的ポリヌクレオチドを移動させることができる。驚くべきことに、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドを特性決定するために、特に、鎖配列決定を用いてその配列を決定するために有利である高塩濃度で機能できる。これは、下により詳細に考察される。

【0006】

したがって、本発明は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法を提供する。

【0007】

本発明は、
− ポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法、
− ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＨｅｌ３０８ヘリカーゼの使用、
− （ａ）ポアおよび（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット、ならびに
− 複数のポアおよび複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置も提供する。

【0008】

本発明者らは、特に電圧などの電位が印加されている場合にも、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターがポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御できることを実証した。モーターは、印加された電圧から生じる場と反対にまたはそれ沿って制御された段階的な様式で標的ポリヌクレオチドを移動させることができる。驚くべきことに、モーターが本発明の方法において用いられる場合に、モーターはナノポアを通る標的ポリヌクレオチドの鎖全体の移動を制御できる。これはポリヌクレオチドを特性決定するために、特に、鎖配列決定を用いてその配列を決定するために有利である。

【0009】

このように本発明は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび分子モーターに接触させて、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合きる分子モーターがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ、および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ａ）ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御するためのヘリカーゼの使用の模式的例を示す図である。１）コレステロール（cholesterol）タグ（ｃ）を含有するアニールされたプライマー（ｂ）を有するｓｓＤＮＡ基質（ａ）が二重層（ｄ）のｃｉｓ側に添加される。コレステロールタグが二重層に結合し、二重層表面に基質を濃縮する。２）ｃｉｓコンパートメントに添加されたヘリカーゼ（ｅ）はＤＮＡに結合する。二価金属イオンおよびＮＴＰ基質の存在下でヘリカーゼは、ＤＮＡに沿って移動する。３）印加された電圧下でＤＮＡ基質は、ＤＮＡ上のリーダーセクションを介してナノポア（ｆ）によって捕捉される。ＤＮＡは、ＤＮＡに結合したヘリカーゼがポアの先端に接触し、さらなる未制御なＤＮＡ移行を防ぐまで印加された電位の力の下でポアを通じて引かれる。このプロセスの際にｄｓＤＮＡセクション（プライマーなど）は除去される。ＤＮＡに沿った３’から５’方向へのヘリカーゼの移動は、挿入されたＤＮＡを印加される場と反対にポアの外側に引く。４）ヘリカーゼは、ＤＮＡをナノポアの外側に引き、ｃｉｓコンパートメントへ戻す。ナノポアを通るＤＮＡの最後のセクションは５’−リーダーである。５）ヘリカーゼがＤＮＡをナノポアの外側へ移動させると、それはｃｉｓコンパートメントに戻って外れる。ｂ）実施例において用いられるＤＮＡ基質設計を示す図である（ａ＝５０Ｔリーダー（ｂ）を有するＤＮＡの４００塩基長鎖、ｃ＝プライマー、ｄ＝コレステロールタグ）。

【図2】ヘリカーゼはＤＮＡを制御された様式でナノポアを通して移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。例示的ヘリカーゼ−ＤＮＡ事象（上セクションに小矢印で示す）（１８０ｍＶ、４００ｍＭ ＫＣｌ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。上）Ｈｅｌ３０８ ４００塩基長ＤＮＡ事象の電流（ｙ軸、ｐＡ）対捕捉時間（ｘ軸、秒）のセクション。オープンポア電流は約１８０ｐＡ（Ａと標識される）である。ＤＮＡは印加された電位の力（＋１８０ｍＶ）の下でナノポアによって捕捉される。付着している酵素を有するＤＮＡは長期遮断（この条件では約６０ｐＡ）を生じ、酵素がポアを通してＤＮＡを移動させるときの電流における段階的変化を示す。中央）中央のセクションは、ＤＮＡ事象（１）の１つの拡大図であり、ＤＮＡ−酵素捕捉、ＤＮＡがポアを通って引かれるときの段階的電流変化、およびナノポアを抜ける前の特徴的な長いポリＴレベルでの終了を示す。下）ＤＮＡがナノポアを通って移動するときの電流における段階的変化の拡大図。

【図3】ヘリカーゼは、ＤＮＡ移動を制御し、ＤＮＡがナノポアを通るときに電流遷移の一貫したパターンを生じる（図３ａおよび３ｂについて、ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））。ポリＴレベルで終了する４つの典型的ＤＮＡ事象由来の最後の約８０電流遷移の例。４つの例（３ａに２つ、３ｂに２つ）は、電流遷移の一貫したパターンが観察されたことを例示する。

【図4】塩濃度の増加は、ポア電流を増加させ、より広いＤＮＡ識別範囲（範囲＝ＤＮＡ電流遷移での最小電流から最大電流）をもたらすことを示す図である。例示的ヘリカーゼ−ＤＮＡ事象（図４ａ〜ｃについて、ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒）、１８０ｍＶ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ配列番号５９および６０、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、４００ｍＭ、１Ｍおよび２Ｍ ＫＣｌにおいて、図４および４ｃに示されている。上トレースは、ポリＴレベルで終了する完全事象を（Ａによって示されるＩ−オープンと共に）示し、下トレースは、１５０ｐＡの一定ｙ軸電流スケールでの各事象の最後の１０秒間の拡大セクションを示す。４００ｍＭ ＫＣｌから２Ｍ ＫＣｌへの塩濃度の増加は、オープンポア電流における約３５０％の増加（Ｉ−オープン、約１８０ｐＡから約８５０ｐＡ）および識別範囲における約２００％の増加（約２５ｐＡから約７５ｐＡ）をもたらす。図４ｄは、塩濃度の関数としてのＤＮＡ識別範囲のプロットである（ｙ軸＝範囲（ｐＡ）、ｘ軸＝塩（ｍＭ））。

【図5】ヘリカーゼ（ａ）は、ＤＮＡ（ｂ）の移動を少なくとも２種のモードの操作で制御できることを示す図である。ヘリカーゼは、ＤＮＡに沿って３’−５’方向に移動するが、ナノポア（ｃ）中でのＤＮＡの方向（ＤＮＡのどちらの端が捕捉されているかに依存する）は、酵素が印加された場と反対にナノポアの外側へＤＮＡを移動させるため（図５ｂ）、または印加された場に沿ってナノポア内へＤＮＡを移動させるためのいずれでも用いられ得ることを意味する（図５ａ）。図５ｂ）ＤＮＡの５’末端が捕捉されている場合、ヘリカーゼは電圧によって印加された場の方向とは反対に作動し、挿入されたＤＮＡをナノポアの外側にＤＮＡがｃｉｓチャンバーに戻って放されるまで引く。右は、印加された場と反対に５’に下がるＨｅｌ３０８からの例示的ＤＮＡ−ヘリカーゼ事象である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））。図５ａ）ＤＮＡが３’を下にナノポアに捕捉される場合、酵素はＤＮＡを場の方向にナノポア中へ、ポアを通って完全に移行され、二重層のｔｒａｎｓ側へ放すまで移動させる。右は、印加された場で３’に下がるＨｅｌ３０８からの例示的ＤＮＡ−ヘリカーゼ事象である（ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（秒））。電流トレースは、ＤＮＡの５’下方向と３’下方向との間で変化する。

【図6】酵素活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。ａ）通例の蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼ（ａ）の能力をアッセイするために用いられた。１）蛍光基質鎖（最終１００ｎＭ）は３’ｓｓＤＮＡオーバーハング、およびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。主要な上部鎖（ｂ）は、カルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端に有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質（ｄ）の短い鎖に相補的である捕捉鎖（ｆ）１μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（５ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’テールに結合し、主要な鎖に沿って移動し、示すとおり相補鎖を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると、主要な鎖上のフルオレセインが蛍光を発する。４）過剰量の捕捉鎖が相補的ＤＮＡに優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。ｂ）４００ｍＭから２Ｍのさまざまな濃度のＫＣｌ（ｘ軸、ｍＭ）を含有する緩衝溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、１μＭ捕捉ＤＮＡ）における活性の初期速度のグラフ（ｙ軸、相対活性）。

【図7】さまざまなＨｅｌ３０８ヘリカーゼを用いるヘリカーゼ制御ＤＮＡ事象の例を示す図である（図７ａ〜ｃについて、ｙ軸＝電流（ｐＡ）、ｘ軸＝時間（分）、１８０ｍＶ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ配列番号５９および６０、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）：Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（ａ）、Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ（ｂ）およびＨｅｌ３０８Ｍｍａ（ｃ）。これらは、ポリＴレベルで終了するＭｓｐＡナノポアを通る制御されたＤＮＡ移動の典型例を表す。

【図8】ヘリカーゼ内部結合活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。Ａ）天然３’末端を欠失しているＤＮＡに結合し、次いでハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために通例の蛍光基質を用いた。蛍光基質鎖（最終５０ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハングおよびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。主要な上部鎖（ａ）は、４個の連続した非ＤＮＡ由来トリエチレングリコールスペーサー（「スペーサー９」基と称される、ｂと標識される）で３’末端または内部、オーバーハングとｄｓＤＮＡとの間の接合部（陰性対照として）のいずれかで修飾される。さらに主要な上部鎖は、カルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端に有する。ハイブリダイズされると、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の短い鎖（ｄ）に相補的である捕捉鎖（１μＭ、ｆ）がアッセイに含まれる。Ｂ）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）の存在下で、３’−末端「スペーサー９」基を含有する基質に添加されたＨｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体（２０ｎＭ、ｇ）は、蛍光基質のｓｓＤＮＡオーバーハングに結合でき、主要な鎖に沿って移動し、相補鎖を置換する。Ｃ）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインが蛍光を発する。Ｄ）過剰量の捕捉鎖が相補的ＤＮＡに優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。

【図9】Ｈｅｌ３０８−調節ｄｓＤＮＡ代謝回転の相対速度を、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、１μＭ捕捉ＤＮＡ中で、３’−非修飾ＤＮＡおよび３’−「スペーサー９」ＤＮＡと比較して示すグラフである（ｙ軸＝相対「３’−Ｓｐ９」活性（％ｗｒｔ天然３’）、ｘ軸＝ａ（Ｍｂｕ）、ｂ（Ｃｓｙ）、ｃ（Ｔｇａ）、ｄ（Ｍｍａ）、ｅ（Ｍｈｕ）、ｆ（Ｍｉｎ）、ｇ（Ｍｉｇ）、ｈ（Ｍｍａｚ）、ｉ（Ｍａｃ）、ｊ（Ｍｏｋ）、ｋ（Ｍｔｈ）、ｌ（Ｍｂａ）、ｍ（Ｍｚｈ））。

【図10】実施例５において使用されるナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのヘリカーゼの使用の模式図である。Ａ）付着しているコレステロール（cholesterol）タグを有するアニールされたプライマー（配列番号６９（ｙと標識される））を有するＤＮＡ基質（配列番号６７（ｗと標識される）および６８（ｘと標識される））は二重層のｃｉｓ側に添加される。コレステロールタグ（ｚと標識される）が二重層に結合し、二重層表面に基質を濃縮する。ｃｉｓコンパートメントに添加されたヘリカーゼ（１と標識される）は配列番号６７の４ｂｐリーダーに結合する。Ｂ）印加された電圧下でＤＮＡ基質は、ＤＮＡ上の５’リーダーセクションを介してナノポアによって捕捉され、配列番号６９が外れる。Ｃ）印加された場の力の下でＤＮＡは、結合したヘリカーゼ（１）がポアの先端に接触し、さらなる未制御な移行を防ぐまでポア内に引かれる。このプロセスではアンチセンス鎖配列番号６８はＤＮＡ鎖から外れる。Ｄ）二価金属イオンおよびＮＴＰ基質の存在下でポアの先端のヘリカーゼ（１）は、ＤＮＡに沿って移動し、ポアを通るＤＮＡの移行を制御する。ＤＮＡに沿った３’から５’方向へのヘリカーゼの移動は、挿入されたＤＮＡを印加される場と反対にポアの外側に引く。ｃｉｓ側（この場合には３’）に曝された１本鎖ＤＮＡは、末端ヌクレオチドまたは内部ヌクレオチドのいずれかに結合するさらなるヘリカーゼ（２〜４）に利用可能である。Ｅ）ポアのヘリカーゼ（１）がＤＮＡから離れる場合、ＤＮＡ上の次のヘリカーゼ（２）がポアに達するまでＤＮＡは場によってポアの中に引かれる。ポアのヘリカーゼは、ＤＮＡをナノポアの外側へ引き、ｃｉｓコンパートメントへ戻す。ナノポアを通るＤＮＡの最後のセクションは５’−リーダーである。Ｆ）ヘリカーゼはＤＮＡをナノポアの外側へ移動させると、ｃｉｓコンパートメントに戻って外れる。矢印はＤＮＡの移動方向を示す。

【図11】９００塩基長のナノポアにおけるＤＮＡの領域の位置（ｙ軸）が、各ヘリカーゼ事象の際に、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体ＭｂｕがＭｓｐＡポア（ｘ軸）を通るＤＮＡ鎖の移行を制御する場合にどのように変化したかを示すデータプロットである（ｙ軸＝９００塩基長における位置、ｘ軸＝インデックス）。Ａ〜Ｃは、鎖のほぼ最初から鎖の最後までの（ポリＴリーダーを介して抜ける）ＤＮＡ鎖全体の典型的移行事象の例を示し、事象Ｄは不完全ＤＮＡ移行（酵素脱離は、ＤＮＡが鎖の末端まで作られなかったことを意味する）の例を示す。ずれ（例えば、点線円によって強調される大きなずれなど）は、配列が鎖中の以前のポイントに戻っていることを示し、酵素脱離の結果である。酵素が脱離すると、ＤＮＡは、鎖沿いのさらなる別の酵素がポアに接触するまで場の力の下でナノポア内へ引き戻され、次いでヘリカーゼ移動が継続する。

【図12】９００塩基長の位置が、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体ＴｇａがＭｓｐＡポアを通るＤＮＡ鎖の移行を制御する場合にどのように変化したかを示すデータプロットである（ｙ軸＝９００塩基長における位置、ｘ軸＝インデックス）。事象Ａ〜Ｄは、ＤＮＡ鎖全体の移行を示す。

【図13】Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（配列番号１０）の酵素前進性をＨｅｌ３０８Ｍｏｋヘリカーゼ（配列番号２９）のそれと比較するために用いた蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質がハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いられた。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は３’ｓｓＤＮＡオーバーハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡ（セクションＡ、配列番号７０）の８０（ａ１）および３３塩基対セクション（ａ２）を有する。主要な下部「テンプレート」鎖（１）は、５’および３’末端でそれぞれカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（４）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）（５）塩基で標識されている３’オーバーハングおよび３３ｎｔ蛍光プローブ（３、配列番号７２）に隣接して、８０ｎｔ「ブロッカー」鎖（２、配列番号７１）にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質は基本的に蛍光を発する。セクションＢに示すとおり、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）の存在下（ＡＴＰおよびＭｇＣｌ２の添加は７および８でそれぞれ示される）でヘリカーゼ（６、２０ｎＭ）は、基質の３’オーバーハング（配列番号７０）に結合し、下鎖に沿って移動し８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号７１）を置換し始める。前進性の場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブも置換する（セクションＣ、配列番号７２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で３’末端で標識されている）。蛍光プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると動力学的に安定なヘアピンを形成しプローブのテンプレート鎖（セクションＤ）への再アニールを防ぐように設計される。ヘアピン産物の形成により、ＦＡＭはＢＨＱ−１の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号７１）および蛍光（配列番号７２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）鎖を置換できる前進性酵素は、したがって、蛍光の経時的な減少をもたらす。しかし酵素が８０ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（配列番号７２、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）を置換することができず、したがって「ブロッカー」鎖（配列番号７１）は主要な下部鎖に再アニールする（セクションＥ）。

【図14】制御目的にも用いられた追加的な通例の蛍光基質を示す図である。陰性対照として用いられる基質は、図３に記載のものと同一であったが、３’オーバーハング（セクションＡ、（配列番号７１（１と標識される）、７２（２と標識される）（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（３）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）（４）でその３’末端で標識されている）および７３（５と標識される、８０ｂｐセクション（ａ１）および３３ｂｐセクション（ａ２）からなる））を欠失していた。図３に記載のものに類似しているが８０塩基対セクション（配列番号７２（２と標識される）（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）（３）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）（４）でその３’末端で標識されている）および７４（６と標識される、２８ｂｐセクション（ａ３）からなる））を欠失している基質が活性だが前進性である必要はないヘリカーゼの陽性対照として用いられた（セクションＢ）。

【図15】緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ 蛍光基質ＤＮＡ（配列番号７０、７１および７２（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）中での図１３に示す前進性基質に対してＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（配列番号１０、白丸）およびＨｅｌ３０８Ｍｏｋヘリカーゼ（配列番号２９、黒三角）を検査した場合の時間依存性蛍光変化のグラフである（ｙ軸＝蛍光（任意単位）、ｘ軸＝時間（分））。Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋによって提示された蛍光の減少は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較してこれらの複合体の前進性の増大を示す。

【図16】緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号７２（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）および７４）中で陽性対照前進性基質（図１４、セクションＢに示すとおり、配列番号７２（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でその５’末端で、ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）でその３’末端で標識されている）および７４）に対して、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（配列番号１０、白丸）およびＨｅｌ３０８Ｍｏｋヘリカーゼ（配列番号２９、黒三角）を検査した場合の時間依存性蛍光変化のグラフである（ｙ軸＝蛍光（任意単位）、ｘ軸＝時間（分））。この陽性対照は、両試料に対する蛍光減少によって示されたとおり、両方のヘリカーゼが実際に活性であることを実証した。

【発明を実施するための形態】

【0011】

配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

【0012】

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

【0013】

配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つのサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を示す。

【0014】

配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つのサブユニットのアミノ酸配列を示す。

【0015】

配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。

【0016】

配列番号８は、Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

【0017】

配列番号９は、拡張Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

【0018】

配列番号１０から５８は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼおよび表５におけるモチーフのアミノ酸配列を示す。

【0019】

配列番号５９から７４は、実施例で用いられた配列を示す。

【0020】

配列番号７５は、５７ページ以降の配列比較でのＨｅｌ３０８Ｄｔｈの配列を示す。

【0021】

配列番号７６は、５７ページ以降の配列比較でのＨｅｌ３０８Ｍｍａｒの配列を示す。

【0022】

配列番号７７は、５７ページ以降の配列比較でのＨｅｌ３０８Ｎｔｈの配列を示す。

【0023】

配列番号７８は、５７ページ以降の配列比較での共通配列を示す。

【0024】

発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。

【0025】

付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば「１つのポア（ａ ｐｏｒｅ）」を参照することは２つ以上のそのようなポアを含み、「１つのヘリカーゼ（ａ ｈｅｌｉｃａｓｅ）」を参照することは２つ以上そのようなヘリカーゼを含み、「１つのポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を参照することは２つ以上のそのようなポリヌクレオチドを含むなど。

【0026】

本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0027】

本発明のＨｅｌ３０８法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼと接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップを含む。次いで、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を、当技術分野において公知の標準的方法を用いて測定する。ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとヘリカーゼとの複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、脂質膜全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。

【0028】

いくつかの場合では、１つまたは複数の相互作用の間にポアを通過する電流が、標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために用いられる。これは鎖配列決定である。

【0029】

本方法は、いくつかの利点を有する。第一に、本発明者らは驚くべきことに、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが驚くべき高い耐塩性を有し、それにより本発明の方法が高塩濃度で実行され得ることを示した。鎖配列決定の内容では、標的ポリヌクレオチドを捕捉および移行するためならびにポリヌクレオチドがポアを通るときに生じる配列依存性電流変化を測定するために電圧オフセットを印加するための導電性溶液を作製するために、塩などの電荷担体が必要である。測定シグナルが塩の濃度に依存することから、得られるシグナルの振幅を増大させるために高塩濃度を用いることは有利である。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されるようにする。鎖配列決定のために、１００ｍＭを超える塩濃度は理想的であり、１Ｍ以上の塩濃度は好ましい。本発明者らは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが例えば２Ｍの高い塩濃度で有効に機能することを驚くべきことに示した。

【0030】

第二に、電圧が印加されるとＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチドを２方向に（すなわち印加された電圧から生じる場に沿ってまたは反対に）驚くべきことに移動させ得る。したがって、本発明の方法は、２つの好ましいモードの内の１つで実行し得る。標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動する方向（すなわち場の方向または反対）に依存して異なるシグナルが得られる。これは下でより詳細に考察される。

【0031】

第三に、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、ポアを通る標的ポリヌクレオチドを典型的には一度に１ヌクレオチドを移動させる。したがって、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは単一塩基ラチェットのように機能できる。標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの全てではないが、実質的に全てがポアを用いて同定され得ることから、当然ながらこれは標的ポリヌクレオチドを配列決定する場合に有利である。

【0032】

第四に、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、１本鎖ポリヌクレオチドおよび２本鎖ポリヌクレオチドの移動を制御できる。これは、種々の異なる標的ポリヌクレオチドが本発明により特性付けられ得ることを意味する。

【0033】

第五に、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、印加された電圧から生じる場に非常に耐性があると考えられる。本発明者らは、「アンジッピング」条件下のポリヌクレオチドの非常に小さな移動を観察している。これは、印加された電圧から生じる場と反対にポリヌクレオチドが移動する場合に望まれない「逆」移動由来の複雑化要因がないことを意味することから重要である。

【0034】

第六に、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、生成が容易で、扱いが容易である。したがってそれらの使用は、配列決定の簡単でより費用のかからない方法に寄与する。

【0035】

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのものである。核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化し得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで修飾し得る。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。

【0036】

ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。

【0037】

ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。

【0038】

ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。

【0039】

ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。

【0040】

ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。

【0041】

標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。

【0042】

標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行し得る。

【0043】

試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には始生代のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界に属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。

【0044】

試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。

【0045】

試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。

【0046】

膜貫通ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるように駆動されるようにする構造である。

【0047】

任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性および親油性特性の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性層は、単層または二重層であってよい。

【0048】

膜は、好ましくは脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。

【0049】

脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。

【0050】

モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。

【0051】

好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。

【0052】

別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ_３Ｎ_４、Ａ１_２０_３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。

【0053】

方法は、（ｉ）ポアを含む人工二重層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層を用いて好ましくは実行される。二重層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。

【0054】

ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。

【0055】

ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに好ましくは付着される。

【0056】

カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とヘリカーゼ活性部位との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて両親媒性層または脂質二重層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。

【0057】

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質二重層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表１に要約する。

【0058】

【表1】

【0059】

ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。

【0060】

ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加し得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。

【0061】

代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成し得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。例えばポリヌクレオチドは、反応基が付着されたプライマーを用いて合成され得る。

【0062】

ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール、チオール、ビオチンまたは脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。

【0063】

膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。

【0064】

膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの反復サブユニット（６、７または８サブユニット）から好ましくは作られる。ポアはより好ましくは七量体または八量体ポアである。

【0065】

膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。

【0066】

膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。

【0067】

本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。

【0068】

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。

【0069】

Ｍｓｐ由来の単量体は、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイし得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力を測定し得る。サブユニットを脂質二重層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁し得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入し得る。

【0070】

配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。

【0071】

相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。

【0072】

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−Ｂ１の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−Ｂ２と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。

【0073】

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出し得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表２に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択し得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表３におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定し得る。

【0074】

【表2】

【0075】

【表3】

【0076】

配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失し得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上を欠失し得る。

【0077】

変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。

【0078】

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加し得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合し得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。

【0079】

上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。

【0080】

Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾し得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。

【0081】

Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識し得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば^１２５Ｉ、^３５Ｓ）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。

【0082】

Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

【0083】

Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出し得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。

【0084】

Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成し得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出し得る。例えばポアはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成し得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。

【0085】

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。

【0086】

そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。

【0087】

配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイし得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力を決定し得る。サブユニットを脂質二重層などの膜に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。

【0088】

変種は、ヘリカーゼへの共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、ヘリカーゼへの付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。

【0089】

変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。

【0090】

変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定し得る。

【0091】

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出し得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出し得る。

【0092】

配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上を欠失し得る。

【0093】

変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。

【0094】

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加し得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。

【0095】

上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾は、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出し得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。

【0096】

配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。

【0097】

変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾し得る。

【0098】

α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出し得る。

【0099】

いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾し得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾し得る。

【0100】

ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾し得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。

【0101】

システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強し得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ⁻基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護し得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。

【0102】

（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着し得るか、またはリンカーを介して付着し得る。

【0103】

本発明に従って、任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを使用し得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはｓｋｉ２様ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に用いられ得る。

【0104】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（本明細書以下でＨｅｌ３０８モチーフと称する；配列番号８）を典型的には含む。Ｈｅｌ３０８モチーフは、典型的にはヘリカーゼモチーフＶＩの部分である（Tuteja and Tuteja、Eur.J.Biochem.271 1849-1863(2004)）。Ｘ１は、Ｃ、ＭまたはＬであってよい。Ｘ１は、好ましくはＣである。Ｘ２は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、典型的には疎水性または中性残基である。Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＰまたはＲであってよい。Ｘ２は、好ましくはＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである。Ｘ２は、より好ましくはＡ、ＭまたはＬである。Ｘ２は、最も好ましくはＡまたはＭである。

【0105】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくはモチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ−Ｐ（本明細書以下で伸張されたＨｅｌ３０８モチーフと称される；配列番号９）を含み、式中Ｘ１およびＸ２は上に記載のとおり。

【0106】

最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ３０８モチーフは、下の表５に示される。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、これらの好ましいモチーフのいずれをも含み得る。

【0107】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくは下の表４に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。

【0108】

【表4】

【0109】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは下の表５に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは表５に示すヘリカーゼの１つの配列、すなわち配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の１つまたはその変種を含む。

【0110】

【表5】

【0111】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕの配列（すなわち、配列番号１０）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｐｆｕの配列（すなわち、配列番号１３）もしくはその変種、（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋの配列（すなわち、配列番号２９）もしくはその変種、（ｄ）Ｈｅｌ３０８Ｍｍａの配列（すなわち、配列番号４５）もしくはその変種、（ｅ）Ｈｅｌ３０８Ｆａｃの配列（すなわち、配列番号４８）もしくはその変種または（ｆ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕの配列（すなわち配列番号５２）もしくはその変種を含む。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは配列番号１０に示す配列またはその変種を含む。

【0112】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａの配列（すなわち、配列番号３３）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙの配列（すなわち、配列番号２２）もしくはその変種、または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕの配列（すなわち配列番号５２）もしくはその変種を含む。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、最も好ましくは配列番号３３に示す配列もしくはその変種を含む。

【0113】

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼの配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。特に、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つの変種は、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。配列番号１０または３３の変種は配列番号１０または３３の配列から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種はヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。

【0114】

配列番号１０または３３などの配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つのアミノ酸配列全長にわたって、変種は好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列に対して少なくとも３０％相同である。より好ましくは、変種ポリペプチドは、配列番号１０または３３などの配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つのアミノ酸配列に対して、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

【0115】

配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つの変種は、関連する野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを好ましくは含む。例えば配列番号１０の変種は、好ましくは配列番号１０のＨｅｌ３０８モチーフ（ＱＭＡＧＲＡＧＲ；配列番号１１）または配列番号１０の伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（ＱＭＡＧＲＡＧＲＰ；配列番号１２）を含む。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のそれぞれのＨｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ３０８モチーフは、表５に示される。しかし、配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つの変種は、異なる野生型配列由来のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを含む場合がある。例えば、配列番号１０の変種は、配列番号１３のＨｅｌ３０８モチーフ（ＱＭＬＧＲＡＧＲ；配列番号１４）または配列番号１３の伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（ＱＭＬＧＲＡＧＲＰ；配列番号１５）を含む場合がある。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つの変種は、表５に示す好ましいモチーフの任意の１つを含む場合がある。配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８の任意の１つの変種は、関連する野生型配列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ内に修飾も含む場合がある。Ｘ１およびＸ２での好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。

【0116】

配列番号１０の変種は、配列番号１０の最初の１９アミノ酸を欠失しているおよび／または配列番号１０の最後の３３アミノ酸を欠失している場合がある。配列番号１０の変種は、配列番号１０のアミノ酸２０から２１１または２０から７２７にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％相同である配列を好ましくは含む。

【0117】

ヘリカーゼは、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼは、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよびヘリカーゼへの電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。

【0118】

本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわち膜貫通タンパク質ポアまたはＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポアまたはヘリカーゼ上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。

【0119】

ポアおよび／またはヘリカーゼは明示標識（revealing label）で標識し得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば¹²⁵I、³⁵S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。

【0120】

タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出し得る。例えばポアおよび／またはヘリカーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成し得る。ポアおよび／またはヘリカーゼのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾し得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ポアおよび／またはヘリカーゼは、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更し得る。

【0121】

ポアおよび／またはヘリカーゼは、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたはヘリカーゼは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

【0122】

ポアおよび／またはヘリカーゼは、他の非特異的修飾もそれらがポア形成またはヘリカーゼ機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾は当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出し得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。

【0123】

ポアおよびヘリカーゼは、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成し得る。ポアまたはヘリカーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製し得る。ポアまたはヘリカーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現し得る。ポアおよび／またはヘリカーゼは、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成し得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。

【0124】

ポアおよび／またはヘリカーゼは、大規模に生成することができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを含む。

【0125】

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定し得る。

【0126】

（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数を用いて測定できる。

【0127】

（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定し得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行い得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定し得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。

【0128】

（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定し得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。

【0129】

（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定し得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定し得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。

【0130】

（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在を測定し得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定し得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシン（methylcyotsine）は、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別し得る。

【0131】

種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。

【0132】

電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出し得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出し得る。

【0133】

好ましい実施形態では方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間にポアを通って流れる電流を測定して、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。

【0134】

本方法は、ポアが膜に挿入されている膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行し得る。本方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行し得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁はポアを含有する膜が形成される開口部を有する。

【0135】

本方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載の装置を用いて実行し得る。

【0136】

本方法は、ヌクレオチド（複数可）との１つまたは複数の相互作用の間にポアを通過する電流を測定するステップを含み得る。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行し得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。

【0137】

本発明の方法は、ヌクレオチドとの１つまたは複数の相互作用の際にポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。

【0138】

本方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的には用いられる。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。上に考察したとおりＨｅｌ３０８ヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。

【0139】

本方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。

【0140】

本方法は、０^ｏＣから１００^ｏＣまで、１５^ｏＣから９５^ｏＣまで、１６^ｏＣから９０^ｏＣまで、１７^ｏＣから８５^ｏＣまで、１８^ｏＣから８０^ｏＣまで、１９^ｏＣから７０^ｏＣまでまたは２０^ｏＣから６０^ｏＣまでで実行し得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。

【0141】

本方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物およびヘリカーゼの作用を促進する酵素補因子の存在下で典型的には実行される。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼを機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋またはＣｏ^２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ^２＋である。

【0142】

標的ポリヌクレオチドは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼおよびポアと任意の順序で接触し得る。標的ポリヌクレオチドがＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にヘリカーゼと複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼ複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。

【0143】

上に考察したとおり、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、ナノポアに関して２つのモードで作動できる。第一に、本方法は、印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通って標的配列を移動させるようにＨｅｌ３０８ヘリカーゼを用いて好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が最初にナノポアに捕捉され、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に移行するまで場に沿ってナノポアを通るように、酵素はＤＮＡをナノポア中に移動させる。代替的に、本方法は、印加された電圧から生じる場とは反対に酵素が標的配列をポアを通して移動させるように好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が最初にナノポアに捕捉され、酵素は、標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ側に戻って放されるまで印加された場とは反対にナノポアの外側へ引かれるようにＤＮＡをナノポアを通して移動させる。

【0144】

本発明の方法は、ＭｓｐＡ由来のポアおよび配列番号８もしくは１０に示す配列またはその変種を含むヘリカーゼを最も好ましくは含む。ＭｓｐＡならびに配列番号８および１０を参照して上に考察した任意の実施形態は、組合せで用いられ得る。

【0145】

他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。本方法は、ポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体を形成するステップを含む。複合体は、ポアとヘリカーゼとを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成し得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアをヘリカーゼに共有結合的に付着するステップによっても形成し得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。

【0146】

キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）ポアおよび（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを含む。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。

【0147】

キットは、脂質二重層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。

【0148】

本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。

【0149】

装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数のポアおよび複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを含む。装置は、本発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。

【0150】

装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。

【0151】

装置は、
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器を好ましくは含み、
流体系は、容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。

【0152】

内部結合分子モーター
分子モーターは、ポリマー（特に、ポリヌクレオチド）のナノポアを通る移行を制御するための手段として一般に用いられている。驚くべきことに、本発明者らは、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで（すなわち５’末端または３’末端ヌクレオチド以外の位置で）結合できる分子モーターが、分子モーターがナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することから、ポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できることを見いだした。分子モーターの制御下でナノポアを通ってポリヌクレオチド全体を移行する能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。本発明において用いられる分子モーターは、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１００００または２００００以上の標的ポリヌクレオチドの移行を制御することにおいて特に有効である。

【0153】

したがって、本発明は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび分子モーターに接触させて、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ、および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法を提供する。

【0154】

本発明のＨｅｌ３０８法との関連において上に考察した任意の実施形態は、本発明のこの方法に等しく適用される。

【0155】

ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本発明において用いられる分子モーターの多く場合は、比較的短い距離でポリヌクレオチドに結合し、それによりさらなる分子モーターがポアと会合する前にポアを通って引かれ得るポリヌクレオチドの長さは比較的短い。

【0156】

内部ヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中の末端ヌクレオチドではないヌクレオチドである。例えばそれは、３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドではない。環状ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドは内部ヌクレオチドである。

【0157】

一般的に内部ヌクレオチドに結合できる分子モーターは、末端ヌクレオチドにも結合できるが、いくつかの分子モーターが内部ヌクレオチドに結合する傾向は他より大きい。本発明における使用のために好適な分子モーターは、典型的にはポリヌクレオチドへのその結合の少なくとも１０％が内部ヌクレオチドへの結合である。典型的にはその結合の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が内部ヌクレオチドへの結合である。末端ヌクレオチドでの結合は、両方の末端ヌクレオチドおよび隣接する内部ヌクレオチドへの結合を同時に含み得る。本発明の目的のためにこれは、内部ヌクレオチドでの標的ポリヌクレオチドへの結合ではない。換言すると本発明において用いられる分子モーターは、１つまたは複数の隣接する内部ヌクレオチドとの組合せで末端ヌクレオチドに結合できるだけではない。分子モーターは、末端ヌクレオチドに同時に結合することなく内部ヌクレオチドに結合できなければならない。

【0158】

内部ヌクレオチドに結合できる分子モーターは、２個以上の内部ヌクレオチドに結合できる。典型的には分子モーターは、少なくとも２個の内部ヌクレオチドに、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の内部ヌクレオチドに結合する。典型的には分子モーターは、少なくとも２個の隣接する内部ヌクレオチドに、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の隣接する内部ヌクレオチドに結合する。少なくとも２個の内部ヌクレオチドは隣接していても隣接しなくてもよい。

【0159】

ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合する分子モーターの能力は、比較アッセイを実行することによって決定し得る。制御ポリヌクレオチドＡに結合するモーターの能力は、同じポリヌクレオチドだが末端ヌクレオチドにブロッキング基が付着しているもの（ポリヌクレオチドＢ）へ結合する能力と比較される。ブロッキング基は、Ｂ鎖の末端ヌクレオチドでのいかなる結合も妨げ、それにより分子モーターの内部結合だけを可能にする。この種類のアッセイの例は、実施例４に開示されている。

【0160】

好適な分子モーターは当技術分野において周知であり、典型的には、これだけに限らないが、ポリメラーゼなどの１および２本鎖トランスロカーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼおよびエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを含む。好ましくは、分子モーターは、ヘリカーゼ、例えばＨｅｌ３０８ヘリカーゼである。内部ヌクレオチドで結合できるＨｅｌ３０８ヘリカーゼの例は、これだけに限らないが、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｃｓｙを含む。それにより分子モーターは、（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（すなわち配列番号３３）もしくはその変種の配列または（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（すなわち配列番号２２）もしくはその変種の配列または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（すなわち配列番号５２）の配列もしくはその変種を好ましくは含む。典型的には変種は、その配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号３３、２２または５２に対して少なくとも４０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持している。さらに可能性のある変種は、上に考察されている。

【0161】

本発明において用いられる分子モーターは、上で考察した任意の方法によって作出でき、上で考察したとおり修飾または標識し得る。分子モーターは、本明細書に記載の方法においてまたは本明細書に記載の装置の部分として用い得る。本発明は、ポアと（標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる）分子モーターとの複合体を形成すし、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するセンサーを形成するステップを含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法をさらに提供する。本発明は、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するために標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターの使用も提供する。本発明は、（ａ）ポアおよび（ｂ）標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーター、を含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。本発明は、複数のポアおよび、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる複数の分子モーターを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置も提供する。

【0162】

次の実施例は本発明を例示する。
実施例

【実施例1】

【0163】

本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖の移動を制御するためのＨｅｌ３０８ヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８ＭＢｕ）の使用を例示する。本実施例全般に使用される一般的な方法および基質を図１に示し、図の解説に記載する。

【0164】

材料および方法
ＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐ断片を増幅するためにプライマーを設計した。これらのプライマーの各５’末端は、５０ヌクレオチド非相補性領域（ホモポリマーストレッチまたは１０ヌクレオチドホモポリマーセクションの反復単位のいずれか）を含んでいた。これらは、ナノポアを通る鎖の移行を制御するためおよび移行の方向性を決定するための識別子として役立つ。付加的に順方向プライマーの５’末端を、２'−Ｏ−メチル−ウラシル（ｍＵ）ヌクレオチド４個を含むように「キャップ」し、逆方向プライマーの５’末端を化学的にリン酸化した。その結果、これらのプライマー修飾は、ラムダエキソヌクレアーゼを用いる主にアンチセンス鎖だけの制御された消化を可能にする。ｍＵキャッピングがセンス鎖をヌクレアーゼ消化から保護する一方で、アンチセンス鎖の５'のＰＯ４はそれを促進する。したがって、ラムダエキソヌクレアーゼとのインキュベーション後に、二重鎖のセンス鎖だけがインタクトで、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として残る。次いで、作製されたｓｓＤＮＡを既に記載のとおりＰＡＧＥ精製した。

【0165】

本明細書に記載の全ての実験において用いたＤＮＡ基質設計を図６に示す。ＤＮＡ基質は、ナノポアによる捕捉を補助するための５０Ｔ ５’−リーダーを有するＰｈｉＸ由来のｓｓＤＮＡの４００塩基セクションからなる（配列番号５９）。５０Ｔリーダー直後のこの鎖にアニールするのは、二重層の表面上のＤＮＡを濃縮し、捕捉効率を改善する３’コレステロールタグを含有するプライマー（配列番号６０）である。

【0166】

緩衝溶液:４００ｍＭ〜２Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（E.coli）ＭＳ（Ｂ２）８ ＭｓｐＡ ＯＮＬＰ３２７１ＭＳ−（Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８
酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（ＯＮＬＰ３３０２、約７．７μＭ）１２．５μｌ−＞最終１００ｎＭ

【0167】

１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００μｍ、厚さ２０μｍのＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍＬ緩衝溶液に分けた。全ての実験は、上記の緩衝溶液中で実行した。単一チャネル電流を１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝溶液に繋ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）をＡｘｏｐａｔｃｈ ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントをｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。二重層中での単一ポアを達成した後、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびヘリカーゼを緩衝液１００μＬに加え、５分間予備インキュベートした（ＤＮＡ＝１．５ｎＭ、酵素＝１μＭ）。ＭｓｐＡナノポアでのヘリカーゼＤＮＡ複合体の捕捉を開始するためにこの予備インキュベーション混合物を電気生理学チャンバーのｃｉｓコンパートメント中の緩衝液９００μＬに添加した（ＤＮＡ＝０．１５μＭ、酵素＝０．１μＭの最終濃度をもたらす）。ヘリカーゼＡＴＰａｓｅ活性を必要に応じてｃｉｓコンパートメントへの二価金属（１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）およびＮＴＰ（１ｍＭ ＡＴＰ）の添加によって開始させた。実験を＋１８０ｍＶの一定電位で実行した。

【0168】

結果および考察
図１に示すヘリカーゼ−ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポアへの添加は、図２に示す特性的電流遮断を生じる。ヘリカーゼ結合を含まないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流に短い遮断（＜＜１秒間）を生じる。ヘリカーゼ結合を有し、活性な（すなわち、ＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）ＤＮＡは、図２に示す電流における段階的変化を含む長い特性的な遮断レベルを生じる。ナノポア中のさまざまなＤＮＡモチーフは、独特の電流遮断レベルを生じさせる。

【0169】

所与の基質に関して本発明者らは、ＤＮＡ配列を反映する電流移行の特性的パターンを観察する（図３の例）。

【0170】

図１に示す実行では、鎖に沿った無作為な位置でＤＮＡがヘリカーゼに捕捉されることから、ＤＮＡ鎖は無作為な開始点から配列決定される。しかし、酵素が解離しない限り、鎖は５０Ｔリーダーで同じように全て終了する（図１）。図２に示すとおり本発明者らは、長い残存時間ポリＴレベルでの電流移行終末を伴って大部分の鎖に同じ特性的な終末を観察する（図３）。

【0171】

耐塩性
この種のナノポア鎖配列決定実験は、イオン性塩を必要とする。ＤＮＡを捕捉および移行させるため、およびＤＮＡがナノポアを通るときに生じる配列依存性電流変化を測定するために電圧オフセットを印加するための導電性溶液を作製するためにイオン性塩が必要である。測定シグナルがイオンの濃度に依存することから、得られるシグナルの振幅を増大させるために高濃度イオン性塩を用いることは有利である。ナノポア配列決定のために、１００ｍＭ ＫＣｌを超える塩濃度は理想的であり、１Ｍ ＫＣｌ以上の塩濃度は好ましい。

【0172】

しかし、多数の酵素（いくつかのヘリカーゼおよびＤＮＡモータータンパク質を含む）は、高塩濃度条件を許容しない。高塩濃度条件下で、酵素は、アンフォールドするか構造的完全性を失うかのいずれかであるか、または適正に機能できない。公知および研究されたヘリカーゼについての最新文献は、ほとんど全てのヘリカーゼがおよそ１００ｍＭ ＫＣｌ／ＮａＣｌを超える塩濃度で機能できず、４００ｍＭ ＫＣｌ以上の条件で正確な活性を示す報告されたヘリカーゼはないことを示す。耐塩性種由来の類似酵素の有望な好塩性変種が存在するが、それらを標準的発現系（例えば大腸菌（E.coli））において発現および精製することは非常に困難である。

【0173】

本発明者らは驚くべきことに、本実施例においてＭｂｕ由来のＨｅｌ３０８が非常に高いレベルのＫＣｌまでの耐塩性を示すことを示す。本発明者らは、４００ｍＭ ＫＣｌから２Ｍ ＫＣｌの塩濃度において酵素が機能性を保持することを、蛍光実験またはナノポア実験のいずれかで見いだしている（図４）。図４は、４００ｍＭ ＫＣｌ、１Ｍ ＫＣｌおよび２Ｍ ＫＣｌ塩条件で図１に記載したものと同じ系を用いて実行したＨｅｌ３０８Ｍｂｕ ＤＮＡ事象を示す。本発明者らは、塩濃度範囲にわたって同様の移動を観察している。本発明者らは、塩濃度が増加するにつれて、固定電圧でナノポアを通る電流（Ｉ−オープン）が増大することを観察している。これは、溶液の伝導性の増大および印加された場の下でナノポアを流れて通るイオンの数の増加を反映する。さらに、本発明者らは、ＤＮＡ事象の電流レベルにおける識別の最小から最大範囲の拡大も観察している（図４拡大図および下右プロットを参照されたい）。本発明者らは、塩濃度が４００ｍＭ ＫＣｌから２Ｍ ＫＣｌに増加する場合のＤＮＡ識別範囲における約２００％の拡大を観察している（下の表６）。

【0174】

【表6】

【0175】

操作の順方向および逆方向モード
大部分のヘリカーゼは、１本鎖ポリヌクレオチド基質に沿って単一方向様式で移動し、各ＮＴＰａｓｅ代謝回転について特定数の塩基を移動する。図１は挿入されたＤＮＡをナノポアの外へ引くこの移動の使用を例示するが、ヘリカーゼ移動は、制御されたやり方でナノポアを通るＤＮＡを供給する他の様式に利用され得る。図５は、操作の基本的な「順方向」および「逆方向」モードを例示する。順方向モードではＤＮＡは、印加された場の力の下でＤＮＡが移動するのと同じ方向にヘリカーゼによってポアへ供給される。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（３’−５’ヘリカーゼである）に関して、これはヘリカーゼがナノポアの先端に接触するまでナノポア中のＤＮＡの３’末端の捕捉を必要とし、次いで印加された電位からの場でのヘリカーゼの制御下でＤＮＡはナノポアに供給され、最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に出る。逆方向モードは、ＤＮＡの５’末端の捕捉を必要とし、その後ヘリカーゼは印加された電位からの場と反対に挿入されたＤＮＡをナノポアの反対に引くために進み、最終的にそれを二重層のこのｃｉｓ側に放す。図５は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕを用いる操作のこれら２つのモードおよび典型例ＤＮＡ事象を示す。

【実施例2】

【0176】

本実施例は、酵素活性を検査するための蛍光アッセイを用いるＨｅｌ３０８ヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８ＭＢｕ）の耐塩性を例示する。

【0177】

通例の蛍光基質を、ハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いた（図６Ａ）。図６Ａの１）に示すとおり、蛍光基質鎖（最終１００ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハングおよびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。主要な上部鎖は５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有し、ハイブリダイズされた相補物は３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基を有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の短い鎖に相補的である捕捉鎖１μＭがアッセイに含まれる。２）に示されるとおりＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（５ｍＭ）の存在下で基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’テールに結合し、主要な鎖に沿って移動し、示すとおり相補鎖を置換する。３）に示すとおり、ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると、主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）に示すとおり、過剰量の捕捉鎖が相補的ＤＮＡに優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。

【0178】

基質ＤＮＡ：５’ＦＡＭ−配列番号６１および配列番号６２−ＢＨＱ１−３’、ＦＡＭ＝カルボキシフルオレセインおよびＢＨＱ１＝ブラックホールクエンチャー−１

【0179】

捕捉ＤＮＡ：配列番号６２

【0180】

図６中のグラフは、４００ｍＭから２ＭのＫＣｌのさまざまな濃度を含有する緩衝溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、１μＭ捕捉ＤＮＡ）中での活性の初期速度を示す。ヘリカーゼは２Ｍで作動する。

【実施例3】

【0181】

本実施例では、３種の異なるＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、すなわちＨｅｌ３０８Ｍｈｕ（配列番号５２）、Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ（配列番号２９）およびＨｅｌ３０８Ｍｍａ（配列番号４５）を用いた。全ての実験は、実施例１に既に記載のとおりの同じ実験条件下で実施した（ポア＝ＭｓｐＡ Ｂ２、ＤＮＡ＝４００塩基長 配列番号５９および６０、緩衝液＝４００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ｄｔｔ、１ｍＭ ＡＴＰ、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）。結果を図７に示す。

【実施例4】

【0182】

本実施例は、蛍光アッセイを用いて多数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼの内部結合能力を測定する。

【0183】

通例の蛍光基質を使用して、天然の３’末端を欠失しているＤＮＡで開始するヘリカーゼの能力をアッセイし、続いてハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換させた（図８）。図８のセクションＡに示すとおり、蛍光基質鎖（最終５０ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハング、およびハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの４０塩基セクションを有する。主要な上部鎖を４個の連続する「スペーサー９」基で、３’末端または、オーバーハングとｄｓＤＮＡとの間の接合部で（陰性対照として）内部的に、のいずれかで修飾する。さらに主要な上部鎖は、５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有し、ハイブリダイズされた相補物は３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基を有する。ハイブリダイズされると、フルオレセイン由来の蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は基本的に非蛍光性である。蛍光基質の短い鎖に相補的である捕捉鎖（１μＭ）がアッセイに含まれる。ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）の存在下で、３’−末端「スペーサー９」基を含有する基質に添加されたＨｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体（２０ｎＭ）は、蛍光基質のｓｓＤＮＡオーバーハングに結合でき、主要な鎖に沿って移動し、セクションＢに示すとおり相補鎖を置換する。ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると（セクションＣ）主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。過剰量の捕捉鎖が相補的ＤＮＡに優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ（セクションＤ）。

【0184】

基質ＤＮＡ：５’ＦＡＭを有する配列番号６３；５’ＦＡＭおよび３’スペーサー（（スペーサー９）_４）を有する配列番号６３；配列番号：６４（５’ＦＡＭを有する）およびスペーサー（（スペーサー９）_４）によって分離された６５；ならびに３’ＢＨＱ１を有する配列番号６２。

【0185】

捕捉ＤＮＡ：配列番号６６

【0186】

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ、Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ、Ｈｅｌ３０８Ｍｉｎ、Ｈｅｌ３０８Ｍｉｇ、Ｈｅｌ３０８Ｍｍａｚ、Ｈｅｌ３０８Ｍａｃ、Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋ、Ｈｅｌ３０８Ｍｔｈ、Ｈｅｌ３０８ＭｂａおよびＨｅｌ３０８Ｍｚｈを含むいくつかの異なるＨｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体を中央結合能力について調べた。図９中のグラフは、Ｈｅｌ３０８−調節ｄｓＤＮＡ代謝回転の相対速度を、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ、１μＭ捕捉ＤＮＡ中での３’−未修飾ＤＮＡおよび３’−「スペーサー９」ＤＮＡと比較して示す。Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ、Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８Ｍｍａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｍｉｎを含むいくつかのＨｅｌ３０８相同体は、Ｈｅｌ３０８−調節ｄｓＤＮＡ代謝回転より２０％大きな相対速度を有することを観察した。

【実施例5】

【0187】

本実施例は、２つのＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８ＭＢｕおよびＨｅｌ３０８Ｔｇａの使用と、インタクトな長いＤＮＡ鎖（９００塩基長）のナノポアを通る移動を制御するそれらの能力を比較する。本実施例全体を通じて使用された一般的方法および基質は、図１０に示され、図上の記述に記載されている。

【0188】

材料および方法
５０−ポリＴ５’リーダーをＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの約９００塩基断片にライゲーションすることによって、ＤＮＡを形成した。リーダーは、ＤＮＡが二重層に挿入されるようにするためにＣｈｏｌタグを有する配列番号６９がハイブリダイズされた相補性セクションも含有する。最後にＡＣＧＴの４ｎｔ ３’−オーバーハングを得るためにＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの３’末端をＡａｔＩＩ消化酵素で消化した。

【0189】

配列決定：配列番号６７−５’リーダーおよびテザーを含む９００塩基長センス鎖；配列番号６８−アンチセンスマイナス４塩基対リーダー５’；およびいくつかのスペーサーおよび３’末端にＣｈｏｌ−タグを有する配列番号６９。

【0190】

緩衝溶液：４００ｍＭ〜２ＮａＣｌ、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、
ナノポア：ＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８（ＯＮＴ Ｒｅｆ Ｂ２Ｃ）
酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ最終１０００ｎＭまたはＨｅｌ３０８Ｔｇａ最終４００ｎＭ

【0191】

脂質二重層に挿入された単一ポアを達成するために、電気的実験を実施例１に記載のとおり準備した。二重層中での単一ポアを達成した後に、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）をチャンバーに加えた。＋１４０ｍＶでの対照記録を２分間実行した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番号：６７、６８および６９（ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ）を添加し、ＤＮＡ事象を観察した。最後にＨｅｌ３０８ヘリカーゼ（Ｍｂｕ １０００ｎＭまたはＴｇａ、４００ｎＭ）を電気生理学的チャンバーのｃｉｓコンパートメントにＭｓｐＡナノポアでのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために添加した。実験は、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。

【0192】

結果および考察
図１０に示すとおり、ヘリカーゼ−ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポアへの添加は、ヘリカーゼがポアを通るＤＮＡの移行を制御することから特徴的電流遮断を生じる。図１１は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体ＭｂｕがＭｓｐＡポアを通るＤＮＡ鎖の移行を制御したときに９００塩基長の位置がどのように変化したかを示す追跡事象例を示す。このヘリカーゼは、ＤＮＡ移行の制御を調節することが見いだされたが、ヘリカーゼがＤＮＡから脱離すると、外部から印加された電位によってかかる力のために鎖がポアを通って戻ることが観察された。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体Ｍｂｕの場合では、９００塩基長鎖はヘリカーゼが離れるごとに多くの位置（およそ１００〜２００塩基）が滑り戻る。位置におけるこれらの急速な変化は、図１１に点線円で示されている。この実験に関してＨｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体Ｍｂｕが分子モーターとして用いられた場合は、検出された全事象の３２％が９００塩基長鎖配列の全長を読み取ったことが見いだされた。図１２は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体ＴｇａがＭｓｐＡポアを通るＤＮＡ鎖の移行を制御した場合に９００塩基長の位置がどのように変化したかを示す同様の追跡事象例を示す。Ｔｇａヘリカーゼが離れた場合（図１２において黒から灰色への色の変化によって示される）にＤＮＡ鎖が比較的少ない距離（＜５０塩基）だけポアを通って戻ることから、この酵素はＭｂｕ相同体よりも内部に結合するより大きな傾向を示した。この実験に関して、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体Ｔｇａが分子モーターとして用いられた場合は、検出された全事象の７４％が９００塩基長鎖配列の全長を読み取ったことが見いだされた。これは、内部に結合する傾向の増大のためにＭｂｕヘリカーゼ相同体と比較してＴｇａヘリカーゼ相同体が１本鎖ＤＮＡの読み取り長さの増大を提供できることを意味する。

【実施例6】

【0193】

本実施例は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ相同体Ｔｇａを使用することによってＤＮＡの５ｋｂ鎖の移行を制御できることを例示する。

【0194】

実施例５に記載のものと類似の実験手順に従った。Ｈｅｌ３０８Ｔｇａを使用することによってＭＳ−（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８を通るＤＮＡの５ｋｂ鎖全体の制御された移行を検出できたことを観察した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕを用いる同一の実験では、５ｋＢ鎖全体の移行を検出できなかった。

【実施例7】

【0195】

本実施例は、蛍光に基づくアッセイを用いてＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（配列番号１０）の酵素前進性をＨｅｌ３０８Ｍｏｋ（配列番号２９）と比較する。

【0196】

通例の蛍光基質をハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼの能力をアッセイするために用いた（図３）。蛍光基質（最終５０ｎＭ）は、３’ｓｓＤＮＡオーバーハングならびにハイブリダイズされたｄｓＤＮＡの８０および３３塩基対セクション（図１３セクションＡ、配列番号７０）を有する。主要な下部「テンプレート」鎖は、８０ｎｔ「ブロッカー」鎖（配列番号７１）にハイブリダイズし、その３’オーバーハングおよび３３ｎｔ蛍光プローブに隣接し、その５’および３’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基でそれぞれ標識される（配列番号７２）。ハイブリダイズされると、ＦＡＭはＢＨＱ−１から離れ、基質は基本的に蛍光性である。ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１０ｍＭ）の存在下でヘリカーゼ（２０ｎＭ）は、図１３セクションＢに示すとおり基質の３’オーバーハング（配列番号７０）に結合し、下部鎖に沿って移動し、８０ｎｔブロッカー鎖（配列番号７１）を置換し始める。前進性である場合、ヘリカーゼは、蛍光プローブ（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号７２）も置換する（図１３セクションＣ）。蛍光プローブは、その５’および３’末端が自己相補的であり、それにより一度置換されると動力学的に安定なヘアピンを形成し、プローブのテンプレート鎖への再アニーリングを防ぐように設計される（図１３セクションＤ）。ヘアピン産物の形成ではＦＡＭはＢＨＱ−１の近傍に運ばれ、その蛍光は消光される。８０塩基長「ブロッカー」（配列番号７１）および蛍光（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号７２）鎖を置換できる前進性酵素は、したがって経時的な蛍光における減少をもたらす。しかし酵素が８０ｎｔ未満の前進性を有する場合は、蛍光鎖（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された配列番号７２）を置換することができず、それにより「ブロッカー」鎖（配列番号７１）は主要な下部鎖（図１３セクションＥ、配列番号７０）に再アニールする。

【0197】

追加的な通例の蛍光基質も制御目的で用いた。陰性対照として用いた基質は、図１３に記載されたものと同一であったが、３’オーバーハング（図１４セクションＡ、（配列番号７１、７２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）および７３））を欠失している。図１３に記載されたものと同様だが８０塩基対セクションを欠失している基質を活性ヘリカーゼの（しかし前進性である必要はない）陽性対照として用いた（図１４セクションＢ、（配列番号７２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）、ならびに７４））。

【0198】

図１５は、緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号７０、７１および７２（その５’末端をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でおよびその３’末端をブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）で標識された）中での図１３に示す前進性基質に対するＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（配列番号１０）およびＨｅｌ３０８Ｍｏｋヘリカーゼ（配列番号２９）の試験での時間依存性蛍光変化のグラフを示す。Ｈｅｌ３０８Ｍｏｋによって示された蛍光の減少は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）と比較したこれらの複合体の前進性の増大を示す。図１６は、全ての試料に関して蛍光が減少したことから全てのヘリカーゼが実際に活性であったことを実証する陽性対照を示す。
配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４および５５（表４）を下に配列比較する。
*の下の数字は配列番号を示す。「−」は、配列比較目的のためだけに示されており、配列の部分を形成しない。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、方法。
［２］
１つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、上記［１］に記載の方法。
［３］
標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、上記［２］に記載の方法。
［４］
標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定される、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、上記［４］に記載の方法。
［６］
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＨｅｌ３０８ヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ；および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間にポアを通過する電流を測定して、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、上記［１］に記載の方法。
［７］
ポアに電圧を印加して、ポアとヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［８］
ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［９］
ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡから選択される、上記［９］に記載の方法。
［１１］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）７個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または（ｂ）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１０］に記載の方法。
［１３］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（配列番号８）を含む（式中、Ｘ１はＣ、ＭまたはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基である）、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
Ｘ２が、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰである、上記［１３］に記載の方法。
［１５］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、表４もしくは５に示すヘリカーゼの内の１つまたはその変種である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ａ）配列番号１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、２９、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および５８のいずれか１つに示す配列、または（ｂ）配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて関連配列に対して少なくとも４０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ａ）配列番号１０もしくは３３に示す配列、または（ｂ）配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号１０もしくは３３に対して少なくとも４０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、上記［１６］に記載の方法。
［１８］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、アミノ酸同一性に基づいて配列番号１０の残基２０から２１１または２０から７２７に対して少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて実行され、塩が場合によりＫＣｌである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
塩濃度が、少なくとも１．０Ｍである、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
ポアとＨｅｌ３０８ヘリカーゼとの複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
［２３］
複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下でポアとヘリカーゼとを接触させるステップおよび（ａ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
電位が、電圧電位または化学電位である、上記［２３］に記載の方法。
［２５］
複合体が、ポアをヘリカーゼに共有結合的に付着するステップによって形成される、上記［２２］に記載の方法。
［２６］
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＨｅｌ３０８ヘリカーゼの使用。
［２７］
（ａ）ポアおよび（ｂ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［２８］
複数のポアおよび複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置。
［２９］
複数のポアを支持でき、前記ポアおよびヘリカーゼを用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための複数の容器
を含み、前記流体系が前記容器から前記センサーデバイスに前記試料を選択的に供給するように構成されている、上記［２８］に記載の分析装置。
［３０］
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび分子モーターに接触させて、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ、および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
［３１］
分子モーターが、ヘリカーゼまたはＨｅｌ３０８ヘリカーゼである、上記［３０］に記載の方法。
［３２］
上記［２］から［２１］のいずれか一項に記載のとおりである、上記［３０］または［３１］に記載の方法。
［３３］
標的ポリヌクレオチドが少なくとも５０００ヌクレオチドを含む、上記［３０］から［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］
分子モーターが、（ａ）配列番号２２、３３もしくは５２に示す配列、または（ｂ）配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２２、３３もしくは５２に対して少なくとも４０％の相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、上記［３０］から［３３］のいずれか一項に記載の方法。
［３５］
ポアと標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターとの複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
［３６］
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターの使用。
［３７］
（ａ）ポアおよび（ｂ）標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる分子モーターを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［３８］
複数のポアおよび標的ポリヌクレオチドに内部ヌクレオチドで結合できる複数の分子モーターを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置。
［３９］
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび少なくとも０．３Ｍの塩濃度に耐性があるヘリカーゼに接触させて、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御し、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドがポアと相互作用するようにするステップ、および
（ｂ）１つまたは複数の相互作用の間に標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含み、少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて実行される方法。
［４０］
ポアと少なくとも０．３Ｍの塩濃度に耐性があるヘリカーゼとの複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
［４１］
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、少なくとも０．３Ｍの塩濃度に耐性があるヘリカーゼの使用。
［４２］
（ａ）ポアおよび（ｂ）少なくとも０．３Ｍの塩濃度に耐性があるヘリカーゼを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット。
［４３］
複数のポアおよび少なくとも０．３Ｍの塩濃度に耐性がある複数のヘリカーゼを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための分析装置。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]