特許 6227390 多能性成体幹細胞およびそれを単離する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6227390

(24)【登録日】2017年10月20日

(45)【発行日】2017年11月8日

(54)【発明の名称】多能性成体幹細胞およびそれを単離する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/074 20100101AFI20171030BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20171030BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20171030BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20171030BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171030BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20171030BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20171030BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171030BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20171030BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171030BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/074

   A61K35/12

   A61K35/28

   A61K48/00

   A61P35/00

   A61P37/04

   A61P37/06

   A61P43/00 105

   C12N5/0775

   C12N5/10

【請求項の数】18

【全頁数】81

(21)【出願番号】特願2013-255938(P2013-255938)

(22)【出願日】2013年12月11日

(62)【分割の表示】特願2012-23028(P2012-23028)の分割

【原出願日】2000年8月4日

(65)【公開番号】特開2014-54264(P2014-54264A)

(43)【公開日】2014年3月27日

【審査請求日】2013年12月11日

【審判番号】不服2016-12789(P2016-12789/J1)

【審判請求日】2016年8月25日

(31)【優先権主張番号】60/147,324

(32)【優先日】1999年8月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/164,650

(32)【優先日】1999年11月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507272577

【氏名又は名称】エイビーティー ホールディング カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100107489

【弁理士】

【氏名又は名称】大塩 竹志

(72)【発明者】

【氏名】レオ ティー フルヒト

(72)【発明者】

【氏名】キャセリン エム ヴァーフェイリー

(72)【発明者】

【氏名】モレイマ レイエス

【合議体】

【審判長】 田村 明照

【審判官】 山本 匡子

【審判官】 大宅 郁治

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１０７０３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５３９８９４１（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００１−５２１３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｎａｔｕｒｅ、２００７．、Ｖｏｌ．４４６、ｐ．４８５−４８６

【文献】 Ｎａｔｕｒｅ、２００２．、Ｖｏｌ．４１８、ｐ．４１−４９

【文献】 Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．、２００１．、Ｖｏｌ．９３８、ｐ．２３１−２３５

【文献】 ＰＮＡＳ、２００１．、Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．１４、ｐ．７８４１−７８４５

【文献】 Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，、２０１０．、Ｖｏｌ．４， Ｎｏ．１、 ｐ．１４−２４

【文献】 Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１０．、Ｖｏｌ．２５１、ｐ．３−１１

【文献】 ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ、２００４．、Ｖｏｌ．４０， Ｎｏ．６、ｐ．１２７５−１２８４

【文献】 Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１３．、Ｖｏｌ．２２， Ｎｏ．１、ｐ．１３３−１４５

【文献】 Ｔｒａｎｓｆｕｓ． Ｍｅｄ． Ｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２００８．、Ｖｏｌ．３５， Ｎｏ．３、ｐ．２２８−２３８

【文献】 Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００９．、Ｖｏｌ．１０６、ｐ．８６７−８７７

【文献】 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６．、Ｖｏｌ．２７１， Ｎｏ．２２、ｐ．１２８７３−１２８７８

【文献】 ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９９．０４．、ＶＯＬ．２８４， ２、ｐ．１４３−１４７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 1/00-5/10

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された哺乳動物幹細胞集団であって、該集団の細胞は、テロメラーゼ、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１およびＲｏｘ−１を発現し、かつ、正常な核型を有し、該集団の細胞は、ＣＤ４５およびＧｌｙＡについて陰性であり、かつ、該集団の細胞は、胚性幹細胞でも、胚性生殖細胞でも、生殖細胞でもなく、該哺乳動物幹細胞は、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験しているか、または、培養中に１０回〜４０回の倍加を経験しており、そして、該集団の細胞が、ヒト骨髄から単離されたものであることを特徴とする、集団。

【請求項2】

細胞培養培地中にある哺乳動物幹細胞の集団であって、該哺乳動物幹細胞は、テロメラーゼ、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１およびＲｏｘ−１を発現し、かつ、正常な核型を有し、該集団の細胞は、ＣＤ４５およびＧｌｙＡについて陰性であり、かつ、該集団の細胞は、胚性幹細胞でも、胚性生殖細胞でも、生殖細胞でもなく、該哺乳動物幹細胞は、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験しているか、または、培養中に１０回〜４０回の倍加を経験しており、そして、該集団の細胞が、ヒト骨髄から単離されたものであることを特徴とする、集団。

【請求項3】

テロメラーゼ、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１およびＲｏｘ−１を発現し、正常な核型を有し、かつ、胚性幹細胞でも、胚性生殖細胞でも、生殖細胞でもない、哺乳動物幹細胞の単離されたクローン集団であって、該哺乳動物幹細胞は、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験しているか、または、培養中に１０回〜４０回の倍加を経験しており、該哺乳動物幹細胞は、ＣＤ４５およびＧｌｙＡについて陰性であり、そして、該哺乳動物幹細胞は、ヒト骨髄から単離されたものである、集団。

【請求項4】

前記哺乳動物幹細胞がヒト細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集団。

【請求項5】

前記哺乳動物幹細胞が、外因性遺伝物質の付加、先在する遺伝物質の欠失、または先在する遺伝物質の改変によって遺伝子改変されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の集団。

【請求項6】

前記改変は、前記哺乳動物幹細胞中への選択可能なマーカー遺伝子またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の導入を含む、請求項５に記載の集団。

【請求項7】

薬学的に許容される担体中にある請求項１〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物幹細胞集団を含む、薬理組成物。

【請求項8】

薬理組成物を製造するための方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の哺乳動物幹細胞を、薬学的に許容される担体と混合する工程
を包含する、方法。

【請求項9】

細胞培養組成物を製造するための方法であって、該細胞培養組成物は細胞培養培地中にある哺乳動物幹細胞を含み、該方法は、
哺乳動物幹細胞を、細胞培養培地中に導入する工程
を包含し、該細胞は、テロメラーゼ、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１およびＲｏｘ−１を発現し、かつ、正常な核型を有し、そして、該哺乳動物幹細胞は、胚性幹細胞でも、胚性生殖細胞でも、生殖細胞でもなく、該哺乳動物幹細胞は、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験しているか、または、培養中に１０回〜４０回の倍加を経験しており、該哺乳動物幹細胞は、ＣＤ４５およびＧｌｙＡについて陰性であり、そして、該哺乳動物幹細胞は、ヒト骨髄から単離されたものである、方法。

【請求項10】

分化した多能性哺乳動物幹細胞を生成するための方法であって、該方法は、
分化を誘導するために適切な培養培地中で請求項１〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物幹細胞集団を培養し、それによって分化細胞を生成する工程
を包含し、該分化細胞は、骨芽細胞型、軟骨細胞型、骨細胞型、脂肪細胞型、軟骨細胞型、繊維芽細胞型、骨髄間質細胞型、骨格筋細胞型、平滑筋細胞型、心筋細胞型、眼細胞型、内皮細胞型、上皮細胞型、肝細胞型、膵臓細胞型、造血細胞型、グリア細胞型、神経性細胞型、および乏突起膠細胞型からなる群より選択される、方法。

【請求項11】

被験体において細胞を生着させるための組成物であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の哺乳動物幹細胞集団
を含む、組成物。

【請求項12】

前記哺乳動物幹細胞が、心臓組織、神経性組織、眼組織、軟骨組織、骨組織、骨格筋組織、平滑筋組織、骨髄組織、脾臓組織、肝臓組織、肺組織、脳組織、免疫系組織、結合組織、血管組織、膵臓組織、中枢神経系（ＣＮＳ）組織、末梢神経系（ＰＮＳ）組織、および腎臓組織のうちの１つ以上に生着する、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

分化因子である物質を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）細胞を所望の物質と接触させる工程であって、該細胞は、テロメラーゼ、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１およびＲｏｘ−１を発現し、かつ、正常な核型を有する哺乳動物幹細胞であり、そして、該哺乳動物幹細胞は、胚性幹細胞でも、胚性生殖細胞でも、生殖細胞でもなく、該哺乳動物幹細胞は、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験しているか、または、培養中に１０回〜４０回の倍加を経験しており、該哺乳動物幹細胞は、ＣＤ４５およびＧｌｙＡについて陰性であり、そして、該哺乳動物幹細胞は、ヒト骨髄から単離されたものである、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）の物質が所望の分化した子孫への分化に影響を与えるか否かを決定する工程であって、分化に影響を与えることは、分化因子である物質を示し、該所望の分化した子孫が、骨芽細胞型、軟骨細胞型、骨細胞型、脂肪細胞型、軟骨細胞型、繊維芽細胞型、骨髄間質細胞型、骨格筋細胞型、平滑筋細胞型、心筋細胞型、眼細胞型、内皮細胞型、上皮細胞型、肝細胞型、膵臓細胞型、造血細胞型、グリア細胞型、神経性細胞型、および乏突起膠細胞型からなる群より選択される、工程
を包含する、方法。

【請求項14】

前記哺乳動物幹細胞が、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験している、請求項１〜６のいずれかに記載の哺乳動物幹細胞集団。

【請求項15】

前記哺乳動物幹細胞が、培養中に４０回を超える細胞倍加を経験している、請求項９に記載の方法。

【請求項16】

前記哺乳動物幹細胞がヒト細胞である、請求項１〜６および１４のいずれか１項に記載の哺乳動物幹細胞集団。

【請求項17】

前記哺乳動物幹細胞がヒト細胞である、請求項８〜１０、１３および１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記哺乳動物幹細胞がヒト細胞である、請求項７、１１および１２のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の一部は、MorayamaReyes に対する国立保健研究所／国立アレルギー感染病研究所からの助成（助成番号IF31-AI-Gn10291）を介して、米国政府の支援を受けた。

【0002】

発明の分野
本発明は、概して、幹細胞を単離する方法、その方法によって単離された幹細胞、およびそのような幹細胞の治療的使用に関する。さらに詳細には、本発明は、分化して様々な細胞系統の細胞を形成する能力を有する単離骨髄由来前駆細胞、ならびにそのような細胞を単離する方法およびそのような方法によって単離された細胞の特異的分化を誘導する方法、さらにはタンパク質および転写因子のようなそれら細胞中に存在する特異的マーカーに関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
幹細胞からの臓器および組織の発生およびそれに続く移植は、多くの病状のための有望な治療法を提供し、従って、多くの分野において幹細胞を研究の中心とならしめた。移植用の臓器および組織の形成のために幹細胞を用いることは、２〜３例挙げると、糖尿病、パーキンソン病、肝疾患、心疾患、および自己免疫疾患のための有望な代替的治療を提供する。しかしながら、臓器および組織の移植に関連する少なくとも２つの重要な問題がある。第1に、ドナー臓器および組織の不足がある。米国において移植のために必要とされ
る臓器のわずか５％がレシピエントに利用可能となる（Evans,etal., J.Am.Med.Assoc. (1992) 267: 239-146）。米国心臓病協会によると、１９９７年に新しい心臓を必要とする４０，０００人のアメリカ人の内、わずか２，３００のみが心臓を受け取ることができ、さらに米国肝臓病基金は、肝不全によって毎年死亡するほぼ３０，０００人の患者のためのドナーは３，０００人より少ないことを報告している。第２の重要な問題は、移植される組織とレシピエントの免疫系との潜在的な不適合性である。提供臓器または組織は異物として宿主免疫系によって認識され、経済的および身体的に−負担を強いることを承知で、拒絶反応抑制剤を患者に提供する必要がある。

【0004】

異種移植、すなわち、別の種からの組織または臓器の移植は、ヒト臓器および組織の不足を克服するための代替的手段を提供することができる。異種移植は、まだ健康である間に臓器を採取し、さらに移植手術の前に患者に有益な前処理を受けさせることを可能とする移植の一歩進んだ計画を提供するであろう。残念ながら、異種移植は、組織不適合性の問題を克服することはできず、かえって悪化させる。さらには、疾病対策センターによると、有害なウィルスは種の壁を越えるという証拠がある。ブタが臓器および組織のドナーの有望な候補になっているが、ブタからヒトへの複数のウィルスの異種間感染が証明されている。例えば、７０人を越えるヒトに感染した致死的結果をもたらす病気である、ヘンドラ(Hendra)ウィルスの発生を阻止するために、１００万頭を超えるブタが最近マレーシアで屠殺された（Butler,D.,Nature(1999) 398: 549）。

【0005】

幹細胞：定義および使用
従って、移植のための臓器および組織の最も有望な供給源は、幹細胞技術の開発にある。理論的に、幹細胞は自己再生細胞分裂を受けて、無期限の間、表現型および遺伝子型において同一である娘細胞を生じさせることができ、最終的に、少なくとも１つの確定的な細胞型に分化することができる。患者自身の幹細胞から組織または臓器を発生させることによって、あるいはレシピエントの免疫系が異物として認識しないように異種細胞を遺伝子組換えすることによって、付随する感染または組織拒絶の危険無しに、異種移植に関連した利点を提供するように移植組織を作成することができる。

【0006】

また、幹細胞は、遺伝子治療の結果を改善する可能性をもたらす。患者自身の幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子組換えし、ｉｎ ｖｉｖｏで再導入して、所望の遺伝子産物を産生させることができる。それら遺伝子操作幹細胞は、体の特定部位での移植のためまたは全身的適用のために多数の細胞型を形成するように分化誘導される能力を有するであろう。あるいは、レシピエントの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原を発現するように、またはＭＨＣを全く発現しないように、異種幹細胞を遺伝子操作して、付随の拒絶の危険無しに、レシピエントにドナーからのそれら細胞の移植を可能とすることができる。

【0007】

幹細胞は、多数回に及ぶ、人によっては無限回とも云われる分裂能を有し、異なる細胞系に分化し、移植時には組織を再生させる細胞として定義される。幹細胞の典型は、無制限の自己再生能及び多能的分化能を有する胚性幹細胞である。この細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得るか、あるいは移植後胚由来の始原生殖細胞（胚性生殖細胞すなわちＥＧ細胞）より得ることが可能である。これまでＥＳ及びＥＧ細胞はマウスから得られていたが、最近ではヒト以外の霊長類及びヒトからも得られている。ＥＳ細胞はマウスの胚盤胞または他の動物の胚盤胞に導入される場合、マウス（動物）のすべての組織に分化することが可能である。ＥＳ及びＥＧ細胞は出生後の動物に移植すると奇形腫を形成するが、このこともやはりその多能性を示すものである。ＥＳ（及びＥＧ）細胞はＳＳＥＡ１及びＳＳＥＡ４抗体による陽性染色法によって特定が可能である。

【0008】

分子レベルでは、ＥＳ及びＥＧ細胞はこれらの未分化細胞に極めて特異的な多くの転写因子を発現する。その例としてｏｃｔ−４やＲｅｘ−１がある。その他にＬＩＦ−Ｒやｓｏｘ−２及びＲｏｘ−１転写因子も見られるが、後者の２つはＥＳ細胞以外の細胞においても発現される。ｏｃｔ−４は原腸形成前の胚、分裂初期段階の胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、及び胚性腫瘍（ＥＣ）細胞において発現される転写因子である。ｏｃｔ−４はｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の分化を誘導するとダウンレギュレートされ、成体の動物ではｏｃｔ−４は生殖細胞にのみ見られる。幾つかの研究によって、ｏｃｔ−４はＥＳ細胞の未分化の表現型の維持に必要とされ、胚形成及び分化の初期段階を決定するうえで重要な役割を担っていることが示されている。ｏｃｔ−４はＲｏｘ−１とともにジンクフィンガータンパク質であるＲｅｘ−１の転写を活性化し、ＥＳ細胞を未分化の状態に維持するうえでも必要とされる。同様にｓｏｘ−２はｏｃｔ−４とともにＥＳ／ＥＣ細胞の未分化状態を維持し、マウスＥＳ細胞（ヒトでは異なる）を維持するうえで必要とされる。ヒト及びマウス始原生殖細胞ではＬＩＦの存在が必要である。ＥＳ細胞の別の特徴はテロメラーゼの存在であり、このためこれらの細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの無制限の自己再生能を有するものである。

【0009】

幹細胞は多くの臓器組織において特定されている。最もよく調べられているものは造血幹細胞である。この細胞は細胞表面のマーカー及び機能的特徴に基づいて単離された中胚葉由来の細胞である。造血細胞は骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢より単離され、レシピエントの生涯にわたる造血作用を与え、複数の造血細胞系を形成する（参照、Fei,R.,et al., 米国特許第５，６３５，３８７号; McGlave, et al., 米国特許第５，
４６０，９６４号;Simmons, P., etal., 米国特許第５，６７７，１３６号; Tsukamoto,et al., 米国特許第５，７５０，３９７号;Schwartz,et al., 米国特許第５，７５９，７９３号;DiGuisto, et al., 米国特許第５，６８１，５９９号; Tsukamoto,et al., 米国特許第５，７１６，８２７号;Hill, B.,et al., Exp. Hematol. (1996) 24 (8): 936-943）。造血幹細胞は致死レベルの放射線を照射した動物やヒトに移植すると赤血球、好中性マクロファージ、骨髄巨核球、及びリンパ様造血細胞プールを再生させる。造血細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにて、少なくともある程度の自己再生細胞分裂を行わせること、及びｉｎ
ｖｉｖｏで見られるものと同じ細胞系へと分化させることが可能である。すなわちこの細胞は幹細胞としての基準を満たすものである。しかしながらこの幹細胞は造血系の細胞のみに分化するため、例えば大量の化学療法剤の投与によって損傷した心臓や肺などの他の損傷組織を修復するための細胞の供給源とはなり得ない。

【0010】

よく調べられている幹細胞の第２のものは、神経幹細胞である（Gage FH: Science 287: Science 287:1433-1438,2000; Svendsen CN etal., Brain Path 9: 499-513, 1999; Okabe S et al.,Mech Dev59: 89-102, 1996）。神経幹細胞は胎児脳の脳室下領域及び嗅
球から最初に確認された。最近に至るまで成体の脳には幹細胞の能力を有する細胞は既に含まれていないものと考えられていたが、齧歯類及びより最近ではヒト以外の霊長類及びヒトにおける幾つかの研究によって幹細胞が成体脳にも引き続き存在していることが示された。これらの幹細胞はｉｎ ｖｉｖｏ増殖が可能であり、またｉｎ ｖｉｖｏにて少なくとも一部の神経細胞を継続的に再生することが可能である。神経幹細胞はｅｘ ｖｉｖｏでの培養において増殖させ、異なる種類の神経細胞及びグリア細胞に分化させることが可能である。神経幹細胞は脳に移植すると神経細胞及びグリア細胞を生着、形成することが可能である。したがってこの細胞もまた幹細胞の基準を満たすものである。

【0011】

間葉性幹細胞（ＭＳＣ）は胚の中胚葉より最初に誘導され、成人の骨髄より単離されたものであるが、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、及び腱へと分化することが可能である。胚形成において中胚葉は、肢芽中胚葉、骨を形成する組織、軟骨、脂肪、骨格筋、及び可能性として内皮へと発生する。中胚葉はまた、内臓中胚葉へと分化し、内臓中胚葉は心筋、平滑筋、あるいは内皮と造血前駆細胞とからなる血島を生ずる。したがって原始中胚葉性すなわち間葉性幹細胞は多くの異なる細胞及び組織の発生源となり得るものである。間葉性幹細胞は幹細胞として挙げられる第３の組織特異的細胞であり、フリデンシュタイン（Ｆｒｉｄｅｎｓｈｔｅｉｎ）によって最初に述べられた（Fridenshtein,Arkh.Patol., 44: 3-11, 1982）。これまでに多くの間葉性幹細胞が単離されている（参照、Caplan,A., et al., 米国特許第５，４８６，３５９号;Young,H., et al., 米国特許第５，８２７，７３５号; Caplan, A., etal., 米国特許第５，８１１，０９４号; Bruder,S., etal., 米国特許第５，７３６，３９６号; Caplan, A., et
al., 米国特許第５，８３７，５３９号;Masinovsky, B., 米国特許第５，８７３，６７０号; Pittenger, M., 米国特許第５，８２７，７４０号;Jaiswal.N.,et al., J. CellBiochem. (1997) 64 (2): 295-312; Cassiede P., et al.,J.BoneMiner. Res. (1996)11 (9): 1264-1273; Johnstone, B., et al., (1998)238(1):265-272; Yoo, et al., J. Bone Joint Surg. Am. (1998) 80 (12):1745-1757;Gronthos, S., Blood(1994) 84 (12): 4164-4173; Makino, S., et al., J.Clin.Invest. (1999) 103 (5):696-705）。これまでに記述されている多くの間葉性幹細胞のすべては限られた分化能を示し、一般に間葉由来のものと考えられる分化細胞のみに分化する。これまでに報告されている最も多能性の高い間葉性幹細胞はピッテンジャー（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ）等によって単離された細胞であり、この細胞の表現型はＳＨ２^＋ＳＨ４^＋ＣＤ２９^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ７１^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ１０６^＋ＣＤ１２０ａ^＋ＣＤ１２４^＋ＣＤ１４⁻ＣＤ３４⁻ＣＤ４５⁻である。この細胞は間葉由来の多くの種類の細胞に分化することが可能であるが、当該細胞を単離した研究チームが増殖培養中に造血細胞を一切確認しなかったと述べているように、その分化能は間葉系の細胞に限定されたものであることは明らかである（Pittenger,etal.,Science (1999) 284: 143-147）。

【0012】

これまでに消化器幹細胞、表皮幹細胞、卵形細胞とも呼ばれる肝幹細胞などの他の幹細胞が特定されている（Potten C, Philos Trans RSocLond B Biol Sci 353:821-30, 1998; Watt F, Philos. Trans R Soc Lond B BiolSci353: 831, 1997;Alison M et al, Hepatol 29: 678-83 1998）。これらの細胞の多くのものについてはあまりよく調べられていない。

【0013】

ＥＳ細胞と比較すると組織特異的幹細胞の自己再生能は低く、また複数の細胞系へと分化するが多能性は有さない。組織特異的細胞がＥＳ細胞に関して上記に述べたようなマーカーを発現するか否かについては明らかにされていない。更に、組織特異的幹細胞におけるテロメラーゼの活性度に関しても完全には研究し尽くされていないが、これはこれらの細胞の高密度の集団を多数得ることが困難であることに一部起因するものである。

【0014】

最近まで、組織特異的幹細胞は同一組織の細胞にのみしか分化し得ないものと考えられていたが、多くの最近の論文によって成人の組織特異的幹細胞が異なる組織の細胞に分化し得る可能性が示唆されている。また多くの研究によって骨髄移植時に移植された細胞が骨格筋に分化し得ることが示されている（FerrariScience279: 528-30, 1998; GussoniNature 401: 390-4, 1999）。これは骨髄に存在する間葉細胞の潜在的分化能の範囲内であると考えられる。ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）はその論文において、筋衛星細胞が造血細胞に分化し得ることについて述べているが、これもやはり臓側中胚葉内での表現型の変換の一例である（JacksonPNASUSA96: 14482-6, 1999）。胚の１つの層（例 臓側中胚葉）に由来する幹細胞が、胚形成において胚の異なる層から誘導されると考えられる組織に分化し得ることを示した研究もある。例えば、骨髄移植を行ったヒトや動物において検出される内皮細胞またはその前駆細胞は少なくともその一部が骨髄ドナーに由来している（Takahashi,NatMed5: 434-8, 1999; Lin, Clin Invest 105: 71-7, 2000）。すなわち、
ＭＳＣなどの臓側中胚葉由来ではない、内臓中胚葉由来の細胞は移植骨髄とともに導入されたものである。更に驚くべき報告として、齧歯類及びヒトにおいて肝上皮細胞及び胆管上皮細胞がドナー骨髄から誘導されることを示した報告がある（Petersen,Science284:1168-1170, 1999; Theise, Hepatology 31: 235-40, 2000; Theise,Hepatology32:11-6, 2000）。同様に３つの研究グループによって、神経幹細胞が造血細胞に分化し得ることが示されている。最後になるが、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）等によって、胚盤胞に注入された神経幹細胞がキメラマウスのすべての組織に分化し得ることが報告されている（Clarke,Science288:1660-3, 2000）。

【0015】

ここで、これらの研究の多くは単一の細胞が異なる臓器の組織に分化し得ることを結論的に証明したものではない点を指摘しておく必要がある。実際、殆どの研究者が始原細胞の表現型を特定していない。例外としてワイスマンとグロンペ（Ｗｅｉｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｏｍｐｅ）による研究がある。この研究は肝臓に生着した細胞が、造血幹細胞が高度に濃縮されたＬｉｎ⁻Ｔｈｙ_１ＬｏｗＳｃａ_１^＋骨髄細胞中に存在することを示したものである。同様にミュリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）の研究グループによって、造血幹細胞が高度に濃縮された骨髄ＳＰ細胞が筋肉及び内皮に分化し得ることが示され、またジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）等によって造血系の再構成は筋Ｓｐ細胞によるものであることが示されている（Gussonietal., Nature 401: 390-4, 1999）。

【0016】

異種の胚性幹細胞から発生した組織や臓器を移植するには、細胞を更に遺伝子改変して特定の細胞表面マーカーの発現を阻害するか、あるいは移植拒絶反応を防ぐために化学療法的免疫抑制剤を継続使用する必要がある。したがって、胚性幹細胞の研究によって移植用臓器の限られた供給量の問題に有望な代替策が与えられるものの、移植された異種細胞及び組織を定着させるための免疫抑制を必要とすることにより問題や危険をともなう。人口の大半をカバーする治療を行えるだけの免疫適合性細胞を得るためには推定で２０種類の免疫学的に異なる胚性幹細胞の細胞系を樹立する必要がある（Wadman,M.,Nature (1999) 398: 551）。

【0017】

胚由来ではなく、成体由来の細胞を自己由来または異種遺伝子型幹細胞の供給源として使用することにより、移植胚性幹細胞の使用にともなう組織不適合性の問題が解決されるばかりでなく、胚性幹細胞の研究にともなう倫理的ジレンマの解決も図られる。これまでのところ、組織移植としての自己由来幹細胞の使用にともなう最大の難点は細胞の限定された分化能にある。完全に発育を遂げた生物、特にヒトから多くの幹細胞がこれまでに単離されている。しかしながらこれらの細胞は多能性を有するとの報告もあるものの、異なる種類の細胞への分化能は限定されたものであった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

すなわち、多分化能を有する幹細胞は本発明者及び他の研究者によってこれまでに単離されているものの、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋、及び造血細胞などの異なる細胞系の広範な種類の細胞への分化能を有する前駆細胞はこれまで述べられていなかった。細胞及び組織移植、遺伝子治療によって将来的に治療法が進歩を遂げるには、分化能が最も高い幹細胞または前駆細胞が必要である。したがって成体における胚性幹細胞と同等な細胞が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0019】

発明の概要
本発明は、表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ４５、ならびにＨＬＡクラスＩおよびII陰性である単離多能性哺乳動物幹細胞を提供する。また、細胞は、表面抗原ＣＤ３４、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ＨＬＡクラスＩ陰性であり、かつｏｃｔ３／４ ｍＲＮＡ陽性あって差し支えなく、さらにｈＴＲＴｍＲＮＡ陽性であって差し支えない。特に、本発明の細胞は、表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２ＥおよびＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｃ、ＣＤ４４、ＨＬＡクラスＩ、ならびに２−ミクログロブリン陰性であり、かつＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＤＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１およびＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａおよびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂ陽性であって差し支えない。本発明は、転写因子ｏｃｔ３／４、ＲＥＸ−１、およびＲＯＸ−１を発現する、単離された、多能性で非胚性である、非生殖細胞系の細胞を提供する。また、成長因子ＬＩＦに反応しかつＬＩＦに対する受容体を有する出生後の哺乳動物由来の単離多能性細胞を提供する。

【0020】

上記に述べた本発明の細胞は、中胚葉、外胚葉、及び内胚葉由来の少なくとも１種類の分化細胞に分化誘導することが可能である。例えば、本発明の細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、及び乏突起膠細胞の細胞タイプの細胞に少なくとも分化誘導することが可能である。当該細胞としてはヒト細胞またはマウス細胞を使用することが可能である。当該細胞は胎児、新生児、子供、または成人から得ることが可能である。当該細胞は、骨髄、肝臓や脳などの臓器から得ることが可能である。

【0021】

本発明は更に、上記の多能性成体幹細胞から得られる分化細胞を提供するものであり、その場合の子孫細胞は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、または乏突起膠細胞であり得る。分化した子孫細胞は、皮膚上皮細胞、肝上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓内分泌細胞または小島細胞、膵臓外分泌細胞、消化管上皮細胞、腎臓上皮細胞、または表皮関連構造（毛嚢など）であり得る。分化した子孫細胞は歯の周囲の軟部組織または歯を形成する場合もある。

【0022】

本発明は上記に述べたような単離形質転換多能性哺乳動物幹細胞を提供するものであり、その場合、当該細胞のゲノムを予め選択された単離ＤＮＡの挿入、予め選択された単離ＤＮＡによる細胞ゲノムのセグメントの置換、または細胞ゲノムの少なくとも一部の欠失あるいは不活化によって改変しておくことが可能である。この改変は、ウイルスベクターの組み込みによるＤＮＡの挿入や、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスやレトロウイルスベクターを使用したウイルスによる形質導入によって行うことが可能である。また、細胞ゲノムの不活化したい部分の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸分子を使用して当該単離形質転換細胞の細胞ゲノムの一部を不活化することも可能である。更に、不活化したい細胞ゲノムの部分の配列を標的としたリボザイム配列を用いて細胞ゲノムの一部を不活化することも可能である。改変ゲノムは、改変ゲノムを有する子孫細胞またはその子孫と、改変していないゲノムを有する子孫細胞との区別を可能とするように発現される、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の遺伝子配列を有していてもよい。例えば、マーカーとしては、緑色、赤色、黄色の蛍光タンパク質、β−ｇａｌ、Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ^ｍ、またはヒグロマイシンを使用することが可能である。本発明の細胞は、タンパク質、酵素または他の細胞産物の発現を調節する誘導可能なプロモーターや他の制御機構によって調節することが可能な遺伝子を発現することが可能である。

【0023】

本発明は、テロメラーゼを高レベルで発現し、同じドナーから得られたリンパ球のテロメアと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での増殖後に長いテロメアを維持することが可能な細胞を提供するものである。テロメアはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での増殖後に約１１〜１６ＫＢの長さを有していてもよい。

【0024】

本発明は、ｏｃｔ３／４の発現レベルを調整する因子を含む、未分化の多能性幹細胞の継続的増殖または分化を促進するための細胞分化溶液を提供するものである。

【0025】

本発明は、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を単離するための方法を提供するものである。この方法では、骨髄単核細胞からＣＤ４５^＋グリコフォリンＡ^＋細胞を枯渇させ、ＣＤ４５⁻グリコフォリンＡ⁻細胞を回収し、回収したＣＤ４５⁻グリコフォリンＡ⁻細胞をマトリクスコーティング上に播種し、播種した細胞を生長因子を補った培地中で培養する。枯渇工程では、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用したネガティブ選択を行ってもよい。成長因子はＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、及びＬＩＦから選択することが可能である。最後の工程では更に、デキサメタゾン、リノレイン酸、及び／またはアスコルビン酸を補った培地中で培養することも可能である。

【0026】

本発明は、単離多能性成体幹細胞の培養方法であって、インスリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、リノレイン酸、デキサメタゾン、及び血小板由来成長因子を含有した無血清または低血清培地に細胞を加える工程を含む方法を提供するものである。無血清または低血清培地としては、ＭＣＤＢと混合した低グルコースＤＭＥＭを使用することが可能である。インスリンは約１０〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよい。無血清または低血清培地は、０よりも高く約１０μｇ／ｍｌよりも低い濃度の有効量のトランスフェリンを含有することが可能であり、セレニウムは約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、ウシ血清アルブミンは約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、リノレイン酸は約２〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在すればよく、デキサメタゾンは約０．００５〜約０．１５μＭの濃度で存在すればよい。無血清培地または低血清培地は約０．０５〜０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸を含有することが可能である。無血清培地または低血清培地は約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子、１０〜１０，０００ＩＵの白血病抑制因子を含有することが可能である。本発明は更に、上記の方法に基づいて単離された哺乳動物の多能性成体幹細胞の培養クローン集団を提供するものである。

【0027】

本発明は、ＭＡＳＣ由来細胞及び分化した子孫を永久的及び／または条件的に不死化するための方法であって、ＭＡＳＣまたは分化した子孫にテロメラーゼを導入する工程を含む方法を提供するものである。

【0028】

本発明は、完全に同種異系の多能性幹細胞、誘導した造血幹細胞、または子孫細胞を哺乳動物に投与して、後の多能性幹細胞由来の組織移植や他の臓器移植のために哺乳動物に免疫寛容を誘導することにより哺乳動物の造血及び免疫系を再構成するための方法を提供するものである。

【0029】

本発明は、適当な成長因子を投与し、細胞を増殖させることによって、未分化の多能性幹細胞を分化した毛嚢へと増殖させる方法を提供するものである。

【0030】

本発明は上記に述べた細胞の多くの用途を提供するものである。例えば、本発明は、単離細胞を使用するための方法であって、該細胞の集団を子宮内移植して細胞または組織をキメラ化することにより、移植後に出生前または出生後のヒトまたは動物の体内でヒト細胞を産生し、該細胞が治療効果を有する酵素、タンパク質や他の産物をヒトまたは動物体内で産生して遺伝子異常を修正する方法を提供するものである。本発明は更に、治療処置を必要とする患者の遺伝子治療において上記の細胞を使用するための方法であって、所望の遺伝子産物をコードする予め選択した単離ＤＮＡを前記細胞に導入することによって細胞を遺伝子改変し、培養中で該細胞を増殖させ、該細胞を前記患者の体内に導入して所望の遺伝子産物を産生させる方法を提供するものである。

【0031】

本発明は、培養中で上記の単離多能性成体幹細胞を増殖させ、増殖させた該細胞の有効量を損傷組織を修復する必要のある患者の損傷組織と接触させることによって、患者の組織を修復する方法を提供するものである。当該細胞は患者の体内に局所的注入または全身的注入により導入することが可能である。当該細胞は適当なマトリクスインプラントとともに患者の体内に導入することが可能である。こうしたマトリクスインプラントは、更なる遺伝子物質、サイトカイン、成長因子や当該細胞の増殖及び分化を促進する他の因子を与えるようなものであってもよい。当該細胞は患者の体内への導入に先立ってポリマーカプセルなどにカプセル化することが可能である。

【0032】

本発明は、ヒト患者において感染因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、多能性成体幹細胞を増殖させたクローン集団を培養中で遺伝子改変することによって感染因子に対する防御免疫応答反応を引き起こす１以上の予め選択した抗原分子を発現させる工程と、患者の体内に免疫応答を誘導するうえで有効量の遺伝子改変細胞を導入する工程とを含む方法を提供するものである。この方法は、多能性成体幹細胞を樹状細胞に分化させる工程を第２工程の前に更に含んでいてもよい。

【0033】

本発明は、生理学的異常に関連した遺伝子多型を特定するためにＭＡＳＣを使用するための方法であって、表現型データを得ることが可能な個人の統計的に有意な集団からＭＡＳＣを単離する工程と、前記統計的に有意な個人の集団から得たＭＡＳＣを培養増殖してＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、前記培養ＭＡＳＣにおいて少なくとも１つの遺伝子多型を特定する工程と、前記培養ＭＡＳＣを分化誘導する工程と、正常な遺伝子型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンと特定された遺伝子多型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンとを比較することにより前記少なくとも１つの遺伝子多型に関連した異常代謝プロセスを特徴付けする工程とを含む方法を提供するものである。

【0034】

本発明は更に、哺乳動物における癌を治療するための方法であって、多能性成体幹細胞を遺伝子改変して腫瘍障害性タンパク質、抗血管新生タンパク質、または腫瘍細胞表面で発現されるタンパク質を、抗原に対する免疫応答刺激に関連したタンパク質とともに発現させる工程と、前記哺乳動物に前記遺伝子改変多能性成体幹細胞の有効抗癌量を導入する工程とを含む方法を提供するものである。

【0035】

本発明は、生物学的または生理学的因子に対する細胞応答を特徴付けるためにＭＡＳＣを使用する方法であって、統計的に有意な個人の集団からＭＡＳＣを単離する工程と、前記統計的に有意な個人集団から得られたＭＡＳＣを培養増殖して複数のＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、前記ＭＡＳＣ培養を１以上の生物学的または生理学的因子と接触させる工程と、前記１以上の生物学的または生理学的因子に対する１以上の細胞応答を特定する工程と、前記統計的に有意な集団の個人から得られた複数のＭＡＳＣ培養の前記１以上の細胞応答を比較する工程とを含む方法を提供するものである。

【0036】

本発明は更に、特異的に分化した細胞を治療に使用するための方法であって、特異的に分化した細胞をこれを必要とする患者に投与することからなる方法を提供するものである。本発明は更に、遺伝子操作した多能性幹細胞を内在性遺伝子または導入遺伝子を選択的に発現させるために利用する利用方法、ならびに、病気を治療するためにｉｎ ｖｉｖｏで増殖させたＭＡＳＣを動物への移植／投与に利用する利用方法を提供するものである。例えば、多能性幹細胞すなわちＭＡＳＣから誘導した神経網膜細胞を利用して、特に黄斑変性、糖尿病性網膜疾患、緑内障、色素性網膜炎などによって生ずる神経網膜疾患などによる失明を治療することが可能である。本発明の細胞は哺乳動物の体内に細胞を定着させるために利用することが可能であり、自家、同種異系、異種の細胞を投与して該哺乳動物の組織特異的な代謝的、酵素的、凝固的、構造的機能などを回復または改変することが可能である。本発明の細胞は哺乳動物の体内に細胞を定着させるために利用することが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞分化を誘導することが可能である。本発明の細胞は哺乳動物の体内に分化した幹細胞を投与するために利用することも可能である。本発明の細胞やそのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの子孫を利用して遺伝子疾患、変性性疾患、心臓血管疾患、代謝蓄積症、神経疾患または癌などの病態を治療することが可能である。本発明の細胞を用いて歯周病を治療するための歯肉様材料を作成することが可能である。本発明の細胞を用いて皮膚移植や形成手術に利用可能な多能性幹細胞由来の皮膚上皮組織を発生させることが可能である。本発明の細胞を用いて陰茎や心臓などの筋肉を増強することが可能である。本発明の細胞を用いて治療用途の血液をｅｘ ｖｉｖｏで作成したり、出生前または出生後の動物の体内でヒトに用いるためのヒト造血細胞及び／または血液を作成することが可能である。本発明の細胞は癌治療や自己免疫疾患の治療において化学療法や放射線療法からの患者の回復を助けたり、レシピエントに免疫寛容を誘導するための治療手段として使用することが可能である。本発明の細胞を利用してＡＩＤＳや他の感染症を治療することが可能である。

【0037】

本発明の心筋細胞またはＭＡＳＣを利用して、特に心筋炎、心筋症、心不全、心臓発作による障害、高血圧、アテローム性動脈硬化、心臓弁機能障害などの心臓疾患を治療することが可能である。遺伝子操作を施した多能性哺乳動物由来幹細胞または分化したその子孫を利用して中枢神経系の欠損または損傷にともなう疾患を治療することが可能である。更に、多能性哺乳動物由来幹細胞または神経関連細胞に分化した該細胞を利用して、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳにともなう痴呆、脊椎損傷、脳や他の神経系に影響する代謝性疾患などの神経の欠損や変性にともなう疾患を治療することが可能である。

【0038】

多能性哺乳動物由来幹細胞または間質細胞などに分化したその子孫を利用して、造血細胞、膵臓小島またはβ細胞、肝細胞などの他の細胞の分化や増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて支援することが可能である。本発明の幹細胞または軟骨に分化したその子孫を利用して軟骨断裂、軟骨菲薄化、変形性関節炎などの間接や軟骨の疾患を治療することが可能である。更に、本発明の幹細胞または骨芽細胞に分化したその子孫を利用して、骨折、非治癒性骨折、変形性関節炎や、前立腺癌、乳癌、多発性骨髄腫などの骨に転移した腫瘍によって生ずる骨の「孔」などの、骨に悪影響を与える病態を改善することが可能である。

【0039】

本発明は更にヒト患者において防御的免疫応答を誘導するための免疫感作を与えるキットを提供するものである。このキットには、骨髄吸引液から多能性成体幹細胞を単離するための培地及び抗体、単離多能性成体幹細胞を培養するための培地及び細胞因子、及び抗原分子を産生するように多能性成体幹細胞を遺伝子改変するための遺伝子要素が別梱されて含まれている。当該キットには更に、多能性成体幹細胞を組織特異的な細胞に分化させるうえで有効な培地及び細胞因子が含まれる場合もある。遺伝子要素としてはウイルスベクターを使用することが可能であり、このウイルスベクターは細菌またはウイルス由来の１以上の抗原をコードしたヌクレオチド配列を有していてもよい。この遺伝子要素としては、細菌、ウイルス、または寄生虫の抗原をコードしたヌクレオチド配列を有するプラスミドを使用することも可能である。このプラスミドにはリン酸カルシウムトランスフェクション用の要素が同梱される場合もある。遺伝子要素としては、癌細胞に共通する抗原をコードしたヌクレオチド配列を有するベクターを使用することが可能である。更に遺伝子要素として寄生生物の抗原をコードしたヌクレオチド配列を有するベクターを使用することも可能である。

【0040】

本発明は更に上記に述べたような多能性幹細胞の遺伝子プロファイリングのための方法、ならびにデータバンクにおけるこの遺伝子プロファイリングの使用方法を提供するものである。本発明は更に薬の探索を助けるためにデータベースにおいて上記に述べたような遺伝子プロファイルされた多能性幹細胞を使用する使用方法を提供するものである。
・本発明はさらに以下を提供し得る：
・（項目１） 表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ４５、ならびにＨＬＡクラスＩおよびII陰性であることを特徴とする単離多能性哺乳動物幹細胞。
・（項目２） 表面抗原ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ならびにＨＬＡクラスＩおよびII陰性であることを特徴とする項目１記載の単離細胞。
・（項目３） 表面抗原ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ＨＬＡクラスＩ陰性であり、かつｏｃｔ３／４ｍＲＮＡ陽性であることを特徴とする項目２記載の単離細胞。
・（項目４） 表面抗原ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ＨＬＡクラスＩ陰性であり、かつｏｃｔ３／４ｍＲＮＡおよびｈＴＲＴ ｍ
ＲＮＡ陽性であることを特徴とする項目３記載の単離細胞。
・（項目５） 表面抗原ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、およびＣＤ６２Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、Ｓｔｒｏ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、ＣＤ４４、ＨＬＡクラスＩ、および２−ミクログロブリン陰性であり、かつＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１およびＴＧＦ−Ｒ２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａおよびＰＤＧＦ−Ｒ１ｂ陽性であることを特徴とする項目４記載の単離細胞。
・（項目６） 転写因子ｏｃｔ３／４、ＲＥＸ−１及びＲｏｘ−１を発現する単離多能性非胚性非生殖細胞系細胞。
・（項目７） 成長因子ＬＩＦに応答するとともにＬＩＦに対する受容体を有する、出生後の哺乳動物に由来する単離多能性細胞。
・（項目８） 中胚葉、外胚葉、及び内胚葉由来の分化細胞の少なくとも１種類に分化誘導が可能であることを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目９） 少なくとも、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、及び乏突起膠細胞の細胞タイプの細胞に分化誘導が可能であることを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目１０）ヒト細胞であることを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目１１）マウス細胞であることを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。・（項目１２）胎児、新生児、子供、または成人から得られることを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目１３）新生児、子供、または成人から得られることを特徴とする請求項１、６または７記載の単離細胞。
・（項目１４）臓器に由来することを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目１５）上記臓器が骨髄、肝臓、または脳であることを特徴とする請求項１４記載の単離細胞。
・（項目１６）骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、造血細胞、グリア細胞、神経性細胞、または乏突起膠細胞であることを特徴とする、項目１、６または７の単離細胞から得られる分化した子孫細胞。
・（項目１７）皮膚上皮細胞、肝上皮細胞、膵臓上皮細胞、膵臓内分泌細胞または小島細胞、膵臓外分泌細胞、消化管上皮細胞、腎臓上皮細胞、または表皮関連構造であることを特徴とする項目１６記載の分化した子孫細胞。
・（項目１８）上記表皮関連構造が毛嚢であることを特徴とする項目１７記載の分化した子孫細胞。
・（項目１９）歯の周囲の軟部組織または歯を形成することを特徴とする請求項１６記載の分化した子孫細胞。
・（項目２０）予め選択された単離ＤＮＡの挿入、予め選択された単離ＤＮＡによる細胞ゲノムのセグメントの置換、または細胞ゲノムの少なくとも一部の欠失あるいは不活化によってゲノムが改変されている項目１、６または７記載の単離多能性成体幹細胞からなる単離形質転換多能性哺乳動物幹細胞。
・（項目２１）ゲノムがウイルスによる形質導入によって改変されることを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。
・（項目２２）ゲノムがウイルスベクターの組み込みによるＤＮＡの挿入によって改変されることを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。
・（項目２３）ゲノムがＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いて改変されることを特徴とする項目２１または２２記載の単離形質転換細胞。
・（項目２４）不活化したい細胞ゲノムの部分の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸分子を使用して細胞ゲノムの一部が不活化されることを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。
・（項目２５）不活化したい細胞ゲノムの部分の配列を標的としたリボザイム配列を用いて細胞ゲノムの一部が不活化されることを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。・（項目２６）改変ゲノムを有する子孫細胞またはその子孫と、改変していないゲノムを有する子孫細胞との区別を可能とするように発現される、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子の遺伝子配列を改変ゲノムは有することを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。
・（項目２７）上記マーカーは、緑色、赤色、黄色の蛍光タンパク質、β−ｇａｌ、Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ^ｍ、またはヒグロマイシンである項目２６記載の単離形質転換細胞。
・（項目２８）タンパク質、酵素または他の細胞産物の発現を調節する誘導可能なプロモーターや他の制御機構によって調節することが可能な遺伝子を発現することを特徴とする項目２０記載の単離形質転換細胞。
・（項目２９）テロメラーゼを高レベルで発現し、同じドナーから得られたリンパ球のテロメアと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での増殖後に長いテロメアを維持することを特徴とする項目１、６または７記載の単離細胞。
・（項目３０）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養での増殖後に約１１〜１６ＫＢの長さのテロメアを維持することを特徴とする項目２８記載の単離形質転換細胞。
・（項目３１）ｏｃｔ３／４の発現レベルを調整する因子を含む、未分化の多能性幹細胞の継続的増殖または分化を促進するための細胞分化溶液。
・（項目３２）多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を単離するための方法であって、
（ａ）骨髄単核細胞からＣＤ４５^＋グリコフォリンＡ^＋細胞を枯渇させる工程と、
（ｂ）ＣＤ４５⁻グリコフォリンＡ⁻細胞を回収する工程と、
（ｃ）回収したＣＤ４５⁻グリコフォリンＡ⁻細胞をマトリクスコーティング上に播種する工程と、
（ｄ）播種した細胞を生長因子を補った培地中で培養する工程とを含む方法。
・（項目３３）上記枯渇工程が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用したネガティブまたはポジティブ選択を含むことを特徴とする項目３２記載の方法。
・（項目３４）上記成長因子が、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、及びＬＩＦから選択されることを特徴とする項目３２記載の方法。
・（項目３５）上記（ｄ）工程が更に、デキサメタゾン、リノレイン酸、及び／またはアスコルビン酸を補った培地中で培養することを含むことを特徴とする項目３２記載の方法。
・（項目３６）単離多能性成体幹細胞の培養方法であって、インスリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、リノレイン酸、デキサメタゾン、及び血小板由来成長因子を含有した無血清または低血清培地に細胞を加える工程を含む方法。
・（項目３７）上記無血清または低血清培地が、ＭＣＤＢと混合した低グルコースＤＭＥＭであることを特徴とする項目３６記載の方法。
・（項目３８）インスリンが約１０〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする項目３６記載の方法。
・（項目３９）上記無血清または低血清培地が０よりも高く約１０μｇ／ｍｌよりも低い濃度の有効量のトランスフェリンを含有することを特徴とする請求項３６記載の培養方法。
・（項目４０）セレニウムが約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする項目３６記載の培養方法。
・（項目４１）ウシ血清アルブミンが約０．１〜約５μｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする項目３６記載の培養方法。
・（項目４２）リノレイン酸が約２〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする項目３６記載の培養方法。
・（項目４３）デキサメタゾンが約０．００５〜約０．１５μＭの濃度で存在することを特徴とする項目３６記載の培養方法。
・（項目４４）上記無血清培地または低血清培地が、約０．０５〜０．２ｍＭのＬ−アスコルビン酸を含有することを特徴とする項目３６記載の方法。
・（項目４５）上記無血清培地または低血清培地が、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子、１０〜１０，０００ＩＵの白血病抑制因子を含有することを特徴とする項目３６記載の方法。
・（項目４６）項目３２の方法に基づいて単離された哺乳動物の多能性成体幹細胞の培養クローン集団。
・（項目４７）ＭＡＳＣ由来細胞及び分化した子孫を永久的及び／または条件的に不死化するための方法であって、ＭＡＳＣまたは分化した子孫にテロメラーゼを導入する工程を含む方法。
・（項目４８）哺乳動物の造血及び免疫系を再構成するための方法であって、完全に同種異系の多能性幹細胞、誘導した造血幹細胞、または子孫細胞を哺乳動物に投与して、後の多能性幹細胞由来の組織移植や他の臓器移植のために哺乳動物に免疫寛容を誘導する工程を含む方法。
・（項目４９）未分化の多能性幹細胞を分化した毛嚢へと増殖させるための方法であって、適当な成長因子を投与する工程と、細胞を増殖させる工程とを含む方法。
・（項目５０）項目１、６または７記載の単離細胞を使用するための方法であって、上記細胞の集団を子宮内移植して細胞または組織をキメラ化することにより、移植後に出生前または出生後のヒトまたは動物の体内でヒト細胞を産生させる工程を含み、上記細胞が治療効果を有する酵素、タンパク質や他の産物をヒトまたは動物体内で産生して遺伝子異常を修正することを特徴とする方法。
・（項目５１）治療処置を必要とする患者の遺伝子治療において項目１、６または７記載の単離細胞を使用するための方法であって、
（ａ）所望の遺伝子産物をコードする予め選択した単離ＤＮＡを上記細胞に導入することによって細胞を遺伝子改変する工程と、
（ｂ）培養中で上記細胞を増殖させる工程と、
（ｃ）上記細胞を上記患者の体内に導入して所望の遺伝子産物を産生させる工程とを含む方法。
・（項目５２）損傷した組織を修復する必要のある患者の組織を修復する方法であって、
（ａ）培養中で項目１、６または７記載の単離細胞を増殖させる工程と、
（ｂ）増殖させた上記細胞の有効量を上記患者の損傷組織と接触させる工程とを含む方法。
・（項目５３）上記細胞は上記患者の体内に局所的注入により導入されることを特徴とする項目５１または５２記載の方法。
・（項目５４）上記細胞は上記患者の体内に全身的注入により導入されることを特徴とする５１または５２記載の方法。
・（項目５５）上記細胞は適当なマトリクスインプラントとともに上記患者の体内に導入されることを特徴とする項目５１または５２記載の方法。
・（項目５６）上記マトリクスインプラントは、更なる遺伝子物質、サイトカイン、成長因子や上記細胞の増殖及び分化を促進する他の因子を与えることを特徴とする項目５１または５２記載の方法。
・（項目５７）上記細胞は上記患者の体内への導入に先立ってカプセル化されることを特徴とする項目５１または５２記載の方法。
・（項目５８）上記カプセル化した細胞はポリマーカプセル内に包含されることを特徴とする項目５７記載の方法。
・（項目５９）ヒト患者において感染因子に対する免疫応答を誘導するための方法であって、
（ａ）項目１、６または７記載の多能性成体幹細胞を増殖させたクローン集団を培養中で遺伝子改変することによって感染因子に対する防御免疫応答反応を引き起こす１以上の予め選択した抗原分子を発現させる工程と、
（ｂ）上記患者の体内に免疫応答を誘導するうえで有効量の上記遺伝子改変細胞を導入する工程とを含む方法。
・（項目６０）多能性成体幹細胞を樹状細胞に分化させる工程を上記（ｂ）工程の前に更に含む項目５９記載の方法。
・（項目６１）生理学的異常に関連した遺伝子多型を特定するためにＭＡＳＣを使用するための方法であって、
（ａ）表現型データを得ることが可能な個人の統計的に有意な集団からＭＡＳＣを単離する工程と、
（ｂ）上記統計的に有意な個人の集団から得たＭＡＳＣを培養増殖してＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、
（ｃ）上記培養ＭＡＳＣにおいて少なくとも１つの遺伝子多型を特定する工程と、
（ｄ）上記培養ＭＡＳＣを分化誘導する工程と、
（ｅ）正常な遺伝子型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンと特定された遺伝子多型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンとを比較することにより上記少なくとも１つの遺伝子多型に関連した異常代謝プロセスを特徴付けする工程とを含む方法。
・（項目６２）哺乳動物における癌を治療するための方法であって、
（ａ）項目１、６または７記載の多能性成体幹細胞を遺伝子改変して腫瘍障害性タンパク質、抗血管新生タンパク質、または腫瘍細胞表面で発現されるタンパク質を、抗原に対する免疫応答刺激に関連したタンパク質とともに発現させる工程と、
（ｂ）上記哺乳動物に上記遺伝子改変多能性成体幹細胞の有効抗癌量を導入する工程とを含む方法。
・（項目６３）生物学的または生理学的因子に対する細胞応答を特徴付けるためにＭＡＳＣを使用する方法であって、
（ａ）統計的に有意な個人の集団からＭＡＳＣを単離する工程と、
（ｂ）上記統計的に有意な個人集団から得られたＭＡＳＣを培養増殖して複数のＭＡＳＣ培養を樹立する工程と、
（ｃ）上記ＭＡＳＣ培養を１以上の生物学的または生理学的因子と接触させる工程と、
（ｄ）上記１以上の生物学的または生理学的因子に対する１以上の細胞応答を特定する工程と、
（ｅ）上記統計的に有意な集団の個人から得られた複数のＭＡＳＣ培養の上記１以上の細胞応答を比較する工程とを含む方法。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１ａおよび１ｂは、本発明の未分化ＭＡＳＣｓの写真である。ＣＤ４５の発現及びグリコフォリンＡの発現を欠いた細胞を免疫磁気ビーズ枯渇法及びＦＡＣＳによって選別した。選別後に回収された細胞は小型の芽細胞であった（図１ａ）。フィブロネクチンコーティングした９６穴プレートのウェル中、ＤＭＥＭ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸からなる合成培地に５０００個の細胞を播いた。７〜２１日後に接着細胞の小さなコロニーが形成された（図１ｂ）。

【0042】

【図2】図２は、培養におけるＭＡＳＣｓの増殖速度を示すグラフである。フィブロネクチンコーティングした９６穴プレートのウェル中、ＤＭＥＭ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸からなる合成培地に２％ＦＣＳを加えたものと加えないものとにＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞を播いた。細胞がほぼコンフルエンスに達した時点で細胞をトリプシン処理して回収し、同じ培養条件下で１：４の希釈率で毎週２回継代培養した。

【0043】

【図3】図３は、２３および３５回の細胞分裂の間、２ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２の再播種密度で培養した、年齢３５歳のドナーからのＭＡＳＣｓのテロメア長を示す。テロメア長は常法により求めた。テロメア長は９ｋＢであった。これは同じドナーから得た血中リンパ球のテロメア長よりも３ｋＢ長かった。それぞれ１０回及び２５回の細胞分裂後にテロメア長を評価し、更に３５回の細胞分裂後にテロメア長を評価したところ変化は見られなかった。コントロールとしてＨＬ６０細胞（短いテロメア）及び２９３細胞（長いテロメア）を測定した。

【0044】

【図4】図４は、本発明のＭＡＳＣｓのために発明者が用いた培養、形質導入、分化、および分化の確認のための一般的プロトコルを示す。図に示すように培養後にｅＧＦＰを有するレトロウイルスベクターによる形質導入を行った。ほぼコンフルエンスに達したＭＡＳＣを、１０μｇ／ｍＬのプロタミンの存在下、ＭＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸）中で調製したＭＦＧ−ｅＧＦＰを含むＰＡ３１７上清に連続２日間、６時間づつ曝露した。最後の形質導入の２４時間後に細胞をトリプシン処理してＦＡＣＳによる選択を行った。３０〜７０％のＭＡＳＣがｅＧＦＰ陽性であった。ＦＡＣＳ上でＡＣＤＵ装置を用い、ＦＮコーティングして同じ培地を入れた９６穴プレートのウェル１個当たり１〜１００個のｅＧＦＰ陽性細胞を選別した。これらのウェルの内、ウェル当たり１０個の細胞が入ったプレート１枚につき約２個のウェルにおいてＭＡＳＣの子孫が生じた。ここからクローンを培養増殖させた。増殖させた細胞の８〜１０個の継代集団が異なる分化経路に沿って分化誘導された。図に示す方法によって分化を確認した。

【0045】

【図5】図５は、本発明のＭＡＳＣｓを分化誘導して、骨芽細胞、軟骨芽細胞(chondroblasts)、および示されたような脂肪細胞を形成するために本発明者が用いた分化プロトコルを示す。図中、最終分化を誘導するうえで必要なサイトカインと最終分化の誘導を証明するための適当な試験が示してある。

【0046】

【図6】図６は、１０^−７Ｍデキサメタゾン、β―グリセロホスフェート、および１０ｍＭのアスコルビン酸で誘導した後、培養１５日目の骨シアロタンパク質の免疫組織染色、ならびに７、１１、および１４日目の骨シアロタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。中央のパネルは、軟骨についてトルイジンブルー染色を行った結果と、７、１１及び１４日目にＩＩ型コラーゲンについてウェスタンブロット分析を行った結果であり、１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を加えた無血清培地中でＭＡＳＣをマイクロマス培養した後に軟骨細胞に分化したことを示すものである。一番下のパネルでは、１４日目のオイルレッド染色及びＰＰＡＲｇについてのウェスタンブロット分析の結果によって１０％ウマ血清によるＭＡＳＣの処理後の分化が示されている。

【0047】

【図7】図７は、筋肉タンパク質のウェスタンブロットを示す。パネルＡはコンフルエンスに達したＭＡＳＣを３μＭの５−アザシチジンと２４時間培養した結果を示したものである。この後、培養をＭＡＳＣ増殖培地（ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、トランスフェリン、セレニウム、ウシ血清アルブミン、デキサメタゾン、リノレイン酸、インスリン、及びアスコルビン酸）中に維持した。分化はウェスタンブロットによって評価した。５−アザシチジンによる誘導の５日後に、細胞の約５０％においてＭｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ及びＭｙｆ６転写因子が検出された。１４〜１８日後には、Ｍｙｏ−Ｄの発現レベルは大幅に低下したが、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６は高値に保たれた。誘導後４日目にはデスミン及び骨格筋アクチンが検出され、骨格筋ミオシンが１４日目に検出された。免疫組織化学法により、１４日後に７０〜８０％の細胞が成熟筋タンパク質を発現していることが示された（図示せず）。５−アザシチジンまたはレチノイン酸による処理により、培養の第１週目においてＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現された。更に、２日目以降に低レベルのトロポニンＴが検出され、このことは、心筋トロポニンＴが胚性骨格筋中に見出されることから、胎児筋肉が生成されたことを示している。誘導２日後に平滑筋アクチンが検出され、１４日後まで高値に維持された。パネルＢでは無血清培地中に１４日間維持し、コンフルエンスに達したＭＡＳＣに唯一のサイトカインとして１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを添加した。平滑筋マーカーの存在をウエスタンブロットにより評価した。２日目以降には平滑筋アクチンが、６日目以降には平滑筋ミオシンが検出された。１５日目には免疫組織化学法によって細胞の約７０％が抗平滑筋アクチン／ミオシン抗体により陽性染色された。４日目以降にはミオゲニンの、６日目以降にはデスミンの存在が確認された。２〜４日後にはＭｙｆ５及びＭｙｆ６タンパク質が検出され、１５日目まで高値を維持した。Ｍｙｏ−Ｄは検出されなかった。

【0048】

パネルＣでは、コンフルエンスに達したＭＡＳＣをレチノイン酸に曝露した後、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを加えた無血清培地中で培養した。この後細胞をウェスタンブロットで分析した。２日後にはＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現され、１５日目まで高値を維持した。４日目以降には心筋トロポニンＴが発現され、６日目以降には心筋トロポニンＩが発現され、１１日後にＡＮＰが検出された（図示せず）。１５日目には免疫組織化学法によってこれらの心筋タンパク質は７０％を越える細胞において検出された（図示せず）。２日目以降には転写因子Ｍｙｆ６が見出された。デスミンの発現が６日目に、ミオゲニンの発現が２日目に始まった。骨格筋アクチンも確認された。発明者等は更に、培養中で稀に自然収縮が生じ、数ｍｍの距離を伝播するのを確認した。

【0049】

【図8】図８は、筋芽細胞と筋管とが融合によって多核筋管を形成した状態を示す顕微鏡写真である。ＭＡＳＣにｅＧＦＰを形質導入した集団を５−アザシチジンで２４時間誘導し、ＭＡＳＣ増殖培地中に維持して得られた筋芽細胞を同じドナーから得られたｅＧＦＰを形質導入していないＭＡＳＣから得られた筋芽細胞と共培養した。筋管を誘導するため、ＭＡＳＣ由来筋芽細胞（非形質転換ＭＡＳＣを５−アザシチジンで２４時間誘導した後、ＭＡＳＣ増殖培地中に１４日間維持して得られたもの）を１０％ウマ血清とＤＭＥＭ中で培養した。多核化細胞が形成された時点で筋管をＰＫＨ２６（赤色の膜色素）とインキュベートし、洗浄して、１０％ウマ血清の存在下で上記に述べたように調製したｅＧＦＰを形質導入した筋管と共培養した。２日後に細胞を蛍光顕微鏡下で調べた。顕微鏡写真にはｅＧＦＰ陽性筋芽細胞がＰＫＨ２６で標識された筋管と融合した状態が示されている。

【0050】

【図9】図９は、本発明のＭＡＳＣｓからの内皮細胞分化を誘導するために本発明において用いられた方法、および内皮細胞分化を検出するために用いられたマーカーを示す。

【0051】

【図10】図１０は、内皮細胞分化を確認するための、フォン・ヴィレブランド因子およびＣＤ３４マーカーに関する免疫蛍光染色、ならびに内皮細胞表面受容体Ｔｉｅ／Ｔｅｋに関するウェスタンブロット分析の一連の写真を示す。多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）はＦｌｋ１を発現したが、ＣＤ３４、ＰＥＣＡＭ、Ｅ−及びＰ−セレクチン、ＣＤ３６、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ及びＦｌｔ１は発現しなかった。ＭＡＳＣを２０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦを添加した無血清ＭＡＳＣ培地で培養した場合、１４日目までに細胞表面にＣＤ３４が発現され、細胞がｖＷＦを発現するのを確認した（免疫蛍光法）。更に細胞は７、１１及び１４日目にウェスタンブロット分析により示されたようにＴｉｅ／Ｔｅｋを発現した。ＶＥＧＦによって誘導した細胞をマトリゲルまたはＩＶ型コラーゲン上で培養すると血管形成が観察された。

【0052】

【図11】図１１は、ＭＡＳＣｓをＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ、Ｔｐｏ、およびＥｐｏと共に１４日間培養し、その後、造血支持フィーダーＡＦＴ０２４を用いてＳＣＦおよびＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中において培養することによって、ＭＡＳＣｓが、アストロサイト、乏突起膠細胞、及び神経性細胞に分化することを示す一連の顕微鏡写真である。細胞は、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（アストロサイト）、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）（乏突起膠細胞）、及びニューロフィラメント−６８及び２００（ニューロン）に対する抗体によって標識した。

【0053】

【図12】図１２は、１００ng/mLのｂＦＧＦと共に、フィブロネクチンコートウェル中において、低密度ＭＡＳＣｓを培養した際に、ニューロンが発生することを示す一連の顕微鏡写真である。２０±２％の細胞がβ−チューブリンＩＩＩについて陽性染色され、２２±３％がニューロフィラメント−６８について陽性染色され、５０±３％がニューロフィラメント−１６０について陽性染色され、２０±２％がニューロフィラメント−２００について陽性染色され、８２±５％がニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）について陽性染色され、８０±２％が微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）について陽性染色された。ニューロン１個当たりの軸索の数は分化後２、３〜４週後に３±１個〜５±１個及び７±２個に増加した。図には示されていないが、培養２週間後には、２６±４％の細胞がＧＦＡＰ陽性であり、２８±３％がＧａｌＣ陽性であったのに対し、４週後ではＧＦＡＰまたはＧａｌＣ陽性細胞は減少した。

【0054】

【図13】図１３は、ＧＦＡＰ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびニューロフィラメント−２００、ｘ、ｘに関するＲＴ−ＰＣＲの結果およびウェスタンブロット分析、及びｂＦＧＦによるＭＡＳＣの誘導後の日数を示す。

【0055】

【図14】図１４は、ＭＡＳＣｓからの神経発生に対する、１００ng/mLのｂＦＧＦ、あるいは１０ng/mLのＦＧＦ−９、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−４、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、またはＣＮＴＦの影響を示す。分化した細胞の性質はＧＦＡＰ、ＧａｌＣ、ニューロフィラメント２００、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＡＢＡ及びパルブアルブミン、ならびにアセチルコリン（ＣＡＴ）に対する抗体を用いた免疫組織化学法によって特定した。ｂＦＧＦとともに３週間培養すると、ＭＡＳＣはニューロン、アストロサイト、及び乏突起膠細胞に分化した。ＧＡＢＡ、パルブアルブミン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡ−デカルボキシラーゼ、またはトリプトファンヒドロキシラーゼは検出されなかった。１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９及びＥＧＦとともに３週間培養すると、ＭＡＳＣはアストロサイト、乏突起膠細胞、及びＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロンを生じた。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８及びＥＧＦとともに３週間培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンの両方を生じる。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０及びＥＧＦとともに３週間培養するとアストロサイト及び乏突起膠細胞を生じたがニューロンは発生しなかった。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４及びＥＧＦにて３週間処理するとアストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニューロンには分化しなかった。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ及びＥＧＦにて処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞のみへの分化が見られた。ＧＤＮＦとともに培養するとＭＡＳＣはＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロンに分化した。培養すると３週間後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみへの分化が見られた。

【0056】

【図15】図１５は、ウィスターラットの脳において中大脳動脈の結紮によって生じさせた頭頂梗塞の周りへの未分化ＭＡＳＣｓの移植の効果を示す。ラットにはシクロスポリンを継続投与し、麻痺した四肢の機能をＭＡＳＣの注入の６週間後に調べた。コントロールとして動物に生理食塩水またはＭＡＳＣにより調整した培地を注入した。ＭＡＳＣまたはコントロール溶液の移植後６週目に四肢の定位機能について検定した結果を示した。ＭＡＳＣを移植したラットにおいてのみ擬似移植を行った動物のレベルに比肩する機能改善が見られた。

【0057】

【図16】図１６は、ウィスターラットの脳において中大脳動脈の結紮によって生じさせた頭頂梗塞の周りへの未分化ＭＡＳＣｓの移植の効果を示す。ラットにはシクロスポリンを継続投与し、麻痺した四肢の機能をＭＡＳＣの注入の６週間後に調べた。２及び６週間後に動物を殺して神経に係る表現型を決定した。ｅＧＦＰ^＋細胞の移植後の脳が自己蛍光を発することから、移植片の免疫組織化学的分析を行う必要があった。２週目ではｅＧＦＰ^＋細胞の大半が移植領域自体において検出された。６週後ではｅＧＦＰ^＋細胞は移植片の外部に移動した。２週目では抗ｅＧＦＰ抗体で染色された細胞は球形状を維持し、その直径は１０〜３０μｍの範囲であった。６週後ではｅＧＦＰ^＋細胞は大幅に縮小しており、移植領域には正常な脳組織へと延出する神経突起が見られた。ヒト特異的核抗体であるＮｕＭａによる染色によってヒト細胞の存在が確認された（図示せず）。この抗体によれば免疫蛍光抗体による２重及び３重の染色が可能であり、移植片中のヒト細胞を特定するために将来的に利用されるであろう。

【0058】

本発明者等は、ヒト特異的抗ネスチン抗体を利用してＮｕＭａ陽性細胞及びＧＦＰ^＋細胞と同じ場所にネスチン陽性細胞の小集団を検出した。このことは神経外胚葉の分化を示すものである。更に発明者等は、βチューブリンＩＩＩ、ニューロフィラメント−６８及び−１６０、オリゴマーカー、及びＧＦＡＰについて陽性染色を確認した。このことは神経細胞及びグリア細胞への分化を示すものである。

【0059】

【図17】図１７は、ＨＧＦおよびＫＧＦでＭＡＳＣｓを処理した後の、サイトケラチン１８および１９に関する免疫組織化学分析およびウェスタンブロット分析を示す。１４日後、サイロケラチン１８及び１９を発現する大型の上皮様細胞が見られた。

【発明を実施するための形態】

【0060】

発明の詳細な説明
ある系統にコミットした幹細胞において「クローニングプロセス」または「トランス−分化」において起きるのと同様の遺伝的再プログラミングが起きるか否かは分かっていない。本発明は、多様な臓器（例えば骨髄、肝臓、脳）に発生した後でさえ、それら臓器から精製し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した場合に残存する多能性幹細胞は、明らかな老化無しに増殖することができ、さらに、その幹細胞が由来する組織とは異なる多様な細胞型に分化することができることを示している。「可塑性」を有する様々な臓器由来の幹細胞の表現型は類似している（ＣＤ４５⁻ＣＤ４４⁻ＨＬＡ⁻ＤＲ⁻ＨＬＡクラスＩ⁻ｏｃｔ３／４ｍＲＮＡ^＋およびｈＴＲＴ^＋）。さらには、そのような幹細胞の特徴は、例えば、始原生殖細胞（幹細胞がその直接の子孫であって差し支えない）の特徴に類似する。

【0061】

本発明は、骨髄細胞のごく一部、ならびに脳および肝臓中の細胞が、通常、ＥＳおよびＥＧ細胞でのみ認められる遺伝子（ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１）を発現することの証拠を有する。さらには、本発明は、ｏｃｔ−４／ｅＧＦＰ構成物に関して形質転換した新生マウスの骨髄および脳においてｅＧＦＰ^＋細胞を検出し、さらに、ｏｃｔ−４発現細胞が、後胚期の生殖細胞以外の組織に存在することを示している。従って、少数の幹細胞が成人してからもずっと残存し、多能性を有する様々な臓器中において生存している。このことは異なる臓器に由来する幹細胞において見られる可塑性を説明するものである。

【0062】

多能性幹細胞の選択及び表現型
本発明は、骨細胞、軟骨、脂肪細胞、繊維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋、平滑筋、心筋、内皮、上皮細胞（ケラチノサイト）、造血細胞、グリア細胞、神経細胞、及び乏突起膠細胞の前駆細胞へと分化することが可能な、ヒトまたはマウス（または他の生物種）の成体、新生児、または胎児から単離される多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を提供するものである。これらの細胞はこれまでに述べられているいずれの成体由来幹細胞よりも胚性幹細胞に近い分化表現型を示す。

【0063】

ここに述べられる多能性成体幹細胞は本発明者等によって開発された方法によって単離されたものである。発明者等はＭＡＳＣを特徴付ける多くの特異的細胞表面マーカーを特定したものである。本発明の方法を利用することにより、ヒト、マウスや他の生物種の成体、幼体または胎児から多能性成体幹細胞を単離することが可能である。更に、マウスではこれらの細胞は脳及び肝臓から単離されている。したがって、骨髄吸引液、脳または肝臓の生体組織及び場合により他の臓器を採取し、本発明者等により特定されたような当該細胞上に発現される表面マーカーに基づいて当業者に周知のポジティブまたはネガティブ選択法を用いることにより、煩瑣な実験を行うことなく当該細胞を単離することがここに至って当業者に可能となったのである。

【0064】

Ａ．ヒト骨髄からの多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の単離
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を選択するためには、当業者に周知の標準的手法（参照、Muschler, G.F., etal., J. BoneJointSurg. Am. (1997) 79 (11): 1699-709, Batinic, D., etal., Bone MarrowTransplant.(1990) 6(2): 103-7）によって得ることが可能
な骨髄吸引液から骨髄単核細胞を得る。多能性成体幹細胞は骨髄（または肝臓や脳などの他の臓器）に存在するが、通常の白血球抗原ＣＤ４５や赤芽球特異的グリコフォリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）は発現しない。この細胞の混合集団をフィコール−ハイパック分離にかける。次いで細胞を抗ＣＤ４５及び抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を用いたネガティブ選択にかけ、ＣＤ４５^＋及びＧｌｙ−Ａ^＋の細胞集団を除去し、残りの約０．１％の骨髄単核細胞を回収する。また、細胞をフィブロネクチンコーティングしたウェルに播種して、下記に述べる要領で２〜４週間培養した後にＣＤ４５^＋及びＧｌｙ−Ａ^＋細胞を除去することも可能である。あるいは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体などの、本発明者等によって特定されたここに述べる細胞特異的マーカーの組合わせを用いたポジティブ選択を行って細胞を単離する。ポジティブ及びネガティブ選択はいずれも当業者に周知の方法であり、また、ネガティブ選択を行ううえで適当な多くのモノクローナル及びポリクローナル抗体も当該技術分野において周知であって（参照、LeukocyteTypingV, Schlossman, et al.,Eds. (1995) Oxford University Press）、多くの供給元より市販されている。更に、細胞集団の混
合物からの哺乳動物細胞の分離法がシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）等による米国特許第５，７５９，７９３号（磁気的分離）、及び、Basch,et al.,J.Immunol. Methods (1983) 56: 269 （免疫親和性クロマトグラフィ）、ならびにWysocki and Sato,Proc.Natl.Acad. Sci (USA) (1978) 75: 2844) （蛍光発色細胞分析分離法）（図１Ａ）に述べられて
いる。回収したＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞は５〜１１５ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約７〜１０ｎｇ／ｍｌ）の血清フィブロネクチンまたは他の適当なマトリクスコーティングにてコーティングした培養皿に播種する。細胞は、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ）の上皮成長因子（ＥＧＦ）、１〜５０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍｌ）のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）または１００〜１０，０００ＩＵ（好ましくは約１０００ＩＵ）のＬＩＦを、１０^−１０〜１０^−８Ｍのデキサメタゾンまたは他の適当なステロイド、２〜１０μｇ／ｍｌのリノレイン酸、及び０．０５〜０．１５μＭのアスコルビン酸とともに補ったダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）または他の適当な細胞培養培地中で維持される。他の適当な培地として、ＭＣＤＢ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭやＲＰＭＩなどが挙げられる。細胞は、無血清下か、１〜２％ウシ胎児血清存在下か、あるいは１〜２％ヒトＡＢ血清または自家血清（図１Ｂ）中に維持することができる。

【0065】

本発明者等は、低密度で培養された多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は白血病抑制因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）を発現し、ＣＤ４４を少量発現するかあるいは発現しないが、多能性幹細胞（ＭＳＣ）の特徴を有する細胞を高密度で培養すると、ＬＩＦ−Ｒを発現しなくなるがＣＤ４４を発現することを示した。ＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻細胞の１〜２％がＣＤ４４⁻であり、ＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻細胞の内ＬＩＦ−Ｒ^＋であるのは０．５％未満である。蛍光発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）により選択された細胞を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）にかけてｏｃｔ−４のｍＲＮＡを定量した。ｏｃｔ−４のｍＲＮＡの濃度は、選別されていないＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻細胞と比較して、ＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻ＣＤ４４⁻細胞で５倍高く、ＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻ＬＩＦ−Ｒ^＋細胞で２０倍高かった。選別した細胞は１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＬＩＦを加えたＭＡＳＣ培地に播種した。ＭＡＳＣが増殖を開始した頻度は、選別されていないＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻細胞と比較してＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻ＬＩＦ−Ｒ^＋細胞で３０倍高く、ＣＤ４５⁻ＧｌｙＡ⁻ＣＤ４４⁻細胞で３倍高かった。

【0066】

このヒト細胞を０．５ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２未満の細胞密度で再播種すると、培養はあまり増殖することなく死滅した。３日毎に１０ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２を上回る細胞密度で再播種すると、後述するように３０回の分裂を行う以前に細胞は分裂を停止した。またこれにより分化能も失われた。３日毎に２ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２の細胞密度で再播種すると、４０回を上回る分裂が普通に見られ、分裂回数が７０回を上回る細胞集団も見られた。細胞の倍加時間は最初の２０〜３０回の分裂では３６〜４８時間であった。この後、細胞の倍加時間は６０〜７２時間にまで延びた（図２）。

【0067】

５人のドナー（２才〜５５才）より得た多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を２ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２の播種密度で２３〜２６回の分裂を行うまで培養したところテロメアの長さは１１〜１３ｋＢであった。これは同じドナーから得られた血中リンパ球のテロメアの長さよりも３〜５ｋＢ長かった。２人のドナーから得た細胞のテロメアの長さを２３回及び２５回の細胞分裂後にそれぞれ測定し、更に３５回目の細胞分裂後に再測定したところ変化は見られなかった。これらのＭＡＳＣの核型は正常であった。（図３）
Ｂ．マウス組織からの多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の単離
Ｃ５７／ＢＬ６マウスから骨髄を得、単核細胞またはＣＤ４５及びＧｌｙＡポジティブの細胞を除去した細胞をヒトＭＡＳＣで用いたものと同じ培養条件下（１０ｎｇ／ｍＬのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦ）で播種した。骨髄単核細胞を播種した場合には、培養開始後１４日後にＣＤ４５^＋細胞を除去することにより造血細胞を除去した。ヒトＭＡＳＣと同様、２回の細胞分裂毎に２０００細胞／ｃｍ^２の播種密度で培養に再播種した。ヒト細胞において見られたのと対照的に、０日目にＣＤ４５^＋細胞を除去した新鮮なマウス骨髄単核細胞をＭＡＳＣ培地に播種した場合、細胞は増殖しなかった。マウス骨髄単核細胞を播種し、１４日後に培養細胞からＣＤ４５^＋細胞を除去すると、ヒトＭＡＳＣに形態及び表現型において類似した細胞が出現した。

【0068】

ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＦＧのみと培養した場合、細胞の倍加は遅く（６日よりも長い）、１０回の細胞分裂を越える時間にわたって培養を維持することはできなかった。１００〜１００００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０００ＩＵ）のＬＩＦを添加することにより細胞の増殖は大幅に向上し、細胞の分裂回数は７０回を上回った。

【0069】

５日齢のＦＶＢ／Ｎマウスから得た骨髄、脳、または肝臓単核細胞をフィブロネクチン上、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＬＩＦとともにＭＡＳＣ培地に播種した。１４日後にＣＤ４５^＋細胞を除去し、上述したようなＭＡＳＣ培養条件下に細胞を維持した。ＦＶＢ／Ｎマウスからの骨髄、脳、または肝細胞にて開始した培養中にヒトＭＡＳＣ及びマウス骨髄Ｃ５７／Ｂ１６ＭＡＳＣに形態及び表現型において類似した細胞が増殖した。

【0070】

Ｃ．多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）の表現型
１．ヒトＭＡＳＣ
２２〜２５回目の細胞分裂後に得たヒト多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）に蛍光発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）による免疫表現型分析を行った結果、細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、及び−Ｐ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｍｕｃ１８、ＳＴＲＯ−１、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋは発現せず、ＣＤ４４、ＨＬＡ−クラスＩ、及びβ２マイクログロブリンを低レベルで発現し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１を発現することが示された（Ｎ＞１０）。

【0071】

２ｘ１０^３個／ｃｍ^２の細胞密度にて再播種した培養中で細胞分裂の回数が４０回を越えると表現型はより均一となり、ＨＬＡ−クラスＩまたはＣＤ４４を発現する細胞は見られなくなった（Ｎ＝６）。高いコンフルエンスにまで細胞が増殖すると、Ｍｕｃ１８、ＣＤ４４、ＨＬＡ−クラスＩ及びβ２−マイクログロブリンを高レベルで発現するようになり、これは多能性幹細胞（ＭＳＣ）について報告されている表現型と同様のものであった（Ｎ＝８）（Pittenger,Science(1999) 284: 143-147）。

【0072】

免疫組織化学的分析により、２ｘ１０^３個／ｃｍ^２の播種密度にて培養されたヒトＭＡＳＣはＥＧＦ−Ｒ、ＴＧＦ−Ｒ１及び−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａ及び−Ｂを発現し、ＭＡＳＣの細胞集団の一部（１〜１０％）は抗ＳＳＥＡ４抗体にて染色されることが示された（KannagiR,EMBO J 2: 2355-61, 1983）。

【0073】

本発明者等は、２ｘ１０^３個／ｃｍ^２の播種密度にて２２〜２６回の細胞分裂にわたって培養したヒトＭＡＳＣの発現遺伝子プロファイルをクロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）製ｃＤＮＡアレイを用いて評価し、以下のプロファイルを得た。

【0074】

Ａ．多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４４−Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ；ＩＬＩ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３−Ｌ、またはＣＮＴＦの受容体のｍＲＮＡを発現せず、ＨＬＡ−クラスＩ、ＣＤ４４−Ｅ及びＭｕｃ１８のｍＲＮＡを低レベルで発現する。

【0075】

Ｂ．ＭＡＳＣは、サイトカインであるＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ１；サイトカイン受容体であるＦｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、アクチビンＲ１及び−Ｒ２、ＴＧＦＲ−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ；接着受容体であるＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及びＣＤ１０のｍＲＮＡを発現する。

【0076】

Ｃ．ＭＡＳＣは、ｈＴＲＴ及びＴＲＦ１；ＰＯＵ−ドメイン転写因子ｏｃｔ−４ ｃ ｓｏｘ−２（ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するうえでｏｃｔ−４とともに必要とされる。UwanoghoD,Mech Dev 49: 23-36, 1995）、ｓｏｘ−１１（神経発生）、ｓｏｘ−９（
軟骨形成、LefebvreV, Matrix Biol 16:529-40, 1998）；ホメオドメイン転写因子であるＨｏｘａ４及び−ａ５（頚部及び胸部骨格の指定；気道の臓器形成、PackerAI,Dev Dyn17: 62-74, 2000）、Ｈｏｘ−ａ９（骨髄造血、Lawrence H, Blood 89: 1922, 1997）、Ｄｌｘ４（前脳及び頭部周辺構造の指定、AkimenkoMA,JNeurosci 14: 3475-86, 1994）、
ＭＳＸ１（胚中胚葉、成人心臓及び筋肉、軟骨及び骨形成、Foerst-Potts L,DevDyn209:
70-84,1997）、ＰＤＸ１（膵臓、Offield MF, Development 122: 983-95, 1996）のｍ
ＲＮＡを発現する。

【0077】

Ｄ．ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、及びｈＴＲＴのｍＲＮＡの存在がＲＴ−ＰＣＲにより確認された。

【0078】

Ｅ．更にＲＴ−ＰＣＲにより、Ｒｅｘ−１のｍＲＮＡ（ＥＳの未分化状態を維持するうえでｏｃｔ−４とともに必要とされる。Rosfjord E,BiochemBiophys Res Common 203: 1795-802, 1997）及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡ（Ｒｅｘ−１の転写にｏｃｔ−４とともに必
要とされる。Ben-ShushanE,Cell Biol 18: 1866-78, 1998）がＭＡＳＣにおいて発現されていることが示された。

【0079】

ｏｃｔ−４は原腸形成前の胚、分裂初期段階の胚、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、及び胎児性（ＥＣ）癌細胞内において発現される転写因子であり（Nichols J, etalCell95: 379-91, 1998）、細胞が分化誘導されるとダウンレギュレートされる。ｏｃｔ−４の発現
は胚形成及び分化の初期段階を決定するうえで重要な役割を担っている。ｏｃｔ−４はＲｏｘ−１とともに、ＥＳを未分化に維持するうえでやはり必要とされるジンクフィンガータンパク質であるＲｅｘ−１の転写を活性化させる（RosfjordE,RizzinoA. Biochem Biophys Res Commun 203: 1795-802, 1997; Ben-Shushan E,etal., MolCell Biol 18: 1866-78, 1998）。更に、ＥＳ／ＥＣ及び他のより分化の進んだ細胞において発現されるｓｏ
ｘ−２は、ＥＳ／ＥＣの未分化状態を維持するうえでｏｃｔ−４とともに必要とされる（UwanoghoD,Rex M, Cartwright EJ, PearlG, Healy C, Scotting PJ, Sharpe PT:Embryonicexpression of the chicken Sox2,Sox3 and Sox11 genes suggests aninteractiverole in neuronal development. MechDev 49: 23-36, 1995）。マウスＥＳ細胞及び始原生殖細胞の維持にはＬＩＦの存在が必要であるが、ヒト及びヒト以外の霊長類のＥＳ細胞についてはこの条件はさほど明確ではない。

【0080】

本発明者等は、ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、及びＲｏｘ−１がヒト及びマウス骨髄由来の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）及びマウス肝臓及び脳由来のＭＡＳＣ中で発現されていることを観察した。ヒトＭＡＳＣは白血病抑制因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）を発現し、ＳＳＥＡ−４にて陽性染色される。ヒトＭＡＳＣの増殖がＬＩＦによって影響されるかは依然明らかではないがヒトＭＡＳＣはＬＩＦ−Ｒ^＋細胞を選別することによって濃縮されることが初期の実験によって示されている。これに対してマウスＭＡＳＣの増殖はＬＩＦによって助長される。最後にｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、Ｒｅｘ−１及びＲｏｘ−１のｍＲＮＡレベルはヒトＭＡＳＣの培養において３０回目の細胞分裂以降に高くなり、表現型がより均一な細胞を生ずる。これに対して高密度で培養されたＭＡＳＣではこれらのマーカーは発現しなくなる。このことは４０回の細胞分裂以前の老化及び細胞が軟骨芽細胞、骨芽細胞、及び脂肪細胞以外への分化能を失うことに関連している。したがってｏｃｔ−４の存在は、Ｒｅｘ−１、Ｒｏｘ−１、ｓｏｘ−２、及びＬＩＦ−ＲとともにＭＡＳＣ培養中の最も原始的細胞の存在を示すマーカーとなる。

【0081】

本発明者等はｏｃｔ−４のプロモーターであるｅＧＦＰ遺伝子に関してマウスの形質転換体を調べた。これらの動物では始原生殖細胞ならびに生後の生殖細胞中にｅＧＦＰの発現が見られる。本発明者等はＭＡＳＣがｏｃｔ−４を発現する際に生後のこれらの動物の骨髄、脳、及び肝臓にｅＧＦＰポジティブな細胞が見られるか否かについて試験を行った。生後５日目のマウスの骨髄、脳、及び肝臓からｅＧＦＰ^＋細胞（最も明るかった細胞１％）を選別した。蛍光顕微鏡検査法による評価を行ったところ、脳及び骨髄から選別された細胞の内、ｅＧＦＰ^＋であったのは１％未満であった。選別した細胞集団においてＱ−ＲＴ−ＰＣＲによりｏｃｔ−４のｍＲＮＡが検出された。選別した細胞をマウスＭＡＳＣを支持可能な条件下（ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦを補い、フィブロネクチンでコーティングしたウェル）で播種した。細胞は生存したが増殖は見られなかった。マウス胚性繊維芽細胞に移したところ細胞の増殖が見られた。ＭＡＳＣ支持条件下に再び播種したところ、ＭＡＳＣの形態及び表現型を備えた細胞が検出された。

【0082】

２．マウスＭＡＳＣ
ヒト細胞におけるのと同様、Ｃ５７／ＢＬ６ＭＡＳＣを、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＬＩＦを添加して培養した場合、ＣＤ４４及びＨＬＡ−クラスＩネガティブとなり、ＳＳＥＡ−４にて陽性染色され、ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、ＲＯＸ−１及びｓｏｘ−２の転写産物を発現した。同様にＦＶＢ／Ｎの骨髄、脳、及び肝臓から得たＭＡＳＣはｏｃｔ３／４のｍＲＮＡを発現した。

【0083】

多能性成体幹細胞の培養
本明細書中に述べるような単離多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は本発明の方法を用いて培養することが可能である。簡単に述べれば、低血清もしくは無血清培地中での培養が細胞を未分化状態に維持するうえで好ましい。ここに述べられるような、当該細胞の培養に用いられる無血清培地は表Ｉに示されるように補ったものである。

【0084】

【表1】

ＭＡＳＣはＬＩＦ−Ｒを発現し、また一部の細胞はｏｃｔ−４を発現することにより、ＬＩＦを添加することによって培養が向上するか否かについて試験を行った。ヒトＭＡＳＣに１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを添加した場合、短期間の細胞増殖に影響は見られなかった（２５回の細胞分裂までの細胞倍加時間、ｏｃｔ−４の発現レベルが同じ）。ヒト細胞における場合と比較して、０日目にＣＤ４５^＋細胞を除去した新鮮なマウス骨髄単核細胞をＭＡＳＣ培養に播種した場合、細胞の増殖は見られなかった。マウス骨髄単核細胞を播種し、培養細胞から１４日後にＣＤ４５^＋細胞を除去した場合、ヒトＭＡＳＣに形態及び表現型において類似した細胞が出現した。このことは、マウスＭＡＳＣの初期の増殖には造血細胞によって分泌される因子が必要であることを示している。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＦＥＧのみを加えて培養した場合、細胞の倍加時間は遅く（６日よりも長い）、１０回の細胞分裂を越える時間にわたって培養を維持することはできなかった。１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦの添加により細胞の増殖は大幅に向上した。

【0085】

培養中で樹立された細胞は、４０％ＦＣＳ及び１０％ＤＭＳＯを加えたＤＭＥＭを用い、凍結して凍結ストックとして保存することが可能である。培養細胞の凍結ストックを調製するための他の方法も当業者に周知である。

【0086】

単分化能前駆細胞及び組織特異的細胞型へのＭＡＳＣの分化誘導
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、適当な成長因子、ケモカイン、及びサイトカインを用い、例えば、中胚葉由来の各種細胞、神経外胚葉由来の細胞（グリア細胞、乏突起膠細胞、及びニューロン）や内胚葉由来の細胞などの多くの細胞系を形成するように分化誘導することが可能である。

【0087】

Ａ．臓側中胚葉
１．骨芽細胞：
コンフルエンスに達した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を１０^−６〜１０^−８Ｍ（好ましくは約１０^−７Ｍ）のデキサメタゾン、β−グリセロフォスフェート及び５〜２０ｍＭ（好ましくは１０ｍＭ）のアスコルビン酸とともに培養した。骨芽細胞の存在を証明するため、ＶｏｎＫｏｓｓａ染色法（ＣａＰＯ４の銀還元反応）、または骨シアロタンパク質、オステオネクチン、オステオカルシンに対する抗体（免疫組織化学／ウエスタン）を使用した。培養１４日から２１日後には細胞の８０％を上回るものがこれらの抗体によって陽性に染色された（図５、６）。

【0088】

２．軟骨芽細胞：
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）をトリプシン処理し、５０〜１００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＴＧＦ−β１を補った無血清ＤＭＥＭ中、マイクロマス懸濁培養として培養した。試験管の底に微小な軟骨凝集体が形成され、トルイジンブルーにて陽性に染色された。初期にはマイクロマス全体にわたってＩ型コラーゲンが検出された（５日目）が、１４日後では繊維状軟骨の外層においてのみ検出された。５日後にはＩＩ型コラーゲンが検出されるようになり、１４日後にはマイクロマスは強く染色された。骨シアロタンパク質についての染色は繊維状軟骨の外層において陰性もしくは微弱な陽性であった。オステオネクチン、オステオカルシン、及びオステオポンチンについては異なる染色強度が得られた。ＩＩ型コラーゲンの存在はウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲにより確認した。更に、５日後に回収された細胞にＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、軟骨に特異的な転写因子であるＣＡＲＴ１及びＣＤ−ＲＡＰ１の存在が示された（図５、６）。

【0089】

３．脂肪細胞：
脂肪細胞の分化を誘導するには、約１０⁻⁷〜約１０^−６Ｍ（好ましくは約１０⁻⁷Ｍ）のデキサメタゾン、約５０〜約２００μｇ／ｍｌ（好ましくは約１００μｇ／ｍｌ）のインスリン、または約２０％のウマ血清を補った培地を使用することが可能である。脂肪細胞の分化は、光学顕微鏡による観察、オイル・レッドによる染色、あるいはリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、脂肪細胞の脂質結合タンパク質（ａＰ２）、またはペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）の検出によって検出される。細胞マーカー及び産物の検出方法は当業者には公知のものであり、ＰＰＡＲγに結合するトログリタゾン（ＴＲＯ）及びロシグリタゾン（ＲＳＧ）などの特定のリガンドを用いた検出法などが挙げられる。

【0090】

４．軟骨及び骨の発現遺伝子プロファイル
本発明者等は、骨芽細胞及び軟骨芽細胞への分化に際して発現される遺伝子を調べた。詳細には、ＭＡＳＣ（ｎ＝３）及び２日間にわたって骨芽細胞及び軟骨芽細胞培養条件に切り換えたＭＡＳＣの発現遺伝子プロファイルを調べてこれら２つの特定の細胞系列への均一な相対的転換が見られるか否かを、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）社及びインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社のｃＤＮＡアレイを用いて判定した。検出された変化の一部を表２に列記した。これは決して、ＭＡＳＣ、骨芽細胞、及び軟骨芽細胞の発現遺伝子プロファイルの決定的評価たりうるものではない。しかしながらこの結果は、ＭＡＳＣの骨及び軟骨への分化が発現遺伝子プロファイルに著明かつ多様な変化をもたらすことを示すものであり、培養中の細胞の多くが所定の経路に沿って分化誘導可能であるという所見と符合するものである。

【0091】

【表2】

５．サブトラクティブ
・ハイブリダイゼーションによる骨の発現遺伝子プロファイル： 本発明者等はサブトラクション法を用いて未分化の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）と単分化能の子孫細胞との間の遺伝子の相違を調べた。ポリアデニル化ｍＲＮＡを未分化ＭＡＳＣから抽出し、２日間にわたり細胞を骨芽細胞系へと分化誘導した。改変を行うことなく製造者の推奨するところにしたがって、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）社の販売するＰＣＲ−選択キットを使用して発現レベルの異なるｃＤＮＡのサブトラクション及び増幅を行った。未分化のＭＡＳＣではなく、２日目の骨芽細胞培養中で発現した遺伝子から配列の分析を開始した。

【0092】

１）本発明者等は、発現レベルの異なる８６個のｃＤＮＡ配列の配列を決定した。発明者等はノーザンブロッティングによりｍＲＮＡがＭＡＳＣではなく、２日目の子孫骨芽細胞において実際に特異的に発現していることを確認した。得られた配列は以下のデータベースと（ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて）比較した。すなわち、SwissProt,GenBankprotein and nucleotide collections, ESTs, murine andhuman EST contigsである。

【0093】

２）配列は相同性によって分類した。８個が転写因子、２０個が細胞の代謝に関与、５個が染色体の修復に関与、４個がアポトーシス経路に関与、８個がミトコンドリアの機能に関与、１４個が接着受容体／ＥＣＭ要素、１９個が機能が不明な既知のＥＳＴ配列、８個が新規な配列であった。

【0094】

３）本発明者等は、３人の個別のドナーより得られた多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を１２ｈ、２４ｈ、２ｄ、４ｄ、７ｄ、及び１４ｄにわたって骨に分化誘導したものを用い、新規配列の内の２個についてＱ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。２個の遺伝子はそれぞれ分化誘導の最初の２日間及び４日間において発現し、その後はダウンレギュレートされた。

【0095】

４）本発明者は更に未分化のＭＡＳＣに存在するが２日目の骨芽細胞には存在しない遺伝子について分析を行った。この結果、発現レベルの異なる３０個の遺伝子が配列決定され、その内の５個はＥＳＴ配列または未知の配列であった。

【0096】

Ｂ．筋肉
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を任意の筋肉の表現型を有する細胞に分化させるには、分化誘導に先立ってＭＡＳＣがコンフルエンスに達していることが必要である。

【0097】

１．骨格筋：骨格筋分化を誘導するには、コンフルエンスに達した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を、ＭＡＳＣ増殖培地中、約１〜約３μＭ（好ましくは約３μＭ）の５−アザシチジンにて２４時間処理する。次いで培養をＭＡＳＣ培地中で維持する。分化はウェスタンブロット及び免疫組織化学法にて評価する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの骨格筋への分化は当業者には周知の標準的方法及び市販の抗体を用いたウェスタンブロットまたは免疫組織化学法のいずれかによって、Ｍｙｆ−５、Ｍｙｏ−Ｄ、Ｍｙｆ−６、ミオゲニン、デスミン、骨格筋アクチン及び骨格筋ミオシンの一連の活性化を検出することによって証明することが可能である。５−アザシチジンによる誘導の５日後にはＭｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ、及びＭｙｆ６転写因子が細胞の約５０％に検出される。１４〜１８日後では、Ｍｙｏ−Ｄの発現レベルは大幅に低下したのに対し、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６の発現レベルは高値を維持した。デスミン及び骨格筋アクチンは誘導後４日目と早期に検出され、骨格筋ミオシンは１４日目に検出された。免疫組織化学法により１４日目には細胞の７０〜８０％が成熟筋タンパク質を発現していることが確認された。５−シチジンによる処理によって培養の第１週目にＧａｔａ４及びＧａｔａ６が発現した。更に２日後には低レベルのトロポニン−Ｔが検出された。誘導の２日後には平滑筋アクチンが検出され１４日間にわたり高値を維持した。２０％のウマ血清を添加すると筋原細胞の多核化筋管への融合が見られた（図７）。発明者等は２重蛍光標識を用い、系統変換した筋原細胞を分化経路の異なる筋細胞と融合させることが可能であることを示した（図８）。

【0098】

２．平滑筋：成長因子は添加せず、高濃度（約５０〜約２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ）の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を補った無血清培地中で多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を培養することにより平滑筋細胞を誘導することが更に可能である。細胞は分化の開始時点でコンフルエンスに達していることが好ましい。最終分化した平滑筋細胞は、当業者に周知の標準的方法によってデスミン、平滑筋特異的アクチン、及び平滑筋特異的ミオシンの発現を検出することによって同定が可能である。平滑筋アクチンは２日後から、平滑筋ミオシンは１４日後から検出された。細胞の約７０％が抗平滑筋アクチン抗体及び抗平滑筋ミオシン抗体によって陽性染色された。４日後からミオゲニンの存在が確認され、６日後からデスミンが確認された。２〜４日後に更にＭｙｆ５及びＭｙｆ６タンパク質が検出され、１５日目まで高値を維持した。Ｍｙｏ−Ｄは検出されなかった（図７）。

【0099】

３．心筋：心筋分化は、前記に述べたように約５〜約２００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ）の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を、成長因子を添加しない標準無血清培地に添加することによって可能である。コンフルエンスに達したＭＡＳＣをμＭ（好ましくは約３μＭ）の５−アザシチジン、次いで１０⁻⁵〜１０^−７Ｍの（好ま
しくは１０^−６Ｍ）のレチノイン酸に露曝した後、ＭＡＳＣ増殖培地中で培養した。または、ＭＡＳＣをこれらの誘導因子のいずれか一方または両者の組合わせとともに培養した後、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ２、または５〜２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−４と１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２の組合わせを添加した無血清培地中で培養してもよい。発明者等は心筋細胞と一致するタンパク質の発現を確認した。Ｇａｔａ４及びＧａｔａ６が早くも２日目に発現され、１５日まで高値を維持した。心筋トロポニンＴが４日目以降に発現され、心筋トロポニンＩが６日目以降に発現された。ＡＮＰは１１日目以降に検出された。免疫組織化学法により１５日目にこれらの心筋タンパク質が７０％を上回る細胞で検出された。転写因子Ｍｙｆ６は２日目以降に確認された。デスミンの発現が６日目に、ミオゲニンの発現が２日目に始まった。骨格筋アクチンも確認された。培養を３週間以上維持すると細胞はシンシチウムを形成した。発明者等は更に、培養中で稀に自然収縮が生じ、数ｍｍの距離を伝播するのを確認した（図７）。

【0100】

Ｃ．内皮細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）はＦｌｋ１を発現したが、ＣＤ３４、ＰＥＣＡＭ、Ｅ−及びＰ−セレクチン、ＣＤ３６、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ及びＦｌｔ１は発現しなかった。ＭＡＳＣを２０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦを添加した無血清ＭＡＳＣ培地で培養した場合、１４日目までに細胞表面にＣＤ３４が発現され、細胞がｖＷＦを発現するのを確認した（免疫蛍光法）（図９、１０）。更に細胞は、Ｔｉｅ、Ｔｅｋ、Ｆｌｋ１及びＦｌｔ１、ＰＥＣＡＭ、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチン、ならびにＣＤ３６を発現した。組織化学染色の結果をウェスタンブロットにより確認した。ＶＥＧＦによって誘導した細胞をマトリゲルまたはＩＶ型コラーゲン上で培養すると血管形成が観察された（図９、１０）。

【0101】

Ｄ．造血細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）がＣＤ３４^＋の内皮細胞へと分化すること、また最近の研究によってＣＤ３４⁻ＦＬＫ^＋細胞を内皮細胞及び造血細胞に分化誘導することが可能であることが示されたことから、ＭＡＳＣの造血前駆細胞への分化誘導が可能か否かを調べた。ｅｘ ｖｉｖｏでマウス及びヒト再生幹細胞を支持可能な胎児肝臓由来の間葉細胞系であるＡＦＴ０２４フィーダーによって調整し、５％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを添加したＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中、ＩＶ型コラーゲン上にＭＡＳＣを再播種した。これらの培養から回収した細胞は、ｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２、及びＧ−ＣＳＦ−Ｒを発現したが、ＣＤ３４は発現しなかった（ＲＴ−ＰＣＲ）。造血作用が胚性内臓内胚葉が放出する因子によって誘発されることから、発明者等はヒトＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ，Ｔｐｏ、及びＥｐｏの存在下でβＧａｌ^＋のマウスＥＢとヒトＭＡＳＣとを共培養した。２つの別々の実験において、ヒトＣＤ４５を発現するβＧａｌ⁻細胞の小集団が検出された。

【0102】

Ｅ．間質細胞：
発明者等は、多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）をＩＬ−１α、ＦＣＳ、及びウマ血清とともに培養することにより「間質細胞」分化を誘導した。これらの細胞が造血支持能を有することを証明するため、フィーダーを２，０００ｃＧｙにて放射線照射し、ＣＤ３４^＋臍帯血細胞をフィーダーと接触させて播種した。１、２、及び５週間後にメチルセルロースアッセイにおいて子孫細胞を再播種してコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数を求めた。２週間後にＣＦＣは３〜５倍に増加し、５週後においてＣＦＣは維持された。これはマウス胎児肝臓由来のフィーダー細胞であるＡＦＴ０２４と接触させてＣＤ３４^＋細胞を培養した場合と類似していた。

【0103】

Ｆ．神経性細胞
驚くべきことに、造血作用支持フィーダーであるＡＦＴ０２４によって調整したＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地中で、ＶＥＧＦ、造血性サイトカインＳＣＦ、Ｆｌｔ−Ｌ、Ｔｐｏ及びＥｐｏにて誘導した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性アストロサイト、ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）陽性乏突起膠細胞、及びニューロフィラメント陽性ニューロンに分化した（図１１）。そこで発明者等は、ＡＦＴ０２４フィーダーによるＦＧＦ２の産生ならびに培養へのＥＧＦの添加がｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経系細胞への分化を誘導したものであるとの仮説を立てた。

【0104】

そこで発明者等は、神経発生ならびに神経前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養において重要な役割を担っていることが知られているＦＧＦ２がＭＡＳＣ由来の神経発生に与える影響について調べた。ＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えて培養したヒト骨髄由来ＭＡＳＣ（ｎ＝７）の、コンフルエンスが５０％に満たない培養を５０〜５００ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ２を含有する培地に切り換えると、２〜４週間後にアストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンの表現型を有する細胞への分化が確認された（図１１）。培養２週間後において、細胞の２６±４％がＧＦＡＰ陽性であり、２８±３％がＧａｌＣ陽性であり、４６±５％がニューロフィラメント−２００陽性であった。３週後に再び調べたところ、ＧＦＡＰまたはＧａｌＣ陽性細胞の数は減少していたが、２０±２％の細胞がβ−チューブリンＩＩＩについて陽性染色され、２２±３％がニューロフィラメント−６８について陽性染色され、５０±３％がニューロフィラメント−１６０について陽性染色され、２０±２％がニューロフィラメント−２００について陽性染色され、８２±５％がニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）について陽性染色され、８０±２％が微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）について陽性染色された（図１２）。ＧＡＢＡ、パルブアルブミン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＤＯＰＡ−デカルボキシラーゼ、及びトリプトファンヒドロキシラーゼは検出されなかった。ニューロン１個当たりの軸索の数は分化後２、３〜４週後に３±１個〜５±１個及び７±２個に増加した。アストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンの特徴を有する細胞への分化は、ウェスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＧＦＡＰ、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及びニューロフィラメント−２００がＦＧＦ２処理細胞には存在するが、ＭＡＳＣには存在しないことを証明して確認した。

【0105】

ＦＧＦ−９はグリア芽細胞腫細胞系列から最初に単離され、培養中でグリア細胞の分裂を誘導する。ＦＧＦ−９は、大脳皮質、海馬、黒質、脳幹の運動核、プルキンエ細胞層のニューロンにおいてｉｎ ｖｉｖｏに見られる。ＭＡＳＣに５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−９及びＥＧＦを添加して３週間培養すると、アストロサイト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、及びドーパミン作動性ニューロンを生じた。中枢神経系の発生過程では、中／後脳境界において前脳により発現されるＦＧＦ−８が、ソニックヘッジホッグとともに中脳及び前脳のドーパミン作動性ニューロンの分化を誘導する。ＭＡＳＣに５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−８及びＥＧＦを添加して３週間培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンの両方を生じることが分かっている。ＦＧＦ−１０は極微量が脳に見出され、その発現は海馬、視床、中脳、及び脳幹に限定され、ニューロン内で選択的に発現し、グリア細胞では発現しない。ＭＡＳＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−１０及びＥＧＦ中で３週間培養するとアストロサイト及び乏突起膠細胞を生じたが、ニューロンは生じなかった。ＦＧＦ−４は脊索において発現し、中脳の領域化に必要とされる。ＭＡＳＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦ−４及びＥＧＦにて３週間処理するとアストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニューロンには分化しなかった。

【0106】

脳において特異的に発現し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで神経発生に影響する他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などがある。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、及び神経系前駆細胞のニューロンへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を促進し、海馬由来神経幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの軸索生成を促進する神経成長因子ファミリーに属する。黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を支持するというＢＤＮＦの既知の機能と符合するものであるが、ＭＡＳＣを５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＢＤＮＦ及びＥＧＦにて処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのみへの分化が見られた。ＧＤＮＦはＴＧＦスーパーファミリーに属する。神経発生の初期にはＧＤＮＦは前神経外胚葉で発現し、神経発生におけるＧＤＮＦの重要な役割を示すものである。ＧＤＮＦは末梢神経及び筋肉の運動ニューロンの生存を促し、神経栄養因子活性及び分化促進能を有する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＧＤＮＦによりＭＡＳＣのＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロンへの分化が誘導されることが分かっている。ＣＮＴＦは毛様体神経節から最初に単離され、サイトカインのｇｐ１３０ファミリーに属する。ＣＮＴＦは発生初期の神経の生存を促す。ＣＮＴＦにより、ラット胎児の海馬神経細胞の培養においてＧＡＢＡ作動性及びコリン作動性ニューロンの数が増加する。更にＣＮＴＦはＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を防止するとともにＧＡＢＡの取込みを促進する。５〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ）のＣＮＴＦはＭＡＳＣに対し同様のＧＡＢＡ作動性誘導効果を示し、ＭＡＳＣはＣＮＴＦへの曝露の３週後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみに分化した。

【0107】

ラットの脳に移植されたＭＡＳＣの運命についても調べた。５０，０００個のｅＧＦＰ^＋のＭＡＳＣを、シクロスポリンを継続投与したＷｉｓｔｅｒ系ラットに誘発させた頭頂部梗塞の周囲に定位的に移植した。生理食塩水、ＭＡＳＣ調整培地、またはＭＡＳＣの移植後６週目に四肢の定位機能について検定した。ＭＡＳＣを移植したラットにおいてのみ擬似移植を行った動物のレベルに比肩する機能改善が見られた（図１５）。

【0108】

２及び６週間後に動物を殺して神経に係る表現型を決定した。ｅＧＦＰ^＋細胞の移植後の脳が自己蛍光を発することから、移植片の免疫組織化学的分析を行った。２週目ではｅＧＦＰ^＋細胞の大半が移植領域自体において検出された（図１６）。５週後ではｅＧＦＰ^＋細胞は移植片の外部に移動した。２週目では抗ｅＧＦＰ抗体で染色された細胞は球形状を維持し、その直径は１０〜３０μｍの範囲であった。６週後では抗ｅＧＦＰ抗体で染色された細胞は大幅に縮小しており、移植領域には正常な脳組織へと延出する樹状突起が見られた。ヒト特異的核抗体であるＮｕＭａによる染色によってヒト細胞の存在が確認された。この抗体を利用すれば免疫蛍光抗体による２重及び３重の染色が可能であり、移植片中のヒト細胞を特定することが可能である。

【0109】

本発明者等は、ヒト特異的抗ネスチン抗体を利用してＮｕＭａ陽性細胞及びＧＦＰ^＋細胞と同じ場所にネスチン陽性細胞の小集団を検出した。このことは神経外胚葉の分化を示すものである。更に発明者等は、チューブリンＩＩＩ、ニューロフィラメント−６８及び−１６０、オリゴマーカー、及びＧＦＡＰについて陽性染色を確認した。このことは神経細胞及びグリア細胞への分化を示すものである（図に示されていない）。

【0110】

Ｇ．上皮細胞
発明者等はコンフルエンスに達した多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）（ｎ＝４）を１０ｎｇ／ｍＬの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）単独かまたはケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）との組合わせにて処理した。１４日後にＨＧＦ受容体、サイトケラチン８、１８及び１９を発現する大型の類上皮細胞を確認した。サイトケラチン１９の存在は胆管上皮細胞への分化が起きている可能性を示すものである。基質をフィブロネクチンからコラーゲンゲルまたはマトリゲルに変更することによって上皮細胞の形態を有するサイトケラチン１８発現細胞の発生率が向上した（図１７）。

【0111】

分化した複数細胞系列の単一細胞起源
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）同士が互いにクローンであるかどうかを確認するため、発明者等はＦＡＣＳ１により選別を行い、ＭＦＧ−ｅＧＦＰにより形質導入したｅＧＦＰ^＋細胞をウェル１個当たり１０個播種し、１０^８個の細胞にまで培養した。形質導入は以下のように行った。２４時間前に再播種したＭＡＳＣを６時間づつ連続２日間にわたってＰＧ１３細胞系にパッケージングされたＭＦＧ−ｅＧＦＰまたはＭＳＣＶ−ｅＧＦＰ及び１０μｇ／ｍＬのプロタミンに曝露した。ＭＡＳＣの４０〜７０％に形質導入された。ｅＧＦＰの発現はｅｘ ｖｉｖｏにて少なくとも３ヶ月間維持され、分化後も多くの細胞において発現が維持された。１個の細胞を選別した場合、１，０００個を上回るウェルにおいて増殖はまったく見られなかったが、ウェル当たり１０個の細胞を播種した場合にはウェルの３％において細胞の増殖が見られた。ウェルの０．３％のみに１０^７個を越える細胞への更なる増殖が見られた。次いでこれらの細胞を中胚葉由来のすべての種類の細胞に分化誘導した（骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、骨格筋及び平滑筋細胞、及び内皮）。ここでもやはり免疫組織化学法及びウエスタンブロッティングによって分化を確認した。細胞を更にｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲにかけて挿入されたウイルスＤＮＡを挟み込んだヒトＤＮＡの配列が類似していることを証明した。発明者等はレトロウイルス遺伝子がＭＡＳＣ及び分化した子孫の別々の３つのクローンのヒトゲノムの同じ部位に挿入されていることを確認した。

【0112】

ＭＡＳＣの生着
発明者等は多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）が生着し、ｉｎ ｖｉｖｏにて維持されるかを調べるため研究を行った。

【0113】

１．発明者等はｅＧＦＰ^＋のＭＡＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに筋肉内注射した。４週間後に動物を殺し、筋肉を調べてヒトＥＳ細胞に関し上記に述べたように奇形腫が発生しているかを判定した。５頭中５頭の動物に奇形腫の発生は見られなかった。ｅＧＦＰ陽性の細胞は検出された。

【0114】

２．発明者等はｅＧＦＰ^＋のＭＡＳＣをＳＣＩＤマウス胎児に子宮内ＩＶ注入した。出生直後に動物を調べた。ＰＣＲ分析により心臓、肺、肝臓、脾臓、及び骨髄にｅＧＦＰ^＋細胞の存在が確認された。

【0115】

３．発明者等は無傷または梗塞を発生したラットの脳にＭＡＳＣを定位的に移植した。ＭＡＳＣは神経細胞の表現型を獲得し、少なくとも６週間にわたって維持された。

【0116】

ＭＡＳＣの応用例
１．骨芽細胞
骨細胞に分化誘導された本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、細胞治療として、または骨粗鬆症における組織再生、ページェット病、骨折、骨髄炎、骨壊死、軟骨形成不全症、骨形成不全症、遺伝性多発性外骨腫、多発性骨端異形成症、マルファン症候群、ムコ多糖症、神経繊維腫症、または脊柱側彎症、限局性奇形、二分脊椎、半側椎骨、融合椎骨、肢奇形の再建術、腫瘍により損傷した組織の再建、中耳炎などの感染症後の再建に使用することが可能である。

【0117】

２．軟骨細胞
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を分化誘導して形成される軟骨細胞は、細胞治療または、年齢関連疾患及び損傷、スポーツ関連損傷、あるいは、慢性関節リウマチ、関節症性乾癬、ライター関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、強直性脊椎炎、変形性関節炎などの特定の疾患における組織再生、外耳再建術、鼻再建術、及び輪状軟骨の再建術に利用することが可能である。

【0118】

３．脂肪細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）より得られた脂肪細胞は、再建手術や美容整形手術における再形成及びＩＩ型糖尿病の治療に利用することができる。再建手術においては、本発明の方法により分化させた脂肪細胞を、例えば乳房切除術後の乳房再建や、顔面や手からの腫瘍除去などの他の外科手術による欠損組織の再形成に利用することが可能である。美容整形手術では、本発明の方法によって本発明の細胞から得られた脂肪細胞を、乳房拡大や老化した皮膚の皺取りなど様々な方法において使用することが可能である。更にこのようにして得られた脂肪細胞によって脂肪の制限の研究に有効なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムが与えられる。

【0119】

４．繊維芽細胞
ＭＡＳＣから誘導される繊維芽細胞は、細胞治療や組織の修復に利用して外傷の治癒を促したり、美容整形手術用の土台などの連結組織の支持要素を与えることが可能である。

【0120】

５．骨格筋
ＭＡＳＣを分化誘導して得られる骨格筋細胞は、デュシャンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、骨格筋ミオパシーの治療における細胞療法や組織修復、及び骨格筋損傷を修復するための再建術に利用することが可能である。

【0121】

６．平滑筋
ＭＡＳＣを分化誘導して得られる平滑筋細胞は、細胞治療や、食道閉鎖、腸閉鎖、腸重積症などの消化器系の発生異常の治療における組織修復、及び腸梗塞手術や結腸結腸吻合術後の組織の置換に利用することが可能である。

【0122】

本発明のＭＡＳＣから形成された平滑筋細胞は更に、膀胱や子宮の再建、新生血管形成、例えばアテローム性動脈硬化症や動脈瘤などによって損傷した血管の修復に利用することが可能である。平滑筋前駆細胞（メサンギウム細胞）を糸球体の疾患や細胞治療のｉｎ
ｖｉｔｒｏモデルとして、または糖尿病性ニューロパシーにおける組織再生に利用することが可能である。平滑筋前駆細胞は更に、血圧の調節において重要な遠位曲尿細管や傍糸球体組織の緻密斑の修復に利用することが可能である。

【0123】

７．心筋細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）から誘導される心筋細胞は、弁置換術、先天性心異常あるいは心筋症や心内膜炎によるうっ血性心不全や、心筋梗塞により損傷した心組織を治療するための細胞治療や組織修復に有用である。細胞は特に注射により局所的に投与することによって高い効果を得ることが可能である。ＭＡＳＣから分化した小膠細胞は、脊髄損傷、及びハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症やアルツハイマー病などの神経変性性疾患の治療、ならびに中枢神経系を冒す感染症によって損傷した組織の修復に使用することが可能である。サイトカインを産生するよう遺伝子改変された小膠細胞は、血液脳関門のためにアクセスが困難な中枢神経系の感染症を治療するための移植に利用することも可能である。グリア細胞は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症や脳腫瘍による発作後の神経組織を再生するため、及び脊髄損傷後に神経組織を再生するための成長因子または成長因子阻害物質を産生するために利用することも可能である。

【0124】

８．間質細胞
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）から誘導される間質細胞は、化学療法後の骨髄置換のため、また骨髄移植のための移植細胞として使用することができる。乳癌では強力な化学療法レジメンを行う前に患者から例えば骨髄吸引液を採取する。こうした化学療法は組織、特に骨髄に損傷を与える。患者の骨髄から単離したＭＡＳＣを培養して増殖させ、骨髄細胞の再定着に充分な自己細胞を得ることが可能である。これらの細胞は異なる組織に分化することが可能であるので局所的または全身的に導入された細胞が他の損傷組織に移動し、その組織環境に存在する細胞因子によってこれらの細胞の分化が誘導されて増殖するという利点が得られる。

【0125】

９．内皮細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を前記に述べた方法により内皮細胞に分化させ、この内皮細胞を第ＶＩＩＩ因子欠損症の治療、及び新生血管形成のための血管新生因子の産生に利用することが可能である。この内皮細胞は更に血管新生阻害剤を使用した腫瘍抑制のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、ならびに脈管炎、過敏症、及び凝固疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを与えるものである。こうした培養内皮細胞と当業者に周知の高速スクリーニング法を用いることにより、治療効果を有する可能性のある数千もの有用化合物をより速やかにかつ高いコスト効率でスクリーニングすることが可能である。

【0126】

１０．造血細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は造血細胞に分化することが可能である。したがって本発明の細胞を利用して高投与量の化学療法後に骨髄を再生することが可能である。化学療法を行う前に患者から骨髄吸引液を採取する。本発明の方法により幹細胞を単離し、培養、分化誘導する。この後、分化細胞と未分化細胞の混合物を患者の骨髄腔に再導入する。現在この目的で造血幹細胞を用いた臨床試験が行われているが、本発明の幹細胞は骨髄ばかりでなく他の組織の化学療法によって損傷した細胞をも置換することが可能な細胞に更に分化可能であるという更なる利点を有するものである。本発明のＭＡＳＣから誘導される造血細胞を血液細胞に更に分化させて血液バンクで保管することにより、輸血用血液が不足する問題を解消することが可能となる。

【0127】

１１．神経外胚葉細胞
ＭＡＳＣから分化した小膠細胞は、脊髄損傷、及びハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症やアルツハイマー病などの神経変性性疾患の治療、ならびに中枢神経系を冒す感染症によって損傷した組織の修復に使用することが可能である。サイトカインを産生するよう遺伝子改変された小膠細胞は、血液脳関門のためにアクセスが困難な中枢神経系の感染症を治療するための移植に利用することも可能である。グリア細胞は、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症や脳腫瘍による発作後の神経組織を再生するため、及び脊髄損傷後に神経組織を再生するための成長因子または成長因子阻害物質を産生するために利用することも可能である。乏突起膠細胞及びアストロサイトに分化させたＭＡＳＣを例えば、脱髄組織、特に脊髄に移植し、脱髄組織中でＭＡＳＣに周囲の神経組織にミエリン鞘を形成させることが可能である。この方法は、乏突起膠細胞及びアストロサイト前駆細胞の供給源として胚性幹細胞を使用した場合に有効であることがマウスにおいて証明されている（Brustle,O.,et al., Science (1999) 285: 754-756）。本発明のＭＡＳＣは胚性幹細
胞の幅広い分化特性を有するばかりでなく移植用の自己細胞を与えるという更なる利点を有する。

【0128】

本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、例えばムコ多糖症、白質ジストロフィー（グロボイド細胞性白質ジストロフィー、キャナヴァン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマン−ピック病、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、及びテイ−サックス病などの先天性神経変性性疾患や蓄積症を治療することが可能である。また本発明のＭＡＳＣは、脳卒中、中枢神経系出血、中枢神経系外傷などの外傷性疾患、脊髄損傷や脊髄空洞症などの末梢神経系疾患、網膜剥離、黄斑変性や他の変性網膜疾患及び糖尿病性網膜疾患などの網膜疾患の治療に使用することが可能である。

【0129】

１２．外胚葉性上皮細胞
更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、脱毛症などの皮膚疾患、火傷の傷や白子症などの皮膚欠陥を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。

【0130】

１３．内胚葉性上皮細胞
本発明のＭＡＳＣから誘導される上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、複数の臓器疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。この細胞を使用して、例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシスなどの蓄積症、クリグラー−ナジャー症候群などの高ビリルビン疾患、例えばオルニチンデカルボキシラーゼ欠損症、シトルリン血症、及びアルギニノコハク酸尿症といった尿素回路の先天異常などのアンモニア疾患、フェニルケトン尿症、先天性高チロシン血症、及びα１−アンチトリプシン欠損症などのアミノ酸及び有機酸異常、ならびに第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子欠損症などの凝固疾患といった先天性の肝疾患を治療もしくは緩和することが可能である。この細胞はまたウイルス感染による後天性肝疾患を治療するために使用することも可能である。本発明の細胞は更に、人口肝臓（腎臓透析に類似）の製造、凝固因子の生成、及び、肝上皮細胞が産生するタンパク質や酵素の生成などのｅｘ ｖｉｖｏでの応用例に使用することも可能である。

【0131】

更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、胆汁性肝硬変や胆道閉鎖症などの胆道疾患を治療もしくはその症状を緩和することも可能である。

【0132】

更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、膵臓閉塞症、膵臓炎、及びα１−アンチトリプシン欠損症などの膵臓疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。更に、本発明の細胞から膵臓上皮細胞が得られ、また神経細胞が得られることより、β細胞を生成することが可能である。これらの細胞を糖尿病の治療に用いることも可能である（皮下移植、膵臓内または肝臓内移植）。更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、腸閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、及び腸切除などの腸上皮組織の疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。

【0133】

１４．非最適培養条件下での不老性を与えるためのＭＡＳＣの改変
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は長いテロメア（１２ｋｂ）を有し、このテロメア長は異なる年齢のドナーから得られた細胞で異ならない。ＭＡＳＣをｅｘ ｖｉｖｏ培養するとテロメアはｅｘ ｖｉｖｏ培養中において４ヶ月以上の長期にわたって（３５回の細胞倍加より長い期間）短くならない。これはより長期に及ぶこともある。すべての年齢の人から得られるＭＡＳＣ中にテロメラーゼが存在する。ＭＡＳＣをコンフルエンスに達した状態で培養すると老化が始まりテロメアは短くなりはじめる。生産、商業上の理由などにより比較的高密度の培養中で長期に及ぶ増殖を行うことが好ましいことから、ＭＡＳＣをテロメアーゼを含む構築体により形質導入／トランスフェクトして、これにより細胞の老化を防止することが可能である。これらの細胞はｉｎ ｖｉｖｏ移植に使用することが可能であるが、移植に先立って細胞からテロメラーゼを除去することが好ましい。これはテロメラーゼが２個のＬｏｘＰ部位の間に位置するように構築体を構築することによって行うことが可能である。これによりＣｒｅリコンビナーゼによってテロメラーゼを切り出すことが可能となる。Ｃｒｅは、第２のベクター／プラスミドを用いるかまたはテロメラーゼ含有構築体の一部として標的細胞に形質導入／トランスフェクトすることが可能である。Ｃｒｅは、構成的活性型として、または、例えば天然エストロゲン受容体（ＥＲ）リガンドでは誘導されないが４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）により誘導可能なヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の１以上の突然変異リガンド結合ドメインを当該タンパク質に融合するか、またはテトラサイクリンやラパマシン誘導などの薬剤誘導系を用いることにより、誘導可能な酵素として導入することが可能である。

【0134】

１５．免疫拒絶反応を防止するための移植アプローチ
ａ．万能ドナー細胞
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を遺伝子操作して細胞及び遺伝子治療のための万能ドナー細胞とし、遺伝病などの疾患の治療や酵素の置換を行うことが可能である。未分化のＭＡＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ型、ＨＬＡ−ＩＩ型抗原やβ２マイクログロブリンを発現しないが、分化した子孫の一部には少なくともＩ型ＨＬＡ抗原を発現するものがある。ＭＡＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ型及びＨＬＡ−ＩＩ型抗原を欠損させ、場合によりレシピエントとなる患者由来のＨＬＡ抗原を導入することにより万能ドナー細胞に改変することが可能であり、これにより細胞が容易にＮＫ細胞の媒介する細胞障害の標的となることを防止し、細胞での無制限のウイルス増殖や細胞の悪性転換を防止することが可能となる。ＨＬＡ抗原は、相同組換え、またはプロモーター領域への点突然変異の導入、または抗原の最初のエクソンへの点突然変異の導入により、キメラ細胞の場合におけるように停止コドンを導入することによって欠損させることが可能である。ホストのＨＬＡ抗原は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルスなどのウイルスによる形質導入やトランスフェクトによってＨＬＡ抗原のｃＤＮＡを標的細胞に導入することによって移入することが可能である。ＭＡＳＣを利用して特定のタンパク質を体内または血中で所定範囲の量すなわち濃度となるよう調整することが可能である。

【0135】

ｂ．免疫系による認識を回避するための子宮内移植
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を子宮内移植生着に使用して遺伝子の異常を修正したり、ホストの免疫系の発達以前にホストの免疫系に認識されなくなるように細胞を導入することが可能である。これは動物の体内で血液などのヒト細胞を大量に生産するための方法を与えるものであり、また正常なタンパク質または酵素を産生する細胞を移植することによってヒト胎児の遺伝的欠陥を修正する方法として利用することも可能である。

【0136】

１６．遺伝子治療
現在にいたるまで遺伝子治療に使用されるヒト細胞は、骨髄及び皮膚細胞に基本的に限られていた。これは、他の種類の細胞は、体内から抽出し、培養中で増殖させ、遺伝子改変し、組織が由来する患者に首尾良く再移植することが困難であることによる（Anderson,W.F., Nature (1998) 392: 30; Anderson, W. F., ScientificAmerican (1995) 273:1-5;Anderson, W. F., Science(1992) 256: 808-813）。本発明の多能性成体幹細胞（Ｍ
ＡＳＣ）は、体内から抽出、単離し、培養中で未分化状態にてまたは分化誘導して増殖させ、様々な方法、殊にウイルスによる形質導入を用いて遺伝子改変することが可能である。遺伝物質の取込み及び発現は証明することが可能であり、外来ＤＮＡの発現は発生過程の全体を通じて安定的である。幹細胞に外来ＤＮＡを挿入するためのレトロウイルスなどのベクターは当業者には周知のものである（Mochizuki,H.,etal., J. Virol (1998) 72 (11): 8873-8883; Robbins, P., et al., J.Virol.(1997) 71(12): 9466-9474; Bierhuizen, M., et al., Blood (1997) 90(9):3304-3315; Douglas,J., et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10 (6):935-945; Zhang,G., et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. (1996) 227(3): 707-711）。レトロウイルスを用いて形質導入が行われると、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の発現が最終分化した筋細胞、内皮細胞、及び単離ＭＡＳＣに由来するｃ−Ｋｉｔ陽性細胞において持続する。これはＭＡＳＣに導入されたレトロウイルスベクターの発現が分化の全体を通じて持続することを示すものである。予めレトロウイルスベクターにより形質導入し、最初のＭＡＳＣ培養期間の数週目に選別した１０個のｅＧＦＰ^＋細胞にて開始した培養から最終分化が誘導された。

【0137】

造血幹細胞は、その分化能は限定されたものであるが、遺伝子治療において有用であることが示されている（参照、Kohn, D. B., Curr.Opin.Pediatr. (1995) 7: 56-63）。
本発明の細胞は、レトロウイルスベクターが未分化の幹細胞に導入されたにも関わらず、最終分化した筋細胞、内皮細胞及びｃ−Ｋｉｔ陽性細胞において緑色蛍光タンパク質の発現が持続することによって証明されるように、最終分化した時点で形質導入またはトランスフェクトされたＤＮＡを維持可能な広範な種類の分化細胞を提供するものである。

【0138】

本発明のＭＡＳＣは、遺伝子治療用の造血幹細胞と比較して他の利点も有する。本発明の幹細胞は局所麻酔下で得られる骨髄吸引液から単離し、培養中で増殖させ、外来遺伝子をトランスフェクトすることが比較的容易に可能である。同様な目的で用いる相応な数の造血幹細胞は、少なくとも１Ｌの骨髄から単離しなくてはならず、また細胞を培養中で増殖させることも困難である（参照、Prockop, D.J., Science(1997) 276: 71-74）。

【0139】

遺伝子治療用の候補遺伝子の例としては、アポリポタンパク質Ｅ（アルツハイマー病や心血管疾患のリスクとの相関が示されている）、ＭＴＨＦＲ（高ホモシステイン値及び脳卒中と変異体との相関が示されている）、第Ｖ因子（血栓のリスクと相関を有する）、ＡＣＥ（心疾患のリスクと変異体との相関が示されている）、ＣＫＲ−５（ＨＩＶに対する耐性との相関が示されている）、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、欠損によりレッシュ−ナイハン病を発症）、ＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、欠損により重篤な免疫不全疾患につながる）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ、欠損により重篤な複合免疫不全疾患につながる）、ｐ２１（毛細管拡張性運動失調の治療用候補遺伝子として提唱されている）、ｐ４７（欠損と、慢性肉芽腫症の患者の好中球のオキシダーゼ活性の欠落との相関が示されている）、ジェンバンク受託番号Ｍ５５０６７及びＭ３８７５５）Ｒｂ（腫瘍形成に関連する網膜芽腫感受性遺伝子、ジェンバンク受託番号Ｍ１５４００）、ＫＶＬＱＴ１（カリウムチャンネルタンパク質、異常型と心不整脈との相関が示されている。ジェンバンク受託番号Ｕ４０９９０）、ジストロフィン遺伝子（デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連、ジェンバンク受託番号Ｍ１８５３３、Ｍ１７１５４、及びＭ１８０２６）、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症に関連する膜内外伝導度レギュレータ、ジェンバンク受託番号Ｍ２８６６８）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（毛細管拡張性運動失調に関連、ジェンバンク受託番号Ｕ２６４５５）、及びＶＨＬ（このタンパク質の欠損または突然変異はフォンヒッペル−リンダウ病との関連が示されている）をコードする遺伝子が挙げられる（Latif,F.,et al., Science (1993) 260: 1317-1320）。これらの遺伝子改変細胞の使用により効果的に治療可能な他の疾
患としては、第ＩＶ因子欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（重篤な複合免疫不全疾患すなわちＳＣＩＤに関連）や糖尿病、及びグルコセレブロシダーゼ、α−イヅロニダーゼの血書運症が挙げられる。

【0140】

これらの新規な遺伝子は、酵素レベルが調整可能であるように誘導性プロモーターにより発現調節することが可能である。これらの誘導性プロモーター系は産生させるタンパク質に結合させたヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）の突然変異リガンド結合ドメインを有していてもよい。そのためには患者はタンパク質を発現させるためにタモキシフェンを摂取する必要がある。あるいは、テトラサイクリン−ｏｎ／ｏｆｆ系、ＲＵ４８６やラパマイシン誘導系を使用することも可能である。相対的選択発現を行う更なる方法は組織特異的プロモーターを使用することである。例えば脳では、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（Ａｄ−ＮＳＥ）やグリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターにより発現調節される導入遺伝子を導入することが可能であり、これにより脳組織においてほぼ当該遺伝子のみの発現が実現される。同様にＴｅｃプロモーターやＶＥ−カドヘリンプロモーターを使用することにより内皮細胞のみにおける発現を得ることも可能である。

【0141】

遺伝子改変されたＭＡＳＣは局所的に導入するか全身的に注入することが可能である。より限定された分化能を有するこうしたヒト幹細胞は、第ＩＸ因子の遺伝子をトランスフェクトした場合、ＳＣＩＤマウスへの全身注入後少なくとも８週間にわたってタンパク質を分泌する（Keating,A.,et al., Blood (1996) 88: 3921）。本発明のＭＡＳＣは、こ
れまでに報告されているいかなる非胚性幹細胞よりも幅広い分化能を有し、異なる組織に移動してそこでサイトカイン、成長因子などの因子によって細胞分化が誘導されることから、全身的または局所的投与において更なる利点を与えるものである。分化した細胞は周囲の組織の一部となるが、誘導された遺伝子のタンパク質産物を産生する能力は維持したままとなる。

【0142】

例えばパーキンソン病では、ヒト胎児の死体から得られた中脳性ドーパミンニューロンがパーキンソン病の患者の脳内で生存、機能できることが臨床試験により示されている。ＰＥＴ走査により、［^１８Ｆ］フルオロドーパの細胞移植片周囲の領域での取込み量が移植後に増加し、患者によっては少なくとも６週間はその状態に維持されることが示されている（参照、Dunnett,S and A. Bjorklund, Nature (1999) 399 (Suppl.) A32-A39;Lindvall. O., NatureBiotech.(1999) 17: 635-636; Wagner, J., et al., NatureBiotech.
(1999)17:653-659）。胚性細胞と異なり、本発明が述べるところの単離ＭＡＳＣは、移
植用の細胞の速やかな供給を可能とする一方で、胚性細胞移植を病気の治療の有望な代替策とならしめている分化能を維持している。

【0143】

ＡＩＤＳの治療においては、本発明のＭＡＳＣを遺伝子操作して、ＨＩＶ感染細胞内で産生される野生型Ｒｅｖの機能を阻害するＲｅｖのトランスドミナント・ネガティブな突然変異体であるＲｅｖ１０を産生させることが可能である（Bevec,D.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:9870-9874; Ranga, U., etal.,Proc.Natl. Acad. Sci.USA (1998) 95 (3):1201-1206）。ＭＡＳＣは、造血系列の細胞に分化誘導されて患者の体
内に導入されると、欠乏したＨＩＶ感染患者のＴ細胞の供給を回復させる。遺伝子改変されたこれらの細胞は突然変異体であるＲｅｖＭ１０を有するために多くのＨＩＶ株による感染の致死的影響に対して耐性を獲得する。

【0144】

遺伝子改変されたＭＡＳＣを不活担体中にカプセル化して細胞をホストの免疫系から保護する一方で分泌タンパク質を産生することが可能である。細胞のマイクロカプセル化の技術は当業者に周知のものである（参照、Chang,P.,et al., Trendsin Biotech. (1999) 17(2): 78-83）。細胞のマイクロカプセル化の材料としては例えば、ポリマーカプセル、アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギネートマイクロカプセル、ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸バリウムカプセル、アルギン酸バリウムカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）製中空繊維、及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製中空繊維などが挙げられる。例えば米国特許第５，６３９，２７５号（ビージ，Ｅ．等）（Ｂａｅｔｇｅ，Ｅ．）には、遺伝子操作した細胞が封入された生体適合性カプセルを用いた生物学的活性分子の長期かつ安定的な発現のための装置及び方法が開示されている。このような生体適合性免疫隔離性カプセルは、本発明のMASCとともに、例えば糖尿病やパーキンソン病などの多くの生理的疾患を治療するための方法を与えるものである。

【0145】

例えば糖尿病の患者では、生理学的に治療効果を奏するレベルでインスリンを産生するように遺伝子改変した異種幹細胞を患者の組織内に送達すべくカプセル化することが可能である。あるいは、患者自身の骨髄吸引液から得られた自家幹細胞に上記に述べたようにレトロウイルスにて形質導入することも可能である。これらの細胞は、生理学的に治療効果を奏するレベルのインスリンを産生するように遺伝子改変した後、チャン（Ｃｈａｎｇ）やビージ（Ｂａｅｔｇｅ）により述べられるようにカプセル化して患者の組織内に導入することが可能であり、これにより細胞は組織中に滞留して長期にわたってインスリンを産生する。

【0146】

本発明の細胞のマイクロカプセル化の別の利点は、マイクロカプセル内に生物学的治療効果を奏する分子を産生する各種細胞を封入できる点である。本発明のＭＡＳＣは、それぞれ治療上有効なレベルの生物学的活性分子を産生するように遺伝子改変可能な、複数の異なる細胞系列に分化誘導することが可能である。異なる遺伝子要素を有するＭＡＳＣを共にカプセル化して異なる生物学的活性分子を産生することが可能である。

【0147】

本発明のＭＡＳＣはｅｘ ｖｉｖｏにて遺伝子改変することにより、遺伝子治療における最も困難な障壁を克服することが可能である。例えば、患者の骨髄吸引液を採取し、この吸引液からＭＡＳＣを単離する。このＭＡＳＣを１以上の所望の遺伝子産物を発現するように遺伝子改変する。このＭＡＳＣをｅｘ ｖｉｖｏにてスクリーニングもしくは選択して首尾良く改変された細胞を特定し、この細胞を局所的あるいは全身的に患者に再導入することが可能である。あるいは、ＭＡＳＣを遺伝子改変して培養により分化誘導し、移植用の特定の細胞系を得ることも可能である。いずれの場合にも、移植されたＭＡＳＣによって所望の遺伝子産物を発現可能な安定的にトランスフェクトされた細胞の供給源が与えられる。特に患者自身の骨髄吸引液がＭＡＳＣの供給源である場合、本方法により移植細胞を産生するための免疫学的に安全な方法が与えられる。

【0148】

この方法を、その幾つかを数えあげるだけでも、糖尿病、心筋症、神経変性性疾患、及びアデノシンデアミナーゼ欠損症の治療に用いることが可能である。例えば糖尿病では、ＭＡＳＣを単離し、インスリンを産生するように遺伝子改変し、病気を罹患した患者に移植することが可能である。疾患が自己免疫に関連したものである場合、ＭＡＳＣを、免疫監視機構を免れるように改変ＭＨＣを発現するかもしくはＭＨＣを発現しないように遺伝子改変することが可能である。ウイルスゲノムのＥ３領域を発現するアデノウイルスベクターを利用することにより、移植された膵臓小島細胞においてＭＨＣの発現が抑制された。発明者等が証明したように、本発明の細胞は安定的にトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり、したがって糖尿病患者に移植するためのインスリンのより恒久的な供給源を与えるものである。

【0149】

特にＭＨＣの発現を変化させるように遺伝子改変したドナーＭＡＳＣ、及び特に所望のヘモグロビン遺伝子産物を発現するように遺伝子改変した自家ＭＡＳＣは、鎌状赤血球貧血症及びサラセミアの治療のための細胞療法に特に有効である。

【0150】

ＭＡＳＣを遺伝子改変する方法
本明細書中に述べられる方法によって単離される細胞は、当業者に周知の様々な方法により細胞内にＤＮＡやＲＮＡを導入することによって遺伝子改変することが可能である。これらの方法は大まかに４つの大きなカテゴリーに分類される。すなわち、（１）例えばレトロウイルス（レンチウイルスなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルス、及びウシパピローマウイルスなどのＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの使用を含むウイルスによる導入法、（２）リン酸カルシウムトランスフェクション及びＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法などの化学的導入法、（３）例えば、リポソーム、赤血球ゴースト、及びプロトプラストなどの、ＤＮＡを充填した膜小胞を用いた膜融合導入法、（４）マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または直接的な「裸」のＤＮＡの導入などの物理的導入法である。多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、予め選択した単離ＤＮＡの挿入、予め選択した単離ＤＮＡによる細胞ゲノムのセグメントの置換、または、細胞のゲノムの少なくとも一部の欠失または不活化によって遺伝子改変することが可能である。細胞ゲノムの少なくとも一部の欠失及び不活化は、例えば、遺伝子組換え、アンチセンス法（ペプチド核酸すなわちＰＮＡの使用を含む）、リボザイム法などの様々な方法によって行うことが可能である。１以上の予め選択されたＤＮＡ配列の挿入は相同組換えやホスト細胞のゲノムへのウイルスによる挿入によって行うことが可能である。プラスミド発現ベクターや核局在化配列を用いて所望の遺伝子配列を細胞内、特に細胞核内に導入することも可能である。ポリヌクレオチドを核に誘導する方法は当該技術分野にあっては周知のものである。遺伝物質は、対象遺伝子を特定の化学物質／薬剤の使用によりポジティブまたはネガティブに誘導するか、特定の薬剤／化学物質の投与後に消失させるか、化学物質（タモキシフェン応答性突然変異エストロゲン受容体など）による誘導または特定の細胞区画（細胞膜など）中における発現を可能とするように標識可能であるプロモーターを利用して導入することが可能である。

【0151】

相同組換え
リン酸カルシウムトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡ／カルシウムイオンの沈殿物を利用したものであり、標的遺伝子またはポリヌクレオチドを組み込んだプラスミドＤＮＡを単離または培養ＭＡＳＣに導入するために用いることできる。簡略に述べると、プラスミドＤＮＡを塩化カルシウムの溶液に混合した後、リン酸緩衝した溶液に加える。沈殿物が形成された時点でこの溶液を培養細胞に直接加える。ＤＭＳＯまたはグリセロールによる処理を利用してトランスフェクション効率を向上させることが可能であり、ビス−ヒドロキシエチルアミノエタンスルホネート（ＢＥＳ）を使用して安定的トランスフェクタントのレベルを高めることが可能である。リン酸カルシウムトランスフェクションシステムは一般に市販されている（例、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標）、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）、ウィスコンシン州マディソン）。

【0152】

ＤＥＭＥデキストラントランスフェクション法はやはり当業者に周知の方法であり、一過性のトランスフェクションが望ましい場合には、しばしばより効率が高いことからリン酸カルシウムトランスフェクション法よりも好ましい。

【0153】

本発明の細胞は単離細胞であるため、細胞内に遺伝物質を導入するにはマイクロインジェクションが特に効果的である。

【0154】

簡略に述べると、細胞をまず光学顕微鏡のステージに乗せる。顕微鏡による拡大像を見ながらガラス製のマイクロピペットを核に穿刺してＤＮＡまたはＲＮＡを注入する。この方法は所望の遺伝物質を直接核に導入することが可能であり、注入されたポリヌクレオチドの細胞質やリソゾームにおける分解が避けられるために有利である。この方法は形質転換動物の生殖細胞の改変に効果的に用いられてきた。

【0155】

本発明の細胞はエレクトロポレーションによって遺伝子改変することができる。まず標的ＤＮＡまたはＲＮＡを培養細胞の懸濁液に加える。このＤＮＡ／ＲＮＡ−細胞懸濁液を２個の電極間に置き、電気パルスを加えると、細胞の外膜に小孔が開くことによって膜に一時的に透過性が生じる。この膜に開いた小孔から細胞内に標的ポリヌクレオチドが入り込み、電場を中断すると小孔は約１〜３０分で閉鎖する。細胞を遺伝子改変するためのＤＮＡやＲＮＡのリポソームによる導入は、ポリヌクレオチドと安定的な複合体を形成するカチオン性リポソームを利用して行うことができる。リポソーム複合体を安定化させるためにジオレイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレイルフォスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を添加することが可能である。リポソーム導入法用に推奨される試薬は一般に市販されているＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））である。例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）は、カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロリドとＤＯＰＥとの混合物である。線形ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡやＲＮＡの導入は、リポソーム導入法によりｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことが可能である。リポソームは大きなＤＮＡ片を包含することが可能であり、ポリヌクレオチドを分解から保護し、特定の細胞または組織を狙って投与することが可能であることからリポソーム導入法は好ましい方法である。リポソーム法に依拠した他の導入システムが数多く市販されており、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（キアジェン社（Ｑｉａｇｅｎ））、ＤＯＴＡＰ（ロシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、ＦｕＧｅｎｅ６（商標）（ロシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社）、及びＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））などがある。カチオン性脂質による遺伝子導入効率は、アベ等の方法（Abe, A.,etal.(J.Virol. (1998) 72: 6159-6163)）におけるように、水泡性口内炎ウイルスエンベロープの精製Ｇ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などの精製したウイルスまたは細胞エンベロープ成分を使用することによって高めることが可能である。

【0156】

リポポリアミンコーティングしたＤＮＡを用いた始原及び樹立された哺乳動物細胞系へのＤＮＡの導入において有効であることが示されている遺伝子導入法を用いてＭＡＳＣに標的ＤＮＡを導入することが可能である。この方法はＬｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．及びＢｅｈｒ，Ｊ．により一般的に述べられている（Loeffler,J. and Behr, J. Methods in Enzymology (1993) 217:599-618）。

【0157】

裸のプラスミドＤＮＡは単離ＭＡＳＣから分化した細胞からなる組織マス中に直接注入することが可能である。この方法はプラスミドＤＮＡを骨格筋組織に導入するうえで有効であることが示されており、マウス骨格筋内での発現が１回の筋内注入後１９ヶ月以上にわたって観察されている。活発に分裂中の細胞はより効率的に裸のプラスミドＤＮＡを取り込む。このため、プラスミドＤＮＡによる処理に先立って細胞分裂を刺激しておくことが有利である。

【0158】

マイクロプロジェクタイルによる遺伝子導入を利用してｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにてＭＡＳＣに遺伝子を導入することも可能である。マイクロプロジェクタイル遺伝子導入法の基本的な手順についてはＪ．ＷｏｌｆｆによりＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （１９９４）の１９５頁に述べられている。簡略に述べると、標的遺伝子をコードしたプラスミドＤＮＡで、通常１〜３ミクロンの粒径を有する金またはタングステン粒子である微小なビーズをコーティングする。コーティングした粒子は発射室の上方に挿入されたキャリアシート上に置く。キャリアシートは発射後保持スクリーンに向かって加速される。保持スクリーンはキャリアシートの更なる運動を阻止するバリアとして機能し、その際、ポリヌクレオチドコーティングされた粒子は、分化ＭＡＳＣからなる組織マスなどの標的表面に向けて通常ヘリウムガスの流れによって推進される。微粒子注入法は既に述べられているものであり、こうした方法は当業者に周知のものである（参照、Johnston,S.A.,et al., Genet. Eng. (NY) (1993) 15: 225-236; Williams,R.S., et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1991)88: 2726-2730; Yang,N.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1990) 87:9568-9572）。

【0159】

Ｓｅｖｅｓｔｙｅｎ等（Nature Biotech.(1998) 16: 80-85）によって述べられている
ように、プラスミドＤＮＡにシグナルペプチドを結合させてこのＤＮＡを細胞核に取り込ませることでより効率的な発現を図ることが可能である。

【0160】

ウイルスベクターを利用して本発明のＭＡＳＣ及びその子孫を遺伝子改変することが可能である。先に述べた物理的方法と同様、ウイルスベクターを利用して例えば１以上の標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子やリボザイム配列を細胞内に導入する。ウイルスベクター及びそれらを利用して細胞にＤＮＡを導入する方法は当業者に周知のものである。本発明の細胞を遺伝子改変するうえで使用可能なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）、アルファウイルスベクター（例、シンドビスベクター）、及びヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。

【0161】

多くのレトロウイルスベクターが分裂していない細胞に効果的にＤＮＡを導入するために開発されているが、レトロウイルスベクターは活発に分裂中の細胞に形質導入するうえで有効である（Mochizuki,H.,et al., J. Virol. (1998) 72: 8873-8883）。レトロウイルス用のパッケージング細胞系は当業者には周知のものである。パッケージング細胞系はウイルスベクターのカプシドの生成及びウイルス粒子の成熟に必要なウイルスタンパク質を与えるものである。一般にこうしたウイルスタンパク質としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖといったレトロウイルスの遺伝子によりコードされるタンパク質が含まれる。エコトロピック、ゼノトロピック、またはアンフォトロピックのレトロウイルスベクターを生成するうえで好適なパッケージング細胞系を既知の細胞系から選択することにより、レトロウイルスベクター系に一定の特異性を与えるものである。

【0162】

一般にレトロウイルスＤＮＡベクターはパッケージング細胞系とともに細胞内で所望の標的配列／ベクターの組合わせを産生するために用いられる。簡略に述べると、レトロウイルスＤＮＡベクターは、マルチクローニング部位とＳＶ４０プロモーターの近くに２個のレトロウイルスＬＴＲ配列を有するプラスミドＤＮＡである。第１のＬＴＲは、マルチクローニング部位にクローニングされた標的遺伝子の配列に機能的に連関しているＳＶ４０プロモーターの５’側に位置し、マルチクローニング部位の後に３’側の第２のＬＴＲが位置する。レトロウイルスＤＮＡベクターはその形成後、上述したようなリン酸カルシウムトランスフェクションによってパッケージング細胞系内に導入される。約４８時間のウイルス産生後に、標的遺伝子配列を含むウイルスベクターを収穫する。

【0163】

レトロウイルスベクターにより特定の種類の細胞に遺伝子導入する方法はＭａｒｔｉｎ等（J. Virol. (1999) 73: 6923-6929）によって示されている。この方法では、アンフォトロピックなマウス白血病ウイルスのエンベロープに融合させた表面糖タンパクである高分子量メラノーマ関連抗原に対する一本鎖可変フラグメント抗体を利用して、ベクターによりメラノーマ細胞に狙いを絞って標的遺伝子を導入している。例えば、分化細胞を遺伝子改変する場合などのように、標的細胞に狙いを定めた遺伝子導入が望ましい場合には、本発明のＭＡＳＣから分化した各細胞系列が発現する特異的マーカーに対する抗体フラグメントに融合させたレトロウイルスベクターを使用してこれらの細胞に狙いを絞って遺伝子を導入することが可能である。

【0164】

レンチウイルスベクターを利用して本発明の細胞を遺伝子改変することも可能である。多くのこうしたベクターが文献に述べられており、当業者に周知である（Salmons,B.and
Gunzburg, W.H., "Targeting of RetroviralVectors for GeneTherapy,"Hum. Gene. Therapy (1993) 4: 129-141）。これらのベクターはヒト造血幹細胞を遺伝子改変するうえ
で有効であることが示されている（Sutton,R., et al., J. Virol. (1998) 72: 9683-9697）。レンチウイルスのパッケージング細胞系については既に述べられている（参照、Kafri,T.,etal., J. Virol. (1999) 73: 576-584; Dull, T., et al., J. Virol.(1998) 72:9683-9697）。

【0165】

Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）などの組換えヘルペスウイルスを利用して、エリスロポエチン受容体を発現している細胞に狙いを絞ってＤＮＡを導入する試みが成功している（Laquerre,S.,et al., J. Virol. (1998) 72: 9683-9697）。これらのベクタ
ーを利用して本発明の細胞を遺伝子改変することも可能であり、ウイルスベクターにより本発明の細胞が安定的に形質転換されたことを発明者等は証明している。

【0166】

アデノウイルスベクターは形質転換効率が高く、最大で８ＫｂのＤＮＡフラグメントの導入が可能であり、分裂中細胞及び分化細胞のいずれにも感染することができる。多くのアデノウイルスベクターが文献に述べられており、当業者に周知である（参照、Davidson,B.L.,et al., Nature Genetics (1993) 3: 219-223;Wagner, E., et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA (1992) 89: 6099-6103）。標的ＤＮＡをアデノウイルスベクターに挿入
する方法は、組換えアデノウイルスベクターを利用して標的ＤＮＡを特定の種類の細胞に導入するための方法と同様、遺伝子治療の技術分野における当業者にとって周知のものである（参照、Wold,W.,AdenovirusMethods and Protocols, Humana Methods in MolecularMedicine (1998),BlackwellScience, Ltd.）。特定の種類の細胞に対する結合親和性がウイルスベクター繊維の配列の改変によって証明されている。遺伝子導入においてタンパク質の発現を調節するためのアデノウイルスベクター系がこれまでに述べられている（Molin,M.,etal., J. Virol. (1998) 72: 8358-8361）。特定種類の細胞に狙いを絞った形
質転換を可能とすべく遺伝子改変された受容体特異性を有するアデノウイルスベクターを伝播させるための系もこれまでに述べられている（Douglas,J.,etal., Nature Biotech.
(1999) 17: 470-475）。最近の報告に見られるヒツジアデノウイルスベクターは、予め
存在する体液性免疫による遺伝子導入の際の障害の可能性を解消するものである（Hofmann,C., etal., J.Virol. (1999) 73:6930-6936）。

【0167】

更に、分子接合体ベクターを利用して特定細胞を標的とした遺伝子導入及び安定的遺伝子発現を可能とするアデノウイルスベクターが入手可能である。このベクターは標的遺伝子を有するプラスミドＤＮＡをポリリシンとともに濃縮して構築される。このポリリシンは分裂能を失ったアデノウイルスに結合させてある（Schwarzenberger,P.,etal., J. Virol. (1997)71） 8563-8571）。

【0168】

本発明の細胞を形質転換するためのアルファウイルスベクター、特にシンドビスウイルスベクターも入手可能である。これらのベクターは市販されており（インビトロジェン社、カリフォルニア州、カールスバッド）、例として米国特許第５，８４３，７２３号、Ｘｉａｎｇ，Ｃ．等（Science(1989)243: 1188-1191）、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．等（J.Virol. (1993) 67: 6439-6446）及びＦｒｏｌｏｖ，Ｉ．等（Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1996) 93: 11371-11377）などに述べられている。

【0169】

発明者等は、Ｒｏｂｂｉｎｓ等（J. Virol. (1997) 71 (12): 9466-9474）により述べ
られるｅＧＦＰ−ＭＮＤレンチウイルスベクター及びｅＧＦＰ−ＭＧＦベクターを用いた場合にＭＡＳＣが良好な形質転換能を有することを示した。この方法を用いると、ＰＡ３−１７パッケージング細胞（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．及びＣ．Ｂｕｔｔｉｍｏｒｅにより述べられる（Mol.Cell.Biol.(1986) 6: 2895-2902）ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞から誘導されるアンフォトロピックなパッケージング細胞系）とプロタミン（８ｍｇ／ｍｌ）の組合わせ中で調製された上清を含む緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ベクターに４．６時間と短時間の露曝後に３０〜５０％のＭＡＳＣを形質転換することが可能である。未分化のＭＡＳＣの培養期間全体を通じてｅＧＦＰの発現が見られる。更に、リポフェクタミンを用いたトランスフェクションによって導入遺伝子がＭＡＳＣに首尾良く導入されている。

【0170】

標的細胞へのトランスフェクションまたは形質導入は当業者に周知の方法において遺伝子マーカーを用いて証明することが可能である。例えばＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質は遺伝子改変された造血細胞の特定及び追跡において有効なマーカーであることが示されている（Persons,D.,et al., Nature Medicine (1998) 4: 1201-1205）。別の選択可能なマーカーとしては、β−Ｇａｌ遺伝子、ｔｒｕｎｃａｔｅｄ
神経成長因子受容体、薬物選択マーカー（ＮＥＯ、ＭＴＸ、ヒグロマイシンなど）などが挙げられる。

【0171】

１７．ＭＡＳＣは組織の修復に有用である
本発明の幹細胞は組織修復に用いることも可能である。発明者等は、本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）が、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質細胞、平滑筋、心筋、及び造血細胞などの多くの種類の細胞に分化することを証明した。例えば、本明細書にて先に述べた方法により骨芽細胞へと分化誘導したＭＡＳＣを骨に移植することにより、修復プロセスを促進し、弱くなった骨を強化し、関節表面を再形成することが可能である。先に述べた方法により軟骨細胞へと分化誘導したＭＡＳＣを関節に注入して関節軟骨の表面を再形成することが可能である。Ｃａｐｌａｎ等（米国特許第５，８５５，６１９号）は、間葉幹細胞を含む収縮ゲルマトリクスからなる生体マトリクスインプラントについて述べている。このインプラントは、特に腱、靱帯、半月板や筋肉といった組織の欠損を修復するように設計されたものである。例えばコラーゲン、合成ポリグリコール酸繊維、または合成ポリ乳酸繊維などから形成される多孔質の立体的足場に接するように軟骨細胞を加えることによって例えば軟骨を形成することが可能である。発明者等は、本発明のＭＡＳＣを例えば軟骨細胞に分化させ、これをコラーゲン、合成ポリグリコール酸や合成ポリ乳酸などの足場材料の内部もしくは周囲に蓄積することによって組織修復を促すインプラントが得られることを示した。

【0172】

更に、マトリクスにより本発明の細胞を特定の解剖学的部位に導入し、ここでマトリクスに含まれるか、または細胞に取り込まれるようにマトリクスに含ませたプラスミドにコードされた特定の成長因子によって初期の細胞集団の成長を方向付けることが可能である。例えば、特定のポリマーマトリクスを形成する際の発泡工程においてマトリクスの孔内にＤＮＡを取り込ませることが可能である。発泡工程において使用されるポリマーが膨張すると孔内にＤＮＡが閉じ込められ、これによりプラスミドＤＮＡの放出を制御し、ＤＮＡを徐放することが可能となる。こうしたマトリクスの調製方法はＳｈｅａ等（NatureBiotechnology(1999) 17: 551-554）によって述べられている。

【0173】

Ｂｏｎａｄｉｏ，Ｊ．等（Nature Medicine (1999) 5: 753-759）に述べられるように
、サイトカイン、成長因子やホルモンをコードするプラスミドＤＮＡを遺伝子活性化ポリマーマトリクス担体に閉じ込めることが可能である。この生分解性ポリマーを例えば折れた骨の近傍に移植し、そこにＭＡＳＣを移植するとＭＡＳＣがＤＮＡを取込んでサイトカイン、成長因子やホルモンを産生して局所濃度が高くなり、これにより損傷組織の治癒が早められる。

【0174】

本発明の提供する細胞すなわち本発明の方法によって単離されるＭＡＳＣを利用して移植用の組織または臓器を製造することが可能である。Ｏｂｅｒｐｅｎｎｉｎｇ等（NatureBiotechnology(1999)17: 149-155）によれば、イヌの膀胱の外面より得た筋細胞とイヌ
膀胱の内面より得たライニング細胞を培養し、この培養から組織のシートを調製し、小型のポリマー製球体の外側を筋細胞で、内側をライニング細胞でコーティングすることによって機能する膀胱を形成し得たことが報告されている。この球体をイヌの尿路系に挿入すると、球体は膀胱としての機能を開始した。Ｎｉｃｋｌａｓｏｎ等（Science(1999)284:489-493）によれば、培養した平滑筋及び内皮細胞より所定長の血管グラフト材料を製造
し得たことが報告されている。培養細胞から組織層を形成するための他の方法も当業者に周知である（参照、Vacanti,etal., 米国特許第５，８５５，６１０号）。これらの方法
は、これまでに述べられているいずれの非胚性幹細胞と比較してもより幅広い分化能を有する本発明の細胞と組み合わせて使用した場合に特に有効である。

【0175】

本発明のＭＡＳＣは組織損傷領域に直接注入するかまたは全身的に注入することにより心筋細胞を復元することが可能であり、これにより細胞が心組織に生着する。この方法は血管形成と組み合わせた場合に特に有効である。注入方法及び血管形成の促進方法はいずれも当業者に周知のものである。本発明のＭＡＳＣは、これらの方法を利用した心または他の組織修復のためのより多様な細胞の供給源を与える幅広い分化能を有するものである。

【0176】

本発明のＭＡＳＣは、例えば高投与量の化学療法後の骨髄を再生する目的で有用である。化学療法を行う前に患者から骨髄吸引液を採取する。本発明の方法により幹細胞を単離し、培養、分化誘導する。この後、分化細胞と未分化細胞の混合物を患者の骨髄腔に再導入する。現在この目的で造血幹細胞を用いた臨床試験が行われているが、本発明のＭＡＳＣは骨髄ばかりでなく他の組織の化学療法によって損傷した細胞をも置換することが可能な細胞に更に分化可能であるという更なる利点を有するものである。

【0177】

また、Ｌａｗｍａｎ等（国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／４２８３８号）により述べられる方法を用いて同種異系ドナー由来の幹細胞の組織適合性抗原を変化させることも可能である。この方法を用いることにより、凍結ストックを調製し、これを保存して、例えば白血病患者の場合のように、自身の骨髄を再形成できない患者に投与するために利用可能な移植骨髄のパネルを形成することが可能である。

【0178】

患者の免疫系細胞や血液細胞は、例えば、患者から自家幹細胞を単離し、この細胞を培養して細胞集団を増殖させた後、患者に細胞を再導入することによりその数を復元することが可能である。この方法は、例えば多発性骨髄腫、非ホジキン型リンパ腫、自己免疫疾患や充実性腫瘍を診断された患者のように、治療目的で放射線照射及び／または化学療法によって免疫系や骨髄細胞を減少させる必要がある場合に特に有効である。

【0179】

白血病、自己免疫疾患、鎌状赤血球貧血症やサラセミアなどの遺伝病を治療する目的での、本発明の、もしくは本発明の方法により単離された、同種異系の細胞による患者の血液や免疫系細胞の復元は、特にＬａｗｍａｎ等（国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／４２８３８号）により述べられる方法によって組織適合性抗原が変化させられている場合に行うことが可能である。

【0180】

本明細書中に述べられる目的の実現のため、本発明の自己由来または同種異系ＭＡＳＣを、分化または未分化の状態で、遺伝子を改変するかまたは改変することなく、組織部位への直接注入、全身注入、許容されるマトリクスの表面上もしくはその近傍に、または薬学的に許容される担体との組合わせとして、患者に投与することが可能である。

【0181】

１９．ＭＡＳＣによって分化経路を研究するためのモデル系が与えられる
本発明の細胞は更に発生過程の更なる研究を行ううえでも有用である。例えば、Ｒｕｌｅｙ等（国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／４０４６８号）は特定の遺伝子の発現を阻害するとともに、阻害された遺伝子のＤＮＡ配列を得るためのベクター及び方法について述べている。本発明の細胞をＲｕｌｅｙにより述べられるようなベクターで処理し、これによりＤＮＡ配列解析によって特定可能な遺伝子の発現を阻害することが可能である。この細胞を分化誘導し、改変された遺伝子型／表現型の影響を調べることが可能である。

【0182】

例えばＨａｈｎ等（Nature (1999) 400: 464-468）は、正常なヒト上皮繊維芽細胞に以前より癌との相関が示されている遺伝子の特定の組合わせを導入すると細胞が癌化するように分化誘導することが可能であることを証明した。

【0183】

誘導可能な発現エレメントを有するベクターを利用した遺伝子発現の制御によって、特定の遺伝子産物が細胞分化に与える影響を調べるための方法が与えられる。誘導発現系は当業者に周知のものである。このような系の一つにＮｏ，Ｄ．等（Proc.Natl.Acad. Sci. USA (1996) 93: 3346-3351）によって述べられるエクジソン誘導系がある。

【0184】

ＭＡＳＣを利用して、特定の遺伝子変化、毒物、化学療法薬や他の薬剤が発生経路に与える影響を調べることが可能である。当業者には周知の組織培養法によれば、異なる個人から得られた数十万もの細胞試料の大量培養が可能となるため、例えば催奇形性または突然変異誘発性が疑われる化合物の高速スクリーニングを行うことが可能となる。

【0185】

発生経路を研究する目的で、催奇形性が疑われる化合物を含む、特定の成長因子、サイトカインなどの薬剤にてＭＡＳＣを処理することが可能である。ＭＡＳＣはこれまでに述べられている方法及びベクターによって遺伝子改変することも可能である。更に、ＭＡＳＣをアンチセンス技術や細胞に導入されるタンパク質による処理によって改変して天然遺伝子配列の発現を改変することが可能である。例えばシグナルペプチド配列を利用して所望のペプチドやポリペプチドを細胞内に導入することが可能である。ポリペプチド及びタンパク質を細胞内に導入するうえで特に効果的な方法の一つがＲｏｊａｓ等（NatureBiotechnology(1998) 16: 370-375）により述べられている。この方法によれば、培地に導入することにより細胞膜を通過して細胞の内部へと移動するポリペプチドまたはタンパク質産物が得られる。任意の数のタンパク質をこのように使用して細胞の分化に対する標的タンパク質の影響を調べることが可能である。また、Ｐｈｅｌａｎ等（NatureBiotech.(1998)16: 440-443）によって述べられる方法を用いてヘルペスウイルスタンパク質であるＶＰ２２を機能性タンパク質に結合させて細胞内に輸送することも可能である。

【0186】

本発明の細胞は、外来遺伝子の導入またはゲノムＤＮＡの発現の抑制またはＤＮＡの切り出しによって遺伝子操作することにより、化学療法剤や遺伝子治療ベクターとしての潜在的有効性を試験するための欠陥表現型を有する分化細胞を作出することが可能である。

【0187】

２０．ＭＡＳＣは高スループットスクリーニング用の多様な種類の分化及び未分化培養細胞を与える
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、例えば９６穴などの多穴培養プレートで培養することにより、例えば、標的サイトカイン、ケモカイン、生長因子、または薬理ゲノミクスや薬理遺伝学における薬理組成物について高スループットスクリーニングを行うための系を得ることが可能である。本発明のＭＡＳＣは、細胞を同一個体由来の特定の細胞系に分化させることができるという唯一の系を与えるものである。多くの１次培養と異なり、これらの細胞は培養中で維持して長期にわたって観察することができる。同一個体及び異なる複数の個体に由来する細胞の複数の培養を対象となる因子にて処理してその細胞因子が同じ遺伝子組成の異なる種類の分化細胞に与える影響、または遺伝子組成の異なる個体に由来する類似した種類の細胞に与える影響に差異が認められるかを判定することが可能である。したがって、例えばサイトカイン、ケモカイン、薬理組成物、及び成長因子を速やかかつ高いコスト効率にてスクリーニングし、その効果をより明らかに解明することが可能である。大きな個体集団から単離し、遺伝子多型、特に一塩基多型の有無に関して特徴付けられた細胞を細胞培養バンクで保管して各種のスクリーニング法に供することが可能である。例えば、当業者には周知の方法によって決定することが可能な統計的に有意な個体集団から得た多能性成体幹細胞によって、広範な物質に対する陽性または陰性の応答の増強に関連した多型を特定するための高スループットスクリーニング用の理想的な系が与えられる。このような物質の例としては、薬理組成物、ワクチン調製物、細胞障害性物質、突然変異誘発物質、サイトカイン、ケモカイン、生長因子、ホルモン、阻害物質、化学療法剤、及びその他の化合物または因子のホストが挙げられる。こうした研究から得られる情報は、感染症、癌、ならびに多くの代謝性疾患の治療において幅広い応用が考えられる。

【0188】

生物学的、または薬学的物質、またはこうした物質のコンビナトリアルライブラリーに対する細胞応答を特徴付けるためにＭＡＳＣを利用する方法では、ＭＡＳＣを統計的に有意な個体集団から単離し、培養を増殖させ、１以上の生物学的または薬学的物質に接触させる。ＭＡＳＣは、分化細胞が特定の生物学的または薬学的物質の所望の標的である場合に、培養の増殖の前もしくは後に分化誘導することが可能である。統計的に有意な個体集団の複数の個体から得られたＭＡＳＣ培養間で１以上の細胞応答を比較することにより、当該生物学的または薬学的物質の効果を判定することが可能である。また、遺伝子組成が同一のＭＡＳＣまたはこの細胞から分化した細胞を利用して、コンビナトリアルライブラリーの化合物などの異なる化合物をスクリーニングすることも可能である。細胞に基づいた高スループットスクリーニングと組み合わせて用いられる遺伝子発現系についてはこれまでに述べられている（参照、Jayawickreme,C.and Kost, T., Curr. Opin.Biotechnol. (1997) 8: 629-634）。内皮細胞活性化の阻害物質を同定するために用いられる高容量
スクリーニング法についてはＲｉｃｅ等によって述べられるものがあり、始原ヒト臍静脈内皮細胞についての細胞培養系を利用したものである（Rice,etal.,Anal. Biochem. (1996) 241: 254-259）。本発明の細胞によれば、標的とする多数の生物学的及び薬学的物質を同定するうえで用いられる高スループットスクリーニング法のための、最終分化及び未分化の各種の細胞が与えられる。最も重要な点としては、本発明の細胞によって、生物学的及び薬学的物質に対する応答が異なる多様な遺伝子を有する個体群から培養細胞の供給源が与えられることである。

【0189】

ＭＡＳＣは単独または予めパッケージングされた培地及び培養用の補足物質とともに凍結ストックとして提供され、更には、別個にパッケージングされた、特定の種類の細胞を分化誘導するための有効濃度の適当な因子とともに提供される。また、ＭＡＳＣは、当業者に周知の方法によって調製され、上記に述べた方法により分化誘導された細胞を含む凍結ストックとして提供することも可能である。

【0190】

２１．ＭＡＳＣと遺伝子プロファイル
遺伝子の変異は疾病に対する感受性に対して直接、間接の影響を与える。直接的なケースでは、一塩基多型（ＳＮＰ）を生ずる１個のヌクレオチドの変化によっても、タンパク質のアミノ酸配列は変化し、疾病や疾病に対する感受性に直接影響する。生じたタンパク質の機能的変化はしばしばｉｎ ｖｉｔｒｏにて検出することが可能である。例えば、ある種のＡＰＯリポタンパク質Ｅの遺伝子型は特定の患者においてアルツハイマー病の発症及び進行との関連が示されている。

【0191】

ＤＮＡ配列の異常は、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップ技術、及び当業者に周知の他の方法によって検出することが可能である。ヒトのゲノムにおけるタンパク質のコード領域は約３％程度でしかないと推定されており、コード領域には恐らく２００，０００〜４００，０００個の共通のＳＮＰが存在するものと推定されている。

【0192】

ＳＮＰ関連遺伝子解析を用いたこれまでの研究方法では、表現型の特徴付けを行うことが可能な多数の個体から遺伝子解析用の試料を得ていた。残念なことにこうした方法で得られた遺伝的相関は、容易に特定可能な表現型に関連した特定の多型の同定に限定されており、疾患の原因に関する更なる情報を与えるものではなかった。

【0193】

本発明のＭＡＳＣは、特定の疾患に関連した遺伝子要素の特定と、その疾患を有する患者に見られる最終的な表現型との間に橋渡しをするうえで必要な要素を与えるものである。簡略に述べると、まず、表現型に関するデータを得ることが可能な統計的に有意な個体集団からＭＡＳＣを単離する（参照、Collins,etal., Genome Research (1998) 8: 1229-1231）。次いで得られたＭＡＳＣ試料を培養して増殖させ、細胞の２次培養を凍結スト
ックとして保存する。この凍結ストックは後の発生実験で使用する培養を得るために使用することが可能である。増殖させた細胞集団について複数の遺伝子解析を行って遺伝子多型を特定することが可能である。例えば、当業者に周知のＤＮＡチップ技術などの現時点で可能な方法を用いて、大きな標本集団において比較的短時間で一塩基多型を特定することが可能である（Wang,D.,etal., Science (1998) 280: 1077-1082; Chee, M., et al.,
Science(1996) 274:610-614; Cargill, M., et al., Nature Genetics (1999)22:231-238; Gilles, P., etal., Nature Biotechnology (1999) 17:365-370; Zhao,L.P., et al., Am. J. HumanGenet. (1998) 63: 225-240）。ＳＮＰ解析のための方法についてもＳ
ｙｖａｎｅｎ、Ｘｉｏｎｇ、Ｇｕ、Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｈｏｗｅｌｌ、Ｂｕｅｔｏｗ、及びＨｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎによってこれまでに述べられている（Syvanen,A.,Hum.Mut. (1999) 13: 1-10）、（Xiong, M. and L. Jin, Am. J. Hum.Genet. (1999)64:629-640）、
（Gu, Z., et al., Human Mutation (1998) 12:221-225）、（Collins, F., etal., Science(1997) 278: 1580-1581）、（Howell,W., et al., Nature Biotechnology(1999) 17:
87-88）、（Buetow, K., et al., NatureGenetics (1999) 21: 323-325）、（Hoogendoorn,B.,et al., Hum. Genet. (1999) 104: 89-93）。

【0194】

特定の多型が特定の疾患の表現型に関連している場合、その多型のキャリアであることが特定された個体から得た細胞を、非キャリア個体から得た細胞をコントロールとして用いて、発生異常について調べることが可能である。本発明のＭＡＳＣは、本明細書中に述べられた所定の方法及び当業者に周知の他の所定の方法を用いて特定の種類の細胞に分化誘導することが可能であることより、特定の遺伝子疾患に関連した発生異常を研究するための実験系を与えるものである。例えば、特定のＳＮＰが特定の神経変性性疾患と関連している場合、未分化のＭＡＳＣ及びニューロン前駆細胞、グリア細胞などの神経由来の細胞に分化したＭＡＳＣの両方を利用して、その多型の細胞への影響を調べることが可能である。特定の多型を示す細胞を分化の過程で追跡することにより、薬物感受性、ケモカイン及びサイトカイン応答性、成長因子、ホルモン、及び阻害物質に対する応答性、ならびに受容体の発現及び／または機能の変化に対する応答性に影響を与える遺伝子要素を特定することが可能である。この情報は遺伝子を原因とする疾患や遺伝的素因が認められる疾患の治療方法を模索するうえで極めて有用である。

【0195】

ＭＡＳＣを用いた、生理学的異常に関連した遺伝子多型を特定するための本方法においては、表現型に関するデータを得ることが可能な統計的に有意な個体集団からＭＡＳＣを単離し（統計的に有意な集団とは、少なくとも１個の遺伝子多型を有する要素が含まれる充分なサイズの集団として当業者により定義される）、培養を増殖させてＭＡＳＣ培養を樹立する。次いで培養細胞から得たＤＮＡを用いて集団から得られた培養ＭＡＳＣにおける遺伝子多型を特定し、細胞を分化誘導する。正常な遺伝子型を有するＭＡＳＣが示す分化のパターンと特定された遺伝子多型を有するかまたは候補薬に対する応答を示すＭＡＳＣが示す分化のパターンとを比較することにより特定の遺伝子多型に関連した異常代謝プロセスを同定、特徴付けることが可能である。

【0196】

２２．ＭＡＳＣによって安全なワクチン投与が可能となる
本発明のＭＡＳＣを抗原性タンパク質を産生するように遺伝子改変することにより抗原提示細胞として利用することも可能である。例えば複数の遺伝子改変を行った自家または同種異系の前駆細胞を用い、対象細胞をトランスフェクトすべく徐放されるように生分解性マトリクス中に包埋したプラスミドと本発明の前駆細胞とを組み合わせることにより、１乃至複数の抗原に対する免疫応答を刺激することが可能であり、抗原提示細胞が徐放されることによって免疫応答の最大効果が高められる可能性がある。ある種の抗原を長期にわたって複数回投与すると最終抗原チャレンジにおいて免疫応答が高まることが当業者に知られている。また、Ｚｈａｎｇ等（NatureBiology(1998) 1: 1045-1049）の方法にお
いてＭＡＳＣを抗原提示細胞として利用して特定の抗原に対するＴ細胞の寛容を誘導することも可能である。

【0197】

現在使用されている多くのワクチン製剤には添加化学物質や他の物質が用いられている。その例として、抗生物質（ワクチン培養中での細菌の増殖を抑える）、アルミニウム（補助剤）、ホルムアルデヒド（細菌産物をトキソイドワクチンに対して不活化）、グルタミン酸１ナトリウム（安定剤）、卵タンパク質（発育鶏卵を利用して製造されるワクチンの成分）、亜硫酸塩（安定剤）、及びチメロサール（保存剤）などが挙げられる。一部これらの添加成分のため、現在のところワクチン製剤の安全性に関し社会的関心が広く高まっている。例えばチメロサールは水銀を含有し、塩化エチル水銀、チオサリチル酸、水酸化ナトリウム、及びエタノールの組合わせからなる。更に、決定的なものではないが、ある種のワクチン成分と、自己免疫に一般に関連付けられている疾患などの潜在的合併症との関係を示唆する研究もある。したがって、より効果的なワクチン療法が求められており、またワクチン接種の方法の快適度が高まるならばワクチン研究に対する社会的協力が容易に得られるであろう。

【0198】

本発明のＭＡＳＣは、樹状細胞へと分化させることが可能であり、この樹状細胞がＴ細胞に抗原を提示することによりＴ細胞が活性化されて異物に対する応答を生ずる。こうした樹状細胞は、先に述べられた方法を用いて外来抗原を発現するように遺伝子改変することが可能である。こうしたワクチン投与方法の利点は、１個の遺伝子改変細胞によって複数の抗原を提示することが可能な点である。

【0199】

異種由来の分化または未分化ＭＡＳＣワクチンベクターは、外来細胞表面のマーカーによって免疫系が刺激されるという更なる利点を与えるものである。ワクチンの設計実験において、複数の抗原による免疫応答の刺激により、ワクチン製剤中の特定の抗原に対する免疫応答が高められることが示されている。

【0200】

例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、水痘、ポリオ、ジフテリア、百日咳、破傷風、ライム病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、Ｂ型インフルエンザ（Ｈｉｂ）、ＢＣＧ、日本脳炎、黄熱病、及びロタウイルスについて免疫学的に有効な抗原が特定されている。

【0201】

本発明のＭＡＳＣを利用してヒト被験者において感染因子に対する免疫応答を誘導する方法は、培養中で多能性成体幹細胞のクローン集団を増殖させ、１以上の所定の抗原性分子を発現するよう、増殖した細胞を遺伝子改変して感染因子に対する防御免疫応答を刺激し、免疫応答を誘導するうえで有効量の遺伝子改変細胞を被験者に導入することによって行うことが可能である。遺伝子改変細胞の投与方法は当業者に周知のものである。免疫応答を誘導するうえで有効量の遺伝子改変細胞とは、当業者に周知の方法により測定可能な抗体反応を生ずるのに充分な量の所望の抗原を発現する細胞の量のことである。好ましくは、抗体反応とは、適当な感染因子によるチャレンジを行った場合の病気に対する耐性によって検出することが可能な防御抗体反応のことである。

【0202】

２３．ＭＡＳＣと癌治療
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、癌治療のための新規なビヒクルを与えるものである。例えば、ＭＡＳＣを内皮細胞、または局所的、全身的に投与した場合に内皮組織に生着する前駆細胞に分化誘導することが可能である。この細胞は、新生腫瘍に血液供給する血管形成（血管新生）に用いられ、ひいては内皮組織内で分裂、増殖する。外部から導入される因子の刺激によって細胞死するようにこの細胞を遺伝子操作することにより、血管新生を阻害して腫瘍への血流を遮断することが可能である。外部から導入される因子の一例としては抗生物質であるテトラサイクリンがあり、その場合、テトラサイクリン応答性因子の制御下で細胞死を誘発するＣａｓｐａｓｅやＢＡＤなどの遺伝子で細胞をトランスフェクトまたは形質導入する。テトラサイクリン応答性因子についてはこれまでに文献に述べられており（Gossen,M.& Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)89:5547-5551）、内皮細胞においてｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子の発現制御を可能とす
るものであり（Sarao,R. & Dumont, D.,Transgenic Res. (1998) 7: 421-427）、一般に
市販されている（CLONETECHLaboratories, PaloAlto, CA）。

【0203】

また、未分化のＭＡＳＣまたは組織特異的細胞系に分化させたＭＡＳＣを、腫瘍細胞を障害するか血管形成を阻害するような所定の産物（Ｄａｗｓｏｎ等により述べられる色素上皮誘導因子（ＰＥＤＦ）など（Dawson,etal., Science (1999) 285: 245-248））を産生するように遺伝子改変して、これを細胞外環境へと輸送させることも可能である。例えばＫｏｉｖｕｎｅｎ等は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（腫瘍形成への関連が示されているマトリクスメタロプロテアーゼ）を選択的に阻害する所定のアミノ酸配列を有する環状ペプチドについて述べている。この環状ペプチドは動物モデルにおいて腫瘍の成長及び浸潤を阻止し、ｉｎ ｖｉｖｏにて新生血管を特異的に標的とすることが示されている（Koivunen,E.,Nat.Biotech. (1999) 17: 768-774）。細胞を腫瘍部位に送達し、腫瘍阻害産物を産生させ、この後破壊することが望ましい場合には、誘導プロモーターの制御下で細胞死を促進する細胞死促進タンパク質を有するように更に細胞を遺伝子改変することが可能である。

【0204】

ＭＡＳＣは、患者から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏにて培養し、特に適当な抗原に対する高い免疫応答反応に関連が示されてる受容体との組み合わせにおいて該抗原を発現するようにｅｘ ｖｉｖｏにて遺伝子改変し、被験者に再導入して腫瘍細胞が発現するタンパク質に対する免疫応答を引き起こすことが可能であることから、癌ワクチンの投与用のベクターを更に与えるものである。

【0205】

２４．ＭＡＳＣ、またはＭＡＳＣ単離及び培養用の要素の入ったキット
本発明の多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、適当な梱包材料とともにキットとして提供される。例えば、ＭＡＳＣは、本明細書中に述べられるような別梱された未分化状態での培養用の適当な因子及び培地とともに凍結ストックの形で提供される。更に上記に述べたような別梱の分化誘導用の因子を提供することも可能である。

【0206】

本発明によれば、患者の幹細胞を単離、培養するうえで有効量の適当な因子を含むキットも提供される。臨床技師は、患者から骨髄吸引液を採取したならば、抗ＣＤ４５及び抗グリコフォリンＡはキットに入っているので、あとは本明細書中に述べられる方法で幹細胞を選択し、キットに入っている培地を使用して本発明の方法に則って細胞を培養するだけでよい。基本培地の組成については上記に述べられている。

【0207】

本発明の一態様は、臨床的状況下でヒト被験者からＭＡＳＣを単離するためのキットの調製である。同梱されたキットの要素を使用することで、単純な骨髄吸引液からＭＡＳＣを単離することが可能である。分化因子、培地、及び培養中でＭＡＳＣを分化誘導するための説明書が入った更なるキット要素を使用することで、患者自身の骨髄サンプルから抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団を得ることが臨床技師にとって可能となる。キットに入れられる更なる材料として、分化したＡＰＣによって発現、提示される適当な抗原をコードしたポリヌクレオチド投与用ベクターを提供することも可能である。例えばＢ型肝炎の表面抗原、Ａ型肝炎、アデノウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍや他の感染因子の防御抗原の遺伝子配列を有するプラスミドを例えば提供することが可能である。これらのプラスミドは、例えばキットに入っているリン酸カルシウムトランスフェクション用の材料及び使用説明書を使用することで培養ＡＰＣに導入することが可能である。遺伝子改変されたＡＰＣを患者の体内に再注入するための更なる材料を提供することも可能であり、これにより自家ワクチン投与システムが与えられる。

【0208】

本発明を以下の詳細な実施例にもとづいて更に説明する。

【実施例】

【0209】

実施例１．骨髄単核細胞からのＭＡＳＣｓの単離
８０人を越えるボランティアの後部腸骨稜から吸引した骨髄から骨髄単核細胞を得た。

【0210】

表３に示されるように、各被験者から１０〜１００ｃｍ^３の骨髄を得た。表３に、各被験者から単離された単核細胞のおおよその数を示した。単核細胞（ＭＮＣ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）（SigmaChemicalCo, St Louis, MO）上で骨髄を遠心分離して得た。骨髄ＭＮＣはＣＤ４５及びグリコフォリンＡマイクロビーズ（ミルテニーバイオテック社、カリフォルニア州サニーヴェイル）（MiltenyiBiotec,Sunnyvale,CA）とともに１５分インキュベートし、この試料をＳｕｐｅｒＭＡＣＳ磁石の前方に置くことでＣＤ４５^＋／Ｇｌｙ−Ａ^＋細胞を除去した。抽出された細胞は９９．５％がＣＤ４５⁻／Ｇｌｙ−Ａ⁻であった。

【0211】

表３に示されるように、ＣＤ４５^＋／ＧｌｙＡ^＋細胞の除去によって全骨髄単核細胞の約０．０５〜０．１０％を構成するＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞が回収された。

【0212】

【表3】

一般的な白血球抗原であるＣＤ４５、または赤血球前駆細胞のマーカーであるグリコフォリン−Ａ（ＧｌｙＡ）を発現していない細胞を選択した。ＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞は骨髄単核細胞の１／１０^３を構成する。ＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞を、フィブロネクチンにてコーティングし、２％ＦＣＳ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、デキサメタゾン、インスリン、リノレイン酸及びアスコルビン酸を添加したウェルに播種した。７〜２１日後に接着細胞の小集団が形成された。我々は限界希釈アッセイを用いて接着細胞集団を生ずる細胞の頻度を求めたところ５ｘ１０^３個のＣＤ４５⁻／ＧｌｙＡ⁻細胞につき１個の割合であった。

【0213】

コロニー（約１０^３個の細胞）が出現した時点で細胞をトリプシン処理により回収し、同様の培養条件下で３〜５日毎に１：４の希釈率で再播種した。細胞密度は２〜８ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２に保った。細胞の倍加時間は４８〜６０時間であった。１０〜１２回の細胞分裂後に蛍光発色細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）による免疫表現型分析を行った結果、細胞はＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ及びＣＤ６２−Ｐ、Ｍｕｃ１８、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ、及びＣＤ４４を発現していなかった。細胞はＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−クラスＩをまったく発現しておらず、β２マイクログロブリンを低レベルで発現していた。細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤｗ９０、Ｆｌｋ１に対する抗体によって強度に陽性染色された。このＭＡＳＣの表現型は細胞分裂が３０回を越えるまで変化が見られなかった（ｎ＝１５）。２〜５０才のドナーの内、８５％を上回るドナーから３０回以上の細胞分裂が可能で、すべての中胚葉性細胞（下記参照）に分化可能な細胞を含むＭＡＳＣ培養が樹立された。１０人のドナーについて細胞分裂が５０回を越えるまでＭＡＳＣを増殖させた。細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを補った無血清培地で培養したところ、細胞の倍加時間は長くなったが（＞６０時間）細胞分裂は４０回を上回った。ＩＧＦを含まず２％ＦＣＳを加えた培地で培養した細胞で見られたのと同様、無血清培地で培養した細胞はＨＬＡ−クラスＩ及びＣＤ４４について陰性であり、下記に述べるようにすべての中胚葉性表現型に分化可能であった。

【0214】

フィブロネクチンの代わりにＩ型コラーゲンまたはラミニン上に細胞を播種すると、細胞はＣＤ４４及びＨＬＡ−ＤＲを発現したが、細胞分裂が３０回を越えるまで増殖させることはできなかった。ＥＧＦまたはＰＤＧＦを省くと細胞は分裂せずに死滅したのに対し、これらのサイトカインを高濃度で添加するとＭＡＳＣは初期には増殖したが細胞分裂が２０〜３０回を越えると分裂は停止した。高濃度のデキサメタゾンを添加した場合にも細胞分裂は３０回を越えなかった。細胞を２％を越えるＦＣＳを添加した培地で培養するとＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−クラスＩを発現した。同様に高密度の培養（８ｘ１０^３細胞／ｃｍ^２）においてもＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−クラスＩ、ならびにＭｕｃ−１８が獲得されたが、これはＭＡＳＣについて述べられている表現型に類似している。高密度培養または高濃度のＦＣＳを添加しての培養では増殖能が失われ、細胞分裂は２５〜３０回を越えると停止した。

【0215】

我々は培養が樹立された段階で１細胞／ウェルとなるようにＭＡＳＣを再播種してＭＡＳＣのクローン化を試みた。３人のドナーから得た２０００個以上の細胞を、ＦＮコーティングを施し、同じ培地を入れた９６穴プレートに１個ずつ播種した。どのウェルについても細胞の増殖は見られなかった。注目に値するのは、細胞を１０細胞／ウェルで播種したところ約４％のウェルにおいて細胞の増殖が見られたことである。これらのウェルの内の５％の子孫は細胞数が１０^７個を越えるまで増殖させることができた。

【0216】

５人のドナー（２〜５０才）から得たＭＡＳＣを１５回の細胞分裂にわたって培養したところ、そのテロメアの長さは１１〜１６ｋＢであった。３人のドナーにおいてこれは同じドナーから得た血中リンパ球のテロメア長よりも３ｋＢ長かった。１人のドナーから得た細胞のテロメア長について、１５回、３０回、及び４５回の細胞分裂後にテロメア長を測定したところ変化は見られなかった。３０回の細胞分裂後に回収したＭＡＳＣに細胞遺伝学的分析を行ったところ、正常な核型を示した。

【0217】

実施例２．ＭＡＳＣｓの分化
骨芽細胞分化を誘導するために、無血清培地に１０^−７Ｍのデキサメタゾン、１０ｍＭのアスコルビン酸、および１０ｍＭのグリセロホスフェートを補足した。骨芽細胞分化は、骨発生に比較的特異的である、カルシウムの鉱質化、アルカリホスファターゼ発現、ならびに骨シアロタンパク質、オステオポンチン、オステオカルシンおよびオステオネクチンの産生の検出によって確認した（図７を参照）。

【0218】

軟骨分化を誘導するために、以前記載したように、無血清培地に、１００ng/mlのＴＧ
Ｆ−１（Ｐ＆Ｄ Systems, Minneapolis, MN）を補足した。細胞はフィブロネクチンに接
着している状態で、もしくは懸濁培養において分化誘導し、いずれの方法においても分化軟骨細胞が形成された。軟骨細胞を形成する分化は、II型コラーゲン、ならびにグリコサミノグリカンアグリカンの検出によって確認した（図７を参照）。

【0219】

脂肪細胞分化を誘導するために、１０^−７Ｍデキサメタゾンおよび１００μg/mlインシュリンを培地に添加した。また、無血清培地を２０％ウマ血清含有培地に置き換えることによって、脂肪細胞分化を誘導した。脂肪細胞分化は、ＬＰＬおよびａＰ２の検出によって検出した。

【0220】

骨格筋細胞分化を誘導するため、コンフルエンスが８０％を越えたＭＡＳＣを３μＭの５−アザシチジンで２４時間処理した後、ＥＧＦ及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えたＭＡＳＣ培地中で維持したところ、培養条件を変化させてから５日目には筋特異的タンパク質の発現が見られた。誘導２日目に、Ｍｙｆ５、Ｍｙｏ−Ｄ、及びＭｙｆ６転写因子を検出した。１４〜１８日後にはＭｙｏ−Ｄの発現レベルは大幅に低下したが、Ｍｙｆ５及びＭｙｆ６は高値に保たれた。誘導後４日目にはデスミン及びサルコメアアクチンを検出し、１４日目には速収縮性ミオシン及び遅収縮性ミオシンを検出した（図７）。免疫組織化学法により、１４日後には７０〜８０％の細胞が成熟筋タンパク質を発現していることが確認された。我々は２０％ウマ血清を添加して筋原細胞が多核化された筋管へと融合することを示した（図７）。注目に値する点として、５−アザシチジン処理によって更に、培養の第１週目にＧａｔａ４及びＧａｔａ６の発現が、１４日後には心筋トロポニンＴの発現が誘導された。更に誘導２日後に平滑筋アクチンが検出され、１４日目まで高値を保った。

【0221】

無血清ＭＡＳＣ培地中に１４日間維持してコンフルエンスに達したＭＡＳＣに１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを唯一のサイトカインとして添加したところ平滑筋細胞への分化が観察された。これらの細胞は平滑筋のマーカーを発現していた。４日目にミオゲニンの存在が、６日後にデスミンの存在が確認された。２日目以降に平滑筋アクチンが検出され、１４日後に平滑筋ミオシンが検出された。１４日後では、約７０％の細胞が抗平滑筋アクチン及びミオシン抗体により陽性染色された。更に２〜４日後にＭｙｆ５及びＭｙｆ６タンパク質を検出し、これらは１５日目まで高値に保たれたがＭｙｏ−Ｄは検出されなかった（図７）。

【0222】

心筋分化は本明細書中で先に述べた標準無血清培地に１００ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することによって誘導した。ｂＦＧＦ処理の開始時点で細胞はコンフルエンスに達していた。心組織の更なる発生を誘導するため、１００ｎｇ／ｍｌの５−アザシチジン、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び２５ｎｇ／ｍｌの骨形態形成タンパク質２及び４（ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４）を培地に添加した。心組織分化誘導の処理の開始時点で細胞は８０％を越えるコンフルエンスに達していた。Ｇａｔａ４及びＧａｔａ６の発現が２日目には見られ、１５日目まで高値を維持した。２日目以降にＭｙｆ６及びデスミンの発現が見られ、６日目以降にミオゲニンの発現が見られた。４日目以降に心筋トロポニンＴの発現が見られ、１１日目以降に心筋トロポニンＩ及びＡＮＰの発現が見られた。１５日目には免疫組織化学法により７０％を越える細胞においてこれらの成熟心筋タンパク質が検出された。培養を３週間以上継続すると細胞はシンシチウムを形成した。我々は更に、培養中で稀に自然収縮が生じ、数ｍｍの距離を伝播するのを確認した（図７）。ここでもやはり６日目以降にＭｙｆ５、Ｍｙｆ６及び平滑筋アクチンを検出した。

【0223】

１５〜２０日目までにｅｘ ｖｉｖｏで内皮細胞の分化を誘導するため、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で他の成長因子を含まない無血清培地に添加した。内皮細胞の分化は、内皮細胞分化に関連した細胞タンパク質及び受容体を検出するための免疫蛍光染色によって確認した。結果を図７に示す。

【0224】

造血細胞の分化は、ｅｘ ｖｉｖｏでマウス及びヒト再生幹細胞を支持する胎児肝臓由来の間葉細胞系であるＡＦＴ０２４フィーダーにて調整した、５％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを添加したＰＤＦＦ−ＢＢ及びＥＧＦ含有ＭＡＳＣ培地が入れられるとともにＩＶ型コラーゲンでコーティングされたウェルでＭＡＳＣを培養することによって誘導した。これらの培養から回収した細胞は、ｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２、及びＧ−ＣＳＦ−Ｒを発現したが、ＣＤ３４は発現しなかった（ＲＴ−ＰＣＲ）。造血作用が胚性内臓内胚葉が放出する因子によって誘発されることから、発明者等はヒトＳＣＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ，Ｔｐｏ、及びＥｐｏの存在下でβＧａｌ^＋のマウスＥＢとヒトＭＡＳＣとを共培養した。２つの別々の実験において、ヒトＣＤ４５を発現するβＧａｌ⁻細胞の小集団が検出された。

【0225】

「間質細胞」の分化はＭＡＳＣをＩＬ−１α、ＦＣＳ、及びウマ血清とともに培養することにより誘導した。これらの細胞が造血支持能を有することを証明するため、フィーダーを２，０００ｃＧｙにて放射線照射し、ＣＤ３４^＋臍帯血細胞をフィーダーと接触させて播種した。２週間後にメチルセルロースアッセイにおいて子孫細胞を再播種してコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の数を求めた。ＣＦＣは３〜５倍に増殖していた。

【0226】

コンフルエンスに達したＭＡＳＣ培養を肝細胞成長因子（ＨＦＧ）及びＫＧＦにて処理した。１４日後、細胞は、肝上皮細胞の発生に関連が示されているＭＥＴ（ＨＧＦ受容体）、サイトケラチン１８及び１９を発現した。

【0227】

実施例４． 成人骨髄由来ＭＡＳＣへの形質導入
約３〜１０代の継代培養後にＭＡＳＣ培養が樹立された後、連続２日間にわたりレトロウイルスによってＭＡＳＣに緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）保有ベクターを形質導入した。使用したレトロウイルスはＭＦＧ−ｅＧＦＰまたはＭＮＤ−ｅＧＦＰ−ＳＮ構築体であり、Ｄｏｎａｌｄ Ｋｏｈｎ氏の好意により提供されたものである（DonaldKohn,M.D., LA Childrens Hospital, Los Angeles, CA）。いずれのベクターもアンフォトロピックな細胞系であるＰＡ３１７かテナガザル白血病パッケージング細胞系であるＰＧ１３にパッケージングした。このプロデューサーフィーダー細胞をＭＡＳＣ増殖培地で４８時間培養してレトロウイルス上清を調製した。上清は濾過して使用時まで−８０℃に凍結した。ほぼコンフルエンスに達したＭＡＳＣをＭＡＳＣ増殖培地中で継代培養した。２４時間後、８ｇ／ｍＬプロタミン（シグマ社）（Sigma）を加えたレトロウイルス含有上清にて培
地を置換し、５時間培養した。２４時間後にこれを繰り返した。最後の形質導入の２〜３日後、コンソートコンピュータを用いＦＡＣＳスタープラスフローサイトメーター上で（いずれもベクトン・ディキンソン社製）（BectonDickinsonInc.）、５ｎｇ／ｍＬのＦＮにてコーティングした９６穴プレート上のウェル当たりの細胞数１０個にてｅＧＦＰ^＋細胞を選択した。接着細胞の４０〜８５％にｅＧＦＰの発現が見られた。蛍光活動化セルソータ上で自動細胞載置ユニット（ＡＣＤＵ）を用い、フィブロネクチンコーティングした９６穴プレートにウェル当たり１０個のｅＧＦＰ^＋細胞を選別した。細胞はＭＡＳＣ増殖培地中で１〜７ヶ月間培養した。３〜４週間後、３〜４％のウェルにおいて接着細胞がコンフルエンスに達した。この細胞を再び培養して増殖させた。１０^７個以上の細胞に増殖した子孫を生じたウェルはプレート当たり１個に満たなかった（更に４８時間細胞分裂させた）。したがって、更なる増殖能を有するのは骨髄細胞の１／１０^７〜１／１０^８ということになる。

【0228】

増殖させたクローン細胞集団を５〜１０個の集団に分割した。細胞の一部は未分化の状態で低温保存し、一部を骨芽細胞、軟骨細胞、間質細胞、骨格筋及び平滑筋細胞、ならびに内皮細胞に分化誘導した。所定の経路に沿って分化が起きていることを証明し、組織の種類を同定するため、細胞を免疫組織化学法及び／またはウェスタンブロットによって分化後の細胞中に存在することが知られているタンパク質について調べた。

【0229】

細胞集団が１個の細胞から発生したことを示すため、単個細胞選別法またはリングクローニング法を用いたが、ＭＡＳＣが接着細胞であることから、ＦＡＣＳやリングクローニングによって１個ではなく２個の細胞が選択されている可能性がある。レトロウイルスの組込みがランダムに起きることを利用してすべての分化細胞クローンの起源を調べた。ランダムなウイルス組込みのためにレトロウイルスのＬＴＲの両側に位置するホスト細胞のＤＮＡは細胞特異的である。細胞分裂によって生ずるすべての娘細胞は、ホスト細胞のゲノムの同じ位置にレトロウイルスが存在することに基づいて特定が可能である。

【0230】

Ｉｎｖｅｒｓｅポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、挿入されたレトロウイルスの３’側及び５’側のＬＴＲの両側のフランキングホストＤＮＡを増幅した。ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲは、Ｊａｎ Ｎｏｌｔａ氏の好意により提供されたプロトコルに則って行った（JanNolta,Ph.D., LA Children Hospital, Los Angeles, CA）。簡略に述べると、ＤＮＡを未分化のＭＡＳＣ及び分化した子孫から抽出し、Ｔａｑ１（インビトロジェン社）（Invitrogen）にて切断し、フラグメントをライゲートしてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行うことで５’側のフランキングホスト細胞ＤＮＡの配列を得た。こうしたｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲまたはサザンブロット分析を重点的に造血幹細胞に用いることにより分化したすべての細胞系が１個の細胞から誘導されたことを証明した。フランキングＤＮＡを増幅した後、２００〜３００塩基の配列を決定し、フランキングＤＮＡを特異的に認識するプライマーを設計した。次いで未分化細胞及び分化した細胞に、フランキングＤＮＡに特異的なプライマーと５’側のｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）を認識するプライマーとを使用したＰＣＲを行って分化した子孫からＤＮＡを増幅した。検討した３つの試料のそれぞれにおいて、５’側ＬＴＲのフランキング配列として１個の細胞に特異的な配列が特定された。この配列は未分化細胞と分化細胞とで同じであった。このことは、「中胚葉性」の起源を有する細胞のすべてが１個の細胞に由来することを証明するものである。

【0231】

この方法を利用して、本研究では、骨前駆細胞が骨髄に存在し、この細胞が骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維芽細胞、及び骨髄間質細胞へと分化し得ることを確認した。本発明者等は更に、１個の骨髄由来細胞が内臓及び臓側中胚葉からの細胞を生じうることを証明した。更に、９ヶ月以上にわたって培養した細胞の核型が正常であり、その旺盛な増殖能は細胞の幹細胞としての性質によるものであって、腫瘍形成や不死化によるものではないことも証明した。

【0232】

実施例５． 生体骨髄間葉幹細胞からのグリア細胞及び神経細胞の発生
分化したニューロンは分裂が終了しており、ｉｎ ｖｉｖｏではニューロンの再生はほとんどあるいはまったく観察されていない。分裂能を有する新たな神経幹細胞（ＮＳＣ）を脳の欠損領域に導入することによって欠損組織の機能を回復させることができるのであれば、脳の神経変性性及び外傷性疾患の治療における大きな進歩となる。すべての中胚葉性細胞に分化する生後骨髄から選ばれたＭＡＳＣは、ニューロン、乏突起膠細胞、及びアストロサイトにも分化し得ることがこれまでに発見されている。

【0233】

ＭＡＳＣの培養を実施例１に述べた要領で樹立した。神経発生を以下のように誘導した。ニューロン、アストロサイト、及び乏突起膠細胞を神経分化用培地からなる培地中で発生させた。この培地は以下を含む。１０〜９５％ＤＭＥＭ−ＬＧ（好ましくは約６０％）、５〜９０％ＭＣＤＢ−２０１（好ましくは約４０％）、１ｘＩＴＳ、１ｘＬＡ−ＢＳＡ、１０^−７〜１０^−９Ｍのデキサメタゾン（好ましくは１０^−８Ｍ）、１０^−３〜１０^−５Ｍのアスコルビン酸２−リン酸（好ましくは約１０^−４Ｍ）、及び０．５〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。この培地は、特定の種類の細胞に分化誘導するため、更に以下のサイトカインの１以上のものを含有していてもよい。

【0234】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬ）−アストロサイト、乏突起膠細胞、ニューロン（タイプ不明）。

【0235】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アストロサイト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロン。

【0236】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ドーパミン作動性、セロトニン作動性、及びＧＡＢＡ作動性ニューロン、グリア細胞への誘導なし。

【0237】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アストロサイト、乏突起膠細胞、ニューロンへの誘導なし。

【0238】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−アストロサイト、乏突起膠細胞、ニューロンへの誘導なし。

【0239】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ドーパミン作動性ニューロンのみ。

【0240】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロン。

【0241】

５〜５０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）−ＧＡＢＡ作動性ニューロンのみ。

【0242】

ＭＡＳＣを神経性細胞に分化誘導するための生長因子は、神経系の胚発生における知見、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＳＣ分化を評価した研究から得られた知見に基づき選択した。すべての培地は無血清で、強力な外胚葉誘導因子であるＥＧＦを補った。ＦＧＦは神経系の発生において重要な役割を担っている。ヒト生後骨髄由来ＭＡＳＣを１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦの存在下で培養すると、アストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンへの分化が観察された。アストロサイトは、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ−ｆｉｂｒｉｌａｒ−ａｃｉｄｉｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性細胞として同定され、乏突起膠細胞はグルコセレブロシド陽性（ＧａｌＣ）として同定され、ニューロンはＮｅｕｒｏＤ、チューブリンＩＩＩＢ（Ｔｕｊｉ）、シナプトフィジン、及びニューロフィラメント６８，１６０、及び２００を順次発現する細胞として同定される。これらの細胞は、ＧＡＧＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性ニューロンのマーカーは発現しない。

【0243】

ＦＧＦ−９はグリア芽細胞腫細胞系列から最初に単離され、培養中でグリア細胞の分裂を誘導する。ＦＧＦ−９は、大脳皮質、海馬、黒質、脳幹の運動核、プルキンエ細胞層のニューロンにおいてｉｎ ｖｉｖｏで見られる。ＭＡＳＣに１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−９及びＥＧＦを添加して３週間培養すると、アストロサイト、乏突起膠細胞、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、及びドーパミン作動性ニューロンを生じた。中枢神経系の発生過程では、中／後脳境界において前脳により発現されるＦＧＦ−８が、ソニックヘッジホッグとともに中脳及び前脳のドーパミン作動性ニューロンの分化を誘導する。ＭＡＳＣに１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−８及びＥＧＦを添加して３週間培養するとＧＡＢＡ作動性ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンの両方を生じることが分かっている。ＦＧＦ−１０は極微量が脳に見出され、その発現は海馬、視床、中脳、及び脳幹に限定され、ニューロン内で選択的に発現し、グリア細胞では発現しない。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１０及びＥＧＦ中で３週間培養するとアストロサイト及び乏突起膠細胞を生じたが、ニューロンは生じなかった。ＦＧＦ−４は脊索において発現し、中脳の領域化に必要とされる。ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４及びＥＧＦにて３週間処理するとアストロサイト及び乏突起膠細胞に分化したが、ニューロンには分化しなかった。

【0244】

脳において特異的に発現し、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで神経発生に影響する他の成長因子としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）などがある。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、及び神経系前駆細胞のニューロンへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を促進し、海馬由来神経幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの軸索生成を促進する神経成長因子ファミリーに属する。黒質のドーパミン作動性ニューロンの生存を支持するというＢＤＮＦの既知の機能と符合するものであるが、ＭＡＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ及びＥＧＦにて処理すると、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンのみへの分化が見られた。ＧＤＮＦはＴＧＦスーパーファミリーに属する。神経発生の初期にはＧＤＮＦは前神経外胚葉で発現し、神経発生におけるＧＤＮＦの重要な役割を示すものである。ＧＤＮＦは末梢神経及び筋肉の運動ニューロンの生存を促し、神経栄養因子活性及び分化促進能を有する。ＧＤＮＦがＭＡＳＣのＧＡＢＡ作動性及びドーパミン作動性ニューロンへの分化を誘導することが分かっている。ＣＮＴＦは毛様体神経節から最初に単離され、サイトカインのｇｐ１３０ファミリーに属する。ＣＮＴＦは発生初期の神経の生存を促す。ＣＮＴＦにより、ラット胎児の海馬神経細胞の培養においてＧＡＢＡ作動性及びコリン作動性ニューロンの数が増加する。更にＣＮＴＦはＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を防止するとともにＧＡＢＡの取込みを促進する。ＣＮＴＦはＭＡＳＣに対し同様のＧＡＢＡ作動性誘導効果を示し、ＭＡＳＣはＣＮＴＦへの曝露の３週後にＧＡＢＡ作動性ニューロンのみに分化した。

【0245】

上記に述べたように、ＩＬ−１１やＬＩＦなど造血サイトカインのあるものはＮＳＣの栄養因子であることが示されている。更に、神経前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究により、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＳＣＦ、及びＳＣＦ−１が神経性細胞の分化の初期段階で作用するのに対して、ＩＬ５，ＩＬ７，ＩＬ９及びＩＬ１１は後の神経の成熟段階において作用することが示されている。初期作用性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬトロンボポエチン（アムジェン社の好意による）（AmgenInc.,Thousand Oaks, CA））、１０ｎｇ／ｍＬの顆粒細胞コロニー刺激因子（Ａｍｇｅｎ）、３Ｕのエリスロポ
エチン（Ａｍｇｅｎ）、及び１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン３（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）の組合わせの後、１４ｎｇ／ｍＬの胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（イミュネックス社の好意による）（ImmunexInc,Seattle,WA）及び１５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（アムジェン社の好意による）を補ったマウス胎児肝臓フィーダー層ＡＦＴ０２４（Ｄｒ．Ｉｈｏｒ Ｌｅｍｉｓｈｋａの好意による）（Dr.IhorLemichka,Princeton University, NJ
）により調整した培地中で１ヶ月培養することによってＭＡＳＣを誘導した。このような条件下で生成したニューロンはニューロフィラメント６８を発現しているがニューロフィラメント２００は発現しておらず、未成熟である。

【0246】

一部の培養において、レトロウイルスを用いｅＧＦＰ保有ベクターにてＭＡＳＣに形質導入した（上記の実施例４に述べた）。分化したグリア及び神経性細胞では引き続きｅＧＦＰの発現が見られた。このことは、これらの細胞はその分化を妨害することなく遺伝子改変が可能であることを示すものである。したがって、未分化のＭＡＳＣは、後にアストロサイト、乏突起膠細胞、及びニューロンを生ずる神経幹細胞を生成することが可能である。

【0247】

ＭＡＳＣは生後骨髄から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグリア細胞や特定の神経性細胞に分化誘導することが容易であることから、ＮＳＣの移植における主要な問題の１つ、すなわち好適なドナー組織が入手しにくいという問題が解決される。

【0248】

本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、例えばムコ多糖症、白質ジストロフィー（グロボイド細胞性白質ジストロフィー、キャナヴァン病）、フコシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ニーマン−ピック病、サンフィリポ症候群、ウォルマン病、及びテイ−サックス病などの先天性神経変性性疾患や蓄積症を治療またはその症状を緩和することが可能である。また本発明のＭＡＳＣは、ハンチントン病、多発性硬化症やアルツハイマー病などの後天性の神経変性性疾患を治療またはその症状を緩和することが可能である。更に本発明のＭＡＳＣは、脳卒中、中枢神経系出血、中枢神経系外傷などの外傷性疾患、脊髄損傷や脊髄空洞症などの末梢神経系疾患、網膜剥離、黄斑変性や他の変性網膜疾患及び糖尿病性網膜疾患などの網膜疾患の治療に使用することが可能である。

【0249】

実施例６ 造血細胞の発生
造血幹細胞（ＨＳＣ）は中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは卵黄嚢中胚葉に由来するものと長い間考えられていた。原始赤血球系細胞が卵黄嚢に由来していることについては充分な証拠が存在する。完成造血細胞がやはり卵黄嚢の細胞に由来しているか否かについては明らかとなっていない。ニワトリ胚、マウス及びヒト胎児における最近の一連の研究によって、完成造血細胞は固有胚、すなわちＡＧＭ領域に存在する中胚葉性細胞に由来していることが示された。ヒトでは２２〜３５日目に背側大動脈においてＦｌｋ１^＋細胞の小集団が発生し、ＣＤ３４^＋の内皮または造血細胞に分化する。これらは胎児肝臓に定着する細胞であると考えられている。造血能を有する細胞は背側大動脈に由来するが、これらの細胞が成熟造血細胞に分化及びコミットするためには、内皮環境が造血細胞の発生にとって有利な肝臓に細胞が移動する必要がある。これに対し、ＡＧＭ領域に残留する細胞が造血細胞に発生することはない。

【0250】

本発明のＭＡＳＣ培養中のクローンの中には造血能を持ったものがある。このＭＡＳＣは内皮細胞に分化して胚様体らしきものを形成する。この細胞集合体が造血細胞へと分化する。この微小な懸濁集合体をトリプシン処理し、ＦＮ、ＩＶ型コラーゲンまたはＥＣＭ上に再播種する。培地は、０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）及び０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）を含有したＭＡＳＣ培地に５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬ）を補ったものか、ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３−Ｌ及びＳＣＦ（２〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０〜２０ｎｇ／ｍＬ）の組合わせからなるものを使用した。または、０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）及び０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）を含有したＭＡＳＣ培地に５％ＦＣＳと１〜１０００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬ）を補ってＡＦＴ０２４細胞にて調整したものを使用した。これらの培養のいずれから回収された細胞においてもｃＫｉｔ、ｃＭｙｂ、Ｇａｔａ２及びＧ−ＣＳＦ−Ｒの発現が見られ（ＲＴ−ＰＣＲ／免疫組織化学法）、造血細胞への分化が可能であることが示された。

【0251】

実施例７ 上皮組織の発生
出願人等は更に上皮組織の発生を証明した。簡略に述べると、まず血管を１〜１００ｎｇ／ｍＬのフィブロネクチンと、１〜１００ｎｇ／ｍＬのラミニン、ＩＶ型コラーゲンやマトリゲルなどの他のＥＣＭ産物とにてコーティングした。使用した培地は以下からなる。１０〜９５％のＤＭＥＭ−ＬＧ、５〜９０％のＭＣＤＢ−２０１、１ｘＩＴＳ、１ｘＬＡ−ＢＳＡ、１０^−７〜１０^−９Ｍのデキサメタゾン（好ましくは１０^−８Ｍ）、１０^−３〜１０^−５Ｍのアスコルビン酸２リン酸（好ましくは１０^−４Ｍ）。この培地には以下のサイトカインの内の１以上のものを加えてもよい。

【0252】

０．５〜１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。

【0253】

０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。

【0254】

０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（肝細胞成長因子）（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。

【0255】

０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ（ケラチノサイト成長因子）（好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ）。

【0256】

細胞の中には、汎サイトケラチン陽性、ならびにサイトケラチン１８及び１９陽性のものが見られ、これらの細胞が内胚葉由来であることが示された（肝上皮細胞、胆管上皮細胞、膵腺房細胞や消化管上皮細胞）。一部の細胞では、肝上皮細胞及び腎臓上皮細胞に特異的なＨ−Ｍｅｔすなわち肝細胞成長因子受容体の存在が示された。また、皮膚上皮細胞の特徴であるケラチンの存在が示された細胞もあった。

【0257】

本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、複数の臓器疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。この細胞を使用して、例えば、ムコ多糖症、白質ジストロフィー、ＧＭ２ガングリオシドーシスなどの蓄積症、クリグラー−ナジャー症候群などの高ビリルビン疾患、例えばオルニチンデカルボキシラーゼ欠損症、シトルリン血症、及びアルギニノコハク酸尿症といった尿素回路の先天異常などのアンモニア疾患、フェニルケトン尿症、先天性高チロシン血症、及びα１−アンチトリプシン欠損症などのアミノ酸及び有機酸異常、ならびに第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子欠損症などの凝固疾患といった先天性の肝疾患を治療もしくは緩和することが可能である。この細胞はまたウイルス感染による後天性肝疾患を治療するために使用することも可能である。本発明の細胞は更に、人口肝臓（腎臓透析に類似）の製造、凝固因子の生成、及び、肝上皮細胞が産生するタンパク質や酵素の生成などのｅｘ ｖｉｖｏでの応用例に使用することも可能である。

【0258】

更に本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、胆汁性肝硬変や胆道閉鎖症などの胆道疾患を治療もしくはその症状を緩和することも可能である。

【0259】

更に本発明の細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、膵臓閉塞症、膵臓炎、及びα１−アンチトリプシン欠損症などの膵臓疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。更に、本発明の細胞から膵臓上皮細胞が得られ、また神経細胞が得られることより、β細胞を生成することが可能である。これらの細胞を糖尿病の治療に用いることも可能である（皮下移植、膵臓内または肝臓内移植）。

【0260】

更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、腸閉塞、炎症性腸疾患、腸梗塞、及び腸切除などの腸上皮組織の疾患を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。

【0261】

更に本発明の上皮細胞を細胞置換療法及び／または遺伝子治療に使用して、脱毛症などの皮膚疾患、火傷の傷や白子症などの皮膚欠陥を治療もしくはその症状を緩和することが可能である。

【0262】

実施例８ ＭＡＳＣ、軟骨及び骨の発現遺伝子プロファイル
本発明者等は、２ｘ１０^３個／ｃｍ^２の播種密度にて２２〜２６回の細胞分裂にわたって培養したヒトＭＡＳＣの発現遺伝子プロファイルをクロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）及びインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製ｃＤＮＡアレイを用いて評価し、以下のプロファイルを得た。更に発明者等はＭＡＳＣを２日間にわたって軟骨及び骨に分化誘導した際の遺伝子発現の変化を評価した。

【0263】

−多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）は、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４４−Ｈ、ｃＫｉｔ、Ｔｉｅ、ＩＬＩ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、Ｆｌｔ３−Ｌ、またはＣＮＴＦの受容体のｍＲＮＡを発現せず、ＨＬＡ−クラスＩ、ＣＤ４４−Ｅ及びＭｕｃ１８のｍＲＮＡを低レベルで発現する。

【0264】

−ＭＡＳＣは、サイトカインであるＢＭＰ１、ＢＭＰ５、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ１；サイトカイン受容体であるＦｌｋ１、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ１α、ｇｐ１３０、ＬＩＦ−Ｒ、アクチビンＲ１及び−Ｒ２、ＴＧＦＲ−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ；接着受容体であるＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及びＣＤ１０のｍＲＮＡを発現する。

【0265】

−ＭＡＳＣは、ｈＴＲＴ、ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２、ｓｏｘ−１１、ｓｏｘ−９、ｈｏｘａ４、−５、−９、Ｄｌｘ４、ＭＳＸ１、ＰＤＸ１のｍＲＮＡを発現する。

【0266】

−軟骨及び骨のいずれにおいても、ｏｃｔ−４、ｓｏｘ−２、Ｈｏｘａ４、５、９；Ｄｌｘ４、ＰＤＸ１、ｈＴＲＴ、ＴＲＦ１、サイクリン、ｃｄｋ、シンデカン−４、ジストログリカン、インテグリンα２、α３、β１、ＦＬＫ１、ＬＩＦ−Ｒ、ＲＡＲ−α、ＲＡＲγ、ＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ１ａ及び−Ｂ、ＴＧＦ−Ｒ１及び−２、ＢＭＰ−Ｒ１Ａ、ＢＭＰ１及び４、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＭＣＰ１の発現は失われるかもしくは低下した。

【0267】

−骨芽細胞の分化は、ＨＯｘ７、ｈｏｘ１１、ｓｏｘ２２、ｃｄｋｉ、シンデカン−４、デコリン、ルミカン、フィブロネクチン、骨シアロタンパク質、ＴＩＭＰ−１、ＣＤ４４、β８、β５インテグリン、ＰＴＨｒ−Ｐ、レプチン−Ｒ、ＶｉｔＤ３−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ３、ＦＧＦ−Ｒ２、エストロゲン−Ｒ、ｗｎｔ−７ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＢＭＰ２の獲得／及び発現の増加に関連していた。

【0268】

−軟骨の分化はＳｏｘ−９、ＦＲＥＡＣ、ｈｏｘ−１１、ｈｏｘ７、ＣＡＲＴ１、Ｎｏｔｃｈ３、ｃｄｋｉ、ＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、デコリン、軟骨糖タンパク、軟骨オリゴマー基質タンパク質、ＭＭＰ及びＴＩＭＰ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、α１及びα６インテグリン、ＶｉｔＤ３−Ｒ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７の獲得に関連していた。

【0269】

実施例９ ＭＡＳＣと骨芽細胞とで発現レベルが異なる遺伝子のサブトラクティブハイブリダイゼーションによる特徴付け
本発明者等は、未分化のＭＡＳＣとコミットした子孫との間の遺伝子の差異を特定するためサブトラクション的手法を用いた。ポリアデニル化ｍＲＮＡを未分化のＭＡＳＣから抽出し、細胞を２日間にわたり骨芽細胞系に分化誘導した。クロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）より入手されるＰＣＲ選択キットを使用し、製造者の推奨するところに何ら変更を行うことなく基づいて、発現レベルの異なるｃＤＮＡのサブトラクション及び増幅を行った。２日目の骨芽細胞培養中で発現される遺伝子配列を分析したが未分化のＭＡＳＣ中で発現される遺伝子配列については分析を行わなかった。

【0270】

発現レベルの異なる８６個のｃＤＮＡ配列の配列を決定した。ＭＡＳＣにおいてｍＲＮＡの発現は見られず、２日目の骨芽細胞の子孫において実際にｍＲＮＡが特異的に発現していることをノーザンブロッティング法により確認した。これらの配列を（ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって）次のデータベースと比較した。すなわち、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質及びヌクレオチドコレクション、ＥＳＴｓ、マウス及びヒトＥＳＴｃｏｎｔｉｇｓである。

【0271】

配列は相同性によって分類した。８個が転写因子であり、２０個が細胞の代謝に関与しており、５個がクロマチンの修復に関与しており、４個がアポトーシス経路に関与しており、８個がミトコンドリアの機能に関与しており、１４個が接着受容体／ＥＣＭ成分であり、１９個が機能不明な公知のＥＳＴ配列であり、８個が新規な配列であった。

【0272】

新規配列の内２個について、３人のドナーから得たＭＡＳＣを骨に分化誘導したものに１２時間、２４時間、２日、４日、７日及び１４日間にわたってＱ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。遺伝子はそれぞれ分化の最初の２及び４日間に発現され、その後ダウンレギュレートされた。

【0273】

未分化のＭＡＳＣに存在するが２日目の骨芽細胞には存在しない遺伝子について分析した。発現レベルの異なる３０個の遺伝子の配列が決定され、この内の５個はＥＳＴ配列または既知配列であった。これらの遺伝子がＭＡＳＣには存在するが２日目の骨芽細胞には存在しないことをノーザンブロッティングによって確認した。

【0274】

実施例１０ ＭＡＳＣの定着
ＭＡＳＣがｉｎ ｖｉｖｏにて定着、生存するかを調べるため研究を行った。

【0275】

ｅＧＦＰ^＋ＭＡＳＣをＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに筋内注入した。４週後にマウスを殺し、ヒトＥＳ細胞について報告されているように筋肉に奇形腫が生じるか否かを調べた。５頭中５頭において奇形腫は見られなかった。ｅＧＦＰ陽性細胞が検出された。更にｅＧＦＰ^＋ＭＡＳＣＩＶをＳＣＩＤマウス胎児に子宮内注入した。出生直後に動物の評価を行った。ＰＣＲ解析により、心臓、肺、肝臓、脾臓、及び骨髄にｅＧＦＰ^＋細胞の存在が示された。

【0276】

ラットの正常な脳または梗塞を発症した脳にＭＡＳＣを定位的に移植したところ、細胞は神経細胞に見られる表現型を獲得し、この表現型は少なくとも６週間にわたって維持された。これらの研究によりヒトＭＡＳＣはｉｎ ｖｉｖｏで定着し、奇形腫へと発生することなく臓器特異的に分化することが示された。

【0277】

更にこれらの研究によってＭＡＳＣが胚性幹細胞や生殖細胞とは大きく異なることが示された。ＭＡＳＣは成人及び子供の異なる臓器から得ることが可能な新たなクラスの多能性幹細胞である。

【0278】

実施例１１ マウス由来ＭＡＳＣの選択、増殖、及び特徴付けの実例
多能性成体幹細胞（ＭＡＳＣ）はマウスの骨髄から得ることが可能であり、また骨髄以外の臓器にも存在し得る。

【0279】

１．マウス骨髄のＭＡＳＣの特定
本研究者等はマウス骨髄からＭＡＳＣを選択した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスから骨髄を得て、単核細胞またはＣＤ４５及びＧｌｙＡ陽性細胞を枯渇させた細胞（ｎ＝６）をヒトＭＡＳＣで使用したのと同じ条件下（１０ｎｇ／ｍＬのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦ）で播種した。骨髄単核細胞を播種した場合には、培養開始後１４日後にＣＤ４５^＋細胞を枯渇させて造血細胞を除去した。ヒトＭＡＳＣにおけるのと同様、細胞分裂２回毎に培養を２０００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で再播種した。

【0280】

ヒト細胞における観察とは対照的に、０日目にＣＤ４５^＋細胞を枯渇させた新鮮なマウス単核細胞をＭＡＳＣ培地に播種した場合には増殖は見られなかった。マウス骨髄単核細胞を播種し、１４日後に培養細胞のＣＤ４５^＋細胞を枯渇させると、ヒトＭＡＳＣに類似の形態及び表現型を有する細胞が出現した。このことは造血幹細胞が分泌する因子がマウスＭＡＳＣの初期の増殖に必要とされる可能性を示している。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＦＧのみと培養した場合には、細胞倍加時間は長く（６日より長い）、１０回の細胞分裂を越えて培養を維持することはできなかった。１０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦを添加することにより細胞の増殖率が高められ、７０回を越える細胞分裂が可能であった。ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、またはマトリゲル上で培養した場合、細胞の増殖は見られたが細胞はＣＤ４４^＋かつＨＬＡ−クラスＩ陽性であった。ヒト細胞におけるのと同様、フィブロネクチンコーティングした皿上でＬＩＦを加えて培養したＣ５７／ＢＬ６ＭＡＳＣはＣＤ４４及びＨＬＡ−クラスＩ陰性であり、ＳＳＥＡ−４により陽性染色され、ｏｃｔ−４、ＬＩＦ−Ｒ、及びｓｏｘ−２の転写因子を発現した。

【0281】

マウス骨髄から得たＭＡＳＣは、ヒトＭＡＳＣの分化誘導にも用いられる方法によって心筋細胞、内皮及び神経外胚葉細胞に分化誘導することが可能である。したがってＣ５７Ｂ１６マウス由来ＭＡＳＣはヒト骨髄由来のＭＡＳＣに相当するものであるといえる。

【0282】

２．ＭＡＳＣは骨髄以外の組織にも存在する
発明者等は肝臓や脳などの他の組織にもＭＡＳＣが存在するかについて調べた。コラゲナーゼ及びトリプシンで処理した生後５日目のＦＶＢ／Ｎマウスから得た骨髄、脳及び肝臓単核細胞をフィブロネクチン上でＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＬＩＦを添加したＭＡＳＣ培地に播種した。１４日後にＣＤ４５^＋細胞を除去して細胞を上記に述べたようなＭＡＳＣの培養条件下に維持した。骨髄、脳、または肝細胞にて開始した培養中で、ヒトＭＡＳＣ及びＣ５７／Ｂ１６マウスの骨髄から得られたマウスＭＡＳＣに類似した形態を有する細胞が増殖した。これらの細胞はｏｃｔ−４のｍＲＮＡを発現していた。

【0283】

発明者等は更にｏｃｔ−４のプロモーターであるｅＧＦＰ遺伝子について形質転換したマウスを調べた。これらの動物では生後の生殖細胞と同様、始原生殖細胞においてもｅＧＦＰの発現が見られた。ＭＡＳＣはｏｃｔ−４を発現することから、我々はｅＧＦＰ陽性細胞が生後のこれらの動物の骨髄、脳、及び肝臓に見られるかについて試験を行った。生後５日目のマウスの骨髄、脳及び肝臓からｅＧＦＰ^＋細胞を選別した（最も明るい１％の細胞）。蛍光顕微鏡法によって調べたところ、脳及び骨髄から選別した細胞の内１％に満たないものがｅＧＦＰ^＋であった。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより、選別した集団においてｏｃｔ−４のｍＲＮＡが検出された。選別した細胞をＭＡＳＣの支持条件下（フィブロネクチンコーティングし、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＬＩＦを加えたウェル）に播種した。細胞は生存したものの増殖はしなかった。マウス胚性繊維芽細胞に移したところ細胞の増殖が見られた。更にＭＡＳＣ培地に移したところ、ヒト骨髄またはＣ５７／Ｂ１６またはＦＶＢ／Ｎマウスの骨髄から古典的なＭＡＳＣ選択及び培養法によって得たＭＡＳＣに類似した形態及び表現型を有する細胞が得られた。

【0284】

本発明を特定かつ好適な異なる実施形態及び方法について述べたが、発明の範囲を逸脱することなく多くの変更ならびに改変を加えることが可能である点は了承されよう。参照文献、特許及び特許文献はそのすべてが恰も個々に援用されているかのように援用されるものである。

【0285】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

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【表14】

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【図1】

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【図10】

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