特許 6227562 灌流バイオリアクターシステムおよびその操作方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6227562

(24)【登録日】2017年10月20日

(45)【発行日】2017年11月8日

(54)【発明の名称】灌流バイオリアクターシステムおよびその操作方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/02 20060101AFI20171030BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20171030BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/02

   C12N5/071

【請求項の数】22

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2014-553341(P2014-553341)

(86)(22)【出願日】2013年1月15日

(65)【公表番号】特表2015-503929(P2015-503929A)

(43)【公表日】2015年2月5日

(86)【国際出願番号】US2013021533

(87)【国際公開番号】WO2013109520

(87)【国際公開日】20130725

【審査請求日】2015年12月3日

(31)【優先権主張番号】61/587,940

(32)【優先日】2012年1月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507021757

【氏名又は名称】バイエル・ヘルスケア・エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】メディ・サガフィ

(72)【発明者】

【氏名】リカレド・マタンギハン

(72)【発明者】

【氏名】チェタン・ガウダー

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２８０５６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−１５３９７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０８９７１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０７００５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Chiou-Yu Choo et al. ， High-Level Production of a Monoclonal Antibody in Murine Myeloma Cells by Perfusion Culture Using a Gravity Settler，Biotechnology Prgress，２００６年１０月１２日，Volume 23, Issure 1 ，pp 225-231

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイオリアクターの入口（１０４）、バイオリアクターの出口（１０６）および組織培養液（１０８）と培養する細胞（１０９）を含むための培養チャンバー（１０５）を備えたバイオリアクター（１０２）；
該バイオリアクター（１０２）から細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）を受け入れるための入り口（１１２）、該組織培養液（１０８）から細胞（１０９）の一部を分離するための細胞分離部材、組織培養液（１０８）と細胞（１０９）の回収物を供給するための第一の出口（１１４）および組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物を供給するための第二の出口（１１９）を備え、前記バイオリアクターの出口（１０６）に流体連結した細胞保持ユニット（１１０）；並びに
細胞保持ユニット（１１０）から組織培養液（１０８）と細胞（１０９）の再循環排出物を受け入れるためのトラップの入口（１２１）、細胞凝集体（１０９Ａ）を組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物から分離するための沈降チャンバー（１３４）、残りの組織培養液（１０８）および細胞（１０９）を該バイオリアクターに戻すためのトラップの出口（１２３）を含むサイドフローチャンバー（１３６）を備え、前記第二の出口（１１９）に流体連結した細胞凝集体トラップ（１２０）；
を含む、灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項2】

バイオリアクターの入口（１０４）、バイオリアクターの出口（１０６）および組織培養液（１０８）と培養する細胞（１０９）を含むための培養チャンバー（１０５）を備えたバイオリアクター（１０２）;
該バイオリアクター（１０２）から細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）を受け入れるためのトラップの入り口（１２１）、細胞凝集体（１０９Ａ）を、細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）から分離するための沈降チャンバー（１３４）、細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）の排出物を供給するためのトラップの出口（１２３）を含むサイドフローチャンバー（１３６）を備え、前記バイオリアクターの出口（１０６）に流体連結した細胞凝集体トラップ（１２０）並びに
該細胞凝集体トラップ（１２０）から細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）を受け入れるための入り口（１１２）、該組織培養液（１０８）から細胞（１０９）の一部を分離するための細胞分離部材、組織培養液（１０８）と細胞（１０９）の回収物を供給するための第一の出口（１１４）および組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物を前記バイオリアクター（１０２）に供給するための第二の出口（１１９）を備え、前記トラップの出口（１２３）に流体連結した細胞保持ユニット（１１０）；
を含む、灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項3】

該細胞凝集体トラップ（１２０）が、沈降チャンバー（１３４）を格納するトラップ体（１３０）を含み、トラップの入口（１２１）が前記トラップ体（１３０）の一番上に位置し、該トラップの入り口（１２１）に拡張ゾーン（１３２）が形成され、該拡張ゾーン（１３２）の横断面積は、前記沈降チャンバー（１３４）の長さに沿って徐々に増大する、請求項１または２記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項4】

該細胞凝集体トラップ（１２０）が、サイドフローチャンバー（１３６）からのトラップ出口（１２３）に、収縮ゾーン（１３８）を含み、該収縮ゾーン（１３８）の横断面積は、トラップの出口（１２３）に向かって、徐々に減少する、請求項１または２記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項5】

沈降チャンバー（１３４）は最大横断面積を有し、サイドフローチャンバー（１３６）は最大横断面積を有し、沈降チャンバー（１３４）の最大横断面積は、サイドフローチャンバー（１３６）の最大横断面積と等しい、またはそれよりも大きい、請求項１または２記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項6】

沈降チャンバー（１３４）の最大横断面積が、サイドフローチャンバー（１３６）の最大横断面積よりも、少なくとも５倍大きい、請求項５記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項7】

サイドフローチャンバー（１３６）が、沈降チャンバー（１３４）から水平方向に拡張する、請求項１または２記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項8】

細胞凝集体トラップ（１２０）を通る、組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の連続的なフローを含む、請求項１または２記載の灌流バイオリアクターシステム（１００）。

【請求項9】

沈降チャンバー（１３４）であって、細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）から細胞凝集体（１０９Ａ）を分離するための沈降チャンバー（１３４）；
組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物を受け入れるための、トラップの入口（１２１）;
細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）を供給するためのトラップの出口（１２３）を備え、沈降チャンバー（１３４）と連結して操作可能である、サイドフローチャンバー（１３６）;並びに
細胞凝集体（１０９Ａ）を排出するように設計された、沈降チャンバー（１３４）に連結したトラップ廃棄口（１２６）；
を含む、細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項10】

沈降チャンバー（１３４）を格納するトラップ体（１３０）を含み、トラップの入口（１２１）が前記トラップ体（１３０）の一番上に位置し、該トラップの入り口（１２１）に拡張ゾーン（１３２）が形成され、該拡張ゾーン（１３２）の横断面積は、前記沈降チャンバー（１３４）の長さに沿って徐々に増大する、請求項９に記載の細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項11】

サイドフローチャンバー（１３６）のトラップの出口（１２３）に収縮ゾーン（１３８）を含み、該収縮ゾーン（１３８）の横断面積は、トラップの出口（１２３）に向かって、徐々に減少する、請求項９記載の細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項12】

沈降チャンバー（１３４）は最大横断面積を有し、サイドフローチャンバー（１３６）は最大横断面積を有し、沈降チャンバー（１３４）の最大横断面積が、サイドフローチャンバー（１３６）の最大横断面積と等しい、またはそれより大きい、請求項９記載の細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項13】

沈降チャンバー（１３４）の最大横断面積が、サイドフローチャンバー（１３６）の最大横断面積の５倍以上である、請求項１２記載の細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項14】

サイドフローチャンバー（１３６）が沈降チャンバー（１３４）から水平方向に拡張する、請求項９記載の細胞凝集体トラップ（１２０）。

【請求項15】

灌流バイオリアクターシステムの操作方法であって、
細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）をバイオリアクター（１０２）から細胞保持ユニット（１１０）に供給し；
細胞保持ユニット（１１０）中で、組織培養液（１０８）から細胞（１０９）の一部を分離し、組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の回収物並びに組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物を供給し、ここで、前記細胞保持ユニットは、細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）を受け入れるための入り口（１１２）、該組織培養液（１０８）から細胞（１０９）の一部を分離するための細胞分離部材、組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の回収物を供給するための第一の出口（１１４）並びに組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物を供給するための第二の出口（１１９）を備えており；
細胞凝集体トラップ（１２０）中で、組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物から細胞凝集体（１０９Ａ）を分離することを含み、ここで、前記細胞凝集体トラップは、組織培養液（１０８）と細胞（１０９）の再循環排出物を受け入れるためのトラップの入口（１２１）、細胞凝集体（１０９Ａ）を組織培養液（１０８）および細胞（１０９）の再循環排出物から分離するための沈降チャンバー（１３４）並びにトラップの出口（１２３）を含むサイドフローチャンバー（１３６）を備えている、前記灌流バイオリアクターシステムの操作方法。

【請求項16】

組織培養液（１０８）および細胞（１０９）を、比較的細胞凝集体（１０９Ａ）の量が少なくなった状態でバイオリアクター（１０２）に戻すことを含む、請求項１５記載の方法。

【請求項17】

細胞凝集体トラップ（１２０）から細胞凝集体（１０９Ａ）を廃棄することを含む、請求項１５記載の方法。

【請求項18】

細胞凝集体トラップ（１２０）から廃棄する細胞の濃度が、細胞保持ユニット（１１０）に供給される、細胞（１０９）を含む組織培養液（１０８）の最初の細胞濃度の少なくとも３倍以上であるように、細胞凝集体（１０９Ａ）および組織培養液（１０８）を廃棄することを含む、請求項１５記載の方法。

【請求項19】

細胞凝集体（１０９Ａ）が、１０個以上の凝集細胞（１０９Ａ）または、２０個以上の凝集細胞（１０９Ａ）を含む、請求項１５記載の方法。

【請求項20】

細胞凝集体（１０９Ａ）が６０ミクロンより大きい最小寸法を有する、請求項１５記載の方法。

【請求項21】

細胞（１０９）が、凝固因子を産生する哺乳類細胞もしくは他の細胞を含む、または、細胞が、BHK細胞、HKB細胞もしくはHEK細胞を含む、請求項１５記載の方法。

【請求項22】

第VII因子、第VIII因子または第IX因子を産生することを含む、請求項１５記載の方法

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１２年１月１８日に出願された、表題「PERFUSION BIOREACTOR SYSTEMS AND METHODS OF OPERATING THE SAME」(代理人整理番号BH-001/L)の、米国仮特許出願第61/587,940号の利益およびそれに対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

慣用的な灌流バイオリアクターシステムおよびプロセスは、細胞を、液体培地、例えば組織培養液（ＴＣＦ）で培養する機能を有するバイオリアクターを含む。培養細胞およびＴＣＦは、該バイオリアクターから、例えばポンピングにより移し、該細胞は、ＴＣＦから慣用的な細胞保持ユニットにより分離する。未だ細胞、小片および細片をいくらか含む、細胞保持ユニットからの回収液を、その後さらに処理する。本明細書中で用いる回収物は、所望の生成物（例えば、凝固因子）を得るためにさらなる処理をされるＴＣＦを含む。濾過技術、例えばデッドエンド深層濾過、膜濾過、精密濾過および／または遠心分離を、細胞保持ユニットからの回収物をさらに濃縮および／または精製するのに使用し得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

比較的高い濃度の細胞を含む、細胞保持ユニットから出る、他のＴＣＦの排出液は、バイオリアクターに直接戻る（例えば、再利用または再循環する）。かかる連続的な灌流バイオリアクタープロセスでは、回収液および再循環排出液は、１０日以上であり得る培養期間の間、実質的に連続的である。しかし、この型の慣用的な灌流設定を用いることにより、バイオリアクター中の細胞密度が、比較的不十分に制御され得る環境が引き起こされ得る。

【0004】

したがって、バイオリアクター細胞密度をより効率的に調節する灌流バイオリアクターシステムおよび方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

第一の態様において、灌流バイオリアクターシステムを提供する。該灌流バイオリアクターシステムは、(1) 組織培養液および培養する細胞を含むように設計したバイオリアクター; (2) バイオリアクターから、細胞を含む組織培養液を受け入れ、細胞を組織培養液から分離し、組織培養液と細胞の回収物を供給し、組織培養液と細胞の再循環排出物を供給するように設計した細胞保持ユニット; および (3) 組織培養液と細胞の再循環排出物を受け入れ、組織培養液および細胞の再循環排出物から細胞凝集体を分離し、残りの組織培養液および細胞をバイオリアクターに戻す細胞凝集体トラップを含む。

【0006】

他の態様において、細胞凝集体トラップを提供する。該細胞凝集体トラップは、沈降チャンバー; (2) 組織培養液および細胞の再循環排出物を受け入れるよう設計したトラップの入口; (3) 細胞を含む組織培養液の再循環排出物を少なくともいくらかバイオリアクターに戻すように設計したサイドフローチャンバー; および (4) 細胞凝集体を排出するように設計した沈降チャンバーに連結した廃棄トラップ出口を含む。

【0007】

他のシステム態様において、灌流バイオリアクターシステムを提供する。該灌流バイオリアクターシステムは、 (1) 組織培養液と培養する細胞を含むよう設計したバイオリアクター; (2) 細胞を組織培養液から分離し、回収物を供給するように設計した細胞保持ユニット; および(3) 組織培養液および細胞から細胞凝集体を分離し、比較的細胞凝集体の量が少なくなった排出物を供給するよう設計した細胞凝集体トラップを含む。

【0008】

方法の態様において、灌流バイオリアクターシステムの操作方法を提供する。該方法は、(1) 細胞を含む組織培養液を、バイオリアクターから細胞保持ユニットに供給し、(2) 細胞保持ユニット中で、組織培養液から細胞を分離し、組織培養液と細胞の回収物および組織培養液と細胞の再循環排出物を供給し; (3) 細胞凝集体トラップ中で、組織培養液と細胞の再循環排出物から細胞凝集体を分離することを含む。組織培養液および細胞は、細胞凝集体が比較的少なくなった状態で、バイオリアクターに戻してよい。

【0009】

他の方法の態様において、灌流バイオリアクターシステムの操作方法を提供する。該方法は、(1)バイオリアクターから組織細胞液および細胞のフローを供給し; (2) 細胞保持ユニット中で組織培養液から細胞を分離して回収物を供給し; (3) 細胞凝集体トラップ中で、細胞凝集体を組織培養液および細胞から分離し、比較的細胞凝集体の量が減少した組織培養液を産生することを含む。組織培養液および細胞は、細胞凝集体の量が比較的少なくなった状態で、バイオリアクターに戻してよい。

【0010】

本発明のこれらの特徴および他の特徴を本明細書中に記載する。

【0011】

以下の図は例示を目的とするものに過ぎないことは、当業者には理解されることである。かかる図は、本発明の範囲をいかなる点においても限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本態様による細胞凝集体トラップを含む灌流バイオリアクターシステムの一態様のブロック図を示す。

【図2A】本態様による細胞凝集体トラップの断面の側面図を示す。

【図2B】図２Ａの、２Ｂ−２Ｂの断面線に沿った、細胞凝集体トラップの上向きの断面の端面図を示す。

【図3】本態様による灌流バイオリアクターシステムの操作方法を表すフローチャートを示す。

【図4】本態様による灌流バイオリアクターシステムの他の操作方法を表す他のフローチャートを示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

細胞(動物、植物または微生物細胞を含む)の培養は、生物学的に有効な物質および薬学的に有効な生成物を産生するために使用し得る。しかし、特定の細胞培養において、細胞は、ある程度まで、お互いに接着して、比較的大きな細胞凝集物、細胞凝集塊または凝集体を形成し得る（本明細書中では、以降「細胞凝集体」とよぶ）。該細胞凝集体が存在する場合、灌流バイオリアクタープロセスにおいて、特定のプロセスの問題を引き起こし得る。具体的には、細胞凝集体が存在することにより、バイオリアクター中の細胞密度が、比較的不安定になり得る；すなわち、所望の細胞密度の設定範囲内に適切に維持、保持または調節するのが困難になる。細胞凝集体が存在すると、細胞濃度を正確に測定することも困難である。結果として、TCFおよび細胞を、慣用的な灌流バイオリアクターシステムの廃棄ポンプを定期的に操作することにより時々廃棄することが必要となる。さらに、廃棄したＴＣＦおよび細胞の量を測定することも困難である。この廃棄により、所望の生成物を含む価値のあるＴＣＦもまた廃棄されていることは当然のことである。さらに、バイオリアクター培養中の細胞、特に動物細胞または植物細胞は、一般的に、機械的な剪断力を受けることに対して非常に感受性が高い。したがって、廃棄する物質の量を最小化することだけでなく、細胞の、損傷を与える可能性のある剪断力に対する暴露を最小化することも望ましい。さらに、バイオリアクター中の細胞濃度を正確に調節することができることも望ましい。

【0014】

したがって、本発明の態様によれば、改善した灌流バイオリアクターシステムが提供される。該改善灌流バイオリアクターシステムは、細胞保持ユニットと併せて操作するように、提供され、設計され、および／または調整された細胞凝集体トラップを含む。該細胞凝集体トラップは、機能的には、沈降に基づいており、ここで、細胞凝集体は、沈降し、再循環流動から取り除き得る。細胞凝集体トラップを、灌流バイオリアクター中で細胞保持ユニットと併せて使用することによって、比較的大部分の細胞をバイオリアクターに戻し、灌流プロセスに有害であり得る細胞凝集体は、取り除き、廃棄し得る。

【0015】

他の態様によれば、該灌流バイオリアクターシステムは、バイオリアクター、バイオリアクターに連結した細胞保持ユニットであり、バイオリアクターからＴＣＦおよび細胞を受け入れ、ＴＣＦから細胞を分離し、回収物を得られるように設計した細胞保持ユニット、細胞保持ユニットからＴＣＦおよび細胞の再循環排出物を受け入れ、ＴＣＦおよび細胞から細胞凝集体を分離し、残りのＴＣＦおよび細胞をバイオリアクターに戻すように設計した細胞凝集体トラップを含む。

【0016】

他の態様において、灌流バイオリアクターシステムの操作方法を提供する。該方法は、ＴＣＦおよび細胞を供給し、細胞凝集体トラップ中にＴＣＦおよび細胞を受け入れ、該細胞凝集体トラップ中で細胞凝集体をＴＣＦおよび細胞から分離することを含む。残りのTCFおよび細胞を、細胞凝集体の量が比較的少なくなった状態で、バイオリアクターに戻してよい。

【0017】

他の態様において、灌流バイオリアクターシステムの操作方法を提供する。該方法は、細胞を含むＴＣＦをバイオリアクターから細胞保持ユニットに供給し、ＴＣＦから細胞を分離して回収物を供給し、残りの再循環ＴＣＦおよび細胞を細胞凝集体トラップに受け入れ、該細胞凝集体トラップ中で細胞凝集体をＴＣＦおよび細胞から分離することを含む。残りのＴＣＦおよび細胞は、細胞凝集体の量が比較的少なくなった状態でバイオリアクターに戻してよい。本明細書中に記載の方法、灌流バイオリアクターシステムおよび細胞凝集体トラップは、凝固因子産生および／または生物学的な薬剤または因子を製造するための他の適当な方法に適用し得る。

【0018】

細胞凝集体トラップを含む灌流バイオリアクターシステム、細胞凝集体トラップおよび灌流バイオリアクターシステムの操作方法のこれらの態様および他の態様は、以下の図１〜４に記載する。図1は、灌流バイオリアクターシステム（100）の一態様のブロック図を示す。該灌流バイオリアクターシステム（100）は、バイオリアクターの入口（104）およびバイオリアクターの出口（106）を含むバイオリアクター（102）を含む。該バイオリアクター（102）は、組織培養液（ＴＣＦ）（108）および培養する細胞（109）を維持するように設計した培養チャンバー（105）を含む。該灌流バイオリアクターシステム（100）は、凝固因子のような生物製剤の産生に使用し得る。例えば、該灌流バイオリアクターシステム(100)および該方法は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のような凝固因子または他の適当な因子または物質の製造に使用し得る。

【0019】

第ＶＩＩＩ因子の製造方法の例は、米国特許第6,338,964号、表題「Process and Medium For Mammalian Cell Culture Under Low Dissolved Carbon Dioxide Concentration」に記載されており、その記載内容は全体が参照により本明細書中に包含される。例えば、細胞培養プロセスは、高濃度の錯化剤と、添加したＮａＨＣＯ_３濃度が低い緩衝剤とを含むＴＣＦ中で細胞を培養することを含み得る。該細胞培養プロセスは、培養チャンバー、例えば図１の培養チャンバー（105）中で行ってよく、該培養チャンバーは、いくつかの態様において、撹拌インペラーを含む撹拌型発酵槽であってよい。該発酵槽は、酸素化システムとして、培養チャンバーの底にマイクロスパージャー（microsparger）を備えているか、または膜を備えていてよい。該TCFは、他の補助剤、例えば鉄、Pluronic F-68またはインスリンを補充した、JRH (Lenexa, Kansas)またはLife Technologies (Grand Island, N.Y.)により製造されている、市販のDMEM/F12処方に基づいた培地組成物であってよく、本質的に他の蛋白質を含まないでいてよい。錯化剤であるヒスチジン(his) およびイミノ二酢酸(IDA) を使用してよく、有機緩衝剤、例えばMOPS (3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸)、TES (N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-2-アミノエタンスルホン酸)、BES (N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]-2-アミノエタンスルホン酸)およびTRIZMA (トリス[ヒドロキシメチル]アミノエタン)を使用してもよく; これらは全て、例えば、Sigma (Sigma, St. Louis, Mo.)より入手し得る。いくつかの態様において、TCFは、既知の濃度のこれらの錯化剤および有機緩衝剤を、個々にもしくは組み合わせて補充してもよい。該TCFは、鉄キレート剤として、EDTAを、例えば50μMで含んでいてもよい。他の組成物、製剤、補助剤、錯化剤および／または緩衝剤を使用してもよい。

【0020】

細胞培養は、細胞を以前に増殖していた培養物中から播種することにより始めてよい。典型的なバイオリアクターパラメーターは、安定な条件、例えば約３５℃〜３７℃の温度、約６．８〜７．０のｐＨ、空気飽和の約３０％〜７０％の溶存酸素（ＤＯ）、約３０rpm〜８０rpmの撹拌速度、およびほぼ一定の液体体積といった条件下に、（例えば自動的に）維持し得る。他のバイオリアクターパラメーターを用いてもよい。ＤＯおよびｐＨは、市販されているプローブを用いてオンラインで測定し得る。バイオリアクタープロセスは、バッチモードで約１〜２日間、最初に細胞濃度を倍加させて始めてよい。この後、ＴＣＦが連続的にバイオリアクターにポンプで送り込まれ、細胞（および細胞凝集体を含んでいてよい）を含んでいるＴＣＦがポンプで排出される、灌流段階が起こり得る。ＴＣＦの流速は、調節されており、細胞濃度に比例して増加し得る。細胞濃度が、バイオリアクター中で標的とする高いレベル（例えば約１０Ｘ１０^６個／ml〜２０ｘ１０^６個／mL）に達し、この濃度で調節し得る場合、定常状態または安定した灌流プロセスを達成し得る。この点において、流速は一定に維持し得る。細胞密度は、灌流バイオリアクターシステム中で、４，０００，０００〜４０，０００，０００個/mLであってよい。他の生物製剤、凝固因子、細胞濃度または細胞密度等も使用し得る。

【0021】

図１に関して、細胞(109)は、真核細胞または原核細胞、例えば動物、植物もしくは微生物細胞であってよい。例えば、細胞(109)は、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK細胞)、腎臓細胞とＢ細胞のハイブリッド(HKB細胞)またはヒト胎児由来腎臓細胞 (HEK細胞−HEK293または293細胞ともよばれる)等であってよい。該TCF（109）は、ＴＣＦの入口（105A）または灌流バイオリアクターシステム（100）の他の場所を介して培養チャンバー（105）に導入し得る。ＴＣＦ（108）中の細胞（109）は、その性質および処理により、時々、拡大図で示されるような細胞凝集体（109A）を形成し得る。本明細書中で、「細胞凝集体」という語は、細胞凝塊物、細胞凝集塊または、お互いに連結し、接着して細胞の群を形成している細胞の凝集体をさす。本発明の１以上の態様を用いて取り除き得る「細胞凝集体」は、約１０個以上の細胞、約２０個以上の細胞、または約４０個以上の細胞であり得る。本発明の１以上の態様により、細胞凝集体は、細胞約１０〜約５０，０００個、または約４０個〜約３００個の範囲で取り除き得る。より一般的には、本発明の様々な態様の１つ以上を用いて取り除き得る細胞凝集体（109A）は、該凝集物中の内部の細胞の少なくともいくらかが、灌流プロセスの間に、十分な酸素および／または栄養がないことから死ぬ傾向があるような大きさおよび形状の細胞凝集物を含む。一般的に、細胞凝集体はきわめて大きい。例えば、（細胞凝集体の幅が）最小で、約６０ミクロン以上、または約１００ミクロン以上の大きさの細胞凝集体（109A）は、本発明の様々な態様を用いることにより分離し、取り除き得る。本発明の一以上の態様は、約６０ミクロン〜約３０００ミクロン、または約１００ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の最小寸法を有する細胞凝集体を取り除き得る。それより小さい凝集体をさらに、もしくは代替法として分離し取り除いてよい。バイオリアクター（102）中に細胞凝集体（109A）が存在することは、通常望ましいことではなく、本発明の灌流バイオリアクターシステム（100）および方法（300、400）は、少なくともいくらかの、および多くの場合においては、ほとんどの細胞凝集体（109A）をそこから取り除き得る。図示した灌流バイオリアクターシステム（100）は、バイオリアクター（102）に流体連結した、第一細胞濃度 (C1)にて細胞（109）を含む、ＴＣＦ（108）(細胞凝集体(109)を含んでいてもよい)をバイオリアクター（102）から受け入れるように設計された、細胞保持ユニット（110）を含む。第一細胞濃度 (C1) は例えば、細胞数約4 x 10⁶個/mL〜約40 x 10⁶個/mLの範囲であり得る。他の範囲の細胞濃度を用いてもよい。示す態様中において、第一濃度 (C1)にて、細胞（109）を含むTCF （108）は、バイオリアクターの出口（106）から排出され、第一導管（113）を通って細胞保持ユニットの入口（112）で受け入れられる。該導管（113）は、バイオリアクターの出口（106）から排出された細胞（109）を含むＴＣＦ（108）の冷却に機能する任意の熱交換器と連結していてよい。該細胞保持ユニット（110）は、ＴＣＦ（108）からほとんどの細胞（109）を分離し、第一の保持ユニットの出口（114）にて第二の細胞濃度(C2)のごく少量の細胞（109）のみを含むＴＣＦ(108)の回収物を供給するように設計されており、操作可能であり、そのためそのように機能する。したがって、第二細胞濃度は、第一細胞濃度(C1)より低い、すなわち、C2＜C1であり、具体的には、C2＜＜C1である)。第二細胞濃度(C2)は、例えば、細胞数約0.1 x 10⁶個/mL〜約2 x 10⁶個/mLの範囲であり得る。他の細胞濃度を用いてもよい。所謂回収物は、第一細胞保持ユニットの出口（114）から、例えば第二導管（115）に連結した回収ポンプ（117）のポンピング作用により第二導管（115）を通る。該回収物は、さらに、下流の単離および精製プロセス（118）にて、単離および／または精製され得る。これらの付加的な単離および精製プロセス（118）は、連続的式またはバッチ式で行い得る。例えば、これらの下流の単離および精製プロセス(118)は、米国特許公開番号第2008/0269468号、表題「Devices And Methods For Integrated Continuous Manufacturing Of Biological Molecules」に記載の通りに実行でき、その開示内容は参照によりその全体が本明細書中に包含される。例えば、バッチモードでは、典型的に１〜４日以上で、一定の体積の回収物が集まると、１以上の回収容器を無菌の発酵容器から連絡切断し、該回収物質を１つのバッチとしてよい。次の工程は、細胞、細片、小片を取り除くことである。産業的な規模では、これは、遠心分離およびそれに次ぐデッドエンド膜濾過または、デッドエンド深層濾過およびそれに次ぐデッドエンド膜濾過により行い得る。タンジェント流（または「クロスフロー」）精密濾過または他の任意の適当な濾過技術のような他の技術も使用し得る。任意の場合において、小片除去プロセスの生成物は、浄化組織培養液(cTCF)のバッチである。このcTCFは、任意の適当な方法、例えばクロスフロー限外濾過または充填層クロマトグラフィーにより精製（濃縮）し得る。

【0022】

連続的なモードにおいて、一定体積の回収物は、灌流バイオリアクターシステムと統合した、滅菌条件下で維持し得る連続的精製システムにより精製し得る。本明細書中では、「連続的」という用語は、長期間にわたって、時間、順番および／または操作が中断されないことをさす。例えば、細胞保持ユニット(110)は、最初の細胞保持および、浄化ＴＣＦの回収物(108)の生成を、第一の保持ユニットの出口（114）で行い得る。該単離および精製プロセス（118）は、第二導管(115)からの回収物の、適当な濾過システムによる、濾過（単離）をさらに含んでいてよく、いくつかの態様において、該濾過システムによるｃＴＣＦの供給は、約３ミクロン以下、０．４５ミクロン以下または０．２ミクロン以下の最終濾過速度によって行われる。他の濾過速度を用いてもよい。

【0023】

濾過プロセスに次いで、例えば連続的な限外濾過分離プロセスを含む精製プロセスを行ってよい。いくつかの態様において、限外濾過は、流束対ＴＭＰ曲線の圧力依存性領域において、対象分子の転移点より下の特定の比流量で行ってよく、ここで、かかる特定の比流量は、連続的限外濾過の間を通じて実質的に一定である。連続単離および精製プロセス(118)を用いることにより、比較的高い収量を達成することができる。いくつかの態様において、cTCFは、cTCFの体積流量（l／時間）とほとんど同等であるか、約０．１〜２倍の面積（m²）を有するか、cTCFの体積流量（l／時間）とほとんど同等であるか、約０．３〜１倍の面積（m²）を有する限外濾過膜を通る。他の膜面積を用いてもよい。

【0024】

細胞保持ユニット（110）中の分離の後、TCF（108）および比較的高い濃度の細胞（109）の再循環排出物は、第二の保持ユニットの出口(119)にて、第三の細胞濃度(C3)に得られる。かかる第三の細胞濃度(C3)は、一般的に、第一濃度(C1)よりも比較的高く、すなわち、C3＞C1であり、これは、少量の細胞（109）の損失が回収液で見られるにもかかわらず、第一の保持ユニットの出口(114)にて抽出されるＴＣＦ（108）の体積がより大きいためである。第三細胞濃度(C3)は、例えば、細胞数約6 x 10⁶個/mL〜約60 x 10⁶個/mLの範囲であり得る。他の範囲の細胞濃度を用いてもよい。細胞保持ユニット(110)は、任意の公知の細胞分離技術、例えばディスクフィルター、スピンフィルター、フラットシートフィルター、微孔性中空繊維フィルター、クロスフローフィルター、ボルテックスフローフィルター、連続遠心分離、遠心性バイオリアクター、重力型セトラー、超音波デバイスおよび液体サイクロン等に基づいていてよい。中に入る第一細胞濃度(C1)を、外に出る細胞濃度(C2およびC3)に分けるよう設計され、操作可能であるため、そのように機能する、任意の適当なタイプの細胞保持ユニット(110)を使用し得る。

【0025】

本明細書中に記載の態様において、灌流バイオリアクターシステム（100）は、細胞凝集体トラップ（120）を含む。該細胞凝集体トラップ（120）は、トラップの入り口(121)において、細胞保持ユニット(110)から、ＴＣＦ(108)および細胞(109)の再循環排出物を第三の細胞濃度(C3)にて受け入れるように設計されていて操作可能であり、そのため、そのように機能する。細胞保持ユニット(110)は、第三導管(122)により、細胞凝集体トラップ(120)に流体連結されていてよい。いくつかの態様において、細胞保持ユニット(110)および細胞凝集体トラップ(120)の機能を１つのユニットに統合し得る。したがって、かかる態様においては、導管(122)は削除されていてよく、細胞保持ユニット(110)の排出物が、トラップの入口(121)に直接受け入れられてよい。

【0026】

細胞凝集体トラップ(120)は、細胞凝集体(109A)を、細胞凝集体トラップ(120)にて受け入れた、第三細胞濃度(C3)のＴＣＦ(108)および細胞(109)の再循環排出物から分離する際に機能する。実施の一において、細胞凝集体(109A)の分離は連続的に行う；すなわち、操作の間、細胞保持ユニット(110)からのフローは連続的である。一般的に、フローストリーム中に存在している場合、細胞凝集体(109A)の少なくともいくらか、一般的にはかなり高い割合(%)は、細胞凝集体トラップ(120)により取り除かれ、第四細胞濃度(C4)の、残存するＴＣＦ(108)および細胞(109)はバイオリアクター(102)の入口(104)に戻される。第四細胞濃度 (C4)は例えば、細胞数約5 x 10⁶個/mL〜約50 x 10⁶個/mLの範囲であり得る。他の範囲の細胞濃度を用いてもよい。いくつかの態様において、該灌流バイオリアクターシステム(100)および細胞凝集体トラップ(120)を含む方法は、細胞凝集体の約２０％〜約８０％を取り除くことができるが、他の割合(%)でも細胞凝集体を取り除き得る。

【0027】

TCF(108)および細胞(109)は、該トラップの出口（123）から出、第四導管（124）を通って、バイオリアクターの入り口(104)に入り得る。１つ以上の再循環ポンプ(125)が備えられていてよく、TCF(108)および細胞(109)のフローが起こるように操作されてよい。かかる１つ以上の再循環ポンプ（125）は、任意の都合のよい位置、例えば導管113、122もしくは124、または他の適当な位置であってよい。本明細書中に記載の態様において、ポンプ(125)は、第四導管（124）に連結している。

【0028】

さらに、該細胞凝集体トラップ(120)は、少量のＴＣＦ（108）およびいくらかの細胞凝集体（109A）が細胞凝集体トラップ（120）から取り除かれることを可能にするように設定され、操作可能であり、したがってそのように機能する任意の適当なトラップ廃棄口（126）を含んでいてよい。第五細胞濃度(C5)は、該トラップ廃棄口（126）にて得られる。第五細胞濃度(C5)は、例えば、細胞数約12 x 10⁶個/mL〜約90 x 10⁶個/mLの範囲であってよい。他の範囲の細胞濃度を用いてよい。いくつかの細胞凝集体（109A）が細胞凝集体トラップ（120）によりプロセスフローストリームより取り除かれるため、細胞濃度(C4)は、一般的に細胞濃度(C3)より低い、すなわちC4＜C3である。細胞凝集体（109A）および少量のTCF（109）は、トラップ廃棄口（126）より流れ、廃棄され得る。廃棄ポンプ（127）を、連続的にまたは周期的に操作して、細胞凝集体（109A）および少量のＴＣＦ(108)を、廃棄導管（128）を通して、廃棄容器、例えばフレキシブルバッグ、または他の型の廃棄容器に流してよい。

【0029】

細胞凝集体トラップ（120）の構造および操作を、以降、図２Ａおよび２Ｂについて記載する。細胞凝集体トラップ（120）は、強固な素材、例えばステンレススチール、ガラスまたはプラスチックでできていてよい、トラップ体（130）を含む。他の素材を用いてもよい。該TCF（108）および細胞（109）(細胞凝集体（109A）をいくらか含んでいてもよい)を、トラップ入り口（121）にて、例えばトラップ体の一番上で受け入れる。示すように、TCF（108）および細胞（109）ならびに場合により、細胞凝集体（109A）は、操作の間、トラップ入り口（121）のすぐ隣の位置に形成され得る拡張ゾーン(132)および該細胞凝集体トラップ（120）の沈降チャンバーに直接流れ込んでよい。該拡張ゾーン(132)は、沈降チャンバー（134）の横断面積が、該沈降チャンバー（134）の長さに沿って徐々に上昇する、斜めのまたは曲面の壁面からなっていてよい。本明細書中に示す態様において、拡張ゾーン(132)は、円錐台状領域として示される。しかし、トラップの入り口(121)の横断領域から、沈降チャンバー(134)の横断面領域への一般的に滑らかな移行の任意のものを用いてよい。一般的に、入り口(121)からの面積の増加の移行率は、細胞(109)の受ける、剪断力を最小化するために、約8.4cm²/cmより小さくてよく、いくつかの態様では、約4.2cm²/cmより小さくてよい。他の移行率を用いてもよい。しかし、いくつかの態様においては、拡張ゾーン(132)は存在しなくてもよい。

【0030】

細胞凝集体トラップ(120)は、サイドフローチャンバー(136)を含んでいてよい。該サイドフローチャンバー（136）は、沈降チャンバー(134)と連結して、ＴＣＦ（108）および細胞（109）が、トラップの出口(123)を通って細胞凝集体トラップ（120）から出て、細胞凝集体（109A）が、沈降チャンバー(134)中にて、重力下で沈降するように構成、設計され、操作可能なものである。示した態様において、サイドフローチャンバー（136）は、一般的に円柱状であり、沈降チャンバー(134)の側面(134S)から水平方向に拡張していることが一般的である。例えば、サイドフローチャンバー（136）は、一般的に、沈降チャンバー(134)から、垂直に拡張し得る。しかし垂直方向以外の他の形状、設計および配向を用いてもよい。

【0031】

沈降チャンバー(134)の拡張ゾーン(132)と同様に、細胞凝集体トラップ（120）は、サイドフローチャンバー(136)からのトラップ出口(123)に直接隣接する位置に、収縮ゾーン(138)を含み得る。いくつかの態様において、該収縮ゾーン(138)は、約8.4cm²/cm以下の面積収縮の移行率を示し、いくつかの態様においては、約4.2cm²/cm以下である。それより大きいもしくは小さい移行率を用いてもよい。いくつかの態様において、D3/D4比は、例えば、約２より大きくてもよい。同様に、沈降チャンバー(134)の底部のトラップ廃棄口(126)に、廃棄収縮ゾーン(140)があってよい。該トラップ廃棄口(126)は、最大の横断寸法Ｄ５（例えば、内径）を有し得る。１以上の態様において、廃棄収縮ゾーン(140)は、約8.4cm²/cm以下の面積収縮の移行率を示してよく、いくつかの態様においては、約4.2cm²/cm以下であってよい。それより大きいまたは小さい移行率を使用し得る。いくつかの態様において、D1/D5比率は、例えば約２より大きくてよい。

【0032】

より詳細には、沈降チャンバー(134)は、いくつかの態様において、約1.9cm〜約6.4cm、いくつかの態様では約2.5cm〜約5.1cmの横断寸法(D1)（例えば内径）を有する円形断面を有し得る。沈降チャンバー(134)の最大横断面積は、約2.9cm²〜約32cm²であってよく、いくつかの態様においては、例えば、約5.1cm²〜約20cm²である。トラップの入り口(121)は、約0.48cm〜約1.6cm、いくつかの態様においては、例えば約0.64cm〜約1.3cmの横断寸法(D2)(例えば内径)を有する円形断面を有し得る。いくつかの態様において、D1/D2比は約２より大きくてもよく、例えば、約４よりさらに大きくてもよい。しかし、他の適当な横断面の形態および大きさを用いてもよい。

【0033】

細胞凝集体トラップ（120）の適当な大きさは、灌流バイオリアクターシステム(100)の容量(例えば、その処理容量)に依存してよく、その大きさはフロー容量に基づいて大きくも小さくもなり得る。細胞凝集体トラップ(120)の大きさはまた、他の因子、例えば流体密度または粘度に依存し得る。沈降チャンバー(134)の最大の横断面積は、トラップの入り口(121)の最大横断面積と等しいかまたはそれより大きくてよい。本明細書中に示す態様において、沈降チャンバー(134)の最大横断面積は、トラップの入り口(121)の最大横断面積より大きい。具体的には、いくつかの態様において、沈降チャンバー(134)の最大横断面積は、トラップの入り口(121)の最大横断面積の約４倍以上、約１０倍以上、約３０倍以上、または約６０倍以上であってよい。

【0034】

該沈降チャンバー（134）は、上側の領域(134U)および下側の領域(134L)を含む。上側領域（134U）は、サイドフローチャンバー(136)の、中心線(142)より上側に位置し、下側領域(134L)は、該サイドフローチャンバー(136)の中心線(142)より下側に位置する。本明細書中に示す態様において、沈降チャンバー（134）の、拡張ゾーン(132)の上端から、収縮ゾーン(140)の下端までの全長(Lt)は、約9cm〜37cmであってよく、いくつかの態様においては約14cm〜28cmであってよい。収縮ゾーン(132)の上端からサイドフローチャンバー(136)の中心線(142)までの上側領域（134U）の長さ(Lu)は、約5cm〜18cmであってよく、いくつかの態様においては約7cm〜14cmであってよい。収縮ゾーン(140)の下端から、サイドフローチャンバー(136)の中心線(142)までの下側領域(134L)の長さ(Ll)は、約5cm〜18cmであってよく、いくつかの態様においては約7cm〜14cmであってよい。他の大きさを用いてもよい。一般的に、Ll/Luの比率は＞0.5であることが望ましく、いくつかの態様においては、例えばLl/Lu＞4であり得る。他の比率を用いてもよい。

【0035】

操作の間、細胞凝集体トラップ（120）を通る体積流量は、一般的に、約0.0025m³/分〜約0.0068m³/分であり、いくつかの態様においては、約0.0030m³/分〜約0.0045m³/分である。他の体積流量(例えば容量)を用いてもよい。しかし、いくつかの態様においては、液流量を、沈降チャンバー(134)中の、層レイレルズ数の範囲に保つことが望ましい。沈降チャンバー (134)中のレイノルズ数は、混合を最小化し、適切な細胞凝集体(109A)の沈降および分離を促進するためには、約2300より小さいか、約1000より小さいか、またはいくつかの態様においては約500より小さくてよく、ここで、該レイノルズ数は、以下の式１によりおよそ定義される：
Ｒｅ = ρＱ/μ 式１
[式中:
Ｑは、液体の体積流量(m³/s)であり、
μは、液体の動的粘度 (kg/(m・s)であり、
ρは液体の密度(kg/m³)である。]。

【0036】

しかし、ＴＣＦ(108)および細胞(109)が、トラップの出口(123)から細胞凝集体トラップ（120）を出られ、沈降チャンバー(134)中で沈降することに対して抵抗を示すように、フローストリーム中で細胞(109)を適切に保持するためには、沈降チャンバー(134)中のフローは、例えば、細胞(109)の沈降を避けられるだけのレイノルズ数を有し得る。

【0037】

サイドフローチャンバー(136)は、約1.9cm〜約6.4cm、いくつかの態様においては約2.5cm〜約5.1cmの最大横断寸法 (D3) (例えば、内径)を示す円形断面を有し得る。該サイドフローチャンバー(136)の最大横断面積は、約2.9cm²〜約32cm²であってよく、いくつかの態様においては、例えば、約5.1cm²〜約20cm²であってよい。例えば、他の適当な横断の形状および大きさを使用してもよい。サイドフローチャンバー(136)の、入口から、収縮ゾーン(138)の出口までの、サイドフローチャンバー(136)の全長 (Ls) は、約4cm〜15cmであってよく、いくつかの態様においては、約5cm〜11cmであってよい。サイドフローチャンバー(136)の出口(123)の最大の大きさ(D4) (例えば、内径)は、約0.48cm〜1.6cmであってよく、いくつかの態様においては約0.64cm〜1.3cmである。他の大きさを用いてもよい。サイドフローチャンバー(136)中のフローは、約２３００より大きい、または例えば約４０００より大きいレイノルズ数を示してよい。他のレイノルズ数の範囲を用いてもよい。サイドフローチャンバー(136)中の細胞(109)の沈降が最小になるようなレイノルズ数を選択してよい。

【0038】

いくつかの態様において、沈降チャンバー(134)の最大横断面積(Asc)は、サイドフローチャンバー(134)の最大横断面積(Asfc)と同等かまたはそれより大きい、すなわちAsc≧Asfcである。具体的には、沈降チャンバー(134)の最大横断面積(Asc)は、サイドフローチャンバー(136)の最大横断面積と等しいかまたは５倍以上大きくてよい。他のAsc/Asfc比率を用いてもよい。横断面積の差異は、一般的には、沈降能を改善するのに機能し得る。本明細書中で記載の代表的な大きさである、D1〜D5は、第二導管(115)中のフローが１日あたり約２０００〜３０００lの容量を有する灌流バイオリアクターシステム(100)の具体的な態様に関する(図1)。それより小さいもしくは大きい容量を有する灌流バイオリアクターシステム(100)は、本発明の態様、例えば第二導管(115)中のフローが１日あたり約１００〜２００lの容量である、灌流バイオリアクターシステム(100)を用いることによって益を得うる。

【0039】

操作中、該細胞凝集体トラップ（120）は、沈降チャンバー(134)およびサイドフローチャンバー(136)について、本明細書中で記載したような適切な寸法決定および体積流量によって、約１０個の凝集細胞より大きいかまたはそれと同等か、または約２０個の凝集細胞(109)より大きいかまたはそれと同等、または約４０個の凝集細胞(109)より大きいかまたはそれと同等の細胞凝集体(109A)を取り除くように設計されており、操作可能であり、そのように適用されている。いくつかの態様において、それより少ない数の凝集細胞を取り除いてもよい。細胞(109)および(TCF)は、サイドフローチャンバー(136)を出ることができる。したがって、望ましくない細胞凝集体(109A)は、本発明の様々な態様の操作により取り除かれる。いくつかの態様において、細胞凝集体トラップ（120）により取り除かれる望ましくない細胞凝集体(109A)は、約６０ミクロンより大きいか、約１００ミクロンより大きいかまたはそれよりもさらに大きい、最小の横方向の寸法(D6)を有し得る(図２Ａ参照)。それよりも小さいサイズの細胞凝集体も取り除き得る。細胞凝集体トラップ（120）を用いる１つの有利な点は、灌流バイオリアクターシステム (100)からのＴＣＦ(108)の廃棄速度が低下し得るということである。具体的には、細胞凝集体トラップ（120）からの廃棄細胞濃度(C5)が、第一の細胞濃度(C1)と同等または約３倍まで高くなる(ここで、C5≧3C1)か、または同等かもしくはC1の約５倍まで高くなる(ここで、C5≧5C1)ように、TCF(108)の廃棄速度を減速しうる。

【0040】

示す態様において、細胞凝集体トラップ（120）は、細胞保持ユニット(110)の出口に設置された状態で示されている。しかし、該細胞凝集体トラップ(120)は、灌流バイオリアクターシステム（100）の、他の任意の場所に設置してよいことは理解されるべきである。例えば、細胞凝集体トラップ（120）のような細胞凝集体トラップは、第一導管(113)の位置(例えば、バイオリアクターの出口(106)または細胞保持ユニットの入り口(112)の隣またはそうでなければ、第一導管(113)に連結している)であってよい。この態様において、細胞凝集体(109A)を含んでいてよいＴＣＦ(108)および細胞(109)の再循環排出物は、細胞凝集体トラップを通り、細胞保持ユニット(110)に達する。したがって、細胞凝集体(109A)は、保持ユニット(110)に入る前にフローストリームから取り除き得る。また、細胞凝集体トラップは、バイオリアクター(102)の中に、例えばバイオリアクターの入り口(104)にてまたはその付近にて統合し得る。

【0041】

灌流バイオリアクターシステム(100)の様々な態様の操作方法を、以下の図３について記述する。灌流バイオリアクターシステム(100)を操作する１つの方法(300)は、バイオリアクター(例えばバイオリアクター(102))から、細胞(例えば細胞(109)および場合によっては、いくつかの細胞凝集体(109A))を含む組織培養液(例えばＴＣＦ(108))を細胞保持ユニット(例えば細胞保持ユニット(110))に供給すること(302)を含む。細胞を含む組織培養液は、第一の細胞濃度(C1)であり得る。さらに、該方法（300）は、該細胞保持ユニット中で、細胞を、組織培養液から分離して、組織培養液および細胞の回収物（例えば、第二導管(115)にて）ならびに組織培養液および細胞の再循環排出物を供給すること(304)を含む。該回収物は、第二の細胞濃度(C2)であり得る。組織培養液および細胞の再循環排出物は、第三細胞濃度(C3)であり得る。組織培養液および細胞の再循環排出物は、第三導管(122)にて得られる。306において、細胞凝集体トラップ(例えば、細胞凝集体トラップ(120))中にて、細胞凝集体(例えば109A)の、組織培養液および細胞の再循環排出物からの分離を行う。最後に、308にて、該組織培養液および細胞を、細胞凝集体の量が比較的少なくなった状態で、バイオリアクターに戻し得る（上述の比較的量が少ないとは、細胞凝集体トラップ(120)が無かった場合にバイオリアクター(102)に戻るであろう組織培養液および細胞との比較である）。戻る組織培養液および細胞は、第四の細胞濃度(C4)であり得る。該分離プロセスの間、沈降チャンバー(134)中で細胞(109)から分離された細胞凝集体(109A)は、周期的または連続的に、沈降チャンバー(134)の底部に沈降し、細胞凝集体(例えば、細胞凝集体トラップ(120))から、例えば、トラップ廃棄口(126)から外に出て廃棄されてよい。

【0042】

灌流バイオリアクターシステム(100)を操作する他の具体的な方法を、図４について記述する。該方法(400)は、組織培養液（例えば、ＴＣＦ(108)）および細胞（例えば、細胞(109)および場合によって細胞凝集体(109A)）のフローをバイオリアクター(例えば、バイオリアクター(102))から供給すること(402)を含む。さらに、該方法(400)は、細胞保持ユニット (例えば、細胞保持ユニット(110))中にて、組織培養液から細胞を分離し、回収物(例えば、導管(115)中の排出物)を供給すること(404)を含む。406において、細胞凝集体トラップ(例えば、細胞凝集体トラップ(120))中で、細胞凝集体を、組織培養液および細胞から分離する。408において、組織培養液および細胞を、細胞凝集体の量が比較的少なくなった状態でバイオリアクターに戻し得る（上述の比較的量が少ないとは、細胞凝集体トラップ(120)が無かった場合にバイオリアクター(102)に戻るであろう組織培養液および細胞との比較である）。上述の内容から理解できるであろうが、細胞凝集体トラップ (例えば、細胞凝集体トラップ(120))は、細胞保持ユニット（例えば、細胞保持ユニット(110)）の前後または、細胞凝集体(109A)を、再循環フローストリームから効率的に取り除き得る、灌流バイオリアクターシステム(100)中の他の任意の場所に設置してよい。さらに、１以上の細胞凝集体トラップを、灌流バイオリアクターシステム中に置いてよい。

【0043】

本態様の方法は、凝集塊または細胞集団としてお互いに接着し得る約１０と同等かまたはそれ以上、または約２０と同等かまたはそれ以上（または約４０と同等かまたはそれ以上）の凝集細胞を有する細胞凝集体（例えば109A）を取り除くのに有用である（しかし、いくつかの態様において、より小さい細胞凝集体も取り除き得る）。例えば、上述の範囲の細胞凝集体（例えば、109A）を取り除き得る。そのため、灌流プロセスの操作の間、バイオリアクター(102)中の密度は、比較的より密接に制御し得る。さらに、他の利点として、ＴＣＦ(108)の廃棄体積を減少し得る。したがって、これは、生成物の体積の損失を最小化し得るという点で顕著に有利である。この利点は、細胞凝集体(109A)が比較的少ない量しか形成されない、灌流バイオリアクターシステム(100)においても、顕著なものである。

【0044】

上述の記載は、細胞凝集体トラップ、細胞凝集体トラップを含む灌流バイオリアクターシステム、該灌流バイオリアクターシステムの操作方法の例となる態様を記載しているにすぎない。本発明が、かかる態様に限定されることは意図されることではない。反対に、本発明は、当業者の理解し得る、様々な代替物、変更および等価物を包含する。例えば、比較的小さい細胞凝集体を、その存在が灌流バイオリアクターシステムの操作に望ましくないものであれば、他の態様の細胞凝集体トラップを用いて取り除いてよい。本明細書中で用いる節の見出しは、構造上の目的のためのみのものであって、本発明の特定事項を限定するものと解されるべきではない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】