特許 6227645 プロセスサンプル中の微生物の多様性指数および生存率指数を構築するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6227645

(24)【登録日】2017年10月20日

(45)【発行日】2017年11月8日

(54)【発明の名称】プロセスサンプル中の微生物の多様性指数および生存率指数を構築するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20171030BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20171030BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171030BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   A01P3/00

   C12N15/00 A

【請求項の数】11

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-523226(P2015-523226)

(86)(22)【出願日】2013年7月17日

(65)【公表番号】特表2015-530872(P2015-530872A)

(43)【公表日】2015年10月29日

(86)【国際出願番号】US2013050896

(87)【国際公開番号】WO2014015044

(87)【国際公開日】20140123

【審査請求日】2016年6月24日

(31)【優先権主張番号】13/550,748

(32)【優先日】2012年7月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507248837

【氏名又は名称】ナルコ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】110001210

【氏名又は名称】特許業務法人ＹＫＩ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ライス ローラ イー

(72)【発明者】

【氏名】ランド リリヤ

【審査官】 安居 拓哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２１７８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Anna Piasecka，Biofouling，２０１２年 ２月，Vol.28, No.2，pp.225-238

【文献】 Minna Peltola，J Ind Microbiol Biotechnol，２００８年，Vol.35，pp.1651-1657

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記工程：
前記産業プロセスシステムの少なくとも１つの部分中に存在する２つ以上の生物の相対濃度を同定する、少なくとも１つの第１の測定を行う工程、
前記産業プロセスシステムの前記少なくとも１つの部分中に存在する２つ以上の生物の相対濃度を同定する少なくとも１つの第２の測定を行う工程であって、前記第２の測定による同定は少なくとも部分的にその後の多様性指数を規定し、前記少なくとも１つの第２の測定は前記第１の測定（複数可）よりも後で行われる、工程、
前記２つ以上の生物の濃度における任意の相対変化に注目する工程、
前記測定された生物の１つの前記相対濃度が、予め決められた閾値量を超えた場合、前記相対変化が前記産業プロセスシステムに対する望まれない効果と関連するかを決定する工程、ならびに
前記望まれない効果を修正するための修正法を実行する工程、
を含む、産業プロセスシステムにおける微生物侵襲に対処する方法であって、
前記測定された生物の１つがパイオニアであるか、および前記測定された生物の１つがアダプターであるかを同定する工程をさらに含み、
前記測定された生物の１つがパイオニアであり、前記第２の測定におけるその相対濃度が前記予め決められた閾値量を超えて増加する場合、前記修正法は、パイオニアを標的とする殺生物剤レジメンを適用する工程を含み、パイオニアが検出されない場合、前記修正法は、前記微生物類の定着を促進する非生物学的ベクターを同定し、排除する工程を含む、方法。

【請求項2】

前記第１および第２の測定は、ＤＮＡ分析、ＰＣＲ分析、ｑＰＣＲ分析、およびそれらの任意の組み合わせからなるリストより選択される少なくとも１つのアイテムにより実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記閾値量は、前記システムから取られた１ｍｌの流体あたり１０^４細胞または前記産業プロセスの最終製品もしくは前記産業プロセスからの固体サンプル１グラムあたり１０^４細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの生物のアイデンティティに関係なく、それらの相対濃度が前の測定に比べ、閾値を超える量だけ増加した場合、全体の生物学的個体数が同じままであっても、殺生物剤処理が前記システムに付加される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記多様性指数の変化を前記産業システムで起きた別の事象と相関させる工程をさらに含み、前記別の事象は下記からなるリストより選択される、請求項１に記載の方法：少なくとも１つの供給材料の源を変更すること、少なくとも１つの供給材料の種類を変更すること、前記システムの少なくとも一部の動作速度を変更すること、およびそれらの任意の組み合わせ、ならびに前記事象を反転させること。

【請求項6】

前記サンプル中の細胞の全体の濃度は前記第１の測定と前記第２の測定の間で不変のままである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記測定は、堆積物が形成されたシステムの一部で行われ、前記堆積物はいずれの重要な生物学的要素も含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記測定は前記システムを通して複数の位置にわたって行われ、前記指数は全システム集団を比較する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも１つの第３の多様性指数測定が、前記第２の測定後および前記修正後に行われ、前記修正の効力が前記第３の多様性指数測定において測定された少なくとも２つの生物の相対濃度の変化により評価される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記サンプル中の細胞の全体の濃度は、前記第１の測定と前記第２の測定の間で不変のままであり、第１および第２の生物のアイデンティティはプロセス機器または最終製品に対しいずれの望まれない効果も引き起こさないことが知られており、有効な殺生物剤は、閾値変化が検出された時に、前記第１および第２の生物を死滅させるために前記システムに添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記生物の１つは、殺生物剤に抵抗性がある胞子を形成することができ、その生物の相対量が閾値を超えて増殖した場合、前記方法は、胞子形成を防止するために、栄養細胞を有するプロセスの領域を標的とする、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は２０１２年１月２４日に出願された米国特許出願１３／３６０，２３８号の一部継続出願である。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
不適用。

【0003】

本発明は一般に、商用プロセスシステム中に存在する微生物類を検出する、同定する、および対処するのに有用な物質の組成物、装置および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

商用プロセスシステム中のある一定の微生物の存在および増殖は進行中の問題である。商用プロセスシステムの様々な段階の多くは、あらゆる種類の微生物類によるコロニー形成に好適な環境的ニッチとしてしばしば機能する、異なる量の水、栄養分、熱、シェルター、アンカリング基材（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、化学的条件、および／または捕食者の不在を有する様々な条件を含む。これらの微生物類による集団増殖はしばしば、プロセス機能の劣化および最終製品の汚損を含む多くの問題を引き起こす。

【0005】

１つのそのような問題は微生物に誘導されるクラスト（ｃｒｕｓｔ）堆積物形成である。クラストは、堆積された有機および／または無機材料を含む、剛性固体組成物の商用プロセスシステム中に存在するアイテムの表面上の蓄積物である。クラストは微生物類自体の分泌物および／またはコロニーである場合がある。特にクラストは、１つ以上の種類の堅い殻の、および／またはキチンを有する、および／またはサンゴ生物の蓄積を含む、またはこれらから構成される可能性がある。クラストはシステムに対し多くのマイナスの影響を有する可能性があり、例えば、動作効率の減少、時期尚早の機器の故障、生産性の損失、製品品質の損失、および健康関連リスクの増加である。一番困るのは、クラストはしばしば、削ることまたは他の物理的手段により物理的に除去しなければならず、これには、プロセスシステムの一部または全ての費用のかかるシャットダウンまたは分解が必要となる。

【0006】

微生物類が引き起こす別の問題は、バイオフィルムの形成による。バイオフィルムは、微生物類または微生物類により分泌されるエキソポリマ物質を含む、有機材料の層であり、これらは、微生物の群集の形成を助ける。バイオフィルムは、プロセス機器の表面上ならびに流体プール中で増殖することができる。これらのバイオフィルムは、栄養分を濃縮するための手段を確立し、増殖のための保護を与える複雑な生態系である。バイオフィルムは、クラスト、腐食、および他の汚損プロセスを加速し得る。バイオフィルムはシステム効率の低減の一因となるだけでなく、病原生物を含む他の微生物類の微生物増殖のための優れた環境を提供する。そのため、プロセス効率を最大にする、およびそのような病原体からの健康関連リスクを最小に抑えるために、可能な最大限までバイオフィルムおよび他の汚損プロセスを低減させることが重要である。

【0007】

いくつかの因子が生物学的汚染の程度の一因となっており、適切な対応を支配している。水温；水ｐＨ；有機および無機栄養分、好気性または嫌気性条件などの増殖条件、および場合によっては太陽光の有無、などは重要な役割を果たし得る。これらの因子はまた、どの型の微生物類が水系に存在するか、およびそれらの微生物類を制御する最善の方法を決定するのを助ける。微生物の適正な同定もまた、適切に対応するには非常に重要である。微生物類が植物、動物、または真菌であるか、あるいはそれらが浮遊性であるか、または固着であるかに関する違いは、様々な生物的防除がどれくらい有効であるかを決定する。異なる微生物類は異なる問題を誘導するので、適正な同定は、望まれない微生物効果を適正に修正するのに非常に重要である。最後に、化学的に引き起こされる問題は殺生物剤で修正することはできないので、どの問題が非生物学に基づく起源を有するかを特定することも必要である。

【0008】

プロセスシステムをモニタするために典型的に使用される標準技術としては、標準平板菌数技術が挙げられる。これらの技術は長いインキュベーション期間を必要とし、微生物増殖に関連する問題の事前制御および防止のための十分な情報を提供しない。最近になって、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｈｐｈａｔｅ）（ＡＴＰ）測定が、事前制御の手段として使用されるようになっている。しかしながら、試薬はコストがかかり、大きな水系から少量がサンプリングされる。ＡＴＰアッセイの使用により、サンプル中の微生物活性を定量することができるが、反応は１つの型の微生物により生成されるＡＴＰを別のものと比較して区別することはできず、生存可能であるが、阻害された生物を検出しない。別の不利点は、この方法を、シート欠陥への微生物の寄与を決定するために使用することができない点である。というのも、ほとんどの生物は、乾燥機セクションの熱への曝露後に生存可能でないからである。データ収集はまた、まれであり、データの著しいギャップに至る。よって、このアプローチは対象となるシステムにおける微生物類の状態に関する制限された情報しか提供しない。加えて、これらのアプローチは典型的には、浮遊性細菌をモニタするために使用される。場合によっては、バイオフィルム細菌を定量するために、表面が拭き取られ、分析される。これらのアプローチは非常に退屈で時間がかかる。

【0009】

微生物活性および好気性代謝は、溶存酸素濃度の減少に至らしめることがよく知られているので、溶存酸素（ＤＯ）プローブが流体中の微生物活性を測定するために使用されている。米国特許５，１９０，７２８号および５，２８２，５３７号は、ＤＯ測定を使用した商業用水中の汚損をモニタするための方法および装置を開示する。しかしながら、このアプローチは生物学的汚損を非生物学的汚損から識別するために栄養分添加の使用を必要とし、プローブ表面が汚損された後、さらなる測定のためにどのようにしてプローブがリフレッシュされるかについての言及がない。加えて、開示されたアプローチは、酸素を連続して供給する手段を必要とする。

【0010】

標準クラーク（Ｃｌａｒｋ）型電気化学ＤＯプローブは下記のような多くの制限を有する：化学的干渉（Ｈ２Ｓ、ｐＨ、ＣＯ２、ＮＨ３、ＳＯ４、Ｃｌ−、Ｃｌ２、ＣｌＯ２、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨおよび様々なイオン性種）、頻繁な較正および膜交換、遅い応答およびドリフト読み取り（ｄｒｉｆｔｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ）、熱衝撃、および膜を横切る高い流量要求。新しい型の溶存酸素プローブ（近年、多くの会社（例えば、ハック（ＨＡＣＨ）、コロラド州ラブランド）により市販されている）は、これらの制限のほとんど全てを克服しており、そのため、ＤＯはプロセス水でオンラインにて測定することができる。この新規ＤＯプローブ（ＬＤＯ）は、寿命蛍光減衰に基づき、この場合、酸素の存在は、フルオロフォアの蛍光寿命を短くする。フルオロフォアはフィルム内で、センサ表面に固定化され、励起が青色ＬＥＤにより提供される。米国特許５，６９８，４１２号および５，８５６，１１９号は、流体中の生物活性をモニタし、制御するための方法を開示し、この場合、ＤＯがｐＨおよび／またはＯＲＰ（酸化還元電位）と合わせて測定され、栄養分／基質枯渇に特定的に関連する代謝挙動における推移が測定される。

【0011】

従来のプレーティング技術およびオキシダント残留物は、十分な殺生物剤投与および微生物増殖の制御を示すことができるが、堆積、欠陥および破損が蔓延したままである。産業システムにおける微生物増殖およびバイオフィルム形成に関するより正確な情報を提供する明確な必要性が存在する。定量的ＰＣＲ技術は、微生物類の品質問題への寄与を決定するための、シート欠陥、フェルト、プロセス水サンプル、などの迅速分析を可能にする。この新しいアプローチは、機械効率および製品品質の改善につながる、問題のより積極的な診断を可能にすることが証明されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許出願公開１３／３６０，２３８号明細書

【特許文献2】米国特許５，１９０，７２８号明細書

【特許文献3】米国特許５，２８２，５３７号明細書

【特許文献4】米国特許５，６９８，４１２号明細書

【特許文献5】米国特許５，８５６，１１９号明細書

【特許文献6】米国特許５，９２８，８７５号明細書

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ｂｙ Ｒａｎｄａｌｌ Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２３９， ｐｐ． ４８７−４９１ （１９８８）

【非特許文献2】Ａｒｔｉｃｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｂｙ Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５５， ｐｐ． ３３５−３５０ （１９８７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

よって、商用プロセスシステムにおいて存在する微生物類の適正な同定のための新規方法および組成物において明確な有用性が存在することが明らかである。このセクションで記載される技術は、特定的にそのようなものとして指定されない限り、本明細書で言及される特許、刊行物または他の情報のいずれかがこの発明に関して「先行技術」であるという承認を構成することを意図しない。加えて、このセクションは、調査がなされたこと、または３７ ＣＦＲ § １．５６（ａ）において規定される他の関連情報が存在することを意味すると解釈されるべきではない。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明の少なくとも１つの実施形態は、産業プロセスシステムにおける微生物侵襲に対処する方法に関する。方法は、下記工程を含む：１）産業プロセスシステムの少なくとも１つの部分中に存在する２つ以上の生物の相対濃度を同定する少なくとも１つの第１の測定を取る工程であって、同定は少なくとも部分的に、ベースライン多様性指数を規定する工程、２）産業プロセスシステムの少なくとも１つの部分中に存在する２つ以上の生物の相対濃度を同定する少なくとも１つの第２の測定を取る工程であって、同定は少なくとも部分的にその後の多様性指数を規定し、少なくとも１つの第２の測定は第１の測定（複数可）よりも後で取られる工程、３）２つの生物の濃度における任意の相対変化に注目する工程、４）第２の測定が、測定とは、予め決められた閾値量よりも大きな量だけ異なっている場合、変化が産業プロセスシステムに対する望まれない効果と関連するかを決定する工程、ならびに５）望まれない効果を修正するための修正法を実行する工程。

【0016】

第１および第２の測定は、ＤＮＡ分析、ＰＣＲ分析、ｑＰＣＲ分析、およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択される少なくとも１つのアイテムにより実施されてもよい。閾値量はシステムから取られた１ｍｌの流体あたり１００細胞、または産業プロセスの最終製品、もしくはプロセスから取られた他の固体サンプル、例えば、限定はされないが、フェルト１グラムあたり１００細胞とすることができる。方法はさらに、生物の１つがパイオニアであるか、および１つがアダプターであるかを同定する工程を含んでもよく、１つがパイオニアであり、その濃度がその後の指数において閾値を超えて増加する場合、修正は、パイオニアを標的とする殺生物剤レジメンを適用する工程を含み、バイオフィルム形成物が検出されない場合、修正は微生物類の定着を促進する非生物学的ベクターを同定し、排除する工程を含む。

【0017】

少なくとも１つの生物のアイデンティティに関係なく、それらの相対濃度が前の測定に比べ、閾値を超える量だけ増加した場合、全体の生物学的集団が同じままであっても、殺生物剤処理がシステムに付加されてもよい。

【0018】

方法はさらに、多様性指数の変化を産業システムで起きた別の事象と相関させる工程を含んでもよく、他の事象は下記からなるリストより選択される：少なくとも１つの供給材料の源を変更すること、少なくとも１つの供給材料の種類を変更すること、システムの少なくとも一部の動作速度を変更すること、およびそれらの任意の組み合わせ、ならびに事象を反転させること。サンプル中の細胞の全体の濃度は第１の測定と第２の測定の間で不変のままであってもよい。測定は堆積物が形成されたシステムの一部で取られてもよく、堆積物がいずれの重要な生物学的要素も含まない。測定はシステムを通して複数の位置にわたって取られてもよく、指数は全システム集団を比較する。

【0019】

少なくとも１つの第３の多様性指数測定は第２の測定後および修正後に取られてもよく、修正の効力は第３の多様性指数測定において測定された少なくとも２つの生物の相対濃度の変化により評価される。サンプル中の細胞の全体の濃度は第１の測定と第２の測定の間で不変のままであってもよく、第１および第２の生物のアイデンティティはプロセス機器または最終製品に対しいずれの望まれない効果も引き起こさないことが知られており、有効な殺生物剤は、閾値変化が検出された時に、第１および第２の生物を死滅させるために、システムに添加されてもよい。生物の１つは胞子を形成することができる場合があり、これらは殺生物剤に抵抗性があり、その生物の相対量が閾値を超えて増殖した場合、処理は、胞子形成を防止するために、栄養細胞を有するプロセスの領域を標的とすることができる。

【0020】

発明の詳細な説明を以下、図面を特定的に参照して記載する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】コートフリーシート（ｃｏａｔｅｄ ｆｒｅｅ ｓｈｅｅｔ）工場で収集されたへッドボックス堆積物中の総細菌（Ａ）、初期（プライマリ、ｐｒｉｍａｒｙ）（Ｂ）および適応（アダプティブ、ａｄａｐｔｉｖｅ）（Ｃ）バイオフィルム形成細菌の迅速検出のための発明の適用を示す３つのグラフを含む。

【図2】発明が適用されたコートフリーシート工場（１−５）、ティッシュ工場（６）、および未コートフリーシート工場（７）からのシート欠陥の総細菌負荷のグラフを示す。

【図3】発明が適用されたシート欠陥サンプルの総細菌負荷のグラフである。

【図4】３つの異なる製紙工場由来の機械フェルトから収集したＤＮＡサンプルにおける微生物の多様性を示す円グラフを示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

下記定義は本出願において使用される、特に特許請求の範囲において使用される用語がどのように解釈されるべきかを決定するために提供される。定義の組織は便宜上のものにすぎず、定義のいずれも、いずれかの特定のカテゴリに制限することは意図されない。

【0023】

「アダプター」は、生物的防除プログラムに対しいくらかのレベルの耐性を示す生物を意味する。アダプターの微生物競合が殺生物剤により低減される場合、この適応生物は繁栄することができ、バイオフィルムを形成することができる。

【0024】

「生物学的」は、組成の少なくとも１０％（体積または質量）が生物由来の細胞を含む物質の組成を意味する。

【0025】

「欠陥」は、産業プロセスと関連するアイテムの望まれない特質を意味する。これとしては、フェルト上の１つ以上のプラグ、ならびに、穴、変色、筋、染み、半透明の染み、およびそれらの任意の組み合わせなどの紙シートの特質が挙げられるが、それらに限定されない。

【0026】

「フェルト」は、抄紙プロセスで使用される、織り合わされた羊毛または任意の他の繊維で作られたベルトを意味し、これは材料のコンベヤーとして機能し、ここで、織り合わされた繊維は、水または他の流体が通過し得る複数の管腔を規定する。フェルトはまた、プレスロール間にクッション材を提供することができ、または、水を抄紙材料から除去するために使用される媒体とすることができる。フェルトとしては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ボトムフェルト、ボトムボードフェルト、シリンダーティッシュウェットフェルト、ドライヤーフェルト、エンドレスフェルト、ピックアップフェルト、サクションピックアップフェルト、ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）トップフェルト、およびトップフェルト。

【0027】

「オポチュニスト（Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔ）」は予め準備されたバイオフィルム、クラスト、堆積物、または他の生物コロニー中への定着により繁栄する生物を意味し、パイオニア生物および／または前のオポチュニスト生物に取って代わる、置換する、一緒に共存する傾向がある。

【0028】

「紙製品または紙シート」は、伝統的に、抄紙プロセスの任意の形成された繊維性構造最終製品を意味するが、必ずしも、セルロース繊維を含まない。そのような最終製品の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：化粧紙、トイレットペーパー、食卓用ナプキン、コピー紙、プリンター用紙、筆記用紙、手帳用紙、新聞紙、板紙、ポスター用紙、ボンド紙、ボール紙、など。

【0029】

「抄紙プロセス」は、原料を紙製品に変換するための１つ以上のプロセスを意味し、これは、パルプ化、蒸解、精製、乾燥、カレンダー加工（ｃａｌａｎｄｅｒｉｎｇ）、プレス加工、クリープ加工（ｃｒｅｐｅｉｎｇ）、脱水、および漂白などの１つ以上の工程を含むが、それらに限定されない。

【0030】

「ＰＣＲ分析」は、ポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。

【0031】

「パイオニアまたは初期」は、清浄表面または領域に付着し、よって、その表面でバイオフィルム、クラスト、または堆積物形成を開始する生物を意味する。

【0032】

「プラグ」は、フェルトの管腔内に配置される材料の固体、半固体、粘性、および／または他の堆積物を意味する。プラグは管腔を通る材料の流れを阻害する可能性があり、および／またはフェルトの任意の他の機能性を損なう可能性がある。

【0033】

「プライマー」は、ＤＮＡの特定のセクションに相補的で、ＤＮＡの特定のセクションに隣接するＤＮＡに相補的なヌクレオチド鎖の合成のための開始点として機能することが知られている、物質の組成物、典型的には、短鎖のヌクレオチドを意味する。

【0034】

「プローブ」は、ＤＮＡの標的セクションに結合するように構築され、配列された物質の組成物を意味し、これは、そのように結合されると容易に検出することができ、よって、これを使用してＤＮＡの標的セクションの有無を示すことができる。

【0035】

「ｑＰＣＲ分析」は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析を意味する。

【0036】

「微生物類」は、それ自体が、産業プロセス（抄紙を含む）において使用される機器内、これに隣接して、これの上面に、またはこれに付着して入り込むのに十分小さな任意の生物を意味し、これとしては下記が挙げられるが、それらに限定されず：非常に小さく、顕微鏡の助けなしでは見ることができないそれらの生物、裸眼で見ることができるが、小さすぎて裸眼で見ることができない多くの個々の生物を含むそのような小さな生物の収集物またはコロニー、ならびに裸眼で見ることができる１つ以上の生物、これとしては下記が挙げられるが、それらに限定されない：その存在が、どうかすると、産業プロセスを損なう、例えば、フェルト内でプラグを形成し、および／または紙シート内の欠陥を引き起こす、任意の生物。

【0037】

以上の定義または本出願のどこかで提示された記述が、辞書で一般的に使用され、または本出願に参照により組み込まれる源内で提示された意味（明示または暗示）と矛盾する場合には、本出願および特に特許請求の範囲の用語は、一般的な定義、辞書定義、または参照により組み込まれた定義ではなく、本出願における定義または説明に従い解釈されるべきと理解される。以上を考慮すると、用語が、辞書により解釈される場合、用語が化学技術のカークオスマー辞典、第５版（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）（２００５）（ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）により出版）により規定される場合にのみ理解できる場合、この定義は、用語が特許請求の範囲においてどのように規定されるかを制御するであろう。

【0038】

発明の少なくとも１つの実施形態は、システムの少なくとも一部の現在の多様性指数をベースライン指数と比較することにより、微生物侵襲を特定する方法に関する。事実上、微生物学的生物を１００％含まない商用プロセスシステムはない。プロセスシステム施設はしばしば、これらを通して生物は入ることができる多くのインプットを有する莫大な量を含み、それらがコロニー形成するための多くの異なるニッチを含み、そのため、それは常にある種の生物集団を有する。しかしながら、商業上の点から見て、システムは、良性生物が居住する方が、有害生物、例えば、プロセスを損ない、生成物にダメージを与え、または人々に危険を引き起こすものが居住するよりもずっと好ましい。その結果、多様性指数を使用することは、集団の変化を良性効果から有害効果への変化と相関させる有用な診断アプローチである。どの生物が存在し、およびそれらがどこにいるのか正確に特定する方法は、適正な修正法を選択する、および最適な位置でそれを配置するのに役立つことができる。

【0039】

多様性指数は商用プロセスシステム中に存在する生物の生物学的多様性のスナップショットである。多様性指数は、システム全体とすることができ、またはプロセスシステムのある一定の部分に限定することができる。例えば、それは多くのリッチ流体インプットの収束点であるので、抄紙プロセスのへッドボックスはしばしば、微生物類が多く生息しており、時間と共に広く変動する多様性指数を有することが予測され得る。対照的に、抄紙プロセスで使用される処理済み真水はほとんど生物を含まず、よって、そこでの２、３の生物から多くの細菌への多様性および存在量の変化は問題を示すであろう。その結果、時として、特定のセクションの多様性指数は、システム全体の多様性指数は提供しないであろう見識を提供することに注意すべきである。多様性の変化の種類およびそれらがどこに位置するのかは、殺生物剤の供給点をどこに配置するべきか、どのように集団に対処すべきかに影響することに注意すべきである。

【0040】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数が有害な微生物学的効果をそれが起こる前に機先を制して回避するために使用される。特に商用プロセスシステムにおける特定の問題に対応する多くの異なる種類の生物が存在するので、特定の標的生物の有無または相対比率に焦点を合わせることが時として効率的である。例えば、いくつかの生物はパイオニアであり、いくつかは適応バイオフィルム形成物である。パイオニアは、前には何もなかったところにバイオフィルムまたはクラスト堆積物を生成し、一方、適応バイオフィルム形成物は、処理プログラムに対し抵抗性を示す。多様性指数のレビューが、最初に、フィルムまたはクラストは主に１つの生物を含み、その後に、その組成が異なる生物に変化したことを示す場合、これはパイオニアから日和見アダプターへの移行を示すことができ、殺生物剤レジメンは、この状況に適切に対処するように改変することができる。同様に、初期フィルム形成物はシステムに１つのメカニズムから到達し、適応フィルム形成物は、別のメカニズムから到達する傾向がある場合、何の種類の生物が存在するかを適正に同定することは、微生物の汚染のベクター源を同定するのを助ける。

【0041】

少なくとも１つの実施形態では、多様性分析を使用して、最終製品の品質管理レビューに焦点を当てることができる。例えば、いくつかの真菌などのいくつかの生物は、それ自体プロセスを著しく損なう原因ではないが、それらは最終製品または機械要素内に包埋されることになる傾向がある塊を形成し、よって望まれない欠陥、フェルト脱水の低減および機械効率の低減を引き起こす。多様性指数における真菌の濃度の上昇は、欠陥に対する最終製品のとりわけ徹底的な精査が適切であることを示唆する。

【0042】

少なくとも１つの実施形態では、指数の変化の性質は、多様性の変化の速度ほど重要ではない。例えば、時間に伴うある多様性指数は比較的静的な集団多様性を示す傾向があるが、これが突然変化した場合、これは、何か重要なものがシステム内で変化したことを示す。これは、材料インプットが集団変化を刺激する欠陥を有する可能性がある、または機器の一部が損傷を受けたまたは正常に動作しない可能性があることを意味することがあり、これは異なる生物のための新しいニッチを切り開く。その結果、多様性指数分析は、プロセスシステムにおける非生物学的問題を検出するために使用することができる。

【0043】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数の変化を使用して、迫り来る問題を、それが実際に現れる前に検出することができる。前述したように、多様性指数の変化は欠陥材料または損傷を受けたもしくは正常に動作しない機器を示し得る。時として、多様性の変化は、他の望まれない効果（例えば、動作効率の損失または欠陥最終製品）が起こる前に検出することができ、多様性の変化の原因の特定により、潜在的な問題について、その効果が重大な、または費用のかかる様式で現れる前に討論することができる。同様に、多様性の変化はクラスト堆積物またはバイオフィルムまたは別の生物により誘導される問題が起こるであろうことを示し得るが、指数により、問題のある微生物の、その関連する問題を引き起こす前での除去が可能になる。時として、急激な変化は、有害生物のコロニー形成の試みを前にブロックした良性種はもはや強力ではなく、有害生物は今や自由にそのニッチにコロニー形成することができることを示す。

【0044】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数の分析は、分析される領域内の総細胞数は不変のままであるが微生物類の組成が変化する状況で起こる。少なくとも１つの実施形態では、多様性の変化は、総細胞数が増加する、または減少する状況に対応する。

【0045】

少なくとも１つの実施形態では、プロセスシステムの１つ以上の部分はそれらの多様性指数のために定期的にサンプリングされる。サンプルは時間で指数化されてもよく、施設での他の事象、例えば、ある一定の機器の活性化、非活性化、動作状態、生産速度、およびまたは温度、および／または異なる材料、添加物、または化学薬品の使用と相関させてもよい。これにより、生物学的多様性の、施設での品質管理の別の手段としての使用が可能になる。いくつかの他の事象に対応する著しい多様性の変化は、他の事象がプロセスに対しいくつかの予想外のプラスまたはマイナスの影響を有し得ることを示す。

【0046】

少なくとも１つの実施形態では、いくつかの微生物に誘導される効果は汚染の瞬間から特定の期間が経過した後に起こることが知られている。その結果、多様性指数の変化を使用して、生物がその関連する問題を引き起こすのにどれくらいに時間がかかるかを決定することができる。この方法は診断ツール（生物がどのように機能するか見出す）ならびにコスト最適化ツールの両方として使用することができる。コスト最適化は、多様性変化からの、問題がある時間枠で起こるであろうという高度な警告を受理し、高度な警告を使用して、予想外の緊急事態に対する突然の応答として購入する場合よりも、低いコストまたは高いアベイラビリティを有する時に修正法を購入または使用することにより、達成することができる。

【0047】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数を使用して、胞子形成生物を検出することができる。これらの生物が胞子形態にある場合、それらは、ほとんど、あるいは全く代謝活性を有さず、殺生物剤に対し非常に抵抗性である。いったんそれらが胞子状態になると生物を制御するのに大量の殺生物剤が必要となり、胞子の可能性により、完成品が非常に高くなる。酪農家の、および液体パッケージング標準は、胞子が存在する状況では満たされない可能性がある。対照的に、これらの生物が植物状態にある場合、それらは殺生物剤に感受性が高く、制御がずっと容易になる。多様性指数方法による胞子形成生物の検出は、生物的防除プログラムの焦点を、胞子の形成の防止にシフトさせる。

【0048】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数分析の結果を使用して、１つ以上の殺生物剤組成物が商用プロセスシステム内の１つ以上の位置に添加される量、種類、および回数を決定することにより、生物的防除プログラムを増強させる。少なくとも１つの実施形態では、上記および下記実施形態のいずれかおよび全てが商業的システム、例えば産業システム、例えば、限定はされないが、プロセス水系、抄紙プロセス、パルプ化プロセス、食品加工プロセス、化学精製プロセス、木材加工プロセス、水濾過プロセス、水精製プロセス、化学合成プロセス、コーティングプロセス、有機化学を使用するプロセス、およびそれらの任意の組み合わせに適用される。少なくとも１つの実施形態では、多様性指数を使用して、機械堆積物、シート欠陥、完成品、フェルト、などにおいて見出される問題のある微生物類が評価される。方法はサンプル抽出物中の核酸の分析に基づく。

【0049】

少なくとも１つの実施形態では、多様性指数の構成物の同定は、微生物類の有無および量を検出するためのＰＣＲプライマーの使用を含む、ＤＮＡに基づく分析により達成される。米国特許５，９２８，８７５号は、胞子形成細菌の有無を検出するためのＰＣＲプライマーの使用を記載する。少なくとも１つの実施形態では、プライマーは、生物の群の中で高度に保存されるＤＮＡ鎖の一部を標的にする。その結果、ＤＮＡの特定の部分の存在の検出は、特定の生物の存在の決定的証拠となる。ＰＣＲ分析は、その汚染微生物類を正確に同定することが困難なため、フェルトおよび紙シートを分析するのに特に役に立つ。というのも、それらは、従来のプレーティング方法またはＡＴＰ測定に対する生存生物が欠乏しているからである。

【0050】

少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、論文、ランダール サイキらによる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＤＮＡのプライマーにより方向付けされた酵素増幅、サイエンス、ボリューム２３９、ｐｐ．４８７−４９１（１９８８）（Ａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ｂｙ Ｒａｎｄａｌｌ Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２３９， ｐｐ． ４８７−４９１ （１９８８））に記載される１つ以上の方法を使用することを含む。少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、論文、カリー ムリスらによるポリメラーゼ触媒連鎖反応を介するインビトロでのＤＮＡの特異的合成、酵素学における方法、ボリューム１５５、ｐｐ．３３５−３５０（１９８７）（Ａｒｔｉｃｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｂｙ Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５５， ｐｐ． ３３５−３５０ （１９８７））において記載される１つ以上の方法を使用することを含む。

【0051】

少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析は、ジョ ヴァンデソンピール（ＪｏＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ）により前置きされた商品カタログ（Ｔｒａｄｅ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ）ｑＰＣＲガイドで記載されるｑＰＣＲ分析である（２０１２年１月１９日に、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅ−ｂｒｏｗｓｅｒ．ｈｔｍｌからダウンロード）。少なくとも１つの実施形態では、方法は定量的ｑＰＣＲ分析である。少なくとも１つの実施形態では、方法は、定性的ｑＰＣＲ分析である。

【0052】

少なくとも１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列を標的にし、標的配列のコピー数を増加させ、下流分析のための有用な量の核酸を得るための方法である。この方法は、機械フェルト、シート欠陥、機械堆積物、などが挙げられるが、それらに限定されない、様々なサンプル中の微生物類の検出に適用することができる。

【0053】

少なくとも１つの実施形態では、市販のＤＮＡ抽出キットのいずれかを使用して、ＤＮＡがサンプルから抽出されるとすぐに、これはリアルタイムで、ＰＣＲアプローチ、例えば定量的ＰＣＲアプローチを使用して分析することができる。定量的ＰＣＲはＰＣＲと同じ手法を使用するが、これはリアルタイム定量的構成要素を含む。この技術では、プライマーが、生物のアイデンティティまたは特定の遺伝子の機能に基づいて対象となるＤＮＡ配列を標的にするように使用される。蛍光などのいくつかの検出の形態が得られたＤＮＡまたは「ＤＮＡアンプリコン」を検出するために使用され得る。蛍光の変化は、標的ＤＮＡの量に正比例する。予め決められた蛍光閾値に到達するのに必要とされるサイクル数は、特定のＤＮＡ標的に対応する標準と比較される。標準は典型的には、数ｌｏｇに及ぶ濃度で純粋で、量がわかっている標的遺伝子である。サンプル中に存在する標的ＤＮＡのコピー数は、検量線を使用して計算される。コピー数／サンプルがその後、使用されて、細胞数／サンプルが決定される。

【0054】

少なくとも１つの実施形態では、保存的アプローチを使用して、細菌由来のＤＮＡ配列を標的にするプライマーセットを使用して、総細菌が定量される。少なくとも１つの実施形態では、初期バイオフィルム形成細菌、例えば、限定はされないが、メイオテルムス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、シュードキサントモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を標的にするプライマーセットが使用される。少なくとも１つの実施形態では、スフィンゴモナダセア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａ）ファミリーの細菌に属する、適応バイオフィルム形成物を標的にするプライマーセットが使用される。少なくとも１つの実施形態では、適応バイオフィルム形成物は、他のバイオフィルムおよび浮遊性微生物類に比べ、オキシダントに基づく生物的防除プログラムに対し、より高い耐性を示した。少なくとも１つの実施形態では、プライマーが、真菌侵襲と細菌侵襲の間で区別するために使用される。

【0055】

少なくとも１つの実施形態では、方法は、生物学的ドメインレベルで、ＤＮＡ間で区別する工程を含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は、細菌、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）、および真核生物（Ｅｕｋａｒｙｏｔａ）のＤＮＡ間で区別する工程を含む。これらの生物は、著しく異なるＤＮＡを有し、ドメインレベルで生物のＤＮＡを同定することに焦点を合わすプロトコルは、より特定的な決定よりも非常に単純である。フェルトでは、異なるドメイン由来の生物はしばしば最も良好に異なって処理されるので、そのような簡単な形態の同定を使用して、特定の汚染物質を最もよく標的にする特定のレジメンを正確に特定することができる。少なくとも１つの実施形態では、使用される試験は、同じドメインの生物間、または異なる種類の細菌間、または異なる種類の古細菌間、または異なる種類の真核生物間で区別しないであろうものである。

【0056】

少なくとも１つの実施形態では、１を超えるプライマーが、１を超える一意的に認識できるヌクレオチド配列を有する生物を同定するために使用される。少なくとも１つの実施形態では、ＰＣＲ分析が、特定の生物に特有な、またはほぼ特有な酵素と関連するゲノム配列を検出するために使用される。

【0057】

少なくとも１つの実施形態では、方法は、欠陥を検出し、その後、ＰＣＲ分析を使用して、欠陥の多様性指数を適正に分析する工程を含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は、欠陥が、全体として生物学に基づく、全体として非生物学的に化学に基づく、または非生物学的に化学、機械、および生物学に基づく源の組み合わせに起因するかを決定する。少なくとも１つの実施形態では、欠陥は、フェルト上の１つ以上のプラグである。少なくとも１つの実施形態では、欠陥は下記の少なくとも１つ以上を有する紙シートである：穴、その少なくとも一部の周りの変色したハローを有する穴、変色した筋、染み、半透明の染み、およびそれらの任意の組み合わせ。

【0058】

少なくとも１つの実施形態では、閾値レベルは、偽陽性を差引くために使用される手法である。時としてＰＣＲ分析は、存在するが、特定の欠陥の原因とならない微量の生物を検出する。少なくとも１つの実施形態では、方法は、１つ以上の特定の生物に対してわかっている予め決められたレベルよりも低い濃度で検出された任意の生物の存在を差引く工程を含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は１０^４細胞／グラム（の欠陥）より低いレベルで検出された任意の生物の存在を差引く工程を含む。少なくとも１つの実施形態では、方法は１０^４細胞／ｍｌより低いレベルで検出された任意の生物の存在を差引く工程を含む。

【0059】

少なくとも１つの実施形態では、方法は、先行技術の方法により他の形では検出されないであろう微生物を検出することができる。例えば、汚損物が嫌気性または硫酸塩還元生物の侵襲により引き起こされる場合、ＡＴＰ検出などの方法は、生物学的に汚損物源を正確に同定しないであろう、というのも、嫌気性条件下で微生物により生成されるＡＴＰの量は、好気性条件下よりも著しく少ないからである。よって、汚損物源が不正確に同定され、抗生物学的アプローチではなくｎ化学薬品が、問題を解決しようとして使用されるであろう。別の例では、従来のアプローチ、例えばプレーティング、ＡＴＰ検出、などを使用する、フェルト中の化学汚染由来の微生物の区別は、事実上、これらのサンプルは輸送中に乾ききり、全ての生存生物は死滅してしまうという事実のために、不可能である。全ての生命はＤＮＡを含むので、ＤＮＡアプローチの使用は常に正確に、生物学的侵襲を示すであろう。

【0060】

多様性指数はＰＣＲ、例えば限定はされないがｑＰＣＲを、下記細菌などの総生物の検出のために使用することができる；スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種；エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種；バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種；ハリスコメノバクター（Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）種；サプロスピラ（Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａ）種；シュレジェレラ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ）種；レプトトリックス（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ）種；スフェロチルス・ナタンス（Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓｎａｔａｎｓ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）種；サイトファーガ−フラボバクテリウム−バクテロイド（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ−Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）門のメンバー；緑色非硫黄細菌、例えばヘルペトシホン（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）、ディノコッカス−サーマス門のメンバー、例えばメイオテルムス種；カタラーゼ生成細菌、アミラーゼ生成細菌、ウレアーゼ生成細菌、硝化細菌、真菌、など。これらの技術はプライマーおよび標準対を使用し、保存配列に基づく標的生物の検出および定量が可能になる。プライマーは進化を通じて高く保存された微生物ゲノム中の領域を標的にするが、特定の門または属に対するプライマーは、ゲノムのより可変な領域を標的にする。

【0061】

サンプル中に存在する対象となる生物を正確に定量することができると、その生物を、サンプル中の総細菌負荷のパーセンテージとして表すことができるようになる。多様性指数はまた、定量的に、いくつかの標的生物の相対存在量として表すことができる。プロセスの任意の部分に対する多様性指数は、機械またはプロセスがうまく動作している時に測定することができ、よって、ベースラインが作成される。機械またはプロセス性能がよくない時に測定された多様性指数をその後、ベースラインと比較し、微生物の集団における変動を探し、どの細菌群が、プロセスにおける問題の原因であるかを決定することができる。多様性指数はまた、サンプル位置間またはベースラインに対してモニタリングデータを比較するために、シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）多様性指数計算を使用して、比較を容易にするために定量化することができる。したがって、処理戦略および供給点はその後、問題と闘うために変更することができる。

【0062】

ＤＮＡの定量に基づく多様性指数は、プロセス中の生物の生存および多様性を、それらの生存率とは独立して測定する。リボ核酸（ＲＮＡ）、特定的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は生体によってのみ生成される分子であり、標的によって、特定の門または属の細菌に特有であるような特性を有する。以上で列挙される生物に特有のｍＲＮＡ配列を増幅することにより、どの細菌がそれらの生存形態で存在するかを決定することが可能になる。生存生物の正確な検出はその後、プロセス水の処理戦略の効力を評価するためのツールとして使用することができる。これは、多様性指数の生存率指数との比較により達成することができる。

【0063】

この方法はプロセスサンプル中に存在する生菌の量および型を定量するであろう。定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応方法を適用して、メッセンジャーリボソーム核酸（ｍＲＮＡ）を検出することができる。ｍＲＮＡは転写されたＤＮＡであり、これは、リボソームに送られ、翻訳として知られているプロセスにおいて、タンパク質合成のための青写真として機能する。ｍＲＮＡは生細胞によってのみ生成される。生細胞由来のＲＮＡは市販のキットの使用により単離することができる。ｍＲＮＡの検出には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応において余分な工程が必要とされる。逆転写酵素が反応カクテルに添加され、ｍＲＮＡがその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写される。２組のプライマーが、この実験のために必要とされる。第１が特定のｍＲＮＡを標的にし、第２は逆転写酵素反応により生成される得られたｃＤＮＡを増幅するために使用される。

【実施例】

【0064】

前記は下記実施例を参照することにより、よりよく理解することができ、これらの実施例は、説明目的で提示され、本発明の範囲を制限することを意図しない。

【0065】

（実施例１）
コートフリーシート工場は機械へッドボックスの１つ内で持続性の堆積を経験し、これが最終的な製品の欠陥の原因であると考えられた。へッドボックス自体は、化学的堆積物および繊維性増殖物の蓄積に見舞われた。顕微および化学分析により、蓄積内には細菌はほとんど〜全く存在しないことが示された。微生物類が問題の根本原因であると推測された。しかしながら、プロセスサンプルを分析するために使用される従来のモニタリング技術（例えば、標準平板菌数およびＡＴＰレベル）は、微生物活性のレベルの上昇を示さなかった。特定的には結果は１００ＣＦＵ／ｍｌ以下および１００ＲＬＵ（ＡＴＰ）以下を示した。

【0066】

へッドボックスからの堆積物サンプルを、数ヶ月にわたってｑＰＣＲ技術を使用して分析し、多様性指数を示した。へッドボックス堆積の物分析からの最初のｑＰＣＲ結果は、高レベルの微生物負荷、ならびに上昇した密度のパイオニア的およびアダプターバイオフィルム形成物を示した（図１）。処理戦略を、殺生物剤をパルパーおよび損紙サイロの両方に添加することにより増強させた。オキシダントに基づく生物的防除プログラムの送り速度もまた増加させた。１ヶ月後に収集した堆積物の分析では、へッドボックス堆積物の総細菌負荷においてほとんど変化が検出されなかった（図１Ａ）。パイオニア的バイオフィルム形成物の数は１対数減少し、一方、適応バイオフィルム形成物の密度は４対数減少した（図１Ｂおよび１Ｃ）。へッドボックス堆積物の量およびシート欠陥の頻度は不変のままであり続けた。ストックおよびプロセス水系の従来のプレーティングおよびＡＴＰ分析では、ほとんど生物活性が示されなかった。ＡＴＰおよび平板菌数値は、平均して、それぞれ、１００ＲＬＵ未満および１００コロニー形成単位／グラム（ＣＦＵ／ｇ）であった。

【0067】

処理戦略を、損紙サイロおよびパルパーへの未安定化塩素および殺生物剤の添加によりさらに最適化した。最後の組の変更の実行の後、追加のサンプルを収集し、分析した。堆積物の総細菌負荷により、ほぼ１対数の減少が示された（図１Ａ）。最終組の堆積物サンプルにより、初期バイオフィルム形成物の密度においてほぼ２対数の減少が示された（図１Ｂ）。適応バイオフィルム形成物は、ほぼバックグラウンドレベルのままであった（図１Ｃ）。また、微生物の集団の制御が改善したにもかかわらず、欠陥頻度、欠陥の性質、およびへッドボックス堆積は不変のままであった。

【0068】

この工場からのシート欠陥を同じｑＰＣＲに基づくアプローチを使用して分析した。従来のプレーティングおよびＡＴＰ方法を使用して欠陥中の細菌量を決定することはできない。というのも、欠陥中に存在した可能性のある細菌の多くは、乾燥機セクションの高温により死滅させられるからである。化学分析はシート中に存在する細菌について決定的な答えを提供しない。というのも、これはニンヒドリン染色に依存するからである。このアプローチは非特異的であり、偽陽性および偽陰性結果となりがちである。この工場からの穴およびシート欠陥のＤＮＡ分析では、非常に低い細菌密度が検出された（図２、サンプル１−５）。初期および適応バイオフィルム形成物は、この工場から分析したシート欠陥では検出されなかった。よって、細菌粘液はおそらく、この工場では欠陥および品質問題の一因とはならなかった。比較すると、著しい生物学的堆積に見舞われた工場は、ずっと高い微生物負荷を含む欠陥を有した（図２、サンプル６）。さらに、同様の細菌種が堆積物および欠陥において同定された。これらの欠陥のニンヒドリン染色により、陽性反応が得られ、微生物類の存在が示された。別の場合では、シート欠陥において、生物学的欠陥と考えられるのに必要とされる最小密度のわずかに上のレベルで細菌が検出された。しかしながら、ニンヒドリン反応は陰性であり、欠陥は微生物類を含まなかったことが示された（図２、サンプル７）。へッドボックス堆積物の定量的ｑＰＣＲ試験は、処理戦略への各改変後の初期および適応バイオフィルム形成物の両方の低減を証明した。これらの標的生物が大幅に減少し、堆積の量または欠陥頻度の減少はないという事実は、細菌はおそらく、この機械システムにおける欠陥問題の一因ではないことを示す。初期バイオフィルム形成物は、機械表面にコロニー形成し、他の生物型の付着および増殖のための有利な環境を生成する。これらの生物の存在がないと、細菌は良好な増殖培地として機能し得る化学的デブリの堆積後に、機械表面に付着し得る。化学的添加物および繊維はへッドボックスの内側に堆積し、微生物のコロニー形成に好適な微小環境となった可能性がある。シート欠陥の分析により、自然な微生物の存在が明らかになったので、微生物類はへッドボックス内の堆積および製品品質への有害作用の主な源としては除外された。機械性能を改善するための努力は、生物的防除から、システムのより良好な機械制御に焦点が当てられ、改善された動作条件および製品品質が可能になった。

【0069】

（実施例２）
コートフリーシート工場は競合的なオキシダントに基づく生物的防除プログラムを数年間使用した。微生物増殖の制御は十分として認知された；しかしながら、プロセス効率の改善のためにシート破損をさらに低減させる機会があった。プログラムは数段階で実行され、最適化された。プロセスを通して細菌密度は低いままであり、シート破損の低減が実証された。破損の平均数／日は平均、１．２破損／日から０．４２破損／日に減少した。

【0070】

最適化プログラムの実行のおよそ２年後、プロセス条件がより変わりやすくなり、同じレベルの制御を維持するためには、増加した濃度の生物的防除製品が必要となったことが観察された。従来のモニタリングツール、例えば平板菌数およびＡＴＰ測定を使用するシステム検査では、プロセス水系内の細菌密度は低いままであり、へッドボックスおよび損紙システムでは増加は全く、またはほとんど観察されなかったことが示された。しかしながら、工場は穴および欠陥の大激増に見舞われた。従来のモニタリング技術は、生物的防除プログラムの性能において何の変化も示さなかったが、オンライン活性モニタは微生物活性の増加を検出した（図３）。

【0071】

機械堆積物およびシート欠陥のｑＰＣＲ分析を使用する多様性指数分析は全て、パイオニア的および適応バイオフィルム形成物の存在を確認した。欠陥中の総細菌の密度はおよそ１．８×１０^７細胞／グラムであった（図３）。この証拠により、欠陥および品質問題における微生物類の役割が示される。機械は腐蝕性煮沸除去（ｃａｕｓｔｉｃ ｂｏｉｌｏｕｔ）を受け、その後、オンライン活性モニタは、微生物活性の減少を証明し、より安定なＯＲＰ値により改善されたプログラム性能および回復力が示された。シート欠陥中の微生物類の量は煮沸除去後、１０^７から１０^５細胞／ｇまで減少した（図３）。これにより、ｑＰＣＲは、従来の技術を用いても検出できないシート欠陥への微生物の寄与を検出することができることが確認される。加えて、ｑＰＣＲを使用して、最終的な製品に対する生物的防除プログラムの効力を評価することができる。

【0072】

（実施例３）
機械上堆積物およびシート欠陥として現れた、性能問題を経験している２つの製紙工場からのフェルトサンプルを、ｑＰＣＲを使用して分析した。各サンプルを微生物類の存在に対して試験した。各サンプルが大量の細菌を含むことが決定されるとすぐに、その後、サンプルを適応および初期バイオフィルム形成物の存在に対して分析した。これらは、機械効率および製品品質の問題の一因であることが知られている、スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）ｆｍ．、メイオテルムス、ゲオテルムス（Ｇｅｏｔｈｅｒｍｕｓ）、およびシュードキサントモナスを含んだ。どちらの工場も正常レベルの適応バイオフィルム形成物を含んだが、しかしながら、工場１は、工場２の２倍も多くの初期バイオフィルム形成物を有した（図４）。適応バイオフィルム形成物のレベルは、そのレベルが、問題の一因である可能性が低いことを示す範囲内にあったので、正常と決定した。多様性指数は、工場２でのパイオニアバイオフィルム形成物のレベルはほぼバックグラウンドレベルにあったことを示した。工場２での高レベルのパイオニアバイオフィルム形成物は、フェルト内でのバイオフィルム形成（これはフェルト閉塞およびシートからの水の除去の低減に至らしめる）を示唆した。フェルト上のバイオフィルムの存在は他の物質の堆積の増加に至らしめる可能性があり、これはその後、シート上に再堆積し得る。工場１でのパイオニアバイオフィルム形成物の上昇したレベルは、プロセスの他の部分、例えばシャワー水、添加物、収納チェスト、などの追加の分析が、これらの生物が発生している場所を決定するために必要であることを示唆した。

【0073】

これらの実施例の結果により、従来のプレーティング技術およびオキシダント残留物は、十分な殺生物剤投与および微生物増殖の制御を示し得るが、堆積、欠陥および破損が高頻度に見られるままであることが証明される。ＰＣＲおよびｑＰＣＲ法を含む多様性指数の利用は産業用水系における微生物増殖およびバイオフィルム形成に関するより正確な情報を提供する。これらの戦略により、堆積物形成に対する微生物類の寄与の迅速分析が可能になり、これらを使用して、微生物類を含む堆積物が欠陥の一因であるかどうかを迅速に決定することができる。

【0074】

ｑＰＣＲに基づく多様性指数により、微生物類の品質問題への寄与を決定するシート欠陥の迅速分析が可能になる。この新しいアプローチは、機械効率および製品品質の改善につながる問題のより積極的な診断を可能にすることが証明された。

【0075】

この発明は多くの異なる形態で具体化され得るが、本明細書では、発明の特定の好ましい実施形態が詳細に記載される。本開示は発明の原理の例示であり、発明を例示した特定の実施形態に限定することを意図しない。全ての特許、特許出願、科学論文、および本明細書で言及される任意の他の参照材料は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、発明は本明細書で記載されるおよび／または本明細書に組み込まれる様々な実施形態のいくつかまたは全ての任意の可能な組み合わせを包含する。加えて、発明は、本明細書で記載されるおよび／または本明細書に組み込まれる様々な実施形態のいずれか１つまたはいくつかを特定的に排除する任意の可能な組み合わせを包含する。

【0076】

上記開示は、例示であり、包括的ではないことが意図される。この記載は、当業者に多くの変更および代替物を示唆するであろう。これらの代替物および変更は全て、特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図され、ここで、「含む」という用語は、「包含するが、限定はされない」ことを意味する。当業者は、本明細書で記載される特定の実施形態の他の等価物を認識することができ、その等価物もまた、特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0077】

本明細書で開示される全ての範囲およびパラメータはそれらの中に含められるいずれかのおよび全てのサブレンジ、ならびに終点間の全ての数を含むことが理解される。例えば、「１から１０」の言明された範囲は、１の最小値と１０の最大値の間（これを含む）のいずれかのおよび全てのサブレンジを含むと考えるべきであり；すなわち、１以上の最小値で始まり（例えば１から６．１）、１０以下の最大値で終わる（例えば２．３から９．４、３から８、４から７）全てのサブレンジ、および最後に、範囲内に含まれる各数１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０である。

【0078】

これで、発明の好ましいおよび他の実施形態の説明は完了する。当業者であれば、本明細書で記載される特定の実施形態の他の等価物を認識することができ、それらの等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】