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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6229864
(24)【登録日】2017年10月27日
(45)【発行日】2017年11月15日
(54)【発明の名称】界面活性剤により改良したエタノール発酵法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/06 20060101AFI20171106BHJP
【ＦＩ】
C12P7/06
【請求項の数】17
【全頁数】15
(21)【出願番号】特願2016-541768(P2016-541768)
(86)(22)【出願日】2014年4月14日
(65)【公表番号】特表2017-501717(P2017-501717A)
(43)【公表日】2017年1月19日
(86)【国際出願番号】CN2014000398
(87)【国際公開番号】WO2015035734
(87)【国際公開日】20150319
【審査請求日】2016年5月26日
(31)【優先権主張番号】201310416058.X
(32)【優先日】2013年9月12日
(33)【優先権主張国】CN
(31)【優先権主張番号】201310660369.0
(32)【優先日】2013年12月9日
(33)【優先権主張国】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】503190796
【氏名又は名称】中国科学院大▲連▼化学物理研究所
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＬＩＡＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＰＨＹＳＩＣＳ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】張宗超
(72)【発明者】
【氏名】劉秀梅
【審査官】
安居 拓哉
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２０１１／０１７１７０７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
W.G.Lee，Biotechnology Letters，１９９６年，Vol.18, No.3，pp.299-304
【文献】
Vu,T.K.L.，Internationl Food Research Journal，２０１０年，Vol.17，pp.117-126
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｐ ７／００−７／６６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
発酵可能な糖質を炭素源とし、界面活性剤−水混合物を発酵媒体とし、ｐＨ調整剤を添加して発酵媒体のｐＨ値を調整し、出芽酵母細胞を接種して超高濃度エタノール発酵を行うことを特徴とする、界面活性剤により改良したエタノール発酵法であって、前記界面活性剤が非イオン系界面活性剤のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、ジメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＰＥＧ）、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）のうち少なくとも１種またはその任意の比率の組合せであり、
ＰＥＧの構造式が
ＭＰＥＧの構造式が
ＤＭＰＥＧの構造式が
ＰＤＭＳの構造式が
（式中、ｎは１〜２５、Ｍはアルキル基）であることを特徴とする、エタノール発酵法。
ＰＥＧの構造式が
【化1】
ＭＰＥＧの構造式が
【化2】
ＤＭＰＥＧの構造式が
【化3】
ＰＤＭＳの構造式が
【化4】
（式中、ｎは１〜２５、Ｍはアルキル基）であることを特徴とする、エタノール発酵法。
【請求項2】
グルコースを前記炭素源とし、グルコースの濃度が２７０〜５００ｇ／Ｌであり、前記界面活性剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ＰＥＧ−水混合物におけるＰＥＧと水の質量比は、１：１９〜４：１６である、請求項１に記載のエタノール発酵法。
【請求項3】
前記ＰＥＧがＰＥＧ−２００、４００、６００、８００、１０００のうちの少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項4】
前記ＰＥＧがＰＥＧ−２００、４００、６００のうちの少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項5】
前記出芽酵母細胞の濃度が１０７〜１０９／Ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項6】
酵母細胞を回収、再利用することができ、発酵液を冷却遠心することにより、酵母細胞を回収し、次の発酵過程に直接用いることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項7】
界面活性剤およびｐＨ調整剤を回収、再利用することができ、冷却遠心して酵母を除去し、上清を蒸留後、残余物を新鮮な界面活性剤の代わりに次の発酵過程に用いることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項8】
酵母細胞および界面活性剤を同時に回収、再利用することができ、冷却遠心により酵母細胞を回収し、上清を蒸留後、界面活性剤を回収し、両者を次の回の発酵過程で同時に用いることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項9】
前記発酵温度が２８〜４４℃であることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項10】
前記発酵温度が３３℃であることを特徴とする、請求項９に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項11】
前記発酵時間が１２〜１２０時間であることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項12】
前記発酵時間が６０時間であることを特徴とする、請求項１１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項13】
前記発酵媒体のｐＨが３．０〜６．５であることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項14】
前記発酵媒体のｐＨ調整剤が硫酸溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液のうちの１種であることを特徴とする、請求項１に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項15】
前記酵母細胞の回収、再利用が、標準的な遠心技術を応用して発酵液を冷却遠心し、遠心速度が４０００〜１５０００ｒｐｍ、遠心時間が１〜３０分間であることを特徴とする、請求項６に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項16】
界面活性剤の回収、再利用が、発酵終了後、冷却遠心して酵母細胞を除去し、標準的な真空蒸留技術により界面活性剤およびｐＨ調整剤を回収し、次の発酵過程で発酵可能な糖質、脱イオン水、回収した界面活性剤およびｐＨ調整剤を直接添加することができ、新たに発酵媒体のｐＨ値を調整する必要がないことを特徴とする、請求項７に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【請求項17】
界面活性剤およびｐＨ調整剤の回収過程が、標準的な真空蒸留技術を応用し、０ＭＰａ〜０．０９ＭＰａの圧力下で、蒸留温度が４０℃〜１００℃、蒸留時間が２０分間〜１２０分間であることを特徴とする、請求項７に記載の界面活性剤により改良したエタノール発酵法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はエタノールを生産する発酵工程の分野に関し、特にＶＨＧ発酵条件下において、界面活性剤により改良したエタノール発酵法である。
【背景技術】
【0002】
世界経済の迅速な発展に伴い、人々の化石資源に対する依存の程度は次第に増加している。化石資源の高強度の採掘および消費、大量のＣＯ２など有害ガスの排出［Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、１８（２〜３）：１３１〜１４１］は、深刻な環境汚染を引き起こし、人類社会の生存および発展に影響を及ぼしている。近年、エネルギーが日々不足し、さらに温室効果ガスの環境への排出が増加することによる、地球の温度上昇の危機を緩和するために、人々は相次いでクリーンな「グリーン」代替可能エネルギーの開発に取り組んでいる。バイオマスエタノールは、新しい再生可能エネルギーとしてクリーン、再生可能などの特徴を有する。自動車排出ガス中の一酸化炭素および炭化水素の排出を低下させることができる特徴は、上記エネルギーの危機を効果的に緩和する主要な対策の１つでもある。
【0003】
バイオエタノールの生産は主に、微生物の発酵によって、各種バイオマスを燃料アルコールに転化させる。生産コストの低下は、バイオマスエタノールの生産、特にセルロースエタノール生産の経済的効果を高め、より幅広く応用するための重要な要素である。生産コストを効果的に節約するため、現在では主に発酵時間の改善、酵母を繰り返し利用する効率の向上、終点のエタノール濃度の上昇に取り組んでいる。ＫｗａｎｇＨｏ Ｌｅｅら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０２、２０１１：８１９１〜８１９８）は、アルギン酸カルシウムを担体として酵母を固定化する方法を報告している。遊離の細胞と比較して、固定化酵母はより高いエタノール収率を得ることができ、なおかつ発酵時間を効果的に１０時間短縮する。米国特許第２０１１０２０１０９３Ａ１号は、発酵媒体に炭酸塩を添加すると、エタノール収率を上昇させ、発酵時間を減少させることができることを報告している。米国特許第２０１００１４３９９３Ａ１号および国際公開２０１０／０６５５９５Ａ２号は、イオン液体を抽出溶媒として使用し、発酵系からエタノールをｉｎ ｓｉｔｕ連続抽出して、酵母活性を保証することを報告している。
【0004】
超高濃度（ＶＨＧ）発酵は、エタノール発酵の経済的指数を上昇させることができる技術であり、超高濃度エタノール発酵は以下の利点を有する。（１）機器単位の生産率および利用率が上昇する、（２）水の消費量が減少する、（３）単位体積あたりのもろみ中のエタノールが増加し、蒸解、発酵、蒸留およびＤＤＧＳの濃縮乾燥過程におけるエネルギー消費が低下する、（４）雑菌の成長を抑制する。しかし、超高濃度エタノール発酵は、出発糖濃度の明らかな上昇により、いくつかの問題ももたらされる。一つは高い糖濃度の作用下で、酵母細胞が高い浸透圧を受け、成長および生存率が低下し、発酵時間が延長し、発酵が不完全になる。もう一つは、酵母細胞が高濃度エタノールによる強い生成物阻害を受け、栄養が不足し、発酵の進行も阻害される。（Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ３９、２０１２：４８〜５２）および（Ｅｎｅｒｇｉｅｓ ２０１２、５、３１７８〜３１９７）は、超高濃度エタノール発酵（ＶＨＧ）条件下で、異なる種類の窒素源を添加し、終点のエタノール濃度を改善することを検討している。
【0005】
本発明は界面活性剤により改良したエタノール発酵法を示しており、高活性の出芽酵母を使用し、グルコースを原料とする。発酵培地中に、非イオン系界面活性剤を添加してアルコール阻害を減少させ、高い糖濃度による浸透圧を低下させ、出芽酵母細胞の特殊環境下における生存率および成長速度を高める。最終的に終点のエタノール濃度が上昇し、発酵過程における水の消費と、精留過程のエネルギー消費とが効果的に低下した。なおかつ酵母および界面活性剤を発酵混合物から分離し、次の回の発酵過程で再利用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】米国特許第２０１１０２０１０９３Ａ１号
【特許文献2】米国特許第２０１００１４３９９３Ａ１号
【特許文献3】国際公開２０１０／０６５５９５Ａ２号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、１８（２〜３）：１３１〜１４１
【非特許文献2】ＫｗａｎｇＨｏ Ｌｅｅら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０２、２０１１：８１９１〜８１９８
【非特許文献3】Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ３９、２０１２：４８〜５２
【非特許文献4】Ｅｎｅｒｇｉｅｓ ２０１２、５、３１７８〜３１９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、界面活性剤により改良したエタノール発酵法を提供することであり、超高濃度（ＶＨＧ）発酵によるエタノール生産過程に関し、特に界面活性剤により改良した超高濃度エタノール発酵に関する。発酵媒体に界面活性剤を添加することにより、終点のエタノール濃度を改善する。周知のように、バイオマスエタノールは主に発酵法により生産され、発酵媒体は糖質および糖質源、出芽酵母を含み、発酵媒体の出発ｐＨは３．５〜５．３、発酵温度は２５℃から４０℃である。本発明は、発酵媒体に非イオン系界面活性剤を添加して、エタノール濃度および酵母細胞の生存能力を改善することを示しており、エタノール濃度は界面活性剤を添加しない場合の１１０ｇ／Ｌから、界面活性剤添加後の１５０ｇ／Ｌまで増加させることができる。
【0009】
本発明は界面活性剤により改良したエタノール発酵法を提供する。発酵可能な糖質を炭素源とし、界面活性剤−水混合物を発酵媒体とする。ｐＨ調整剤を添加して発酵媒体のｐＨ値を調整し、出芽酵母細胞を接種して、超高濃度エタノール発酵を行う。
【0010】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、前記発酵可能な糖質はグルコースであり、発酵可能な糖質の濃度は２７０〜５００ｇ／Ｌである。
【0011】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、前記発酵媒体中の界面活性剤と水との質量比は０．００１〜０．５（好ましくは０．１２５〜０．３７５）である。
【0012】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、一実施案に、（ａ）出芽酵母を含む発酵媒体と、（ｂ）発酵媒体中に非イオン系界面活性剤のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、ジメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＰＥＧ）、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）のうち少なくとも１種を含み、界面活性剤の添加により、ＶＨＧ発酵条件下で酵母細胞の寿命および終点のエタノール濃度を増加させることができることと、（ｃ）酵母細胞を発酵混合物から回収、再利用することができることと、（ｄ）界面活性剤およびｐＨ調整剤を同時に回収、再利用することができること、とを含む。
【0013】
ＰＥＧはＰＥＧ−２００、４００、６００、８００、１０００のうち少なくとも１種である。ＰＥＧの構造式が
【0014】
【化1】
【0015】
【化2】
【0016】
【化3】
【0017】
【化4】
【0018】
本発明によれば、発酵過程または少なくとも１つの部分的発酵過程は、発酵媒体のＨ２Ｏおよび界面活性剤、発酵生成物のエタノール、発酵材料の糖質および出芽酵母を含む。一実施案において、発酵温度は一般的に２８℃から４４℃、特に３０℃から３８℃（最も好ましくは３３℃）が選択され、ｐＨは一般的に３．０から６．５、最も好ましくはｐＨ４．０から５．０の範囲が選択される。酵母細胞の濃度は１０７〜１０９／Ｌ、発酵時間は１２〜１２０時間（好ましくは６０時間）である。
【0019】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、前記発酵媒体のｐＨ調整剤は硫酸溶液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液のうちの１種である。
【0020】
ＶＨＧ発酵過程において、酵母細胞の高濃度グルコースの浸透圧に対する耐性および高濃度エタノールに対する耐性は、考慮するべき重要な要素である。本発明において、発酵媒体に非イオン系界面活性剤を添加し、エタノール濃度を効果的に高めることができる。我々は、このような現象が、直接または間接的に界面活性剤を細胞保護剤とし、酵母細胞の生存能力が改善されることにより、エタノール濃度が高くなった可能性があるためと推測する。
【0021】
使用する界面活性剤は非イオン系界面活性剤である。例えば、非イオン系界面活性剤のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特にＰＥＧ−２００、ＰＥＧ−４００およびＰＥＧ−６００である。界面活性剤と水との質量比は０から２／３であり、界面活性剤および水の混合発酵媒体はエタノール濃度を増加させることができ、本発明で示す観点と一致する。界面活性剤と水との質量比を１／５から２／３、１／５から１／４で混合し、調製した発酵媒体も、エタノール濃度を増加させることができる。
【0022】
本発明で示すエタノールを生産する発酵槽は、エタノールを生産する微生物（例えば酵母）、発酵炭素源（例えば糖質、単糖、多糖など）、ｐＨ調整剤（例えばＨ２ＳＯ４、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸塩緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム）を含む。発酵基質の濃度は２７５ｇ／Ｌから５００ｇ／Ｌであり、発酵基質は発酵可能な糖質で構成され、グルコース、セルロースおよびデンプンが特に炭素源として適している。
【0023】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、酵母細胞を回収、再利用することができる。発酵液を冷却遠心することにより、酵母細胞を回収し、次の発酵過程に直接用いる。前記酵母細胞の回収、再利用は、標準的な遠心技術を応用して発酵液を冷却遠心する。遠心速度は４０００〜１５０００ｒｐｍ、遠心時間は１〜３０分間である。
【0024】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、界面活性剤およびｐＨ調整剤を回収、再利用することができる。冷却遠心して酵母を除去し、上清を蒸留後、残余物を新鮮な界面活性剤の代わりに次の発酵過程に用いる。前記界面活性剤およびｐＨ調整剤の回収過程は、標準的な真空蒸留技術を応用し、０ＭＰａ〜０．０９ＭＰａの圧力下で、蒸留温度は４０℃〜１００℃、蒸留時間は２０分間〜１２０分間である。
【0025】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、酵母細胞および界面活性剤を同時に回収、再利用することができる。冷却遠心により酵母細胞を回収し、上清を蒸留後、界面活性剤を回収し、両者を次の回の発酵過程に同時に用いる。
【0026】
本発明で提供する界面活性剤により改良したエタノール発酵法において、界面活性剤の回収、再利用は、発酵終了後、冷却遠心して酵母細胞を除去し、標準的な真空蒸留技術により、界面活性剤およびｐＨ調整剤を回収する。次の発酵過程で発酵可能な糖質、脱イオン水、回収した界面活性剤およびｐＨ調整剤を直接添加することができ、新たに発酵媒体のｐＨを調整する必要はない。
【0027】
界面活性剤は蒸気圧が低いだけでなく、調整可能な水溶性を有し、構造および分子量の選択により、その物理的性質に対する細かい制御を実現することができる。この一連の特性により、界面活性剤が多くの微生物に対して幅広い生物適合性を有することが決まり、なおかつ遠心、蒸留などの技術により、これを発酵混合物から分離することができる。本発明で示す酵母細胞回収の１つの過程において、酵母細胞は遠心分離により、界面活性剤および水の発酵混合物から回収、再利用することができ、具体的なプロセスの工程は、図１に示す通りである。
【0028】
一実施案において、本発明は界面活性剤の回収過程を示している。すなわち、発酵終了後、界面活性剤は発酵混合物から標準的な蒸留技術により回収、再利用することができ、界面活性剤は複数回繰り返し利用することができる。具体的なプロセスの工程は、図２に示す通りである。
【0029】
材料および発酵分析過程【0030】
発酵終了後、生成物の試料を脱イオン水で希釈する。発酵液中の各成分の含量測定には、高速液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）を採用し、グルコースの投入量に基づいて、その転化率、エタノール収率を計算し、発酵液中のエタノールの質量、活性化水およびｐＨ液の体積に基づいて、エタノール濃度を計算する。クロマトグラフの条件は、イオン交換カラム、カラム温度６５℃、示差屈折率検出器、検出器５０℃、移動相５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、サンプル注入量２５μＬである。グルコース転化率＝（グルコース投入量（ｍｏｌ）−グルコース残余量（ｍｏｌ））／グルコース投入量（ｍｏｌ）×１００％
エタノール収率＝実際のエタノール生成量（ｍｏｌ）／２＊グルコース投入量（ｍｏｌ）×１００％
エタノール濃度（ｇ／Ｌ）＝実際のエタノール生成量（ｇ）／Ｈ２Ｏ（Ｌ）
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0032】
以下、具体的実施例を組み合わせて、本発明についてさらに詳しく述べるが、本発明の保護範囲は実施例に制限されない。当業者が上記本発明の内容に基づいて、本発明に対していくつかの本質的でない改良および調整を行った場合も、これらは本発明の保護範囲に属する。
【0033】
実施例１〜９ ＰＥＧ−２００と水との比率がエタノール発酵効率に与える影響まず、出芽酵母を０．４ｇ秤取して１００ｍＬの三角フラスコに入れ、３８℃の条件下で４ｍＬの超純水を用いて２０分間再水和、活性化すると、酒母として使用することができる。その後、グルコース６．０ｇ、ＰＥＧ−２００（表１の用量による）（１〜８ｇ）、予め調製したｐＨ＝３．４のＨ２ＳＯ４溶液（表１の用量による）を添加し、ラップで密封し、振とう機により３６℃の条件下で４８時間振とう培養する。振とう機の回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎである。表１のデータから、発酵系にＰＥＧ−２００を添加しなかったとき（実施例１）、グルコース転化率は９６％、エタノール収率は８１％、エタノール濃度は１１２ｇ・Ｌ−１であり、１．０ｇのＰＥＧ−２００をｐＨ液の代わりに使用すると、グルコース転化率が９９％まで、エタノール収率が８８％まで、エタノール濃度が１２９ｇ・Ｌ−１まで上昇し、ＰＥＧ−２００量の増加に伴って、グルコース転化率、エタノール収率および濃度は、いずれもまず上昇してから低下する傾向を示すことがわかる。これらの結果は、ＰＥＧを一定比率の範囲内で水の代わりに発酵媒体とすることができ、発酵終点の生成物であるエタノール濃度が上昇し、発酵終点で残存するグルコース含量が減少し、水の消費が減少し、生産コストが低下し、発酵効率が上昇することを予備的に説明している。
【0034】
表１．ＰＥＧ−２００と水との比率がエタノール発酵効率に与える影響【表1】
【0035】
実施例１０〜１７ ＰＥＧ−４００と水との比率がエタノール発酵効率に与える影響酵母を０．４ｇ秤取して１００ｍＬの三角フラスコに入れ、３８℃の条件下で４ｍＬの超純水を用いて２０分間再水和、活性化すると、酒母として使用することができる。その後、グルコース６．０ｇ、ＰＥＧ−４００（表２の用量による）（１〜８ｇ）、予め調製したｐＨ＝３．４のＨ２ＳＯ４溶液（表２の用量による）を添加し、ラップで密封し、振とう機により３６℃の条件下で４８時間振とう培養する。振とう機の回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎである。表２のデータから、４．０ｇのＰＥＧ−４００をｐＨ液の代わりに使用すると、エタノール濃度が１５０ｇ／Ｌ−１に達することができ、なおかつ発酵系にほとんど糖が残らないことがわかる。これらの結果は、ＰＥＧを一定比率の範囲内で水の代わりに発酵媒体とすることができ、発酵終点の生成物であるエタノール濃度が上昇し、発酵終点で残存するグルコース含量が減少し、水の消費が減少し、生産コストが低下し、発酵効率が上昇することをさらに証明している。
【0036】
表２．ＰＥＧ−４００と水との比率がエタノール発酵効率に与える影響【表2】
【0037】
実施例１８〜２５ ＰＥＧ−６００と水との比率がエタノール発酵効率に与える影響酵母を０．４ｇ秤取して１００ｍＬの三角フラスコに入れ、３８℃の条件下で４ｍＬの超純水を用いて２０分間再水和、活性化すると、酒母として使用することができる。その後、グルコース６．０ｇ、ＰＥＧ−６００（表３の用量による）（１〜８ｇ）、予め調製したｐＨ＝３．４のＨ２ＳＯ４溶液（表３の用量による）を添加し、ラップで密封し、振とう機により３６℃の条件下で４８時間振とう培養する。振とう機の回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎである。表３のデータから、ＰＥＧ−６００をｐＨ液の代わりに使用すると、エタノール濃度がＰＥＧ−６００量の増加に伴って次第に上昇してから低下し、最高でエタノール濃度は１５３ｇ／Ｌ−１に達することができることがわかる。これらの結果は、ＰＥＧを一定比率の範囲内で水の代わりに発酵媒体とすることができ、発酵終点の生成物であるエタノール濃度が上昇し、発酵終点で残存するグルコース含量が減少し、水の消費が減少し、生産コストが低下し、発酵効率が上昇することを充分に証明している。
【0038】
表３．ＰＥＧ−６００とｐＨ液との比率がエタノール発酵効率に与える影響【表3】
【0039】
実施例２６ 発酵温度の影響酵母を０．５ｇ秤取して１００ｍＬの三角フラスコに入れ、３８℃の条件下で４ｍＬの超純水を用いて２０分間再水和、活性化すると、酒母として使用することができる。その後グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、ｐＨ＝３．４のＨ２ＳＯ４溶液を１２ｍＬ添加して、ラップで密封し、振とう機により３２℃〜４２℃の条件下で１２〜７２時間振とう培養する。振とう機の回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎである。図３、図４、図５から、温度が異なると、発酵過程でグルコース転化率、エタノール収率および濃度に比較的大きな差があり、発酵温度が３５℃を超えると、温度の上昇に伴って、終点のエタノール濃度が低下するが、温度が３０℃まで低下すると、終点のエタノール濃度も低下することがわかる。最も好ましい発酵温度として、３３℃を選択するべきである。発酵終点のエタノール濃度は最高で１６０ｇ・Ｌ−１に達することができ、なおかつ発酵系にグルコースは残らない。
【0040】
実施例２７ 発酵ｐＨの影響酵母を０．５ｇ秤取して１００ｍＬの三角フラスコに入れ、３７℃の条件下で４ｍＬの超純水を用いて２０分間再水和、活性化すると、酒母として使用することができる。その後グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、ｐＨ＝３．４〜５．１のＨ２ＳＯ４溶液を１２ｍＬ添加し、ラップで密封し、振とう機により３５℃の条件下で１２〜７２時間振とう培養する。振とう機の回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎである。ｐＨ値は酵母細胞の透過性に影響を及ぼし、さらには酵母細胞の栄養物質吸収およびエタノール排出に影響を及ぼすため、適したｐＨの発酵に対する影響は極めて重要である。図６、図７、図８から、発酵液のｐＨ値が４．３〜５．１の範囲内のとき、６０時間で発酵の終点に達することができ、終点のエタノール濃度は最高で１６０ｇ・Ｌ−１に達することができ、なおかつグルコースの発酵が完全であることがわかる。
【0041】
実施例２８ 純水中で４８時間発酵後の酵母の繰り返し再利用酵母粉末０．５ｇを２５〜３８℃の条件下、４ｍＬの超純水を用いて１５〜３０分間再水和し、その後グルコースを６．５ｇ、予め調製したｐＨ値４．３の硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、振とう機により振とうし、３３℃の条件下で４８時間発酵させる。発酵終了後、８０００ｒｐｍで５分間冷却遠心分離し、発酵終了後の発酵液から清澄液を除去し、固体の酵母粉末を残す。再度超純水を４ｍＬ、グルコースを６．５ｇ、硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、３３℃で４８〜７２時間発酵させ、このように２回繰り返す。グルコース転化率、エタノール収率および濃度は、それぞれ図９、図１０、図１１に示す通りである。図のデータから、発酵系に界面活性剤を添加しなかったとき、酵母の回収効率は低く、４８時間発酵後、酵母を回収して繰り返し再利用した場合、１回目の再利用で６０ｇ・Ｌ−１のエタノール濃度しか得ることができないことがわかる。
【0042】
実施例２９ 界面活性剤−水混合系中で４８時間発酵後の酵母の繰り返し再利用酵母粉末０．５ｇを２５〜３８℃の条件下、４ｍＬの超純水を用いて１５〜３０分間再水和し、その後グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、予め調製したｐＨ値４．３の硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、振とう機により振とうし、３３℃の条件下で４８時間発酵させる。発酵終了後、８０００ｒｐｍで５分間冷却遠心分離し、発酵終了後の発酵液から清澄液を除去し、固体の酵母粉末を残す。再度超純水を４ｍＬ、グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、３３℃で４８時間発酵させ、このように３回繰り返す。グルコース転化率、エタノール収率および濃度は、それぞれ図１２、図１３、図１４に示す通りである。図のデータから、発酵系にＰＥＧ−４００を添加すると、酵母の回収効率は高く、４８時間発酵後、酵母を回収して繰り返し再利用した場合、１回目の再利用で１１８ｇ・Ｌ−１のエタノール濃度を得ることができることがわかる。
【0043】
実施例３０ 界面活性剤−水混合系中で３６〜７２時間発酵後の酵母の繰り返し再利用酵母粉末０．５ｇを２５〜３８℃の条件下、４ｍＬの超純水を用いて１５〜３０分間再水和し、その後グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、予め調製したｐＨ値４．３の硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、振とう機により振とうし、３３℃の条件下で３６〜７２時間発酵させる。発酵終了後、８０００ｒｐｍで５分間冷却遠心分離し、発酵終了後の発酵液から清澄液を除去し、固体の酵母粉末を残す。再度超純水を４ｍＬ、グルコースを６．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、３３℃で４８時間発酵させ、このように３回繰り返す。グルコース転化率、エタノール収率および濃度は、それぞれ図１５、図１６、図１７に示す通りである。図のデータから、発酵系にＰＥＧ−４００を添加すると、酵母の回収効率は高く、４８時間発酵後、酵母を回収して繰り返し再利用した場合、１回目の再利用で１１８ｇ・Ｌ−１のエタノール濃度を得ることができることがわかる。
【0044】
実施例３１ 界面活性剤の回収、再利用酵母粉末０．５ｇを２５〜３８℃の条件下、４ｍＬの超純水を用いて１５〜３０分間再水和し、その後グルコースを７．５ｇ、ＰＥＧ−４００を４．０ｇ、予め調製したｐＨ値４．３の硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、振とう機により振とうし、３３℃の条件下で７２時間発酵させる。発酵終了後、８０００ｒｐｍで５分間冷却遠心分離して、固体の酵母粉末を除去し、上清を蒸留して、蒸留後の残余物を次の発酵過程に用いる。再度、酵母粉末０．５ｇを２５〜３８℃の条件下、４ｍＬの超純水を用いて１５〜３０分間再水和したもの、グルコースを６．５ｇ、硫酸溶液を１２ｍＬ添加し、３３℃で７２時間発酵させ、このように４回繰り返す。グルコース転化率、エタノール収率および濃度は図１８に示す通りである。界面活性剤のＰＥＧ−４００は繰り返し再利用することができ、発酵効率に対して明らかな影響を及ぼさない。