特許 6231490 イヌにおける肝臓の銅蓄積についての遺伝子検査

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6231490

(24)【登録日】2017年10月27日

(45)【発行日】2017年11月15日

(54)【発明の名称】イヌにおける肝臓の銅蓄積についての遺伝子検査

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20171106BHJP

   G06F 19/22 20110101ALI20171106BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20171106BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 ZZNA

   G06F19/22

   !C12N15/00 A

【請求項の数】29

【全頁数】105

(21)【出願番号】特願2014-545354(P2014-545354)

(86)(22)【出願日】2012年12月6日

(65)【公表番号】特表2015-502152(P2015-502152A)

(43)【公表日】2015年1月22日

(86)【国際出願番号】GB2012053038

(87)【国際公開番号】WO2013083988

(87)【国際公開日】20130613

【審査請求日】2015年12月1日

(31)【優先権主張番号】1120989.7

(32)【優先日】2011年12月6日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】390037914

【氏名又は名称】マース インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＡＲＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】マーティン，アラン ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】ジョンズ，ポール グリン

(72)【発明者】

【氏名】ワトソン，エイドリアン

(72)【発明者】

【氏名】ロシューゼン，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】フィーテン，ヒル

(72)【発明者】

【氏名】リーグウォーター，ピーター アントニウス ジョゼフ

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０３８０３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１１６１３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５０１６５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０３３７３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１２４２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 CORONADO V A ET AL，Polymorphisms in canine ATP7B: Candidate modifier of copper toxicosis in the Bedlington terrier，THE VETERINARY JOURNAL，２００８年，vol. 177, no. 2，293 - 296

【文献】 Zhi-Ying Wu et al，J. Mol. Med.，84(2006)，p.438-442

【文献】 Wijmenga C. et al.，Proceedings of the Nutrition Society，63(2004)，p.31-39

【文献】 Stuehler B. et al.，J. Mol. Med.，82(2004)，p.629-634

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イヌを検査して肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、
Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（（配列番号１４４の位置１０１）、ここで、Ａ対立遺伝子の存在は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す）、
Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａ（ここで、Ｇ対立遺伝子の存在は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す）、および
染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート（前記リピートの少なくとも３つのコピーの存在は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。

【請求項2】

試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）、および／または
（ｂ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）、および／または
（ｃ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

１つまたは複数の多型が、一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）およびａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）から選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａ、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）、または
（ｂ）ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）およびＣｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）
の有無を検出することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、請求項１に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）データを、請求項１に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することと
を含む方法。

【請求項8】

コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに請求項７に記載のすべてのステップを実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。

【請求項9】

請求項８に記載のコンピュータプログラムと、
請求項１に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと
を含むコンピュータ記憶媒体。

【請求項10】

請求項７に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、請求項１に定義されている多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）請求項１に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。

【請求項11】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、請求項１に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。

【請求項12】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための、請求項１に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の使用。

【請求項13】

肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・請求項１から７および１１のいずれか一項に記載の方法に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定すること、
を含む方法。

【請求項14】

イヌが、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項１から７、１１もしくは１３のいずれか一項に記載の方法または請求項１２に記載の使用。

【請求項15】

イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａの多型の有無を検出することを含み、Ａ対立遺伝子の存在は、肝臓の銅蓄積からの保護を示す、方法。

【請求項16】

試料中のイヌのゲノムにおける、ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）の多型の有無を検出することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

試料中のイヌのゲノムにおける、ＣｈｒＸ＿６３３９７３９３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２；配列番号１４３）の多型の有無を検出することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａ、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、および／または
（ｂ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７２３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）およびａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）から選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

試料中のイヌのゲノムにおける、
Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａ、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）の有無を検出することを含む、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、請求項１５に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）データを、請求項１５に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定することと
を含む方法。

【請求項23】

コンピュータシステムにおいて実行される際に、コンピュータシステムに請求項２２に記載の全ステップを実施するよう指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。

【請求項24】

請求項２３に記載のコンピュータプログラムと、
請求項１５に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと
を含むコンピュータ記憶媒体。

【請求項25】

請求項２２に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、請求項１５に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）前記多型およびそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。

【請求項26】

イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４におけるＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置するＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａの多型の有無を検出することを含み、Ａ対立遺伝子の存在は、肝臓の銅蓄積からの保護を示す、方法。

【請求項27】

イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための、請求項１５に定義されている多型の使用。

【請求項28】

肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出するためのイヌを選択する方法であって、
− 請求項１５から２２および２６のいずれか一項に記載の方法に従って、第１のイヌ候補のゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定し、これによって第１のイヌ候補が、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫の作出に適しているか決定すること
を含む方法。

【請求項29】

イヌが、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、請求項１５から２２、２６もしくは２８のいずれか一項に記載の方法または請求項２７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患に対するイヌの感受性、またはイヌが肝臓の銅蓄積および銅関連肝疾患から保護されている可能性を決定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

銅は、体内における多数の代謝過程に重要な微量ミネラルであり、それ自体が、食餌の不可欠な一部である。銅は、腸を通して吸収されると、骨髄、筋肉および脾臓等、他の組織に見出すこともできるが、主に肝臓に貯蔵される。肝臓は、銅を貯蔵すると共に、それぞれセルロプラスミンおよび胆汁酸塩による銅の輸送および排泄の協調において中心的役割を果たす。一般に、銅の欠乏は、その毒性よりも共通の課題である。しかし、毒性が生じると、影響を受ける動物にとって重大な意味合いを持ち得る。

【0003】

肝疾患はイヌには普通見られないが、その最も普通の形態の１つは慢性肝炎（ＣＨ）である。ＣＨは組織学的診断により、線維症、炎症、ならびに肝細胞アポトーシスおよび壊死の存在を特徴とする。肝硬変は、疾患の最終段階として生じ得る。ＣＨの原因の１つは、肝臓の銅蓄積である。

【0004】

肝臓の銅蓄積は、銅取込みの増大、肝臓の銅代謝における原発性の代謝欠陥、または銅の胆汁排泄の変化の結果として生じ得る。後者の場合、これがどの程度までイヌで生じるか明らかではないが、銅毒性は肝臓の炎症、線維症および胆汁鬱滞に続発する。続発性の銅蓄積症において、銅蓄積は主として門脈周囲の実質に限定され、肝銅濃度は家族性の蓄積症における蓄積よりも低い。誘発因子（単数または複数）および感作抗原の性質は知られていないが、原発性の胆汁性肝硬変において観察される免疫学的異常および形態学的特徴は、免疫介在性の機序と同時に発生する。

【0005】

小腸は、哺乳類における食餌性の銅吸収の主要部位として認識されている。腸管腔から腸管粘膜への輸送は、飽和輸送成分に関与する担体介在性の過程である。粘膜細胞に入れば、新たに吸収された銅の約８０％はサイトゾルに存在し、主としてメタロチオネイン（ＭＴ）と結合する。これは、金属のホメオスタシス、貯蔵、輸送および解毒等、多くの機能を備える低分子量の誘導タンパク質である。腸細胞を通過した後、銅は門脈循環へと進み、そこで担体タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸と結合して肝臓へと輸送され、より少量が腎臓へと進む。多くの哺乳類において銅は容易に排泄され、銅排泄の主要経路は胆汁である。

【0006】

過剰な肝臓の銅蓄積を有するイヌは、強力な銅キレート化剤であるＤ−ペニシラミンを用いて通常は治療される。しかし最終的には、ＣＨのイヌに適用できる最も有効な治療法は肝移植である。

【0007】

肝臓の銅蓄積の遺伝的な根拠は未知である。これは、銅は多くの異なった生物学的経路に関与しており、その各々には非常に複雑で多数の遺伝子が関与しているという事実により難しくなっている。

【0008】

国際公開第２００９／０４４１５２（Ａ２）号パンフレットは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、（ａ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すイヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａまたはＵＢＬ５遺伝子における多型、および／または（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することと、これにより肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することとを含む方法を開示する。

【0009】

国際公開第２０１０／０３８０３２（Ａ１）号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１１６１３７（Ａ１）号パンフレットは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法に用いるためのさらに別の多型を開示する。これらは、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法において用いるための多型も開示する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、イヌのゲノムにおいて、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するいくつもの多型を発見した。本発明者らは、イヌのゲノムにおいて、肝臓の銅蓄積からの保護と関連する多型も発見した。これらの多型の発見は、多型をスクリーニングすることによる、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはそれからイヌが保護されている可能性を予見する検査のための基盤を提供する。検査の予見力は、定義された多型のうち１つまたは複数の検出結果の組合せに関与するモデルを用いて拡大され得る。肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型の検出結果と、イヌにおける肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型の検出結果を組み合わせた遺伝子検査は、イヌが肝臓の銅蓄積の危険性を有する可能性に関して特に情報価値があるであろう。

【0011】

イヌの肝臓における銅の蓄積は、高い肝臓銅に起因し得る肝臓の１つまたは複数の疾患または状態に至り得る。例えば、高い肝臓銅は、慢性肝炎、肝硬変および最終的には肝不全に至り得る。したがって、本発明により、高銅と関連するこのような肝疾患または状態の発症の危険性があるまたはそれらから保護されていないイヌを同定することができる。肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性が確認されたら、あるいはイヌが、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の突然変異を持たないことが確認されたら、低銅食材（例えば、国際公開第２００９／０４４１５２（Ａ２）号パンフレットに開示されている食材）を投与すること等によって、低レベルまたは正常レベルの肝臓銅レベルを維持するための、このイヌに適した予防措置を同定することが可能である。さらに、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連する突然変異を持たないと確認された、あるいは肝臓の銅蓄積からの保護と関連する突然変異を有すると確認されたイヌは、肝疾患または他の高銅と関連する状態に罹患する可能性が低いイヌの作出を目標とする繁殖プログラムに理想的である。

【課題を解決するための手段】

【0012】

したがって、本発明は、イヌを検査して肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。

【0013】

本発明は、
・本明細書に定義されている１つまたは複数の多型およびそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
・肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）該データを、本明細書に定義されている１つまたは複数の多型およびそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することと
を含む方法と、
・コンピュータシステムにおいて実行される際に、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するよう指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムと、
・本発明のコンピュータプログラムおよび本発明のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体と、
・本発明の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）本明細書に定義されている１つまたは複数の多型およびそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステムと、
・肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、本明細書に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法と、
・肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための、本明細書に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の使用と、
・肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出するためのイヌを選択する方法であって、
・本発明の方法に従って、第１のイヌ候補のゲノムが、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むか決定し、これによって、第１のイヌ候補が、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫の作出に適しているか決定することと、
・場合により、本発明の方法に従って、第１のイヌとは異なる性別の第２のイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むか決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出することと
を含む方法
も提供する。

【0014】

本発明者らは、肝臓の銅蓄積からのイヌの保護と関連する多型を発見した。したがって、本発明は、イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。

【0015】

本発明は、
・本明細書に定義されている１つまたは複数の多型およびそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）該データを、本明細書に定義されている１つまたは複数の多型およびそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定することと
を含む方法と、
・コンピュータシステムにおいて実行される際に、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するよう指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムと、
・本発明に係るコンピュータプログラムおよび本発明に係るデータベースを含むコンピュータ記憶媒体と、
・本発明の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける本明細書に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）前記多型およびそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステムと、
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法と、
・イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための、本明細書に定義されている多型の使用と、
・肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出するためのイヌを選択する方法であって、
・本発明の方法に従って、第１のイヌ候補のゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定し、これによって第１のイヌ候補が、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫の作出に適しているか決定することと、
・場合により、第１のイヌとは異なる性別の第２のイヌのゲノムが、本発明に係る肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出することと
を含む方法
も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型によるラブラドールレトリーバーにおける平均銅レベル（表９のデータ）を図示する図である。ｙ軸は乾燥重量による肝臓銅（ｍｇ／ｋｇ）である。ｘ軸はＡＴＰ７Ａ遺伝子型である：左から右へ、最初の３つのバーは試験した雌イヌについてであり、最後の２つのバーは試験した雄イヌについてである。誤差バーは標準誤差である。

【図2】ラブラドールレトリーバーにおける性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型による組織学的銅スコア（表９のデータ）のボックスプロットを示す図である。ｙ軸は銅組織学的スコアの値である。ｘ軸はＡＴＰ７Ａ遺伝子型であり：左から右へ、最初の３つは試験した雌イヌについてであり、最後の２つは試験した雄イヌについてである。クラスカル・ワリスｐ−値は０．０００３９６である。

【図3】ＡＴＰ７Ｂにおける可変的な長さのコードリピートを示す図である。上部：塩基およびその相当するアミノ酸（ＡＡ）。囲んだＣの染色体位置は、３１３５２８７である。下部：Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＮＣＢＩ、ならびにビーグルおよびラブラドール群の配列決定は、異なる数のＣＧＣＣＣＣリピートを明らかにする。結果として、囲んだアミノ酸アラニン（Ａ）およびプロリン（Ｐ）は、より多くまたは少なく産生される。配列番号２３６、２３７および２３８は、それぞれ２、３および４個のリピートを含有するポリヌクレオチド配列である。

【図4】重金属関連ドメイン３および４の間のＡＴＰ７Ｂ ＣＧＣＣＣＣリピートの位置を示す図である。

【図5】ＡＴＰ７Ｂ ４１４５Ｇ＞Ａ ＳＮＰ（Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４）を示す図である。最も右寄りの垂線は、突然変異のおおよそのポジションを示す。Ｇ＞Ａ置換は、グルタミンアミノ酸（ＡＡ）を生じる。

【図6】ｃｈｒ２２の最初の１５ＭｂにおけるＬＤ構造を示す図である。三角形の頂点における矢印は、コード突然変異の位置を示す。矢印の指し示す線は、この区域における数個のＳＮＰを有するコード突然変異の高ＬＤを表す。

【図7】定量的肝臓銅レベルにおける危険性対立遺伝子の数の効果を示す図である。ｘ軸は、危険性対立遺伝子の数であり、ｙ軸は、ｍｇ／ｋｇで表す肝臓銅である。水平線は、４００ｍｇ／ｋｇの正常肝臓銅レベルを示す。

【図8】組織学的銅スコアの段階的モデリングを示す図である。Ｘ１〜Ｘ１７は、表２１における因子である。

【図9】対数（log）定量的銅スコアの段階的モデリングを示す図である。Ｘ１〜Ｘ１７は、表２１における因子である。

【図10】本発明を実施するように構成されている機能的構成要素の模式的な実施形態を図解する図である。

【0017】

配列の簡単な説明
配列番号１〜５は、実施例２における３領域モデルに用いるＳＮＰを網羅するポリヌクレオチド配列を示し、これらは表４にも示されている。

【0018】

配列番号６〜１４１は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性の決定に用いることもできるさらなるＳＮＰを網羅するポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列は、表５および表６にも示されている。

【0019】

配列番号１４２は、肝臓の銅蓄積からのイヌの保護と関連するＡＴＰ７Ａコード領域ＳＮＰのポリヌクレオチド配列である（ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３）。この配列は、表８にも示されている。

【0020】

配列番号１４３は、ＳＮＰ ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３と連鎖不平衡にあるＳＮＰ（ＣｈｒＸ＿６３３９７３９３ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２）のポリヌクレオチド配列である。この配列は、表８にも示されている。

【0021】

配列番号１４４〜１５８は、本発明のＳＮＰを網羅するポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列は、表１８にも示されている。

【0022】

配列番号１５９〜２２６は、表１８におけるＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを網羅するポリヌクレオチド配列を示す。これらの配列は、表２０にも示されている。

【0023】

配列番号２２７〜２３５は、プライマー配列である。

【0024】

配列番号２３６、２３７および２３８は、ゲノム位置２２：３１３５２８７におけるリピート配列に関してそれぞれ２、３または４個のＣＧＣＣＣＣリピートを含有するポリヌクレオチドである。これらの配列は、表１２にも示されている。

【発明を実施するための形態】

【0025】

肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護の確認
肝臓における銅の蓄積は、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマン・ピンシェル、ジャーマンシェパード、キースハウンド、コッカースパニエル、ウェストハイランド・ホワイトテリア、ベッドリントンテリア、およびスカイテリアを含む多数のイヌの血統における肝疾患をもたらす。任意の血統の正常イヌの肝臓における平均銅濃度は、乾燥重量を基準にして２００〜４００ｍｇ／ｋｇであるが、新生児のイヌは一般にそれより高い肝臓銅濃度を有する。イヌの肝臓における銅の量は、生検によって測定することができる。

【0026】

肝臓の銅蓄積に対して感受性であるイヌは、銅を蓄積する傾向を有し、その結果その肝臓銅濃度は、乾燥重量を基準にして４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルに達する。肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を本発明により決定することは、イヌが４００ｍｇ／ｋｇ、例えば６００ｍｇ／ｋｇを超え、８００ｍｇ／ｋｇを超え、１０００ｍｇ／ｋｇを超え、１５００ｍｇ／ｋｇを超え、２０００ｍｇ／ｋｇを超え、５０００ｍｇ／ｋｇを超え、または１００００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルにまで肝臓銅を蓄積する危険性または可能性を決定することを含む。

【0027】

肝臓の銅蓄積から保護されるイヌは、肝臓銅を蓄積する危険性または可能性が低く、その結果その肝臓銅濃度が乾燥重量を基準にして４００ｍｇ／ｋｇを超えるに至る可能性は低い。肝臓の銅蓄積から保護されるイヌの肝臓銅濃度は、６００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば５００ｍｇ／ｋｇ未満、４００ｍｇ／ｋｇ未満、または３００ｍｇ／ｋｇ未満であろう。イヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性を本発明により決定することは、イヌが肝臓銅を６００ｍｇ／ｋｇ未満、例えば５００ｍｇ／ｋｇ未満、４００ｍｇ／ｋｇ未満、または３００ｍｇ／ｋｇ未満のレベルにまで蓄積する可能性を決定することを含む。

【0028】

肝臓銅の蓄積は、組織化学によって評価することができる。例えば、肝銅濃度は、以前に記載された通り、銅の分布を評価するためのルベアン酸染色技法を用いた組織化学によって半定量的に評価することができる（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈら、（１９８８）Ｖｅｔ Ｑ１０：８４〜８９）。濃度は、次の通り０から５のスケールに段階付けすることができる。０＝銅の存在なし、１＝いくつかの銅陽性顆粒を含む孤立性肝細胞および／または細網組織球（reticulohistiocytic）（ＲＨＳ）細胞、２＝少数〜中程度の数の銅陽性顆粒を含む小集団の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、３＝中程度の数の銅陽性顆粒を含む大集団または広範囲の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、４＝多数の銅陽性顆粒を有する広範囲の肝細胞および／またはＲＨＳ細胞、ならびに５＝多数の銅陽性顆粒を有する肝細胞および／またはＲＨＳ細胞が分散して存在する。この段階付けシステムによると、２を超える銅スコアは異常である。

【0029】

したがって、本発明によりイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定することは、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈらに記載されている段階付けシステムを用いて、イヌが３未満またはそれに等しい、例えば２．５、２、１．５未満またはそれに等しい、あるいは１未満またはそれに等しいスコアを付与される可能性の決定に関与し得る。肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を本発明により決定することは、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｉｎｇｈらに記載されている段階付けシステムを用いて、イヌが２を超えるまたはそれに等しい、例えば２．５、３、３．５を超えるまたはそれに等しい、あるいは４を超えるまたはそれに等しいスコアを付与される危険性または可能性の決定に関与し得る。

【0030】

保護の可能性または感受性は、例えば危険性因子、パーセンテージまたは確率として表すことができる。イヌが銅を上述のレベルまで蓄積するであろうか否か決定することもできる。例えば、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはイヌがそれから保護されている可能性を決定する方法は、イヌが銅を４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルまで蓄積するであろうか否か決定することを含むことができる。

【0031】

肝臓銅の４００ｍｇ／ｋｇを超えるレベルまでの蓄積は、肝疾患を伴い、最終的に肝不全に至り得る。したがって、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかを決定することは、イヌが慢性肝炎、肝硬変および肝不全等、肝臓の銅蓄積に起因し得る疾患または状態を発症する可能性が低いことを示す。反対に、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかを決定することは、このような疾患または状態に対するイヌの感受性を示す。したがって、本発明は、慢性肝炎、肝硬変および肝不全などの肝臓の銅蓄積と関連する疾患に対するイヌの感受性またはそれからの保護の可能性を検査する方法を提供する。

【0032】

銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護の多型および徴候
本発明者らは、イヌのゲノムにおいて、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連する多数の多型を発見した。したがって、本発明は、これらのゲノム位置における１つまたは複数の多型マーカーを用いた、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法に関する。

【0033】

したがって、本発明は、イヌを検査して肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。

【0034】

本発明者らは、イヌのゲノムにおいて、肝臓の銅蓄積からの保護と関連する多型も発見した。したがって、本発明は、これらのゲノム位置における１つまたは複数の多型マーカーを用いた、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法に関する。

【0035】

したがって、本発明は、イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法も提供する。

【0036】

「多型の有無を検出すること」という語句は、典型的には、多型がイヌのゲノム中に存在するかどうかを決定することを意味する。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライトまたはリピート多型、挿入多型および欠失多型を含む。好ましくは、多型はＳＮＰである。ＳＮＰの有無を検出することは、ＳＮＰの遺伝子型を同定することまたはイヌのゲノムに存在するヌクレオチド（単数または複数）をＳＮＰについてタイピングすることを意味する。典型的には、両方の相同性の染色体上の同じ位置に存在するヌクレオチドが決定されるであろう。即ち、一方または両方の対立遺伝子が遺伝子型決定され、一方または両方の対立遺伝子の同一性が、この遺伝子型決定に基づき決定される。イヌは、ＳＮＰの第１の対立遺伝子に関してホモ接合型であり、第２の対立遺伝子に関してヘテロ接合型またはホモ接合型であると決定され得る。多型が、マイクロサテライトまたはリピート配列である場合、方法は典型的には、リピート数の決定に関与するであろう。

【0037】

疾患または病態に対する個体の感受性またはそれからの個体の保護などの個体の表現型を決定することは、疾患または病態の原因となる多型の検出に限定されない。遺伝子マッピングの試験においては、個体の試料中の一連のマーカー遺伝子座における遺伝子変化が、所与の表現型との関連について検査される。そのような関連が特定のマーカー遺伝子座と表現型との間で見出されれば、それは、そのマーカー遺伝子座における変化が関心のある表現型に影響するか、またはそのマーカー遺伝子座における変化は遺伝子型が決定されていない、真の表現型に関係した遺伝子座と連鎖不平衡にあるかのいずれかであることを示唆する。互いに連鎖不平衡にある多型の群の場合には、特定の個体におけるすべてのそのような多型の存在の知識は一般的には余剰な情報を提供する。したがって、イヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積または銅関連肝疾患に対する感受性またはそれからの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するとき、多型のそのような群のただ１つの多型だけを検出することが必要である。

【0038】

連鎖不平衡の結果として、機能的感受性／保護的多型ではないが、機能的多型と連鎖不平衡にある多型は、機能的多型の存在を示すマーカーとして作用し得る。本発明の多型と連鎖不平衡にある多型は、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示す。

【0039】

したがって、本明細書において定義した多型の位置の任意の１つは、直接的に、換言すれば、その位置に存在するヌクレオチドを決定することにより、または間接的に、例えば前記多型の位置と連鎖不平衡にある他の多型の位置に存在するヌクレオチドを決定することにより、タイピングすることができる。

【0040】

連鎖不平衡は、集団中の異なった遺伝子座における対立遺伝子の非ランダムの配偶子関連性である。ランダムな組合せにより独立に遺伝されるのではなく一緒に遺伝される傾向を有する多型は、連鎖不平衡にある。２つの多型が一緒の頻度が、２つの多型の個々の頻度の積であれば、多型は互いにランダムに組み合わされまたは独立に遺伝される。例えば、異なった多型部位における２つの多型が集団中の染色体の５０％に存在する場合に、２つの対立遺伝子が集団中の染色体の２５％に一緒に存在すれば、そのとき、それらはランダムに組み合わされていると言われる。より高いパーセンテージは２つの対立遺伝子が連関していることを意味するであろう。２つの多型の頻度が、集団中で個々に、同時に２つの多型の頻度の積より大きければ、第１の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることになる。集団中において、２つの多型が一緒の頻度が、１０％を超え、例えば３０％を超え、５０％を超え、または７０％を超え、２つの多型の個々の頻度の積を超えるならば、第１の多型は第２の多型と連鎖不平衡にあることになる。

【0041】

研究は、連鎖不平衡がイヌには大量にあることを示した（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｂｒｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、 Ｓｕｔｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：２３８８〜２３９６）。連鎖不平衡にある多型は、物理的に近接していることが多く、それは、それらが共遺伝されるからである。本明細書において言及した多型と連鎖不平衡にある多型は、同じ染色体上に位置する。イヌで連鎖不平衡にある多型は、典型的には５ｍｂ以内、好ましくは２ｍｂ以内、１ｍｂ以内、７００ｋｂ以内、６００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、１０ｋｂ以内、５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、５００ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内または１０ｂｐ以内の多型である。

【0042】

本明細書において定義した多型の位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある多型を、日常的技法を使用して同定することは、当業者の能力の内であろう。可能性のある多型が選択されれば、当業者は、この多型とどの多型の型または対立遺伝子とが、本明細書において定義した多型のどれと有意に相関しているかを、容易に決定することができる。

【0043】

より詳細には、多型が本明細書において定義した多型のどの１つと連鎖不平衡にあるかどうかを決定するために、当業者は、イヌのパネルで、候補の多型および１つまたは複数の本明細書において定義した多型の遺伝子型を決定すべきである。パネルのサイズは、統計的に有意な結果を達成するのに十分であるべきである。典型的には、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、または少なくとも２００頭の、異なったイヌからの試料が遺伝子型を決定されるべきである。パネル中のイヌは任意の血統であってよいが、典型的には同じかまたは類似の遺伝的血統背景を有するであろう。イヌのパネルで多型が遺伝子型を決定されれば、多型の１つまたは複数の対の間の連鎖不平衡は、多数の容易に入手できる統計用パッケージのいずれか１つを使用して測定することができる。フリーソフトウェアパッケージの例は、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ（Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ：ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＤ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍａｐｓ、Ｂａｒｒｅｔｔら、２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１（２）：２６３〜２６５）であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗでダウンロードできる。用いることのできるソフトウェアの別の一例は、ＰＬＩＮＫ（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）である。

【0044】

連鎖不平衡の尺度はＤ’である。Ｄ’の０．５〜１の範囲は、多型の対が連鎖不平衡にあることを示し、１は最も有意の連鎖不平衡を示す。したがって、候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とについて、Ｄ’が、０．５〜１、好ましくは０．６〜１、０．７〜１、０．８〜１、０．８５〜１、０．９〜１、０．９５〜１または最も好ましくは１であることがわかれば、候補の多型は、本明細書において定義した多型を予測するということができ、それ故、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示すであろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあるにある多型は、６８０ｋｂ以内でありかつ本明細書において定義した多型と同じ染色体上にあり、多型の対間の連鎖不平衡の計算された尺度Ｄ’は、０．９以上である。

【0045】

連鎖不平衡の他の尺度はＲの２乗であり、ここで、Ｒは補正係数である。「決定係数」としても知られるＲの２乗は、第１の多型の遺伝子型における分散の第２の多型の遺伝子型に占める分率である。したがって、候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とに対して０．５というＲの２乗は、候補の多型が特異的多型における分散の５０％を占めることを意味するであろう。Ｒの２乗はＨａｐｌｏｖｉｅｗなどの標準的統計用パッケージから出せる。典型的には、０．２５以上のＲの２乗（Ｒ＞０．５または＜−０．５）は大きい相関と見なされる。したがって候補の多型と特定の本明細書において定義した多型とについて、Ｒの２乗が０．５以上、好ましくは０．７５以上、０．８以上、０．８５以上、０．９以上または０．９５以上であると見出されれば、候補の多型は本明細書において定義した多型を予測するということができ、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護を示すであろう。本発明の好ましい方法において、本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあるにある多型は、６８０ｋｂ以内でかつ本明細書において定義した多型と同じ染色体上にあり、多型の対の間の連鎖不平衡の計算された尺度、Ｒの２乗は０．５以上である。

【0046】

本発明の多型とＬＤにある多型のハプロタイプを構築することも可能である。１つまたは複数の多型は、本発明の多型と個別にはほんの弱いＬＤにある場合であっても、組み合わせて用いれば強いＬＤになり得る。例えば、ある１個の多型は、０．２５を下回るＲの２乗（R-squared）値を有し得る。しかし、個々に０．２５を下回るＲの２乗を有する２個以上の突然変異は、組み合わせると、０．５を上回るＲの２乗を有し得る。したがって、これらの多型は、組み合わせて用いて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはそれからイヌを保護する可能性を決定することができる。

【0047】

したがって、本発明の方法は、本明細書に定義されている多型と連鎖不平衡にある２個以上の多型の有無を検出することを含むことができ、前記２個以上の多型それぞれのＲの２乗は個々に、０．２５以下となり得るが、前記２個以上の多型の組合せのＲの２乗は、０．５以上である。

【0048】

多型が本明細書において定義した多型と連鎖不平衡にあり、したがって相関していると確認されれば、当業者は、どの型の多型、すなわちどの対立遺伝子が、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護と関連するかを容易に決定することができる。これは、イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析し、イヌを肝臓の銅蓄積のレベルに関して分類することにより達成することができる。次に、イヌのパネルは、関心のある多型について遺伝子型を決定される。次に、遺伝子型は、遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を決定し、それによりどの対立遺伝子が肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護と関連するかどうかを決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる。

【0049】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示すことが判明した本発明の多型は、表１７および１８に同定されている。特に、これらは：Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）である。

【0050】

加えて、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子におけるマイクロサテライトリピートは、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連することが判明した。これは、ゲノム位置３１３５２８７において開始する第２２染色体におけるＣＧＣＣＣＣリピートである（２２：３１３５２８７）。リピート配列は、図３において図解されている（配列番号２３６〜２３８）。２個（配列番号２３６）、３個（配列番号２３７）、４個（配列番号２３８）および潜在的にはそれ以上の個数のリピートが存在し得る。したがって、本発明の方法は、イヌのゲノムにおけるＣＧＣＣＣＣリピートの数を決定することを含み得る。

【0051】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む。

【0052】

本発明を実施するために、任意の数および任意の組合せの多型を検出することができる。少なくとも２つの多型が検出されることが好ましい。２〜５、３〜８、５〜１０または８〜１５個の多型が検出されることが好ましい。

【0053】

イヌのＤＮＡは、
（ｉ）１つまたは複数の多型（ａ）；
（ｉｉ）１つまたは複数の多型（ｂ）；
（ｉｉｉ）１つまたは複数の多型（ｃ）；
（ｉｖ）１つまたは複数の多型（ａ）および１つまたは複数の多型（ｂ）；
（ｖ）１つまたは複数の多型（ａ）および１つまたは複数の多型（ｃ）；または
（ｖｉ）１つまたは複数の多型（ｂ）および１つまたは複数の多型（ｃ）
のそれぞれの位置でタイピングすることができる。

【0054】

好ましくは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）；または
（ｂ）ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）およびＣｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）
の有無を検出することを含む。

【0055】

高銅と関連する突然変異の対立遺伝子を表１８に提示する。よって、本発明の肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）のＡ対立遺伝子、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）のＡ対立遺伝子、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）のＣ対立遺伝子、Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）のＣ対立遺伝子、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８のＴ対立遺伝子、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）のＡ対立遺伝子、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）のＧ対立遺伝子、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）のＡ対立遺伝子、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）のＣ対立遺伝子、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）のＴ対立遺伝子、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）のＧ対立遺伝子、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）のＡ対立遺伝子、Ｃｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）のＡ対立遺伝子、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）のＴ対立遺伝子および／またはＣｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）のＧ対立遺伝子の有無を決定し、これによってイヌのゲノムが銅蓄積に対する感受性を示す多型を有するか決定することを含み得る。

【0056】

染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピートの追加のコピー毎に、銅蓄積の危険性を増加させることが判明した。よって、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピートの数を決定することを含み得る。２個以上のリピート、例えば、３または４個のリピートの存在は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す。

【0057】

本発明の好ましい方法において、多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型は、ＳＮＰである。連鎖不平衡にあることの結果として、この多型は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すであろう。多型（ａ）と連鎖不平衡にあるＳＮＰの例を表１９に提示し、このＳＮＰの前後の配列を表２０に示す。これらのＳＮＰは、単独で用いて、あるいは１つまたは複数の多型（ａ）および／または（ｃ）と組み合わせて用いて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することができる。したがって、本発明の方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、表１９および表２０における多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含むことができる。

【0058】

本発明者らは、肝臓の銅蓄積からの保護を示す、ＡＴＰ７Ａ遺伝子における多型を以前に発見した。例えば、（ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３；ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；配列番号１４２）。よって、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ｄ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；配列番号１４２）および／または
（ｅ）前記多型（ｄ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含むことができる。

【0059】

Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡ対立遺伝子およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴ対立遺伝子は、低銅または肝臓の銅蓄積からの保護と関連する。逆に、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＧ対立遺伝子およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＣ対立遺伝子は、高銅または肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連する。よって、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法は、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡもしくはＧ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴもしくはＣ対立遺伝子の有無を決定することを含み得る。Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴ対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積から保護される可能性があることを示し、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＧ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＣ対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積に対し感受性が高い可能性があることを示す。

【0060】

肝臓の銅蓄積からの保護と関連することが判明した多型は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法において用いることができる。よって、本発明は、イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法を提供する。

【0061】

本発明を実施するために、任意の数および任意の組合せの多型を検出することができる。好ましくは、少なくとも２個の多型が検出される。好ましくは、２〜５、３〜８、５〜１０または８〜１５個の多型が検出される。

【0062】

したがって、イヌのＤＮＡは、
（ｉ）多型（ａ）および／または
（ｉｉ）１つまたは複数の多型（ｂ）
のそれぞれのポジションにおいて分類することができる。

【0063】

イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、（ｃ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；配列番号１４２）および／または（ｄ）（ｃ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含むことができる。ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；配列番号１４２）と連鎖不平衡にある多型の例は、ＣｈｒＸ＿６３３９７３９３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２；配列番号１４３）である。さらなる例を表１９および表２０に提示する。したがって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、（ｃ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；配列番号１４２）および／または（ｄ）ＣｈｒＸ＿６３３９７３９３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２；配列番号１４３）の有無を検出することをさらに含むことができる。

【0064】

好ましくは、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、
Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）
の有無を検出することを含む。

【0065】

上に示す通り、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡ対立遺伝子およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴ対立遺伝子は、低銅または肝臓の銅蓄積からの保護と関連する。逆に、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＧ対立遺伝子およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＣ対立遺伝子は、高銅または肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連する。よって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡもしくはＧ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴもしくはＣ対立遺伝子の有無を決定することを含むことができる。Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＡ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＴ対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積から保護される可能性があることを示し、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４のＧ対立遺伝子およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３のＣ対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が低いことを示す。

【0066】

本明細書に記載されている高い肝臓銅または肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連することが判明した多型も、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法において用いることができる。高い肝臓銅と関連する対立遺伝子の非存在の決定は、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性の決定に役立つことができる。したがって、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ｅ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｆ）前記多型（ｅ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｇ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含むことができる。

【0067】

本発明者らは、以前、イヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５各遺伝子におけるまたはその領域おける多型が、イヌにおける肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことを発見した（実施例１および２）。したがって、これらの多型は、本発明の多型と組み合わせて用いてイヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であるまたはそれから保護されている危険性または可能性を決定するための、改良された遺伝子検査を提供することができる。したがって肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性およびそれからのイヌの保護を決定する本発明の方法は、（Ｉ）肝臓の銅蓄積に対して感受性を示すイヌのＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡまたはＵＢＬ５の遺伝子における多型および／または（ＩＩ）前記多型（Ｉ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することをさらに含むことができる。本発明の多型に加えて、いかなる個数およびいかなる組合せのこれらの多型が検出されてもよい。好ましくは、少なくとも２個のさらなるこれらの多型が検出される。好ましくは、２〜５個、３〜８個または５〜１０個の多型がさらに検出される。

【0068】

したがって、イヌのＤＮＡは、（ｉ）多型（Ｉ）および／または（ｉｉ）１つまたは複数の多型（ＩＩ）のそれぞれの位置においてさらにタイピングすることができる。さらに、イヌのＤＮＡは、
（ｉ）２個以上の多型（Ｉ）、
（ｉｉ）２個以上の多型（ＩＩ）または
（ｉｉｉ）１つまたは複数の多型（Ｉ）および１つまたは複数の多型（ＩＩ）
のそれぞれの位置においてタイピングすることができる。

【0069】

２つの多型（Ｉ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５遺伝子の別々の１つでもあってよく、またはこれらの遺伝子のただ１つだけであってもよい。３つ以上の多型（Ｉ）、例えば３〜１０個のそのような多型があるとき、多型は、同じ遺伝子中に、２つの遺伝子中にまたは３つのすべての遺伝子中にあってもよい。

【0070】

同様に、２つの多型（ＩＩ）があるとき、各多型は、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡおよびＵＢＬ５遺伝子の別々の１つの中に、またはこれらの遺伝子のただ１つだけの中にある多型と連鎖不平衡にあってよい。３つ以上の、例えば３〜１０個のそのような多型（ＩＩ）があるとき、多型は、同じ遺伝子中の、２つの遺伝子中にまたは３つのすべての遺伝子中にある多型と連鎖不平衡にあってよい。

【0071】

本発明の好ましい方法は、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡまたはＵＢＬ５遺伝子中の少なくとも１つの多型（Ｉ）および前記多型（Ｉ）と連鎖不平衡にある少なくとも１つの多型（ＩＩ）の有無を検出することをさらに含む。

【0072】

本発明の好ましい方法において、感受性を示す多型（Ｉ）および／または（ＩＩ）はＳＮＰである。ＳＮＰは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を示す、ＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ａもしくはＵＢＬ５遺伝子中のまたはその領域中の任意のＳＮＰおよび／またはそれらと連鎖不平衡にあるＳＮＰであってよい。

【0073】

したがって、本発明の方法は、表４、表５および表６において特定されたＳＮＰから選択される、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することをさらに含むことができる。表４および５において、各ＳＮＰは、配列中の位置６１に位置する。第１のおよび第２の対立遺伝子は、各ＳＮＰに対してその遺伝子座（［第１の／第２の］）で提供される。表６には、各ＳＮＰに対する第１のおよび第２の対立遺伝子も示されている。任意の数のＳＮＰが、表４、５および６から任意の組合せで使用することができる。ＳＮＰは異なったタイプの多型と組み合わせることもできる。

【0074】

好ましくは、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法は、表４および表６中のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰ、および／またはそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む。したがって、１つまたは複数のＳＮＰが、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４の位置６１）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５の位置６１）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１の位置１６４）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２の位置９７）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３の位置７０）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４の位置８８）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５の位置１０４）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６の位置１３９）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７の位置１２８）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８の位置９５）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９の位置１０６）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０の位置９５）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１の位置９０）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択されることが好ましい。したがって、これらの１６個のＳＮＰのいずれかまたはこれらの１６個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰはタイピングすることができる。これら１６個のＳＮＰの少なくとも２つまたは連鎖不平衡にあるＳＮＰがタイピングされることが好ましい。

【0075】

より好ましくは、本発明の方法は、表４中のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む。したがって、これらの５個のＳＮＰのいずれかまたはこれらの５個のＳＮＰのいずれかと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰをタイピングすることができる。好ましくは、これらの５個のＳＮＰの少なくとも２個または連鎖不平衡にあるＳＮＰがタイピングされる。より好ましくは、すべての５個の位置がタイピングされる。したがって、タイピングされるヌクレオチド（単数または複数）は、
・配列番号１（ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５、ＳＮＰ１）の位置６１；
・配列番号２（ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５、ＳＮＰ２）の位置６１；
・配列番号３（ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７、ＳＮＰ３）の位置６１；
・配列番号４（ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８、ＳＮＰ４）の位置６１；
・配列番号５（ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２、ＳＮＰ５）の位置６１；または
・これらの位置のいずれか１つと連鎖不平衡にある任意の位置と同等の位置から選択されることが好ましい。好ましくは、該方法は、ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰ（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）の有無を検出することを含む。

【0076】

ＳＮＰ１はＧＯＬＧＡ５遺伝子のイントロンの中に位置する。ＳＮＰ２、３および４はＵＢＬ５遺伝子の領域中に位置する。ＳＮＰ５は、ＡＴＰ７Ａ遺伝子の領域中に位置する。したがって本発明の検出方法は、１つまたは複数のこれらの遺伝子の内部にまたは領域中に（コード領域中にまたはそれ以外に）ある任意のＳＮＰ、または連鎖不平衡にある任意の他のＳＮＰに関する。

【0077】

実施例２は、銅蓄積に対する感受性のＢｏｏｌｅａｎモデルを確立するためのＳＮＰ１〜５の使用を示す。表３は、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を示す。２元値は、イヌが銅蓄積に対する感受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）を有することを示す。例えば、０００は、３種の悪い対立遺伝子のいずれも有しないことを表す。１１１は、３種の悪い対立遺伝子をすべて有することを表す。

【0078】

ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（ＳＮＰ１）のＡ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（ＳＮＰ２）のＧ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（ＳＮＰ３）のＣ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（ＳＮＰ４）のＧ対立遺伝子およびＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（ＳＮＰ５）のＡ対立遺伝子は、本発明者らにより、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すことが決定された。これらの対立遺伝子がホモ接合型のイヌは、肝臓の銅蓄積に対し感受性が高い。したがって、本発明の好ましい方法は、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＡ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（ＳＮＰ２）のＧ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（ＳＮＰ３）のＣ対立遺伝子、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（ＳＮＰ４）のＧ対立遺伝子および／またはＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（ＳＮＰ５）のＡ対立遺伝子の有無を決定し、これによってイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す多型を含むか決定することをさらに含む。より好ましい方法は、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＡＡ遺伝子型、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５のＧＧ遺伝子型、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７のＣＣ遺伝子型、ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８のＧＧ遺伝子型および／またはＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２のＡＡもしくはＡＧ遺伝子型の有無を検出することを含む。

【0079】

したがって、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する好ましい方法は、
（ｉ）ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（ＳＮＰ１）のＡＡ遺伝子型、
（ｉｉ）ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（ＳＮＰ２）のＧＧ遺伝子型、
（ｉｉｉ）ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（ＳＮＰ３）のＣＣ遺伝子型、
（ｉｖ）ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（ＳＮＰ４）のＧＧ遺伝子型および／または
（ｖ）ＳＮＰ ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（ＳＮＰ５）のＡＡもしくはＡＧ遺伝子型
の有無を検出し、これによってイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護および／または肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むか決定することをさらに含む。より好ましい方法は、遺伝子型（ｉ）；遺伝子型（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または遺伝子型（ｖ）の有無を検出することを含む。さらにより好ましい方法は、すべての５つの遺伝子型（ｉ）から（ｖ）のすべての有無を検出することを含む。

【0080】

イヌのゲノム中に存在するヌクレオチド（単数または複数）を、表４、５、６、８、１８および２０のいずれかで特定された位置でタイピングすることは、表４、５、６、８、１８および２０において特定された配列と厳密に対応する配列中のこの位置に存在するヌクレオチドがタイピングされることを意味し得る。しかしながら、表４において特定された配列番号１〜５、表５中の配列番号６〜１３０、表６中の配列番号１３１〜１４１、配列番号１４２および表８中の配列番号１４３、表１８中の配列番号１４４〜１５８および表２０中の配列番号１５９〜２２６において提示された厳密な配列は、検査されるイヌに必ず存在するわけではないことは理解されるであろう。したがって、存在するヌクレオチドのタイピングは、表４、５、６、８、１８および２０において特定された位置において、または該配列中の同等のまたは対応する位置においてであり得る。したがって、ここで使用された同等という用語は、表４、５、６、８、１８および２０において特定された位置においてまたは対応する位置においてを意味する。ＳＮＰの配列およびそれに伴って位置は、例えば、イヌのゲノム中におけるヌクレオチドの欠失または付加のために変化し得る。当業者は、配列番号１〜２２６の各々における関連ある位置に対応するまたは同等の位置を、例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、ＡＬＩＧＮ、ＰＩＬＥＵＰまたはＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用して、決定することができるであろう。ＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、相同性またはラインアップ配列を計算するために使用することができる（例えばそれらの初期設定で使用）ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＣＯＭＰＡＲＥ、ＡＬＩＧＮ、およびＰＩＬＥＵＰを含むプログラムを提供する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムも、通常はその初期設定で、２つの配列を比較またはラインアップするために使用することができる。２つの配列のＢＬＡＳＴ比較を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、下でさらに説明する。配列のアラインメントおよび比較のための同様に公的に入手できるツールは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）で見出すことができ、例えばＡＬＩＧＮおよびＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムがある。

【0081】

多型が肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護を示すかどうかを決定するために使用することができる種々の異なった方法がある。典型的には、候補の多型を多型のデータベースおよび肝臓の銅蓄積に対する感受性または保護とのそれらの関連と比較する。そのようなデータベースは、イヌのパネルを、肝臓の銅蓄積について、例えば肝生検材料により表現型解析することにより発生させて、イヌを銅蓄積のレベルに関して分類する。パネル中のイヌは、多型のパネルに対して遺伝子型も決定する。そのようにして、各遺伝子型と肝臓銅のレベルとの関連を決定することが可能である。したがって、多型が、肝臓銅に対する感受性またはそれからの保護のどちらを示すかを決定することは、データベース中における多型の位置を突き止めることにより達成される。

【0082】

対象の多型の位置が、上記のようにしてデータベース中で突き止められなくても、それでもなお、多型が、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護のどちらを示すかを決定することは可能である。これは、イヌのパネルを肝臓の銅蓄積について表現型解析して、イヌを肝臓の銅蓄積レベルに関して分類することにより達成することができる。次に、イヌのパネルは、関心のある多型について遺伝子型を決定する。次に、遺伝子型は、遺伝子型と肝臓の銅レベルとの関連を決定するために、肝臓銅のレベルと相関づけされる。

【0083】

本発明の１つまたは複数の多型の有無がイヌのゲノム中で検出されると、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかそれに対して感受性であるかがそれにより決定される。各多型は、単独でまたは他の多型との組合せで、イヌの肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性を示す。

【0084】

肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性またはイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するため、本明細書に定義されている多型の１つまたは複数を遺伝子型決定することができる。高銅と関連する１つまたは複数の対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積に対し感受性が高いことを示す。逆に、低銅と関連する１つまたは複数の対立遺伝子の存在は、イヌが、肝臓の銅蓄積から保護される可能性があることを示す。例えば、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定するために、イヌからのＤＮＡ試料を使用して、イヌのゲノム中のＣｈｒ２２＿３１３５１４４でのＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。この機能的変異はＡＴＰ７Ｂ（Ｘ染色体上の）中に位置して、Ａ対立遺伝子保護的である。ＳＮＰの遺伝子型が決定されれば、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されるかどうかを決定することは可能である。Ａ対立遺伝子の存在は肝臓の銅蓄積からの保護を示す。対立遺伝子（ＡＡ）に対してホモ接合性のイヌは、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が最も高い。したがって、本発明の好ましい方法は、イヌのゲノム中におけるＡＴＰ７Ｂ ＳＮＰのＡ対立遺伝子の有無を決定することを含む。該方法は、イヌがＡＴＰ７Ｂ ＳＮＰのＡ対立遺伝子に対してホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であるかを決定することを含むことができる。

【0085】

方法が、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護を示す複数の多型の有無を検査することを含む場合、結果を組み合わせて、イヌが、肝臓の銅蓄積に対し感受性が高いまたは肝臓の銅蓄積から保護される危険性または可能性の総合的な評価をもたらすモデルを用いることができる。実施例６は、複数の多型を用いてモデルを作成することのできる仕方を説明する。好ましくは、段階的モデリング技法が用いられる。モデル作成の単純化された例を実施例２に記載する。表３は、ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７Ａ各遺伝子の領域における５個のＳＮＰの組合せの異なる遺伝子型候補と、高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える肝臓レベル）を有しこれらの遺伝子型を有するイヌのパーセンテージを提示する。この例において、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するために、イヌから得られたＤＮＡ試料を用いてイヌのゲノムにおける５個のＳＮＰを遺伝子型同定することができる。ＳＮＰの遺伝子型が決定されると、これらは実施例２に提供されているキーに基づき、すなわち遺伝子型と高銅との関連の程度に基づき、２進値に変換することができる。次に、表３を用いて、その遺伝子型パターンと高銅を有するイヌのパーセンテージに基づき、２進値を危険性因子へと変換する。

【0086】

イヌは、本発明の方法により、任意の年齢、例えば０〜１２歳、０〜６歳、０〜５歳、０〜４歳、０〜３歳、０〜２歳または０〜１歳で検査することができる。好ましくは、イヌはできるだけ若い年齢で、例えば生後１年、生後６カ月または生後３カ月以内に検査される。イヌは、好ましくは、銅蓄積が起こる前に検査される。イヌの履歴はわかってもわからなくてもよい。例えば、イヌは、知られた両親の子であってもよく、および銅蓄積に関する両親の履歴が知られていてもよい。あるいは、イヌは、親子関係および履歴の知られていない迷子または救助されたイヌであってもよい。

【0087】

本発明の任意の方法により検査されるイヌは、いかなる血統のものでもよい。本発明は、混血または交雑種のイヌ、または雑種のまたは異系交配されたイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定する方法を提供する。

【0088】

本発明の方法において、イヌは、肝臓の銅蓄積に対し感受性が高いと疑われているイヌであり得る。あるいは、イヌは、肝臓の銅蓄積から保護されていると疑われ得る。

【0089】

典型的には、イヌは、ラブラドールレトリーバー（Retriver）、ドーベルマンピンシェル、ジャーマンシェパード、キースホンド、コッカースパニエル、ウェストハイランドホワイトテリア、ベドリントンテリアおよびスカイテリアから選択される血統を遺伝的に継承しているであろう。イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または雑種のもしくは異系交配されたイヌであってよい。イヌは、そのゲノムの少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも１００％が、いずれかの純粋な血統またはより好ましくは、本明細書に記載されている任意の血統から継承されていてよい。イヌは、純粋種であってよい。本発明の一実施形態において、検査されるイヌの一方または両方の親が純粋種のイヌでありまたはあった。他の実施形態において、１頭または複数の祖父母が純粋種のイヌでありまたはあった。検査されるイヌの祖父母の１、２、３または４頭全部が純粋種のイヌであってよく、またはあったとしてもよい。

【0090】

イヌはラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってよい。イヌは、その遺伝的背景においてラブラドールレトリーバーの血統の少なくとも５０％または少なくとも７５％を有していてよい。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。

【0091】

イヌの遺伝的血統背景は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、例えばイヌの飼い主または獣医によりそれが特定の血統を継承すると推定されるという理由で、特定の血統の遺伝的継承について検査する必要がないこともある。これは、例えば、イヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。

【0092】

本発明の予測検査は、イヌの遺伝的血統の背景／継承または１種または複数種の他の疾患に対する感受性の決定などの１つまたは複数の他の予測または診断検査と併せて実施してもよい。

【0093】

多型の検出
本発明による多型の検出は、イヌからの試料中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と多型に対して特異的な結合剤とを接触させて、該結合剤がポリヌクレオチドまたはタンパク質に結合するどうかを決定することを含むことができ、この場合、結合剤の結合は多型の存在を示し、結合剤の結合の欠如は、多型の存在しないことを示す。

【0094】

該方法は、試料がイヌのＤＮＡを含有する場合に、イヌからの試料について、一般にインビトロで実施される。試料は、典型的には、イヌの体液および／または細胞を含み、例えば、口腔スワブなどのスワブを使用して得ることができる。試料は、血液、尿、唾液、皮膚、頬細胞または毛根試料であってよい。試料は、通常、方法が実施される前に処理され、例えばＤＮＡ抽出を実施することができる。試料中のポリヌクレオチドまたはタンパク質は、物理的または化学的のいずれかで、例えば適当な酵素を使用して、切断することができる。一実施形態においては、多型の検出に先立って、試料中のポリヌクレオチドの一部が、例えば、クローニングにより、またはＰＣＲに基づく方法を使用して、コピーされまたは増幅される。

【0095】

本発明において、任意の１つまたは複数の方法は、イヌにおける１つまたは複数の多型の有無を決定することを含むことができる。多型は、典型的には、イヌのポリヌクレオチドまたはタンパク質中における多型の配列の存在を直接決定することにより検出される。そのようなポリヌクレオチドは、典型的には、ゲノムのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。多型は、下記の方法など任意の適当な方法により検出することができる。

【0096】

特異的な結合剤は、優先的なまたは高い親和性をもって多型を有するタンパク質またはポリペプチドに結合するが、他のポリペプチドまたはタンパク質には結合しないかまたは低い親和性でのみ結合する作用剤である。特異的な結合剤は、プローブまたはプライマーであってよい。プローブは、タンパク質（抗体など）またはオリゴヌクレオチドであり得る。プローブは標識することができ、または間接的に標識することが可能であってもよい。プローブのポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する結合は、プローブまたはポリヌクレオチドもしくはタンパク質のいずれかを不動化するために使用することができる。

【0097】

該方法においては一般に、多型は、イヌの多型のポリヌクレオチドまたはタンパク質に対する作用剤の結合を決定することにより検出することができる。しかしながら、一実施形態において、作用剤は、例えば、変異位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することにより、対応する野生型配列に結合することもできるとはいえ、野生型配列に対する結合様式は、多型を含むポリヌクレオチドまたはタンパク質の結合とは検出可能な程度に異なるであろう。

【0098】

該方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブが使用される、オリゴヌクレオチド連結アッセイに基づくことができる。これらのプローブは、多型を含むポリヌクレオチドの隣接する領域に結合し、結合後に適当なリガーゼ酵素により２つのプローブが連結されて一緒になることが可能になる。しかしながら、プローブの一方の中に単一のミスマッチが存在すると、結合および連結が妨げられ得る。したがって連結したプローブは、多型を含むポリヌクレオチドでのみ生じ、したがって連結された生成物の検出は、多型の存在を決定するために使用することができる。

【0099】

一実施形態において、プローブは、ヘテロ二重鎖分析に基づくシステムにおいて使用される。そのようなシステムでは、プローブが多型を含むポリヌクレオチド配列に結合したとき、それは多型が生じる部位でヘテロデュプレックスを形成し、それ故、二本鎖構造を形成しない。そのようなヘテロデュプレックス構造は、一本鎖または二本鎖特異的酵素の使用により検出することができる。典型的には、プローブはＲＮＡプローブであり、ヘテロ二重鎖領域はリボヌクレアーゼＨを使用して切断され、多型は切断生成物を検出することにより検出される。

【0100】

方法は、例えば、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３、２６８〜７１（１９９４）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、４３９７〜４４０１（１９９８）に記載されている蛍光性化学的切断ミスマッチ分析に基づくことができる。

【0101】

一実施形態においては、それが多型を含むポリヌクレオチドに結合する場合にのみ、ＰＣＲ反応を開始させるＰＣＲプライマー、例えば配列特異的ＰＣＲシステムが使用され、多型の存在はＰＣＲ生成物を検出することにより決定することができる。好ましくは、プライマーの多型に相補性の領域はプライマーの３’末端にまたはその付近にある。多型の存在は、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ検出システムなどの、蛍光性染料および消光剤に基づくＰＣＲアッセイを使用して決定することができる。

【0102】

特異的な結合剤は、多型の配列によりコードされたアミノ酸配列に特異的に結合することができる。例えば、作用剤は、抗体または抗体のフラグメントであってもよい。検出方法は、ＥＬＩＳＡシステムに基づくことができる。方法は、ＲＦＬＰに基づくシステムであってよい。これは、ポリヌクレオチド中における多型の存在が、制限酵素により認識される制限部位を作り出すかまたは破壊する場合に使用することができる。

【0103】

多型の存在は、多型の存在がゲル電気泳動中のポリヌクレオチドまたはタンパク質の移動度に生じさせる変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合には、一本鎖配座の遺伝子座の多型（ＳＳＣＰ）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＤＧＥ）分析を使用することができる。多型を検出する他の方法においては、多型領域を含むポリヌクレオチドを、多型を含む領域を通して配列を決定して多型の存在を決定する。

【0104】

多型の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出することもできる。特に、多型は、二重ハイブリッド形成プローブシステムによって検出することができる。この方法は、互いに近接に位置し、かつ関心のある標的ポリヌクレオチドの内部セグメントに相補性の２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含み、この場合２つのプローブの各々は蛍光団で標識されている。任意の適当な蛍光性標識または染料を、蛍光団として使用することができ、その結果１つのプローブ（供与体）の蛍光団の発光波長が第２のプローブ（受容体）の蛍光団の励起波長と重なる。代表的供与体蛍光団はフルオレセイン（ＦＡＭ）であり、および代表的受容体蛍光団は、テキサスレッド、ローダミン、ＬＣ−６４０、ＬＣ−７０５およびシアニン５（Ｃｙ５）を含む。

【0105】

蛍光共鳴エネルギー移動が起こるためには、２つの蛍光団は、両プローブの標的に対するハイブリッド形成時に、密接して近づくことが必要である。供与体蛍光団が適当な波長の光で励起されたとき、発光スペクトルのエネルギーが受容体プローブの蛍光団に移動してその蛍光を生じる。したがって、供与体蛍光団にとって適当な波長における励起中の、この波長の光の検出はハイブリッド形成、および２つのプローブの蛍光団の密接な関連を示す。各プローブは、蛍光団を用いて１つの末端で標識することができ、その結果上流（５’）に位置するプローブはその３’末端で標識され、下流（３’）に位置するプローブはその５’末端で標識される。標的配列に結合したときの２つのプローブの間の間隔は、１〜２０ヌクレオチド、好ましくは１〜１７ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド、例えば１、２、４、６、８または１０ヌクレオチドの間隔であることができる。

【0106】

２つのプローブの第１のものは、多型に隣接する遺伝子の保存配列に結合するようにデザインすることができ、第２のプローブは、１つまたは複数の多型を含む領域に結合するようにデザインすることができる。第２のプローブにより標的とされる遺伝子の配列内の多型は、生じる塩基ミスマッチが原因の溶融温度変化を測定することにより検出することができる。溶融温度における変化の程度は、ヌクレオチド多型に関与する数および塩基のタイプに依存するであろう。

【0107】

多型タイピングも、プライマー伸張技法を使用して実施することができる。この技法では、多型の部位周囲の標的領域がコピーされ、または例えばＰＣＲを使用して増幅される。次に単一塩基シークエンシング反応を、多型の部位から１塩基離れてアニールするプライマーを使用して実施する（対立遺伝子特異的ヌクレオチド組み込み）。次に、プライマー伸張生成物を検出して、多型の部位に存在するヌクレオチドを決定する。伸張生成物を検出することができる数通りの方法がある。１検出方法においては、例えば、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドターミネーターが、伸張反応を多型の部位で停止するために使用される。あるいは、質量改変されたジデオキシヌクレオチドターミネーターが使用されて、プライマー伸張生成物が質量分析法を使用して検出される。１種または複数種のターミネーターを特異的に標識することにより、伸張されたプライマーの配列を、およびそれ故に、多型の部位に存在するヌクレオチドを推測することができる。２種以上の反応生成物を反応ごとに分析することができて、その結果、２つ以上のターミネーターが特異的に標識されていれば、両方の相同性染色体に存在するヌクレオチドを決定することができる。

【0108】

本発明は、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護の予測に使用するための、本明細書において定義した多型の任意のもの検出に使用できるプライマーまたはプローブをさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において定義したＳＮＰを検出するためのプライマー伸張反応のためのプライマーとしても使用することができる。

【0109】

そのようなプライマー、プローブおよび他のポリヌクレオチドフラグメントの長さは、好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチドであろう。それらの長さは、典型的には４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチドまでであろう。プローブおよびフラグメントの長さは、本発明の全長のポリヌクレオチド配列を除いて、１５０ヌクレオチドを超えてもよく、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００ヌクレオチドまで、またはさらに５または１０ヌクレオチドなど数ヌクレオチドまでであってよい。

【0110】

本発明の多型の遺伝子型同定のためのプライマーおよびプローブは、表４、５、６、８、１８および２０中の配列を使用し、当技術分野において知られる任意の適当なデザインソフトウェアを使用して、デザインすることができる。これらのポリヌクレオチド配列の相同体は、プライマーおよびプローブをデザインするのにも適しているであろう。そのような相同体は、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を、例えば少なくとも１５、２０、３０、１００またはそれを超える隣接したヌクレオチドの領域にわたって有する。相同性は、ヌクレオチドの同一性（「硬い相同性」と称されることもある）に基づいて計算することができる。

【0111】

例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばその初期設定で使用）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２、ｐ３８７〜３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０〜３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３〜１０に記載されたように、相同性またはラインアップ配列（相等のまたは対応する配列の同定など）を計算するのに使用することができる（典型的にはそれらの初期設定で）。

【0112】

ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列化したとき、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、またはそれを充足するかのいずれかである、検索配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードのヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰの検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。それぞれの方向でのワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘだけ低下したとき；累積スコアが１つまたは複数の負のスコアリング残基のアラインメントの累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５〜１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。

【0113】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する；例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つ尺度は、２つのポリヌクレオチド配列の間でマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満であるとき、および最も好ましくは約０．００１未満であるなら、配列は他の配列と類似であると考えられる。

【0114】

相同性配列は、典型的には、少なくとも１、２、５、１０、２０以上の変異により相違し、変異はヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってよい。

【0115】

プライマーまたはプローブなどの本発明のポリヌクレオチドは、単離されたまたは実質的に精製された形態で存在し得る。本発明のポリヌクレオチドは、その使用目的に干渉しない担体または希釈剤と混合し、それでもなお実質的に単離されたと見なすことができる。それらは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般に、製剤のポリヌクレオチドの少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、９８％または９９％を占めることになる。

【0116】

検出抗体
検出抗体は、１つの多型に対して特異的であるが、本明細書において記載した任意の他の多型には結合しない抗体である。検出抗体は、例えば、免疫沈殿技法を含む精製、単離またはスクリーニングの方法において有用である。

【0117】

抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対するものであってもよい。抗体、または他の化合物は、それが特異的であるタンパク質に対して優先的なまたは高い親和性をもって結合するが、他のポリペプチドには実質的に結合しないかまたは低い親和性でしか結合しないとき、ポリペプチドに「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能力を決定するための競争的結合または放射免疫アッセイに対する種々のプロトコールが当技術分野において周知である（例えばＭａｄｄｏｘら、Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８、１２１１〜１２２６、１９９３を参照されたい）。そのような免疫測定は、典型的には、特異的タンパク質とその抗体との間のコンプレックスの形成およびコンプレックス形成の測定を包含する。

【0118】

この発明の目的のために、用語「抗体」は、特に断らない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）_２フラグメント、ならびに一本鎖抗体を含む。さらに、抗体およびそれらのフラグメントは、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体またはヒト化抗体であってもよい。

【0119】

抗体は、生物学的試料（本明細書において言及した任意のそのような試料など）中の本発明のポリペプチドを検出するための方法において使用することができ、その方法は
Ｉ．本発明の抗体を提供することと、
ＩＩ．抗体抗原コンプレックスの形成が可能な条件下で、生物学的試料を前記抗体と共にインキュベートすることと、
ＩＩＩ．前記抗体を含む抗体抗原コンプレックスが形成されているかどうかを決定することと
を含む。

【0120】

本発明の抗体は、任意の適当な方法により生成させることができる。抗体を調製し特徴づけるための手段は当技術分野において周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．を参照されたい。例えば、抗体は、宿主動物中で全ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、例えばそれらの抗原性エピトープ、（今後「免疫原」と称する）に対して抗体を生じさせることにより生成させることができる。フラグメントは、本明細書において言及したフラグメント（典型的には少なくとも１０個または少なくとも１５個のアミノ酸の長さ）の任意のものであってよい。

【0121】

ポリクローナル抗体を生成させる方法は、適当な宿主動物、例えば実験動物を免疫原で免役して、イムノグロブリンを動物の血清から単離することを含む。したがって、動物に免疫原を接種し、続いて動物から血液を取り出して、ＩｇＧ分画を精製することができる。モノクローナル抗体を生成させるための方法は、所望の抗体を生成する細胞を不死化することを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾臓細胞と腫瘍細胞とを融合することにより生成させることができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５〜４９７）。

【0122】

所望の抗体を生成する不死化された細胞は、従来の手順により選択することができる。ハイブリドーマは、培養で増殖させるかまたは腹水の形成のために腹腔内に注入するかまたは同種異系の宿主または免疫不全の宿主の血液ストリーム中に注入することができる。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続く、エプスタインバールウイルスを用いるリンパ球の形質転換により調製することができる。

【0123】

モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の生成のために、実験動物は、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ニワトリ、ヒツジまたはウマであることが適当である。所望であれば、免疫原は、免疫原が、例えばアミノ酸残基の１つの側鎖を通して、適当な担体に結合された複合体として投与することができる。担体分子は、通常、生理学的に許容される担体である。得られた抗体は単離して、所望であれば精製することができる。

【0124】

検出キット
本発明は、本明細書において定義した１つまたは複数の多型をタイピングするための手段を含むキットも提供する。特に、そのような手段は、本明細書において定義した多型を検出するかまたは検出に役立つことができる、本明細書において定義した特異的な結合剤、プローブ、プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または、抗体フラグメントを含む抗体を含むことができる。プライマーまたはペアまたはプライマーの組合せは、本明細書において論じた検出されるべき多型を含むポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅のみを起こす配列特異的プライマーであることができる。プライマーまたはプライマーのペアは、多型のヌクレオチドに対して二者択一的に特異的ではなくてもよいが、上流（５’）および／または下流（３’）領域に対して特異的であり得る。これらのプライマーは、領域がコピーされるべき多型のヌクレオチドを包含することを可能にする。プライマー伸張技法で使用するのに適したキットは、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を特異的に含むことができる。これらは、伸張生成物の検出およびそれに続く多型の位置に存在するヌクレオチドの決定を可能にするために、例えば蛍光標識または質量改変され得る。

【0125】

キットは、多型が存在しないことを検出することができる特異的な結合剤、プローブ、プライマー、プライマーのペアまたは組合せ、または抗体を含むこともできる。キットは、緩衝剤または水溶液を含むことができる。

【0126】

キットは、上記の方法の実施形態の任意のものが実施されることを可能にする１種または複数種の他の試薬または器具を追加して含むことができる。そのような試薬または器具は、以下の１つまたは複数を含むことができる：作用剤の多型に対する結合を検出する手段、蛍光性標識などの検出可能な標識、ポリヌクレオチドに作用し得る酵素、典型的にはポリメラーゼ、制限酵素、リガーゼ、リボヌクレアーゼＨもしくは標識をポリヌクレオチドに付けることができる酵素、酵素試薬のための適当な緩衝剤（単数または複数）もしくは水溶液、本明細書において論じた多型に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、陽性および／もしくは陰性対照、ゲル電気泳動装置、試料からＤＮＡを単離する手段、個体から試料を得る手段例えばスワブもしくは針を含む器具など、または検出反応をその上で実施することができるウェルを含む指示具。キットは、本発明の特異的な結合剤、好ましくはプローブを含むポリヌクレオチドアレイなどのアレイであることができ、またはそれを含むことができる。キットは、通常、キットを使用するための説明書のセットを含む。

【0127】

生物情報科学
多型の配列は、電子書式で、例えばコンピュータデータベースで貯蔵することができる。したがって、本発明は、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つもしくは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースを提供する。データベースは、本明細書に記載されている他の多型のいずれかに関する情報を含むこともできる。データベースは、多型に関するさらなる情報、例えば、多型と肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連の程度を包含することができる。

【0128】

本発明は、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および
（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型
から選択される１つまたは複数の多型に関する情報と、
これらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連と
を含むデータベースも提供する。

【0129】

データベースは、本明細書に記載されている他の多型のいずれかに関する情報を含むこともできる。データベースは、多型に関するさらなる情報、例えば、多型と肝臓の銅蓄積からのイヌの保護との関連の程度を包含することができる。

【0130】

本明細書に記載したデータベースは、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するために使用することができる。そのような決定は、電子的手段により、例えばコンピュータシステム（ＰＣなど）を使用することにより実施することができる。

【0131】

典型的には、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかの決定は、コンピュータシステムにイヌからの遺伝的データをコンピュータシステムに入力することと、遺伝的データを本明細書に定義されているデータベースと比較することと、この比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することとにより実施されるであろう。次に、この情報は、イヌの肝臓銅レベルの管理を導くために用いることができる、あるいは情報に基づく繁殖目的に用いることができる。

【0132】

本発明は、前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法のすべてのステップを実施するためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラムも提供する。前記プログラムをコンピュータ上で走らせるときに本発明の方法を実施するための、コンピュータで可読の媒体上に貯蔵したプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品も提供される。コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに本発明の方法を実施するように指示する搬送波上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品も、追加で提供される。

【0133】

図１０に例示したように、本発明は、本発明による方法を実施するために整えられた装置も提供する。装置は、典型的には、ＰＣなどのコンピュータシステムを含む。一実施形態において、該コンピュータシステムは、イヌの遺伝的データを受け取る手段２０；データを多型に関する情報を含むデータベース１０と比較するためのモジュール３０；および前記比較に基づいて、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定するための手段４０を備える。

【0134】

品種改良手段
育種価は個体の親としての価値と定義され、農業において家畜の望ましい特色を改良するために普通に使用される。イヌの全体的銅処理能力を改良して慢性肝炎などの銅関連疾患の発生を減少させるためには、肝臓の銅蓄積から保護されまたは肝臓の銅蓄積に対して感受性でない血統についてイヌを選択するのが有利であろう。この問題は、血統を知らせるために、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されまたは肝臓の銅蓄積に対して感受性でないかどうかを決定するために使用することができる多型を使用することにより解決される。

【0135】

例えば、２頭のイヌの子孫の銅処理能力は、ＡＴＰ７Ｂ遺伝子座における両親の遺伝子型により影響され得る。この遺伝子座における特定の変異の移動は、子孫にとって利益であり得る。遺伝子座における遺伝子型を決定することにより、将来の親の育種価を評価して、それにより所与の血統対が適当であるかどうかに関する決定をすることが可能であろう。

【0136】

したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、本発明の方法により、候補の第１のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を作出するのに適するかどうかを決定することを含む方法を提供する。該方法は、本発明の方法により、第１のイヌと性が反対の第２のイヌで、イヌのゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することをさらに含むことができる。結果が第１のおよび／または第２のイヌが肝臓の銅蓄積からの保護を示す遺伝子型を有するということであれば、その場合、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するために、第１のイヌを第２のイヌと交配させることができる。

【0137】

例えば、該方法は、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）から選択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型の有無を、候補の第１のイヌのゲノムで決定することを含むことができる。より好ましくは、方法は、ＳＮＰ ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６ ＳＮＰ；配列番号１４２）、またはＣｈｒＸ＿６３３９７３９３（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２ ＳＮＰ；配列番号１４３）等の前記ＳＮＰと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型の有無を決定することをさらに含む。本発明の方法は、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）のＡ対立遺伝子および／またはＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）のＴ対立遺伝子の有無を決定することを含むことができる。１つまたは複数のこれらのＳＮＰの存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護されており、したがって第２のイヌと交配させるのによい候補であることを示す。第１のおよび／または第２のイヌのいずれかにおけるホモ接合は、このことにより子孫がホモ接合性であり、それにより肝臓の銅蓄積から選択される可能性が増大するので、最も好ましい。

【0138】

本発明は、銅蓄積に対する感受性を示す本発明の多型を使用することにより、肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するためのイヌを選択する方法も提供する。イヌのゲノム中のそのような多型が存在しないことは、そのイヌが交配のためのよい候補であることを示す。したがって、本発明の方法は、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定すること；およびそれにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するのに適するかどうかを決定することを含むことができる。

【0139】

方法は、第一のイヌ候補のゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含むことができる。

【0140】

方法は、第一のイヌとは異なる性別の第二のイヌのゲノムが、肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかを決定することをさらに含むことができる。したがって、方法は、第二のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含むことができる。

【0141】

結果が、第一および／または第二のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す遺伝子型を持たないものであれば、肝臓の銅蓄積に対して感受性ではない子孫を作出するために第一のイヌを第二のイヌと交配することができる。

【0142】

方法は、第１のイヌ候補のゲノムにおける、（Ｉ）肝臓の銅蓄積に対する感受性を示すＧＯＬＧＡ５、ＡＴＰ７ＡまたはＵＢＬ５遺伝子における多型、および／または（ＩＩ）前記多型（Ｉ）と連鎖不平衡にある多型の有無を検出することをさらに含むことができる。方法は、候補の第１のイヌのゲノムで、表４〜６において特定されたＳＮＰから選択される１つまたは複数の多型およびそれらと連鎖不平衡にある１つもしくは複数の多型の有無を決定することを含むことが好ましい。これらの多型の１つまたは複数の存在は、第１のイヌが肝臓の銅蓄積に対して感受性であり、したがって肝臓の銅蓄積から保護される子孫を産するために第２のイヌと交配させるべきよい候補ではないことを示す。

【0143】

第１のイヌ候補および／または第２のイヌ候補は、いかなる血統のものであってもよい。好ましくは、第１のイヌ候補および／または第２のイヌ候補は、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマンピンシェル、ジャーマンシェパード、キースホンド、コッカースパニエル、ウェストハイランドホワイトテリア、ベドリントンテリアおよびスカイテリアから選択される血統を遺伝的に継承している。候補の第１のイヌおよび／または第２のイヌは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることがより好ましい。イヌは、純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において、少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。

【0144】

イヌの遺伝的血統の継承は、遺伝的マーカーの、例えばＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度を評価することにより決定することができる。イヌにおける異なったＳＮＰまたはマイクロサテライトの対立遺伝子の頻度の組合せは、イヌの血統または混血血統のイヌを作り出す血統が決定されることを可能にする特色を提供する。そのような遺伝子検査は商業的に利用できる検査である。あるいは、イヌは、それがラブラドールレトリーバーの血統を継承すると、例えばイヌの飼い主または獣医により推定されるという理由で、ラブラドールレトリーバーの血統継承について検査される必要がないこともある。これは、例えばイヌの祖先の知識のため、またはその外観のためであり得る。

【0145】

オールブリードクラブ登録により認められた血統の最も純粋種のイヌは「非公開の血統台帳」により管理される。血統台帳は、典型的には、例えば、血統協会またはケンネルクラブにより保持される、与えられた血統の承認されたイヌの公式登録である。それは、イヌがそれらの両親の両方とも登録されている場合にのみ追加され得るなら、一般に「非公開」血統台帳と称される。大部分の血統は非公開の血統台帳を有し、その結果、遺伝的多様性は既存集団の外側から導入され得ないので近親交配が生じる。ケンネルクラブにより認められた多くの血統において、これは、遺伝的疾患または障害ならびに同腹子の数の減少、短命および自然受胎不能などの他の問題の高い発生率を生じている。

【0146】

近親交配に関連する問題を回避するためには、血縁的により密接なイヌに比較して血縁的に互いにより隔たった特定の血統の中で、血統についてイヌを選択するのが有利であろう。したがって本発明の一態様において、候補の第１のイヌおよび候補の第２のイヌの遺伝的血統の継承が、２頭のイヌの縁続きの程度を決定するために決定される。本発明のこの態様において、用語「遺伝的血統の継承」は、特定の血統内のイヌの遺伝的祖先の系統に関する。イヌの遺伝的血統の継承は本明細書に記載したようにして決定することができる。イヌの遺伝的継承を決定することにより、彼らがいかに密接に関係しているかを決定するために、単一血統内でイヌの間を区別することは可能である。

【0147】

したがって、本発明の一態様において、候補の第１のイヌと候補の第２のイヌとの縁続きの程度が決定され、それは候補の第１のイヌの遺伝的血統の継承を同じ血統の候補の第２のイヌと比較することを含む。好ましくは、イヌは純粋種のイヌである。各イヌの遺伝的血統の継承は、例えば、前記イヌにおいて、１つまたは複数の血統特異的多型の有無を確認することにより決定することができる。

【0148】

縁続きの程度は、イヌが共通して有する血統特異的多型の数から決定することができる。例えば、同じ血統の２頭のイヌは、０〜１００％の、例えば１０〜９０％、２０〜８０％、３０〜７０％または４０〜６０％の検査済み血統特異的多型を共通して有することができる。したがって２頭のイヌは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の検査済み血統特異的多型を共通して有することができる。２頭のイヌの間に共通の検査済み血統特異的多型のパーセンテージは、それらの縁続きの程度の尺度として使用することができる。本発明のこの態様において、２頭のイヌは、彼らが遺伝的に十分無関係である場合にのみ、一緒に交配させるであろう。例えば、彼らは、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満の検査済み血統特異的多型を共通して有する場合にのみ、一緒に交配させることができる。

【0149】

本発明は、被験対象のイヌと交配させることについて１頭または複数のイヌを選択する方法であって、
（ａ）被験対象のイヌおよび被験対象のイヌと性が反対の２頭以上のイヌの検査群中の各イヌについて、ゲノムが肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型、および／または肝臓の銅蓄積に対して感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
（ｂ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選択することと
を含む方法も提供する。

【0150】

検査群は、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００または２００頭の異なったイヌ、例えば２〜１００、５〜７０または１０〜５０頭のイヌからなってよい。イヌは、通常、肝臓の銅蓄積から保護されるという根拠で検査群から選択される。検査群から選択される１頭または複数のイヌは、被験対象のイヌと同じかまたは類似の血統を遺伝的に継承していてよい。

【0151】

被験対象のイヌおよび検査群中の各イヌの血統は任意でよい。被験対象のイヌおよび／または検査群中の各イヌは、ラブラドールレトリーバー、ドーベルマンピンシェル、ジャーマンシェパード、キースホンド、コッカースパニエル、ウェストハイランドホワイトテリア、ベドリントンテリアおよびスカイテリアから選択される血統を遺伝的に継承していることが好ましい。イヌは、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承していることがより好ましい。イヌは純粋種のラブラドールレトリーバーであってよい。あるいは、イヌは、混血のもしくは交雑種のイヌ、または異系交配のイヌ（雑種）であってもよい。イヌの両親の一方または両方が、純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌの祖父母の１、２、３または４頭が純粋種のラブラドールレトリーバー犬であってもよい。イヌは、その遺伝的背景において、少なくとも５０％または少なくとも７５％のラブラドールレトリーバーの血統を有することができる。したがって、イヌのゲノムの少なくとも５０％または少なくとも７５％は、ラブラドールレトリーバーの血統に由来してよい。

【0152】

肝臓の銅蓄積からの保護またはそれに対する感受性に関する多型の有無に基づいて、検査群内の肝臓の銅蓄積から保護される可能性が最も高いイヌが、被験対象のイヌと交配させるために選択され得る。あるいは、検査群内の肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い多数のイヌが、被験対象のイヌと交配させるために選択される。例えば、検査群中の少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０頭のイヌを選択することができる。その上、他の因子、例えば地理的位置、年齢、品種改良状態、既往歴、疾患感受性または身体的特性に基づいて選択されたイヌの群から、さらに選択することもできる。

【0153】

上で説明したように、遺伝的に最も無関係の同じ血統内でイヌを交配させることが好ましい。これは、遺伝的多様性を血統内で増加または維持し、かつ子孫に生じる近親交配に関係する問題の可能性を減少させるためである。したがって、検査群からのイヌのさらなる選択は、被験対象のイヌとの遺伝的関係に基づくことができる。したがって、方法は、
（ａ）被験対象のイヌの遺伝的血統の継承を、同じ血統のかつ被験対象のイヌと性が反対の２頭以上のイヌの検査群中の各イヌの遺伝的血統の継承と比較することと、
（ｂ）この比較から、被験対象のイヌと検査群中の各イヌとの間の縁続きの程度を決定することと、
（ｃ）被験対象のイヌと交配させることについて検査群から１頭または複数のイヌを選択することと、
をさらに含むことができる。

【0154】

イヌは、被験対象のイヌ（すなわち、精液をとるべきイヌ）とのそれらの関係に基づいて検査群から選択することができる。検査群から選択された１頭または複数のイヌは、イヌの検査群内で最も隔たった関係にある（すなわち最低の縁続きの程度を有する）ことが好ましい。被験対象のイヌおよび検査群中のイヌの遺伝的血統の継承は、すでに知られていてよく、または例えば市販の血統検査により決定してもよい。

【0155】

したがって、本発明は、１頭または複数の適当なイヌを被験対象のイヌと交配させるために推薦する方法を提供する。推薦は、被験対象のイヌの飼い主または世話人、獣医、イヌ飼育者、ケンネルクラブまたは血統登録に対して行うことができる。

【0156】

本発明は、肝臓の銅蓄積からの、性が反対の少なくとも２頭のイヌの保護またはそれに対する感受性が、場合により同じ血統内で、彼らを一緒に交配させる前に決定される、イヌを交配させる方法にも関する。

【0157】

肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対する感受性は、電子書式中、例えばコンピュータデータベース中に貯蔵することができる。したがって、本発明は、肝臓の銅蓄積に対する感受性またはそれからの保護、および１頭または複数のイヌの性に関する情報を含むデータベースを提供する。データベースは、イヌについてのさらなる情報、例えば、イヌの血統を遺伝的に継承している品種改良状態、年齢、地理的位置、既往歴、疾患感受性または身体的特性を含むことができる。データベースは、通常、各イヌについての固有の識別名、例えばイヌの登録名をさらに含む。データベースは、遠隔で、例えばインターネットを使用して評価することができる。

【0158】

本発明を以下の実施例により例示する。

【実施例1】

【0159】

全ゲノム関連研究および情報価値のある遺伝子を潜在的に含有する領域の同定
本実施例は、銅蓄積の遺伝的予測検査の開発に利用される一般アプローチについて記載する。全ゲノム関連研究および情報価値のある遺伝子を潜在的に含有するゲノムの領域の同定に用いられる方法論についても詳述する。

【0160】

銅蓄積の遺伝的予測検査の開発に用いられる一般アプローチを次に示す。第一に、肝臓の銅蓄積により「影響を受ける」または「影響を受けない」と診断されたイヌから収集された試料を、多数のマーカーによる遺伝子型決定アレイにおいて実験を行った。これは、「全ゲノム関連研究」として知られている。このデータの解析は、情報価値のある遺伝子を潜在的に含有する領域の指標をもたらした。次に、関心のある遺伝子を有する領域における情報価値のあるＳＮＰをモデル作成に用いた。並行して、関心のある遺伝子を配列決定して、疾患における遺伝的効果をより良く説明するコード突然変異または他の突然変異を探索した。続いて、さらなるモデル作成においてこれらの突然変異を用いた。実際には、このプロセスは、技術における進行中の改善のためのループおよび平行軌道（loops and parallel tracks）に関与する。

【0161】

患者採用
２５４頭のラブラドールレトリーバーからデータを収集した。２通りの仕方でイヌを採用した。臨床的に罹患したイヌを、委託した獣医師によりユトレヒト大学獣医学部肝臓学科（Hepatology department of the Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University）に入院させた。オランダラブラドールレトリーバーブリードクラブ（Dutch Labrador retriever breed club）の登録ファイルにより、罹患したイヌの最も重要な（First line）血縁を積極的に採用した。

【0162】

診断
イヌ全頭に身体検査を行い、凝固検査のために血液を収集し、肝臓酵素（アルカリホスファターゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ）、胆汁酸およびアルブミンを決定した。ＤＮＡ単離のためにＥＤＴＡ血液試料を用いた。

【0163】

腹腔鏡検査もしくは開腹手術の際に収集または安楽死後に採取して、Ｔｒｕｃｕｔ １４ゲージ針機器により超音波ガイドされるＭｅｎｇｈｉｎｉ技法により２３９頭のイヌから肝生検を得た（Teskeら、1992、Vet. Rec. 131:30〜32）。肝生検を４％緩衝化ホルマリンにおいて３時間固定し、７０％エタノールに移し、パラフィンに包埋した。５ミクロン切片をスライド上に載せ、ヘマトキシリン・エオシン（ルーチン評価）、ワンギーソン（von Giesson）（レティキュリン染色）およびルベアン酸（銅染色）で染色した。

【0164】

診断は、本出願人らの委員会の認可した病理学者による肝生検の組織学的評価に基づいて行った（ＴＳＧＡＭｖｄＩ）。以前に記載された０〜５のスケールで、銅蓄積の重症度をスコア化した（Teskeら、1992、Vet. Rec. 131:30〜32）。銅を含まない容器内に追加的な肝生検を収集し、凍結乾燥し、機器中性子放射化分析（ＩＮＡＡ）により乾燥重量肝臓における定量的な銅を決定した（Bodeら、2008、Anal. Bioanal. Chem. 390:1653〜1658）。

【0165】

組織学的スコアを下に記載する。
グレード０ − 銅なし。
グレード１ − 単独的な（solitary）肝細胞が、数個の銅陽性顆粒を含有する。
グレード２ − 肝細胞の小さな群または区域が、少量から中程度の量の銅陽性顆粒を含有する。
グレード３ − 肝細胞のより大きな群または区域が、中程度の量の銅陽性顆粒を含有し、これは銅含有マクロファージと関連することもある。
グレード４ − 通常、銅含有マクロファージと関連する、多くの銅陽性顆粒を有する肝細胞の大きな区域。
グレード５ − 通常、銅含有マクロファージと関連する、多くの銅陽性顆粒を有する肝細胞の拡散した汎小葉的（pan-lobular）存在。

【0166】

試料表現型決定
銅関連慢性肝炎は、以前に表現型的に特徴づけられた（Hoffmannら、2006、J. Vet. Intern. Med. 20: 856〜861）。肝生検の評価に基づき、４種の表現型を定義した。

【0167】

２２ｋチップデータ（後述を参照）の目的のために、本出願人らは、６００ｍｇ／ｋｇ乾燥重量を上回る肝臓銅濃度を「影響を受ける」と、４００ｍｇ／ｋｇ乾燥重量を下回る肝臓銅濃度を「影響を受けない」と命名した（ｑｕａｎｔａｆｆ）。

【0168】

最も明確な銅中毒症の症例および対照の二元的（binary）表現型も適用した（ｃｕｔｏｘ）。症例は、肝臓銅レベル＞１２００ｍｇ／ｋｇまたは銅染色＞３および肝炎の組織学的兆候を有するものとして定義した。対照は、肝臓銅レベル＜４００ｍｇ／ｋｇおよび染色＜２を有するものとしておよび組織学的に異常なしとして定義した。より分離された表現型を用いて、遺伝的マッピングの分解能を増加させた。

【0169】

ルベアン酸染色に基づく病理学者による半定量的スコア化を定量的表現型（ｒａ）として用い（スコア０〜５）、肝生検を行った全てのイヌにおいて利用した。

【0170】

肝臓組織における定量的銅レベルを定量的表現型（ｃｕｑ）として用い、これは、６５〜３８７０ｍｇ／ｋｇに及んだ。

【0171】

遺伝子型決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ２２Ｋチップ）
およそ２２，０００ＳＮＰ遺伝子座の測定を目標とする第一世代Ｉｌｌｕｍｉｎａイヌ遺伝子型決定アレイ（２２Ｋチップ）を用いて、ゲノムワイド遺伝子型決定を行った。本出願人らは、このアレイにおいて２５１種のイヌＤＮＡ試料の実験を行った。

【0172】

カイ二乗解析
カイ二乗検定の収集により、データを解析した。二自由度検定を用いた。次に、ｐ値により遺伝子座をランク付けして、さらなる調査の優先順位をつけた。

【0173】

ペアワイズ解析
典型的には、遺伝的マッピングは、全ゲノムにわたり広がるマーカーにおいて、選択された試料を遺伝子型決定することにより行われる。疾患等、形質に関して試料を表現型決定した。試料は典型的には、単一の亜集団から選択され、可能な限り該集団内で無関係となるよう選択される。この操作は、集団構造から偽陽性ヒットを得る危険性を低下させるために行われる。

【0174】

以前のイヌの遺伝学的研究において、イヌは常に大量の変動的な遺伝子選択下に置かれているため、これらの厳密な判断基準を満足させることは困難であった。これは、血統、地理、時間および社会的派閥のサブタイプにわたるデータセットにおける集団構造を作製する。集団構造および密接に関係した試料の存在下でイヌの遺伝的データを解析するための新たな方法が開発される必要があった。ペアワイズマッピングは、この目的のために開発された最も成功した方法であった。

【0175】

個体群における遺伝的形質と関連する多型を決定するための方法、即ち「分配マッピング」（「２Ｄマッピング」としても知られる）を開発した。この方法は現在、二元的条件（症例／対照試験）に限定されている。遺伝的連関を有する複合的疾患は一般に、２種以上の遺伝子により推進される。これらの遺伝子は、直線的でない仕方で相互作用する可能性があり、伝統的な方法を用いたこれらのマッピングをより困難なものとしている。遺伝子座は、該個体ペアにおける表現型に寄与するか否かのどちらかであるため、個体ペアのレベルに作用することにより、複数の遺伝子の影響を取り除くことが可能となる。このプロセスの完全な作業を後述する。この解析を行った後、他の方法を用いて各区域における危険性対立遺伝子を抽出し、モデルを構築して表現型を予見することが可能となる。

【0176】

「分配マッピング」アルゴリズムは、５０キロベース毎に停止しつつゲノム全体にわたり走査する。これらのポイントそれぞれにおいて、全個体ペアを解析する。ペア毎に、染色体全体の遺伝子型を解析し、可能性のある３つのシナリオの下で遺伝子型の可能性を比較する。第１のシナリオは、この個体ペアにおいて表現型を推進する劣性突然変異が存在することである。第２のシナリオは、この個体ペアにおいて表現型を推進する優性突然変異が存在することである。第３のシナリオは、この位置におけるイヌのペアにおける表現型には重要な突然変異が存在しないことである。可能性は、後述する隠れマルコフモデルを用いて計算される。これらの可能性を比較することにより、該ポイントにおける劣性または優性表現型推進型突然変異の存在に向けたまたはこれに対するこの個体ペアのベイズ（Bayes）因子を導くことが可能である。これらの値の対数が採用され、そこで、正の値は、劣性または優性突然変異シナリオに向かうより大きい重みを表し、負の値は、そこに重要な突然変異が存在しないことに向かうより強い証拠を表す。

【0177】

個体ペアは、該遺伝子座における対数ベイズ因子の順に選別される。次に、ペアの対数ベイズ因子は、データの各パーセンタイルにおける証拠の累積的重みの記録を採用して、降順で合計される。多くの場合、ある対数ベイズ因子は、陽性となり、ある因子は陰性となるであろう。このことは、記録された値が、データのパーセンテージを上昇させ、続いて降下させる効果を与える。この値の最大値は、劣性または優性モデルいずれかに向かう証拠の重みの尺度を与える。これは、「ピーク値」と称される。

【0178】

一部の事例において、アルゴリズムは、ゲノムの特にホモ接合型区域または高密度の多型を有する区域に向けた偏りを有する。この効果は、４種の可能性のある症例／対照状態（症例−症例、症例−対照、対照−症例、対照−対照）にわたり並べ替えた全ペアを用いたプロセスの実施により定量化される。任意の遺伝子座に関して、並べ替えたモデル下のピーク値を正常ピーク値から引き、これにより補正されたピーク値を得る。次に、ゲノムにわたる補正されたピーク値を比較し、対象とする領域を得ることが可能となる。

【0179】

この方法は、肝臓における銅負荷と関連する多数の位置のマッピングに用いられてきた。これらの位置は、形質連関遺伝子を示すハプロタイプパターンによりマークされる。続いて、可能性のある遺伝子に関して位置を調査した。

【0180】

領域遺伝子解析
次に、全ゲノム関連研究において同定された領域を、可能性のある遺伝子に関して解析した。プロセスは、情報価値のある領域境界を同定することと、Ｅｎｓｅｍｂｌにおける領域における全遺伝子を同定することと、銅または肝臓機能に関係する関連性のあるタンパク質ドメインを探索することと、銅に連関する経路のメンバーシップを探索することと、関連性のある組織において発現される遺伝子を探索することとに関与した。この情報に基づき、次に、疾患関与の可能性により、遺伝子の優先順位をつけた。

【0181】

このプロセスにより、銅蓄積または肝疾患と関連する多数の候補遺伝子を同定した。

【0182】

遺伝子型決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ １７０Ｋチップ）
上述の２２Ｋチップよりも新しいＳＮＰチップを利用できるようになり、これは、より多様なソース由来の１７２，１１５種のマーカーを有する（１７０Ｋチップ）。このチップは、１Ｍｂ当たり平均して７０種を超えるマーカーを含有する。本出願人らは、２２Ｋチップにおける試料と同一およびさらなるＤＮＡ試料の実験をこのアレイにおいて行った。

【0183】

解析
１７０Ｋチップの結果を用いて、ＧｅｎＡＢＥＬソフトウェア（Aulchenkoら、2007、Bioinformatics, 23: 1294〜1296）によりゲノムワイド関連解析を行った。９８％の個体において分類が成功したＳＮＰおよび遺伝子型決定が成功した９８％のＳＮＰを有する個体を解析において維持した。少なくとも２０頭の保因者が存在する場合、解析においてＳＮＰを維持した。有意に関連するＳＮＰを、解析後にハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）に関してチェックした。

【0184】

常染色体の遺伝子型情報に基づき、遺伝的血縁を推定した。集団部分構造が遺伝的血縁マトリックスの計算により説明される多遺伝子モデル（Aulchenkoら、2007、Genetics、177: 577〜585）により、３種の形質（銅中毒症、ルベアン酸染色スコアおよびｍｇ／ｋｇで表す定量的肝臓銅）の遺伝率を推定した。年齢および性別を共変数としてモデル化した。多次元的スケーリングプロットにより集団層別化をチェックした。多遺伝子モデルおよびゲノム対照の推定の残渣においてスコア検定を行うことにより、層別化のための補正を行った。関数ｇｒａｍｍａｓ（Aminら、2007、PloS One、2: e1274）およびｆａｓｔａ（Chenら、2007、Am. J. Hum. Genetics、81: 913〜926）を用いて、集団層別化のために補正した。ｇｒａｍｍａｓ解析において千回の並べ替えを用いて、ゲノムワイド補正されたｐ値を得た。雄雌別々にＸ染色体を解析した。

【0185】

上述のペアワイズ方法をここでも適用した。

【0186】

総計で、１０９４９６種のマーカーおよび２５３頭のイヌが、品質制御を通過した。形質毎の表現型および計算された遺伝率（Ｈ２）の概要を表１に表す。

【0187】

【表1】

【0188】

ゲノムワイド関連解析は、ゲノムワイドに有意な結果に近いヒットをもたらした。全３種の解析の上位５種の有意なＳＮＰの結果を表２に表す。

【0189】

【表2】

【0190】

ゲノムワイドに有意な領域（ｇｒａｍｍａｓにおける１０００回の並べ替え後のｐ値は０．１１であった）に近いものを第２２染色体のｒａ遺伝子型により同定した。関連する領域は、染色体の始まりにおける１５Ｍｂ領域に及ぶことが判明した。候補遺伝子ＡＴＰ７Ｂは、３．１２〜３．１６Ｍｂにおけるこの領域に位置した。この遺伝子の解析を実施例５に記載する。

【実施例2】

【0191】

３領域モデル作成
本実施例は、肝臓の銅蓄積に対する感受性を決定するための３領域モデルの作成について記載する。この研究は、国際公開第２００９／０４４１５２（Ａ２）号パンフレット、国際公開第２０１０／０３８０３２（Ａ１）号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１１６１３７（Ａ１）号パンフレットにおいても記載されている。

【0192】

実施例１に記載されている領域解析において優先順位をつけた、遺伝子におけるおよびその周囲のＳＮＰをデータセットから抽出した。これらを単独およびハプロタイプにおいて解析して、肝臓銅レベルと関連する情報価値のある対立遺伝子パターンを探索した。

【0193】

これらのパターンのうち最も有意なもの（一自由度カイ二乗検定による）をモデルにおいて用いた。３種の遺伝子（ＡＴＰ７Ａ、ＵＢＬ５−オルソログおよびＧＯＬＧＡ５）付近のＳＮＰをモデルにおける使用のために選んだ。次に、０または１のいずれかにより各遺伝子パターンが表され（１は、より高い危険性の遺伝子型またはパターン）、３桁のパターンによる３種のパターンの組合せ（例えば、０−０−０または０−１−１）によるブーリアン（Boolean）モデルを作成した。したがって、１−１−１は、高い肝臓銅の最大の危険性を表す。

【0194】

表３は、銅蓄積を予見するための３領域モデルの結果を示す。各領域は、単一のＳＮＰまたはＳＮＰ群のいずれかを用いる。モデルは、３ゲノム領域におけるＳＮＰのこの単純なモデルを用いた、イヌの遺伝子型に応じた疾患の危険性における明らかな差を示す。

【0195】

【表3】

【0196】

表３の２進値に対するキーを以下に提示する。
ゲノムの遺伝子座第８染色体（ＣＦＡ８）、ＧＯＬＧＡ５遺伝子領域：
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰにＡＡ遺伝子型がある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５のＳＮＰの任意の他の遺伝子型がある場合
ゲノムの遺伝子座第３２染色体（ＣＦＡ３２）、ＵＢＬ５遺伝子領域：
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５にＧＧ、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７にＣＣおよびＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８にＧＧがある場合
０＝これらのＳＮＰのいずれかが異なった遺伝子型を示す場合
ゲノムの遺伝子座Ｘ染色体（ＣＦＡＸ）、ＡＴＰ７Ａ遺伝子領域：
１＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＡＡまたはＡＧがある場合
０＝ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２にＧＧがある場合

【0197】

表３は、３つのゲノムの遺伝子座における対立遺伝子の２元状態を表す。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ８において、１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ１）。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡ３２において３つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ２、３および４）。ゲノムの遺伝子座ＣＦＡＸにおいて１つのＳＮＰが使用された（ＳＮＰ５）。２元値は、銅蓄積に対する感受性を示す対立遺伝子（「悪い」対立遺伝子）を有するイヌを示す。例えば０００は、３つの悪い対立遺伝子のいずれも有しないことを表す。１１１は、３つの悪い対立遺伝子のすべてを有することを表す。

【0198】

表４は、表３中の結果のために使用されたＳＮＰの位置および配列を示す。

【0199】

結果は、３つのゲノムの遺伝子座（ＧＯＬＧＡ５、ＵＢＬ５およびＡＴＰ７Ａ遺伝子の中および周辺にある）は銅蓄積に対する感受性と関連することを示す。さらに、銅蓄積に対する感受性を示すこれらの領域中のＳＮＰを表５に示す。

【0200】

【表4】

【0201】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【表5-8】

【表5-9】

【表5-10】

【表5-11】

【表5-12】

【表5-13】

【表5-14】

【実施例3】

【0202】

肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさらに別のＳＮＰおよび保護ＳＮＰの同定
本実施例は、肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさらなるＳＮＰと、また、ＡＴＰ７Ａ遺伝子におけるいくつかの保護性ＳＮＰの同定について記載する。この研究は、国際公開第２０１０／０３８０３２（Ａ１）号パンフレットおよび国際公開第２０１０／１１６１３７（Ａ１）号パンフレットにも記載されている。

【0203】

実施例２で同定された３つの遺伝子を調べて肝臓の銅蓄積に対する感受性と関連するさらなるＳＮＰを同定した。３つの同定された遺伝子のエクソンを残らず網羅する３３個の単位複製配列を選んだ。これらは、ラブラドールレトリーバーの血統のイヌからのゲノムのＤＮＡの７２個の試料中で増幅されていた。試料は、高銅（６００ｍｇ／ｋｇを超える肝臓銅のレベル）または正常銅肝臓レベル（４００ｍｇ／ｋｇ未満）のいずれかのイヌから採取した。増幅された生成物は、サンガー法により両方向で配列を決定した。ＤＮＡＳＴＡＲにより供給されるソフトウェア「Ｓｅｑｍａｎ４．０」を各単位複製配列中の配列のアセンブルに使用した。次にアセンブリーを検査して一塩基変異（ＳＮＰ）を見出した。次に、これらの変異は、両方向からの配列におけるＳＮＰで、基準強度（ｂａｓｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を検査することにより遺伝子型を決定される。２つの方向からのＳＮＰの遺伝子型が１０個を超える試料中で不一致であれば、ＳＮＰはアーチファクトと分類されておよび無視される。同定された感受性ＳＮＰを表６に提示する。

【0204】

ＡＴＰ７Ａのコード領域における保護性ＳＮＰの発見
保護性ＳＮＰを発見した（ＡＴＰ７Ａ Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３）。これは、表７に提示されており、このＳＮＰの前後の配列は、表８に提示されている。このＳＮＰは、ＡＴＰ７Ａ遺伝子（Ｘ染色体連関遺伝子）のコード領域中にあり、コード配列中に変化を生じさせる。性別およびＡＴＰ７Ａ遺伝子型による肝臓銅の平均レベルの試験を実施した（表９）。図１は、表９のデータをグラフで図示する。図２は、同じデータを銅の組織学的スコアとして図示する。ｐ値（０．０００３９６）は、群として、組織学的なスコアと性別遺伝子型とに対するクラスカル・ワリス検定により決定した。Ｔ対立遺伝子の存在はイヌが高い肝臓銅から保護されることを示すことがデータから明らかである。

【0205】

結果は、慢性肝炎の雌のバイアスを説明することができる。雄イヌは、１コピーのＸ染色体を有するだけなので、ＡＴＰ７Ａ遺伝子座でヘミ接合性である。Ｘ連関劣性遺伝子の効果は、雄のＸ染色体のヘミ接合性状態のために、雌よりも雄において見られる可能性が高い。この場合、保護効果は劣性であるので、雌集団における方が多くの症例が見られる。

【0206】

保護ＳＮＰは、ＡＴＰ７Ａのアミノ酸３２８位におけるトレオニンのイソロイシンへの変化を生じさせ、可能な水素結合の数の３から０への減少および疎水性の増大、可能性としてタンパク質の形状の変化をもたらす。この位置におけるトレオニンは、ウマ、ヒト、チンパンジーおよびイルカを含む多くの哺乳動物を通じて保存され、タンパク質の機能におけるこのアミノ酸の重要性を示す。

【0207】

ＡＴＰ７Ａにおける、さらに別の保護性だが非コード領域にあるＳＮＰの発見
ＡＴＰ７Ａ遺伝子の配列決定により、コード領域のＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６（ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３）のＳＮＰとほとんど完全な連鎖不平衡にあるイントロンのＳＮＰが明らかになった。コード領域のＳＮＰと同様に、イントロンのＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ４２）は、肝臓の銅蓄積からの保護と有意に関連する（表７）。遺伝子型と疾患状態の独立性における２種類の自由度によるカイ２乗検定を用いて両者の有意性を測定した。疾患状態は、銅定量化が＞６００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）かつ組織学スコアが＞＝２．５に対して陽性であり、銅定量化が＜４００ｍｇ／ｋｇ（乾燥肝臓重量）かつ組織学スコアが＜２．５に対して陰性であった。予想の表は、２個の変数の独立性を予見する試料内における遺伝子型頻度および疾患頻度のベイズ法による予測に基づいていた。

【0208】

非コード領域のＳＮＰとコード領域のＳＮＰとの間の連鎖不平衡の計算された尺度は、Ｄ’＝０．９３、Ｒの２乗＝０．８６である。したがって、このＳＮＰ同士はほぼ完全に不平衡にある。

【0209】

ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ４２の前後の配列を表８に示す。

【実施例4】

【0210】

ＡＴＰ７Ａの保護ＳＮＰの血統および地理的多様性に関する調査
本実施例は、ＡＴＰ７Ａ保護性コード領域ＳＮＰの血統および地理的多様性の調査について記載する。

【0211】

ＡＴＰ７Ａのコード領域のＳＮＰ（ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ３＿Ｆ＿６；ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３）は、該ＳＮＰが他の血統においても存在するかどうかを決定するために、ラブラドールレトリーバーに加えて他の血統のイヌからのＤＮＡ試料においても遺伝子型を決定された。表１０は、各遺伝子型のイヌの数について、結果を示す。「Ｔ」の縦欄はホモ接合体の雌（ＴＴ）およびヘミ接合体の雄（Ｔ）を示す。結果は、ＳＮＰは多様なイヌの血統に存在し、したがって種々の異なった血統、混血のイヌおよび雑種における銅蓄積からの保護の指標として使用することができることを示す。該ＳＮＰのＴ対立遺伝子は、米国および日本のラブラドール集団にも見出され、イヌの地理的位置はＳＮＰの効用の障害ではないことを示す。

【0212】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0213】

【表7】

【0214】

【表8】

【0215】

【表9】

【0216】

【表10】

【実施例5】

【0217】

ＡＴＰ７Ｂ配列決定
本実施例は、ＡＴＰ７Ｂ（ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ）の配列決定および銅蓄積と関連する突然変異の解明について記載する。

【0218】

ＡＴＰ７Ｂ配列決定 − ｃＤＮＡ
アンプリコン選択およびプライマー配列
Ｐｅｒｌプライマーによりプライマーを開発し、ＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔを用いて特異性に関してチェックした。プライマーは、ＡＴＰ７Ｂの偽遺伝子（ゲノムポジション（４：３８５９６５１０〜３８５９７６１５）における１１０６ｂｐ断片ではなく、活性ＡＴＰ７Ｂに特異的となるよう設計される必要があった。プライマー（表１１）は、ＡＴＰ７Ｂの偽遺伝子とミスマッチするプライマーを開発することにより保証された。ＮＣＢＩデータベースに従って、主な焦点の断片は、ＡＴＰ７Ｂのエクソン２に位置した。しかし、Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、この断片が、その中間に３３塩基対イントロンを有するエクソン２（ＥＮＳＣＡＦＥ００００００４６０６５）およびエクソン３（ＥＮＳＣＡＦＥ００００００４６０７１）の両方であると言う。

【0219】

【表11】

【0220】

配列決定
Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＳｅｑＭａｎ（ＤＮＡｓｔａｒ８．１）を用いて配列決定の結果を解析した。ＮＣＢＩ（Ｂｕｉｌｄ２．１）およびＥｎｓｅｍｂｌ（ＣａｎＦａｍ ２．０、２００５年５月、データベースバージョン６２．２ｒ）により結果を比較した。メンデル遺伝との不一致（Mendelian inconsistency）に関してラブラドール系図をチェックした。

【0221】

結果
プライマー最適化のための肝臓ＲＮＡから調製されたビーグルｃＤＮＡの配列決定は、関心のある断片を明らかにし、ＡＴＰ７Ｂの同時ｇＤＮＡ配列決定により、本出願人らのラブラドールサブセットにおけるＤＮＡのこの部分のみを最終的に配列決定した。配列決定結果は、２種の関心のあるコード非同義突然変異を明らかにした：ＳＮＰおよびリピート。さらに、本出願人らは、２種のゲノムブラウザＮＣＢＩおよびＥｎｓｅｍｂｌ間の矛盾の一つを解決することができた。ＡＴＰ７Ｂのエクソン１の配列は、未だ解明されていないため、エクソンのナンバリングは、エクソン２から開始する。

【0222】

ＡＴＰ７Ｂコードリピート（Ｃｈｒ２２＿３１３５２８７）
ＡＴＰ７Ｂ遺伝子のエクソン構造の予見において、２種のオンラインゲノムデータベース（ＮＣＢＩおよびＥｎｓｅｍｂｌ）間に矛盾が存在する。ＮＣＢＩによると、エクソン２は、１２３７塩基対（ｂｐ）の長さである。しかし、Ｅｎｓｅｍｂｌは、この１２３７ｂｐは、２個のエクソンである、即ち、エクソン２（９７１ｂｐ）、イントロン２−３（３３ｂｐ）およびエクソン３（２３３ｂｐ）であると言う。本出願人らの配列決定結果は、エクソン２が、実際に１２３７塩基対長であり、イントロン配列が存在しないことを示す。

【0223】

別の注目すべき発見は、３３ｂｐコード断片が、可変的な長さであることである（図３）。Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、４個のリピートを示すが、ＮＣＢＩは、ヘテロ接合性（３および４リピート）を示す。本出願人らが配列決定したビーグルも、ヘテロ接合型であるが、２および３リピートを有する。本出願人らのラブラドールサブセットにおいて、本出願人らは、ホモ接合型（３リピート）、ヘテロ接合型（３および４リピート）およびホモ接合型（４リピート）イヌを見出した。このリピートにおける第１のＣの染色体位置は、２２：３１３５２８７である。リピートは、ＡＴＰ７Ｂの第３および第４の重金属関連ドメインの間に位置する（図４）。真獣類哺乳動物の間の多種（multispecies）アライメントは、この特定の領域が十分に保存されていないことを示す。イヌは、このポジションにおけるＣＧＣＣＣＣリピートが発見された唯一の種である。

【0224】

ＮＣＢＩ由来のリピート前後の配列を表１２に示す。

【0225】

【表12】

【0226】

ＡＴＰ７Ｂ ７９０Ｇ＞Ａ（Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４）
本出願人らは、リピートのおよそ１４４ｂｐ上流が、非同義突然変異（ＡＴＰ７Ｂ ７９０ Ｇ＞Ａ）であることを見出した。このＳＮＰは、染色体ポジション３１３５１４４におけるエクソン２にも位置している。これは、Ｇ＞Ａ置換であり、その結果として、アミノ酸アラニンは、トレオニンに置換される。ＳＮＰは、第３の重金属関連ドメインに位置する。

【0227】

ＡＴＰ７Ｂ配列決定 − ゲノム
完全表現型データが利用できる９８頭のイヌにおいてＢｅｃｋｍａｎｎ ＣｏｕｌｔｅｒによりＡＴＰ７Ｂの再配列決定（Ｓａｎｇｅｒ）を行った。エクソンおよびエクソン−イントロン境界を配列決定した。

【0228】

ＳｅｑＭａｎ（ＤＮＡｓｔａｒ８．１）を用いて配列決定の結果を解析した。ＮＣＢＩ（Ｂｕｉｌｄ２．１）およびＥｎｓｅｍｂｌ（ＣａｎＦａｍ ２．０、２００５年５月、データベースバージョン６２．２ｒ）により結果を比較した。メンデル遺伝との不一致に関してラブラドール系図をチェックした。

【0229】

結果
９８頭のラブラドールにおけるＡＴＰ７Ｂの全ｇＤＮＡ配列決定の解析は、２種のエクソン非同義突然変異（ＳＮＰ ＡＴＰ７Ｂ ７９０ Ｇ＞Ａ；Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４を包含）および４種のエクソン同義突然変異を明らかにした。イントロンにおける９種の単一の塩基対置換を検出した。さらに、イントロン領域において３種の単一の塩基対インデルおよび７ｂｐ欠失を検出した。６塩基対のコードリピート（上述）も見出された。表現型との関係の統計解析を行った。リピートおよび２種の非同義ＳＮＰのみが、９８頭のラブラドールの群において表現型と有意な関連を有していた。拡張されたセットのイヌにおいてこれら３種の突然変異を試験し（次節を参照）、機能的効果の証拠を探索した。

【0230】

ＡＴＰ７Ｂ ４１４５Ｇ＞Ａ
ＡＴＰ７Ｂ ４１４５Ｇ＞Ａ ＳＮＰは、終止コドンのおよそ１５４ｂｐ上流の、ＡＴＰ７Ｂの末端に位置している（エクソン２１、染色体ポジション３１６７５３４）。これは、Ｇ＞Ａ置換がアルギニンの代わりにアミノ酸グルタミンをもたらす非同義突然変異である（図５）。

【0231】

拡張されたセットのラブラドールにおける突然変異の分類および効果の予見
ＡＴＰ７Ｂにおいて見出された２種の関心のあるＳＮＰ（ＳＮＰ７９０Ｇ＞ＡおよびＳＮＰ４１４５Ｇ＞Ａ）およびリピートを、より大型のサブセットのラブラドールレトリーバーにおいてさらに解析した。ＳＮＰ７９０Ｇ＞Ａのため、２６７頭のラブラドールおよび１頭のビーグル（対照）を分類し、ＳＮＰ４１４５Ｇ＞Ａのため、ＳＮａＰｓｈｏｔにより総計２４２頭のラブラドールを分類した。リピートのため、Ｇｅｎｅｓｃａｎにより２１６頭のイヌを分類した。突然変異の分類に用いたプロトコールを、より詳細に後述する。

【0232】

Ｇｅｎｅｓｃａｎ
Ｇｅｎｅｓｃａｎを行って、３プライマープロトコールを用いてＡＴＰ７ＢにおけるＤＮＡ断片長多型を分類した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼは、ショットタンデム型ＧＣリピートを検出することができないため、アンプリコンのＰＣＲ増幅にＰｆｘポリメラーゼを用いた。フォワードプライマーにＭ１３テールを付加されたものを除いて、配列決定に用いたものと同一のプライマーをＧｅｎｅｓｃａｎにも用いた。プライマー配列を表１３に収載した。

【0233】

【表13】

【0234】

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアバージョン４．０によりＧｅｎｅｓｃａｎ結果を解析した。マイクロサテライトの長さおよび長さの差ならびに個体がマイクロサテライトのこの遺伝子座においてホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかに焦点を置いた。ピークを互いにおよびサイズ標準と比較して、ピークの信頼性を決定した。

【0235】

ＳＮａＰｓｈｏｔ
拡張された群のラブラドールレトリーバーにおいて正確なＳＮＰ解析のためにＳＮａＰｓｈｏｔを行った。

【0236】

７９０Ｇ＞Ａのため、配列決定に用いた（機能的ＡＴＰ７Ｂ特異的）プライマーを、ＳＮａＰｓｈｏｔプロトコールのＰＣＲ反応にも用いた。ＰｅｒｌプライマーによりＳＮＰ ４１４５Ｇ＞ＡのＰＣＲプライマーを開発し、ＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔによりチェックした。これらのプライマーは、イントロン配列も取り込まれているため、機能的ＡＴＰ７Ｂ遺伝子に特異的であった。加えて、両方のＳＮＰのため、ＳＮａＰｓｈｏｔプライマーを設計した。プライマー配列を表１４に提示する。

【0237】

【表14】

【0238】

ＳＮａＰｓｈｏｔプロトコールは、ＰＣＲステップを除いて、どちらのＳＮＰも同一であった。標準Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼを用いてＳＮＰ ４１４５Ｇ＞Ａの鋳型を作製した。対照的に、ＳＮＰ ７９０Ｇ＞Ａの鋳型は、ＧＣリッチストレッチをより的確に増幅することのできるＰｆｘポリメラーゼを用いて作製した。

【0239】

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアバージョン４．０により結果を解析した。各色が別の塩基を表す異なる色と、個体のヘテロ接合性またはホモ接合性に焦点を置いた。ピークを互いにおよびサイズ標準と比較して、ピークの信頼性を決定した。

【0240】

多種アライメント
他種間の突然変異領域の保存をチェックするため、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ多種アライメントツールを用いて多種アライメントを形成した。両方の単一塩基は、異なる種にわたって高度に保存されているが、一方、コードリピートは保存されていない。イヌは、該ポジションにリピートを有する唯一の種である。

【0241】

突然変異効果の予見
数種の予見プログラムによりタンパク質機能に予見される可能な有害効果に関して両方のＳＮＰを評価した：
・Ａｌｉｇｎ−ＧＶＧＤ（http://agvgd.iarc.fr/index.php）
ツールは、アミノ酸の生物物理学的特徴およびタンパク質の複数の配列アライメントを組み合わせて、対象とする遺伝子におけるミスセンス置換が、豊富な有害から豊富な中立の範囲に収まる場所を予見する。
・ＰｏｌｙＰｈｅｎ（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/index.html）
直接的な物理および比較考察を用いたヒトタンパク質の構造および機能におけるアミノ酸置換の可能な影響の予見。
・ＰｈＤ−ＳＮＰ（http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP. cgi）
ツールは、ヒト有害一塩基多型の予測装置（predictor）として用いられる。
・ＳＮＡＰ（http://rostlab.org/services/snap/）
これは、タンパク質機能における単一アミノ酸置換の効果を評価するための方法である。

【0242】

予測プログラムは、主に、ヒトのデータ入力に基づくため、あらゆるプログラムが、イヌアミノ酸置換の効果を予見することができるとは限らない。用いられる予測プログラムによると、ＡＴＰ７Ｂ ７９０ Ｇ＞Ａは、タンパク質機能に最も有害な効果を有することが疑われる。

【0243】

ＬＤ計算
ＡＴＰ７Ｂにおけるコード突然変異およびＡＴＰ７Ｂの第１の部分における６７２種のＳＮＰのために、プログラムＨａｐｌｏｖｉｅｗを用いてＬＤの２種の尺度（信頼区間を有するＤ’およびＲの２乗）を計算した。ＧＷＡＳ由来の上位３種の最も関連したＳＮＰの結果を表１５に表す。高Ｄ’および低Ｒの２乗は、測定される突然変異のいずれかの組合せの対立遺伝子頻度における差を示す。領域（Ｃｈｒ２２の最初の１５Ｍｂ）におけるＬＤ構造を図６に表す。この領域における突然変異および数種のＳＮＰの間に高ＬＤが存在し、ＧＷＡＳ解析において関連する大きな区域をもたらす。

【0244】

【表15】

【0245】

コード突然変異と表現型との統計的関連
拡張されたセットのラブラドールにおいてＡＴＰ７Ｂにおけるコード突然変異を分類し、線形モデルを用いて、同一モデルにおける単一の突然変異および全突然変異の、突然変異の効果の規模および方向（ベータ）ならびに関連の有意性（ｐ値）を決定した。２１１頭のラブラドールのため、ＡＴＰ７Ｂにおける全３種の突然変異およびＡＴＰ７Ａにおける突然変異を分類した。このセットにおいて、各イヌの危険性対立遺伝子の数を決定し、ＲＡ染色に基づく肝臓銅における危険性対立遺伝子の数の効果を計算した。

【0246】

結果変数としての銅のｒａスコア化による線形モデリングを、ＡＴＰ７Ｂコード突然変異の共変数として年齢、性別および突然変異を用いて行った。単一対立遺伝子効果および他の２種に対し補正した各突然変異の効果の両方を計算し、結果を表１６にまとめる。相加的な仕方で突然変異をモデル化したため、効果は、対立遺伝子の余剰のコピー全てに対し推定された。

【0247】

７９０ Ｇ／Ａ（Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４）突然変異は、保護的であることが判明したが、一方、リピートの余剰のコピー全て（Ｃｈｒ２２＿３１３５２８７）およびポジション４１４５における余剰のＡ全て（Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４）は、肝臓銅の有意により高いＲＡスコア化をもたらした。

【0248】

【表16】

【0249】

疾患表現型に寄与するあらゆる公知のコード突然変異の効果を研究するため、ＡＴＰ７Ｂにおける３種の突然変異と共に、以前に発見されたＡＴＰ７Ａコード突然変異の分類が成功した２１１頭のラブラドールにおいて線形モデリングを行った。個々のイヌ毎に危険性対立遺伝子の数を計数した。危険性対立遺伝子は次の通りであった：ＡＴＰ７Ａコード突然変異のＣ、ＡＴＰ７Ｂ ７９０、Ｇ／ＡのＧ（Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４）、染色体位置２２：３１３５２８７におけるＡＴＰ７Ｂリピートの３リピートおよびＡＴＰ７Ｂ ４１４５ Ｇ／ＡのＡ（Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４）。結果変数は、ＲＡ銅染色（レベル０〜５）に基づく肝臓銅レベルであり、危険性対立遺伝子の数を共変数としてモデル化した。余剰の危険性対立遺伝子は全て、３．５ ｅ−０８の非常に有意なｐ値を有する０．３３のＲＡ染色スコアにおける有意な増加をもたらした。図７は、定量的肝臓銅レベルにおける危険性対立遺伝子の数の効果を示す。

【実施例6】

【0250】

ＳＮＰ遺伝子型決定およびモデル作成
本実施例は、ＳＮＰの遺伝子型決定およびモデル作成について記載する。

【0251】

ＣＡＣＨ表現型のＤＮＡ試料のＳＯＬＩＤ配列決定（ＳＯＬＩＤ ３配列決定プラットフォームを用いる）によりＳＮＰを同定した。加えて、以前の研究由来のＳＮＰならびにＡＴＰ７Ａ、ＣＯＭＭＤ１、ＡＴＯＸ１およびＡＴＰ７Ｂ遺伝子の配列決定は、解析に包含された。

【0252】

あらゆる利用できる表現型のＤＮＡ試料において、ＧｅｎｅＳｅｅｋによりＳＮＰを遺伝子型決定した。カイ二乗検定の収集によりＳＮＰを解析した。表現型および遺伝子型間の独立の帰無仮説により、二自由度検定を用いた。用いた表現型を次に示す：
・組織学的スコア＞＝２．５ｖｓ．組織学的スコア＜２．５
・定量的銅＞６００ｖｓ．定量的銅＜４００

【0253】

カイ二乗検定と共に、定量的銅および組織学的スコアに対し相関係数検定を適用した。ｃｏｒｒｃｏｅｆ関数を用いたＭＡＴＬＡＢにおいて検定を行って、ｐ値および相関係数を生じた。次に、ｐ値により遺伝子座をランク付けして、さらなる調査の優先順位をつけた。有意性０．００１を超えるゲノム領域を、実施例１における見出し「領域遺伝子解析」の節に記載されている潜在的な候補遺伝子に関して調査した。

【0254】

次に、選択されたＳＮＰに関して遺伝子型を検査した。ｃｏｒｒｃｏｅｆ関数は、低いメンバーシップの群を有する順序データ（遺伝子型等）において偽陽性を生じることもあるため、表現型に差を有する少なくとも２群において１０種以上の試料を含有するＳＮＰのみのフィルターをＳＮＰにかけた。残りのＳＮＰは、モデル作成において用いた。

【0255】

最終データは、２６０種の試料において遺伝子型決定された３８６種のＳＮＰからなる。解析は、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護と有意に関連する多くのＳＮＰを同定した。この解析を表１７に示す。前後の配列を包含するＳＮＰに関するさらなる情報を表１８に提示する。

【0256】

ＳＮＰと連鎖不平衡にある、したがって、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護とも関連するＳＮＰの例を表１９および表２０に提示する。

【0257】

【表17-1】

【表17-2】

【0258】

【表18-1】

【表18-2】

【表18-3】

【0259】

【表19-1】

【表19-2】

【表19-3】

【表19-4】

【表19-5】

【表19-6】

【表19-7】

【表19-8】

【表19-9】

【0260】

【表20-1】

【表20-2】

【表20-3】

【表20-4】

【表20-5】

【表20-6】

【表20-7】

【表20-8】

【表20-9】

【0261】

モデル作成
表１７〜表２０において同定された突然変異は、単独で用いて、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護を決定することができる。しかし、肝臓の銅蓄積に対する感受性または肝臓の銅蓄積からの保護を評価するより的確な方法は、突然変異の組合せに関与するモデルの使用により達成することができる。表１７および表１８における突然変異は、後述するモデル作成において用いた。

【0262】

変数
選ばれた変数は、Ｇｅｎｅｓｅｅｋ遺伝子型決定において同定された全突然変異と、雄が０雌が１としてコードされる性別であった。遺伝子型は、０、１または２の順序形態でコードされた（第２の対立遺伝子の計数）。

【0263】

ｌｏｇ１０定量的銅および組織学的スコアの、２種のレポーター（reporter）変数を用いた。これらは両者共に、遺伝学およびおよそ互いに対し直線的に応答すると考えられるため、この種類の線形モデリングの優れた候補となる。

【0264】

方法
変数の数および利用できる試料サイズのため、全ての遺伝的効果を一緒にモデル化できるとは限らない。これを解決するため、段階的モデリング技法を用いた。この技法は、モデルにおける係数の推定の有意性を観察しつつ因子を挿入および除去することにより、モデルにおいていずれの因子を用いるべきかを決定する。用いた正確な方法を下に述べる：
１．データを平均パッチ（mean-patched）して、欠損データを可能にする。
２．ＭＡＴＬＡＢ段階的コマンドを用いて、平均パッチデータにおいて段階的回帰を行った。これは、係数０．９前後の信頼区間を用いる。
３．次に、選択された変数および係数を記録し、適切な分散分布に関して残渣を検査した。
４．診断に適切なカットオフを探索するため、オッズ比、罹患率（prevalance）補正した陽性適中率（predicted value）および罹患率補正した陰性適中率を、全潜在的カットオフに対して作成して、異なるカットオフにおけるＰＰＶおよびＮＰＶ間のトレードオフ（trade-off）を示すチャートを作成した。これらの目的のため、陽性は、組織学的スケールで＞２．５および定量的銅スケールで＞６００ｍｇ／ｋｇ銅であった。

【0265】

モデル決定において用いる因子の鍵を表２１に示す：

【0266】

【表21】

【0267】

結果
段階的ツールを用いたモデリングは、図８および図９に示す予測関数を生じた。図８は、組織学的銅スコアの段階的モデリングを図解する。図９は、対数定量的銅スコアの段階的モデリングを図解する。

本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
イヌを検査して肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｂ）前記多型（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｃ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１５（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
［２］
試料中のイヌのゲノムにおける、
（ｄ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）および／または
（ｅ）前記多型（ｄ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］
１つまたは複数の多型が、一塩基多型（ＳＮＰ）である、上記［１］または［２］のいずれか一項に記載の方法。
［４］
試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを含む、上記［４］に記載の方法。
［６］
試料中のイヌのゲノムにおける、
（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）、または
（ｂ）ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ８＿４８９２７４３（配列番号１５７）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）およびＣｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）
の有無を検出することを含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型が、多型（ａ）の６８０ｋｂ以内にあり多型（ａ）と同一の染色体上に存在し、多型対間の連鎖不平衡の計算された尺度Ｒ^２が０．５を超えるまたはそれに等しい、上記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
上記［１］に定義されているおよび場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベース。
［９］
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、上記［１］に定義されているおよび場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）データを、上記［１］に定義されているおよび場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定することと
を含む方法。
［１０］
コンピュータシステムにおいて実行される場合、コンピュータシステムに上記［９］に記載のすべてのステップを実施するように指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
［１１］
上記［１０］に記載のコンピュータプログラムおよび上記［８］に記載のデータベースを含むコンピュータ記憶媒体。
［１２］
上記［９］に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、上記［１］に定義されているおよび場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）上記［１］に定義されているおよび場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。
［１３］
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、上記［１］に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型および場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
［１４］
肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定するための、上記［１］に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型および場合により上記［２］から［７］のいずれか一項に定義されている多型から選択される１つまたは複数の多型の使用。
［１５］
肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することについてイヌを選択する方法であって、
・上記［１］から［７］、［９］および［１３］のいずれか一項に記載の方法に従って、候補の第１のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定し、それにより候補の第１のイヌが肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出するのに適するかどうかを決定することと、
・場合により、上記［１］から［７］、［９］および［１３］のいずれか一項に記載の方法に従って、第１のイヌと反対の性の第２のイヌのゲノムが肝臓の銅蓄積に対する感受性を示す１つまたは複数の多型を含むかどうかを決定することと、
・場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性が高い子孫を作出することと
を含む方法。
［１６］
イヌが、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、上記［１］から［７］、［９］、［１３］もしくは［１５］のいずれか一項に記載の方法または上記［１４］に記載の使用。
［１７］
イヌを検査してイヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
［１８］
試料中のイヌのゲノムにおける、（ｃ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）および／または（ｄ）（ｃ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］
試料中のイヌのゲノムにおける、（ｃ）ＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）および／または（ｄ）ＣｈｒＸ＿６３３９７３９３（ＳＮＰ ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ１６＿Ｆ＿４２；配列番号１４３）の有無を検出することを含む、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
イヌを検査して肝臓の銅蓄積に対するイヌの感受性を決定する方法であって、試料中のイヌのゲノムにおける、
（ｅ）Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、ＣｈｒＸ＿１２０８７９７１１（配列番号１４７）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５２６２（配列番号１４９）、Ｃｈｒ１４＿３９４３７５４３（配列番号１５０）、Ｃｈｒ１５＿６２６２５０２４（配列番号１５１）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ２４＿４０１１８３３（配列番号１５３）、Ｃｈｒ１８＿６０８１２１９８（配列番号１５４）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）および染色体位置２２：３１３５２８７におけるＣＧＣＣＣＣリピート、
（ｆ）前記多型（ｅ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型、および／または
（ｇ）Ｃｈｒ３２＿３８９０４５１（配列番号１５６）、Ｃｈｒ８＿４８９２７２３（配列番号１５７）およびＣｈｒ８＿４８８０５１８（配列番号１５８）
から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することをさらに含む、上記［１７］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、ＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）、ＡＴＰ７ａ＿Ｒｅｇ４＿Ｆ＿９（配列番号１３１）、ＵＢＬ５＿Ｒｅｇ１Ｆ＿１６（配列番号１３２）、ｇｏｌｇａ５＿Ｒｅｇ１＿２４（配列番号１３３）、ｇｏｌｇａ５＿２６（配列番号１３４）、ｇｏｌｇａ５＿２７（配列番号１３５）、ｇｏｌｇａ５＿２８（配列番号１３６）、ｇｏｌｇａ５＿２９（配列番号１３７）、ｇｏｌｇａ５＿３０（配列番号１３８）、ｇｏｌｇａ５＿３１（配列番号１３９）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３２（配列番号１４０）、ａｔｐ７ａｒｅｇ１７＿３３（配列番号１４１）およびそれらと連鎖不平衡にある１つまたは複数のＳＮＰから選択される１つまたは複数のＳＮＰの有無を検出することをさらに含む、上記［１７］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
試料中のイヌのゲノムにおける、
ＢＩＣＦ２Ｐ５０６５９５（配列番号１）、ＢＩＣＦ２Ｐ７７２７６５（配列番号２）、ＢＩＣＦ２Ｓ２３３３１８７（配列番号３）、ＢＩＣＦ２Ｐ１３２４００８（配列番号４）、およびＢＩＣＦ２Ｐ５９１８７２（配列番号５）のＳＮＰの有無を検出することを含む、上記［２１］に記載の方法。
［２３］
試料中のイヌのゲノムにおける、
Ｃｈｒ２２＿３１６７５３４（配列番号１４４）、Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）、Ｃｈｒ２０＿５５４６１１５０（配列番号１４６）、Ｃｈｒ１９＿６０７８０８４（配列番号１４８）、Ｃｈｒ３＿８６８３８６７７（配列番号１５２）、Ｃｈｒ１０＿６５２０９９４６（配列番号１５５）およびＣｈｒＸ＿６３３３８０６３（配列番号１４２）の有無を検出することを含む、上記［１７］から［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
多型（ａ）と連鎖不平衡にある多型が、多型（ａ）の６８０ｋｂ以内かつそれと同一染色体上にあり、多型ペア間の連鎖不平衡の計算された尺度Ｒ^２が０．５以上である、上記［１７］から［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
上記［１７］に定義されているおよび場合により上記［１８］から［２４］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベース。
［２６］
イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、上記［１７］に定義されているおよび場合により上記［１８］から［２４］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータをコンピュータシステムに入力することと、
（ｂ）データを、上記［１７］に定義されているおよび場合により上記［１８］から［２４］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型、ならびにそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むコンピュータデータベースと比較することと、
（ｃ）比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定することと
を含む方法。
［２７］
コンピュータシステムにおいて実行される際に、コンピュータシステムに上記［２６］に記載の全ステップを実施するよう指示するプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
［２８］
上記［２８］に記載のコンピュータプログラムと、上記［２５］に記載のデータベースとを含むコンピュータ記憶媒体。
［２９］
上記［２６］に記載の方法を実施するように構成されているコンピュータシステムであって、
（ａ）イヌのゲノムにおける、上記［１７］に定義されているおよび場合により上記［１８］から［２４］のいずれか一項に定義されている１つまたは複数の多型の有無に関するデータを受け取るための手段と、
（ｂ）前記多型およびそれらと肝臓の銅蓄積からのイヌの保護またはそれに対するイヌの感受性との関連に関する情報を含むデータベースと、
（ｃ）データをデータベースと比較するためのモジュールと、
（ｄ）前記比較に基づいて、イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための手段と
を含むコンピュータシステム。
［３０］
イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定する方法であって、イヌのゲノムにおける、（ａ）Ｃｈｒ２２＿３１３５１４４（配列番号１４５）および（ｂ）（ａ）と連鎖不平衡にある１つまたは複数の多型から選択される１つまたは複数の多型の有無を検出することを含む方法。
［３１］
イヌが肝臓の銅蓄積から保護されている可能性を決定するための、上記［１７］に定義されているおよび場合により上記［１８］から［２４］のいずれか一項に定義されている多型の使用。
［３２］
肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出するためのイヌを選択する方法であって、
− 上記［１７］から［２４］、［２６］および［３０］のいずれか一項に記載の方法に従って、第１のイヌ候補のゲノムが、肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定し、これによって第１のイヌ候補が、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫の作出に適しているか決定することと、
− 場合により、第１のイヌとは異なる性別の第２のイヌのゲノムが、上記［１７］から［２４］、［２６］および［３０］のいずれか一項に記載の肝臓の銅蓄積からの保護を示す１つまたは複数の多型を含むか決定することと、
− 場合により、第１のイヌと第２のイヌとを交配して、肝臓の銅蓄積から保護される可能性のある子孫を作出することと
を含む方法。
［３３］
イヌが、ラブラドールレトリーバーの血統を遺伝的に継承している、上記［１７］から［２４］、［２６］、［３０］もしくは［３２］のいずれか一項に記載の方法または上記［３１］に記載の使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]