特許 6231493 Ｐ因子を標的とする抗体のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6231493

(24)【登録日】2017年10月27日

(45)【発行日】2017年11月15日

(54)【発明の名称】Ｐ因子を標的とする抗体のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171106BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20171106BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20171106BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20171106BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20171106BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K16/18ZNA

   C07K16/46

   C12N5/10

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61P27/02

   A61K39/395 N

【請求項の数】24

【全頁数】144

(21)【出願番号】特願2014-548290(P2014-548290)

(86)(22)【出願日】2012年12月17日

(65)【公表番号】特表2015-503909(P2015-503909A)

(43)【公表日】2015年2月5日

(86)【国際出願番号】IB2012057394

(87)【国際公開番号】WO2013093762

(87)【国際公開日】20130627

【審査請求日】2015年12月1日

(31)【優先権主張番号】61/578,458

(32)【優先日】2011年12月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】バルバラ・ブランネッティ

(72)【発明者】

【氏名】ジョイ・ゴッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ウーテ・イェーガー

(72)【発明者】

【氏名】レスリー・ジョンソン

(72)【発明者】

【氏名】キム・ヨンイン

(72)【発明者】

【氏名】クリスチャン・カルステン・ジルヴェスター・クンツ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ログスカ

(72)【発明者】

【氏名】イゴール・スプロウスキー

(72)【発明者】

【氏名】シャ−メイ・リアオ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ステファニダキス

【審査官】 川口 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１１０９１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１１２８５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１８７５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１４８８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２９７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Gupta-Bansal, R., et al.，Inhibition of complement alternative pathway function with antiproperdin monoclonal antibodies，Molecular Immunology，２０００年，37，191-201

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｐ因子と結合する抗体または抗原結合フラグメントであって、
ｍ)配列番号１６９、１７０および１７１にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号１７２、１７３および１７４にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ａ)配列番号１、２および３にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号４、５および６にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｇ)配列番号８５、８６および８７にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号８８、８９および９０にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｈ)配列番号９９、１００および１０１にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号１０２、１０３および１０４にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｉ)配列番号１１３、１１４および１１５にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号１１６、１１７および１１８にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｎ)配列番号１８３、１８４および１８５にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号１８６、１８７および１８８にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｏ)配列番号１９７、１９８および１９９にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号２００、２０１および２０２にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；
ｐ)配列番号２１１、２１２および２１３にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号２１４、２１５および２１６にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；または
ｑ)配列番号２２５、２２６および２２７にそれぞれ示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３および配列番号２２８、２２９および２３０にそれぞれ示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３
を含む、単離抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項2】

それぞれ配列番号１７５および１７６；配列番号７および８；配列番号９１および９２；配列番号１０５および１０６；配列番号１１９および１２０；配列番号１８９および１９０；配列番号２０３および２０４；配列番号２１７および２１８または配列番号２３１および２３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項3】

重鎖可変ドメイン配列が、配列番号７、９１、１０５、１１９、１７５、１８９、２０３、２１７および２３１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項4】

軽鎖可変ドメイン領域が配列番号１７６、８、９２、１０６、１２０、１９０、２０４、２１８または２３２を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項5】

配列番号１７７、９、９３、１０７、１２１、１９１、２０５、２１９または２３３と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖およびさらに配列番号１７８、１０、９４、１０８、１２２、１９２、２０６、２２０または２３４と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載のＰ因子と結合する単離抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項6】

配列番号１７７および１７８、９および１０、９３および９４、１０７および１０８、１２１および１２２、１９１および１９２、２０５および２０６、２１９および２２０または２３３および２３４と少なくとも９０％配列同一性であるアミノ酸配を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項５に記載のＰ因子と結合する単離抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項7】

抗体がヒト抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)_２、ＦｖまたはｓｃＦｖである、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域を含むポリペチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項9】

核酸配列が配列番号１１、９５、１０９、１２３、１７９、１９３、２０７、２２１および２３５から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項８に記載の核酸分子。

【請求項10】

請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域を含むポリペチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項11】

請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合フラグメントの重鎖を含むポリペチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖を含むポリペチドをコードする、単離核酸分子。

【請求項13】

請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはフラグメントをコードするヌクレオチドを含む、単離核酸分子。

【請求項14】

請求項８〜１３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。

【請求項16】

請求項１〜７のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される希釈剤または担体を含む、組成物。

【請求項17】

医薬として使用するための、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項18】

加齢性黄斑変性症処置に使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項19】

代替補体経路阻害に使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項20】

補体介在細胞死阻害に使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項21】

細胞におけるＣ３ｂ形成阻害に使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項22】

細胞における膜侵襲複合体形成阻害に使用するための、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項23】

配列番号１７５に示す重鎖可変ドメイン配列と、配列番号１７６に示す軽鎖可変ドメイン配列とを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項24】

配列番号１７７に示す重鎖と、配列番号１７８に示す軽鎖とを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

発明の背景
加齢性黄斑変性症(ＡＭＤ)は進行性疾患であり、米国で６５歳以上の視力喪失および失明の主原因である。ＡＭＤは読書または運転に必要な高い視力を担う網膜の一部である網膜黄斑に主に影響する。ＡＭＤ患者の大部分はドルーゼンと呼ばれる細胞外網膜沈着物の存在により特徴付けられる疾患の初期段階にある。ドルーゼンは、細胞残骸、炎症メディエータおよび細胞外マトリックス成分の細胞外網膜沈着物である。ＡＭＤの後期は萎縮型または滲出型として顕在化し、いずれも視力喪失と関連する。萎縮型ＡＭＤはまた地図状萎縮としても知られ、眼底検査で網膜色素上皮(ＲＰＥ)喪失の局所領域に対応する明瞭な境界が画定された領域として現れる。滲出型ＡＭＤは脈絡膜の血管新生と関連し、ブルッフ膜の完全性喪失および網膜における血管増殖を起こし、そこでしばしば出血が起こりうる。この漏出は網膜細胞に恒久的な損傷を与え、大量死させ、中心視野における盲点を形成する。

【0002】

先天的ヒト免疫系は補体経路から成る。補体経路は先天的および適応免疫の橋渡しをする化膿性細菌感染に対しての防御として働き、免疫複合体集積物および炎症性傷害を処理する。補体は、血漿および細胞表面におけるカスケード反応に関与する３０を超えるタンパク質の系である。補体系およびその補体成分は種々の免疫過程に関連する。例えば、補体Ｃ５ｂ−９複合体は、終末複合体または膜侵襲複合体(ＭＡＣ)とも呼ばれ、膜透過性損傷を誘発することにより細胞死における重要な役割を果たす。

【0003】

古典的経路、レクチン経路および代替経路の３種の補体活性化経路が知られている。これら３経路は全て、Ｃ３コンバターゼによるＣ３開裂、次いでＣ５コンバターゼによるＣ５開裂を起こし、Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂを遊離する。Ｐ因子は代替補体経路の主要制御因子である。インビボで２つの主用機能を有することが提唱されている。第一に、Ｐ因子は、コンバターゼ酵素のＣ３ｂに結合することによりＣ３およびＣ５コンバターゼを安定化し、それによりＣ３コンバターゼの半減期を延長する。第二に、Ｐ因子は細胞表面へ結合し、コンバターゼが形成できる鋳型として機能することにより溶解される細胞を決定し、代替補体経路の活性化および細胞溶解に至る。

【0004】

最近の研究は、補体成分Ｃ３およびＣ５がＡＭＤの患者のドルーゼンの主要成分であることを証明している(Mulling, R.F. et al. (2000) FASEB J 14, 835-46)。それらの存在ならびにドルーゼンを覆うＲＰＥ細胞における膜侵襲複合体(ＭＡＣ)Ｃ５ｂ−９および他の急性相反応物タンパク質の存在が、補体活性化およびＭＡＣ形成を誘発できる過程に関与すると推測されている(Johnson, L et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896)。それゆえに、補体成分が単なる自然免疫のメディエータ以上のものであることを示す証拠が増え続けている。

【0005】

萎縮型ＡＭＤから滲出型ＡＭＤへの進行阻止のために栄養療法が処方されている。現在まで、ＦＤＡが承認している滲出型ＡＭＤは光線力学治療(ＰＤＴ)、抗ＶＥＧＦアプタマー、例えばペガプタニブおよび抗ＶＥＧＦ抗体、ラニビズマブを含むのみである。これらの薬物または治療は、典型的に既に実質的に視力喪失している患者に投与される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

現在の処置に代わるまたは補うＡＭＤ、特に萎縮型ＡＭＤの有効な処置の開発がまだ必要とされている。特に、視力喪失の早期発見、予防または回復を提供できる処置への必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明の要約
本発明は、ヒトまたはカニクイザルＰ因子に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、該抗体はＴＳＲ５ドメイン(配列番号４０６)と結合する。例えば、ここに記載する抗体または抗原結合フラグメントは配列番号４０７の配列を含むＴＳＲ５ドメインの領域に結合し、より具体的に該抗体はまたアミノ酸配列ＫＳＩＳＣ(配列番号４０８)を含むＰ因子ＴＳＲ５ドメインの領域とも結合する。ある態様において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＰ因子エピトープと結合する。他の態様において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＰ因子エピトープに結合する。

【0008】

ここに記載する単離抗体または抗原結合フラグメントは、Ｐ因子に１.２nM以下のＫＤで結合する。例えば、ここに記載する単離抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトまたはカニクイザルＰ因子と、１.１nM以下、１nM、６００pM以下、５００pM以下、４００pM以下、３００pM以下、２００pM以下、１００pM以下、７５pM以下、５０pM以下、４０pM以下、３０pM以下、２０pM以下または１０pM以下のＫＤで結合し得る。

【0009】

ここに記載する単離抗体および抗原結合フラグメントの結合親和性は、溶液平衡滴定(ＳＥＴ)により決定できる。ＳＥＴの方法は当分野で知られ、詳細は後記する。あるいは、ここに記載する単離抗体またはフラグメントの結合親和性をBiacoreアッセイにより決定できる。Biacore動態アッセイの方法は当分野で知られ、詳細は後記する。

【0010】

ここに記載する単離抗体および抗原結合フラグメントは代替補体経路阻害に使用できる。例えば、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロ溶血アッセイで測定して、２５nM以下、２０nM以下、１６nM以下、１５nM以下、１４nM以下、１３nM以下、１２nM以下、１１nM以下、１０nM以下、９nM以下、８nM以下、７nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。より具体的に、ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロ溶血アッセイで測定して、１６nM以下または９nM以下のＩＣ_５０でヒトにおける代替補体経路を阻害できる。

【0011】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロＣ３ｂ沈着アッセイで測定して、１０nM以下、７nM以下、６nM以下、５nM以下、４nM以下、３nM以下、２nM以下、１nM以下、１５nM以下、１nM以下、０.５nM以下または０.１nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。より具体的に、ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロＣ３ｂ沈着アッセイで測定して、３nM以下または２nM以下のＩＣ_５０でヒトにおける代替補体経路を阻害できる。

【0012】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、補体膜侵襲複合体の沈着により測定して２５nM以下、２０nM以下、１５nM以下、１０nM以下、９nM以下、８nM以下、７nM以下または６nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。より具体的に、ここに記載する単離抗体またはそのフラグメントは、補体膜侵襲複合体の沈着で測定して、２５nM以下または７.５nM以下のＩＣ_５０でヒトにおける代替補体経路を阻害できる。

【0013】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｃ３ａの産生で測定して、８０nM以下、５０nM以下、４５nM以下または３５nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。

【0014】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、ｉＣ３ｂの産生で測定して、８０nM以下、５０nM以下、４５nM以下または３５nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。

【0015】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまたＣ５ａの産生で測定して、８０nM以下、５０nM以下、４５nM以下または３５nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。

【0016】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、Ｃ５ｂの産生で測定して、８０nM以下、５０nM以下、４５nM以下または３５nM以下のＩＣ_５０で代替補体経路を阻害できる。

【0017】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ５ａおよび／またはＣ５ｂの産生減少で測定して、Ｃ３および／またはＣ５コンバターゼの不安定化および／または活性遮断により代替補体経路を阻害できる。

【0018】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、Ｃ５ａの産生を８０nM以下、５０nM以下、４５nM以下または３５nM以下のＩＣ_５０で阻害できる。

【0019】

単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまたＰ因子のＣ３ｂへの結合を遮断および／またはＰ因子が細胞表面またはＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドに結合するのを阻止し得る。

【0020】

本発明の他の面は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはウサギＰ因子と特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。さらなる面において、単離抗体または抗原結合フラグメントは、表１に記載する抗体または抗原結合フラグメントと結合について競合する。

【0021】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ヒトまたはヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントまたはＳｃＦｖフラグメントおよび／またはＩｇＧアイソタイプであり得る。

【0022】

ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまたアミノ酸が抗体フレームワーク内で各ヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列配列から置換されているフレームワークも含む。

【0023】

本発明の他の面は、表１に記載する重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。例えば、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７、ＮＶＳ９６２−Ｇ、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｔ、ＮＶＳ９６２−Ｑ、ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａ、ＮＶＳ９６５−Ｑ、ＮＶＳ９６５−Ｓ、ＮＶＳ９６５−Ｔ、ＮＶＳ８０４、ＮＶＳ８０５、ＮＶＳ８０６、ＮＶＳ８０７またはＮＶＳ８０８の重鎖および軽鎖配列を有し得る。

【0024】

本発明の他の面は、表１に記載するＦａｂの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。例えば、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７、ＮＶＳ９６２−Ｇ、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｔ、ＮＶＳ９６２−Ｑ、ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａ、ＮＶＳ９６５−Ｑ、ＮＶＳ９６５−Ｓ、ＮＶＳ９６５−Ｔ、ＮＶＳ８０４、ＮＶＳ８０５、ＮＶＳ８０６、ＮＶＳ８０７またはＮＶＳ８０８の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有し得る。

【0025】

本発明はまた、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３および２６７から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４および２６８から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５および２６９から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、単離抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトＰ因子に結合する。他の面において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントはさらに配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0026】

本発明はまた、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントｔに関し、ここで、単離抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトＰ因子に結合する。

【0027】

本発明はまた、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有するＰ因子と結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１、２、３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号４、５、６を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１５、１６、１７を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１８、１９、２０を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２９、３０、３１を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号３２、３３、３４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号４３、４４、４５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号４６、４７、４８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号５７、５８、５９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号６０、６１、６２を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号７１、７２、７３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号７４、７５、７６を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号８５、８６、８７を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号８８、８９、９０を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号９９、１００、１０１を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１０２、１０３、１０４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１１３、１１４、１１５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１１６、１１７、１１８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１２７、１２８、１２９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１３０、１３１、１３２を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１４１、１４２、１４３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１４４、１４５、１４６を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１５５、１５６、１５７を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１５８、１５９、１６０を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１６９、１７０、１７１を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１７２、１７３、１７４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１８３、１８４、１８５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号１８６、１８７、１８８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号１９７、１９８、１９９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２００、２０１、２０２を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２１１、２１２、２１３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２１４、２１５、２１６を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２２５、２２６、２２７を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２２８、２２９、２３０を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２３９、２４０、２４１を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２４２、２４３、２４４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２５３、２５４、２５５を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２５６、２５７、２５８を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は配列番号２６７、２６８、２６９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は配列番号２７０、２７１、２７２を含む。

【0028】

本発明の一つの態様において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。他の態様において、単離抗体または抗原結合フラグメントはさらに軽鎖可変ドメイン配列を含み、ここで、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは一体となってＰ因子のための抗原結合を形成する。さらなる態様において単離抗体または抗原結合フラグメントはさらに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ここで、該単離抗体またはその抗原結合フラグメントはＰ因子と結合する。

【0029】

本発明はまた配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、該単離抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトＰ因子と結合する。一つの態様において、単離抗体または抗原結合フラグメントはさらに重鎖可変ドメイン配列を含み、ここで、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは一体となってＰ因子のための抗原結合を形成する。

【0030】

本発明の他の態様において、Ｐ因子と結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号７および８；２１および２２；３５および３６；４９および５０；６３および６４；７７および７８；９１および９２；１０４および１０５；１１８および１１９；１３２および１３３；１４６および１４７；１６０および１６１；１７４および１７５；１８８および１８９；２０２および２０３；２１６および２１７；２３０および２３１；２４４および２４５；２５８および２５９；または２７２および２７３の配列を含む重鎖および軽鎖可変ドメインを含み得る。

【0031】

本発明は、さらに、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、該抗体はＰ因子と結合する。一つの面において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0032】

他の態様において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含み、ここで、該抗体はＰ因子と結合する。

【0033】

他の態様において、Ｐ因子と結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５の配列を含む重鎖を有し得る。さらなる態様において、単離抗体は、また重鎖と一体となってヒトＰ因子への抗原結合部位を形成できる軽鎖も含む。さらなる態様において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６を含む配列を有する軽鎖を含む。

【0034】

本発明は、さらに、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１および２７５から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、該抗体はＰ因子と結合する。一つの面において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントはまた配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２および２７６から成る群から選択される配列と少なくとも９５％配列同一性を有する軽鎖を含む。

【0035】

本発明は、さらに、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１および２７５から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、該抗体はＰ因子と結合する。

【0036】

本発明はまた、ここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物に関し、また薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物に関する。具体的に、本発明は、さらに、例えば抗体ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７、ＮＶＳ９６２−Ｇ、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｔ、ＮＶＳ９６２−Ｑ、ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａ、ＮＶＳ９６５−Ｑ、ＮＶＳ９６５−Ｓ、ＮＶＳ９６５−Ｔ、ＮＶＳ８０４、ＮＶＳ８０５、ＮＶＳ８０６、ＮＶＳ８０７またはＮＶＳ８０８のような表１の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。本発明はまた表１の単離抗体またはその抗原結合フラグメントの２個以上の組み合わせを含む医薬組成物にも関する。

【0037】

本発明はまた、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含むポリペチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。

【0038】

本発明はまた、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択される配列と少なくとも９０％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペチドをコードする配列を含む単離核酸に関する。

【0039】

本発明はまた、ここに記載する核酸分子の１個以上を含むベクターにも関する。

【0040】

本発明はまた、上記抗体の重鎖をコードする組み換えＤＮＡ配列および上記抗体の軽鎖をコードする第二組み換えＤＮＡ配列を含む単離宿主細胞に関し、ここで、該ＤＮＡ配列はプロモータと操作可能に結合し、宿主細胞中で発現できる。抗体がヒトモノクローナル抗体であり得ることが意図される。宿主細胞が非ヒト哺乳動物細胞であり得ることも意図される。

【0041】

本発明はまた補体介在細胞死の阻害方法に関し、ここで、該方法は、細胞をここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量と接触させる過程を含む。細胞がヒト細胞であることが意図される。さらに細胞が対象内にあることが意図される。さらに対象がヒトであることが意図される。

【0042】

本発明は、さらに、細胞における代替補体経路の阻害方法に関し、ここで、該方法は、細胞をここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量と接触させる過程を含む。一つの面において、細胞がヒト細胞であることが意図される。さらに細胞が対象内にあることが意図される。さらに対象がヒトであることが意図される。

【0043】

本発明はまた細胞における膜侵襲複合体の形成阻害方法に関し、ここで、該方法は、細胞をここに記載する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量と接触させる過程を含む。細胞がヒト細胞であることが意図される。さらに細胞が対象内にあることが意図される。さらに対象がヒトであることが意図される。

【0044】

前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。

【0045】

一つの面において、本発明はＰ因子と結合する第一抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＣ５と結合する第二抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該組み合わせは代替補体経路を阻害する。一つの面において、第一および第二抗体は組成物として組み合わせてよい。

【0046】

このような組み合わせは、眼炎症阻止に使用できる。眼炎症は網膜における好中球集積および／またはマクロファージ動員の測定により決定できる。

【0047】

一つの面において、このような組み合わせを網膜における好中球集積または網膜におけるマクロファージ動員の阻害に使用できる。

【0048】

一つの面において、このような組み合わせにおけるＰ因子と結合する抗体は配列番号４０８を含むＰ因子の領域と結合する。あるいはまたは組み合わせにおいて、このような抗体は配列番号４０７を含むＰ因子の領域と結合する。

【0049】

さらなる面において、Ｐ因子およびＣ５と結合する抗体またはその結合フラグメントの組み合わせは、表１から選択される第一抗体または抗原結合フラグメントおよび表２から選択される第二抗体または抗原結合フラグメントを含む。一つの面において、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは表１に記載の抗体と同じエピトープに結合し、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは、表２に記載する抗体と同じエピトープに結合する。

【0050】

一つの面において、本発明は、ａ)それぞれ配列番号１、２および３に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４、５および６に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｂ)それぞれ配列番号１５、１６および１７に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１８、１９および２０に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｃ)それぞれ配列番号２９、３０および３１に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号３２、３３および３４に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｄ)それぞれ配列番号４３、４４および４５に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４６、４７および４８に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｅ)それぞれ配列番号５７、５８および５９に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号６０、６１および６２に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｆ)それぞれ配列番号７１、７２および７３に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号７４、７５および７６に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｇ)それぞれ配列番号８５、８６および８７に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号８８、８９および９０に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｈ)それぞれ配列番号９９、１００および１０１に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１０２、１０３および１０４に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｉ)それぞれ配列番号１１３、１１４および１１５に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１１６、１１７および１１８に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｊ)それぞれ配列番号１２７、１２８および１２９に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１３０、１３１および１３２に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｋ)それぞれ配列番号１４１、１４２および１４３に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１４４、１４５および１４６に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｌ)それぞれ配列番号１５５、１５６および１５７に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１５８、１５９および１６０に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｍ)それぞれ配列番号１６９、１７０および１７１に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１７２、１７３および１７４に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｎ)それぞれ配列番号１８３、１８４および１８５に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号１８６、１８７および１８８に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｏ)それぞれ配列番号１９７、１９８および１９９に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２００、２０１および２０２に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｐ)それぞれ配列番号２１１、２１２および２１３に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２１４、２１５および２１６に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｑ)それぞれ配列番号２２５、２２６および２２７に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２２８、２２９および２３０に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｒ)それぞれ配列番号２３９、２４０および２４１に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２４２、２４３および２４４に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｓ)それぞれ配列番号２５３、２５４および２５５に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２５６、２５７および２５８に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；およびｔ)それぞれ配列番号２６７、２６８および２６９に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号２７０、２７１および２７２に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１、２、３および軽鎖ＣＤＲ１、２、３を含む第一抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは、ａ)それぞれ配列番号４１０、４１１および４１２に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４１３、４１４および４１５に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｂ)それぞれ配列番号４２６、４２７および４２８に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４２９、４３０および４３１に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｃ)それぞれ配列番号４４２、４４３および４４４に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４４５、４４６および４４７に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；ｄ)それぞれ配列番号４２６、４５８および４２８に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４２９、４３０および４５９に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３；およびｅ)それぞれ配列番号４７０、４７１および４７２に示す重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３およびそれぞれ配列番号４７３、４７４および４７５に示す軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１、２、３および軽鎖ＣＤＲ１、２、３を含む。

【0051】

一つの面において、本発明は、第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)に関し、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号７および８；配列番号２１および２２；配列番号３５および３６；配列番号４９および５０；配列番号６３および６４；配列番号７７および７８；配列番号９１および９２；配列番号１０５および１０６；配列番号１１９および１２０；配列番号１３３および１３４；配列番号１４７および１４８；配列番号１６１および１６２；配列番号１７５および１７６；配列番号１８９および１９０；配列番号２０３および２０４；配列番号２１７および２１８；配列番号２３１および２３２；配列番号２４５および２４６；配列番号２５９および２６０；または配列番号２７３および２７４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号４１６および４１７；配列番号４３２および４３３；配列番号４４８および４４９；配列番号４６０および４６１；または配列番号４７６および４７７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む。

【0052】

一つの面において、本発明は、第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)に関し、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号７および８；配列番号２１および２２；配列番号３５および３６；配列番号４９および５０；配列番号６３および６４；配列番号７７および７８；配列番号９１および９２；配列番号１０５および１０６；配列番号１１９および１２０；配列番号１３３および１３４；配列番号１４７および１４８；配列番号１６１および１６２；配列番号１７５および１７６；配列番号１８９および１９０；配列番号２０３および２０４；配列番号２１７および２１８；配列番号２３１および２３２；配列番号２４５および２４６；配列番号２５９および２６０；または配列番号２７３および２７４から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号４１６および４１７；配列番号４３２および４３３；配列番号４４８および４４９；配列番号４６０および４６１；または配列番号４７６および４７７から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む。

【0053】

さらなる面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、(ａ)第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９または２７３を含む重鎖可変領域およびさらに軽鎖可変領域を含み、ここで、該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域は一体となってＰ因子への抗原結合部位を形成し、(ｂ)第二抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４１６、４３２、４４８、４６０または４７６を含む重鎖可変領域およびさらに軽鎖可変領域を含み、ここで、該重鎖可変領域および該軽鎖可変領域は一体となってＣ５への抗原結合部位を形成する。さらなる面において、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０または２７４の軽鎖可変領域配列を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１７、４３３、４４９、４６１または４７７の軽鎖可変領域配列を含む。

【0054】

さらなる面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、(ａ)第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０または２７４を含む軽鎖可変ドメインおよびさらに重鎖可変ドメインを含み、ここで、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは一体となってＰ因子への抗原結合部位を形成し、(ｂ)第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１７、４３３、４４９、４６１または４７７を含む軽鎖可変ドメインを含む軽鎖可変領域およびさらに重鎖可変ドメインを含み、ここで、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは一体となってＣ５への抗原結合部位を形成する。

【0055】

一つの面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、(ａ)第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５の重鎖およびさらに軽鎖を含み、ここで、重鎖および軽鎖は一体となってＰ因子への抗原結合部位を形成し、(ｂ)第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１８、４３４、４５０、４６２または４７８の重鎖およびさらに軽鎖を含み、ここで、重鎖および軽鎖は一体となってＣ５への抗原結合部位を形成する。さらなる面において、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６の軽鎖を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１９、４３５、４５１、４６３または４７９の軽鎖を含む。

【0056】

一つの面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、(ａ)第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６の軽鎖およびさらに重鎖を含み、軽鎖および重鎖は一体となってＰ因子への抗原結合部位を形成し、(ｂ)第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１９、４３５、４５１、４６３または４７９の軽鎖およびさらに重鎖を含み、軽鎖および重鎖は一体となってＣ５への抗原結合部位を形成する。

【0057】

一つの面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖およびさらに配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１８、４３４、４５０、４６２または４７８と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖およびさらに配列番号４１９、４３５、４５１、４６３または４７９と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0058】

さらなる面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖およびさらに配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、第二抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１８、４３４、４５０、４６２または４７８から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖およびさらに配列番号４１９、４３５、４５１、４６３または４７９から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0059】

さらなる面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号９および１０、２３および２４、３７および３８、５１および５２、６５および６６、７９および８０、９３および９４、１０７および１０８、１２１および１２２、１３５および１３６、１４９および１５０、１６３および１６４、１７７および１７８、１９１および１９２、２０５および２０６、２１９および２２０、２３３および２３４、２４７および２４８、２６１および２６２または２７５および２７６と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含み；第二抗体またはその抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号４１８および４１９、４３４および４３５；４５０および４５１；４６２および４６３；または４７８および４７９と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む。

【0060】

さらなる面において、本発明は第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメント(これは組成物として組み合わさっていてよい)を含み、ここで、第一抗体またはその抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号９および１０、２３および２４、３７および３８、５１および５２、６５および６６、７９および８０、９３および９４、１０７および１０８、１２１および１２２、１３５および１３６、１４９および１５０、１６３および１６４、１７７および１７８、１９１および１９２、２０５および２０６、２１９および２２０、２３３および２３４、２４７および２４８、２６１および２６２または２７５および２７６から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含み；第二抗体またはその抗原結合フラグメントはそれぞれ配列番号４１８および４１９、４３４および４３５；４５０および４５１；４６２および４６３；または４７８および４７９から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む。

【0061】

本発明は、さらに、上記第一および／または第二抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。このような核酸配列をベクターに挿入でき、これを続いて、一つの面において、このような核酸配列を発現できる宿主細胞に包含させてよい。

【0062】

本発明は、さらに、対象における加齢性黄斑変性症の処置方法であって、該対象に、第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を単独でまたは組成物として組み合わせて投与することを含む、方法に関する。対象はヒトであり得る。

【0063】

本発明は、さらに、対象における代替補体経路の阻害方法であって、該対象に第一および第二抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を単独でまたは組成物として組み合わせて投与することを含む、方法に関する。対象はヒトであり得る。

【0064】

定義
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は本発明が関与する分野の通常の技術者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

【0065】

ここで使用する用語“抗体”は、全抗体およびその任意の抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または一本鎖を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続した少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３ドメインから成る。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域はＣＬである１ドメインから成る。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれるより保存性の領域に分散した相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる超可変性の領域に細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから成る。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体活性化経路の第一補体(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合を介在し得る。

【0066】

ここで使用する抗体の“抗原結合部分”または“抗原結合フラグメント”なる用語は、ある抗原(例えば、Ｐ因子)と特異的に結合する能力を維持したインタクト抗体の１個以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体のフラグメントにより実施できる。用語“抗体の抗原結合部分”または“抗原結合フラグメント”に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメイン；Ｆ(ａｂ)_２フラグメントから成る一価フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインまたはＶＬドメインから成る一ドメイン抗体(ｄＡｂ)フラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546)；および単離相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。

【0067】

さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされているが、これらは、組み換え方法により、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価分子を形成する、一タンパク質鎖として製造されることを可能とする人工ペプチドリンカーによりあわせることができる(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; and Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体は１個以上の抗体の抗原結合部分またはフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる慣用法を使用して得て、フラグメントを、インタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングする。

【0068】

抗原結合フラグメントはまた一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも含まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136参照)。抗体の抗原結合部分はポリペチドに基づきスキャフォールド、例えばフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)に接木され得る(フィブロネクチンポリペチドモノボディを記載する米国特許番号６,７０３,１９９参照)。

【0069】

抗原結合フラグメントは、直列Ｆｖセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)の対を含む一本鎖分子に包含され、相補的軽鎖ポリペチドと共に、抗原結合領域の対を形成し得る(Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許番号５,６４１,８７０)。

【0070】

ここで使用する用語“親和性”は、一抗原性部位での抗体と抗原の相互作用の強度を意味する。各抗原性部位内で、抗体“アーム”の可変領域は、抗原と多くの部位で弱い非共有結合的力を介して相互作用し、相互作用が多いほど、親和性が強くなる。ここで使用するＩｇＧ抗体またはそのフラグメント(例えば、Ｆａｂフラグメント)に対する“高親和性”なる用語は、標的抗原に対して１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下または１０^−１０ Ｍまたは１０^−１１Ｍ以下または１０^−１２Ｍ以下または１０^−１３Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。しかしながら、高親和性結合は他の抗体アイソタイプで変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する高親和性結合は、１０^−７Ｍ以下または１０^−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。

【0071】

用語“アミノ酸”は、天然に存在するおよび合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を意味する。天然に存在するアミノ酸は遺伝コードによりコードされるもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合したアルファ炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このようなアナログは、修飾されたＲ基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する化合物を意味する。

【0072】

ここで使用する用語“結合特異性”は、個々の抗体結合部位が唯一つの抗原性決定基と反応する能力を意味する。

【0073】

抗体(例えば、Ｐ因子結合抗体)に“特異的に(または選択的に)結合する”なる用語は、タンパク質および他の生物製剤の異種性集団における同族抗原(例えば、ヒトＰ因子またはカニクイザルＰ因子)の存在の決定因である結合反応を意味する。用語“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異性の抗体”は、ここでは用語“抗原に特異的に結合する抗体”と同義に使用する。

【0074】

用語“黄斑変性症と関連する状態または障害”は、例えば、網膜黄斑の細胞の増殖減少、網膜黄斑の細胞の死または再編成増加(例えば、ＲＰＥ細胞)、正常生物学的機能喪失またはこれらの事象の組み合わせの結果、網膜黄斑が変性するかまたは機能障害性となる、あらゆる数の状態を意味する。黄斑変性症は、正常網膜黄斑の細胞および／または細胞外マトリックスの組織構造の完全性喪失および／または網膜黄斑の細胞の機能喪失となる。黄斑変性症関連障害の例は、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、優性ドルーゼンおよびMalattia Leventinese(放射状ドルーゼン)を含む。本用語はまた網膜黄斑機能不全および／または変性前または後に起こる黄斑外変化も包含する。それゆえに、用語“黄斑変性症関連障害”は、また網膜黄斑の完全性または機能を変化または障害させる状態(例えば、ＲＰＥまたはブルッフ膜への損傷)を広く含む。例えば、本用語は網膜剥離、脈絡網膜性変性症、網膜変性症、光受容体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、杆体錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。

【0075】

用語“補体成分”、“補体タンパク質”または“補体成分タンパク質”は、補体系の活性化に関与する分子を意味する。古典的経路成分は、例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＣ５ｂ−９複合体(膜侵襲複合体：ＭＡＣ)を含む。代替経路成分は、例えば、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｈ、因子Ｉおよびプロパージンを含む。

【0076】

用語“補体経路により制御される細胞活動”は、Ｃ５ｂ−９攻撃複合体、血管透過性変化、平滑筋細胞収縮および遊走、Ｔ細胞増殖、免疫粘着性、樹状細胞、単球、顆粒球および血小板の凝集、好中球(ＰＭＮ)およびマクロファージの食作用、遊走および活性化に由来する細胞損傷を含む。

【0077】

さらに、補体経路の活性は、補体経路の副産物が関与する炎症誘発性応答の増加をもたらす。補体経路の活性化と関連する障害は腎炎、喘息、再灌流傷害、血液透析、リウマチ性関節炎、全身性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病、ａＨＵＳ、ＭＰＧＮ IIまたは何らかの他の補体介在疾患を含む。黄斑変性症と関連する障害は、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、ソースビー眼底変性症、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、優性ドルーゼンおよびMalattia Leventinese(放射状ドルーゼン)、網膜黄斑の機能不全および／または変性の前または後に起こる黄斑外変化、網膜剥離、脈絡網膜性変性症、網膜変性症、光受容体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、杆体錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。

【0078】

用語“キメラ抗体”は、(ａ)定常領域またはその部分が抗原結合部位(可変領域)が異なる別のクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域またはキメラ抗体に新規特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと結合するように変更され、置き換えられまたは交換されている；または(ｂ)可変領域またはその部分が異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域に変更され、置き換えられまたは交換されている抗体分子を意味する。例えば、マウス抗体を、その定常領域をヒト免疫グロブリン由来定常領域で置き換えることにより修飾できる。ヒト定常領域での置換により、キメラ抗体は抗原認識におけるその特異性特異性を維持しながら、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性が減少している。

【0079】

用語“Ｐ因子タンパク質”または“Ｐ因子抗原”または“Ｐ因子”は同義に使用し、種々の種のＰ因子タンパク質を意味する。例えば、ヒトＰ因子は表１：配列番号４０１に示す配列を有する。ヒトＰ因子は、Complement Tech, Tyler, TXから得ることができる。カニクイザルＰ因子はカニクイザル血清から精製できる(Nakano et al., (1986) J Immunol Methods 90:77-83から適用させた方法)。他の種由来のＰ因子タンパク質の例を表１、配列番号４０２、４０３、４０４または４０５に示し、Ｐ因子タンパク質結合ドメインおよびフラグメント(例えば：配列番号４０６、４０７または４０８)も同様である。Ｐ因子は当分野で“プロパージン”としても知られる。

【0080】

用語“保存的修飾変異体”はアミノ酸および核酸配列のいずれにも使用する。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸または核酸がアミノ酸配列をコードしないとき本質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸があるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。それゆえに、アラニンがコードにより特定される全ての位置で、該コドンは、コードされるポリペチドを変えることなく、記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸多様性は“サイレント多様性”であり、これは、保存的修飾多様性の１種である。ポリペチドをコードするここでの全ての核酸配列も、核酸の全ての可能なサイレント多様性を記載する。当業者は、核酸における各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外)を修飾して、機能的に同一の分子が得られることを認識する。従って、ポリペチドをコードする核酸の各サイレント多様性は、記載した配列の各々に潜在する。

【0081】

ポリペチド配列に関して、“保存的修飾変異体”は、あるアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸への置換を起こす、ポリペチド配列への個々の置換、欠失または付加を含む。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当分野で周知である。このような保存的修飾変異体は本発明の多型変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。次の８群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１)アラニン(Ａ)、グリシン(Ｇ)；２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；３)アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；４)アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)；５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)；７)セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)；および８)システイン(Ｃ)、メチオニン(Ｍ)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。ある態様において、用語“保存的配列修飾”は、該アミノ酸配列が包含される抗体の結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいうために使用する。

【0082】

用語“エピトープ”は、抗体と特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングから成り、通常特異的三次元構造的特徴、ならびに特異的電荷特徴を有し得る。立体構造的および非立体構造的エピトープは、前者への結合が変性溶媒存在下で無くなるのに対し、後者は違う点で区別される。

【0083】

ここで使用する用語“ヒト抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれもヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域はまたこのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列突然変異型またはヒトフレームワーク配列分析由来のコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロで無作為または部位特異的変異によりまたはインビボで体細胞変異により導入された変異)。

【0084】

用語“ヒトモノクローナル抗体”は、フレームワークおよびＣＤＲ領域のいずれもヒト配列由来である可変領域を有する一結合特異性を示す抗体を意味する。一つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。

【0085】

“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持するが、ヒトで免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持し、抗体の残りの部分をヒト対応物(すなわち、定常領域ならびに可変領域のフレームワーク部分)で置き換えることにより達成できる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; and Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994参照。ヒト工学技術の他の例は、ＵＳ５,７６６,８８６に開示するXoma技術を含むが、これらに限定されない。

【0086】

用語“同一パーセント”または“同一性パーセント”、２個以上の核酸またはポリペチド配列の状況で、同じである２個以上の配列または部分配列を意味する。２個の配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは手動整列および目視により測定して比較ウィンドウまたは指定領域で最大一致について比較し、整列したとき、２個の配列の特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同一であるならば、“実質的に同一”である(すなわち、特定の領域にわたりまたは特定していないとき、全配列にわたり６０％同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性)。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長以上である領域、好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)である領域にわたり存在する。

【0087】

配列比較のために、典型的に１個の配列は参照配列として働き、それに対し試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であるならば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用しても、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算する。

【0088】

ここで使用する“比較ウィンドウ”は、配列を、２個の配列を最適に整列後同数の連続位置の参照配列と比較し得る、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに一般的には約１００〜約１５０から成る群から選択される連続位置の数のいずれか一つのセグメントも意味する。比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970の相同性整列アルゴリズム、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性方法の試験、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)または手動整列および目視(例えば、 Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)参照)により実施できる。

【0089】

配列同一性パーセントおよび配列類似度決定に適切な二つのアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。BLAST解析実施用ソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初にクエリー配列中の短ワード長Ｗの同定により高スコア配列対(ＨＳＰ)を同定し、これは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列したとき、ある正値閾値スコアＴとマッチするかまたは充足する。Ｔは隣接ワードスコア閾値を意味する(Altschul et al., supra)。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの探索を開始するための種として作用する。ワードヒットは累積的整列スコアが増え続ける限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ(整合残基対の報酬スコア；常に＞０)およびＮ(不整合残基のペナルティスコア；常に＜０)を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコア付けマトリクスを使用して、累積的スコアを計算する。各方向でのワードヒット伸長は、累積的整列スコアがその達成した最大価から数Ｘ落ちたとき、累積的スコアが１個以上の負のスコアの残基整列の集積により０以下になったときまたはいずれかの配列末端に達したとき停止する。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、感受性および整列速度を決定する。BLASTＮプログラム(ヌクレオチド配列について)はデフォルトとしてワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３および期待値(Ｅ)１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照)、整列(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。

【0090】

BLASTアルゴリズムはまた２配列間の類似度の統計学的分析も行う(例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993参照)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似度の一つの指標は、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))である。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０.２未満、より好ましくは約０.０１未満および最も好ましくは約０.００１未満であるならば、参照配列と類似であると見なす。

【0091】

２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用する。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(gcg.comのウェブサイトで入手可能)におけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)アルゴリズムを使用して決定できる。

【0092】

上記配列同一性パーセンテージ以外に、２個の核酸配列またはポリペチドが実質的に同一との他の指標は、下記のとおり、第一核酸によりコードされるポリペチドが、第二核酸によりコードされるポリペチドに対して惹起した抗体と免疫学的に交差反応性であることである。それゆえに、ポリペチドは、例えば、２個のペプチドが保存的置換によってのみ異なるとき、第二ポリペチドと典型的に実質的に同一である。２個の核酸配列が実質的に同一である他の指標は、下記のとおり２個の分子またはそれらの補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２個の核酸配列が実質的に同一であるさらに他の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。

【0093】

用語“代替補体経路阻害”は、Ｐ因子抗体が代替補体経路活性化を妨害する能力を意味する。具体的に、“阻害”は、ここに記載する抗Ｐ因子抗体またはそのフラグメントと接触後、対照と比較して、細胞または対象におけるＭＡＣ形成、溶血アッセイまたはＣ３ｂ沈着アッセイを含むここに記載する１個以上のアッセイで測定して、代替補体活性化における統計学的に有意な減少(すなわち、ｐ＜０.０５)を意味する。ここで使用する“代替補体経路阻害”はまた、下記加齢性黄斑変性症と診断された患者における、ここに記載する抗Ｐ因子抗体での処置後の視覚機能または網膜解剖所見における臨床的に関連する改善も意味する。

【0094】

用語“単離抗体”は、異なる抗原性特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する(例えば、Ｐ因子と特異的に結合する単離抗体は、Ｐ因子以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。Ｐ因子と特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、他の抗原と交差反応し得る。さらに、単離抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。

【0095】

用語“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス(例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ)を意味する。アイソタイプはまた、これらのクラスの修飾されたバージョンも言い、修飾はＦｃ機能の変更、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を亢進または減少するために成されている。

【0096】

ここで使用する用語“Ｋ_{ａｓｓｏｃ}”または“Ｋ_ａ”は特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を意味し、一方、ここで使用する用語“Ｋ_ｄｉｓ”または“Ｋ_ｄ”は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。ここで使用する用語“Ｋ_Ｄ”は、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａ比(すなわちＫ_ｄ／Ｋ_ａ)により得られる解離定数を言い、モル濃度(Ｍ)として表す。抗体のＫ_Ｄ値は、当分野で十分確立されている方法を使用して決定できる。抗体のＫ_Ｄを決定する方法は、Biacore^{(登録商標)}システムのようなバイオセンサーシステムの使用による表面プラズモン共鳴の測定または溶液平衡滴定(ＳＥＴ)による溶液中の親和性測定を含む。

【0097】

ここで使用する用語“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”は、一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する一結合特異性および親和性を示す。

【0098】

用語“核酸”は、ここでは用語“ポリヌクレオチド”と同義に使用し、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。本用語は、既知ヌクレオチドアナログまたは修飾された主鎖残基または結合を含み、合成され、天然に存在するおよび天然に存在せず、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝される核酸を意味する。このようなアナログの例は、ホスホロチオエート類、ホスホロアミデート類、メチルホスホネート類、キラル−メチルホスホネート類、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(ＰＮＡ)を含むが、これらに限定されない。

【0099】

特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的修飾変異体(例えば、コドン置換変性)および相補的配列、ならびに明示的に示す配列も潜在的に包含する。具体的に、下記のとおり、コドン置換変性は、１個以上の選択した(または全)コドンの３位が混合残基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成し得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)。

【0100】

用語“操作可能に結合”は、２個以上のポリヌクレオチド(例えば、ＤＮＡ)セグメント間の機能的関係を意味する。典型的に、本用語は転写調節配列と転写配列との機能的関連を意味する。例えば、プロモータまたはエンハンサ配列は、適当な宿主細胞または他の発現系においてコーディング配列の転写を刺激または調節するならば、コーディング配列に操作可能に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合しているプロモータ転写調節配列は、転写配列と物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、ある転写調節配列、例えばエンハンサは、転写を促進するコーディング配列に物理的に連続しているか近接している必要はない。

【0101】

ここで使用する用語、“最適化”は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般的に真核細胞、例えば、ピキア属の細胞、トリコデルマ属の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変えられていることを意味する。最適化ヌクレオチド配列は、“親”配列としても知られる出発ヌクレオチド配列により元々コードされていたアミノ酸配列を完全にまたは最大限残すように操作する。ここでの最適化配列は、哺乳動物細胞で好ましいコドンを有するように改変されている。しかしながら、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化発現もここでは想定される。最適化ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列も最適化と呼ぶ。

【0102】

用語“ポリペチド”および“タンパク質”は、ここでは同義にアミノ酸残基のポリマーをいうために使用する。本用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。特に断らない限り、特定のポリペチド配列はまたその保存的修飾変異体を潜在的に包含する。

【0103】

ここで使用する用語“組み換えヒト抗体”は、組み換え手段により製造、発現、調製または単離された全てのヒト抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離された抗体またはそれらから調製されたハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体およびヒト免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部のスプライシング、他のＤＮＡ配列に対する配列決定を含む他の手段により製造、発現、調製または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を含む。ある態様において、しかしながら、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(またはヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用するとき、インビボ体細胞突然変異誘発)に付し、それゆえに、組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来し、関連はしているものの、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在し得ない配列であり得る。

【0104】

用語“組み換え宿主細胞”(または単に“宿主細胞”)は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図することは理解されるべきである。変異または環境的要因により後代である修飾が起こり得るため、このような子孫は、実際親細胞とは同一ではないかもしれないが、なおここで使用する用語“宿主細胞”の範囲には包含される。

【0105】

用語“対象”はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は全ての脊椎動物(例えば：哺乳動物および非哺乳動物)、例えば、非ヒト霊長類(例えば：カニクイザル)、ヒツジ、イヌ、ウシ、トリ、両生類および爬虫類を含む。示していない限り、用語“患者”または“対象”はここでは同義に使用する。ここで使用する用語“cyno”または“カニクイザル”はカニクイザル(Macaca fascicularis)を意味する。

【0106】

ここで使用する何らかの疾患または障害(すなわち、ＡＭＤ)を“処置する”または“処置”なる用語は、一つの態様において、疾患または障害の改善(すなわち、疾患またはその症状の少なくとも一つの進行の遅延または停止または減少)を意味する。他の態様において、“処置”または“処置する”は、患者により認識し得ないものを含む身体的パラメータの少なくとも１個の軽減または回復を意味する。さらに別の態様において、“処置”または“処置する”は、疾患または障害の、身体的(例えば、認識できる症状の安定化)、生理学的(例えば、身体的パラメータの安定化)のいずれか、または両者の調節を意味する。さらに別の態様において、“処置”または“処置する”は、疾患または障害の予防または発症または進展または進行の遅延を意味する。“予防”は、ＡＭＤに関連する限り、悪化の危険性のある患者における、下記視覚機能、網膜解剖所見および／またはＡＭＤ疾患パラメータの悪化の予防または遅延をする何らかの作用を意味する。より具体的に、ＡＭＤの“処置”は、視覚機能および／または局所解剖所見の改善または保存をもたらす何らかの作用を意味する。疾患の処置および／または予防の評価方法は当分野で知られ、下に記載する。

【0107】

用語“ベクター”は、結合されている他のポリヌクレオチドの輸送ができるポリヌクレオチド分子をいうことを意図する。ベクターの一つのタイプは“プラスミド”であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のタイプのベクターはアデノ随伴ウイルスベクター(ＡＡＶまたはＡＡＶ２)のようなウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートし得る。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内で自律増殖可能である(例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合でき、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、操作可能に結合した遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターはここでは“組み換え発現ベクター”(または単に“発現ベクター”)と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同義に使用してよい。しかしながら、本発明は、同様の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のようなこのような他の形態の発現ベクターも含むことを意図する。

【図面の簡単な説明】

【0108】

【図1】Ｐ因子結合部位を記載する。図１Ａは、相対位置Ｐ因子のＴＳＲ５ドメインおよびＴＳＲ５配列フラグメント：Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを説明する。図１Ｂは、マウス配列と整列させたヒトＴＳＲ５配列を示す。括弧はＴＳＲ５の配列フラグメントを示す。図１Ｃは、ＴＳＲ５の領域Ｂに結合した抗体を説明する。

【図2】２０％ヒト血清における代替補体経路阻害を証明する溶血アッセイの結果を示す。

【図3】図２に記載する溶血アッセイのデータから作成したアイソボログラムを示す。

【図4】抗因子Ｐおよび抗Ｃ５抗体単独および組み合わせでの阻害を比較する、マウスポリ−ＩＣモデルにおけるマクロファージ浸潤の阻害％を示す。

【図5】図４に記載するポリ−ＩＣ結果のデータから作成したアイソボログラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0109】

詳細な記載
本発明は、一部、ヒトおよびカニクイザルＰ因子の両方に特異的に結合する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧ形態抗体ならびにＦａｂフラグメントのようなその抗原結合フラグメント(例えば、抗体ＮＶＳ９６５−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ８０４およびＮＶＳ８０７参照)の両者に関する。

【0110】

したがって、本発明は、Ｐ因子(例えば、ヒトＰ因子、カニクイザルＰ因子、ラットＰ因子、ウサギＰ因子)と特異的に結合する抗体、医薬組成物、製造方法およびこのような抗体および組成物の使用方法を提供する。

【0111】

Ｐ因子抗体および抗原結合フラグメント
本発明は、Ｐ因子に特異的に結合する抗体を提供する。ある態様において、本発明は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはウサギＰ因子と特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例に記載するとおりに単離されたヒトモノクローナル抗体およびＦａｂｓを含むが、これらに限定されない。

【0112】

本発明は、Ｐ因子タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と特異的に結合する抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９または２７３のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本発明はまたＰ因子タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、ここで、抗体は下記表１に挙げるＶＨ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、Ｐ因子タンパク質と特異的に結合する抗体(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)を提供し、ここで、抗体は、１個、２個、３個またはそれ以上の下記表１に挙げるＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む(またはあるいは、これらから成る)。

【0113】

本発明は、Ｐ因子タンパク質と特異的に結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０または２７４のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまたＰ因子タンパク質と特異的に結合する抗体(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)を提供し、該抗体は、下記表１に挙げるＶＬ ＣＤＲのいずれか一つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。特に、本発明はＰ因子タンパク質と特異的に結合する抗体(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)を提供し、該抗体は、１個、２個、３個またはそれ以上の下記表１に挙げるＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む(またはあるいは、これらから成る)。

【0114】

他の本発明の抗体は、変異されているが、なおＣＤＲ領域において表１に記載する配列に示すＣＤＲ領域と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０または９５％同一性を有するアミノ酸を含む。ある態様において、表１に記載する配列に示すＣＤＲ領域と比較したとき、ＣＤＲ領域において１個、２個、３個、４個または５個までのアミノ酸が変異されている、変異体アミノ酸配列を含む。

【0115】

本発明はまた、Ｐ因子タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞での発現について最適化できる(例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の最適化核酸配列を示す)。

【0116】

【表1】

【表2】

【0117】

【表3】

【表4】

【0118】

【表5】

【表6】

【0119】

【表7】

【表8】

【0120】

【表9】

【表10】

【0121】

【表11】

【表12】

【0122】

【表13】

【表14】

【0123】

【表15】

【表16】

【0124】

【表17】

【表18】

【0125】

【表19】

【表20】

【0126】

【表21】

【表22】

【0127】

【表23】

【表24】

【0128】

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【表26】

【0129】

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【表28】

【0130】

【表29】

【表30】

【0131】

【表31】

【表32】

【0132】

【表33】

【表34】

【0133】

【表35】

【表36】

【0134】

【表37】

【表38】

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【表39】

【表40】

【0136】

【表41】

【表42】

【0137】

【表43】

【表44】

【0138】

【表45】

【表46】

【0139】

【表47】

【表48】

【0140】

【表49】

【表50】

【0141】

【表51】

【表52】

【0142】

【表53】

【表54】

【0143】

【表55】

【表56】

【0144】

【表57】

【表58】

【0145】

【表59】

【表60】

【0146】

【表61】

【表62】

【0147】

【表63】

【表64】

【0148】

【表65】

【表66】

【0149】

【表67】

【表68】

【0150】

【表69】

【0151】

他の本発明の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、なお、表１に記載する配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％同一性を有するものを含む。ある態様は、表１に記載する配列に示す可変領域と比較して可変領域において１個、２個、３個、４個または５個までのアミノ酸が変異しているが、実質的に同じ抗原結合活性を維持する変異体アミノ酸配列を含む。

【0152】

これらの抗体の各々がＰ因子と結合できるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列(アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列)は、本発明の他のＰ因子結合抗体を調製するために“混合および整合”させ得る。このような“混合および整合”したＰ因子結合抗体を、当分野で知られた結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例セクションに記載する他のアッセイ)を使用して試験できる。これらの鎖を混合および整合するとき、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えなければならない。同様に特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と置き換えなければならない。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えなければならない。同様に特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えなければならない。従って、一つの面において、本発明は、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合領域を提供し、ここで、抗体はＰ因子(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と特異的に結合する

【0153】

他の面において、本発明は、(ｉ)配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１および２７５から成る群から選択される哺乳動物細胞での発現について最適化されているアミノ酸配列を含む完全長重鎖および配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２および２７６から成る群から選択される哺乳動物細胞での発現について最適化されているアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離抗体；または(ii)その抗原結合部分を含む機能的タンパク質を提供する。

【0154】

ここで使用する用語“相補性決定領域”および“ＣＤＲ”は、抗原特異性および結合親和性に関与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を意味する。一般に、各重鎖可変領域に３個のＣＤＲ(ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域に３個のＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３)がある。

【0155】

あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia” numbering scheme)に記載のものを含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定できる。

【0156】

例えば、Kabat下で、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のＣＤＲアミノ酸残基は３１−３５(ＨＣＤＲ１)、５０−６５(ＨＣＤＲ２)および９５−１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ；軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)のＣＤＲアミノ酸残基は２４−３４(ＬＣＤＲ１)、５０−５６(ＬＣＤＲ２)および８９−９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。Chothia下、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は２６−３２(ＨＣＤＲ１)、５２−５６(ＨＣＤＲ２)および９５−１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けられ；ＶＬのアミノ酸残基は２６−３２(ＬＣＤＲ１)、５０−５２(ＬＣＤＲ２)および９１−９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けられる。KabatおよびChothiaのＣＤＲ定義を組み合わせて、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおいてアミノ酸残基２６−３５(ＨＣＤＲ１)、５０−６５(ＨＣＤＲ２)および９５−１０２(ＨＣＤＲ３)およびヒトＶＬにおいてアミノ酸残基２４−３４(ＬＣＤＲ１)、５０−５６(ＬＣＤＲ２)および８９−９７(ＬＣＤＲ３)から成る。

【0157】

他の面において、本発明は、表１に記載する重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはこれらの組み合わせを含むＰ因子結合抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３または２６７に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４または２６８に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５または２６９に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６または２７０に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７または２７１に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８または２７２に示す。これらのＣＤＲ領域はKabatシステムを使用して描かれる。

【0158】

あるいは、Chothiaシステム(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)を使用して規定して、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９または３９５に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０または３９６に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１または３９７に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２または３９８に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３または３９９に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４または４００に示す。

【0159】

これらの抗体の各々がＰ因子と結合し、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域により提供されることを考慮して、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列を“混合および整合”させ得る(すなわち、異なる抗体のＣＤＲを混合および整合できるが、各抗体は、好ましくは本発明の他ののＰ因子結合分子を調製するＶＨ ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含む)。このような“混合および整合”したＰ因子結合抗体を、当分野で知られ、実施例に記載した結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡｓ、ＳＥＴ、Biacore)を使用して試験できる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換えなければならない。同様にＶＬ ＣＤＲ配列を混合および整合するとき、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列置き換えなければならない。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、本発明のモノクローナル抗体についてここに示すＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列で１個以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を置換することにより調製できることは当業者には認識される。前記に加えて、一つの態様において、ここに記載する抗体の抗原結合フラグメントは、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３またはＶＬ ＣＤＲ １、２および３を含むことができ、ここで、フラグメントは、一可変ドメインとしてＰ因子に結合する。

【0160】

本発明のある態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載するＦａｂｓの重鎖および軽鎖配列を有し得る。より具体的に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７、ＮＶＳ８０５、ＮＶＳ８０６、ＮＶＳ８０７、ＮＶＳ８０８、ＮＶＳ８０９、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｑ、ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａ、ＮＶＳ９６２−Ｇ、ＮＶＳ９６２−Ｔ、ＮＶＳ９６５−Ｓ、ＮＶＳ９６５−ＴまたはＮＶＳ９６５−Ｑの重および軽配列を有し得る。

【0161】

本発明の他の態様において、Ｐ因子と特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、Kabatにより規定され、表１に記載する重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２および軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。本発明のさらに別の態様において、Ｐ因子と特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、Chothiaにより規定され、表１に記載する重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２および軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

【0162】

具体的態様において、本発明は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号４３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号４５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号４８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号５７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号５９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号７１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号７３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号７６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号８５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号８７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号８８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号９０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号９９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１００の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１０１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１０２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１０４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１１３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１１５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１１６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１１８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１２７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１２９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１３１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１３２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１４４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１４６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１５５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１５６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１５８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１５９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１６０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１６９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１７２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１７４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１８３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１８８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号１９７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２００の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２０１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２０２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２１１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２１３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２１６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２２５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２２７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２３０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２３９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２４１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２４２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２４４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２５３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２５５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２５６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２５８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２６７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２６９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２７０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２７１を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。

【0163】

他の具体的態様において、本発明は、配列番号２８１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２８２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２８３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２８４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２８５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２８６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２８７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２８８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２８９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２９０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２９１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２９２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２９３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２９４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２９５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２９６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２９７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２９８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号２９９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３００の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３０１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３０２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３０３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３０４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３０５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３０６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３０７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３０８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３０９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３１０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３１１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３１２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３１３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３１４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３１５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３１６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３１８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３２２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３２３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３２５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３２６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３２７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３２８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３２９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３３１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３３２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３３４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３３５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３３７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３３８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３３９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３４０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３４１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３４３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３４４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３４６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３４７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３４９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３５１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３５２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３５３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３５４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３５５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３５６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３５７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３５８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３５９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３６１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３６２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３６４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３６５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３６７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３６８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３６９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３７０を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３７１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３７３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３７４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３７６を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３７７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３７９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３８０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３８１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３８２を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３８３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３８４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３８５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３８６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３８７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３８８を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３８９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３９０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３９１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３９２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３９３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３９４を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。他の具体的態様において、本発明は、配列番号３９５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３９６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３９７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３９８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３９９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号４００を含むＰ因子と特異的に結合する抗体を含む。

【0164】

ある態様において、本発明は、表１に記載するＰ因子と特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを含む。好ましい態様において、Ｐ因子と結合する抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂ ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７、ＮＶＳ８０４、ＮＶＳ８０５、ＮＶＳ８０６、ＮＶＳ８０７、ＮＶＳ８０８、ＮＶＳ８０９、ＮＶＳ９６２−Ｓ、ＮＶＳ９６２−Ｑ、ＮＶＳ９６２−Ｇ、ＮＶＳ９６２−Ｔ、ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａ、ＮＶＳ９６５−Ｔ、ＮＶＳ９６５−ＱまたはＮＶＳ９６５−Ｓである。

【0165】

ここで使用するヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるならば、特定の生殖系列配列の“産物である”またはこれに“由来する”重鎖または軽鎖可変領域または完全長重鎖または軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫化するかまたはファージ上に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを目的の抗原についてスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはこれに“由来する”ヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い(すなわち、最大％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の“産物である”またはこれに“由来する”ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を有し得る。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択したヒト抗体は、典型的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト抗体をヒトと同定するアミノ酸残基を含む。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。典型的に、組み換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０個を超えないアミノ酸差異を示す。ある場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と５個を超えないまたは４個、３個、２個または１個を超えないアミノ酸差異を示し得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の例は、下記可変ドメイン生殖系列フラグメント、ならびにＤＰ４７およびＤＰＫ９を含む。

【0166】

相同抗体
さらに別の態様において、本発明は、表１に記載する配列と相同であるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、抗体はＰ因子タンパク質(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と結合し、所望の表１に記載する抗体の機能的特性を維持する。

【0167】

例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその機能的抗原結合フラグメントを提供し、ここで、重鎖可変ドメインは配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；そして、抗体はＰ因子(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と特異的に結合する。

【0168】

他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。他の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５アミノ酸位置のアミノ酸置換以外同一であり得る。表１に記載するＶＨおよびＶＬ領域のものと高い(すなわち、８０％以上)同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、それぞれ配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９または２７３および配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０または２７４をコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発)、その後のここに記載する機能的アッセイを使用するコードされた改変された抗体の残存機能についての試験により得ることができる。

【0169】

他の態様において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。配列番号：９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５のいずれかの完全長重鎖および配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６のいずれかの完全長軽鎖と高い(すなわち、８０％以上)同一性を有する完全長重鎖および完全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペチドをコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的またはＰＣＲ介在突然変異誘発)、その後のここに記載する機能的アッセイを使用するコードされた改変された抗体の残存機能についての試験により得ることができる。

【0170】

他の態様において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示す配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。

【0171】

他の態様において、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、表１に示す配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。

【0172】

ここで使用する、２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適整列のために導入する必要がある、ギャップ数およびギャップ長を考慮に入れた、これらの配列により共有される同一位置の数の関数(すなわち、％同一性は同一位置数／位置の総数×１００である)である。２配列間の配列比較および同一性パーセント決定は、下記非限定的例に記載する数学的アルゴリズムを使用して達成できる。

【0173】

これに加えてまたはこれ以外に、本発明のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列を同定するための、公的データベースに対する検索を実施するための“クエリー配列”として使用できる。例えば、このような検索はAltschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。

【0174】

保存的修飾を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１個以上がここに記載する抗体またはその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を有し、該抗体は、本発明のＰ因子結合抗体の所望の機能的特性を維持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３および２６７およびその保存的修飾体からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４および２６８およびその保存的修飾体からなる群から選択され；重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５および２６９およびその保存的修飾体からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０およびその保存的修飾体からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１およびその保存的修飾体からなる群から選択され；軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２およびその保存的修飾体からなる群から選択され；そして抗体またはその抗原結合フラグメントはＰ因子に特異的に結合する。

【0175】

他の態様において、本発明の抗体は、哺乳動物細胞での発現について最適化され、完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を有し、ここで、これらの配列の１個以上はここに記載する抗体に基づく特定したアミノ酸配列またはその保存的修飾体を有し、該抗体は、本発明のＰ因子結合抗体の所望の機能的特性を維持する。したがって、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖から成る哺乳動物細胞での発現について最適化された単離抗体を提供し、ここで、完全長重鎖は配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１および２７５およびその保存的修飾体から成る群から選択されるアミノ酸配列を有し；完全長軽鎖は配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２および２７６およびその保存的修飾体から成る群から選択されるアミノ酸配列を有し；そして、抗体はＰ因子(例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子)と特異的に結合する。

【0176】

同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載するＰ因子結合抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。それゆえに、さらなる抗体は、Ｐ因子結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合(例えば、統計学的に有意な方法での結合の競合的阻害)する能力に基づき同定できる(例えば実施例に記載のもの)。試験抗体が本発明の抗体のＰ因子タンパク質への結合を阻害する能力は、試験抗体がＰ因子への結合について抗体と競合できる能力を証明し、このような抗体は、理論に縛られないが、Ｐ因子タンパク質上の競合する抗体と同じまたは関連(例えば、構造的に類似または空間的に近位)エピトープに結合する。ある態様において、Ｐ因子上の本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体はここに記載するとおり製造および単離できる。ここで使用する抗体は、等モル濃度の競合抗体存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＰ因子結合を５０％を超えて阻害するとき、結合について“競合”する。

【0177】

他の態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、Ｐ因子のトロンボスポンジンタイプ５反復(ＴＳＲ５)ドメイン(配列番号４０６)と結合する。他の態様において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０７を含むＰ因子ＴＳＲ５ドメインの領域と結合する。さらに他の態様において、該領域は配列番号４０８を含む。

【0178】

本発明の他の態様において、単離抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０７を含むエピトープと結合し、他の態様において、エピトープは配列番号４０８を含む。本発明の他の態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４０７のペプチドと結合し、さらに他の態様において、Ｐ因子エピトープは配列番号４０８を含む。

【0179】

操作および修飾抗体
本発明の抗体は、さらに、ここに示すＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上を有する抗体を出発物質として使用して、修飾抗体を設計し、その修飾抗体は出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１個以上のＣＤＲ領域および／または１個以上のフレームワーク領域内の１個以上の残基の修飾により操作し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基の修飾により操作してよい。

【0180】

実施できる可変領域操作の一つのタイプはＣＤＲ移植である。抗体は、標的抗原と主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)に位置するアミノ酸残基を介して相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも抗体毎により多様性である。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した特異的天然に存在する抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの構築により、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327;Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525;Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許番号５,２２５,５３９およびQueen et al.の米国特許番号５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)

【0181】

したがって、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３および２６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４および２６８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５および２６９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；およびそれぞれ配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。それゆえに、このような抗体はモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る

【0182】

あるいは、本発明の他の態様は、それぞれ配列番号２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９および３９５から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０および３９６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；配列番号２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１および３９７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；およびそれぞれから成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；配列番号２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３および３９９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；および配列番号２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４および４００から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。それゆえに、このような抗体はモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る

【0183】

このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースまたは公表された刊行物から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は“VBase”ヒト生殖系列配列データベース(mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseのワールドワイドウェブから入手可能)、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836に見ることができ；これらの内容は、本明細書に引用により明示的に包含させる。

【0184】

本発明の抗体で使用するためのフレームワーク配列の例は、選択した本発明の抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列をフレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域に移植できまたはＣＤＲ配列を生殖系列配列と比較して１個以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合には抗体の抗原結合能力の維持または亢進のためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有利であることが判明している(例えば、Queen et al.の米国特許番号５,５３０,１０１；５,５８５,０８９；５,６９３,７６２および６,１８０,３７０参照)。ここに記載する抗体および抗原結合フラグメントを建設するためのスキャフォールドとして利用できるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２およびＶｋ２を含むが、これらに限定されない。さらなるフレームワークは当分野で知られ、例えば、vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1のワールドワイドウェブ上のvBaseデータベースに見ることができる。

【0185】

したがって、本発明の態様は、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９および２７３から成る群から選択されるアミノ酸配列またはこのような配列のフレームワーク領域内に１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびさらに配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０および２７４から成る群から選択されるアミノ酸配列またはこのような配列のフレームワーク領域内に１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む単離Ｐ因子結合抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0186】

他のタイプの可変領域修飾は、“親和性成熟”として知られる、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより目的の抗体の１個以上の結合特性(例えば、親和性)を改善させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ介在突然変異誘発を変異の導入のために行ってよく、目的の抗体結合または他の機能的特性に対する影響をここに記載するおよび実施例に提供するインビトロまたはインビボアッセイで評価できる。保存的修飾(上記のとおり)を導入できる。変異はアミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的にＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個を超えない残基を変更する。

【0187】

したがって、他の態様において、本発明は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３および２６７または配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３または２６７と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域；配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４および２６８または配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４または２６８と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５および２６９または配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５または２６９と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０または配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６または２７０と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１または配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７または２７１と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域；および配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２または配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８または２７２と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域から成る単離Ｐ因子結合抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0188】

したがって、他の態様において、本発明は、配列番号２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９および３９５または配列番号２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９または３９５と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域；配列番号２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０および３９６または配列番号２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０または３９６と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域；配列番号２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１および３９７または配列番号２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１または３９７と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域；配列番号２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２および３９８または配列番号２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２または３９８と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域；配列番号２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３および３９９または配列番号２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３または３９９と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域；および配列番号２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４および４００または配列番号２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４または４００と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域から成る単離Ｐ因子結合抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0189】

抗体フラグメントの代替的フレームワークまたはスキャフォールドへの移植
得られたポリペチドがＰ因子と特異的に結合する少なくとも１個の結合領域を含む限り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドを用いることができる。このようなフレームワークまたはスキャフォールドはヒト免疫グロブリンの５個の主用なイディオタイプまたはそのフラグメントを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。新規フレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントは当業者により発見および開発され続けている。

【0190】

一つの面において、本発明は、本発明のＣＤＲが移植できる非免疫グロブリンスキャフォールドを使用する非免疫グロブリンに基づく抗体の製造方法に関する。現在または将来的に知られる非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドを、標的Ｐ因子タンパク質に特異的な結合領域を含む限り、用い得る。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドは、フィブロネクチン(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小モジュラー免疫薬(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、プロテインＡ(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン(ガンマ結晶またはユビキチン)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)を含むが、これらに限定されない。

【0191】

フィブロネクチンスキャフォールドはフィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブロネクチンIII型の第１０モジュール(^１０Ｆｎ３ドメイン))に基づく。フィブロネクチンIII型ドメインは、７個または８個のベータ鎖を有し、これは２個のベータシートに分散し、これ自体互いに包装されて、タンパク質のコアを形成し、さらにループ(ＣＤＲに類似)を含み、これはベータ鎖を互いに連結し、溶媒に晒される。ベータシートサンドイッチの各端に少なくとも３個のこのようなループがあり、ここで、該端はベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である(ＵＳ６,８１８,４１８参照)。これらのフィブロネクチンに基づくスキャフォールドは免疫グロブリンではないが、全体的折り畳みは、ラクダおよびラマＩｇＧにおける全抗原認識単位を含む重鎖の可変領域である、最小機能的抗体フラグメントのものと密接に関連する。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、自然に近い抗原結合特性および抗体の親和性を模倣する。これらのスキャフォールドは、インビボの抗体親和性成熟の過程に類似するインビトロでのループ無作為化およびシャフリング方法に使用できる。これらのフィブロネクチンに基づく分子をスキャフォールドとして使用でき、そこで、分子のループ領域を標準的クローニング技術を使用して本発明のＣＤＲに置き換えることができる。

【0192】

アンキリン方法は、アンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質を、異なる標的への結合に使用できる可変領域を担持するスキャフォールドとして使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α螺旋およびβターンから成る３３アミノ酸ポリペチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用してほとんど最適化される。

【0193】

アビマーは天然Ａドメイン含有タンパク質、例えばＨＥＲ３由来である。これらのドメインは、本来タンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトに置いて２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合する多くの異なる“Ａドメイン”モノマー(２−１０)から成る。アビマーは、例えば、米国特許出願公開２００４０１７５７５６；２００５００５３９７３；２００５００４８５１２；および２００６０００８８４４に記載する方法を使用して、標的抗原に結合できるように調製できる。

【0194】

アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１個のスキャフォールドに基づく３螺旋束から成る小さく、単純なタンパク質である。プロテインＡは黄色ブドウ球菌である細菌由来の表面タンパク質である。このスキャフォールドドメインは５８アミノ酸から成り、そのうち１３個は無作為化されて、多数のリガンド変異体と共にアフィボディライブラリーを産生する(例えば、ＵＳ５,８３１,０１２参照)。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０kDaである抗体の分子量と比較して、６kDaの分子量を有する。サイズが小さいにも係らず、アフィボディ分子の結合部位は抗体のものに類似する。

【0195】

アンチカリンはPieris ProteoLab AG社により開発された製品である。リポカリンに由来し、通常化学的に感受性のまたは不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵する、小さく、堅牢なタンパク質のどこにでもある群である。数種の天然リポカリンはヒト組織または体液に生じる。タンパク質構造は免疫グロブリンを案じし、強固なフレームワークの頂上に超可変ループがある。しかしながら、抗体またはそれらの組み換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基の一ポリペチド鎖からなり、一免疫グロブリンドメインよりほんのわずかだけ大きい。結合ポケットを形成する４個のループの組は明白な構造的可塑性を示し、多様な側鎖を許容する。結合部位は、それゆえに、高親和性および特異性で異なる形の処方標的分子を認識するために、独自の工程で再形成され得る。リポカリンファミリーの１タンパク質であるPieris Brassicaeのビリン結合タンパク質(ＢＢＰ)は、４個のループの組の突然変異誘発によりアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンを記載する特許の一例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９９１６８７３である。

【0196】

アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性のために設計された小非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリン分子を２個のライブラリーから極めて迅速に選択でき、その各々は異なるヒト由来スキャフォールドタンパク質に基づく。アフィリン分子は免疫グロブリンタンパク質に対する構造的相同性を示さない。現在、２種のアフィリンスキャフォールドが用いられ、その一方はヒト構造的眼水晶体タンパク質であるガンマ結晶であり、他方は“ユビキチン”スーファーファミリータンパク質である。両ヒトスキャフォールドとも極めて小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほとんど耐性である。この高安定性は主にタンパク質のベータシート構造の伸長による。ガンマ結晶由来タンパク質の例はＷＯ２００１０４１４４に記載させ、“ユビキチン様”タンパク質の例はＷＯ２００４１０６３６８に記載される。

【0197】

タンパク質エピトープ模倣物(ＰＥＭ)は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する主二次構造であるタンパク質のベータハルピン二次構造を模倣する中程度のサイズの、環状、ペプチド様分子(ＭＷ １〜２kDa)である。

【0198】

本発明は、Ｐ因子タンパク質と特異的に結合する完全なヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＰ因子結合抗体は、ヒト対象に投与したとき、抗原性がさらに低減されている。

【0199】

ラクダ科抗体
新世界メンバー、例えばラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)を含むラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)ファミリーのメンバーから得た抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象への抗原性について特徴づけされている。哺乳動物のこのファミリー由来のある種のＩｇＧ抗体は生来軽鎖を欠き、それゆえに、他の動物由来の抗体の２個の重鎖および２個の軽鎖の典型的４鎖四次構造と構造的に区別されることが判明している。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４(１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７８)参照。

【0200】

ＶＨＨとして同定される小さな一可変ドメインであるラクダ科抗体の領域は、標的に対して高親和性を有する小タンパク質を産生するために遺伝子操作することにより得ることができ、“ラクダ科ナノボディ”として知られる低分子量抗体由来タンパク質をもたらす。１９９８年６月２日発行の米国特許番号５,７５９,８０８参照；またStijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; and Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの操作されたライブラリーは、例えば、Ablynx、Ghent、Belgiumから商業的に入手可能である。非ヒト起源の他の抗体と同様、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を組み換えにより変更して、ヒト配列をより密接に模倣する配列を得ることができ、すなわち、ナノボディを“ヒト化”できる。こうして、ラクダ科抗体のヒトに対する天然の低抗原性をさらに減らすことができる。

【0201】

ラクダ科ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の１／１０の分子量であり、タンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことによる一つの結果は、ラクダ科ナノボディが大型抗体タンパク質で機能的に探知されない抗原性部位に結合する能力であり、すなわち、ラクダ科ナノボディは古典的免疫学的技術を使用して他の場合には隠れている抗原を検出する試薬としておよび可能な治療剤として有用である。それゆえに、サイズが小さいことによる別の結果は、ラクダ科ナノボディが標的タンパク質の溝または狭い隙間における特異的部位への結合の結果阻害でき、それ故に古典的抗体よりも古典的低分子量剤の機能をより模倣した能力において役立ち得ることである。

【0202】

低分子量および小型サイズにより、さらに、ラクダ科ナノボディは極めて熱安定であり、厳しいｐＨおよびタンパク分解消化に安定であり、抗原性が低い。他の結果は、ラクダ科ナノボディが循環系から組織に容易に移動し、血液脳関門すら通過し、神経組織に影響する障害を処置できることである。ナノボディはさらに血液脳関門を通過する薬物輸送を促進できる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願２００４０１６１７３８参照。これらの特性は、ヒトへの低抗原性と組み合わさって、大きな治療可能性を示す。さらに、これらの分子は原核細胞、例えば大腸菌で完全に発現でき、バクテリオファージと融合タンパク質で発現され、機能的である。

【0203】

従って、本発明の特性は、Ｐ因子に対する高親和性を有するラクダ科抗体またはナノボディである。ここでのある種の態様において、ラクダ科抗体またはナノボディはラクダ科動物で天然に産生され、すなわち、ラクダ科でここで他の抗体について記載した技術を使用したＰ因子またはそのペプチドフラグメントでの免疫化後に産生される。あるいは、Ｐ因子結合ラクダ科ナノボディは改変され、すなわち、例えば、ここでの実施例に記載するとおりＰ因子を標的として用いるパニング法を使用した、突然変異誘発したラクダ科ナノボディタンパク質を適当に示すファージのライブラリーからの選択により製造する。改変ナノボディは、さらにレシピエント対象における４５分〜２週間の半減期を有するように遺伝子操作によりカスタマイズできる。具体的態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、例えばＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４に記載のとおり、ナノボディまたは一ドメイン抗体フレームワーク配列に移植することにより得る。

【0204】

二重特異性分子および多価抗体
他の面において、本発明は、本発明のＰ因子結合抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性または多特異的分子に関する。本発明の抗体またはその抗原結合部位を誘導体化または他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、他の抗体または受容体に対するリガンド)と結合して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を産生できる。本発明の抗体は、実際、誘導体化または１個を超える他の機能的分子と結合して、２個を超える異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異的分子を産生できる；このような多特異的分子もここで使用する養母“二重特異性分子”に包含することを意図する。本発明の二重特異性分子を製造するために、本発明の抗体を、二重特異性分子が得られるように、１個以上の他の結合分子、例えば他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物と機能的に結合(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合的結合またはその他)できる。

【0205】

したがって、本発明は、Ｐ因子に対する少なくとも１個の第一結合特異性および第二標的エピトープに対する第二結合特異性を含む、二重特異性分子を含む。例えば、第二標的エピトープは、第一標的エピトープと異なるＰ因子の他のエピトープである。

【0206】

加えて、二重特異性分子が多特異性である本発明について、分子は、第一および第二標的エピトープに加えてさらに第三の結合特異性を含み得る。

【0207】

一つの態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１個の抗体または抗体そのフラグメントを含む。抗体はまた軽鎖または重鎖二量体またはＦｖのようなその最小フラグメントまたはLadner et al. 米国特許番号４,９４６,７７８に記載の一本鎖構築物であり得る。

【0208】

二重特異性抗体は、同じ鎖上の２ドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより接続したＶＨおよびＶＬドメインが一ポリペチド鎖上に発現される、二価の、二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは他の鎖の相補性ドメインと結合し、それによ２個の抗原結合部位を生成する(例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123参照)。二重特異性抗体は、構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ(ＶＨ−ＶＬ配置)またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ(ＶＬ−ＶＨ配置)の２個のポリペチド鎖を同じ細胞上に発現させることにより製造できる。そのほとんどが細菌中で可溶性形態で発現できる。一本鎖二重特異性抗体(ｓｃＤｂ)は、２個の二重特異性抗体形成ポリペチド鎖と、約１５アミノ酸残基のリンカーの接続により製造する(Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21参照)。二重特異性抗体をＦｃと融合して、“二二重特異性抗体”を製造できる(Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65参照)。

【0209】

本発明の二重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。

【0210】

二重特異性分子は、当分野で知られた方法を使用して、成分結合特異性をコンジュゲートすることにより製造できる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、二重特異性分子の各結合特異性を別々に製造し、次いで互いにコンジュゲートし、例えば、多様なカップリングまたは架橋剤を共有結合に使用できる。架橋剤の例はプロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)(例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). 他の方法はPaulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), and Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものを含む。コンジュゲーション剤(Conjugating agent)はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもPierce Chemical Co.(Rockford, IL)から入手可能である。

【0211】

結合特異性が抗体であるとき、２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートできる。具体的態様において、ヒンジ領域を、コンジュゲーション前に奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾する。

【0212】

あるいは、両結合特異性を同じベクターでコード化させ、発現させ、同じ宿主細胞で集合させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)_２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２個の結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子の製造方法は、例えば米国特許番号５,２６０,２０３；米国特許番号５,４５５,０３０；米国特許番号４,８８１,１７５；米国特許番号５,１３２,４０５；米国特許番号５,０９１,５１３；米国特許番号５,４７６,７８６；米国特許番号５,０１３,６５３；米国特許番号５,２５８,４９８；および米国特許番号５,４８２,８５８に記載されている。

【0213】

二重特異性分子のその特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＥＡ)、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイの各々は、一般的に特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を、目的の複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いて検出する。

【0214】

他の面において、本発明は、本発明のＰ因子に結合する本発明の抗体の少なくとも２個の同一または異なる抗原結合部位を含む多価化合物を提供する。本発明の抗体の抗原結合部位は、タンパク質融合または共有結合または非共有結合的結合を介して互いに結合できる。あるいは、結合方法は二特異性分子について記載している。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の抗体と本発明の抗体の定常領域と結合する抗体、例えばＦｃまたはヒンジ領域の架橋により得ることができる。

【0215】

三量体形成ドメインは、例えばBorean特許ＥＰ１０１２２８０Ｂ１に記載されている。五量体化モジュールは、例えばＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７に記載されている。

【0216】

半減期が延長した抗体
本発明は、インビボでの半減期が延長したＰ因子タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。

【0217】

多くの因子がインビボでのタンパク質の半減期に影響し得る。例は、腎臓濾過、肝臓での代謝、タンパク分解酵素(プロテアーゼ類)での分解および免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取り込み)である。多様な戦略が本発明の抗体の半減期を伸ばすために使用できる。例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スキャフォールド、ポリシアル酸(ＰＳＡ)、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)、アルブミン結合リガンドおよび炭水化物シールドへの化学結合；血清タンパク質に結合するタンパク質、例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎおよびトランスフェリンとの遺伝子融合；血清タンパク質に結合する他の結合部分、例えばナノボディ、Ｆａｂｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンへのカップリング(遺伝的または化学的)；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃへの遺伝子融合；またはナノ担体、徐放性製剤または医療デバイスへの取り込み。

【0218】

インビボでの抗体の血清循環を延長するために、不活性ポリマー分子、例えば高分子量ＰＥＧを、ＰＥＧの抗体のＮ末端またはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションまたはリシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能的リンカーと共にまたは伴わず、抗体またはそのフラグメントに結合できる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、典型的にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合する条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施できる。ここで使用する、用語“ポリエチレングリコール”は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧ、例えばモノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。ある態様において、ペグ化する抗体は非グリコシル化抗体である。生物学的活性の最小限の喪失となる直鎖または分枝鎖ポリマー誘導体化を有する。コンジュゲーション程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトロメトリーにより厳しくモニターし、抗体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションを確実にする。未反応ＰＥＧを、分子ふるいまたはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離できる。ＰＥＧ誘導体化抗体を、当業者に周知の方法を使用して、例えば、ここに記載した免疫アッセイにより結合活性ならびにインビボ有効性について試験できる。タンパク質のペグ化方法は当分野で知られ、本発明の抗体に適用できる。例えば、Nishimura et al. のＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.のＥＰ０４０１３８４参照。

【0219】

他の修飾ペグ化方法は、再構成化学的直交操作技術(ReCODE PEG)であり、これは、化学的に特定の側鎖を生合成タンパク質に、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して取り込む。この方法は、３０を超える新アミノ酸の大腸菌、酵母および哺乳動物細胞における生合成タンパク質への取り込みを可能にする。ｔＲＮＡは非天然アミノ酸を、アンバーコドンが位置する任意の場所に取り込み、アンバーを停止コドンから化学的に特定のアミノ酸の取り込みのシグナルとなるものに変換する。

【0220】

組み換えペグ化方法(ｒＰＥＧ)も血清半減期延長に使用できる。この方法は、３００〜６００アミノ酸の不定形タンパク質尾部に既存の医薬タンパク質を遺伝的融合させることを含む。このような不定形タンパク質鎖の見かけの分子量がその実際の分子量の約１５倍大きくなるため、タンパク質の血清半減期は、大きくのびる。化学コンジュゲーションおよび再精製を必要とする伝統的ペグ化と比較して、製造工程は極めて単純であり、産物は均質である。

【0221】

ポリシアル化は他の方法であり、これは、治療ペプチドおよびタンパク質の活性寿命を延長し、安定性を改善するのに天然ポリマーポリシアル酸(ＰＳＡ)を使用する。ＰＳＡは、シアル酸(糖)のポリマーである。タンパク質および治療ペプチド薬物送達に使用したとき、ポリシアル酸はコンジュゲーションに保護的微小環境を提供する。これが循環中の治療タンパク質の活性寿命を延ばし、免疫系により認識されるのを妨げる。ＰＳＡポリマーはヒト体内で天然に見られる。何百万年の壁をこれで覆うように進化したある種の細菌により導入された。これらの天然にポリシアル化された細菌は、次いで、分子模写により、体内の防御系から逃れることに成功した。ＰＳＡは、天然の最終的な隠蔽方法であり、このような細菌により大量に、予定された物理的特徴で産生できる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内でのＰＳＡと化学的同一である限り、タンパク質とカップリングしたときでさえ完全に非免疫原性である。

【0222】

他の方法は、抗体に結合したヒドロキシエチルデンプン(“ＨＥＳ”)誘導体である。ＨＥＳは、蝋状トウモロコシ澱粉由来の修飾天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝され得る。ＨＥＳ溶液を、通常血液量不足を補い、血液のレオロジー的特性を改善するために投与し。抗体のヘシル化(hesylation)は、分子の安定性の増加ならびに腎クリアランス減少により循環半減期の延長を可能にし、生物学的活性を高める。種々のパラメータ、例えばＨＥＳの分子量を変えることにより、広範なＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズできる。

【0223】

インビボで長い半減期を有する抗体はまたＩｇＧ定常ドメインまたはＦｃＲｎ結合そのフラグメント(好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント)への１個以上のアミノ酸修飾(すなわち、置換、挿入または欠失)の導入によっても産生できる。例えば、国際公開番号ＷＯ９８／２３２８９；国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１；および米国特許番号６,２７７,３７５参照。

【0224】

さらに、抗体または抗体フラグメントをインビボでより安定にしまたはインビボで半減期を長くするために、抗体をアルブミンとコンジュゲートできる。本技術は当分野で周知であり、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；および欧州特許番号ＥＰ４１３,６２２を参照のこと。さらに上記二特異性抗体の状況で、抗体の特異性は、抗体の１結合ドメインがＰ因子に結合し、抗体の第二結合ドメインが血清アルブミン、好ましくはＨＳＡに結合するように設計できる。

【0225】

半減期を延長する戦略は、特にナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤およびインビボ半減期延長が望まれる他の抗体またはタンパク質で有用である。

【0226】

抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を産生するために異種タンパク質またはポリペチド(またはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペチド)と組み換え的融合または化学的結合(共有結合および非共有結合の両者を含む)したＰ因子タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、ここに記載する抗体の抗原結合フラグメント(例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ(ａｂ)２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ)および異種タンパク質、ポリペチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペチドまたはペプチドを抗体または抗体フラグメントと融合または結合する方法は当分野で知られている。例えば、米国特許５,３３６,６０３、５,６２２,９２９、５,３５９,０４６、５,３４９,０５３、５,４４７,８５１および５,１１２,９４６；欧州特許番号ＥＰ３０７,４３４およびＥＰ３６７,１６６；国際公開番号ＷＯ９６／０４３８８およびＷＯ９１／０６５７０；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; and Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341参照)。

【0227】

さらなる融合タンパク質を、遺伝子混合、モチーフ混合、エクソン混合および／またはコドン混合(ここでは纏めて“ＤＮＡ混合”と呼ぶ)の技術を介して産生し得る。ＤＮＡ混合は、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性改変に使用し得る(例えば、高親和性および低解離速度の抗体またはそのフラグメント)。一般的に、米国特許５,６０５,７９３、５,８１１,２３８、５,８３０,７２１、５,８３４,２５２および５,８３７,４５８；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; and Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313参照(これら特許および刊行物の各々は、引用によりその全体を本明細書に包含させる)。抗体またはそのフラグメントまたはコードする抗体またはそのフラグメントは、組換え前にエラープローンＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為突然変異誘発に付すことにより変え得る。Ｐ因子タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを１個以上の異種分子の１個以上の成分、モチーフ、セクション、パーツ、ドメイン、フラグメントなどと組み換えし得る。

【0228】

さらに、抗体またはそのフラグメントは、マーカー配列、例えば精製を容易にするためのペプチドと融合し得る。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば特にｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)で提供されるタグであり、その多くが市販されている。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のとおり、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素(“ＨＡ”)タグ(Wilson et al., 1984, Cell 37:767)および“フラッグ”タグを含むが、これらに限定されない。

【0229】

他の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは診断剤または検出可能剤とオン樹ゲートできる。このような抗体は、臨床的試験法の一部として疾患または障害の発症、進展、進行および／または重症度のモニタリングまたは予後診断、例えば特定の治療の有効性の決定に有用であり得る。このような診断および検出は、例えば、オースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない種々の酵素；例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンであるがこれらに限定されない接合団；例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンであるが、これらに限定されない蛍光物質；例えば、ルミノールであるが、これに限定されない発光物質；例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンであるが、これらに限定されない生物発光物質；例えば、ヨウ素(^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉおよび^１２１Ｉ)、炭素(^１４Ｃ)、硫黄(^３５Ｓ)、トリチウム(^３Ｈ)、インジウム(^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎおよび^１１１Ｉｎ)、テクネチウム(^９９Ｔｃ)、タリウム(^２０１Ｔｉ)、ガリウム(^６８Ｇａ、^６７Ｇａ)、パラジウム(^１０３Ｐｄ)、モリブデン(^９９Ｍｏ)、キセノン(^１３３Ｘｅ)、フッ素(^１８Ｆ)、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^１１３Ｓｎおよび^１１７Ｔｉｎであるが、これらに限定されない放射性物質；および種々の陽電子放出断層撮影および非放射性常磁性金属イオンを使用する陽電子放出金属を含むが、これらに限定されない検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成できる。

【0230】

本発明は、さらに治療部分とコンジュゲートした抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。抗体またはそのフラグメントは治療部分、例えば細胞毒、例えば、細胞増殖阻止または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ−エミッターとコンジュゲートし得る。細胞毒または細胞毒性剤は細胞に有害な薬剤を含む。

【0231】

さらに、抗体またはそのフラグメントを、ある生物学的応答を修飾する治療部分または薬物部分とコンジュゲートし得る。治療部分または薬物部分は古典的化学治療剤に限定されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管形成剤；または生物学的応答修飾剤、例えば、例えば、リンホカインを含み得る。

【0232】

さらに、抗体を、２１３Ｂｉのようなアルファエミッタのような放射性物質または、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むが、これらに限定されない放射性金属イオンのポリペチドへのコンジュゲートに有用な大環状キレート剤とコンジュゲートできる。ある態様において、大環状キレート剤は１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ”’−四酢酸(ＤＯＴＡ)であり、これはリンカー分子を介して抗体に結合できる。このようなリンカー分子は通常当分野で知られ、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載され、各々その全体を引用により本明細書に包含させる。

【0233】

治療部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。

【0234】

抗体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である固体支持体とも結合し得る。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。

【0235】

本発明の抗体の製造方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記Ｐ因子結合抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、列番号７、２１、３５、４９、６３、７７、９１、１０５、１１９、１３３、１４７、１６１、１７５、１８９、２０３、２１７、２３１、２４５、２５９または２７３に示す重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および／または配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１０６、１２０、１３４、１４８、１６２、１７６、１９０、２０４、２１８、２３２、２４６、２６０または２７４に示す軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的態様において、核酸分子は表１に同定したものである。ある別の本発明の核酸分子は、表１に同定したヌクレオチド配列と実質的に同一(例えば、少なくとも６５、８０％、９５％または９９％)なヌクレオチド配列である。適当な発現ベクターから発現されたとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペチドはＰ因子抗原結合能力を示すことができる。

【0236】

また本発明で提供されるのは、上記Ｐ因子結合抗体の重鎖または軽鎖の少なくとも１個のＣＤＲ領域および通常全３個のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの他のポリヌクレオチドは、上記Ｐ因子結合抗体の重鎖および／または軽鎖の全てまたは実質的に全ての可変領域配列をコードする。コード縮重のため、多様な核酸配列が免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードする。

【0237】

本発明の核酸分子は抗体の可変領域および定常領域のいずれもコードし得る。本発明の核酸配列のいくつかは、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１または２７５に示すＰ因子結合抗体の成熟重鎖配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)な成熟重鎖配列をコードするヌクレオチドである。ある他の核酸配列は配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２または２７６に示す成熟軽鎖配列と実質的に同一(例えば、少なくとも８０％、９０％または９９％)である成熟軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。

【0238】

ポリヌクレオチド配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成またはＰ因子結合抗体またはその結合フラグメントをコードする既存配列(例えば、下記実施例に記載する配列)のＰＣＲ突然変異誘発により製造できる。核酸の直接化学合成は当分野で知られる方法、例えばNarang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル方法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル方法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホロアミデート方法；および米国特許番号４,４５８,０６６の固体支持方法により達成できる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; and Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のとおり達成できる。

【0239】

また本発明で提供されるのは、上記Ｐ因子結合抗体の製造のための発現ベクターおよび宿主細胞である。種々の発現ベクターを、Ｐ因子結合抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるために使用できる。ウイルスベースおよび非ウイルス発現ベクターの両方とも、哺乳動物宿主細胞での抗体の産生に使用できる。非ウイルスベクターおよび系は、プラスミド、典型的にタンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを伴うエピソームベクターおよびヒト人工的染色体を含む(例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997参照)。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞でのＰ因子結合ポリヌクレオチドおよびポリペチド発現に有用な非ウイルスベクターは、pThioHis A、BおよびC、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、BおよびC(Invitrogen, San Diego, CA)、ＭＰＳＶベクターおよび他のタンパク質を発現することが当分野で知られる多数の他のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０を使用したベクター、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ)に基づくベクターを含む。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; and Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992参照。

【0240】

発現ベクターの選択は、ベクターを発現させることを意図する宿主細胞による。典型的に、発現ベクターは、Ｐ因子結合抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に結合したプロモータおよび他の調節配列(例えば、エンハンサ)を含む。ある態様において、誘導性プロモータを使用して、誘導条件下以外での挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモータは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータまたはヒートショックプロモータを含む。形質転換生物培養物を、発現産物が宿主細胞に十分に耐容性であるコーディング配列に対する集団を阻害することなく、非誘導条件下で増幅できる。プロモータに加えて、他の調節要素がＰ因子結合抗体鎖またはフラグメントの効率的発現のために必要であるかまたは望ましいことがある。これらの要素は、典型的にＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボゾーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現効率は、使用する細胞系への適当なエンハンサの導入により高められ得る(例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; and Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987参照)。例えば、ＳＶ４０エンハンサまたはＣＭＶエンハンサを、哺乳動物宿主細胞における発現増加に使用し得る。

【0241】

発現ベクターはまた挿入されたＰ因子結合抗体配列によりコードされるポリペチドとの融合タンパク質を形成するために分泌シグナル配列位置を提供し得る。多くの場合、挿入されたＰ因子結合抗体配列は、ベクターへの挿入前にシグナル配列と結合させる。Ｐ因子結合抗体軽および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け入れるために使用するベクターは、しばしば定常領域またはその一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それにより、インタクト抗体またはそのフラグメントの産生に至る。典型的に、このような定常領域はヒト型である。

【0242】

Ｐ因子結合抗体鎖を担持し、発現させる宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な原核宿主の一つである。使用に適する他の微生物宿主は、桿菌、例えばバチルス・スブチリスおよび他の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチアおよび種々のシュードモナス種を含む。これらの原核宿主において、典型的に宿主細胞に適合する制御配列(例えば、複製開始点)を含む発現ベクターも製造できる。さらに、任意の数の多様な周知のプロモータ、例えばラクトースプロモータ系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモータ系、ベータ−ラクタマーゼプロモータ系またはファージラムダのプロモータ系が存在し得る。プロモータは、典型的に発現を、所望によりオペレータ配列と共に制御し、転写および翻訳の開始および完了のためのリボゾーム結合部位配列などを含む。他の微生物、例えば酵母も本発明のＰ因子結合ポリペチドの発現に使用できる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用できる。

【0243】

ある好ましい態様において、哺乳動物宿主細胞を、本発明のＰ因子結合ポリペチドの発現および産生に使用する。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株(例えば、実施例に記載する１Ｄ６.Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン)または外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞株(例えば、下に例示するＳＰ２／０骨髄腫細胞)であり得る。これらは、任意の正常死または正常または異常不死動物またはヒト細胞を含む。例えば、インタクト免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマなどがある。ポリペチド発現のための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般的に、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製開始点、プロモータおよびエンハンサ(例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986参照)および必要な処理情報部位、例えばリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネータ配列を含み得る。これらの発現ベクター通常は、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルス由来のプロモータを含む。適切なプロモータは構成的、細胞型特異的、段階特異的および／または調節可能または制御可能であり得る。有用なプロモータは、メタロチオネインプロモータ、構成的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメサゾン−誘導性ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、MRP polIIIプロモータ、構成的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン−誘導性ＣＭＶプロモータ(例えばヒト最初期ＣＭＶプロモータ)、構成的ＣＭＶプロモータおよび当分野で知られるプロモータ−エンハンサ組み合わせを含むが、これら限定されない。

【0244】

目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの挿入方法は細胞性宿主のタイプによる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞で通常利用され、一方リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが他の細胞性宿主で使用されうる(一般的にSambrook, et al., supra参照)。他の方法は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム介在形質転換、注入および微量注入、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工的ウイルス粒子、ヘルペスウイルス構造的タンパク質ＶＰ２２への融合(Elliot and O'Hare, (1997) Cell 88:223)、薬物によるＤＮＡ取込増進およびエクスビボ形質導入を含む。組み換えタンパク質の長期、高収率産生のために、安定した発現がしばしば望まれる。例えば、ＨＥＲ３結合抗体鎖または結合フラグメントを安定して発現する細胞株を、ウイルス複製開始点または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して製造できる。ベクター導入後、細胞を１〜２日間富化培地で増殖させ、選択培地に移す。選択可能マーカーの目的は選択への耐性の付与であり、その存在により、選択培地中の導入配列の完全発現を成功させた細胞の増殖を可能にする。耐性の、安定形質移入細胞を、細胞型に適当な組織培養技術を使用して増殖できる。

【0245】

本発明のモノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)を、モノクローナル抗体のための常套的方法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256:495の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む多様な技術により製造できる。モノクローナル抗体製造のための多くの技術、例えば、ウイルスによるまたは発癌的手法によるＢリンパ球の形質転換を使用し得る。

【0246】

ハイブリドーマ製造のための動物系はマウス、ラットおよびウサギ系を含む。マウスで産生されるハイブリドーマは確立された方法である。免疫化プロトコルおよび融合用免疫化脾細胞の単離技術は当分野で知られている。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合法も知られている。

【0247】

本発明のキメラまたはヒト化抗体を、上記のとおり製造したマウスモノクローナル抗体の配列に基づき製造できる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを目的のマウスハイブリドーマから得て、標準的分子生物学技術を使用して非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を製造するために、マウス可変領域を、当分野で知られた方法を使用してヒト定常領域と結合できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許番号４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を産生するために、マウスＣＤＲ領域を、当分野で知られた方法を使用してヒトフレームワークに挿入できる。例えば、Winterの米国特許番号５２２５５３９およびQueen et alの米国特許５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０参照。

【0248】

ある態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。Ｐ因子に対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたは染色体転移マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェニックおよび染色体転移マウスは、ここではそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼び、ここでは纏めて“ヒトＩｇマウス”と呼ぶ。

【0249】

ＨｕＭＡｂマウス^{(登録商標)}(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子微小遺伝子座を、不活性化内因性μおよびκ鎖座である標的変異と共に含む(例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859参照)。従って、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現が低く、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス転換および体細胞変異に付され、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する(Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546参照)。ＨｕＭＡｂマウスの産生および使用およびこのようなマウスで行うゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; and Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載され、その内容全体を引用によりその全体を特に本明細書に包含させる。さらに、米国特許５,５４５,８０６；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,８７７,３９７；５,６６１,０１６；５,８１４,３１８；５,８７４,２９９；および５,７７０,４２９；全てLonbergおよびKay；Surani et al.の米国特許番号５,５４５,８０７；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２；およびKorman et alのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４も参照のこと。

【0250】

他の態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスを使用して惹起できる。このようなマウスは“ＫＭマウス”と呼び、Ishida et alのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳述されている。

【0251】

なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＰ因子結合抗体の惹起に使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と呼ぶ代替トランスジェニック系を使用できる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et alの米国特許５,９３９,５９８；６,０７５,１８１；６,１１４,５９８；６、１５０,５８４および６,１６２,９６３に記載されている。

【0252】

さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替染色体転移動物系が当分野で利用可能であり、本発明のＰ因子結合抗体の惹起に使用できる。例えば、“ＴＣマウス”と呼ぶヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両者を担持するマウスを使用でき、このようなマウスはTomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが文献に記載されており(Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明のＰ因子結合抗体の惹起に使用できる。

【0253】

ヒト本発明のモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用しても製造できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立され、下記実施例に記載する。例えば：Ladner et al.の米国特許５,２２３,４０９；５,４０３,４８４；および５,５７１,６９８；Dower et al.の米国特許５,４２７,９０８および５,５８０,７１７；McCafferty et al.の米国特許５,９６９,１０８および６,１７２,１９７；およびGriffiths et al.の米国特許５,８８５,７９３；６,５２１,４０４；６,５４４,７３１；６,５５５,３１３；６,５８２,９１５および６,５９３,０８１参照。

【0254】

ヒト本発明のモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が免疫化により産生されるように再構成されているＳＣＩＤマウスを使用しても製造できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許５,４７６,９９６および５,６９８,７６７に記載されている。

【0255】

フレームワークまたはＦｃ操作
改変された本発明の抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾されているものを含む。典型的にこのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすために行う。例えば、一つの手法は、１個以上のフレームワーク残基の対応する生殖系列配列への“復帰突然変異”である。より具体的に、体細胞変異に付された抗体は、抗体が由来する生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列と抗体が由来する生殖系列配列の比較により同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的突然変異誘発により生殖系列配列に“復帰突然変異”させる。このような“復帰突然変異”抗体もまた本発明に包含されることを意図する。

【0256】

他のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的免疫原性を減らすために、フレームワーク領域または１個以上のＣＤＲ領域内でさえ１個以上の残基を突然変異させることを含む。この技法は“脱免疫原性化”と呼ばれ、Carr et al.の米国特許公開２００３０１５３０４３にさらに詳述される。

【0257】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えてまたはそれとは別に、本発明の抗体は、典型的に抗体の１個以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞毒性を変えるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように改変し得る。さらに、本発明の抗体は、同様に抗体の１個以上の機能的特性を変えるために化学的修飾(例えば、１個以上の化学部分を抗体に結合できる)できまたはそのグリコシル化を変えるように修飾し得る。これらの態様の各々を下に詳述する。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、KabatのＥＵ指数である。

【0258】

一つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域を、ヒンジ領域におけるシステイン残基数が変わるように、例えば、増えるまたは得るように修飾する。この技法はさらにBodmer et al.の米国特許番号５,６７７,４２５に記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数を、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するまたは抗体の安定性を上昇または減少させるために変える。

【0259】

他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を、抗体の生物学的半減期を減らすように変異させる。より具体的に、１個以上のアミノ酸変異を、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインｐＡ結合に対してブドウ球菌性プロテインＡ(ＳｐＡ)結合が障害されるように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この技法はさらにWard et al.の米国特許番号６,１６５,７４５に詳述される。

【0260】

他の態様において、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。種々の手法が可能である。例えば、Wardの米国特許番号６,２７７,３７５に記載のとおり次の変異の１個以上を導入できる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延長するために、Presta et al.の米国特許５,８６９,０４６および６,１２１,０２２に記載のとおり、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で修飾して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように変更できる。

【0261】

さらに別の態様において、Ｆｃ領域を、抗体のエフェクター機能を変えるために少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変える。例えば、１個以上のアミノ酸を、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変わるが、親抗体の抗原結合能力を維持するように異なるアミノ酸残基で置換する。親和性が変えられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この技法は、Winter et al.の米国特許５,６２４,８２１および５,６４８,２６０にさらに詳述される。

【0262】

他の態様において、アミノ酸残基から選択された１個以上のアミノ酸を、抗体のＣ１ｑ結合が変えられおよび／または補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)が減らされるかまたはなくなるように異なるアミノ酸残基で置換する。この技法は、Idusogie et al.の米国特許６,１９４,５５１にさらに詳述される。

【0263】

他の態様において、１個以上のアミノ酸残基を変え、それにより、抗体が補体を固定する能力を変える。この技法はBodmer et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに詳述される。

【0264】

さらに他の態様において、Ｆｃ領域を、１個以上のアミノ酸修飾により、抗体が抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を仲介する能力を高めるおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を高めるように修飾する。この技法はPrestaのＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに詳述される。さらに、ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対する結合部位は位置づけられており、結合が改善された変異体が記載されている(Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照)。

【0265】

さらに別の態様において、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体(すなわち、グリコシル化を欠く抗体)を製造できる。グリコシル化は、例えば、抗体の“抗原”への親和性を高めるために変え得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１箇所以上のグリコシル化部位を変えることにより達成できる。例えば、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除き、それによりその部位でのグリコシル化を無くすような１個以上のアミノ酸置換を行う。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高める。このような手法は、Co et al.の米国特許５,７１４,３５０および６,３５０,８６１にさらに詳述される。

【0266】

これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、グリコシル化のタイプが変わるように修飾でき、例えばフコシル残基の量が少ない低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が多い抗体である。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞での抗体の発現により達成できる。グリコシル化機構が変えられた細胞は文献に記載され、組み換え本発明の抗体を発現し、それによりグリコシル化が変えられた抗体を産生する宿主細胞として使用できる。例えば、Hang et al.のＥＰ１,１７６,１９５は、細胞株で発現された抗体が低フコシル化であるような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載する。PrestaのＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ(２９７)結合炭水化物に結合させる能力が減少し、また宿主細胞で発現された抗体が低フコシル化である変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞を記載する(またShields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740参照)。Umana et al.のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、改変細胞株で発現された抗体で二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加されるように糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ類(例えば、ベータ(１,４)−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))が改変された細胞株を記載し、これは抗体のＡＤＣＣ活性を高める(また Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180参照)。

【0267】

改変抗体の製造方法
ここに示すＶＨおよびＶＬ配列または完全長重鎖および軽鎖配列を有する本発明のＰ因子結合抗体を使用して、完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合する定常領域の修飾により新規Ｐ因子結合抗体を調製できる。それにより、本発明の他の面において、本発明のＰ因子結合抗体の構造的特性を使用して、ヒトＰ因子の結合およびまたＰ因子の１個以上の機能的特性の阻害のような本発明の抗体の少なくとも１個の機能的特性を保持する構造的に関連するＰ因子結合抗体を調製する(例えば、ＭＡＣ沈着アッセイにおけるＭＡＣ沈着阻害、溶血アッセイにおける赤血球溶解阻害)。

【0268】

例えば、本発明の抗体の１個以上のＣＤＲ領域またはその変異体を既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合え的に組み合わせて、さらなる組み換え操作された、上記本発明のＰ因子結合抗体を調製できる。他のタイプの修飾は先のセクションに記載したものを含む。製造方法のための出発物質は、ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域である。改変抗体を製造するために、実際ここに提供するＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上または１個以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体の製造(すなわち、タンパク質としての発現)が必要である。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元の配列由来の“第二世代”配列を製造し、次いで“第二世代”配列を製造し、タンパク質として発現させる。

【0269】

したがって、他の態様において、本発明は、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、１８３、１９７、２１１、２２５、２３９、２５３および２６７から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２、８６、１００、１１４、１２８、１４２、１５６、１７０、１８４、１９８、２１２、２２６、２４０、２５４および２６８から成る群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３、１５７、１７１、１８５、１９９、２１３、２２７、２４１、２５５および２６９から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；および配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４、８８、１０２、１１６、１３０、１４４、１５８、１７２、１８６、２００、２１４、２２８、２４２、２５６および２７０から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５、８９、１０３、１１７、１３１、１４５、１５９、１７３、１８７、２０１、２１５、２２９、２４３、２５７および２７１から成る群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６、９０、１０４、１１８、１３２、１４６、１６０、１７４、１８８、２０２、２１６、２３０、２４４、２５８および２７２から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列から成るＰ因子結合抗体の製造方法であって、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を少なくとも１個の変更された抗体配列を作るように変更し、変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法を提供する。

【0270】

したがって、他の態様において、本発明は、配列番号２８１、２８７、２９３、２９９、３０５、３１１、３１７、３２３、３２９、３３５、３４１、３４７、３５３、３５９、３６５、３７１、３７７、３８３、３８９および３９５から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２８２、２８８、２９４、３００、３０６、３１２、３１８、３２４、３３０、３３６、３４２、３４８、３５４、３６０、３６６、３７２、３７８、３８４、３９０および３９６から成る群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２８３、２８９、２９５、３０１、３０７、３１３、３１９、３２５、３３１、３３７、３４３、３４９、３５５、３６１、３６７、３７３、３７９、３８５、３９１および３９７から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列；および配列番号２８４、２９０、２９６、３０２、３０８、３１４、３２０、３２６、３３２、３３８、３４４、３５０、３５６、３６２、３６８、３７４、３８０、３８６、３９２および３９８から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２８５、２９１、２９７、３０３、３０９、３１５、３２１、３２７、３３３、３３９、３４５、３５１、３５７、３６３、３６９、３７５、３８１、３８７、３９３および３９９から成る群から選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２８６、２９２、２９８、３０４、３１０、３１６、３２２、３２８、３３４、３４０、３４６、３５２、３５８、３６４、３７０、３７６、３８２、３８８、３９４および４００から成る群から選択されるＣＤＲ３配列から成るＰ因子結合抗体の製造方法であって、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を少なくとも１個の変更された抗体配列を得るように変更し、変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法を提供する。

【0271】

したがって、他の態様において、本発明は、配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１０７、１２１、１３５、１４９、１６３、１７７、１９１、２０５、２１９、２３３、２４７、２６１および２７５から成る群から選択される配列を有する完全長重鎖抗体配列；および配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４、１０８、１２２、１３６、１５０、１６４、１７８、１９２、２０６、２２０、２３４、２４８、２６２および２７６から成る群から選択される配列を有する完全長軽鎖抗体配列からなる哺乳動物細胞での発現のために最適化されたＰ因子結合抗体最適化の製造方法であって、完全長重鎖抗体配列および／または完全長軽鎖抗体配列の少なくとも１個のアミノ酸残基を少なくとも１個の変更された抗体配列を得るように変更し、変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法を提供する。一つの態様において、重鎖または軽鎖の変更は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。

【0272】

変更された抗体配列はまたＵＳ２００５０２５５５５２に記載のとおり固定されたＣＤＲ３配列または最小必須結合決定基およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の多様性を有する抗体ライブラリーのスクリーニングにより製造できる。スクリーニングは、抗体を抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適当なスクリーニング方法、例えばファージディスプレイ方法により実施できる。

【0273】

標準的分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を製造および発現できる。変更された抗体配列によりコードされる抗体は、ここに記載するＨＥＲ３結合抗体の機能的特性の１個、いくつかまたは全てを維持し、該機能的特性は、ヒトおよび／またはカニクイザルＰ因子への特異的結合を含むが、これらに限定されず、抗体は溶血アッセイにおいて赤血球溶解を阻害する。

【0274】

本発明の抗体の製造方法のある種の態様において、変異を無作為にまたは選択的にＰ因子結合抗体コーディング配列の全てまたは一部に導入でき、得られた修飾Ｐ因子結合抗体を、ここに記載するとおり結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングできる。変異的方法は文献に記載されている。例えば、ShortのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの組み合わせを使用する抗体変異の調製およびスクリーニング方法を記載する。あるいは、Lazar et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の生理化学特性を最適化するためのコンピュータ利用スクリーニング方法を記載する。

【0275】

本発明のある態様において抗体は、脱アミドの部位を除去するように操作されている。脱アミドはペプチドまたはタンパク質の構造的および機能的変化をもたらすことが知られている。脱アミドは生理活性の減少、ならびにタンパク質医薬の薬物動態および抗原性を変えることができる(Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9)。

【0276】

改変抗体の機能的特性は、当分野で利用可能なおよび／またはここに記載する標準的アッセイ、例えば実施例に記載のもの(例えば、ＥＬＩＳＡｓ)を使用して、評価できる。

【0277】

予防および治療的使用
ここに記載するＰ因子と結合する抗体は、処置を必要とする対象に本発明の抗体または抗原結合フラグメントの有効量を投与することにより、上昇した補体活性と関連する疾患または障害の処置のための治療的に有用な濃度で使用できる。具体的態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体の有効量を投与することを含む、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)の処置方法を提供する。

【0278】

本発明の抗体は、特に、萎縮型ＡＭＤから滲出型ＡＭＤへの進行、地図状萎縮の進行の遅延および／または阻止、黄斑性浮腫の予防または処置、ルセンティス注射頻度減少および萎縮型および滲出型ＡＭＤ進行による視力喪失の阻止に使用できる。滲出型ＡＭＤ患者の処置のために抗ＶＥＧＦ治療と組み合わせて使用もできる。

【0279】

ＡＭＤのような眼疾患の処置および／または予防は、臨床的に関連する視覚機能の測定および／または網膜解剖所見を使用して眼科医または医療専門家により決定できる。ＡＭＤの処置は、視覚機能および／または局所解剖所見の改善または保存をもたらす何らかの作用(例えば、ここに記載する抗Ｐ因子抗体の投与)を意味する。さらに、予防は、ＡＭＤに関する限り、悪化の危険性のある患者における、下記視覚機能、網膜解剖所見および／またはＡＭＤ疾患パラメータの悪化の予防または遅延をする何らかの作用(例えば、ここに記載する抗Ｐ因子抗体の投与)を意味する。

【0280】

視覚機能は、例えば、視力、低照度での視力、視野、中心視野、末梢視覚、コントラスト感受性、暗順応、光ストレス回復、色の識別、読む速度、補助器具への依存度(例えば、大活字書体、拡大デバイス、望遠鏡)、顔認識、動力者操作時の熟達、日常生活の１つ以上の活動の実行能力および／または患者が報告する視覚機能に関する満足度であり得る。それゆえに、ＡＭＤの処置は、対象で予め特定した暗順応の程度が少なくとも１０％減少したときまたは１０％以上の時間を要するときに実施されるということができる。さらに、ＡＭＤの処置は、認定医療専門家(すなわち、眼科医)が決定して、視覚角として表して中心視野暗点が少なくとも１０％減少したときまたは１０％以上の総領域が欠けたときに実施されるということができる。

【0281】

視覚機能測定の例は、Snellen視力、ＥＴＤＲＳ視力、低照度視力、アムスラーグリッド、Goldmann視野、Humphrey視野、微小視野検査、ペリ−ロブソン・チャート、ＳＫＩＬＬカード、石原式色覚検査表、Farnsworth D15またはD100色試験および読む速度、顔認識、模擬運転についての確認された試験および患者の報告する満足度を含む。それゆえに、ＡＭＤの処置は、ＥＴＤＲＳスケールで視覚の２段階以上(または１０文字)の獲得または喪失により達成されたということができる。さらに、ＡＭＤの処置は、対象の読む速度(文字／分)が少なくとも１０％増加したまたは１０％以上の減少を欠くときに実施されるということができる。さらに、ＡＭＤの処置は、対象が石原試験のまたはFarnsworth試験の配列ディスク上の正確に同定したプレートの割合が少なくとも２０％増加するまたは２０％減少を欠くときに実施されるということができる。

【0282】

処置または予防し得る網膜解剖所見の望ましくない面は、例えば、ドルーゼン、軟ドルーゼン、硬ドルーゼン、角質ドルーゼン、基底層状ドルーゼン、集密的ドルーゼン、大ドルーゼン(例えば、直径１２５ミクロン以上)、ＲＰＥ萎縮、光受容体萎縮、地図状萎縮、脈絡膜新生血管、網膜下血管新生、網膜血管新生、古典的脈絡膜新生血管、潜在性脈絡膜新生血管、網膜血管腫増殖、脈絡網膜性吻合、脈絡膜解剖所見異常、網膜下出血、網膜内出血、硝子体出血、黄斑性瘢痕、網膜下線維症および網膜線維症を含む。それゆえに、例えば、地図状萎縮の処置は、対照または同じ対象の同じ眼の先に報告された増殖速度と比較した病変における増殖速度の２０％以上の減少により決定できる。

【0283】

網膜解剖所見を評価する方法の例は眼底検査、眼底撮影法、蛍光眼底造影、インドシアニングリーン蛍光眼底撮影法、光干渉断層撮影(ＯＣＴ)、スペクトラルドメイン光干渉断層撮影、走査型レーザー検眼鏡、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自発蛍光、組織診、剖検および免疫組織化学を含む。それゆえに、ＡＭＤは、ＯＣＴで測定した黄斑性厚の１０％減少および／または蛍光眼底造影で測定した過蛍光の減少により対象において処置されたということができる。

【0284】

網膜解剖所見の測定例は、ドルーゼン面積、ドルーゼン体積、地図状萎縮病変面積、地図状萎縮増殖速度および新血管膜面積を含む。

【0285】

ある態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体の有効量を投与することによる、補体関連疾患または障害の処置方法を提供する。既知補体関連疾患または障害の例は、神経障害、多発性硬化症、卒中、ギランバレー症候群、外傷性脳傷害、パーキンソン病、不適切なまたは望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶反応、異種移植拒絶反応、インターロイキン−２治療中のＩＬ−２誘発毒性、炎症性障害、自己免疫性疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、熱傷または凍傷を含む熱的傷害、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、バルーン血管形成術、心肺バイパスまたは腎臓バイパスにおけるポンプ後症候群、血液透析、腎臓虚血、皮膚腺再構築後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血および重症筋無力症を含む。さらに、他の既知の補体関連疾患は、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気腫、肺塞栓症および梗塞、肺炎、線維形成粉塵疾患、不活性粉塵および鉱物(例えば、シリコン、石炭塵、ベリリウムおよびアスベスト)、肺線維症、有機粉塵疾患、化学傷害(刺激性ガスおよび化学物、例えば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニアおよび塩酸)、煙傷害、熱的傷害(例えば、熱傷、凍傷)、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫疾患、グッドパスチャー症候群、肺脈管炎および免疫複合体関連炎症のような肺疾患および障害である。

【0286】

具体的態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体の有効量を投与することを含む補体関連疾患または障害の処置方法を提供し、ここで、該疾患または障害は喘息、関節炎(例えば、リウマチ性関節炎)、自己免疫性心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血−再灌流傷害、バラケル−ジーモンス症候群、血液透析、全身性狼瘡、エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病および他の神経変性状態のような中枢神経系の疾患、ａＨＵＳ、糸球体腎炎、類天疱瘡またはＭＰＧＮ IIである。

【0287】

具体的態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体を含む組成物の有効量を投与することによる、糸球体腎炎の処置方法を提供する。糸球体腎炎の症状は、タンパク尿；糸球体濾過速度(ＧＦＲ)減少；高血圧および浮腫をもたらす水保持にいたる高窒素血症(尿毒症、過剰な血中尿窒素−ＢＵＮ)および塩保持を含む血清電解質変化；赤血球円柱を含む血尿および異常尿沈渣；低アルブミン血症；高脂血症；および脂肪尿を含むが、これらに限定されない。具体的態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体を含む組成物の有効量を投与することによる、発作性夜間ヘモグロビン尿(ＰＮＨ)の処置方法を提供する。

【0288】

具体的態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の抗体を含む組成物の有効量を投与することによる、外循環と関連する免疫および止血系の機能不全を減少する方法を提供する。本発明の抗体は、患者血液を患者の血管から、導管を通って循環させ、患者の血管に戻すことを含むあらゆる過程に使用でき、導管は補体活性化、血小板活性化、白血球活性化または血小板−白血球接着の少なくとも一つを誘発できる物質を含む管腔表面を有する。このような工程は、全ての形態のＥＣＣ、ならびに人工または外来臓器、組織または血管を患者の血液循環に導入することを含む方法を含むが、これらに限定されない。

【0289】

本発明の治療剤で処置する対象は、黄斑変性症と関連する状態を処置する方法が知られている他の治療剤、例えば、米国特許番号６,２１８,３６８に記載の抗生物質処置も問うよできる。他の処置において、シクロスポリンのような免疫抑制性剤は、免疫応答を抑制できる薬剤である。これらの薬剤は、細胞毒性剤、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤｓ)、特異的Ｔリンパ球免疫抑制剤および抗体またはそのフラグメントを含む(Physicians’ Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)参照)。免疫抑制性処置は、典型的に１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年の間隔で継続する。ある患者において、処置を患者が死ぬまで投与する。

【0290】

本発明の治療剤を他の薬剤と共に投与したとき、２剤を任意の順番で連続的または同時に投与できる。ある面において、本発明の抗体を、また第二財(例えば、ベルテポルフィン)での処置も受けている対象に投与する。他の面において、結合分子を外科的処置と関連して投与する。

【0291】

Ｐ因子結合抗体との組み合わせ処置のための適切な薬剤は、補体成分の活性を調節できることが知られている薬剤を含む(例えば、米国特許番号５,８０８,１０９参照)。他の薬剤は補体介在活性を減少と報告されている。このような薬剤は、アミノ酸(Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509)；ホスホネートエステル類(Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289)；ポリアニオン性物質(Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242)；スルホニルフルオライド類(Hansch, C.;Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160およびそこに引用されている引用文献)；ポリヌクレオチド(DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255)；ピマール酸(Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1)；ポルフィン類(Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137)；いくつかの抗炎症剤(Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625)；フェノール類(Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65)；およびベンズアミジン類(Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138)を含む。これらの薬剤のいくつかは、プロテアーゼおよびエステラーゼの一般的阻害により機能する。その他は補体経路における何らかの特定の中間工程に特異的ではなく、むしろ、補体活性化の１工程以上を阻害する。後者の化合物の例は、Ｃ１、Ｃ４およびＣ３ｂ利用を阻害するベンズアミジン類を含む(例えば、Vogt et al. Immunol. 1979, 36, 138参照)。

【0292】

補体成分活性を阻害することが知られているさらなる薬剤は、スタキボトリス属の真菌代謝物であるＫ−７６である(Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104:5551, 1982)。Ｋ−７６およびＫ−７６ ＣＯＯＨのいずれも、補体を主にＣ３ｂ工程で阻害することが示されており(Hong et al., J. Immunol. 122:2418, 1979;Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24:1091, 1980)、正常ヒト補体で走化性因子の産生を阻害することが示されている(Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102:421, 1983)。高濃度のＫ−７６またはＫ−７６ ＣＯＯＨで、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７およびＣ９とそのそれぞれの前の中間体との反応の幾分環阻害が示される。Ｋ−７６またはＫ−７６ ＣＯＯＨはまた補体アクティベーター系におけるＣ３ｂを阻害するとも報告されている(Hong et al., J. Immunol. 127:104-108, 1981)。本発明の方法の実施に際し他の適切な薬剤は、グリセオフルビン(Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981)、イソパンナリン(Djura et al., Aust. J. Chem.36:1057, 1983)およびSiphonodictyon coralliphagumの代謝物(Sullivan et al., Tetrahedron 37:979, 1981)を含む。

【0293】

組み合わせ治療レジメンは、相化的であってよく、症状的結果を生じることもある(例えば、２剤の組み合わせ使用により予測される以上の補体経路活性減少)。ある態様において、本発明は、本発明のＰ因子結合抗体および抗血管形成、例えば抗ＶＥＧＦ剤または他の抗補体抗体、例えば補体因子５(Ｃ５)と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントによる、上記ＡＭＤまたは他の補体関連疾患の予防および／または処置のための組み合わせを提供する。

【0294】

抗補体抗体の組み合わせ
一つの面において、本発明は、任意の１個以上の抗Ｐ因子と補体経路の他の成分と結合し、活性を阻害する付加的抗体の組み合わせを提供する。特に、本発明は、補体成分５(Ｃ５)と結合する抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせた任意の１個以上の抗ここに記載するＰ因子抗体または抗原結合フラグメントを含む。Ｃ５に結合し、補体活性化を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントの例は、例えば米国特許８,２４１,６２８(引用により本明細書に包含させる)に見ることができる。より具体的に、Ｃ５と結合し、補体経路を阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを表２に示し、記載する。一つの面において、本発明は、表１に示し、記載する抗Ｐ因子抗体またはその抗原結合フラグメントと表２からの抗Ｃ５抗体８１０９の組み合わせに関する。より具体的に、本発明の一つの面は、表１からの抗体ＮＶＳ９６２(またはその抗原結合フラグメント)と表２からの抗体８１０９(またはその抗原結合フラグメント)の組み合わせに関する。

【0295】

一つの面において、ここに記載する抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の組み合わせは補体経路、特に代替補体経路の相乗的阻害を証明する。このような阻害は、例えば、下記実施例に記載する溶血またはポリ−ＩＣアッセイにより証明できる。ここに記載する抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の組み合わせの使用により達成される代替補体経路阻害における相乗は、当分野で周知の方法を使用して決定できる。例えば、抗Ｐ因子抗体および抗Ｃ５抗体の相乗効果は、Chalice Analyzerのような特定のソフトウェアを使用して単なる相加に対して決定できる。

【0296】

要約すると、Chalice Analyzer(Lehar et al, Nature Biotechnology 2009, 7:659)ソフトウェアを使用して、補体阻害抗体(例えば、抗Ｐ因子および抗Ｃ５)が、補体活性化遮断に対して相乗的に作用するか否かを決定できる。組み合わせ効果は、単剤曲線に基づく組み合わせ参照モデルと、各データ点の比較により特徴付けることができる(Greco, Bravo, Parsons (1995). The search for synergy: a critical review from a response surface perspective. Pharmacol Rev 47(2): 331-85)。Loewe加算性モデル(Loewe (1928). Die quantitativen Probleme der Pharmakologie. Ergebn. Physiol. 27: 47-187)において、Ｉ_Loewe(Ｃ_Ｘ,Ｃ_Ｙ)は、(Ｃ_Ｘ／ＩＣ_Ｘ)＋(Ｃ_Ｙ／ＩＣ_Ｙ)＝１を満たす阻害であり、ＩＣ_Ｘ,Ｙは、適合単剤曲線のＩ_Loeweでの有効濃度である。Loewe加算性は、ＸおよびＹが同じ化合物であるときに産生された組み合わせ応答を表すため、相乗性の一般的に認められた参照である(Greco et al.)。

【0297】

効力変化を、通常、同じ効果に到達するのに必要な単剤と比較したときに、所望の効果レベルに到達するのに必要な薬剤がどの程度少ないかを示すアイソボログラム(Greco et al.)を使用して示す。アイソボログラム表示および組み合わせ指数計算のための効果レベルの選択は、手動でも、Chalice Analyzerで自動に選択させてもよい。自動等レベル選択アルゴリズムは、観察したＩ_データを最大Ｉ_データ−Ｉ_Loeweと共に発見し、少ない単剤Ｉ_ｍａｘを超えるＩ_データのデータ点を除外する。この除外は、アイソボログラムが両方の単剤によりカバーされるレベルで最良の相乗性を反映することを確実にするために適用する。アイソボログラムレベルＩ_ｃｕｔの選択で、アイソボログラムは、選択した等レベルとの交差に対応する濃度の位置を同定することにより描かれる。アイソボログラムは、Loewe用量相加的“薬物それ自体”標準と比較した、相乗性の標準的アイソボログラム解析を示す。特定したアイソボログラムレベルについて、観察された等効果カウンター(例えば、図３における曲線)を理論的用量相加カウンター(例えば、図３における直線)と、組み合わせの両物質のＩＣ_効果標準化直線濃度スケール上に示す。用量相加参照は、常に２個のＩＣ_効果濃度を接続する線である。ＩＣ_効果交差点は、近似シグモイド用量応答曲線の内挿により見ることができる。

【0298】

効力変化を組み合わせ指数ＣＩとしてスコア化する(Chou, Talalay (1984). Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55)。選択した等効果レベルＩ_ｃｕｔについて、ＣII＝(Ｃ_Ｘ／ＥＣ_Ｘ)_Ｉ＋(Ｃ_Ｙ／ＥＣ_Ｙ)_Ｉ(式中、特定のデータ点の(Ｃ_Ｘ／ＥＣ_Ｘ)_Ｉは選択阻害レベルでのその有効濃度に対するＸ化合物の測定濃度の比である)である。ＣＩは、どの程度の薬剤が選択した効果レベルを達成するために単剤に対して組み合わせで必要であるかを概算すると考えることができ、０.１の値は、単剤のわずか１／１０当量が同じ効果レベルを達成するために必要であったことを意味する。０.５〜０.７の範囲のＣＩ値が、現在の臨床組み合わせのインビトロ測定で典型的である(Greco et al.)。１.０のＣＩ値は抗体の組み合わせの相加効果の指標であり、一方０.５未満のＣＩ値は、抗体組み合わせから得られる強い相乗効果の指標である。Chalice Analyzerにおいて、最高ＣＩが、各Ｉ_ｃｕｔ交差濃度について計算した多くの組み合わせ指数値から報告される。全測定ＣＩ値の中で、最大シグナル対ノイズレベルを最高組み合わせ指数として記載する。

【0299】

ここに記載する抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の組み合わせは、個々にまたは一組成物として投与してよい。さらに、ｒ抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の相対量は１：１比であってよく、異なる比でもよい。抗Ｃ５抗体に対する抗Ｐ因子抗体の特定の量は、最終的に処置医または医療専門家が処置する病態の改善を達成するために選択してよい。例えば、ここに記載する組み合わせをＡＭＤ処置に使用するとき、医師または医療専門家は、ここに記載する測定および基準を使用して決定して、最適治療利益を達成するために、抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の相対量を調整してよい。

【0300】

医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と製剤されたＰ因子結合抗体(インタクトまたは結合フラグメント)を含む医薬組成物を提供する。組成物は、さらに、例えば、病的血管新生または腫瘍増殖の処置または予防に適切な、１種以上の他の治療剤を含み得る。薬学的に許容される担体は、組成物を亢進または安定化でき、または組成物の製造を容易にするために使用できる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性である溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。

【0301】

本発明の医薬組成物は、当分野で知られる種々の方法により投与できる投与経路および／または方法は所望の結果により変わる。硝子体内、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下への投与または標的部位の近位への投与が好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または注入による)が好ましい。投与経路によって、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多選択性分子を、該化合物を不活性化し得る酸および他の条件の活性から化合物を守るために物質でコーティングしてよい。

【0302】

組成物は無菌および液体でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコール類および塩化ナトリウムを組成物に包含させることが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、ステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを包含させることにより達成できる。

【0303】

本発明の医薬組成物は、当分野で周知のおよび当分野で日常的に実施されている方法に従い製造できる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下に製造する。典型的に、治療的有効量または有効量のＰ因子結合抗体を本発明の医薬組成物に用いる。Ｐ因子結合抗体を、当業者に知られた慣用法により薬学的に許容される投与形態に製剤する。投与量レジメンを、最適な所望応答(例えば、治療応答)を提供するように調節する。例えば、単回ボーラスを投与してよく、数回の分割投与量を一定時間かけて投与してよくまたは投与量を治療状況の緊急度により示されるように徐々に減らしても増やしてもよい。非経腸組成物を投与の容易さおよび投与量の均一さのために投与量単位形態に製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置する対象への均一投与に適した物理的に分けられた単位を言い、各単位は、所望の治療を生じると計算された予め決定された量の活性化合物を必要な医薬担体と共に含む。

【0304】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変わり得る。選択した投与量は、用いる特定の本発明の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、他の薬物、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的状態および薬歴などの医学分野で知られた因子を含む、多様な薬物動態因子による。

【0305】

医師または獣医師は、医薬組成物中で用いる本発明の抗体を、所望の治療効果が達成されるのに必要であるより低いレベルを用いて開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増やし得る。一般に、ここに記載するアレルギー性炎症性障害の処置のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の併用剤および処置が予防的であるか治療的であるかを含む多くの多様な因子により変わる。処置投与量は安全性および有効性を最適化するためにタイトレーションする必要がある。抗体の全身投与について、投与量は約０.０００１〜１００mg／kg、より一般にには０.０１〜１５mg／kg宿主体重の範囲であり得る。抗体の硝子体内投与について、投与量は０.１mg／眼〜５mg／眼の範囲であり得る。例えば、０.１mg／ml、０.２mg／ml、０.３mg／ml、０.４mg／ml、０.５mg／ml、０.６mg／ml、０.７mg／ml、０.８mg／ml、０.９mg／ml、１.０mg／ml、１.１mg／ml、１.２mg／ml、１.３mg／ml、１.４mg／ml、１.５mg／ml、１.６mg／ml、１.７mg／ml、１.８mg／ml、１.９mg／ml、２.０mg／ml、２.１mg／ml、２.２mg／ml、２.３mg／ml、２.４mg／ml、２.５mg／ml、２.６mg／ml、２.７mg／ml、２.８mg／ml、２.９mg／ml、３.０mg／ml、３.１mg／ml、３.２mg／ml、３.３mg／ml、３.４mg／ml、３.５mg／ml、３.６mg／ml、３.７mg／ml、３.８mg／ml、３.９mg／ml、４.０mg／ml、４.１mg／ml、４.２mg／ml、４.３mg／ml、４.４mg／ml、４.５mg／ml、４.６mg／ml、４.７mg／ml、４.８mg／ml、４.９mg／mlまたは５.０mg／ml。処置レジメの例は、２週間毎または月１回または３〜６ヶ月毎の全身投与を必要とする。処置レジメの例は、２週間毎または月１回または３〜６ヶ月の全身投与を必要とする。

【0306】

抗体は、通常複数回投与する。各投与の間隔は週、月または年であり得る。患者のＰ因子結合抗体の毛中レベルの測定により示されるとおり間隔は不定期であってもよい。さらに、別の投与間隔が医師により決定されてよく、毎月または有効であるための必要に応じて投与される。有効性は病変増殖、ルセンティスレスキューの割合、スペクトラルドメイン光干渉断層撮影(ＳＤ−ＯＣＴ)で決定した網膜厚および二次的視力に基づく。全身投与のいくつかの方法において、１〜１０００μg／ml、ある方法では２５〜５００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するように投与量を調節する。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与でき、この場合、少ない頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者の抗体半減期により代わる。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体および非ヒト抗体より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は処置が予防的であるかまたは治療的であるかにより変わる。予防適用において、相対的に低投与量を、相対的に低頻度で、長期間にわたり投与する。ある患者は、死ぬまで処置を受け続ける。治療的適用において、相対的に高投与量を、相対的に短い間隔が、疾患進行が減少するまたは停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで必要であることがある。その後、患者に予防的レジメを投与してよい。

【実施例】

【0307】

次の実施例は本発明をさらに説明するために提供するが、その範囲に限定されない。本発明の他の変法が当業者には容易に明らかであり、添付する特許請求の範囲に包含される。

【0308】

実施例１：親和性成熟Ｐ因子抗体の産生
完全なヒトファージ表示ライブラリーを使用して、ここに記載するＰ因子結合抗体を産生した。
ビオチニル化および非ビオチニル化ヒトおよびカニクイザルＰ因子を溶液および固相パニングに使用した。標準的パニングをＲａpMＡＴ手法と同様行った(Prassler et al., (2009) Immunotherapy 1(4):571-583)。親和性成熟後(Knappik et al., (2000) J.Mol.Biol., 296:57-86)、一連の１０抗体をその後ジスルフィド架橋Ｆａｂ形式への変換のために選択した。得られたジスルフィド架橋Ｆａｂｓを表１に示す(ＮＶＳ９６２、ＮＶＳ９６３、ＮＶＳ９６４、ＮＶＳ９６５、ＮＶＳ９６６、ＮＶＳ９６７)。

【0309】

実施例２：さらなる抗体最適化
次の実施例は、ここに記載する抗体のさらなる最適化に使用し得る方法を記載する。

【0310】

脱アミド部位の除去
脱アミド部位を、還元状態で行ったペプチド位置づけおよび分子ふるいクロマトグラフィー(ＳＥＣ)により同定した。脱アミド物質はＭＡＣ沈着アッセイにおいて効果が減少し、BiacoreおよびＳＥＴで測定して、ヒトおよびカニクイザルＦＰに対する親和性が減少している。脱アミドの程度は経時的(３週間)、高温度(５日間、３７Ｃ)および還元条件下に増加した。脱アミドをイオン交換カラムを使用して検出でき、複数ピークおよび付加的脱アミドピークの観察をもたらす。最も脱アミドされやすいアミノ酸配列はＳＮＧ、ＬＮＧ、ＬＮＮ、ＥＬＮである(Daugherty, A. and Mrsny, R. (2010) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing. Springer. p103-129)。したがって、我々は、脱アミド部位を除去し、機能保持について修飾抗体を試験するため一連の試験をした。
２個のＦａｂｓ、ＮＶＳ９６２およびＮＶＳ９６５を、重鎖の脱アミド部位、特異的に３０位にあるアスパラギンを置換するために再設計した。次の新規Ｆａｂｓを産生して脱アミド部位を除去し、対応するアミノ酸置換を表２に示す。

【0311】

【表70】

産生したさらなるＦａｂは、Ｆａｂ ＮＶＳ９６２におけるセリン３１をアラニンで置換し、Ｆａｂ ＮＶＳ９６２−Ｓ３１Ａを産生した。修飾されたＦａｂｓの配列は表１に示す。

【0312】

開裂部位の除去
さらに最適化をＮＶＳ９６２−ＳおよびＮＶＳ９６５−Ｓで行って、重鎖ＣＤＲ３における開裂部位を除去した。特異的に、重鎖をＹ１０２Ｓ１０３で開裂した。下記表は開裂部位破壊のために行ったアミノ酸置換を記載する。修飾されたＦａｂｓの配列は表１に示す。

【表71】

【0313】

実施例３：最適化抗体の特徴づけ
次の実施例は、抗体親和性の測定に使用し得る方法を記載する。これらおよび他の結合親和性測定法は当分野で知られている。

【0314】

親和性決定
Ｐ因子の抗体親和性を、Biacore T200(Biacore)を使用する表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)および溶液平衡滴定(ＳＥＴ)により測定した。Ｐ因子結合についての各技術および対応する平均結果を下に記載する。モデリング仮定は、系中のＰ因子濃度、Ｐ因子生合成の動態および半減期、ならびに所望の投与スケジュールを考慮に入れて、Ｐ因子に対して５００pMより大きい親和性のＦａｂが遊離Ｐ因子レベル低下に十分であることを示唆する。

【0315】

Biacore決定
相互作用の動態、すなわち複合体形成(ｋ_ａ)および解離(ｋ_ｄ)の速度をセンサーグラムの情報から決定できる。サンプルが調製したセンサー表面を通過するとき結合が起こるならば、センサーグラムの応答は増加する。平衡に達したならば、一定シグナルが見られる。サンプルを緩衝液で置き換えると、結合分子が解離し、応答が減少する。Biacore評価ソフトウェアは、相互作用モデルにデータを適合させることによりｋ_ａおよびｋ_ｄの値を得る(表４)。

【0316】

Biacore動態実験を、ＣＭ５センサーチップ(GE Healthcare、BR-1005-30)を使用するBiacore T100(GE Healthcare)で２５℃で行った。流動緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ(＋)(GE Healthcare、BR-1001-88)であった。要約すると、結合親和性決定のために次の工程を行った。
・ 抗ＦＰ ＩｇＧ固定化センサーチップ製造：マウス抗ＦＰモノクローナル抗体(Quidel、Ａ２３５)(アセテートｐＨ５.０カップリング緩衝液(GE Healthcare、BR-1003-51)中３０μg／ml)を、ＣＭ５チップ上の２個のフローセル(Ｆｃ１および２)に１０μl／分の流速で６００秒、製造者の指示に従うアミノカップリング法を使用してカップリングさせた(GE Healthcare、BR-1000-50)。最終固定化レベルは＞７０００ＲＵであった。
・ 第二フローセルへのＦＰ捕捉：流動緩衝液中１μg／mlのＦＰを１０μl／分で第二フローセル(Ｆｃ２)に注入し、Ｆａｂのための捕捉レベル〜２０ＲＵまたはＩｇＧ動態分析のための〜７ＲＵに到達させた。
・ 両フローセルへの種々の濃度の抗ＦＰ ＦａｂまたはＩｇＧ注入：両フローセル(Ｆｃ１および２)に抗ＦＰ溶液(流動緩衝液中０.３１２５nM〜１０nM；１：２連続希釈)を６０μl／分で２４０秒注入。
・ 解離：ＨＢＳ−ＥＰ(＋)流動緩衝液を６０μl／分で両フローセルに注入し、ＦＰと抗ＦＰ Ｆａｂ／ＩｇＧの解離をモニター。解離時間を５nMおよび２.５Ｍ Ｆａｂ／ＩｇＧ濃度では２４００秒および別の５nM Ｆａｂ／ＩｇＧ濃度を含む他の全濃度で３００秒に設定した。
・ 再生：再生を、両フローセルで各サイクルの最後に１０mM グリシン−ＨＣｌ ｐＨ１.７(GE Healthcareにより提供)＋０.０５％Ｐ２０ 界面活性剤(GE Healthcare、BR-1000-54)で流速６０μl／分で１５秒、２回行った。
・ 動態分析：動態速度定数を、１：１結合モデルをBIAevaluation 1.1ソフトウェアに適合させることにより得て、ここで、Ｒ_ｍａｘ値を局所的に適合させた。

【0317】

Biacore結合動態決定の結果を表４に示す。示されるとおり、ここに記載する抗体はヒトＰ因子に対し高親和性結合を示し、ＫＤ値は典型的に１nM以下、多くの場合２００pM以下であった。これらの抗体はまたカニクイザルＰ因子に極めて高い親和性を示す(結合親和性５００pM未満)。

【0318】

ＳＥＴ決定
ＳＰＲのようなセンサー表面を使用する動態アッセイとは対照的に、ＳＥＴは、溶液での親和性を決定する方法である。動態データを送達しない平衡測定である。
ＳＥＴにおいて、一定量の抗体を種々の濃度の抗原と、平衡に達するまでインキュベートする。平衡化溶液中の遊離抗体濃度を、溶液を抗原被覆ＭＳＤＴＭプレート(Meso Scale Discovery^ＴＭ)に適用し、続いてＥＣＬ標識二次的抗体とインキュベートし、シグナル強度を測定することにより決定する。低抗原濃度で、強シグナルが達成され(プレート上の抗原と結合する高濃度の遊離抗体)、高抗原濃度については、抗体が完全に抗原捕捉され、低シグナルとなる。マッチング範囲での十分な数の抗原濃度が利用可能であるならば、適当な適合モデルを使用して、滴定曲線は親和性の合理的決定を可能にする。完全滴定のために、予測Ｋ_Ｄの少なくとも１０倍高い抗原濃度を適用する。アッセイに適用する抗体の一定濃度はＫ_Ｄの範囲またはそれより下でなければならない(表４)。

【0319】

溶液平衡滴定(ＳＥＴ)でのＫ_Ｄ決定のために、抗体タンパク質の単量体フラクションを使用した(少なくとも９０％単量体含量、分析的ＳＥＣにより分析；ＦａｂについてはSuperdex75 (Amersham Pharmacia)またはＩｇＧについてはTosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience))。
溶液での親和性決定を基本的に文献に記載のとおり行った(Friguet et al. 305-19)。ＳＥＴ方法の感受性および精度を改善するために、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬベースの技術に変えた(Haenel et al., 2005).
１mg／mlヤギ抗ヒト(Ｆａｂ)_２フラグメント特異的抗体(Dianova)をＭＳＤスルホＴＡＧ^ＴＭ ＮＨＳ−エステル(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA)で製造者の指示に従いラベルした。

【0320】

ヒトＰ因子(Complement Technology cat#：A139)およびカニクイザル血清から精製したカニクイザルＰ因子(Nakano, et al., (1986) J Immunol Methods 90:77-83を応用したプロトコル)を、標準的結合ＭＳＤプレート(Meso Scale Discovery、３８４ウェル：MSD cat#:L21XA、９６ウェル：MSD cat#:L15XA)に、２５μl ＰＢＳ中０.２〜０.３μg／mlで被覆し、一夜、４℃でインキュベートした。Ｐ因子阻害剤を固定濃度(１pMまたは１０pM)にインキュベーション緩衝液(ＰＢＳと２％ＢＳＡ(Sigma cat#：Ａ４５０３)および１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ(Sigma cat#：２３４７２９))で希釈し、インキュベーション緩衝液中のＰ因子(ヒトまたはカニクイザル)の一連の希釈物に天下した。サンプルを、ＲＴで一夜インキュベートして平衡化させた。プレートを洗浄緩衝液(ＰＢＳと０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、１００μl インキュベーション緩衝液でＲＴで２時間遮断した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。Ｐ因子阻害剤およびＰ因子滴定含有サンプルをプレート(２５μl)に天下し、ＲＴで１５分インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。２５μl 検出抗体(抗ヒト(ヤギ)スルホＴＡＧ、インキュベーション緩衝液中１：１０００、MSD cat#:R32AJ-1)を添加し、ＲＴで６０分インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μlの１×ＭＳＤ Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加した(界面活性剤と共に、MSD cat#:R92TC-1)。プレートをMSD Spector Imager 6000で読んだ。

【0321】

データをGraphPad Prismソフトウェアｖ４で、バックグラウンド(Ｆａｂ非含有ウェルの平均)を各値から減算した。Ｘ軸値(溶液中のＰ因子濃度)をｌｏｇ１０ｘに変換した。ＫＤ値(ＫＤ)を次のモデルから適合させた：
Ｆａｂ：

【数1】

Ｔｏｐ＝抗原濃度＝０でのシグナル
ｘ＝溶液中のＰ因子濃度
Ｆａｂ＝一価検体(Ｆａｂ)に適応した濃度

【0322】

【表72】

【表73】

【0323】

実施例４：Ｐ因子抗体は代替補体経路を阻害する
溶血アッセイ
溶血手法において、全ての補体成分が存在し、機能的でなければならない。それゆえに、溶血手法は機能的完全性および補体系の欠損の両方をスクリーニングできる(van et al., 1980;Minh et al., 1983;Tanaka et al., 1986)。古典的経路の機能的能力を測定するために、溶血素で被覆したヒツジ赤血球(ウサギＩｇＧをヒツジ赤血球に)またはウサギ抗ニワトリ抗体で感作したニワトリ赤血球を標的細胞(感作細胞)として使用した。これらのＡｇ−Ａｂ複合体は、成分が機能的であり、適切な濃度で存在するとき、古典的経路を活性化し、標的細胞を溶解する。ヒトおよびカニクイザル血清における代替経路の機能的能力を決定するために、ウサギ赤血球を標的細胞として使用する(米国特許番号６,０８７,１２０参照)。

【0324】

溶血アッセイは、補体活性化について試験する基本的機能的アッセイであり、抗ヒトＦＰ ｍＡｂｓおよびＦａｂ分子が補体経路による赤血球(ＲＢＣｓ)溶解を遮断する能力を評価するために使用されている。ヒトＣ５を認識する一本鎖Ｆｖフラグメントによる補体活性のインビトロおよびインビボ阻害を、溶血アッセイを使用して測定できる(Thomas et al., 1996;Rinder et al., 1995;Rinder et al., 1995)。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９産生の遮断は、体外循環中の白血球および血小板活性化を遮断する。要約すると、古典的経路アッセイのために、感作赤血球(例えば、ニワトリＲＢＣｓ)を血清に存在する補体タンパク質による溶解の標的として使用する。次のアッセイが、代替補体経路阻害についてのＰ因子抗体の特徴づけおよびスクリーニングに興味深い。

【0325】

この方法はRinder et al., 1995;Thomas et al., 1996の応用である。
試薬：
・ ウサギ赤血球(Ｒｂ ＲＢＣｓ) − Lampire, Cat# 7246408
・ ヒト血清 − Novartis Blood Research Program；またはカニクイザル血清 − Alpha Genesis
・ ゼラチンベロナール緩衝液(ＧＶＢ) − Boston BioProducts, Cat# IBB-300
・ ＥＧＴＡ − Boston BioProducts, Cat# BM-151
・ ＭｇＣｌ_２
・ Ｕ底９６ウェルプレート − Corning, Cat# 3795
・ Ｆｌａｔ底９６ウェルプレート − Corning, Cat# 3370
・ ＮＰ−４０ − Sigma, Cat# 74385

【0326】

プロトコル：
ウサギ赤血球(ＲＢＣｓ)を洗浄し、ＧＶＢ／ＥＧＴＡ／Ｍｇ^＋＋中で８.３３×１０^７細胞／mlに調節した。ＧＶＢで希釈した５０μl Ｆａｂを９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。ＥＧＴＡおよびＭｇ^＋＋含有ＧＶＢで希釈した５０μl血清をついで添加した。コントロールウェルを次の方法で調製した：Ｆａｂ非含有血清(ネガティブコントロール)および細胞＋０.１％ＮＰ−４０(１００％溶解コントロール)およびＮＰ−４０ブランクウェル。Ｆａｂ含有および非含有血清およびコントロールを室温で３０分インキュベートした。この時点で、３０μl Ｒｂ ＲＢＣｓをサンプルおよコントロールウェルに添加し、３０μlの緩衝液をブランクウェルに添加した。細胞を一般的に３０分、３７℃でインキュベートし、プレートを２０００rpmで５分遠心分離した。上清を回収し、平底プレートに移した。上清の吸光度をＯＤ４１５およびＯＤ５７０で読んだ。溶血パーセントを次の式を使用して計算した。

【数2】

【0327】

表５は、Ｐ因子抗体および抗原結合フラグメントが１０％ヒトまたは２０％カニクイザル血清で溶血を阻害する能力を例示する。ここに記載するＰ因子抗体の各々は、溶血を５０nM以下のＩＣ_５０で阻害する。
対照的に、古典的補体経路活性化を試験するためにアッセイを感作赤血球で行ったとき、ここに記載するＰ因子抗体は、古典的補体経路を阻害しないことが判明した(データは示していない)。

【0328】

Ｃ３ｂ沈着アッセイ
代替経路における補体Ｃ３に対して活性な阻害剤を測定する一つの方法は、ザイモサン上に沈着する分解産物であるＣ３ｂの測定である。このＥＬＩＳＡに基づくアッセイを、次の工程で行った：カーボネート緩衝液、ｐＨ９.６(Pierce Cat# 28382)中の２５μlの１mg／ml ザイモサンＡ(Sigma Z4250)を、Maxisorp３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート(Nunc 464718)に一夜、４℃で被覆した。次の日、ザイモサン被覆プレートを吸引し、１００μl／ウェルのＥＬＩＳＡ遮断緩衝液であるSynblock(AbD Serotec BUFO34C)で、２時間、室温で遮断した。別の反応において、ゼラチンベロナール緩衝液(Boston Bioproducts IBB320−１０mM バルビタール、１４５mM ＮａＣｌ、０.１％ゼラチン、０.５mM ＭｇＣｌ_２、１０mM ＥＧＴＡ)で連続希釈した阻害剤を、１mM ＭｇＣｌ_２および１０mM ＥＧＴＡの最終総反応濃度となるようにＭｇＣｌ_２およびＥＧＴＡを添加した１０％血清に添加した。ポジティブコントロールは阻害剤を含まず、ネガティブコントロールは２５mM ＥＤＴＡを含んだ。混合物を室温で３０分インキュベートすることにより再平衡化した。遮断緩衝液を除去するために、緩衝液を吸引し、プレートをＴＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄した。２５μl／ウェルの阻害剤含有１０％血清またはコントロールをプレートに添加し、３７℃で３０分インキュベートした(ザイモサン上のＣ３ｂ沈着の直線状範囲内にあることを予め時間経過により決定した)。３０分のインキュベーション後、プレートをＴＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回インキュベートした。ザイモサン上のＣ３ｂ沈着を検出するために、製造者の指示に従いＰＢＳと２％BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN 16006980)で希釈した２５μl／ウェルのニワトリ抗ヒトＣ３−ＨＲＰコンジュゲートポリクローナル抗体(Immunology Consultants Laboratory, Inc. Cat# CC3-80P-1)、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma cat# P1379)および０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００(Sigma cat# P234729)をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ついで２５μlのUltra TMB基質溶液(Pierce Cat#34028)を添加した。ウェル中の溶液が青色に変わったら、１５μlの２Ｎ 硫酸で反応を停止させた。プレートを、Spectromaxを使用して４５０nmで読み、プラスチックプレートについて５７０nm(ＯＤ_{４５０−５７０ｎｍ}読み取り)で補正した。ザイモサン上のＣ３ｂ沈着を次の式により計算した：

【数3】

試験した抗体の各々は、少なくとも１０nM以下のＩＣ_５０でＣ３ｂ沈着を阻害した(表５)。

【0329】

ＭＡＣ沈着アッセイ
Ｐ因子抗体が代替補体経路を阻害する能力の決定に使用できる他のアッセイは、抗体が、Ｃ３コンバターゼおよびＰ因子活性の下流である膜侵襲複合体(ＭＡＣ)産生を阻害する能力である。要約すると、ザイモサンＡ(Sigma)を、プレートに、カーボネート緩衝液、ｐＨ９.５中１mg／mlで被覆し、代替経路を活性化した。Ｆａｂｓを血清(２０％血清、５mM ＭｇＣｌ_２、１０mM ＥＤＴＡ)とプレインキュベートし、ついでプレートに添加し、一夜、室温でインキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄後、ＭＡＣを抗Ｃ５ｂ−９−ＡＬＰ(Diatec)と１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、２mM ＭｇＣｌ_２添加４−メチルウンベリフェリルホスフェート(Fisher)と３０分間インキュベートすることにより検出した。０.２Ｍ ＥＤＴＡで反応を停止させ、プレートをｅｘ＝３５５nm、ｅｍ＝４６０nmで読んだ。ＭＡＣ沈着阻害を、各サンプルについてベースライン(ＥＤＴＡ処置ヒト血清)およびポジティブコントロール(ヒト血清)に対して計算し、ＰＲＩＳＭでのＩＣ_５０曲線の作成に使用した。
表５は、Ｐ因子抗体がＭＡＣの沈着を阻害する能力を証明するデータを示し、それ故に、抗体が代替補体経路を阻害することを示唆する。具体的に、抗体は、ＭＡＣ沈着を２５nM以下のＩＣ_５０で阻害した。

【0330】

Ｃ３ａ沈着アッセイ
Ｐ因子抗体の代替補体経路を阻害する能力を評価するために使用する他の方法は、Ｃ３コンバターゼによるＣ３開裂後抗体がＣ３ａの産生を阻害する能力の測定である。本アッセイを、１０mg／mlおよび１０％および２０％ヒト血清でで被覆し、２^ｎシリーズで希釈した抗プロパージンＦａｂとプレインキュベートしたザイモサン−被覆Maxisorpプレート被覆で行った。血清をプレートに３０分間添加し、その時点で血清をＣ３ａ産生の評価のために回収した。
Maxisorpプレートを、抗C3a des-arg neo抗体(１μg／ml)で一夜被覆し、３回洗浄し、希釈剤で２時間、室温で遮断した。希釈剤吸引後、血清を１時間添加した。プレートを３回洗浄し、希釈剤で希釈した１００μL／ウェル検出抗体マウス抗ヒトＣ３ａ−ビオチン１：１０００を添加した。さらに１時間のインキュベーション後、希釈剤で１：５０００希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ二次抗体をウェルに１時間、室温で添加した。プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ検出基質を添加した。標準停止溶液を使用して反応を停止し、吸光度を４５０〜５７０nmで読んだ。
血清添加と平行して、標準曲線を血清で希釈した精製C3a des-argを使用して作成した。５μg／mlから出発して、C3a des-argを１：４で連続的に希釈して、７点曲線を作成した。標準曲線ウェルを上記のとおり処理し、洗浄し、読んだ。

【0331】

【表74】

【表75】

ＮＤ：測定せず

【0332】

実施例５：種交差反応性
ヒトおよびカニクイザルに加えて、ここに記載する抗Ｐ因子抗体が他の種由来のＰ因子と結合するか否かを決定するために、ＭＡＣ沈着および溶血アッセイを上記のとおり行った。Biacore分析または溶血アッセイを上記のとおり行った。各種類として使用した血清濃度は次のとおりであった：１０および２０％ウサギ、１０および２０％カニクイザルおよび１０および２０％ヒト血清。ラットＰ因子結合をBiacoreで評価した。下記表６に示すとおり、Ｐ因子抗体は、ウサギ、ラットおよびカニクイザルを含む数種で交差反応可能であった。

【表76】

ＮＤ：測定せず

【0333】

実施例６：エピトープ位置づけ
Ｐ因子は、数個のトロンボスポンジン反復ドメイン(ＴＳＲ０−６)から成る。ＴＳＲ０ドメインはまたＮ末端ドメインとも呼ばれる。Ｐ因子Ｆａｂｓのエピトープ位置づけを、各ＴＳＲについてマウスおよびヒトキメラを調製することにより行った。先の機能的アッセイはＦａｂｓがマウスＰ因子と結合しないことを示したが(溶血アッセイ)、キメラの各々はＰ因子枯渇血清で機能的であった。この方法を使用して、全てのＦａｂｓがＴＳＲ５(配列番号４０６)に結合することが決定された。図１Ｃは、抗体がＴＳＲ５の領域Ｂに結合することを示す。市販の抗体であるＡ２３３はこの領域に結合しないことが示された。結合を、標準方法を使用してＥＬＩＳＡまたはBiacoreで評価できる。１個のＡｂ、ＮＶＳ４８７について、データは、マウスＰ因子との交差反応性のために決定的ではなかった。マウスとヒトＰ因子ＴＳＲ５ドメインの配列整列化は、エピトープが配列番号４０８のアミノ酸を含むことを示す。

【0334】

実施例７：代替補体経路のインビボ阻害
カニクイザルで本発明の抗体を用いて実験を行い、代替補体経路を阻害する能力を決定した。
試験アイテムであるＮＶＳ９６２を表７に示す投与レベルで投与した。投与経路は硝子体内(ＩＶＴ)または静脈内(ＩＶ)のいずれかであった。

【表77】

【0335】

表７に示すとおり、試験アイテムおよび媒体溶液(媒体：１０mM Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ；１０％トレハロース；０.０２％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ５.５)を硝子体内および静脈内に実験１日目、１５日目および２９日目に投与した。
毒性評価は死亡率、臨床所見、体重、薬力学(溶血分析)、眼科検査、眼内圧測定、網膜電図検査、血液所見、臨床試験、臓器重量および病理に基づいた。
実験中死亡例はなく、臨床所見、体重、眼科検査、眼内圧測定、網膜電図検査、血液所見、臨床試験、臓器重量および病理の評価で試験アイテムに関連した関連知見はなかった。
補体介在溶血活性を上記溶血アッセイを使用して測定した(実施例４参照)。溶血アッセイデータの分析は、ＮＶＳ９６２のＩＶ投与が、投与直後溶血補体活性の完全なまたはほぼ完全な、しかし短命の、阻害に至ることを示した。ＩＶＴ経路で１mg／眼の投与量で投与したとき、試験アイテムは血清溶血補体活性にわずかしか効果がないかまったく効果がなかった。５mg／眼および１０％カニクイザル血清で、溶血補体活性の完全なまたはほぼ完全な阻害が観察された。

【0336】

実施例８：抗体組み合わせによる代替補体経路の阻害
溶血アッセイ
表２からの抗Ｃ５抗体８１０９および表１からの抗Ｐ因子抗体ＮＶＳ９６２のＦａｂバージョンを使用する溶血アッセイを実施例４に記載のとおり行った。
図２は、抗Ｃ５抗体および抗原結合フラグメントと組み合わさったＰ因子抗体および抗原結合フラグメントが２０％ヒト血清において溶血を阻害する能力を例示する。５００nM抗Ｐ因子および５００nM抗Ｃ５ Ｆａｂｓは、個々では６０分インキュベートしたとき、溶血阻害の効果がないことが証明されている。対照的に、抗Ｐ因子および抗Ｃ５抗体の同じ濃度および１６７nMほども低い濃度での組み合わせが、ほぼ完全な溶血阻害を証明した。さらに、ほぼ完全な溶血阻害は２５０分まで続いた。

【0337】

溶血アッセイからのデータをChalice AnalyzerソフトウェアChalice Analyzerソフトウェアを使用して、補体阻害抗体が、補体活性化遮断に対して相乗的に作用するか否かを決定。組み合わせ効果は、単剤曲線に基づく組み合わせ参照モデルと、各データ点の比較により特徴付けることができる(Greco, Bravo, Parsons (1995). The search for synergy: a critical review from a response surface perspective. Pharmacol Rev 47(2): 331-85)。Loewe加算性モデル(Loewe (1928). Die quantitativen Probleme der Pharmakologie. Ergebn. Physiol. 27: 47-187)において、Ｉ_Loewe(Ｃ_Ｘ,Ｃ_Ｙ)は、(Ｃ_Ｘ／ＩＣ_Ｘ)＋(Ｃ_Ｙ／ＩＣ_Ｙ)＝１を満たす阻害であり、ＩＣ_Ｘ,Ｙは、適合単剤曲線のＩ_Loeweでの有効濃度である。加算性は、ＸおよびＹが同じ化合物であるときに産生された組み合わせ応答を表すため、相乗性の一般的に認められた参照である(Greco et al.)。

【0338】

効力変化を、通常、同じ効果に到達するのに必要な単剤と比較したときに、所望の効果レベルに到達するのに必要な薬剤がどの程度少ないかを示すアイソボログラム(Greco et al.)を使用して示す。アイソボログラム表示および組み合わせ指数計算のための効果レベルの選択は、手動でも、Chalice Analyzerで自動に選択させてもよい。自動等レベル選択アルゴリズムは、観察したＩ_データを最大Ｉ_データ−Ｉ_Loeweと共に発見し、少ない単剤Ｉ_ｍａｘを超えるＩ_データのデータ点を除外する。この除外は、アイソボログラムが両方の単剤によりカバーされるレベルで最良の相乗性を反映することを確実にするために適用する。アイソボログラムレベルＩ_ｃｕｔの選択で、アイソボログラムは、選択した等レベルとの交差に対応する濃度の位置を同定することにより描かれる。アイソボログラムは、Loewe用量相加的“薬物それ自体”標準と比較した、相乗性の標準的アイソボログラム解析を示す。特定したアイソボログラムレベルについて、観察された等効果カウンター(例えば、図３における曲線)を理論的用量相加カウンター(例えば、図３における直線)と、組み合わせの両物質のＩＣ_効果標準化直線濃度スケール上に示す。用量相加参照は、常に２個のＩＣ_効果濃度を接続する線である。ＩＣ_効果交差点は、近似シグモイド用量応答曲線の内挿により見ることができる。

【0339】

効力変化を組み合わせ指数ＣＩとしてスコア化する(Chou, Talalay (1984). Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55)。選択した等効果レベルＩ_ｃｕｔについて、ＣII＝(Ｃ_Ｘ／ＥＣ_Ｘ)_Ｉ＋(Ｃ_Ｙ／ＥＣ_Ｙ)_Ｉ(式中、特定のデータ点の(Ｃ_Ｘ／ＥＣ_Ｘ)_Ｉは選択阻害レベルでのその有効濃度に対するＸ化合物の測定濃度の比である)である。ＣＩは、どの程度の薬剤が選択した効果レベルを達成するために単剤に対して組み合わせで必要であるかを概算すると考えることができ、０.１の価は、単剤のわずか１／１０当量が同じ効果レベルを達成するために必要であったことを意味する。０.５〜０.７の範囲のＣＩ値が、現在の臨床組み合わせのインビトロ測定で典型的である(Greco et al.)。１.０のＣＩ値は抗体の組み合わせの相加効果の指標であり、一方０.５未満のＣＩ値は、抗体組み合わせから得られる強い相乗効果の指標である。Chalice Analyzerにおいて、最高ＣＩが、各Ｉ_ｃｕｔ交差濃度について計算した多くの組み合わせ指数価から報告される。全測定ＣＩ値の中で、最大シグナル対ノイズレベルを最高組み合わせ指数として記載する。

【0340】

溶血アッセイからのデータを阻害％で示し、８×８Excel表に載せ、ここで、抗体濃度をμＭ値として示した。ExcelテンプレートをChaliceソフトウェア(Lehar et al. 2009)にアップロードし、組み合わせ指数を、各抗体のＩＣ_２０を使用してアイソボログラム曲線を作成することにより産生した(ＣＩ＝Ｃ_Ｘ／ＩＣ_Ｘ＋Ｃ_Ｙ／ＩＣ_Ｙ、ここで、ＩＣ_ＸおよびＩＣ_ｙはそれぞれ２０阻害％効果をもたらす抗Ｐ因子抗体および抗Ｃ５抗体単独の濃度であり、Ｃ_ＸおよびＣ_ｙは２０％阻害をもたらす混合物の各薬剤の濃度である)。２０％阻害での組み合わせ指数は０.３６であり、抗Ｐ因子抗体と抗Ｃ５抗体の相乗作用を示す(図３)。

【0341】

マクロファージ浸潤
抗ｆＰおよび抗Ｃ５ Ｆａｂｓの効果を個々にまたは組み合わせてインビボで眼炎症のポリ−ＩＣマウスモデルを使用して。マウスに合成ｄｓＲＮＡアナログであるポリＩ：Ｃを０.１ml ＰＢＳ中、全身的にＣ５７ＢＬ／６マウスにi.v.注射し、抗ｆＰ(表１からの抗体ＮＶＳ９６２)および抗Ｃ５抗体(表２からの抗体８０１９)を個々にまたは組み合わせて併用した。示す時点でマウスを屠殺した。眼および網膜を回収し、タンパク質抽出物をサイトカインで調整し、Multiplexアッセイ(Pierce)を使用してケモカイン分析した。網膜白血球浸潤を決定するために、眼を４％パラホルムアルデヒドに固定し、マクロファージに対するAlexa Fluor-488コンジュゲートＦ４／８０抗体で染色した。網膜を、網膜脈管構造がスライドガラスの上面に向くように平らにマウントし、１滴のVectashieldマウンティング媒体(Vector Laboratories Inc, Burtingame, CA)と共にカバースライドを載せた。各網膜の５(５００μm)領域の蛍光像をAxio.ImageM1顕微鏡(Zeiss)上のAxiocam MR3カメラで撮った。好中球およびマクロファージの数をAxiovisionソフトウェア(Version 4.5 Zeiss)で定量した。光干渉断層撮影(ＯＣＴ)を使用して、ポリＩ：Ｃで処置したマウスからの網膜像を得て、分析した。これらの結果(図４)は、試験した最高濃度(２０μg)で、４５阻害％と同程度のマクロファージ阻害が観察された。対照的に、抗Ｐ因子とＣ５抗体の２μgほどの低濃度での組み合わせは７９阻害％を証明し、濃度を挙げると１００阻害％を達成した(抗Ｃ５および抗Ｐ因子抗体個々ではそれぞれ１３％および３２阻害％と対照的)。

【0342】

前段に記載するインビボポリ−ＩＣモデル(マクロファージ浸潤)からのデータを阻害％として表し、４×４Excel表に載せ、ここで、抗体濃度をμＭ値として示した。ExcelテンプレートをChalice Analyzer(上記)にアップロードし、組み合わせ指数を、各抗体のＩＣ_５０を使用してアイソボログラム曲線を作成することにより産生した(ＣＩ＝Ｃ_Ｘ／ＩＣ_Ｘ＋Ｃ_Ｙ／ＩＣ_Ｙ、ここでＩＣ_ＸおよびＩＣ_ｙはそれぞれ５０阻害％効果をもたらす抗Ｐ因子抗体および抗Ｃ５抗体単独の濃度であり、Ｃ_ＸおよびＣ_ｙは５０阻害％をもたらす混合物の各薬剤の濃度である)。５０阻害％での組み合わせ指数は０.４２であり(図５参照)、抗Ｐ因子抗体と抗Ｃ５抗体の相乗作用を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]