特許 6232373 ワクチンから抗原を単離し定量する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6232373

(24)【登録日】2017年10月27日

(45)【発行日】2017年11月15日

(54)【発明の名称】ワクチンから抗原を単離し定量する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/20 20060101AFI20171106BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20171106BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20171106BHJP

   A61K 39/165 20060101ALI20171106BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20171106BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20171106BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20171106BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20171106BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/20

   C12N7/02

   C07K14/11

   A61K39/165

   A61K39/155

   A61K39/145

   G01N33/68

   G01N30/02 B

【請求項の数】27

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-506509(P2014-506509)

(86)(22)【出願日】2012年4月18日

(65)【公表番号】特表2014-513680(P2014-513680A)

(43)【公表日】2014年6月5日

(86)【国際出願番号】US2012034054

(87)【国際公開番号】WO2012145386

(87)【国際公開日】20121026

【審査請求日】2015年4月9日

(31)【優先権主張番号】61/477,835

(32)【優先日】2011年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506299054

【氏名又は名称】ナノセラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100133042

【弁理士】

【氏名又は名称】佃 誠玄

(72)【発明者】

【氏名】グラニンガー，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】カリヴォダ，マルティン

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０５９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１８０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３８５６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Biol. Stand.，１９８０年，Vol.8, No.3，pp.233-242

【文献】 J. Chromatogr.，１９８３年，Vol.266，pp.55-66

【文献】 Vaccine，２００９年，Vol.27, No.9，pp.1468-1477

【文献】 Vaccine，２００６年，Vol.24, No.16，pp.3137-3144

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／２０

Ａ６１Ｋ ３９／１４５

Ａ６１Ｋ ３９／１５５

Ａ６１Ｋ ３９／１６５

Ｃ０７Ｋ １４／１１

Ｃ１２Ｎ ７／０２

Ｇ０１Ｎ ３０／０２

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ワクチン組成物からＨＡ１抗原またはＨＡ１抗原サブタイプを単離する方法であって：
（ａ）界面活性剤を使用せず、かつ、アルキル化剤を使用せずに、還元によりワクチン組成物中のＨＡ１抗原またはＨＡ１抗原サブタイプを可溶化する工程であって、還元がカオトロピック試薬の存在下で７０℃〜９０℃のインキュベーション温度で行われる、工程；および
（ｂ）得られたワクチン組成物から分画によりＨＡ１抗原またはＨＡ１抗原サブタイプを単離する工程を含む、前記方法。

【請求項2】

インキュベーション温度が７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記還元は、ワクチン組成物をジチオスレイトールで処理することを含む、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

前記可溶化工程は、カオトロピック試薬で変性させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

抗原または抗原サブタイプの酸性化により還元をさらに行うことにより分離した抗原サブタイプ間でジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

抗原を含むワクチン組成物中の抗原または抗原サブタイプの含有量を定量する方法であって、抗原または抗原サブタイプを定量する工程をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を含む、前記方法。

【請求項7】

定量工程を抗原標準を用いずに行う、請求項６記載の方法。

【請求項8】

定量工程を抗原標準を用いて行う、請求項６記載の方法。

【請求項9】

定量工程は、アミノ酸分析による抗原の定量を含む、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

前記還元は５分から２０時間のインキュベーション時間で行う、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記還元は３０分から２時間のインキュベーション時間で行う、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記還元は１時間のインキュベーション時間で行う、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記還元は８５℃のインキュベーション温度で行う、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記カオトロピック試薬が、塩酸グアニジン、尿素、チオ尿素、リチウム、過塩素酸塩、またはチオシアネートである、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

酸性化をリン酸、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸、またはギ酸を用いて行う、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記分画をクロマトグラフィーで行う、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換−ＨＰＬＣ（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である、請求項１６記載の方法。

【請求項18】

前記クロマトグラフィーが逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣである、請求項１７記載の方法。

【請求項19】

前記ＨＡが、インフルエンザウイルスワクチン組成物、麻疹ウイルスワクチン組成物、パラインフルエンザウイルスワクチン組成物、またはムンプスウイルスワクチン組成物由来である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記ワクチン組成物がインフルエンザウイルスワクチン組成物である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

インフルエンザウイルスワクチン組成物が、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢからなる群から選択されるインフルエンザウイルスからの保護を提供する、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗原サブタイプが、インフルエンザＡ ＨＡ サブタイプ ＨＡ１、またはインフルエンザＢ ＨＡ１である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記抗原サブタイプが、前記インフルエンザＡ ＨＡ サブタイプ ＨＡ１である、請求項２２記載の方法。

【請求項24】

インフルエンザワクチン組成物が、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、およびインフルエンザＢからなる群から選択されるインフルエンザ型からの保護を提供する、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

２.５％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）で抗原含有量を定量する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

ＲＳＤが２.２％である、請求項２４記載の方法。

【請求項27】

ＲＳＤが１.３％である、請求項２５または２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１１年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／４７７，８３５号の利益を主張するものであり、その出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は一般に、ワクチンの分野および公知の標準を用いずに、ワクチン中の抗原を単離し、抗原含有量を測定する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

インフルエンザウイルスは、一般的に核タンパク質抗原および基質タンパク質抗原間の抗原差異に基づき、３つの型、Ａ、Ｂ、Ｃに分類される。インフルエンザウイルスは、２つの主要なウイルス表面糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原としての性質により、さらにサブタイプに分けられる。ＨＡとＮＡは共に抗原エピトープを持つ。ＨＡおよびＮＡに対して産生される抗体が、ヒトおよび動物における感染および／または疾病に対する耐性に関係している。インフルエンザに対するワクチン接種の有効性は、ワクチン中の免疫原性ＨＡの量により大きく左右される。従って、インフルエンザＡおよびＢウイルスの主な抗原決定因子はＨＡであり、インフルエンザに対するワクチン接種の有効性はワクチン中の免疫原性ＨＡの量、すなわち、抗原含有量に大きく左右される。

【0004】

これまで、抗原含有量は世界保健機関協働センター（以下「ＷＨＯ」）が提供する国際標準を用いて測定されており、それらは抗原価、例えば、ワクチンのＨＡ含有量の測定に用いられている。しかし、標準が利用できない時、例えば、異なる季節性株の間でウイルス性抗原に抗原差異がある（すなわち、相同性が比較的低い）時、または、まだ標準が全く用意されていないウイルスの世界的な流行が起きた時に、ワクチン製造業者がワクチンを製造することは多い。

【0005】

そのような世界的流行は２００９年４月に起こった。メキシコ、アメリカおよび他の国々でインフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９Ｈ１Ｎ１が大流行したのである。インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９Ｈ１Ｎ１は、ヒト、豚、鳥インフルエンザ由来の遺伝子を組み合わせて進化した新規のインフルエンザ株で、当初は「豚インフルエンザ」と呼ばれた。この特殊な事例において、ＷＨＯがＨ１抗原の標準を入手する前にワクチンが必要となった。２００９年９月、アメリカ食品医薬品局は２００９Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する４つのワクチンを承認した。しかし、これらのワクチンの開発時に、新しいワクチン中のＨＡを定量するために利用できるＷＨＯ標準はまだなかった。

【0006】

数十年の間、インフルエンザワクチンのＨＡ含有量は、世界保健機関（ＷＨＯ）協働センターが提供する国際標準を用い、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤまたはＳＲＤ）で分析されてきた。これらの国際標準は、抗原価、例えばワクチンのＨＡ含有量の定量に用いられている。ＳＲＩＤでは、インフルエンザのウイルス粒子を界面活性剤で破壊し、抗体をロードしたアガロースゲルで、室温で３日間、免疫拡散法に供する。ゲルの染色時に、抗原−抗体複合体の沈殿領域の直径を測定し、特定のサブタイプのウイルス調製物の抗原含有量を、既知の含有量のＨＡを含むこのサブタイプの全ウイルスの参照バッチから得られた検量線を用いて計算する。しかし、ＳＲＩＤは手がかかるロースロープットアッセイである。その上、特に非精製の（処理中の）インフルエンザウイルスに対する感受性、正確性、精度は比較的低い。

【0007】

Kapteynら（Vaccine 24:3137-44, 2006； “Kapteyn”）は、インフルエンザウイルス培養液中のＨＡの定量のため、ならびに３価のワクチン中の個々のインフルエンザ株由来のＨＡの同定のためのＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ法を公表した。しかしKapteynの方法は、標準を用いずにＨＡを定量することはしなかった。さらにKapteynは、界面活性剤を用いて抗原を可溶化し、アルキル化を用いてタンパク質が反応性スルフヒドリル基と再結合して複合体を形成することを防いだ。実際にKapteynの方法では、強い界面活性剤を使用することで膜を溶解し、ＨＡを完全に単離していた。また、Kapteynの方法は、ホルマリンにより不活性化したインフルエンザ株のＨＡを定量するのには適していないとされている。

【0008】

このように、これまでの技術では、粗ＨＡ試料または精製ＨＡ試料中のＨＡ抗原濃度を、特に界面活性剤またはアルキル化剤で処理されていない試料中のＨＡ抗原濃度を、ＷＨＯ協働センターが提供するようなＨＡタンパク質標準がない状態で、正確で効率的に測定する方法は開示されていない。ＷＨＯ協働センターから抗原標準が入手できるようになる前のワクチン製造において、ＨＡ等のウイルス性抗原を含む抗原を確実に単離・定量するための、堅実で正確で迅速な方法を求める強いニーズが当該分野であることは明らかである。以下の開示で、そのような方法の詳細を記載する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Vaccine 24:3137-44, 2006; “Kapteyn”

【発明の概要】

【0010】

本明細書に記載する方法は、利用可能な抗原標準がない状態でワクチン中の抗原含有量を測定する手段を提供するために開発された。従って本発明は、国際標準を必要としない、ワクチン開発および製造工程中の、ワクチン中の抗原濃度の迅速で正確な定量に関する当該分野における一つ以上のニーズに取り組む。このように、本明細書で提供される方法により、ＷＨＯが標準を開発・提供するのを待つことなしに、ワクチン製造業者は一般の人々に供給できるワクチンをより迅速に製造することができる。

【0011】

より詳細には、本発明はワクチン抗原を単離し正確に定量する、迅速で堅実な方法を提供し、その方法は標準を使用せず、正確で再現性がある。本開示は、種々の抗原での使用に適用可能であり、これまでのワクチン製造分野に改良された方法を提供する。

【0012】

本発明はワクチン組成物から抗原を単離する方法を提供し、前記方法は（ａ）界面活性剤を使用せずに、かつ、アルキル化剤を使用せずにワクチン組成物中の抗原を可溶化する工程；および（ｂ）分画により抗原または抗原サブタイプを単離する工程を含む。

【0013】

いくつかの態様では、可溶化工程を還元により行う。いくつかの態様では、還元は、ワクチン組成物をジチオスレイトールで処理することを含む。いくつかの態様では、還元は約５分から約２０時間までのインキュベーション時間で行う。他の態様では、還元は約３０分から約２時間までのインキュベーション時間で行う。より詳細な態様では、還元は約１時間のインキュベーション時間で行う。さらなる態様では、還元は約２０℃から約１００℃までのインキュベーション温度で行う。様々な態様では、還元は約５０℃から約９０℃までのインキュベーション温度で行う。ある態様では、還元は約８５℃のインキュベーション温度で行う。さらなる態様では、還元工程ではｐＨを調整している。様々な態様では、還元をｐＨ約６からｐＨ約１１までのｐＨで行う。特定の態様では、還元をｐＨ約７からｐＨ約１０までのｐＨで行う。付加的な態様では、可溶化工程は、カオトロピック試薬で変性させることをさらに含む。様々な態様では、カオトロピック試薬は塩酸グアニジン、尿素、チオ尿素、リチウム、過塩素酸塩、またはチオシアネートである。さらなる態様では、抗原または抗原サブタイプを酸性化してさらに還元を行うことにより、分離した抗原サブタイプ間でのジスルフィド結合の形成を防ぐ。様々な態様では、酸性化を、リン酸、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸、またはギ酸を用いて行う。

【0014】

いくつかの態様では、分画をクロマトグラフィーで行う。様々な態様では、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換−ＨＰＬＣ（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。例示的な態様では、クロマトグラフィーは逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣである。

【0015】

本発明はさらに、ワクチン組成物中の抗原または抗原サブタイプの含有量を定量する方法を提供する。そのような方法には、本明細書で上述したワクチン組成物から抗原を単離する方法が全て含まれ、抗原または抗原サブタイプを定量する工程がさらに含まれる。例示的な態様では、定量工程を抗原標準を用いずに行う。様々な態様では、定量工程はアミノ酸分析による抗原の定量を含む。いくつかの態様では、抗原はウイルス性または細菌性である。ある態様では、抗原は赤血球凝集素（ＨＡ）である。特定の態様では、ＨＡはインフルエンザウイルスワクチン組成物、麻疹ウイルスワクチン組成物、パラインフルエンザウイルスワクチン組成物、またはムンプスウイルスワクチン組成物由来である。いくつかの態様では、ワクチン組成物はインフルエンザウイルスワクチン組成物である。さらなる態様では、インフルエンザウイルスワクチン組成物は、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢからなる群から選択されるインフルエンザウイルスからの保護を提供する。様々な態様では、抗原サブタイプは、インフルエンザＡ ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３、ＨＡ４、ＨＡ５、ＨＡ６、ＨＡ７、ＨＡ８、ＨＡ９、ＨＡ１０、ＨＡ１１、ＨＡ１２、ＨＡ１３、ＨＡ１４、ＨＡ１５、ＨＡ１６およびインフルエンザＢ ＨＡのいずれか一つである。ある態様では、抗原サブタイプは、インフルエンザＡ ＨＡ サブタイプＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３、ＨＡ５、ＨＡ７、ＨＡ９、ＨＡ１０、またはインフルエンザＢ ＨＡである。例示的な態様では、インフルエンザＡ ＨＡ サブタイプはＨＡ１である。さらなる態様では、インフルエンザワクチン組成物は、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、およびインフルエンザＢからなる群から選択されるインフルエンザ型からの保護を提供する。様々な態様では、本方法は約２.５％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）で抗原含有量を定量する。より詳細な態様では、ＲＳＤは約２.２％である。さらにより詳細な態様では、ＲＳＤは約１.３％である。

【0016】

上述の概要は、本開示の全ての態様を定義するものではなく、付加的な態様が以下の発明を実施するための形態等の他のセクションで記載されている。本文書全体は、統合された開示として関連することを意図しており、例え特徴の組み合わせがこの文書の同一文または同一段落または同一セクション内に一緒に記載されていなくても、本明細書に記載する特徴の組み合わせは全て予期されると理解されるべきである。他の特徴および発明の効果は、以下の発明を実施するための形態から明らかとなる。しかし、本開示の趣旨および範囲内での種々の変形および改変が、この発明を実施するための形態から当業者に明らかとなるため、発明を実施するための形態および特定の実施例は、本開示の特定の実施形態を示す一方で、例示のためだけに提供されていることは理解されるべきである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、定義づけられた生化学的活性を有する生化学的対照試料である国際標準、例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）国際標準がない状態でのワクチンの開発および製造において、抗原を単離・調製し、抗原濃度を測定する新規の方法を提供する。本方法には、界面活性剤およびアルキル化を使用せずに、ワクチン組成物中のウイルス由来の抗原を可溶化することによる従来技術の改良も含まれる。次いで、可溶化した抗原を分画により分離し、定量アミノ酸分析により定量する。

【0018】

時宜を得て利用可能なＷＨＯ国際標準は、世界中でワクチン製造において、生化学的測定の比較基準として役に立っている。しかし、新しいウイルスが大流行して、標準を調製する必要がある時には、これらのＷＨＯ国際標準をすぐに利用できない。これまでの問題は、新しいウイルスの大流行に応じ、ワクチン製造業者は新しいワクチンの迅速な開発および製造を強いられる一方、新しいワクチン中の抗原を定量するためのＷＨＯ国際標準の供給を待っていることである。本開示の方法は、ＷＨＯ国際標準を必要とせずに抗原を定量する新規の方法を提供することにより、この問題の解決方法を提供する。

【0019】

病原菌由来の抗原の分離および回収方法に関する、これまでのもう一つの問題は、他のタンパク質からの抗原の分離が最適でないことである。当該分野で、対象の抗原タンパク質のピークの解像度は低く、回収率は低くて定量的でなく、試料の調製には非常に長い時間がかかった。本開示は、界面活性剤を使用せずに、例示的な態様では、抗原上のスルフヒドリル基を保護するためのアルキル化を行わずに、変性・還元させた試料中の抗原を、クロマトグラフィーを使用して単離することにより、これらの問題の多くを解決する。このように、副反応が少なく、試料の調製時間は大幅に減少する。クロマトグラフィーを用いた抗原の単離後、国際標準を使用せずに抗原濃度を定量する。より詳細な態様では、定量アミノ酸分析を抗原定量の代替方法として行う。

【0020】

従来技術で解決すべき課題は、ハイスループットな分離、精製、抗原の定量に適用できるであろう、正確で迅速で堅実な方法を提供することだった。より詳細な態様では、解決すべき課題は、界面活性剤を使用せず、アルキル化を必要とせず、抗原標準を必要とせずに、そのような方法を提供することだった。本明細書に記載する方法は、赤血球凝集素（ＨＡ）抗原、特に主要な決定因子であるＨＡ１が著しく良好に、調製物中に存在する他のタンパク質から高い純度で分離され、それを他の（既知の）値、国際標準と比較、または定量アミノ酸分析のいずれかにより、当業者は調製物中に存在する抗原の量を測定することができることを示す。

【0021】

より詳細には、本開示はＨＡ抗原を分離する新規の方法に関し、その方法は、可溶化した抗原調製物を界面活性剤を使用せずに利用し、抗原を、一つの態様では、クロマトグラフィーカラムで、分画する工程を含む。本開示は、ある態様では、カラムからのＨＡ抗原の溶出をさらに含み、またさらなる態様では、ＡＡＡによる抗原の定量を含む。

【0022】

しかし、本開示の任意の実施形態が詳細に説明される前に、本開示はその応用において、以下に記載された、または図および実施例に示された説明の詳細および構成要素の組み合わせに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で用いられるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。本出願で引用される参照文献は全て、本明細書に参照として明示的に組み込まれる。

【0023】

本開示は、他の実施形態を包含し、様々な方法で実行または実施される。また、本明細書で用いられる用語および専門用語は説明目的のためのものであり、限定するものとみなされるべきではないことが理解されるべきである。「を含む（including）」、「を含む（comprising）」または「を持つ（having）」という用語およびその変形は、その後に挙げる項目およびそれと同等なもの並びに付加的な項目を包含するという意味である。

【0024】

定義
他に断りがない限り、本明細書で用いられる技術・科学用語は全て、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。

【0025】

以下の略語を全体に渡って使用する。
ＡＡ アミノ酸
ＡＡＡ アミノ酸分析
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＨＡ 赤血球凝集素
ＨＡ１〜１６ 赤血球凝集素サブタイプ１〜１６
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ イオン交換−ＨＰＬＣ
ｋＤａ キロダルトン
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ 液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法
ＭＶＢ 単価バルク
ＲＳＤ 相対標準偏差
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相ＨＰＬＣ
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＲＤ 一元放射免疫拡散法
ＵＶ 紫外線

【0026】

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

【0027】

本明細書で用いられる場合、他に断りがない限り、以下の用語はそれらに与えられた意味を持つ。

【0028】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸残基のポリマーを指す。「タンパク質」は、典型的には大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」は典型的には短いポリペプチドを指す。

【0029】

本明細書で挙げる任意の数値は、低い値から高い値までの全ての値を含む、すなわち、列挙される最低値と最高値の間の数値の可能な組み合わせは全て、本出願において明示的に記述されたものとみなされるべきであることも、特に理解される。例えば、濃度の範囲が約１％〜５０％と記述されていたら、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％等の値が本明細書で明示的に列挙されたこととなる。上に挙げた値は、具体的に意図することの単なる例である。

【0030】

範囲は、様々な態様で、「約（about）」または「約（approximately）」ある特定の値から、および／または「約（about）」または「約（approximately）」別の特定の値までとして、本明細書で表される。「ほぼ（almost）」という用語もまた、「約（approximately）」という用語と互換的に用いられる。値が、前に「約（about）」をつけて近似値として表される時には、範囲内にいくらかの変動量が含まれており、それには開示または記載された値の＋／−１０％、＋／−５％、＋／−１.０％の値が含まれると理解される。

【0031】

「インフルエンザ」は、オルトミクソウイルス科（Orthmyxoviridae）のインフルエンザウイルス、Ａ、Ｂ、Ｃの３型のいずれかを指す。インフルエンザＡおよびＢのみが季節的大流行をもたらす。インフルエンザウイルスは、典型的には、哺乳動物の鼻、喉および肺内の、および鳥類の腸管内の上皮細胞表面のシアル酸糖上の赤血球凝集素（ＨＡ）を介して結合することにより宿主に感染する。

【0032】

インフルエンザＡ属には一つの種、インフルエンザＡウイルスがある。インフルエンザＡは、ＨＡタンパク質（Ｈ１〜１６）およびノイラミニダーゼタンパク質（Ｎ１〜９）の血清学的特性に基づき、サブタイプまたは血清型に分類される。インフルエンザサブタイプは、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの組み合わせにより、例えば、ＨｘＮｙのように命名される。ヒトで確認され、公知の世界的流行におけるヒトの死亡数の順で並べたサブタイプとしては、それらに限定されるものではないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７が挙げられる。インフルエンザＢ属には一つの種、インフルエンザＢウイルスがある。インフルエンザＢはＡ型と比べ２〜３倍の遅さで突然変異するため、遺伝学的に多様性に乏しく、インフルエンザＢ血清型は一つしかない。インフルエンザＣ属には一つの種、インフルエンザＣウイルスがあり、それはヒト、イヌ、ブタに感染し、重篤な疾病と局所的な流行の双方を引き起こすことがある。しかし、インフルエンザＣは他の型より稀である。

【0033】

「抗原」または「抗原サブタイプ」という用語は、抗体等の選択的結合剤により結合され得、さらには、各抗原のエピトープに結合しうる抗体を生成するために対象に使用されうる、分子または分子の一部を指す。抗原は、様々な態様では、一つ以上のエピトープを有する。例示的な態様では、ＨＡが抗原である。ＨＡは抗原性糖タンパク質であり、感染される細胞にウイルスを結合させる役割を果たしている。少なくとも１７個の異なるＨＡ抗原がこれまでに同定されており、ＨＡ１〜ＨＡ１６、あるいはインフルエンザＡのＨ１〜Ｈ１６およびインフルエンザＢの少なくとも一つの公知のＨＡ抗原に分類されている。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３はヒトインフルエンザＡに一般的にみられ、インフルエンザＢ ＨＡ抗原はヒトインフルエンザＢに一般的にみられる。本開示は、これらに限定するものではないが、ＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３、ＨＡ４、ＨＡ５、ＨＡ６、ＨＡ７、ＨＡ８、ＨＡ９、ＨＡ１０、ＨＡ１１、ＨＡ１２、ＨＡ１３、ＨＡ１４、ＨＡ１５、ＨＡ１６およびインフルエンザＢ ＨＡのいずれかを含む、公知の、および未知のＨＡウイルスタンパク質の全てを単離・定量する方法を含む。

【0034】

「抗原含有量」または「抗原濃度」という用語は、ワクチン試料中の抗原の量、すなわち抗原の濃度を指す。

【0035】

「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、特定の疾病（例えば、インフルエンザ）に対する免疫を向上させる生化学的調製物を指す。「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、ワクチン開発および製造に関わる中流−、上流−、下流−工程調製物を含む、全てのワクチン製剤のことをいう。

【0036】

「標準」または「国際標準」または「国際対照標準」または「抗原標準」という用語は、管理当局により、例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）またはＷＨＯ協働センターが提供する、定義づけられた生化学的活性を有する生化学的対照試料を指す。

【0037】

「相対標準偏差」、「ＲＳＤ」または「％ＲＳＤ」は、変動係数の絶対値であり、パーセンテージで表されることが多い。しばしば用いられる類似の用語は、相対分散であり、これは変動係数の平方である。また、標準誤差率は、標準誤差を推定値で割ってから１００をかけ、パーセンテージで表すことで得られる、統計的推定の信頼性の基準である。ＲＳＤは分析化学で広く用いられ、分析の精度および繰返し性を表す。ＲＳＤ＝（アレイＸの標準誤差）×１００／（アレイＸの平均）

【0038】

セクションの見出しは、構成上の目的のためだけに本明細書で用いられ、記載されている主題を多少なりとも限定するものと解釈されるべきではない。

【0039】

ワクチンからの抗原の分離
本開示は、それに限定するものではないが、ＨＡ抗原を含む抗原をワクチン組成物から単離する方法を含む。例示的な実施形態では、インフルエンザウイルスワクチンは、卵由来原料または細胞培養物由来のウイルス性原料のいずれかの上流、中流、または下流工程から得られる。次いで、抗原は界面活性剤を使用せずにワクチン組成物から可溶化させる。

【0040】

ウイルス破壊としても知られる抗原の可溶化は、化学的または物理的方法を用いたウイルスの破壊を伴い、さらに単離および定量するために一つまたは複数の抗原を単離する。例示的な態様では、可溶化工程を、界面活性剤を使用せずに還元により行う。界面活性剤は本明細書に記載する方法では使用しない。何故なら、それらはタンパク質に結合し、その性質を変えてしまう。すなわち、界面活性剤は単離した抗原を汚染し、抗原濃度の正確な測定に必要なクロマトグラフ分離を阻害するからである。

【0041】

このように抗原可溶化を、タンパク質のジスルフィド結合を還元する界面活性剤ではない、任意の還元剤により行う。好適な還元剤としては、それらに限定されるものではないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、タンパク質−Ｓ−Ｓ−還元体（商標）（G Biosciences（登録商標）、Maryland Heights、ＭＯ）、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、チオプロピル−アガロース、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ホスホロチオ酸ナトリウム、亜硫酸塩および亜硫酸塩生成剤、ジチオエリトリトール、トリブチルホスフィン、グルタチオン、チオグリコレート、２,３−ジメルカプトプロパノール、または過ギ酸が挙げられる。様々な態様では、塩酸グアニジンまたは、それらに限定するものではないが、尿素、チオ尿素、リチウム、過塩素酸塩、チオシアネート等の別のカオトロピック試薬もまた、可溶化反応緩衝液で用いられる。カオトロピック試薬はタンパク質を変性させるが、タンパク質を沈殿はさせない。タンパク質の還元を行うための化合物および方法は当業者に周知である。具体的な還元溶液および条件については、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0042】

例示的な態様では、還元緩衝液または還元剤はＨＡ分子間のジスルフィド結合を還元して、各サブユニット、例えば、ＨＡ１およびＨＡ２にし、例えば、ウイルスからＨＡ１を放出する。ある態様では、ＤＴＴを約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭの濃度で使用する。より詳細な態様では、ＤＴＴを、例えば、約２０ｍＭから約１００ｍＭまでに渡る濃度で使用する。

【0043】

例示的な態様では、還元は約５分から約２０時間、約１０分から約１０時間、または約３０分から約２時間のインキュベーション時間で行う。いくつかの態様では、インキュベーション時間は約１時間である。従って、インキュベーション時間は、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、約５時間、約５．５時間、約６時間、約６．５時間、約７時間、約７．５時間、約８時間、約８．５時間、約９時間、約９．５時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、または約２０時間である。具体的な還元時間については、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0044】

他の態様では、還元は約２０℃から約１００℃までのインキュベーション温度で行う。特定の態様では、還元は約５０℃から約９０℃までのインキュベーション温度で行う。より詳細な態様では、還元は約８５℃のインキュベーション温度で行う。従って、インキュベーション温度は、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、 約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、または約１００℃である。具体的な還元温度は、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0045】

さらなる態様では、抗原の還元ではｐＨを調整している。様々な態様では、還元反応をｐＨ約６からｐＨ約１１までのｐＨで行う。特定の態様では、ｐＨは約ｐＨ７から約ｐＨ１０までである。より詳細な態様では、ｐＨは約７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９、８.０、８.１、８.２、８.３、８.４、８.５、８.６、８.７、８.８、８.９、９.０、９.１、９.２、９.３、９.４、９.５、９.６、９.７、９.８、９.９、１０.０である。

【0046】

例示的な態様では、還元をアルキル化しないで行う。アルキル化は還元後のタンパク質のスルフヒドリル基を保護し、遊離のシステインの逆反応を防ぐ。従ってアルキル化が典型的には使用され、分離したＨＡ抗原、例えば、ＨＡ１およびＨＡ２、および他のタンパク質の再結合および／または複合体形成を防ぐ。しかし、４−ビニルピリジンのようなアルキル化剤の使用は、本明細書の実施例でより詳細に記載するように、タンパク質の純度を低下させてしまう。従って、分離した抗原、例えば、ＨＡ１がＨＡ２、および他のタンパク質と再結合および／または複合体を形成するのを防ぐために、全てのタンパク質のスルフヒドリル基を、アルキル化剤を使用せずに保護する。

【0047】

例示的な態様では、アルキル化剤をさらに使用することなしに、分離した抗原および他のタンパク質の再結合および／または複合体形成を防ぐために、還元されたタンパク質のスルフヒドリル基を酸性化によるプロトン化により保護する。酸性化によりジスルフィド結合の形成は妨げられる。何故なら、ジスルフィド結合が形成されるためには、スルフヒドリル基は少なくとも部分的にはイオン型である必要があるからである。酸性化は簡潔で効果的な処理であり、その際にはｐＨをモニタリングして調整し、抗原が沈殿するのを防ぐ。様々な態様では、酸性化を、リン酸、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸、またはギ酸を用いて行う。例示的な態様では、酸性化はリン酸で行う。しかし、酸性化のあらゆる他の方法が当該分野で使用されているように、リン酸に限定されるものではない。酸性化の方法は当該分野で周知であり、本明細書でさらに詳しく述べることはしない。具体的な酸性化の溶液および条件は、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0048】

抗原の分画
還元および酸性化の後、抗原を分画により単離する。例示的な態様では、分画をクロマトグラフィーで行う。当該分野で公知のクロマトグラフィーの、任意の好適なタイプを使用する。例えば、クロマトグラフィーのそのような好適なタイプとしては、それらに限定されるものではないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換−ＨＰＬＣ（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が挙げられる。

【0049】

いくつかの態様では、抗原の分画をＲＰ−ＨＰＬＣで行う。従って、逆相カラムの好適なタイプとしては、それらに限定されるものではないが、Ｃ２からＣ１８までに渡る様々な改変のある、多孔性、非多孔性またはモノリシック（monolithic）のシリカカラムまたはポリマー系カラムである。分析目的に好適なカラムの直径は、それに限定するものではないが、典型的には、流量により約７５μｍから約５ｍｍまでの範囲であり、流量は約０.１μＬ／分から約５ｍＬ／分まで様々な範囲に及びうる。充分な量の抗原を単離するためには、約１ｍｍから約１０ｍｍまでの直径のカラムが典型的に用いられる。タンパク質は、逆相カラムから、それらに限定するものではないが、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン等の水性および有機溶媒の混合物とともに分離・溶出され、それらに限定するものではないが、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ヘプタフルオロ酪酸、ギ酸、リン酸、リン酸塩緩衝液等の調整剤を含むことが多い。タンパク質の逆相ＨＰＬＣの方法は当該分野で周知であり、当業者により実施されうるので、本明細書においてはさらに詳しくは述べない。具体的な逆相ＨＰＬＣの方法および条件については、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0050】

実施例において本明細書に記載する、クロマトグラフィーによる抗原の分画により、低い相対標準偏差（ＲＳＤ）で優れた直線性および精度が得られた。直線性、すなわち（ある範囲内で）試料中の分析物の濃度（量）に正比例する試験結果を得る能力は、いかなる分析方法においても重要である。分析方法の精度は、所定の条件下で、同種の試料から複数のサンプリングをして得られた一連の測定間の一致の程度（分散度）を表す。精度は、様々な態様で、繰返し性、中間精度、再現性の３つのレベルで考慮される。

【0051】

抗原の定量
国際標準を使用せずに分画により単離した後、抗原または抗原サブタイプを定量する方法が本開示に含まれる。分画した抗原を定量する好適な方法としては、それらに限定されるものではないが、アミノ酸分析（ＡＡＡ）、窒素定量法（Kjeldahl）、質量分析法、同位体希釈質量分析法が挙げられる。

【0052】

例示的な態様では、抗原濃度はＡＡＡを用いて測定する。ＡＡＡとは、抗原およびアミノ酸の分子量に基づき、アミノ酸組成を調べるために、および／または組成物中の抗原濃度を定量するために用いられる技法を指す。ＡＡＡは、当業者に公知の従来の技術を用いて行う。ＡＡＡはタンパク質量の正確な測定に好適な手段であるが、相対アミノ酸組成および遊離アミノ酸に関する詳細な情報をも提供する。Amino Acid Analysis Protocols： Methods in Molecular Biology, Volume 159 （Cooperら編、2001 Humana Press Inc.,Totawa,NJ）を参照のこと。相対アミノ酸組成からタンパク質の特徴的な組成が分かり、それでタンパク質の同定には十分であることも多い。これはタンパク質の断片化に用いるプロテアーゼを選択するための決定支援としてしばしば用いられる。

【0053】

典型的には、ＡＡＡには、加水分解、続いて分離、検出、定量が含まれる。加水分解または「酸加水分解」は、典型的には酸性条件で行われる。例えば、標準的な手順は、６Ｍ塩酸での加水分解（２４時間、１１０℃）である。この標準的な手順は、時間的な制約と温度との折り合いをつけたものであり、当業者が変更することができる。例示的な態様では、加水分解時間試験を行ってＨＡに最適な加水分解時間を決める。しかし、本開示の方法に従って定量するそれぞれ一つ一つの抗原のために、加水分解時間を最適化することができる。ＡＡＡの手順は当該分野で周知であり、ＡＡＡのための製品が市販されている（AccQ Tag kit （Waters, No WAT052880）およびSigma-Aldrich）。いくつかの実施形態では、Zorbax Eclipse ＡＡＡ ＨＰＬＣカラムを用いる。当業者はＡＡＡを行う様々な方法を知っている。具体的なＡＡＡの手順については、実施例において本明細書でより詳細に記載する。

【0054】

特定の抗原の公知の配列に基づき、抗原分子当たりのアミノ酸の理論数を、続いて、注入当たりの抗原のモル量を計算する。計算した、または測定した抗原の分子量および試料調製の際に適用した希釈係数から試料中の抗原濃度が計算でき、試料１ｍＬ当たりのμｇ抗原として表される。

【0055】

例示的な態様では、ＨＡ濃度を計算する式が本明細書で以下に提供される。
ｎ_ＨＡ１＝ｎ_ＡＡ／ｘ_ＡＡ
ｎ_ＨＡ１…赤血球凝集素ＨＡ１のモル量［μｍｏｌ］
ｎ_ＡＡ…各アミノ酸のモル量（アミノ酸分析の結果）［μｍｏｌ］
ｘ_ＡＡ…赤血球凝集素ＨＡ１の分子当たりの各アミノ酸数

ｎ_ＨＡ１＝ｎ_ＨＡ
ｎ_ＨＡ…赤血球凝集素のモル量［μｍｏｌ］

ｍ_ＨＡ＝ｎ_ＨＡ＊Ｍ_ＨＡ
ｎ_ＨＡ…赤血球凝集素のモル量［μｍｏｌ］
ｍ_ＨＡ…ＨＡの質量［μｇ］
Ｍ_ＨＡ…（計算または測定した）赤血球凝集素の分子量［μｇ＊μｍｏｌ^−１］

ｃ_ＨＡ＝ｍ_ＨＡ＊ＤＦ／Ｖ_ｉ
ｃ_ＨＡ…赤血球凝集素の濃度［μｇ／ｍＬ］
ＤＦ…希釈係数
Ｖ_ｉ…注入量［ｍＬ］

【0056】

本開示の例示的な実施形態では、ＨＡの定量はＨＡ１のピーク面積に基づいて行われ、それは他のワクチン成分からよく分離している。本開示の適用性が、それらに限定するものではないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、およびインフルエンザＢを含む、異なるインフルエンザＡサブタイプに対して示され、本明細書で開示された方法が、異なるＨＡ抗原に広く適用可能であることが強く示唆される。本開示では、インフルエンザ由来のＨＡについて詳細に記載したが、インフルエンザ由来のＨＡの使用のみに限定されるものではない。本開示は、他のウイルス由来のＨＡ抗原にも、他の抗原または抗原サブタイプの分離および定量にも適用可能である。

【0057】

本明細書に記載するワクチン組成物中の抗原濃度を測定する方法は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．９％未満、約２．８％未満、約２．７％未満、約２．６％未満、約２．５％未満、約２．４％未満、約２．３％未満、約２．２％未満、約２．１％未満、約２．０％未満、約１．９％未満、約１．８％未満、約１．７％未満、約１．６％未満、約１．５％未満、約１．４％未満、約１．３％未満、約１．２％未満、約１．１％未満、約１．０％未満のＲＳＤで抗原濃度を測定する。例示的な態様では、本明細書に記載する方法は、抗原濃度により、約２.２％および約１.３％のＲＳＤで抗原濃度を測定する。

【0058】

本明細書で引用する各出版物、特許出願、特許、他の参照文献は、本開示と矛盾しない程度まで、その全体が参照により組み込まれる。

【0059】

本明細書に記載する実施例および実施形態は、説明の目的のためだけのものであり、その内容を踏まえた様々な改変または変形が当業者に示唆され、それらは本出願の趣旨および範囲、および添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることは理解されよう。本明細書で引用する全ての出版物、特許、特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0060】

本開示の付加的な態様および詳細は、以下の実施例から明らかとなり、それらは限定するものではなく説明のためのものである。

【0061】

実施例１：
ワクチン中のＨＡを単離・定量するための方法の開発および最適化
本明細書に記載する実験の目的は、ＷＨＯまたは他の機関からの標準試薬が利用できない場合に、ＨＡ（すなわちＨＡ１）の測定に基づき、インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）のワクチン調製物の総ＨＡ含有量を測定するための新規のＨＰＬＣの方法を開発することである。

【0062】

インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）の新製品の以下のバッチを評価した。

【0063】

【表1】

【0064】

逆相ＨＰＬＣによるＨＡの定量
試料調製条件を以下の通り最適化した。未希釈試料または脱イオン水で希釈した試料を、同量の還元緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、２６６ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.３、４０ｍＭジチオスレイトール）と混合した。試料を８５℃で１時間インキュベートした後、１０％（ｖ／ｖ）８.５％リン酸を添加して反応を止め、逆反応の遊離のシステインによるジスルフィド結合の形成を防いだ。試料を１８,４０７gで１０分間遠心分離し、粒子状物質を除去した。同一のＨＰＬＣ条件を用いた。

【0065】

クォータナリーポンプを備えたAgilent ＨＰＬＣシステムおよびダイオードアレイ検出器を用いた。Jupiter 5μ C4カラム（１５０×２ｍｍ）で、以下の勾配を用いて逆相−ＨＰＬＣでタンパク質を分離した。
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
溶出液Ｂ：０．０８５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
溶出液Ｃ：メタノール

【0066】

試料および標準は、２０％の溶出液Ｂでの定組成溶離で、流量０.４ｍＬ／分で１０分間、別々の方法で注入した。この後、タンパク質の溶出方法を実施した。

【0067】

【表2】

【0068】

溶出したタンパク質を、２１４ｎｍのＵＶ吸収を用いて検出した。ＨＡ１を定量し、試料１ｍＬ当たりのμｇＨＡとして表した。適切な標準がないため、最初は面積のみを記録した。この後、試料２のアミノ酸分析により、溶出したＨＡ１の定量を行った。単価バルク（ＭＶＢ）試料調整物（試料１）を、ＨＰＬＣ分析のさらなる検量のための対照試料として用いた。

【0069】

アミノ酸分析
タンパク質の酸加水分解を、ガラスアンプル内で行った。２ｎｍｏｌの２−Ｌ−アミノ酪酸を内部標準として各アンプルに添加し、ＨＰＬＣ画分をアンプル内に直接回収した。回収した画分を真空下で乾燥した（SpeedVac, Savant, SVC100H）。試料を３００μＬの６Ｎ塩酸／０.２％フェノールに溶解し、窒素で覆い、アンプルをヒートシールした。酸加水分解を１１５℃で１８時間行った。アンプルを開け、５００μＬの脱イオン水を加えた。その溶液をろ過し（０.２μ）、エッペンドルフ（登録商標）バイアルに移し、真空下で乾燥した（SpeedVac, Savant, SVC100H）。AccQ Tagキット（Waters, No WAT052880）を用い、製造業者の指示に従ってアミノ酸分析を行った。簡潔に説明すると、試料を０.１Ｎ塩酸に溶解し、AccQ Fluor試薬を用いてアミノ酸を標識した。内部標識（α−アミノ酪酸）およびアミノ酸標準（Agilent, No.5061-3330）を同様に処理した。

【0070】

クォータナリーポンプを備えたWaters ＨＰＬＣシステムおよび蛍光検出器（Spectra Systems FL 2000）を用いた。アミノ酸をSentry Guardカラム（２０×３.９ｍｍ、Waters, No. WAT044380）およびプレカラム（１５０×２ｍｍ）を備えたAccQ Tag C18カラム（４μ、１５０×３.９ｍｍ、Waters, No. WAT052885）で逆相−ＨＰＬＣにより分離し、３７℃で操作した。５μＬの試料を注入し、アミノ酸組成を以下の勾配を用いて分析した。
溶出液Ａ：脱イオン水
溶出液Ｂ：アセトニトリル、グラディエントグレード品質
溶出液Ｃ：希釈したAccQ−Tag緩衝液濃縮物（Waters, No. WAT052890）
脱イオン水１：１０希釈

【0071】

【表3】

【0072】

蛍光標識されたアミノ酸の溶出は、２５０ｎｍでの励起および３９４ｎｍでの発光により、蛍光検出を用いて検出した。外部標準（Agilent, No. 5061-3330）を用いて検量し、内部標準を用いて修正した。データをさらにロイシン、バリン、リジン、フェニルアラニンについて処理した。これらは酸加水分解条件下で最も安定なアミノ酸であるためである。

【0073】

インフルエンザＡ／カリフォルニア／０７／２００９ （Ｈ１Ｎ１）のＨＡの公知の配列（GenBank accession No. ACQ55359.1）に基づき、ＨＡ１分子当たりのアミノ酸の理論数、続いて、注入当たりのＨＡのモル量を計算した。ＨＡの計算した、または測定した分子量、および試料調製の際に適用した希釈係数から試料中のＨＡ濃度が計算でき、試料１ｍＬ当たりのμｇＨＡとして表した。

【0074】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた後、クマシー・ブルー染色を行った。単価バルク試料を還元および非還元条件で分析し、ＨＰＬＣにより単離した還元ＨＡ１と比較した。電気泳動の後、ゲルを既製のクマシー溶液（GelCode（登録商標）Blue Stain Reagent, Pierce, cat. ＃ 24590）で２時間染色した。脱イオン水を２〜３回換えてゲルを脱染し、画像スキャンをする前に一晩脱イオン水中に保管した。ＳＤＳゲルを、濃度計イメージスキャナーＩＩＩ（GE Healthcare）の製造業者が提供するゲルデータプログラムでスキャンした。Image Quant TL ソフトフェア（Amersham Bioscience）を使用してバンドを同定し、吸収の吸光度the optical density of the absorptionを得た。バンドの境界は手作業で決めた。

【0075】

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ
マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤ
Ｉ／ＴＯＦ）分析のために、タンパク質を上述の方法によるＨＰＬＣを用いて精製した。凍結乾燥したＨＰＬＣ画分を５μＬの５０％アセトニトリル、０.５％ギ酸の水溶液に溶解し、マトリックス溶液（１０ｍｇ／ｍＬシナピン酸の５０％アセトニトリル溶液および０.５％ギ酸の水溶液）と混合した。１μＬをＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ標的上にのせ、室温で乾燥した。標準多チャンネルプレート検出器またはCovalX HM１高質量検出器のいずれかを用いて、Applied Biosystems 4800 MALDI TOF／TOFでスペクトルを得た。

【0076】

付属のソフトウェアパッケージ（Data Explorer 4.9、Applied Biosystems）を用いてスペクトルを分析した。分子量は、ウシ血清アルブミンを用いてなされた外部校正で得られた、少なくとも１０個のスペクトルの平均として計算した。

【0077】

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるピークの同定
ＨＰＬＣピークを手作業で回収し、SpeedVacで凍結乾燥した。凍結乾燥物を再構成緩衝液（８Ｍウレア、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８.４）に溶解し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８.４を添加して、０.９Ｍウレアの最終濃度になるように希釈し、トリプシンを用いて消化した。

【0078】

ゲル内でのトリプシン消化のため、ゲルの切片をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、アセトニトリルで洗浄後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８.４で、そして再びアセトニトリルで繰り返し洗浄した。最終工程として、ゲル切片をアセトニトリルで処理し、SpeedVacで１時間凍結乾燥した。トリプシン溶液（１２.５ｎｇ／μＬ）を用いてゲル切片を再水和させ、一晩消化した。次いで、ペプチドを上清から回収した。

【0079】

生成したペプチドを、Zorbax SB300 C18 5μ １５０×０.５ｍｍカラムを用いて、Agilent 1100キャピラリーＨＰＬＣで分離し、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはタンデムＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィー−質量分析法を用いて、エレクトロスプレー源を備えたリニアトラップ四重極型（ＬＴＱまたはリニアイオントラップ）Orbitrap 質量分析計でオンラインで分析した。ペプチドは正確な質量および６０,０００の解像度で、ＬＴＱ Orbitrapで前駆体スキャンで測定した。続いて、４つの最も強度の高いイオンを選択し、ＬＴＱでタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）モードを用いて分析した。同定のため、ＭＳ／ＭＳスペクトルをBioworks ３.３ソフトウェアを用いて処理し、Ｈ１Ｎ１由来のウイルス性タンパク質のみを含む手作業で作成されたデータベース（インフルエンザウイルスリソース、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi,２００９年０６月１５日から取得した配列）またはUniprotデータベース（リリース１４.８、２００９年０２月１０日）を検索した。

【0080】

ＨＰＬＣの方法の最適化
他のインフルエンザワクチン中のＨＡを定量するための既定のＨＰＬＣの方法を用いて、Ｈ１Ｎ１に関する最初の実験を行った。簡潔に説明すると、試料の調製は、３７℃で１時間のウイルス破壊工程と、それに続く４−ビニルピリジンによるアルキル化を含んだ。この試料調製方法を用いて、試料２のＨＰＬＣピークの分画によりＨＡ１を単離し、アミノ酸分析を用いて定量した。６回のアミノ酸分析の平均として、試料１では６２.２μｇ／ｍＬＨＡという値が得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて試料からのＨＡ１の回収率を予測した。ゲルをクマシー染色し、比重走査により評価した。結果から、５３ｋＤａの位置に移動する単離されたＨＡ１は、試料１の対応するバンドの約１３％の強度しかなかったことが分かった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、試料１のこのバンドの純度を調べた。これらの分析により、このバンドのＨＡ１含有量、約２５％（ｎ＝６）が得られたが、主に含まれているのは核タンパク質だった。総合的に考えると、ＨＡ１の回収率は約５０％に過ぎないことが結果から分かった。ＨＡ１の回収率が低いため、試料調製方法のさらなる最適化を行った。

【0081】

ウイルス破壊工程中のインキュベーション温度を変え、約８０℃で最も高い回収値が得られた。さらなる実験で、３７℃から９０℃の間でウイルス破壊のインキュベーション温度の最適化、３０分から４時間の間でインキュベーション時間の最適化を行った。さらに、アルキル化工程の代替手段として、８.５％のリン酸を用いた酸性化について調べた。

【0082】

ウイルス破壊、すなわち、可溶化に最適な条件は、約８５℃、１時間の後、アルキル化工程または酸性化工程のいずれかを行うことだと分かった。これらの最適化された試料調製条件を用いて、ＨＡ１の回収率を再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。ＨＡ１の回収率は、試料１における対応バンドのＨＡ１含有量である２５％に対して、９０から１２０％であった。

【0083】

ＨＡ１の回収率に加えて、選択性を２つの最適化した方法（アルキル化を含む方法と含まない方法）について調べた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、４−ビニルピリジンを用いたアルキル化を含む方法では、ＨＡ１ピーク中のタンパク質の純度は８７％であった。これに対して、アルキル化の代わりにリン酸による酸性化を用いて、遊離のシステインの逆反応を防いだ場合、ＨＡ１ピーク中のタンパク質の純度は９６％に改善した。

【0084】

対照試料の確定
配列アラインメント
以下の受託番号を持つ配列をGenbankから取得した：（１）ＨＡ、インフルエンザＡウイルス（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））：ACQ55359.1および（２）ＨＡ、インフルエンザＡウイルス（Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６（Ｈ１Ｎ１））、ABU50586.1。タンパク質の配列を、ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）のデフォルト設定を用いてアラインメントした。

【0085】

インフルエンザＡウイルス（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））ＨＡとインフルエンザＡウイルス（Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６（Ｈ１Ｎ１））ＨＡとの配列アラインメントの相同性によると、これらの２つのウイルス間のＨＡ相同性は約７９％に過ぎない。他の大流行間期の株は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）に対して比較的低い相同性しか示さない。この相同性の低さから、大流行間期の参照抗原を用いた検量は、世界的に流行したＨ１Ｎ１株の場合には不可能であることが示唆された。

【0086】

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによる分子量
アミノ酸配列（受託番号：ＨＡ、インフルエンザＡウイルス（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））：ACQ55359.1）に基づくインフルエンザＡウイルス（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））ＨＡの理論分子量は、６１４２４（ＨＡ０、ジスルフィド結合は還元され、タンパク質加水分解で開裂していないＨＡ１およびＨＡ２からなる）、還元されたＨＡ１は３６３１２、還元されたＨＡ２は２５１３０である。しかし、これにはグリコシル化等の翻訳後修飾、特に糖タンパク質の質量に大きく関わるＮ−グリコシル化（ＨＡ１ドメインには、５つのＮ−グリコシル化可能部位がみられた）が含まれていない。還元後に単離したＨＡ１の分子量を、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦを用いて測定したところ、試料２についての測定では４５２６８ ±１１９（ｎ＝１５）であった。試料３については、４５２２９±１０１（ｎ＝２０）というＨＡ１分子量が測定された。本方法の誤差範囲内であり、２つのロット間でＨＡ１の分子量に差はなかった。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦデータをＬＣ−ＭＳペプチドマッピングのデータによりさらに裏付けし、ここでは、糖ペプチドをウイルスタンパク質のトリプシン消化後に分析した。

【0087】

【表4】

【0088】

これらのＮ−グリコシル化の結果は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによる測定分子量と理論分子量との差異とよく一致した。この測定は異なるＮ−グリコシル化アイソフォームの平均に基づいているため、質量計算にはＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによる分子量を使用した。

【0089】

【表5】

【0090】

ＨＡ２は単離できなかった。従って、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによる分子量の測定はできなかった。しかし、Ｎ−グリコシル化はＬＣ−ＭＳペプチドマッピングにより同定することができた（表５）。計算のため、ＨＡ２の理論分子量（２５１３０）を使用し、同定したＮ−グリコシル化の分子量を足して、２６９００という質量を得た。ＨＡ１とＨＡ２のこれらの値によれば、グリコシル化ＨＡ１、グリコシル化ＨＡ２、６個のジスルフィド結合を含むＨＡの総分子量は、７２１５６である。

【0091】

アミノ酸分析
試料調製の最適化後に、（１）４−ビニルピリジンを用いたアルキル化工程を含む、または（２）リン酸を用いた酸性化工程を含む試料調製の二つの選択肢について並行してアミノ酸分析を行った。試料２をＨＰＬＣ分析の校正のための対照試料として用いた。

【0092】

試料２を、後述の通り、アルキル化工程を含めて調整し、アルキル化が精製にどのような影響を及ぼすのか調べた。ＨＡ含有量を調べるため、８５℃、１時間の破壊工程および４−ビニルピリジンを用いたアルキル化をして、ＨＡ１の分画を行った。ＨＡ１のＨＰＬＣピーク画分を回収し、アミノ酸分析に使用した。ロイシン、バリン、リジン、フェニルアラニンの含有量を調べるため、加水分解物を分析した。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦにより調べた分子量を用いて、ＨＡ濃度を計算した。ピーク当たりのＨＡ含有量の平均は、９３.７±３.２μｇ／ｍＬ ＨＡに対して４.６４μｇ（ｎ＝８）であった。ＨＡ１の純度は８７％に過ぎなかったため、ＨＡの値は過大に見積もられており、従って、アルキル化がさらなる分析に有用だとは考えられない。

【0093】

【表6】

【0094】

また、試料２を酸性化工程を行って調製する。試料２のＨＡ含有量を調べるため、ＨＡ１を含む画分を、８５℃、１時間の破壊工程およびリン酸を用いた酸性化工程を含めて調製した。ＨＡ１のＨＰＬＣピーク画分を回収し、アミノ酸分析に使用した。ロイシン、バリン、リジン、フェニルアラニンの含有量を調べるため、加水分解物を分析した。本明細書に記載するように、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦにより測定した分子量を用いて、ＨＡ濃度を計算した。ピーク当たりのＨＡ含有量の平均は、９２.７±９.０μｇ／ｍＬ ＨＡに対して４.２１μｇ（ｎ＝８）であった。この値を、ＨＡのＨＰＬＣ測定のさらなる検量に用いた。次いで、アミノ酸分析のために、ＨＡ１の分画を行った。

【0095】

【表7】

【0096】

最終的な方法
表８に、新規の試料調製方法を開発するために調べた主なパラメーターをまとめている。どの方法を使用するかは、主にＬＣ−ＭＳＭＳを用いた選択性に基づいて最終的に決定し、ここで４−ビニルピリジンを用いたアルキル化を含む方法が著しく低い選択性を示した。修飾によりわずかに親水性が増加するため、この観察結果は、ほぼ確実に溶出位置の変化によるものだった。溶出位置が変化したことにより、共溶出するタンパク質が変わったのである。アルキル化を行って、または行わずに調製した試料調製物のＨＡ１の溶出プロフィールを調べた。４−ビニルピリジンを用いたアルキル化を行って調製した試料中のＨＡ含有量は、おそらくより高濃度の汚染タンパク質のために、わずかに多かった。

【0097】

【表8】

【0098】

以下の全ての実験では、上記の最初の実験で記載した最適化した方法に従って試料調製を行った。

【0099】

方法の検証
直線性
分析方法の重要な基準の一つは直線性、すなわち（ある範囲内で）試料中の分析物の濃度（量）に正比例する試験結果を得る能力である。濃度依存的なＨＰＬＣ応答の直線性を証明するため、試料２を脱イオン水で異なる濃度に希釈し、異なる濃度の試料をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。対照試料の濃度は、上述の通りアミノ酸分析により求めた。

【0100】

【表9】

【0101】

【表10】

【0102】

データの検量線は、２３.１７５μｇ／ｍＬから１８５.４μｇ／ｍＬの間のタンパク質濃度の範囲で良好な直線性を示した。表１１に計算した残差を示す。全ての計算値が理論値の±５％以内にある。

【0103】

【表11】

【0104】

選択性
選択性の重要な必須条件は、ＨＡ１のＨＰＬＣピークが十分な純度を示すことである。ＨＡ１の単離したピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをクマシー染色して用い、単離したＨＡ１はシングルバンドとして移動する。このＨＡ１バンドを、バンド内のタンパク質を同定するために、インゲル消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によりさらに分析した。このバンドは、ＨＡ１だけを含んでいた。ＨＡ１ピーク内のタンパク質を分析する、より感度の高い方法は、凍結乾燥後に回収した画分を直接消化することである。

【0105】

同定した全てのペプチドについて、再構成イオンクロマトグラフにおけるピークの高さを測定し、含まれるタンパク質の純度を推定した 。異なるペプチドは異なるイオン化効率を持つため、どのタンパク質が検出可能であるかの推測とおおよその相対定量としてこの方法を用いた。

【0106】

【表12】

【0107】

表１２から分かるように、ＨＡ１のピークは＞９６％のＨＡ１を含む。少量の不純物が、核タンパク質および宿主細胞タンパク質（アクチンおよびコフィリン−１）として同定された。

【0108】

精度
試料２中のＨＡ含有量を求める方法の精度を示すため、２３.１７５μｇ／ｍＬおよび９２.７μｇ／ｍＬの２つの濃度で、２日間（１日６回）、計１２回ＨＡ含有量の測定を行った同日内の精度は、低濃度で２.９６％および１.７７％、高濃度試料で０.８１％および０.８９％であった。相対標準偏差（ＲＳＤ）は低濃度試料で２.１９％、高濃度試料で１.３０％であった。

【0109】

【表13】

【0110】

【表14】

【0111】

本開示は、本開示を実行するための具体的な形態を含むことが認められた、また含むことを提案した特定の実施形態という観点から記載された。記載された発明の様々な改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない範囲において、当業者に明らかである。本発明は、特定の実施形態に関連付けて記載されているが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、当業者に明らかな、本発明を実行するための記載された形態の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内となる。