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特許6232525照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】6232525
(24)【登録日】2017年10月27日
(45)【発行日】2017年11月15日
(54)【発明の名称】照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20171106BHJP
G01N 21/64 20060101ALN20171106BHJP
G01N 21/01 20060101ALN20171106BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
!G01N21/64 E
!G01N21/01 D
【請求項の数】20
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2017-535728(P2017-535728)
(86)(22)【出願日】2017年2月9日
(86)【国際出願番号】JP2017004801
【審査請求日】2017年7月14日
(31)【優先権主張番号】特願2016-22607(P2016-22607)
(32)【優先日】2016年2月9日
(33)【優先権主張国】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】503360115
【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構
(74)【代理人】
【識別番号】100137800
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 正義
(74)【代理人】
【識別番号】100148253
【弁理士】
【氏名又は名称】今枝 弘充
(74)【代理人】
【識別番号】100148079
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 裕明
(74)【代理人】
【識別番号】100188581
【弁理士】
【氏名又は名称】堀切 康平
(74)【代理人】
【識別番号】100158241
【弁理士】
【氏名又は名称】吉田 安子
(72)【発明者】
【氏名】三上 秀治
(72)【発明者】
【氏名】合田 圭介
【審査官】
越河 勉
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１４／１１０２９０（ＷＯ，Ａ４）
【文献】
国際公開第２０１４／１４７５９０（ＷＯ，Ａ４）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０２Ｂ２１／００，２１／０６−２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、前記第１の光と前記第２の光との周波数の差が異なる組み合わせで干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成部と、
複数の前記干渉光を照射する干渉光照射部と
を備えることを特徴とする照射装置。
複数の前記干渉光を照射する干渉光照射部と
を備えることを特徴とする照射装置。
【請求項2】
前記干渉光生成部は、レーザ光源から出力された光を回折させ、入力されるコム信号の周波数に応じた複数の回折光を複数の前記第１の光として射出する第１音響光学ディフレクタと、
前記レーザ光源から出力された前記光を回折させ、入力されるコム信号の周波数に応じた複数の回折光を複数の前記第２の光として射出する第２音響光学ディフレクタと
を備えることを特徴とする請求項１に記載の照射装置。
前記レーザ光源から出力された前記光を回折させ、入力されるコム信号の周波数に応じた複数の回折光を複数の前記第２の光として射出する第２音響光学ディフレクタと
を備えることを特徴とする請求項１に記載の照射装置。
【請求項3】
前記レーザ光源からの前記光が入射され、前記光の周波数を変換した光を射出する音響光学周波数シフタをさらに備え、
前記第２音響光学ディフレクタは、前記音響光学周波数シフタで周波数が変換された前記光が入射されることを特徴とする請求項２に記載の照射装置。
前記第２音響光学ディフレクタは、前記音響光学周波数シフタで周波数が変換された前記光が入射されることを特徴とする請求項２に記載の照射装置。
【請求項4】
前記第１音響光学ディフレクタ及び前記第２音響光学ディフレクタは、隣接または離れた位置の第１の光と第２の光との干渉によるクロストーク成分を抑制する位相に各コム成分が設定された前記コム信号が入力されることを特徴とする請求項２または３に記載の照射装置。
【請求項5】
前記干渉光生成部は、レーザ光源から出力された光が正負の異なる入射角度でそれぞれ入射され、コム信号の周波数に応じた２組の複数の回折光を複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光として射出する音響光学ディフレクタを有することを特徴とする請求項１に記載の照射装置。
【請求項6】
前記レーザ光源からの前記光が入射され、入射する前記光の透過成分の透過光と、回折し周波数が変換された成分の変換光を射出する音響光学周波数シフタをさらに備え、
前記音響光学ディフレクタは、前記透過光と前記変換光とが正負の異なる入射角度で入射される
ことを特徴とする請求項５に記載の照射装置。
前記音響光学ディフレクタは、前記透過光と前記変換光とが正負の異なる入射角度で入射される
ことを特徴とする請求項５に記載の照射装置。
【請求項7】
複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とが異なり、
前記干渉光生成部は、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
前記干渉光生成部は、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
【請求項8】
複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とは、周波数範囲が重ならないことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の照射装置。
【請求項9】
前記干渉光照射部は、複数の前記干渉光のスポットをライン状に並べて照射することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の照射装置。
【請求項10】
前記干渉光照射部は、同じピッチで並ぶ複数の前記第１の光と複数の前記第２の光との入射により、前記干渉光の照射位置に複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光のそれぞれのスポットを同じ配列ピッチでライン状に並べ、
前記干渉光生成部は、前記干渉光の照射位置で前記第１の光のスポットに対する前記第２の光のスポットの位置を前記配列ピッチの半分だけスポットの並ぶ方向にずらし、前記第１の光のスポットと前記第２の光のスポットとが重なった前記干渉光のスポットを形成するずらし量及び方向に複数の前記第１の光と複数の前記第２の光との相対的な位置をずらすことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
前記干渉光生成部は、前記干渉光の照射位置で前記第１の光のスポットに対する前記第２の光のスポットの位置を前記配列ピッチの半分だけスポットの並ぶ方向にずらし、前記第１の光のスポットと前記第２の光のスポットとが重なった前記干渉光のスポットを形成するずらし量及び方向に複数の前記第１の光と複数の前記第２の光との相対的な位置をずらすことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
【請求項11】
請求項９または１０に記載の照射装置と、
前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出器とを備えることを特徴とするレーザ顕微鏡システム。
前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出器とを備えることを特徴とするレーザ顕微鏡システム。
【請求項12】
複数の前記干渉光のスポットが並んだ方向と交差する方向に、複数の前記干渉光のスポットと前記試料とを相対的に移動させる走査部を備えることを特徴とする請求項１１に記載のレーザ顕微鏡システム。
【請求項13】
前記走査部は、前記試料が流体と共に流れ得る流路を有するフローセルであり、
前記干渉光照射部は、前記流路内で前記スポットを前記試料の流れる方向と交差する方向に並べることを特徴とする請求項１２に記載のレーザ顕微鏡システム。
前記干渉光照射部は、前記流路内で前記スポットを前記試料の流れる方向と交差する方向に並べることを特徴とする請求項１２に記載のレーザ顕微鏡システム。
【請求項14】
前記試料からの検出光を波長に応じて２以上の波長成分に分離する波長分離部を備え、
前記光検出器は、前記波長分離部により分離される波長成分ごとに設けられていることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡システム。
前記光検出器は、前記波長分離部により分離される波長成分ごとに設けられていることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡システム。
【請求項15】
互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、
複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
複数の前記干渉光を照射する照射ステップと
を有することを特徴とする照射方法。
複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
複数の前記干渉光を照射する照射ステップと
を有することを特徴とする照射方法。
【請求項16】
複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とが異なり、
前記干渉光生成ステップは、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１５に記載の照射方法。
前記干渉光生成ステップは、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１５に記載の照射方法。
【請求項17】
前記回折光生成ステップは、レーザ光源から出力された光を、第１音響光学ディフレクタと第２音響光学ディフレクタとにそれぞれに入射して回折させ、複数の前記第１の光として、入力されたコム信号の周波数に応じた複数の第１回折光を前記第１音響光学ディフレクタで生成し、複数の前記第２の光として、入力されたコム信号の周波数に応じた複数の第２回折光を前記第２音響光学ディフレクタで生成することを特徴とする請求項１５または１６に記載の照射方法。
【請求項18】
前記回折光生成ステップは、隣接または離れた位置の第１の光と第２の光との干渉によるクロストーク成分を抑制する位相に各コム成分が設定された前記コム信号を、前記第１音響光学ディフレクタ及び前記第２音響光学ディフレクタに入力することを特徴とする請求項１７に記載の照射方法。
【請求項19】
前記回折光生成ステップは、レーザ光源から出力された光を正負の異なる入射角度で音響光学ディフレクタに入射し、コム信号の周波数に応じた２組の複数の回折光を複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光として射出することを特徴とする請求項１５または１６に記載の照射方法。
【請求項20】
互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、
複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
複数の前記干渉光を照射する照射ステップと、
前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出ステップとを有することを特徴とするレーザ顕微鏡の検出方法。
複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
複数の前記干渉光を照射する照射ステップと、
前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出ステップとを有することを特徴とするレーザ顕微鏡の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法に関する。【背景技術】
【0002】
共焦点光学系を用いたレーザ顕微鏡システムが知られている。このレーザ顕微鏡システムは、レーザ光を対物レンズで集光して試料に照射し、試料から放出される蛍光や反射光を集光レンズ及び集光レンズの焦点位置に配されたピンホールを介して光検出器で受光する。そして、レーザ光の照射位置を直交する２方向にそれぞれ移動することにより、試料表面を走査している。【0003】
一方、周波数多重励起（ＦＩＲＥ：Fluorescence Imaging using Radiofrequency-tagged Emission）法と称される手法を用いたレーザ顕微鏡システムが特許文献１によって提案されている。この周波数多重励起法のレーザ顕微鏡システムは、レーザ光を第１、第２のレーザ光に分けるビームスプリッタと、第１のレーザ光から偏向角と周波数シフトの大きさが互いに異なる複数の回折光を出力する音響光学ディフレクタ（以下、ＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector）と称する）と、光検出器の応答性や蛍光の応答速度を考慮してビート周波数を低くするために第２のレーザ光の周波数をシフトする音響光学周波数シフタ（以下、ＡＯＦＳ（Acousto-Optic Frequency Shifter）と称する）と、ＡＯＤからの複数の回折光にＡＯＦＳからの第２のレーザ光を重ね合わせ、回折光と第２のレーザ光との周波数との差（ビート周波数）で強度変調された励起光を生成するビームスプリッタと、励起光を試料に照射する照射部とを備えている。【0004】
上記周波数多重励起法のレーザ顕微鏡システムでは、照射部が複数の励起光の照射スポットをライン状に並べて形成し、これら複数の照射スポットを一方向に移動している。これにより、複数の照射スポットの一方向への１回の移動で、試料表面を走査することができる。照射スポットに対応した試料の各部分からは、試料内の蛍光物質からの蛍光が放出される。そして、放出される蛍光は、照射される干渉光のビート周波数に応じて光強度が変化するとともに、照射スポットの副走査方向への移動によって、副走査ラインにおける蛍光物質の分布に応じて変調されたものになる。すなわち、蛍光は、照射された干渉光のビート周波数を搬送周波数とした信号を蛍光物質の分布に応じて強度変調した光信号である。そして、各照射スポットからの複数の光信号を重ね合わせて多重化した多重化信号である検出光が電子増倍管等の光検出器で検出され、その周波数スペクトルから、各照射スポットの移動領域における蛍光物質の分布を算出して観察画像を得ている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１４／１１０２９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記のように周波数多重励起法は、各照射スポットに対応した複数の光信号を多重化した検出光（多重化信号）を検出しているため、１つの光信号が占有することができる帯域幅の上限は隣接した搬送周波数の間隔、すなわちビート周波数の間隔と等しくなる。一方、ＡＯＤが出力する複数の回折光の周波数の間隔は、コム信号に含まれる各駆動信号（コム成分）の周波数間隔と等しいから、励起光のビート周波数の間隔は、駆動信号の周波数間隔と同じになる。したがって、検出光の帯域幅は、ＡＯＤが動作可能な駆動信号の周波数の幅（以下、動作帯域という）に制限される。【0007】
また、実用上のＡＯＤの動作帯域は、例えば１００ＭＨｚ〜２００ＭＨｚ程度であり十分とはいえない場合がある。このため、例えば照射スポットの移動速度を高くした場合には、各光信号の帯域幅が広がるから、照射スポットの個数を少なくしなければならず、あるいは各光信号の高周波成分をカットして光信号の帯域幅を制限する必要があり空間分解能やコントラストの低下を招き観察画像を劣化させてしまう。逆に、画質の高い観察画像を得るためには、複数の照射スポットの移動速度を低くする必要があった。【0008】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の照射装置は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、前記第１の光と前記第２の光との周波数の差が異なる組み合わせで干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成部と、複数の前記干渉光を照射する干渉光照射部とを備えるものである。【0010】
本発明のレーザ顕微鏡システムは、上記の照射装置と、前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出器とを備えるものである。【0011】
本発明の照射方法は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、複数の前記干渉光を照射する照射ステップとを有するものである。【0012】
本発明のレーザ顕微鏡の検出方法は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、複数の前記干渉光を照射する照射ステップと、前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出ステップとを有するものである。【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、周波数の差が異なる組み合わせで干渉させて複数の干渉光を生成して照射するので、多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる。そして、帯域幅が広がることで、例えば観察画像の画質を維持しながら観察画像の取得速度を高くしたり、観察画像の取得速度を維持しながら観察画像の画質を高くすることが可能になる。【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】第１実施形態に係るレーザ顕微鏡システムの構成を示す概略図である。
【図2】コム信号と第１、第２回折光の周波数スペクトルを示す説明図である。
【図3】干渉光を生成する際の第１回折光と第２回折光との組み合わせを示す説明図である。
【図4A】干渉光の周波数スペクトルを示す説明図である。
【図4B】検出光の周波数スペクトルを示す説明図である。
【図5】照射スポットの副走査方向への移動状態を示す説明図である。
【図6】隣接した照射スポット間で生じるクロストークを示す説明図である。
【図7】１つの照射スポットを挟んだ一対の照射スポット間で生じるクロストークを示す説明図である。
【図8】対物レンズと反対側に光検出部を配した第２実施形態のレーザ顕微鏡システムの要部構成を示す概略図である。
【図9】試料から放出される蛍光を波長ごとに分離して検出する第３実施形態のレーザ顕微鏡システムの要部構成を示す概略図である。
【図10】フローサイトメータにレーザ顕微鏡システムを適用した第４実施形態の要部構成を示す概略図である。
【図11】第１回折光の照射スポットに対して第２回折光の照射スポットをずらした第５実施形態を示す説明図である。
【図12】１つのＡＯＤを用いた第６実施形態の要部構成を示す説明図である。
【図13】干渉光が試料で反射した反射光を検出する例を示す説明図である。
【図14】変調ディスクを用いて周波数が異なる回折光を生成する例を示す説明図である。
【図15】変調ディスクのパターンを模式的に示す説明図である。
【図16】実施例における干渉光の周波数スペクトルを示すグラフである。
【図18】実施例で得られた観察画像である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
［第１実施形態］図１に示すように、本発明を実施したレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光生成部１１と、干渉光照射部１２と、光検出部１３と、信号処理部１４とを備えている。このレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光生成部１１で生成した複数の干渉光を主走査方向（Ｍ方向）にライン状に並べた状態で干渉光照射部１２から試料Ｔに照射して試料Ｔの画像を取得する。この例のレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光が励起光として試料Ｔに照射され、試料Ｔから放出される蛍光を光検出部１３で検出し、得られる検出信号を信号処理部１４で処理することにより、各副走査ラインにおける蛍光物質の分布を取得して、蛍光物質の分布を示す１フレーム分の観察画像を生成する。
【0016】
干渉光生成部１１は、干渉光照射部１２とともに照射装置を構成する。干渉光生成部１１は、レーザ装置１５、偏光ビームスプリッタ１６、第１及び第２アーム１７、１８、ビームスプリッタ１９等で構成される。第１光生成部としての第１アーム１７は、互いに周波数が異なる複数の第１の光としての複数の第１回折光を生成するユニットであり、１／２波長板２１、アナモルフィックプリズムペア２２、ミラー２３、第１音響光学ディフレクタ（以下、ＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector）と称する）２４を備える。第２光生成部としての第２アーム１８は、互いに周波数が異なる複数の第２の光としての複数の第２回折光を生成するユニットであり、ミラー３１、音響光学周波数シフタ（以下、ＡＯＦＳ（Acousto- Optic Frequency Shifter）と称する）３２、アナモルフィックプリズムペア３３、第２ＡＯＤ３４を備える。【0017】
レーザ光源としてのレーザ装置１５からのレーザ光は、１／２波長板４１を介して偏光ビームスプリッタ１６に入射する。レーザ装置１５は、連続発振タイプであり、直線偏光のレーザ光を連続的に出力する。この例では、レーザ装置１５としては、波長４９１ｎｍのレーザ光を出力するＤＰＳＳ (Diode Pumped Solid State)レーザを用いている。【0018】
偏光ビームスプリッタ１６は、レーザ装置１５からのレーザ光を分割する光分割部として設けられている。この偏光ビームスプリッタ１６は、入射するレーザ光の一部を透過して第１レーザ光として第１アーム１７の１／２波長板２１に射出し、残りのレーザ光を反射して第２レーザ光として第２アーム１８のミラー３１に射出する。この偏光ビームスプリッタ１６は、レーザ光の偏光方向に応じた強度比でレーザ光を透過及び反射する。偏光ビームスプリッタ１６に入射するレーザ光の偏光方向は、１／２波長板４１の光学軸の方位によって調整することができる。これにより、第１アーム１７、第２アーム１８における各レーザ光の損失を考慮して、第１レーザ光と第２レーザ光との強度比を調整している。例えば、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に入射する第１レーザ光と第２レーザ光との光強度が同じになるように調整している。なお、第１レーザ光と第２レーザ光との強度比を調整する必要がない場合には、光分割部として、偏光ビームスプリッタ１６に代えて、ハーフミラーや無偏光タイプのビームスプリッタを用いることができ、この場合には１／２波長板２１、４１は不要である。【0019】
また、後述するように第１レーザ光から生成される第１回折光と、第２レーザ光から生成される第２回折光とを干渉させることができれば、第１レーザ光を出力するレーザ装置と第２レーザ光を出力するレーザ装置とを別々に設けてもよい。【0020】
第１アーム１７では、偏光ビームスプリッタ１６からの第１レーザ光が１／２波長板２１、アナモルフィックプリズムペア２２、ミラー２３を介して第１ＡＯＤ２４に入射する。１／２波長板２１は、第１レーザ光の偏光方向を、第２レーザ光の偏光方向に一致するように回転する。【0021】
アナモルフィックプリズムペア２２は、第１レーザ光のビーム形状（断面形状）を円形から楕円形に変形させる。この変形では第１ＡＯＤ２４による第１レーザ光の回折方向（ＡＯＤ内で進行波が進む方向）に沿ってビーム形状を引き延ばすことにより行う。このように、第１レーザ光のビーム形状を変形することで、第１ＡＯＤ２４から射出される各第１回折光の広がりを抑え、分解能の低下を防止している。【0022】
第１ＡＯＤ２４は、コム信号発生部４２からの第１コム信号によって駆動され、回折によって第１レーザ光から複数（Ｎ本）の第１回折光を生成する。この第１ＡＯＤ２４からの各第１回折光は、ビームスプリッタ１９に入射する。コム信号発生部４２は、例えば任意波形発生器で構成されている。【0023】
第１コム信号は、互いに異なる複数の周波数の駆動信号を重ねたものであり、この第１コム信号の入力によって第１ＡＯＤ２４は、偏向角が異なるＮ本の第１回折光を同時に射出する。また、第１ＡＯＤ２４は、駆動信号の周波数に比例して、第１回折光の偏向角を大きくするとともに、第１回折光を、第１レーザ光に対して周波数シフトする。この周波数シフトは、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数だけ第１回折光の周波数が高くまたは低くなる。この例では、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数分だけ周波数が高くなった第１回折光が第１ＡＯＤ２４から射出する。したがって、偏向角が大きい第１回折光ほど周波数が高くなる。なお、偏向角は、０次の回折光と第１回折光とのなす角度である。また、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数分だけ第１回折光の周波数を低くしてもよい。【0024】
図２に示すように、第１コム信号は、一定な周波数間隔Δｆで周波数ｆ１１から周波数ｆ１ＮまでのＮ個の駆動信号を重ねたものである。これにより、第１ＡＯＤ２４からは、周波数間隔Δｆで周波数ｆａ１から周波数ｆａＮまでのＮ本の第１回折光が出力される。ここで、第１レーザ光、すなわちレーザ装置１５から出力されるレーザ光の周波数をｆ０、ｉを１、２・・・Ｎとすると「ｆａｉ＝ｆ０＋ｆ１ｉ」となる。また、周波数間隔Δｆを一定にすることで、隣接した第１回折光同士の偏向角の差をいずれも等しくしている。【0025】
この例では、第１ＡＯＤ２４として、動作可能な駆動信号の範囲（以下、動作帯域という）が１００ＭＨｚ〜２００ＭＨｚのＡＯＤを用いている。また、第１コム信号における周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして、１０１ＭＨｚ（＝ｆ１１）から２００ＭＨｚ（＝ｆ１(１００)）までの駆動信号を重ね合わせており、これにより周波数が１ＭＨｚ間隔（＝Δｆ）で変化する１００（＝Ｎ）本の第１回折光を生成する。【0026】
図１において、第２アーム１８では、偏光ビームスプリッタ１６からの第２レーザ光は、ミラー３１、ＡＯＦＳ３２、アナモルフィックプリズムペア３３を介して第２ＡＯＤ３４に入射する。周波数変換部としてのＡＯＦＳ３２は、シフト信号発生部４３からのシフト信号によって駆動され、第２レーザ光の周波数をシフト周波数ｆｓだけ低くする。このＡＯＦＳ３２は、第２ＡＯＤ３４として、第１ＡＯＤ２４と同じ動作帯域であり、同じ特性を持つＡＯＤを用いながら、複数の第１回折光の周波数範囲（第１の周波数範囲）と第２ＡＯＤ３４から射出される複数の第２回折光の周波数範囲（第２の周波数範囲）とが重ならないようにしている。このため、シフト周波数ｆｓは、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲とが重ならないように決められている。この例では、シフト周波数ｆｓは、１００ＭＨｚとしてある。また、ＡＯＦＳ３２によって、第２レーザ光の周波数をシフト周波数ｆｓだけ高くしてもよい。【0027】
上記のように、ＡＯＦＳ３２は、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲とが重ならないようにするために設けているので、第１、第２ＡＯＤ２４、３４によって第１、第２レーザ光から直接に周波数範囲が重ならない複数の第１回折光と複数の第２回折光とを生成することができる場合には、ＡＯＦＳ３２は、不要である。また、後述するように、第１ＡＯＤ２４からの第１回折光と第２ＡＯＤ３４からの第２回折光とを組み合わせて干渉光を生成することで、干渉光のビート周波数を低くできるので、光検出部１３の応答性や試料Ｔの蛍光物質の応答速度に対応させてビート周波数を低くするためのＡＯＦＳを不要とすることができる。【0028】
アナモルフィックプリズムペア３３は、ＡＯＦＳ３２からの第２レーザ光のビーム形状を円形から楕円形に変形させる。この変形では第２ＡＯＤ３４による第２レーザ光の回折方向に沿ってビーム形状を引き延ばすことにより行う。アナモルフィックプリズムペア３３は、アナモルフィックプリズムペア２２と同様に、第２ＡＯＤ３４から射出される各第２回折光の広がりを抑え、分解能の低下を防止している。【0029】
第２ＡＯＤ３４は、コム信号発生部４２からの第２コム信号によって駆動され、回折によって第２レーザ光からＮ本の第２回折光を生成する。第２ＡＯＤ３４からの各第２回折光は、ビームスプリッタ１９に入射する。第２コム信号は、第１コム信号と同様に、互いに異なる複数の周波数の駆動信号を重ねたものであり、この第２コム信号の入力によって第２ＡＯＤ３４は、偏向角が異なるＮ本の第２回折光を同時に射出し、各第２回折光は、その周波数が周波数シフトによって駆動信号の周波数分だけ第２レーザ光よりも高くされている。【0030】
この例では、第２ＡＯＤ３４としては、上述のように第１ＡＯＤ２４と同じＡＯＤを用いている。すなわち、同一の周波数の駆動信号に対する回折光の偏向角が同じになり、駆動信号の周波数の変化量に対する第１回折光と第２回折光の偏向角の変化量が同じになる第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とを用いている。また、図２に示すように、第２コム信号の各駆動信号の周波数と第１コム信号の各駆動信号の周波数とを同じにしている（ｆ１ｉ＝ｆ２ｉ）。したがって、第２コム信号は、周波数間隔Δｆで周波数ｆ２１（＝ｆ１１）から周波数ｆ２Ｎ（＝ｆ１Ｎ）までのＮ個の駆動信号を重ねたものになっている。第２ＡＯＤ３４からは、周波数間隔Δｆで周波数ｆｂ１から周波数ｆｂＮまでのＮ本の第２回折光が出力される。第２回折光の周波数ｆｂｉは、対応する駆動信号の周波数ｆ２ｉを用いて「ｆｂｉ＝ｆ０−ｆｓ＋ｆ２ｉ」となる。【0031】
第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４として、同じＡＯＤを用いることによって、複数の干渉光を生成するための複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせを容易にしている。すなわち、コム信号中の駆動信号の周波数の変化量に対する第１回折光と第２回折光の偏向角の変化量が同じになる第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とを用いることによって、複数の第１回折光と複数の第２回折光の偏向角の角度間隔を互いに同じすることができ、それらの重ね合わせを容易にしている。例えば、後述するようにビームスプリッタ１９のように簡単な構成で複数の第１回折光と複数の第２回折光とを重ね合わせて、所望の複数の干渉光を得ることができる。【0032】
上記第２ＡＯＤ３４は、第１ＡＯＤ２４と同じく周波数が１ＭＨｚ間隔（＝Δｆ）で変化する１００（＝Ｎ）本の第２回折光を生成する。また、同じ周波数の駆動信号に対する第２回折光と第１回折光との各偏向角は同じであるが、各周波数はＡＯＦＳ３２のシフト周波数ｆｓだけ第１回折光の周波数が高くなる（ｆａｉ＝ｆｂｉ＋ｆｓ）。【0033】
重ね合わせ部としてのビームスプリッタ１９は、複数の第１回折光と複数の第２回折光とを互いに周波数が異なる同士で組み合わせて重ねることで、第１回折光と第２回折光とが干渉したＮ本の干渉光を生成する。図３に示すように、第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とは、同一の水平面に各第１回折光、各第２回折光を射出するように配置され、第１回折光Ｌａｉの周波数をｆａｉ、第２回折光Ｌｂｉの周波数をｆｂｉとしたときに、ビームスプリッタ１９によって、第１回折光Ｌａｉと第２回折光Ｌｂ（Ｎ―ｉ＋１）とを重ね合わせて干渉光Ｌａｂｉを生成するように、その向きが調整されている。すなわち、第１回折光については周波数が高くなる順番で、また第２回折光は周波数が低くなる順番で、第１回折光と第２回折光とを組み合わせてＮ本の干渉光を生成する。このようにして、第１の光としての第１回折光については周波数が低いものから、また第２の光としての第２回折光は周波数が高いものからそれぞれ順番に選択される第１回折光と第２回折光とを組み合わせてＮ本の干渉光を生成している。なお、第１回折光Ｌａｉ及び第２回折光Ｌｂｉの周波数ｆａｉ、ｆｂｉは、「ｉ」が大きいほど周波数が高い（ｆａ（ｉ＋１）≧ｆａｉ、ｆｂ（ｉ＋１）≧ｆｂｉ）。【0034】
なお、干渉光を生成する際に、第１回折光に対応する第２回折光が完全に重ならなくてもよい。また、第１アーム１７と第２アーム１８の各レーザ光の光路長は、第１回折光と第２回折光とが干渉する範囲（コヒーレント長の範囲）で一致させておく。【0035】
上記のように、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせることにより、図４Ａに示すように、各干渉光の隣接したビート周波数ｆａｂｉ（＝ｆａｉ−ｆｂ（Ｎ―ｉ＋１））を一定な周波数間隔Δｆａｂ（＝ｆａｂ（ｉ＋１）−ｆａｂｉ）にするとともに、その周波数間隔Δｆａｂを従来よりも広くしている。具体的には、特許文献１に記載される手法による隣接したビート周波数の周波数間隔は、回折光を生成するＡＯＤの駆動信号の周波数間隔と同じであって、この例の周波数間隔Δｆに相当する。しかし、この例では隣接したビート周波数ｆａｂの周波数間隔Δｆａｂは、ＡＯＤの駆動信号の周波数間隔Δｆの２倍（Δｆａｂ＝２・Δｆ）になる。【0036】
図４Ｂに示すように、各ビート周波数ｆａｂｉは、それぞれ試料Ｔを蛍光、すなわち蛍光の光強度の変化に応じて変化する光信号の搬送周波数（中心周波数）となり、搬送周波数ごとに側波ＳＢとして利用可能な幅、すなわち帯域幅が周波数間隔Δｆａｂとなる。したがって、搬送周波数ごとの帯域幅と、Ｎ本の干渉光による検出で利用可能な全帯域幅が従来手法の２倍になる。具体的には、この例では周波数間隔Δｆが１ＭＨｚであるから、従来手法では搬送周波数ごとの帯域幅が１ＭＨｚ、全帯域幅が１００ＭＨｚであるのに対して、この例では搬送周波数ごとの帯域幅が２ＭＨｚ、全帯域幅が２００ＭＨｚである。【0037】
また、上記のように複数の第１回折光のそれぞれに、対応する第２回折光を重ねて干渉光を生成しているので、各第１回折光の周囲に分布する干渉に利用されないレーザ光が少なくなる。このため干渉光の生成効率が高くなるとともに、各干渉光の光強度を高めることができるので、ショットノイズの低減を図ることができる。【0038】
上記のようにビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する際の第１回折光と第２回折光の組み合わせは一例であり、これに限定されるものではない。ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成するには、第１の回折光と第２の回折光との周波数の差が異なるように複数の第１回折光と複数の第２回折光を組み合わせればよい。【0039】
図１において、ビームスプリッタ１９からのＮ本の干渉光は、等角度間隔で水平面上に並んで射出され、干渉光生成部１１の一部であるアナモルフィックプリズムペア４４、リレー光学系４５を介してダイクロイックミラー４６に入射する。このときに、Ｎ本の干渉光が並ぶ方向が主走査方向に相当する方向であり、この主走査方向に直交する方向が副走査方向である。なお、この例では、干渉光照射部１２では、主走査方向は矢印Ｍで示す上下方向になり、副走査方向は矢印Ｓで示す水平方向になる。【0040】
アナモルフィックプリズムペア４４は、アナモルフィックプリズムペア２２、３３によって楕円形となっている各干渉光のビーム形状を、その短軸方向に引き延ばすことによって円形とする。アナモルフィックプリズムペア２２、３３、４４に代えてシリンドリカルレンズ等を用いてもよい。【0041】
リレー光学系４５は、ビームスプリッタ１９側に配されたレンズ４５ａとダイクロイックミラー４６側に配されたレンズ４５ｂとから構成されており、レンズ４５ａの前側焦点位置が第１、第２ＡＯＤ２４、３４の出力面に、レンズ４５ｂの後側焦点位置が後述する走査ミラー４７ａの反射面に一致するように配されている。これにより、各干渉光を所定のビーム径を保持した状態で走査ミラー４７ａに入射させる。ダイクロイックミラー４６は、リレー光学系４５を通った各干渉光を干渉光照射部１２に向けて反射し、干渉光照射部１２からの検出光を透過して光検出部１３に送る。【0042】
干渉光照射部１２は、走査ミラー４７ａを備えたレゾナントスキャナ４７、ミラー４８、リレー光学系５１、対物レンズ５２、試料Ｔを載置するステージ（図示省略）等で構成されている。ダイクロイックミラー４６からのＮ本の干渉光は、走査ミラー４７ａ、ミラー４８、リレー光学系５１を介して対物レンズ５２に入射し、試料Ｔに照射される。ダイクロイックミラー４６で反射された各干渉光は、走査ミラー４７ａによって上方に９０度折り曲げられてから、ミラー４８に入射する。【0043】
レゾナントスキャナ４７は、干渉光の入射方向と直交する水平方向に平行な回転軸４７ｂを中心に走査ミラー４７ａを揺動させることによって、各干渉光を副走査方向に周期的に偏向して等角度走査する。【0044】
リレー光学系５１は、ミラー４８側に配されたレンズ５１ａと対物レンズ５２側に配されたレンズ５１ｂとから構成されており、レンズ５１ａの前側焦点位置が走査ミラー４７ａの反射面に、レンズ５１ｂの後側焦点位置が対物レンズ５２の入射瞳に一致するように配されている。このリレー光学系５１によって、各干渉光は、対物レンズ５２の入射瞳にほぼいっぱいに広がって入射する。【0045】
対物レンズ５２は、入射するＮ本の干渉光をそれぞれ集光して試料Ｔに向けて照射する。図５に示すように、対物レンズ５２によって、その焦点面に各干渉光をそれぞれ集光したＮ個の照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮが形成される。照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮは、それらの直径とほぼ同じピッチで主走査方向にライン状に並ぶ。照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮの直径（半値全幅）は、この例では、約３３０ｎｍである。【0046】
照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮは、上記走査ミラー４７ａの揺動によって、ライン状に並んだ状態を維持して副走査方向に同時に移動する。これにより、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮの１回の副走査方向の移動で試料Ｔを２次元的に走査する。このときに、光の入射角度の変化に比例して像高が変化する対物レンズ５２の領域を使用することで、走査ミラー４７ａによる干渉光の副走査方向の等角度走査は等速直線走査になる。そして、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮが１方向に１回移動することで、１フレーム分の走査が完了する。なお、以下では照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮを特に区別する必要がない場合には照射スポットＳＰと記す。【0047】
この例においては、レゾナントスキャナ４７が、試料Ｔに対してライン上に並んだ照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮの照射ラインを副走査方向に移動させる走査部であるが、走査部としては、レゾナントスキャナ４７に代えて、ガルバノミラーやポリゴンミラーなどの他の光偏向手段を用いてもよい。【0048】
また、この例では、固定された試料Ｔに対して、ライン上に並んだ照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮの照射ラインを副走査方向に移動させているが、走査部による試料Ｔの２次元的な走査は、試料Ｔと照射ラインとを相対的に移動すればよい。したがって、後述する第４実施形態のように、固定された照射ラインに対して試料Ｔを副走査方向に移動してもよい。また、この例では、試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向を、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮが並ぶ主走査方向と直交する副走査方向に一致させているが、その移動方向は、副走査方向の成分が含まれていればよい。すなわち、試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向が主走査方向と平行にならなければよく、照射ラインと試料Ｔとの相対的な移動方向とのなす角度をθとしたときに、「０°＜θ≦９０°」を満たせばよい。したがって、主走査方向と交差する方向に、試料Ｔと照射ラインとを相対的に移動させればよく、この例では、照射ラインを主走査方向と交差する方向に移動すればよい。【0049】
試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向が、主走査方向に対して直交する方向ではない場合、すなわち「０°＜θ＜９０°」となる場合、移動方向と直交する方向における照射スポットの間隔が実質的に狭くなる（cosθ倍になる）ため、この方向のピクセルサイズを小さくする（ピクセル分解能を向上する）ことになり、解像度向上の効果が得られる。【0050】
なお、対物レンズ５２は、その光軸方向に移動自在にされており、例えばモータ（図示省略）によって移動できる。これにより、試料Ｔに対する対物レンズ５２の焦点面の位置を変えて走査を行うことができる。試料Ｔを載せたステージを対物レンズ５２の光軸方向に移動させてもよい。【0051】
照射スポットＳＰ内の試料Ｔに干渉光が照射されることで、照射スポットＳＰ内の試料Ｔの蛍光物質が励起して蛍光を発生する。そして、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮが副走査方向に移動することによって、主走査方向に並んだＮ個の照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮによって主走査方向に並んだＮ本の副走査ラインにそれぞれ干渉光が照射される。これにより、各副走査ラインから蛍光が放出される。各副走査ラインから放出される蛍光の光強度は、照射される干渉光のビート周波数に応じて変化するとともに、照射スポットＳＰの副走査方向への移動によって、副走査ラインにおける蛍光物質の分布に応じて変化する。すなわち、蛍光は、照射された干渉光のビート周波数を搬送周波数とした信号を蛍光物質の分布に応じて強度変調した光信号である。【0052】
第１回折光と第２回折光とは、いずれも強度分布がガウシアン分布となったものであり、干渉光は、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせたものになるので、強度分布の半値幅が狭く尖度が大きくなる。このため、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせた干渉光を試料Ｔに照射する手法は、従来の手法に比べて空間分解能が高くなるという利点がある。【0053】
図１において、上記のようにして、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮから放出される各蛍光は、対物レンズ５２によって集光され、それら各蛍光からなる検出光が対物レンズ５２からリレー光学系５１に入射し、リレー光学系５１に入射した検出光は、干渉光と逆の経路を通ってダイクロイックミラー４６に入射する。【0054】
ダイクロイックミラー４６に入射した検出光は、ダイクロイックミラー４６を透過して、光検出部１３に送られる。光検出部１３は、ミラー５４、集光レンズ５５、スリット板５６、光検出器としての光電子増倍管（以下、ＰＭＴ（Photomultiplier tube）という）５７、増幅器５８、デジタイザ５９を備える。検出光は、ミラー５４、集光レンズ５５を介してＰＭＴ５７に入射する。集光レンズ５５の焦点位置には、スリット板５６が配されており、スリット板５６に形成されたスリット５６ａを透過した検出光だけがＰＭＴ５７に入射する。これにより、レーザ顕微鏡システム１０を共焦点式として、対物レンズ５２の焦点面からの蛍光成分だけをＰＭＴ５７に入射させ、コントラストや空間分解能を向上させている。スリット５６ａの長手方向は、対物レンズ５２の焦点面における主走査方向を焦点面とスリット板５６との間にある光学系を通して投影した向きである。光検出器としては、ＰＭＴ５７に代えてアバランシェフォトダイオード等を用いてもよい。なお、スリット板５６を省略してもよい。【0055】
ＰＭＴ５７は、入射する検出光の強度に応じた検出信号を出力する。すなわち、各照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮから、それぞれ蛍光物質の分布に応じて変調された蛍光が光信号として放出され、それら光信号を重ね合わせて多重化された多重化信号としての検出光がＰＭＴ５７で検出され、その多重化信号に相当する検出信号が出力される。このとき、各光信号は、上記のように照射される干渉光のビート周波数が搬送周波数となっている。【0056】
ＰＭＴ５７からの検出信号は、増幅器５８で増幅されてからデジタイザ５９によって、その信号レベルが所定のサンプリング周波数でサンプリングされて検出データにデジタル変換される。走査ミラー４７ａの揺動に同期してレゾナントスキャナ４７が出力する同期信号によって、デジタイザ５９が１フレームの走査開始と終了を検知することで、１フレームの検出信号を検出データに変換する。デジタイザ５９のサンプリング周波数は、検出光の帯域の上限周波数の２倍よりも高くされている。検出光の帯域の上限周波数は、最も高いビート周波数より周波数間隔Δｆ（＝Δｆａｂ）だけ高いから、この例では上限周波数が２００ＭＨｚであり、サンプリング周波数を例えば１ＧＨｚに設定している。【0057】
検出信号から変換された検出データは、信号処理部１４に送られる。この信号処理部１４は、例えばＰＣで構成されており、検出信号から試料Ｔの情報、この例では蛍光物質の分布を取得するものである。信号処理部１４は、フーリエ変換部１４ａ、逆フーリエ変換部１４ｂ、画像処理部１４ｃ、モニタ１４ｄを有する。まず、フーリエ変換部１４ａによって、１回の副走査で得られる１フレーム分の検出データに対して高速フーリエ変換を行い、周波数スペクトルが求められる。【0058】
なお、照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮのビート周波数を、デジタイザ５９による１フレームに対するサンプリング数（Ｎｄ）とサンプリング周波数（ｆｄ）との比（＝ｆｄ／Ｎｄ）の整数倍になるように設定するのがよい。これにより、フーリエ変換後の周波数データ点に、各照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮのビート周波数が正確に一致するため、後段のデータ処理の精度を向上させることができる。【0059】
次に、逆フーリエ変換部１４ｂによって、フーリエ変換部１４ａで求められた周波数スペクトルから、干渉光のビート周波数ごとに、ビート周波数を搬送周波数とした所定の帯域幅Δｆｗ（≦２Δｆ）で周波数スペクトルを分離し、それら分離した各周波数スペクトルに逆フーリエ変換をそれぞれ行う。周波数スペクトルを分離することは、周波数スペクトルを副走査ラインごとに分離することに相当し、副走査ラインに干渉光が照射することで得られる変調された蛍光（光信号）の周波数スペクトルである。この逆フーリエ変換により、周波数スペクトルから時間軸方向、すなわち各副走査ラインに沿った蛍光物質の分布が求められる。逆フーリエ変換部１４ｂで求められたＮ本分の副走査ラインについての蛍光物質の分布は、画像処理部１４ｃにより、その分布を２次元にマッピングした観察画像に変換されてモニタ１４ｄに表示される。なお、上記高速フーリエ変換と逆フーリエ変換の代わりに短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）を行った画像取得も可能である。この場合、主走査方向のピクセルに相当する時間範囲でのＳＴＦＴのスペクトルが副走査方向の輝度分布に相当し、ＳＴＦＴのスペクトルの時間変化が観察画像となる。【0060】
上記のように、搬送周波数ごとの帯域幅が従来よりも広くなっているので、従来よりも高い周波数の変調成分まで利用して副走査ラインに沿った蛍光物質の分布を求めることが可能になる。したがって、各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。【0061】
ところで、一対の照射スポットＳＰの間でクロストークが生じ、不要なクロストーク成分（ビート周波数）が発生することがある。例えば、図６に模式的に示すように、隣接した照射スポットＳＰｉ、ＳＰｉ＋１の間では、照射スポットＳＰｉを形成する干渉光の第１回折光Ｌａｉと照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ）との干渉、及び照射スポットＳＰｉを形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋１）と他方の照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ＋１）との干渉のそれぞれにより、隣接したビート周波数ｆａｂｉとビート周波数ｆａｂ（ｉ＋１）の中間に不要なクロストーク成分が発生する。【0062】
また、図７に示すように。１つの照射スポットＳＰｉを挟んだ一対の照射スポットＳＰｉ−１，ＳＰｉ＋１の間では、照射スポットＳＰｉ−１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ−１）と照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ）との干渉、及び照射スポットＳＰｉ−１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋２）と照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ＋１）との干渉のそれぞれにより、それら中間の照射スポットＳＰｉを形成する干渉光のビート周波数ｆａｂｉと同じ周波数のクロストーク成分が発生するため、ビート周波数ｆａｂｉの成分の振幅を大きくしたり小さくしたりする。【0063】
上記のようなクロストークは、次の２つの条件を満たすことで抑制することができる。１つ目の条件は、隣接する一対の照射スポット間のクロストークについて、第１回折光と第２回折光の２つの干渉によって発生するクロストーク成分が互いに打ち消すように、一対の照射スポットの各第１回折光と第２回折光の位相を設定することである。２つ目の条件は、１つの照射スポットを挟んだ一対の照射スポット間のクロストークについて、いずれのクロストーク成分も影響を与えるビート周波数の干渉光に対して一定の位相を有するようにすることである。具体的には、各第１回折光については位相を「０」とし、第２回折光の位相を周波数（波数）の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずらせばよい。【0064】
第１、第２回折光の位相は、第１、第２コム信号の駆動信号（コム成分）の位相に一致するので、上記のように各第１、第２回折光の位相を設定するには、第２コム信号の各駆動信号の位相を周波数の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずつずらせばよい。なお、各第２回折光の位相を「０」とし、第１回折光の位相を周波数の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずらしてもよい。【0065】
なお、第１コム信号、第２コム信号は、いずれもその各駆動信号が干渉することで、瞬間的に非常に高いピーク値を示すことがある。このような現象が生じる場合では、非常に高いピーク値の影響を受けて、第１コム信号、第２コム信号の全体的な振幅が小さくなり、この結果、干渉光の全体的な振幅も小さくなってしまう。このような非常に高いピーク値の発生の防止と、クロストーク成分の抑制のため、第１回折光については、例えば周波数が低いものから順に位相を０、φ、３φ、６φ、１０φ・・・・とし、第２回折光については、周波数が高いものから順に位相を０、π−φ、−３φ、π−６φ、−１０φ・・・・とするのがよい。すなわち、ｉを１、２・・・Ｎとしたときに、第１回折光Ｌａｉと第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋１）を組み合わせて干渉光を生成する場合、第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i−１）φ／２＋（i−１）π」に設定し、第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋１）の位相を「φｂ−i（i−１）φ／２＋（i−１）π」に設定することである。φａ，φｂは、いずれも任意の定数であり、値φは、非常に高いピーク値の発生の防止するために設定される定数であって３°程度に設定すればよい。また、値φを１８３°程度に設定してもよい。この場合は、所望のビート周波数成分に対してクロストーク成分がほぼ同位相で加算されるので、信号増強効果がある。第１回折光と第２回折光とに与える位相の順番は逆でもよく、与える位相を第１回折光と第２回折光と入れ替えてもよい。この場合にも、第１、第２回折光の位相を第１、第２コム信号の駆動信号の位相として設定すればよい。【0066】
値φを３°程度に設定した場合、第１，第２コム信号のｐ―ｐ値（最大値と最小値との差）が理論上の最小値とほぼ一致する。また、各干渉光の強度を合成した強度変化を示す信号のｐ−ｐ値も理論的最小値に近くなる。したがって、第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４の回折効率、光検出部１３のダイナミックレンジが大きくなって有利になる。【0067】
なお、上記でキャンセルするクロストーク成分を逆に信号として利用することも可能である。この場合には、クロストーク成分の抑制がなされないように設定するため、例えば、上記と同様にして第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i−１）φ／２」に設定し、第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋１）の位相を「φｂ−i（i−１）φ／２」に設定する。さらに、クロストーク成分に十分な振幅を持たせるために、主走査方向に並ぶ複数の照射スポットＳＰについて、隣接した照射スポットＳＰの一部が互いに重なり合うように、隣接した照射スポットＳＰの中心間隔を照射スポットＳＰのスポット径よりも小さくする。これは、クロストーク成分もこれまでに述べた信号成分と同様に、回折光の重なりによって生じるため、クロストーク成分を信号として用いる場合には重なりを大きくして振幅をなるべく大きくするのが望ましいからである。この場合、隣接した干渉光間の２組の第１回折光と第２回折光とのクロストーク成分が本来の第１、第２回折光の干渉によるビート周波数成分と同程度の振幅を持つようになり、主走査方向のピクセル数（副走査ラインのライン数）を倍増させることができる。その分１ピクセルあたりの周波数帯域が半減することになるが、従来の方法に比べて周波数帯域が倍増したことにより、同一の速度で２倍のピクセル数の情報取得が可能になるため、結果的に周波数帯域の増大による情報量の増大という効果が得られる。【0068】
上記レーザ顕微鏡システム１０の構成は、一例であり、上記構成に限定されるものではない。複数の第１回折光と複数の第２回折光を生成する構成についても、上記構成に限定されない。例えば、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として同じＡＯＤを用いながら、第１、第２ＡＯＤ２４、３４を互いに重ならない周波数範囲のコム信号でそれぞれ駆動して第１、第２回折光を生成してもよい。具体的には、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として、いずれも動作帯域が例えば１００〜３００ＭＨｚの同じＡＯＤを用い、第１ＡＯＤ２４を１０１〜２００ＭＨｚの周波数範囲の第１コム信号で動作させ、第２ＡＯＤ３４を２０１〜３００ＭＨｚの周波数範囲の第２コム信号で動作させてもよい。【0069】
また、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として同じＡＯＤを用い、第１、第２レーザ光を互いに正負逆の入射角で対応するＡＯＤに入射することによって、第１、第２ＡＯＤ２４、３４による周波数シフトの正負を互いに逆にして第１、第２回折光を生成してもよい。この場合には、同じ周波数範囲の第１、第２コム信号を用いても、第１、第２レーザ光に対する第１、第２回折光の周波数シフトの正負が互いに逆になるため、第１、第２回折光の各周波数範囲が重ならない。なお、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に対する第１、第２レーザ光の入射角の大きさは、干渉光の生成効率を高くするために同じにすることが好ましい。【0070】
上記２つのいずれの構成においても、複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせが容易になるとともに、第１、第２回折光の各周波数範囲が重ならないのでＡＯＦＳ３２が不要になり、部品点数を削減する上で有利である。【0071】
第１、第２ＡＯＤ２４、３４は、異なるＡＯＤを用いてもよい。この場合であっても、コム信号中の駆動信号の周波数の変化量に対する偏向角の変化量が第１ＡＯＤ２４と同じになる第２ＡＯＤ３４を用いることによって、上記同様に、複数の干渉光を生成するための複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせが容易になる。また、このときに、第１コム信号の周波数範囲と重ならない周波数範囲の第２コム信号で動作可能な第２ＡＯＤ３４を用いれば、第１、第２回折光の周波数範囲が重ならないのでＡＯＦＳ３２を設ける必要がなくなる。【0072】
また、第１、第２回折光の周波数範囲の一部範囲が重なることによって、同じビート周波数の干渉光が生成されてもよい。この場合には、同じビート周波数の干渉光のうちの１の干渉光を残して他の干渉光を、例えばリレー光学系４５のレンズ４５ａ、４５ｂの間で干渉光が集光される位置で遮光する等して除去すればよい。このような場合にも、実際に利用する干渉光が、周波数範囲の重ならない第１、第２回折光を用いて生成されているので、ＡＯＦＳ３２を省略することができる。【0073】
［第２実施形態］第２実施形態は、対物レンズとは反対側に放出される試料からの蛍光を検出するようにレーザ顕微鏡システムを構成したものである。なお、以下に説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。また、この第２実施形態のレーザ顕微鏡システムは、干渉光生成部の構成は第１実施形態と同じであるから、図８では干渉光生成部を省略して描いてある。なお、後述する第３、第４実施形態の図９、図１０や、図１３についても、図８と同様である。
【0074】
図８に示すように、干渉光生成部で生成されたＮ本の干渉光は、ミラー７１で反射されて干渉光照射部１２に送られる。干渉光照射部１２では、第１実施形態と同様に、Ｎ本の干渉光は、走査ミラー４７ａ、ミラー４８、リレー光学系５１、対物レンズ５２を介して試料Ｔに照射され、主走査方向に並んだＮ個の照射スポットが走査ミラー４７ａの揺動で副走査方向に移動されて１フレーム分の走査が行われる。試料Ｔを挟んで対物レンズ５２の反対側に、光検出部７３が配されている。光検出部７３は、試料Ｔ側から順に、バンドパスフィルタ７４、集光レンズ５５、ＰＭＴ５７が配されている。バンドパスフィルタ７４は、干渉光をカットするとともに、試料Ｔから放出される蛍光を透過する。これにより、干渉光が照射されて試料Ｔから放出される蛍光のうち、背後側すなわち対物レンズ５２と反対側に放出される蛍光がバンドパスフィルタ７４、集光レンズ５５を介してＰＭＴ５７によって受光される。【0075】
第１実施形態と同様に、検出光の帯域幅を広くしているので、例えば、各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。【0076】
［第３実施形態］図９は、検出光を複数の波長に分解して検出する第３実施形態のレーザ顕微鏡システムを示している。なお、第３実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する光検出部が異なる他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。この例では、例えば、干渉光の照射によって、互いに波長の異なる第１〜第３波長成分の蛍光を放出する３種類の蛍光物質のいずれか１つ、あるいは２以上を含有するような試料Ｔが用いられる。
【0077】
図９に示すように、光検出部８１は、波長分離部としての第１、第２ダイクロイックミラー８２ａ、８２ｂと、第１〜３検出ユニット８３ａ〜８３ｃを備えている。第１ダイクロイックミラー８２ａは、検出光に含まれる第１波長成分の蛍光を第１検出ユニット８３ａに向けて反射して、それ以外の波長成分を透過する。また、第２ダイクロイックミラー８２ｂは、第１ダイクロイックミラー８２ａを透過した検出光のうちの第２波長成分の蛍光を第２検出ユニット８３ｂに向けて反射して、それ以外の波長成分の蛍光を第３検出ユニット８３ｃに向けて透過する。【0078】
第１〜第３検出ユニット８３ａ〜８３ｃは、いずれも集光レンズ５５、スリット板５６、ＰＭＴ５７を備えている。第１検出ユニット８３ａは、第１ダイクロイックミラー８２ａで反射された第１波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第１波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。第２検出ユニット８３ｂは、第２ダイクロイックミラー８２ｂで反射された第２波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第２波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。第３検出ユニット８３ｃは、第２ダイクロイックミラー８２ｂを透過した第３波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第３波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。【0079】
上記のように構成することにより、３種類の蛍光物質のいずれが試料Ｔに含まれているか、また試料Ｔの内部に各蛍光物質がどのように分布しているか等を観察することが可能になる。もちろん、第１実施形態と同様に、検出光の帯域幅を広くしているので、例えば各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。【0080】
上記では、検出光を３つの波長成分に分離しているが、分離する波長成分は２以上であれば良い。また、第２実施形態のように対物レンズ５２の反対側に試料Ｔから放出される蛍光からなる検出光や、後述するように干渉光が試料Ｔで反射した反射光からなる検出光、試料Ｔを透過した干渉光からなる検出光についても波長成分に分離して検出することができる。【0081】
［第４実施形態］図１０は、試料を副走査方向に移動することにより、照射スポットと試料とを副走査方向に相対的に移動する第４実施形態のレーザ顕微鏡システムを示している。なお、第４実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
【0082】
図１０に示す例は、フローサイトメータに、本発明のレーザ顕微鏡システムを適用した構成になっている。干渉光照射部８６は、フローセル（フローサイトメトリー用セル）８７に形成された微小流路８７ａに対して、対物レンズ５２から干渉光を照射する。微小流路８７ａの内部に対物レンズ５２の焦点面が位置し、主走査方向が微小流路８７ａ内の流れ方向と直交する方向になるように調整されている。すなわち、微小流路８７ａ内の流れ方向と直交する方向に照射スポットＳＰをライン状に並べて形成する。微小流路８７ａ内に試料Ｔを水等の流体とともに流すことにより、ライン状に並んだ照射スポットＳＰに対して試料Ｔが副走査方向に移動する。【0083】
この例では、走査用ミラー等で照射スポットＳＰを副走査方向に移動する必要がないため、ダイクロイックミラー４６で反射させたＮ本の干渉光をリレー光学系５１を介して対物レンズ５２に入射させている。微小流路８７ａ内を試料Ｔが高速に流れても、搬送周波数ごとの帯域幅を広くしてあるので、良好な観察画像を得ることができる。【0084】
なお、上述のように試料Ｔの２次元的な走査を行う場合、試料Ｔと照射スポットＳＰ１〜ＳＰＮが並ぶ照射ラインとの相対的な移動方向に副走査方向の成分が含まれていればよいので、この例では副走査方向となる微小流路８７ａ内の流れ方向に対して複数の照射スポットＳＰの並ぶ主走査方向が交差していればよい。【0085】
［第５実施形態］図１１は、第１回折光と第２回折光とをずらした第５実施形態を示している。なお、第５実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
【0086】
この第５実施形態では、図１１に示すように、対物レンズ５２の焦点面、すなわち干渉光の照射位置で、第１回折光の照射スポットＳＰ１１〜ＳＰ１Ｎと第２回折光の照射スポットＳＰ２１〜ＳＰ２Ｎとを、それぞれその直径とほぼ同じ配列ピッチＰで主走査方向に平行な同一のライン上に並べて形成する。例えば第２アーム１８内のミラー３１の傾きを調整することによって、第２回折光の照射スポットＳＰ２１〜ＳＰ２Ｎを配列ピッチＰの１／２だけ主走査方向にずらして照射スポットＳＰ１１〜ＳＰ１Ｎに重ね合わせる。【0087】
なお、ミラー２３の傾きの調整に代えて、第１コム信号または第２コム信号のいずれか一方の各駆動信号の周波数を他方に対してずらすことでも実現できる。また、位相の設定は、第１実施形態において説明したクロストーク成分を信号として利用する場合と同様に、クロストーク成分の抑制がなされないようにするため、例えば第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i−１）φ／２」に設定する。さらに第２回折光Ｌｂ（Ｎ−ｉ＋１）の位相を「φｂ−i（i−１）φ／２」に設定する。さらに、第１、第２回折光のビーム径を大きくして、隣接する第１回折光と第２回折光の中心間隔と、回折光の照射スポットのスポット径とが同程度、あるいは前者が後者よりも小さくなるように設定すればよい。このときに第１、第２回折光の中心間隔に対してスポット径を大きくする調整を行ってもよい。第１、第２回折光の照射スポットの重なりを大きくするのがよい。第１、第２回折光の照射スポットの重なりが大きいほど干渉光の強度が大きくなり、それに応じて検出信号の信号レベルを大きくできることから、このような設定を行うことが望ましい。【0088】
上記のように第１回折光と第２回折光を重ね合わせることで、図中ハッチングで示すように、干渉光の照射スポットを、第１回折光の照射スポットＳＰ１１〜ＳＰ１Ｎと第２回折光の照射スポットＳＰ２１〜ＳＰ２Ｎとが重なった部分として形成する。これにより、主走査方向に並ぶ干渉光の照射スポットが上記第１実施形態に比べて約２倍になる。すなわち、主走査方向に並ぶピクセル数（副走査ラインのライン数）を倍増させることができ、主走査方向の空間解像度が向上する。この場合、１ピクセルあたりの周波数帯域が半減することになるが、従来の方法に比べて周波数帯域が倍増したことにより、従来と同一の速度で２倍のピクセル数の情報取得が可能になるため、結果的に周波数帯域の増大による情報量の増大という効果が得られる。【0089】
本実施形態は、隣接する第１、第２回折ビームの中心間隔が小さくなる極限で、第１実施形態で説明したクロストーク成分を利用する場合と一致する。これは、隣接する第１、第２回折光の中心間隔が小さくなると、主走査方向にずれて配置された隣接する第１、第２回折光の空間的重なりが１００％に近づくためである。図１１において第１、第２回折光の中心間隔を一定に保ったままビーム径を大きくしていく状況と同義である。【0090】
［第６実施形態］図１２は、第１ＡＯＤと第２ＡＯＤとして１つのＡＯＤを用いて、第１回折光と第２回折光を生成する第６実施形態を示している。なお、この第６実施形態におけるレーザ顕微鏡システムの構成は、干渉光生成部において１つのＡＯＤを用いて第１回折光と第２回折光を生成する点が第１実施形態と異なるだけである。このため、図１２には、干渉光生成部の要部のみ描いてある。また、第１実施形態と実質的に同じ構成部材については、同じ符号を付して、その詳細な説明を省略する。また、第６実施形態のレーザ顕微鏡システムの干渉光照射部、光検出部、信号処理部については他の実施形態と同様な構成とすることができる。
【0091】
図１２に示すように、レーザ顕微鏡システムの干渉光生成部１１は、レーザ装置１５、ＡＯＦＳ９１、アナモルフィックプリズムペア９２、λ／２板９３、リレー光学系９４、ＡＯＤ９５、リレー光学系９６、ウォラストンプリズム９７、ポラライザ９８等で構成されている。レーザ装置１５からの直線偏光のレーザ光は、ＡＯＦＳ９１に入射する。ＡＯＦＳ９１は、レーザ光を第１レーザ光Ｂａと第２レーザ光Ｂｂとに分けている。ＡＯＦＳ９１は、入射するレーザ光をそのまま透過した透過成分を第１レーザ光Ｂａ（透過光）として、また回折した成分を第２レーザ光Ｂｂ（変換光）として射出する。【0092】
本実施形態でのＡＯＦＳ９１は、第１実施形態と異なり、ＡＯＤ９５で発生する２種類の回折光の周波数範囲を近づけ、干渉光のビート周波数を低くするために設けてある。例えば、ＡＯＤ９５への駆動信号の周波数範囲が１００ＭＨｚから２００ＭＨｚの間である場合、第１レーザ光Ｂａから生成される第１回折光の周波数シフトの範囲は１００ＭＨｚから２００ＭＨｚ、第２レーザ光Ｂｂから生成される第２回折光の周波数シフトの範囲は「−１００ＭＨｚ」から「−２００ＭＨｚ」となる。これらによる干渉光のビート周波数の周波数範囲を０Ｈｚから２００ＭＨｚの間に設定するためには、ＡＯＦＳ９１の周波数シフト量を「＋２００ＭＨｚ」にすればよい。仮にＡＯＦＳ９１による周波数シフトがない場合、干渉光のビート周波数の周波数範囲は２００ＭＨｚから４００ＭＨｚの間となる。このような高周波成分は励起する蛍光物質の種類やＰＭＴ５７等の動作帯域によっては十分な信号レベルが得られない恐れや、信号レベルの変化を十分な精度で検出できない恐れがある。そこで上記のようにＡＯＦＳ９１により干渉光のビート周波数の周波数範囲を全体的に低周波領域にシフトさせることで、信号レベルの低下を避け、また十分な精度で信号レベルの変化を検出できるようにしている。【0093】
第１、第２レーザ光Ｂａ、Ｂｂは、それぞれアナモルフィックプリズムペア９２を通過して横方向（ＡＯＤ９５による回折方向）にビーム形状が拡大された後、レンズ９４ａ、９４ｂからなるリレー光学系９４を介してＡＯＤ９５の入射面にそれぞれ正負が異なる入射角で入射する。なお、アナモルフィックプリズムペア９２とリレー光学系９４との間の第１レーザ光Ｂａの光路上には、λ／２板９３が配されており、第１レーザ光Ｂａは、λ／２板９３を透過することで偏光方向が９０度回転する。なお、第１レーザ光Ｂａに代えて第２レーザ光Ｂｂの偏光方向を９０度回転してもよい。また、リレー光学系９４は、その前側焦点位置がＡＯＦＳ９１の出力面に、また後側焦点位置がＡＯＤ９５の入射面に一致するように調整されている。【0094】
ＡＯＤ９５は、レーザ光から複数の第１回折光を生成する第１ＡＯＤと、レーザ光から複数の第２回折光を生成する第２ＡＯＤとして機能するものである。ＡＯＤ９５は、一定な周波数間隔ΔｆのＮ個の駆動信号を重ねたコム信号が入力されている。このＡＯＤ９５により、入射する第１レーザ光Ｂａから複数の第１回折光が生成され、第２レーザ光Ｂｂから複数の第２回折光が生成される。第１、第２レーザ光Ｂａ、Ｂｂが互いに正負逆の入射角でＡＯＤに入射することによって、ＡＯＤ９５から射出される第１回折光と第２回折光との周波数シフトの正負が互いに逆になる。ここで、第２回折光は、結果的に元のレーザ光の周波数に対して、ＡＯＦＳ９１とＡＯＤ９５とによって周波数シフトされるから、ＡＯＦＳ９１による周波数シフトを、ＡＯＤ９５に駆動するコム信号の最低周波数成分の２倍とするのがよい。また、ＡＯＤ９５に対する第１、第２レーザ光の入射角の大きさは、干渉光の生成効率を高くするために同じにすることが好ましい。【0095】
上記のようにＡＯＤ９５で生成される複数の第１回折光および複数の第２回折光は、レンズ９６ａ、９６ｂからなるリレー光学系９６を介して、重ね合わせ部としてのウォラストンプリズム９７に互いに異なる方向から入射する。なお、リレー光学系９６は、その前側焦点位置がＡＯＤ９５の出力面に、また後側焦点位置がウォラストンプリズム９７に一致するように調整されている。【0096】
ここで、ＡＯＤ９５から射出される第１、第２回折光は、それぞれ元の第１レーザ光Ｂａ、第２レーザ光Ｂｂの偏光状態を保つため、互いに偏光が直交している。そして、これら第１、第２回折光がリレー光学系９６を介してウォラストンプリズム９７に入射することによって、周波数が異なる回折光同士で第１回折光と第２回折光が合波された、すなわち重ね合わせられた合波光がウォラストンプリズム９７から射出される。【0097】
ウォラストンプリズム９７からの合波光の光路上に、４５度直線偏光のみを透過するポラライザ９８が配されている。ウォラストンプリズム９７からの合波光がポラライザ９８に入射することにより、合波光から４５度直線偏光となる干渉光だけがポラライザ９８を透過する。これにより、上記第１実施形態におけるビームスプリッタ１９から射出される干渉光と同等の複数の干渉光が生成される。複数の干渉光は、そのビーム形状を短軸方向に引き延ばすことによって円形とするアナモルフィックプリズムペア等（図示省略）を介して干渉光照射部に送られる。【0098】
なお、ＡＯＤ９５から第１レーザ光Ｂａが回折されないで透過する０次成分が第２回折光の一部に同軸に重なるが、その第１レーザ光Ｂａの０次成分は、重なる第２回折光と偏光が直交しているので、ウォラストンプリズム９７から合波光とは異なる方向に射出されるため、無視することができる。同様に、ＡＯＤ９５から第２レーザ光Ｂｂが回折されないで透過する０次成分は、第１回折光の一部に同軸に重なるが、それらの偏光が互いに直交しているので、第２レーザ光Ｂｂの０次成分がウォラストンプリズム９７から合波光とは異なる方向に射出されるため、無視することができる。【0099】
上記のように、この例では１つのＡＯＤ９５を用いてそれぞれ複数の第１、第２回折光を生成して複数の干渉光を生成することができ、第１、第２回折光を生成する部品点数を減らすことが可能である。【0100】
別の手法により、１つのＡＯＤを用いて複数の第１回折光と複数の第２回折光とを生成することも可能である。例えば、ＡＯＤの一方の面から第１レーザ光を入射して、他方の面から複数の第１回折光を射出させるとともに、ＡＯＤの他方の面から第２レーザ光を入射して一方の面から複数の第２回折光を射出させるようにする。このようにしても第１、第２回折光を生成するＡＯＤが１つになり部品点数を減らすことが可能である。【0101】
上記の各実施形態では、試料Ｔからの蛍光を検出するが、これに限られない。例えば試料Ｔを透過した干渉光や、試料Ｔで反射（もしくは後方散乱）した干渉光を検出してもよい。反射光を検出する場合には、干渉光と検出光を分離するダイクロイックミラーに代えて、例えば図１３に示すように、偏光ビームスプリッタ９９ａと１／４波長板９９ｂとを用いればよい。１／４波長板９９ｂは、偏光ビームスプリッタ９９ａの干渉光照射部１２側に配置する。これにより、偏光ビームスプリッタ９９ａに入射する反射光は、干渉光生成部からの干渉光に対して偏光方向が９０度回転したものとなり、光検出部１３に向けて偏光ビームスプリッタ９９ａを透過する。また、干渉光は基本的に蛍光と波長が異なるため、上記透過光や反射光と蛍光を第3実施形態と同様に別々の検出器で同時に検出してもかまわない。【0102】
上記各実施形態では、ＡＯＤを用いて、それぞれ周波数の異なる複数の第１及び第２の回折光を生成し、これらから複数の干渉光を生成したが、複数の干渉光の生成は、これに限られるものではない。【0103】
図１４は、所定の透過率あるいは位相のパターンが表面に形成された変調ディスク１０１を用いて、周波数の異なる複数の回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮを生成する例を示している。変調ディスク１０１は、その中心軸１０２がモータ１０３に取り付けられており、モータ１０３によって高速に回転される。この回転している変調ディスク１０１に、その一方の面からレーザ光Ｌをシリンドリカルレンズ１０４を介して照射することによって、変調ディスク１０１の他方の面から回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮを射出する。【0104】
図１５に示すように、シリンドリカルレンズ１０４を介してレーザ光Ｌを照射することによって、変調ディスク１０１には、その径方向に沿ったライン状にレーザ光Ｌが照射される。また、変調ディスク１０１には、パターンは変形した縞状のパターンとなっており、縞の周期が照射されるレーザ光の波長よりわずかに長い程度にしてある。これにより、変調ディスク１０１上のレーザ光Ｌの照射領域内の各位置から、他の回折光と重なることなく１次回折の回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮが射出される。また、変調ディスク１０１の縞の周期は、変調ディスク１０１の径方向で異なるため、回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮの周波数シフト量が変調ディスク１０１の径方向に沿って異なる。この結果、上記実施形態と同様に、ＡＯＤから生成される回折光と実質的に同様の性質を持つ第１の光または第２の光としての複数の回折光が得られる。なお、このような変調ディスク１０１の詳細は次の文献１、文献２等に記載されている。文献１：JEFFREY J. FIELD,DAVID G. WINTERS,AND RANDY A. BARTELS, J. Opt. Soc. A 32(11) 2156 (2015).
文献２：Jeffrey S. Sanders, Ronald G. Driggers, Carl E. Halford, and Steven T. Griffin, Opt. Eng. 30(11), 1720-1724 (1991).
【0105】
干渉光の生成は、例えば図１に示される第１実施形態の第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４の代わりにそれぞれ図１４の変調ディスク１０１を用いた構成を用い、一方の変調ディスク１０１から生成される周波数シフト量が大きい回折光部分を第１回折光として、またもう一方の変調ディスク１０１から生成される周波数シフト量が小さい回折光部分を第２回折光として用い、それらを重ねればよい。もちろん、各変調ディスク１０１から得られる回折光の周波数が異なるように２枚の変調ディスク１０１のパターンが互いに異なっていてもよい。【0106】
［実施例］図１のレーザ顕微鏡システム１０と同様な構成を用いて試料Ｔを観察した。この観察では、レーザ顕微鏡システム１０は、第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４として１０２ＭＨｚ〜２０１ＭＨｚの駆動信号で動作可能な同じＡＯＤを用いた。また、第１ＡＯＤ２４は、周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして１０２ＭＨから２０１ＭＨｚまでの各駆動信号を重ね合わせた第１コム信号で駆動した。また、第２ＡＯＤ３４についても、周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして１０２ＭＨから２０１ＭＨｚまでの各駆動信号を重ね合わせた第２コム信号で駆動した。第１コム信号と第２コム信号は周波数成分間の位相の設定値として上に述べた数式に従ってクロストークがキャンセルされるように設定し、φａ＝φｂ＝０、φ＝３．３°とした。
【0107】
また、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に対する第１、第２レーザ光の入射角の正負を互いに逆にすることによって、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲が重ならないが、干渉光のビート周波数を低周波領域に下げるためにＡＯＦＳ３２で周波数を上げた第２レーザ光を第２ＡＯＤ３４に入射させた。このＡＯＦＳ３２は、周波数２００ＭＨｚのシフト信号で駆動することで、第２レーザ光の周波数シフト量を「＋２００ＭＨｚ」とした。第１回折光はその周波数が低いものから、第２回折光はその周波数が高いものから順番に組み合わせられるようにしてビート周波数が異なる１００本の干渉光を生成した。なお、第１、第２ＡＯＤ２４、３４は、動作帯域が１００〜２００ＭＨｚであるが、ＡＯＤの動作帯域は回折効率が最大値の−３ｄＢとなる周波数で規定されるため、動作帯域からわずかに外れた周波数で励起しても十分に動作する。【0108】
上記のように駆動される第１、第２ＡＯＤ２４、３４からの第１回折光、第２回折光から生成されて、対物レンズ５２から出力された複数の干渉光を測定して得られた周波数スペクトルを図１６に示す。周波数スペクトルから、ビート周波数が２ＭＨｚ間隔で４ＭＨｚから２０２ＭＨｚまでの１００本の干渉光が形成されていることが確認でき、２００ＭＨｚの帯域幅が得られることが分かった。また、上記周波数スペクトルをフーリエ変換したところ、図１７に示すような信号波形が得られた。この信号波形は、重ね合わせる第１回折光と第２回折光とが完全に重なったときの理想的な信号波形の約７０％の振幅であり、干渉光の生成効率が約７０％であることが分かった。【符号の説明】
【0110】
１０ レーザ顕微鏡システム１１ 干渉光生成部
１２ 干渉光照射部
１３ 光検出部
１４ 信号処理部
１９ ビームスプリッタ
２４，３４、９５ ＡＯＤ
３２、９１ ＡＯＦＳ
９７ ウォラストンプリズム
ＳＰ 照射スポット
Ｔ 試料
【要約】
多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法を提供する。レーザ光を分離して第１ＡＯＤ（２４）、第２ＡＯＤ（３４）にそれぞれ入射することによって偏向角と周波数シフトの大きさが互いに異なる複数の第１回折光及び第２回折光を生成する。ビームスプリッタ（１９）で第１回折光と第２回折光とを重ね合わせて、互いにビート周波数が異なる複数の干渉光を生成する。対物レンズ（５２）は、主走査方向に複数の干渉光の照射スポットをライン状に並べて形成し、試料（Ｔ）に干渉光を照射する。走査ミラー（４７ａ）の揺動で照射スポットを主走査方向と直交する副走査方向に移動する。各干渉光の照射で試料（Ｔ）から放出される蛍光を光検出部（１３）で検出する。