特許 6233929 化合物、これを用いた定量分析用標準物質およびデスモシン類の定量方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6233929

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】化合物、これを用いた定量分析用標準物質およびデスモシン類の定量方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20060101AFI20171113BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20171113BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20171113BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20171113BHJP

   C07D 213/55 20060101ALI20171113BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/62 V

   G01N30/88 E

   G01N27/62 X

   G01N30/72 C

   G01N30/86 J

   C07D213/55

【請求項の数】5

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-55337(P2014-55337)

(22)【出願日】2014年3月18日

(65)【公開番号】特開2015-178957(P2015-178957A)

(43)【公開日】2015年10月8日

【審査請求日】2017年2月21日

(73)【特許権者】

【識別番号】502350504

【氏名又は名称】学校法人上智学院

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】臼杵 豊展

【審査官】 佐藤 仁美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２１０５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２４９４９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２７３５８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１３０１８２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５３６０７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／６２、３０／００−３０／９６、

Ｈ０１Ｊ ４９／００−４９／４２、

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（Ｉ）に示される化合物。

【化12】

（上記一般式（Ｉ）中、Ｒ¹は、炭素数２以上６以下のアルキレン基であり、Ｒ²は炭素数１以上４以下のアルキレン基であり、Ｒ³は、炭素数２以上６以下のアルキレン基である。ここで、Ｒ¹がトリメチレン基であり、Ｒ²がジメチレン基であり、かつ、Ｒ³がテトラメチレン基であることはない。）

【請求項2】

請求項１に記載の化合物において、Ｒ²がジメチレン基であり、Ｒ³がテトラメチレン基である、化合物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の化合物において、当該化合物とデスモシンとの分子量差が−１４以上２８以下である、化合物。

【請求項4】

請求項１乃至３いずれか一項に記載の化合物を含む、定量分析用標準物質。

【請求項5】

測定対象の試料に請求項１乃至３いずれか一項に記載の化合物を添加するステップを含む、デスモシン類の定量方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、化合物、これを用いた定量分析用標準物質およびデスモシン類の定量方法に関する。

【背景技術】

【0002】

慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease：ＣＯＰＤ）は、気管支炎や肺気腫などの病気の総称である。世界保健機関（World Health Organization：ＷＨＯ）によると、現在死亡原因の第４位を占めており、２０２０年までに第３位に浮上すると警告している。ＣＯＰＤについては、そもそもの病態が極めて複雑で未知の部分が多く、根本的治療薬すら存在しない。今世紀、発展途上国での喫煙者の増加や産業発展による大気汚染により、世界規模でのＣＯＰＤ患者の急増が危惧されているため、迅速かつ簡便な検査法の確立が至上命題となっている。

【0003】

ＣＯＰＤ患者の痰・血液・尿を加水分解処理し、高速液体クロマトグラフ−質量分析計（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry：ＬＣ−ＭＳ）で分析すると、肺胞の伸縮を司る弾性繊維エラスチンの架橋アミノ酸であり下記式に示されるデスモシン（化合物１）およびその異性体であり下記式に示されるイソデスモシン（化合物２）が観測される。健常者と比べて、ＣＯＰＤ患者におけるそれらの存在量が異なることから、デスモシン類はＣＯＰＤのバイオマーカーとして有望視されている。

【0004】

【化1】

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Toyonobu Usuki他７名、「Total synthesis of COPD biomarker desmosine that crosslinks elastin」、Chem. Commun.、２０１２年、４８号、３２３３−３２３５ページ

【非特許文献2】Hiroto Yanuma他１名、「Total synthesis of the COPD biomarker desmosine via Sonogashira and Negishi cross-coupling reactions」、Tetrahedron Lett.、２０１２年、５３号、５９２０−５９２２ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、生体内に含まれるデスモシン類の絶対量が微量であるため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Liquid Chromatography−tandem Mass Spectrometry）等による厳密な定量分析のためには、内部標準物質の添加が必要となっている。このため、デスモシン類の標準物質として用いられる化合物が容易に合成できるとよい。デスモシンの全合成に関する技術として、非特許文献１および２に記載のものがある。

【0007】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、新規なデスモシン類似体を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明によれば、
下記一般式（Ｉ）に示される化合物が提供される。

【化2】

（上記一般式（Ｉ）中、Ｒ¹は、炭素数２以上６以下のアルキレン基であり、Ｒ²は炭素数１以上４以下のアルキレン基であり、Ｒ³は、炭素数２以上６以下のアルキレン基である。ここで、Ｒ¹がトリメチレン基であり、Ｒ²がジメチレン基であり、かつ、Ｒ³がテトラメチレン基であることはない。）

【0009】

また、本発明によれば、前記本発明における化合物を含む、定量分析用内部標準物質等の定量分析用標準物質が提供される。
また、本発明によれば、測定対象の試料に前記本発明における化合物を添加するステップを含む、デスモシン類の定量方法が提供される。
なお、本明細書において、デスモシンおよびイソデスモシンをあわせて「デスモシン類」とも呼ぶ。

【0010】

なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。

【0011】

たとえば、本発明によれば、前記本発明における化合物を内部標準物質等の標準物質として使用する定量分析方法が提供される。
また、本発明によれば、前記本発明における化合物を内部標準物質等の標準物質として使用するデスモシン類の分析または定量方法が提供される。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、新規なデスモシン類似体を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】desmosine-CH₂のLC-MS測定結果を示す図である。

【図2】desmosine-CH₂のLC-MS測定により得られた検量線を示す図である。

【図3】desmosine-CH₂のLC-MS/MS測定結果を示す図である。

【図4】desmosine-CH₂のLC-MS/MS測定結果を示す図である。

【図5】desmosine-CH₂のLC-MS/MS測定により得られた検量線を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明の実施形態を具体例に基づいて説明する。以下の実施形態に記載の複数の態様を組み合わせて用いることもできる。

【0015】

本実施形態における化合物は、デスモシンの類似化合物であって、下記一般式（Ｉ）に示される。

【0016】

【化3】

【0017】

（上記一般式（Ｉ）中、Ｒ¹は、炭素数２以上６以下のアルキレン基であり、Ｒ²は炭素数１以上４以下のアルキレン基であり、Ｒ³は、炭素数２以上６以下のアルキレン基である。ここで、Ｒ¹がトリメチレン基であり、Ｒ²がジメチレン基であり、かつ、Ｒ³がテトラメチレン基であることはない。）

【0018】

デスモシンは、一般式（Ｉ）において、Ｒ¹がトリメチレン基であり、Ｒ²がジメチレン基であり、かつ、Ｒ³がテトラメチレン基である化合物である。そして、本実施形態における化合物は、デスモシンの類似体であって、複素環に結合する一または二以上の側鎖のアルキル鎖長が、デスモシンと異なるものである。

【0019】

一般式（Ｉ）において、複素環の４位の炭素原子に結合する側鎖における炭素数が、具体的には当該側鎖におけるアルキレン鎖長がデスモシンと異なるとき、Ｒ¹は、炭素数２以上６以下のアルキレン基である。このとき、本実施形態における化合物とデスモシンとの分子量差を−１４以上４２以下の範囲で調整することができる。

【0020】

一般式（Ｉ）において、複素環の３位および５位の炭素原子に結合する側鎖における炭素数が、具体的には当該側鎖におけるアルキレン鎖長がデスモシンと異なるとき、２つのＲ²は、炭素数１以上４以下のアルキレン基である。このとき、本実施形態における化合物とデスモシンとの分子量差を−２８以上５６以下の範囲で調整することができる。

【0021】

また、一般式（Ｉ）において、複素環の１位の窒素原子に結合する側鎖における炭素数が、具体的には当該側鎖におけるアルキレン鎖長がデスモシンと異なるとき、Ｒ³は、炭素数２以上６以下のアルキレン基である。このとき、本実施形態における化合物とデスモシンとの分子量差を−２８以上２８以下の範囲で調整することができる。

【0022】

一般式（Ｉ）に示した化合物は、デスモシンの定量分析において標準物質として用いる観点から、デスモシンとの分子量差が−２８以上であり、好ましくは−１４以上である。同様の観点から、一般式（Ｉ）に示した化合物は、デスモシンとの分子量差が５６以下であり、好ましくは４２以下、さらに好ましくは２８以下である。これにより、たとえば一般式（Ｉ）に示した化合物をデスモシンと適度な質量差を有する質量分析用の標準物質として用いることができる。

【0023】

また、一般式（Ｉ）に示した化合物の安定性の観点からは、一般式（Ｉ）中、Ｒ³がテトラメチレン基であることが好ましい。また、化合物の安定性および分子量の制御性をさらに高める観点からは、Ｒ²がジメチレン基であり、Ｒ³がテトラメチレン基である構造とすることが好ましい。このとき、Ｒ¹は炭素数２または４以上６以下のアルキレン基である。

【0024】

次に、本実施形態における化合物の製造方法を説明する。本実施形態における化合物の製造方法に制限はないが、たとえば非特許文献１または２に記載の方法を用いることができる。さらに具体的には、以下のスキーム１に示す手順とすることができる。
なお、スキーム１においては、アミノ基の保護基をｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基とし、カルボキシル基の保護基をベンジル（Ｂｎ）基とする場合を例に挙げて説明するが、アミノ基およびカルボキシル基のそれぞれについて、保護基の有無、数および種類に制限はなく、適宜選択することができる。

【0025】

【化4】

【0026】

スキーム１中、一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において、Ｒ¹¹基は、単結合または炭素数１以上４以下のアルキレン基である。すなわち、Ｒ¹¹基のアルキレン鎖長は、一般式（Ｉ）におけるＲ¹基のアルキレン鎖長より２少ない。また、Ｘ¹はハロゲンである。
一般式（ＩＶ）中、Ｘ⁴およびＸ⁵は、それぞれ異なるハロゲンである。一般式（ＩＶ）に示した化合物として、たとえば３，５−ジブロモ−４−ヨードピリジンが挙げられる。
一般式（Ｖ）中、Ｒ²は一般式（Ｉ）におけるＲ²と同じであり、Ｘ²はハロゲンである。
また、式（ＶＩ）中、Ｒ³は一般式（Ｉ）におけるＲ³と同じであり、Ｘ³はハロゲンである。
なお、スキーム１において、Ｒ¹¹がメチレン基であり、Ｒ²がジメチレン基であり、かつ、Ｒ³がテトラメチレン基であることはない。

【0027】

スキーム１に示した手順では、まず、一般式（ＩＩ）に示した化合物を一般式（ＩＩＩ）に示した化合物に変換する。そして、薗頭クロスカップリングにより、一般式（ＩＶ）に示した化合物のピリジン環の４位に、一般式（ＩＩＩ）に示した化合物の−Ｃ≡Ｃ−Ｒ¹¹−Ｃ（ＮＨＢｏｃ）ＣＯ₂Ｂｎ基を導入する。
また、根岸クロスカップリングにより、ピリジン環の３位および５位に、一般式（Ｖ）に示した化合物の−Ｒ²−Ｃ（ＮＨＢｏｃ）ＣＯ₂Ｂｎ基を導入する。ここで、Ｒ²は一般式（Ｉ）におけるＲ²と同じであり、Ｘ²はハロゲンである。
なお、薗頭クロスカップリングによる反応と根岸クロスカップリングによる反応の順序に制限はない。

【0028】

さらに、ピリジン環の１位に、一般式（ＶＩ）に示した化合物の−Ｒ³−Ｃ（ＮＨＢｏｃ）ＣＯ₂Ｂｎ基を導入する。
その後、ピリジン環の４位の側鎖に含まれるエチニレン基の還元反応をおこない、炭素−炭素三重結合を一重結合とする。そして、各側鎖のアミノ基およびカルボキシル基を脱保護する。
以上の手順により、一般式（Ｉ）に示した化合物が得られる。
各手順における詳細な反応条件については、実施例の項において後述する。

【0029】

次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態における化合物は、デスモシン類との構造の類似性が高く、かつ、デスモシン類に対して分子量の絶対値を１４ｍ／ｚ以上シフトさせることができる。このため、デスモシン類の定量分析用標準物質として好適に用いられる。さらに具体的には、ＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法等の質量分析を含む方法によりデスモシン類を定量分析する際の内部標準物質として好適である。このとき、デスモシン類の定量方法は、たとえば測定対象の試料に本実施形態における化合物を添加するステップを含む。また、本実施形態における化合物は、たとえばＣＯＰＤバイオマーカー分析における内部標準物質として用いることができる。
また、本実施形態の化合物は、製造工程中に同位体標識工程を必要としないため、デスモシン類の同位体標識化合物と比べて合成が容易である。このため、本実施形態の化合物は、大量生産に好適である。
また、質量分析において異なる質量数であっても同一の構造の化合物が同時に存在すると、お互いに干渉し合い、厳密性が損なわれる場合がある。これに対し、本実施形態の化合物を質量分析の内部標準物質として用いることにより、たとえばデスモシン類との干渉を抑制することも可能となるため、より厳密な定量分析に寄与しうる。

【実施例】

【0030】

（実施例１）
本実施例では、スキーム２に示す手順にてデスモシン−ＣＨ₂（化合物１８）の合成をおこなった。また、デスモシン−ＣＨ₂（化合物１８）およびこれに関連する化合物の炭素原子の番号付けは以下の通りである。

【0031】

【化5】

【0032】

【化6】

【0033】

本実施例にて用いた試薬、分析装置等は以下の通りである。
（試薬）
非水系の反応は、すべて、窒素雰囲気下、マグネチックスターラーを用いておこない、特に記載のない場合には蒸留した新鮮な溶媒を用いた。Diisopropylethylamine (iPr₂NEt) および trimethylsilyl chloride (TMSCl) は蒸留により乾燥した。Dimethylformamide (DMF) はMgSO₄ により蒸留し、活性化したモレキュラーシーブ上で保存した。脱水したtetrahydrofuran (THF)、methanol (MeOH) および ethanol (EtOH) は関東化学社より購入し、活性化したモレキュラーシーブ上で保存した。すべての試薬を製造業者より入手し、特に記載のない場合にはさらに精製することなく用いた。

【0034】

（分析）
薄層クロマトグラフィー（Thin Layer Chromatography：ＴＬＣ）分析にはメルク社製のSilica gel 60 F₂₅₄プレートを用いた。
カラムクロマトグラフィーには、酸性 Silica gel 60 (spherical, 40-50 μm) または中性Silica gel 60N (spherical, 40-50 μm) を用いた（いずれも関東化学社製）。
逆相シリカゲルクロマトグラフィーは、Wako gel 100 C₁₈（和光純薬工業社製）を用いておこなった。
融点の測定には、ATM-01装置（アズワン社製）を用いた。
旋光度の測定には、JASCO P-2200 デジタル旋光計およびナトリウムランプ (λ= 589 nm) Ｄ線を用いた。測定結果を「[α]_D^T (c g/100 mL, solvent)」と表記する。
ＵＶスペクトル測定にはJASCO V-560 UV/VIS分光光度計を用いた。
赤外線（ＩＲ）スペクトル測定には、JASCO FT-IR 4100分光計を用いた。測定結果を波数(cm^-1) で示す。
¹H および ¹³C NMRスペクトル測定には、JEOL JNM-EXC 300 スペクトロメータ (300 MHz) または JEOL JNM-ECA 500 スペクトロメータ (500 MHz) を用いた。
¹H NMRデータは、以下のように示す：化学シフト (δ, ppm)、積分値、多重度 (s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; m, multiplet), カップリング定数 (J) in Hz、帰属。
¹³C NMR データは、化学シフト (δ, ppm)により示す。
EI-MS スペクトル測定は、Shimadzu GCMS QP-5050 装置またはJEOL JMS-700 装置によりおこなった。FAB-MS スペクトル測定にもJEOL JMS-700を用いた。ESI-MSスペクトル測定は、JEOL JMS-T100LC 装置またはThermo Exactive スペクトロメータを用いた。

【0035】

Benzyl 2-(S)-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-hex-5-ynoate（化合物２０）の合成

【0036】

【化7】

【0037】

CuCN (322.5 mg, 3.58 mmol, 1.0 eq)およびLiCl (309.3 mg, 7.16 mmol, 2.0 eq) を１つのフラスコに合わせ入れ、減圧下で150℃にて２時間加熱乾燥した。CuCNおよびLiClの乾燥中に、ヒートガンを用いて亜鉛粉末(1.45 g, 22.2 mmol, 6.2 eq)を減圧下で５分間加熱乾燥した。そして、亜鉛粉末の入ったフラスコにDMF (1.5 mL)およびTMSCl (0.14 mL, 1.1 mmol, 5 mol% to Zn)を室温（２５℃、以下同じ。）で加えた。室温にて３０分撹拌後の懸濁液に、2-(S)-2-(benzyloxycarbonylamino)-4-iodobutyric acid benzyl ester （化合物１４）(1.5 g, 3.58 mmol, 1.0 eq)のDMF溶液(1.0 mL, washed with 0.5 mL x 2)を加えた。化合物１４にＺｎが導入されたことをＴＬＣにて確認した。その後、別のフラスコ中で−５℃に冷却しておいたCuCNおよびLiClのDMF (7.5 mL)溶液を、Ｚｎが導入された化合物１４の溶液に３０分かけて添加した。
−５℃にて１５分撹拌後、−２０℃に冷却し、化合物１４の反応混合物に、新たに調製した(2-bromoethynyl)trimethylsilane (1.0 mL, 7.16 mmol, 2.0 eq)を５分かけて滴下した。その後、混合液を徐々に室温まで温め、１７時間撹拌を続けた。得られた混合物をEtOAcで希釈し、飽和NH₄Cl溶液でクエンチした。続いて、EtOAcにより水層を抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/EtOAc = 20/1→10/1)により精製し、化合物19を非分離副生物とともに得た(870.4 mg)。
得られた粗生成物のTHF (30.0 mL)およびEtOH (654μL)溶液を0 ℃に冷却し、そこにtetrabutylammonium fluoride (TBAF) (607μL, 1.0 M solution in THF)を加えた。0 ℃にて1.5時間撹拌した後、反応混合物をEtOAcにて希釈し、飽和NH₄Cl溶液でクエンチした。そして、水層をEtOAcにて抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/EtOAc = 15/1)により精製し、化合物20を白色固体として得た(496.4 mg, 1.18 mmol, 44% (2 steps)); R_f 0.29 (hexane/EtOAc = 8/1); [α]_D²⁰ +5.7 (c 0.1, CHCl₃); mp 61-62 ℃; IR (ATR, cm^-1) 3400, 3326, 1755, 1683, 1514, 1451, 1368, 1295, 1254, 1213, 1160, 1052, 959, 755, 695, 638; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ7.37-7.33 (5H, m, Bn), 5.22-5.17 (2H, m, Bn), 5.13 (1H, s, 17NH), 4.43 (1H, m, H17), 2.29-2.23 (2H, m, H15), 2.13-2.04 (1H, m, H16), 1.96 (1H, t, J = 2.84 Hz, H13), 1.92-1.79 (1H, m, H16), 1.43 (9H, s, t-Bu); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ171.8, 155.0, 135.0, 128.3, 128.2, 128.0, 82.5, 79.7, 69.0, 66.9, 52.6, 31.1, 28.0, 14.5; FAB-MS (m/z) calcd for C₁₈H₂₄NO₄ [M+H]⁺ 318.17, found 318.25。

【0038】

(S)-Benzyl 2-(tert-butoxycarbonylamino)-6-(3,5-dibromo-pyridin-4-yl)-hex-5-ynoate (化合物21)の合成

【0039】

【化8】

【0040】

3,5-dibromo-4-iodopyridine (化合物１２：249.1 mg, 0.69 mmol, 1.0 eq)、2-tert-butoxycarbonylamino-hex-5-ynoic acid benzyl ester (化合物２０：327.1 mg, 1.03 mmol, 1.5 eq)、tris(dibenzylideneacetone)dipalladium (0) (Pd₂dba₃) (64.2 mg, 70.0 μmol, 10 mol%)、P(2-furyl)₃ (64.9 mg, 0.28 mmol, 40 mol%)およびCuI (55.7 mg, 0.28 mmol, 40 mol%)のDMF (34.5 mL)溶液を、freeze/pump/thawサイクルにより脱気し、得られた溶液にiPr₂NEt (6.9 mL)を加えた。４０℃にて１７時間撹拌後、反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和NH₄Cl溶液でクエンチした。続いて、EtOAcにより水層を抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮した。これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/ethyl acetate = 5/1)により精製し、化合物２１を白色固体として得た(276.3 mg, 0.50 mmol, 73%)； R_f 0.27 (hexane/EtOAc = 5/1); [α]_D²⁰ +9.9 (c 0.1, CHCl₃); mp 114-115 ℃; IR (ATR, cm^-1) 3348, 1753, 1682, 1518, 1448, 1360, 1303, 1215, 1166, 1055, 959, 752, 694, 606; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.61 (2H, s, H2/6), 7.37-7.36 (5H, m, Bn), 5.24-5.18 (2H, m, Bn), 5.14 (1H, m, 17NH), 4.52 (1H, m, H17), 2.67-2.61 (2H, m, H15), 2.32-2.21 (1H, m, H16), 2.08-1.96 (1H, m, H16), 1.42 (9H, s, t-Bu); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ172.0, 155.5, 149.7, 135.3, 134.7, 128.8, 128.6, 128.4, 123.5, 104.3, 80.2, 78.1, 67.4, 53.1, 31.3, 28.4, 16.7; ESI-HRMS (m/z) calcd for C₂₃H₂₄Br₂N₂NaO₄ [M+Na]⁺ 574.9980, found 574.9980。

【0041】

((2S,2'S)-benzyl 4,4'-(4-((S)-6-(benzyloxy)-5-(tert-butoxycarbonyl amino)-6-oxopent-1-ynyl)pyridine-3,5-diyl)bis(2-(tert-butoxycarbonylamino)butanoate))(化合物22)の合成

【0042】

【化9】

【0043】

亜鉛末(198 mg, 3.0 mmol) を窒素パージした1.5 mLマイクロチューブに入れた。これに乾燥DMF (150 μL) およびTMSCl (60.0 μL, 0.47 mmol) を加え、得られた混合物を室温にて１５分間強く撹拌した。撹拌を停止し、マイクロシリンジを用いて溶液を除去した。残った固体を減圧下で熱空気銃を用いて乾燥させた。得られた活性亜鉛を室温に冷却し、これに2-(S)-2-(benzyloxycarbonylamino)-4-iodobutyric acid tert-butyl ester (化合物１４：217.5 mg, 0.5 mmol, 5.0 eq)の乾燥DMF (150 μL and rinsed with 100 μL DMF) 溶液を加えた。反応混合物を室温にて１時間撹拌した。ＴＬＣ分析(hexane/ethyl acetate = 5/1) にて出発物質が残存していないことを確認した後、撹拌を停止し、遠心分離機を用いて亜鉛末を沈澱させた。マイクロシリンジおよび200 μL のDMFにより亜鉛末中の溶液を取り出し、Pd-pyridine-enhanced precatalyst preparation stabilization and initiation (PEPPSI（商標）)-IPr (13.2 mg, 20 mol%)および化合物21 (55.2 mg, 0.1 mmol, 1.0 eq) の入った10 mLのフラスコに加えた。６０℃にて１．５時間撹拌を続け、反応混合物をEtOAcで希釈し、飽和NH₄Cl溶液でクエンチした。EtOAcにより水層を抽出した。有機層をあわせて食塩水で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥させ、さらに真空中で濃縮して黄色油状の粗生成物を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(hexane/ethyl acetate = 2/1→1/1)により精製し、化合物２２の精製物を黄色油状物質として得た (77.8 mg, 0.83 mmol, 83%) ；R_f 0.42 (hexane/EtOAc = 1/1); [α]_D²⁰ +23.5 (c 0.1, CHCl₃); IR (ATR, cm^-1) 3783, 3465, 3084, 2976, 2361, 1713, 1514, 1452, 1367, 1254, 1168, 1053, 859, 748, 697; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.18 (2H, s, H2/6), 7.33-7.30 (15H, m, Bn), 5.38 (1H, s, 17NH), 5.32-5.30 (2H, m, 21NH/21’NH), 5.19-5.09 (6H, m, Bn), 4.43 (1H, m, H17), 4.38-4.36 (3H, m, H11/21/21’), 2.77-2.68 (4H, m, H19/19’), 2.58-2.54 (2H, m, H16), 2.20-1.84 (6H, m, H16/20/20’), 1.43-1.40 (27H, m, t-Bu); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ172.3, 172.1, 155.5, 149.4, 147.7, 135.4, 135.3, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 80.0, 67.3, 67.1, 53.5, 53.0, 33.0, 28.4, 28.1, 16.5; ESI-MS (m/z) calcd for C₅₅H₆₈N₄NaO₁₂ [M+Na]⁺ 999.47, found 979.44.; ESI-HRMS (m/z) calcd for C₅₅H₆₈N₄NaO₁₂ [M+Na]⁺ 999.4731, found 999.4744。

【0044】

(3,5-bis((S)-4-(Benzyloxy)-3-(tert-butoxycarbonylamino)-4-oxobutyl)-4-((S)-6-(benzyloxy)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-6-oxopent-1-ynyl)-1-((S)-6-(benzyloxy)-5-(tert-butoxycarbonylamino)-6-oxohexyl)pyridinium iodide) (化合物26) の合成

【0045】

【化10】

【0046】

化合物２２(13.3 mg, 13.6 μmol, 1.0 eq)およびbenzyl 2-(S)-((tert-butoxycarbonyl)amino)-6-iodohexanoate (化合物２５：18.3 mg, 40.8 μmol, 3.0 eq) をCH₃NO₂ (1.0 mL) 中の混合物とし、６０℃で２３時間加熱した。その後、８０℃に昇温して２５時間反応させた。反応混合物を真空中で濃縮した。中性シリカゲルクロマトグラフィー (Hexane/Ethyl acetate = 1/1→CH₂Cl₂/MeOH = 10/1) により精製し、化合物２６(15.9 mg, 11.2 μmol, 82%) を黄色油状物質として得た； R_f 0.32 (CH₂Cl₂/MeOH = 10/1); [α]_D²⁵ +10.9 (c 0.1, CHCl₃); IR (ATR, cm^-1) 3862, 3740, 3360, 2976, 2363, 2224, 1711, 1628, 1513, 1370, 1252, 1167, 1053, 861, 749, 698; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.95 (2H, s, H2/6), 7.34-7.31 (20H, m, Bn), 5.62-5.59 (2H, m, 21NH/21’NH), 5.33 (1H, s, 17NH), 5.24 (1H, s, 11NH), 5.21-5.11 (8H, m, Bn), 4.73-4.66 (1H, m, H7), 4.57-4.53 (1H, m, H7), 4.40-4.39 (1H, m, H17), 2.97 (4H, t, J = 7.35 Hz, H19/19’), 2.64 (2H, t, J = 6.15 Hz, H15), 2.27-1.94 (8H, m, H8/16/20/20’), 1.91-1.65 (4H, m, H9/10), 1.42-1.39 (36H, m, t-Bu); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ172.2, 155.7, 142.9, 135.4, 135.3, 135.2, 128.7, 128.5, 80.2, 67.5, 67.4, 67.2, 53.1, 29.7, 28.4, 17.1; ESI-HRMS (m/z) calcd for C₇₃H₉₄N₅O₁₆ [M]⁺ 1296.6673, found 1296.6696。

【0047】

Desmosine-CH₂ (化合物18) の合成

【0048】

【化11】

【0049】

化合物２６(33.3 mg, 23.4 μmol, 1.0 eq) のMeOH (1.0 mL) 溶液を10% Pd/C (125.6 mg, 116.9 μmol, 5.0 eq) で処理し、バルーン圧にて水素添加した。４０℃にて４日間撹拌後、中性シリカゲル上のセライトパッドで濾過し、ＭｅＯＨで溶出することにより不溶物を分離した。濾液を濃縮して得られた粗生成物(19.0 mg) にMeOH (0.6 mL) を加え、10% Pd/C (71.6 mg) で処理し、バルーン圧、４０℃にて水素添加した。２日間撹拌後、中性シリカゲル上のセライトパッドで濾過し、ＭｅＯＨで溶出することにより不溶物を分離し、濾液を真空中で濃縮した。得られた粗生成物 (13.6 mg) をさらに精製することなく次の反応に用いた。
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および蒸留水の混合物 (2.9 mL, TFA/water = 95/5) を濾液に加え、室温で３時間撹拌した。その後、溶媒を真空中で除去した。Ｃ１８シリカゲルカラムクロマトグラフィー (0.1% TFA in distilled water) により精製し、化合物１８ (6.7 mg, 10.3 μmol, 44% (2 steps)) を黄色油状物質として得た； R_f 0.22 [MeOH (0.1% TFA)/H₂O (0.1% TFA)]; [α]_D²⁰ +16.4 (c 0.1, H₂O); ¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ8.55 (2H, s, H2/6),4.1 (2H, t, J = 7.6 Hz, H7), 4.10 (2H, t, J = 6.1 Hz,H21/21’), 5.14 (1H, m, NH), 4.04-3.97 (2H, m, H11/17), 3.10-3.04 and 2.97-2.89 (4H, m, H19/19’), 2.97-2.89 (2H, m, H13), 2.26-2.21 (4H, m, H20/20’), 2.07-1.94 (8H, m, H8/10/15/16), 1.68-1.55 (4H, m, H9/14); ¹³C NMR (75 MHz, D₂O) δ173.2, 173.1, 172.8 (C12/18/22/22’), 160.1 (C4), 142.3 (C2/6), 140.3 (C3/5), 61.2 (C7), 53.7, 53.6 (C11/17/21/21’), 31.0, 30.5, 30.1, 29.8 (C8/10/15/20/20’), 29.1 (C13), 26.1, 25.2 (C9/14), 21.6 (C16); ESI-HRMS (m/z) calcd for C₂₅H₄₂N₄O₈ [M]⁺ 540.3033, found 540.3031。

【0050】

（実施例２）
本例では、実施例１で得られたdesmosine-CH₂（「des-CH₂」とも呼ぶ。）のLC-MSによる分析をおこなった。
desmosine-CH₂の溶液（3.4 mg/ml in 1mM HFBA、3 mM NH₄Ac aq）を希釈してLC-MS用のサンプル（100 μg/ml）を調製し、以下の条件にて分析をおこなった。
・LC-MS（Waters社製）
・カラム温度：30 ℃
・オートサンプラー内温度：18 ℃
・インジェクション量：10 μL
・流速：0.2 mL/min
・移動相溶媒：A…7 mM heptafluorobutyric acid (HFBA) および 5 mM NH₄Ac aq
B…7 mM HFBA および 5 mM NH₄Ac in 80% Acetonitrile
・溶媒比率 (A:B)：時間（分） A B
0-6 100 0
6-7 95 5
7-8 10 90
・MS分析時間：1-8 min
・Cone voltage：45 V

【0051】

分析の結果、保持時間は6.1 minでありピークが分析時間内に下がりきることが確認された。
また、すべての化合物のMSを検出するfull scan modeにてdesmosine-CH₂溶液を分析した結果、desmosine-CH₂は540.5 m/zで検出された。そこで、MSで特定の質量の化合物のみを選択して検出するSelected Ion Monioring (SIM)では540.5 m/zを追跡することとした。これによりその他の質量の化合物は検出されなくなるため、より低濃度のサンプルであってもdesmosine-CH₂を検出することができるようになる。
図１は、SIM modeおよびFull scan modeでのLC-MS測定結果を示す図である。

【0052】

検量線の作成
様々な濃度のサンプル（200, 1000, 2000, 5000, 10000, 15000, 20000 ng/mL）を調製し、SIMモードにて測定をおこなった。各サンプルについて測定されたピーク面積値から検量線を作成したところ、以下の式が得られた。
y = 4.5928x - 1631.2 (R² = 0.9978)
上記式中、ｘはdesmosine-CH₂の濃度であり、ｙはピーク面積値である。
測定結果を表１および図２に示す。

【0053】

【表1】

【0054】

Desmosine-CH₂の定量分析
検量線の信頼性を確認するため、QC (Quality Control)サンプルを用いて定量を行った。
QCサンプルとして既知濃度のdesmosine-CH₂溶液（entry 1：2600 ng/mL、entry 2：16700 ng/mL）を新たに調製し、これをLC-MSによって分析した。そして得られたピーク面積値を式のyに代入することで濃度xを算出した。結果を表２に示す。

【0055】

【表2】

【0056】

理論値との誤差は±15%までが許容範囲であるとされている。表２より、entry 1および2における誤差はそれぞれ-10.2％、-4.0％であり、ともに許容範囲内であった。よって、得られた検量線は定量分析に用いることができる正確性を有することがわかる。

【0057】

さらに、SIMモードでの分析において、移動相の比率、溶媒比を変える速度(curve)、cone voltageといった条件を1つずつ変えることで、さらなる条件の最適化をおこなった。その結果、desmosine-CH₂のLC-MS分析の観点からは、
・溶媒比率（A:B）：85:15
・Curve：6
・Cone voltage：45 V
とすることが好ましい条件であった。

【0058】

（実施例３）
本例では、実施例１で得られたdesmosine-CH₂のLC-MS/MSによる分析をおこなった。
Full Scan Modeにおけるフラグメンテーションの確認
LC-MS/MS分析では、SIMモードで選択した分子を開裂させることで得られるフラグメンテーションを選択的に検出できる(Selected Reaction Monitoring = SRM )。そのため、SIMモードよりもさらに高感度となり、より低濃度の化合物を分析することが可能となる。
そこでまずはdesmosine-CH₂のLC-MS/MS分析をおこなうために、すべての化合物を検出するfull scanにおいて測定し、化合物を開裂させるためのcollision energyを調節することでdesmosine-CH₂から得られるフラグメンテーションを確認した。図３は、desmosine-CH₂のLC-MS/MS測定で得られたフラグメンテーションを示す図である。
比較的高濃度である10000 ng/mLのdesmosine-CH₂の溶液を、シリンジから一定の流速で直接MS/MSにインジェクトした。その後、測定画面を確認しながらcollision energyを調節し、生成するフラグメンテーションを確認したところ、40 Vのcollision energyにおいて495.14 m/zのピークが最も強く検出された。そこでdesmosine-CH₂をSRMモードで分析する際には、collision energyを40 Vとし、追跡するフラグメンテーションを495.14 m/zとした。

【0059】

分析条件の最適化、SRM モードにおける感度確認
LC-MS/MSにおけるdesmosine-CH₂の分析条件は以下の通りである。
・LC-MS/MS（Thermo社製）
HPLC: FINNIGAN Surveyor
MS/MS: FINNIGAN Quantum discovery
・カラム：N-dc18-2x150 mm
・インジェクション量：10 μL
・流速：0.2 mL/min
・移動相溶媒：A…7 mM HFBA および 5 mM NH₄Ac aq
B…7 mM HFBA および 5 mM NH₄Ac in 80% Acetonitrile
・溶媒比率（A:B）：時間（分） A B
0-10 100 0
10-11 75 25
11-14 10 90
14-17 10 90
17-30 100 0

【0060】

上記の条件において、100 ng/mlのdesmosine-CH₂溶液のSRMモードによる分析について感度確認をおこなった結果、desmosine-CH₂のピークが明確に確認された。測定結果を図４に示す。また、SRMモードではSIMモードよりもさらに低濃度のサンプルについても分析できることがわかった。

【0061】

検量線の作成
各濃度のサンプル(2, 10, 20, 50, 100, 150, 200 ng/ml)をSRMモードにて分析し、ピーク面積値から検量線を作成したところ、以下の式が得られた。
y = 415.17x - 5379.2 (R² = 0.967)
上記式中、ｘはdesmosine-CH₂の濃度であり、ｙはピーク面積値である。
測定結果を表３および図５に示す。

【0062】

【表3】

【0063】

本明細書において、以下の略語を用いた。
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
Ｐｒ：プロピル
Ｂｕ：ブチル
Ａｃ：アセチル
ｒｔ：室温
ｍｉｎ：分
ｈ：時間
ｄ：日

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】