6234003 ＶＥＧＦ産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6234003

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/886 20060101AFI20171113BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171113BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/886

   A61P43/00 111

【請求項の数】3

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2012-5150(P2012-5150)

(22)【出願日】2012年1月13日

(65)【公開番号】特開2013-144650(P2013-144650A)

(43)【公開日】2013年7月25日

【審査請求日】2014年12月25日

【審判番号】不服2016-11941(P2016-11941/J1)

【審判請求日】2016年8月8日

(73)【特許権者】

【識別番号】000186588

【氏名又は名称】小林製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】小西 明伸

【合議体】

【審判長】 村上 騎見高

【審判官】 穴吹 智子

【審判官】 前田 佳与子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−３５４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−２４０８２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−６３０５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．１，ｐ１７〜２３（１９９６年）

【文献】 日薬理誌，Ｖｏｌ．１１９，ｐ１６７〜１７４（２００２年）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K36/00-36/9068

CA

BIOSIS

MEDLINE

EMBASE

JSTPLUS

JMEDPLUS

JST7580

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アロエエキスを有効成分とする、毛乳頭細胞のＶＥＧＦ産生促進剤。

【請求項2】

前記アロエエキスが、アロエ植物体の水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種による抽出物である、請求項１に記載のＶＥＧＦ産生促進剤。

【請求項3】

前記アロエ植物体が、キダチアロエ及び／又はアロエベラである、請求項１又は２のいずれかに記載のＶＥＧＦ産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アロエエキスを有効成分とするＶＥＧＦ産生促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、vascular endothelial growth factor）は、下垂体星状濾胞細胞の培養液より単離された、血管内皮細胞に特異的に作用する増殖因子である。そして、ＶＥＧＦの産生細胞として、下垂体星状濾胞細胞はもとより、マクロファージ、平滑筋細胞、胚線維芽細胞等の多様な正常細胞、並びに腫瘍細胞の報告がある。

【0003】

さて、毛は、毛包角化細胞の増殖、分化（角化）により形成される。そして、毛包角化細胞の増殖、分化及びアポトーシスを制御し、毛周期調節の中心的な役割を担っているのが、毛乳頭（毛乳頭細胞）である。この毛乳頭には、毛細血管が入りこみ、毛細血管は栄養供給等の役割を果している。毛乳頭細胞についての報告は多い。例えば、毛乳頭細胞は、成長期に毛乳頭内の血管内皮細胞、つまり毛細血管を構成する細胞を増殖することが報告されている（非特許文献１）。また、アスペルギルス菌から見つかった血管新生阻害剤（TNP-470）をマウスの腹腔に注射した場合、体毛の毛周期が遅れ、成長期が始まらないことが報告されている（非特許文献２）。

【0004】

一方、毛包では外毛根鞘細胞と毛乳頭細胞とがＶＥＧＦを発現することが報告されている（非特許文献３及び４）。また、ＶＥＧＦの動きを阻害する特異抗体をマウス腹腔に注射すると、成長期が遅れるとともに毛包のサイズが小さくなり、毛包の発達や再生に血管新生が重要であることが報告されている（非特許文献５）。反対に、外毛根鞘でのＶＥＧＦ合成量を増加させた場合、毛包のサイズが増大するとともに、作られる毛の直径も太くなることが報告されている。

【0005】

また、アロエ抽出物を有効成分とする毛乳頭活性化剤が報告されている（特許文献１及び２）。しかしながら、特許文献１では、育毛について、毛乳頭での、毛周期における成長期を延長させる作用及び休止期から成長期への移行を促進する作用を見たものであり、育毛におけるＶＥＧＦ産生促進を評価したものではない。

【0006】

以上のことから、脱毛や薄毛といった症状の予防・改善のために、優れたＶＥＧＦ産生促進剤の開発が期待されている。また、ＶＥＧＦによる効果を高めることで、血管新生が促され、毛細血管の生成も高められるので、育毛・発毛効果、創傷治癒効果、肌の血色改善効果、冷え改善効果、腸内の吸収促進効果等が期待できる。そして、育毛剤に対するニーズは、ストレスの増加、女性の社会進出等に伴い増加傾向にある。

【0007】

また、脱毛の症例には、円形脱毛症等の成長期性（棍棒毛性）脱毛症、男性型脱毛症等の休止期性（萎縮毛性）脱毛症がある。脱毛の悩みを抱える対象者が、育毛剤を適切に用いることで、薄毛・抜け毛の進行を遅らせ、現状を維持できることから、対象者の生活の質（QOL）を向上させることができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Am.J.Anat.,147、243-253（1976）

【非特許文献2】J.Invest.Dermatol.,114、909-916（2000）

【非特許文献3】J.Invest.Dermatol.,106、17-23（1996）

【非特許文献4】Arch.Dermatol.Res.,209,661-668（1998）

【非特許文献5】J.Clin.Invest.,107、409-417（2001）

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開平１１−２４０８２３号公報

【特許文献2】特開平１０−２２９９７８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、ＶＥＧＦ産生促進剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、鋭意検討した結果、アロエから抽出されたエキスが、ＶＥＧＦ産生促進効果をもたらすことを見出した。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．アロエエキスを有効成分とするＶＥＧＦ産生促進剤。
項２．前記アロエエキスが、アロエ植物体の水、エタノール及び１，３−ブチレングリコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種の抽出溶媒で抽出されたものである、前記項１に記載のＶＥＧＦ産生促進剤。
項３．前記アロエエキスが、キダチアロエ及び／又はアロエベラから抽出されたものである、前記項１又は２のいずれかに記載のＶＥＧＦ産生促進剤。
項４．アロエエキスを有効成分とするＶＥＧＦ遺伝子発現量増加剤。

【0013】

以下、本発明について説明する。

【0014】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、有効成分としてアロエエキスを含有する。

【0015】

（１）アロエエキス
アロエエキスを調製するためのアロエは、特に限定されないが、医薬部外品に使用が認められているという理由から、キダチアロエ（学名：Aloe arborescens）、アロエベラ（学名：Aloe vera）が好ましい。

【0016】

本発明の有効成分であるアロエエキスの原料には、アロエ植物の全体をそのまま使用しても良い。またアロエの葉の外皮を使用しても良く、葉内部のゼリー質を使用しても良い。調製が容易という理由から、アロエ植物の全体を使用して、アロエエキスを調製することが好ましい。

【0017】

抽出するアロエは、植物体（例えば、葉、茎、根等）の生の状態のもの（未乾燥物）、乾燥させたもの（乾燥物）、又は凍結したもの（凍結物）を用いることができる。また、アロエ植物体の未乾燥物、乾燥物又は凍結物を適切な大きさに細砕し粉末化したものを用いることもできる。

【0018】

本発明に関するアロエの抽出物（エキス）を作製する方法としては、抽出工程及び分離工程を組み合わせる方法、上記方法に更に分画工程を組み合わせる方法等があげられるが、これらに限定されない。

【0019】

抽出工程は、アロエ植物体から抽出溶媒を用いて、抽出物として必要な成分を取り出す工程であり、抽出方法や抽出条件は特に限定されない。

【0020】

抽出溶媒の種類は特に限定されないが、水、有機溶媒及びこれらを混合した混合溶媒があげられる。上記の水としては、冷水、常温水、温水、熱水及び水蒸気等の全ての温度における水の状態があげられ、また、殺菌処理、イオン交換処理、浸透圧調整又は緩衝化されていてもよい。有機溶媒としては、親水性有機溶媒が好ましく、例えば、炭素数１〜５の１価アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール等）、炭素数２〜５の多価アルコール（グリセリン、イソプロピレングリコール、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等）、エステル（酢酸メチル等）、ケトン（アセトン等）等を用いることができる。これらの親水性有機溶媒は、１種のみを用いても、或いは２種以上を併用してもよい。本発明では、安全性及び有効成分の抽出効率の点から、水、エタノール、１，３−ブチレングリコールよりなる群から選ばれる少なくとも１種の抽出溶媒を用いることが好ましい。

【0021】

抽出溶媒として水及び１，３−ブチレングリコールの混合液を用いる場合は、混合液中の１，３−ブチレングリコールの含有率は、０．１〜７０重量％程度が好ましく、５〜６０重量％程度がより好ましく、１０〜５０重量％程度が更に好ましい。抽出溶媒として、水及びエタノールの混合液を用いる場合は、混合液中のエタノールの含有率は、０．１〜７０重量％程度が好ましく、５〜６０重量％程度がより好ましく、１０〜５０重量％程度が更に好ましい。

【0022】

抽出手法としては、浸漬抽出、攪拌抽出、還流抽出、振とう抽出及び超音波抽出があげられ、抽出条件としては、室温抽出、加熱抽出（加温抽出ともいう）、加圧抽出、超臨界抽出等があげられるが、好ましくは、室温抽出である。抽出時間は特に限定されない。また、ｐＨ調整してもよい。上記抽出操作は１回でもよく、抽出操作を行った後に得られる抽出残渣を再度抽出することを複数回数繰り返すことにより複数回行ってもよい。更に、抽出工程の前後に、必要に応じて濾過等の処理を行ってもよい。

【0023】

分離工程は、上記で得られた抽出物から、抽出残渣である不溶物と抽出物を分離する方法であり、例えば、遠心分離、フィルタプレス、濾過（加圧、常圧）、クロマトグラフィー等の吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離等による方法があげられる。抽出液から分取された抽出物はそのまま用いてもよく、更に分画等により精製してもよい。

【0024】

分画工程は、上記で得られた分離物から必要な成分を分画して精製及び濃縮する方法である。分画工程に用いられる方法としては、担体として陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、シリカゲル、芳香族化合物を吸着するポリスチレン系の樹脂等を用いるクロマトグラフィー、透析、分子ふるい、減圧濃縮、凍結乾燥等の方法があげられるがこれらに限定されない。更に、本工程後に、必要に応じて遠心分離等により上清を回収する工程を行ってもよい。

【0025】

なお、上記各工程の前後に、必要に応じて濾過等の処理を行ってもよい。濾過には、ガーゼや濾過フィルター、市販の濾過器等を用いることができる。また、必要に応じて、滅菌処理等を施すことができる。

【0026】

上記方法により、本発明の抽出物を得ることができる。得られた抽出物は、そのままの液状形態を有していてもよいが、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等の乾燥工程により粉末化することもできる。

【0027】

（２）ＶＥＧＦ産生促進剤
本発明のＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子、vascular endothelial growth factor）産生促進剤は、前記アロエエキスを有効成分として含有するものである。

【0028】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤におけるアロエエキスの配合割合は、本発明の効果が発揮されることを限度として制限されないが、例えば、ＶＥＧＦ産生促進剤中に、アロエエキスが１００重量％含まれていてもよく、好ましくは１０〜９０重量％程度、より好ましくは２０〜８０重量％程度が挙げられる。

【0029】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤（医薬品の形態を含む）は、その形態は特に制限されず、非経口投与形態及び経口投与形態のいずれもが含まれる。

【0030】

非経口投与形態としては、注射剤、点滴剤、経皮吸収剤等が挙げられる。経皮吸収剤とする場合、軟膏剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤、噴霧剤、溶液剤、懸濁液剤等の外用製剤とすることができる。また、注射剤とする場合、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等の方法が選択することができる。

【0031】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を外用製剤として使用する場合、基剤として、低級アルコール及び水を使用することができる。低級アルコールとしては、メチルアルコール；エチルアルコール；ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール；１，３−ブチルアルコール、sec-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール；ベンジルアルコールなどの炭素数１〜７のアルコールを例示することができる。

【0032】

外用製剤として使用する場合、肌への刺激性軽減という理由から、そのｐＨが４〜８の範囲にあることが好ましい。ｐＨ調整には、塩基性物質または酸性物質を用いて行うことが行うことができる。塩基性物質としては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの無機塩基；トリエタノールアミンやジイソプロパノールアミンなどの有機アミン類；アルギニン、リジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸などを挙げることができる。また、酸性物質としては、塩酸、硝酸、メタスルホン酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸などの無機酸及び有機酸を挙げることができる。

【0033】

外用製剤として使用する場合、他成分として薬効補助剤を配合することも可能である。薬効補助剤としては、カンフル、テレピン油、ハッカ油、メントール及びその誘導体、ユーカリ油、乳酸メンチルなどの清涼化剤；ノナン酸バニリルアミド、カプサイシンなどの局所刺激剤；グリチルリチン酸などの抗炎症剤；ジフェニルイミダゾール、ジフェンヒドラミン及びその塩、マレイン酸クロルフェニラミンなどの抗ヒスタミン剤；酢酸トコフェロール、ニコチン酸ベンジルなどの血行促進剤；アルニカチンキ、オウバクエキス、サンシシエキス、セイヨウトチノキエキス、ロートエキス、ベラドンナエキス、トウキエキス、シコンエキス、サンショウエキス、トウガラシエキスなどの生薬などが挙げられる。上記の成分の他、適当な併用可能な活性成分、防腐剤、保存剤、酸化防止剤、安定化剤等の通常の皮膚外用剤に使用される添加剤を適宜用いることができる。

【0034】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、外用製剤として調製され、局所的に外用投与することができる。本発明のＶＥＧＦ産生促進剤の投与量は、対象者の年齢や性別、脱毛症状の程度等によって異なり、一律に規定することはできないが、ＶＥＧＦ産生を促進できれば良い。ＶＥＧＦ産生促進剤の投与量は、アロエエキスに換算して、成人１日用量として、好ましくは０．００００１〜１ｇ、より好ましくは０．０００１〜０．１ｇ程度となる量であることが望ましい。

【0035】

経口投与形態としては、慣用の形態がいずれも含まれ、特に制限されない。通常、液剤（シロップ等を含む）等の液状製剤（懸濁剤含む）；及び錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）等の固形製剤が含まれる。

【0036】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、経口投与可能な形態とする場合、製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤、抗酸化剤等を含むことができる。

【0037】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を、経口投与形態とする場合、摂取量は、ＶＥＧＦ産生を促進できる量であれば良い。ＶＥＧＦ産生促進剤の投与量は、アロエエキスに換算して、成人１日用量として、好ましくは０．０００６〜６ｇ（０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重）、より好ましくは０．００６〜６ｇ（０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重）を使用する。もちろん個別的に、投与されるヒトの年齢、体重、症状、投与経路、投与期間及び治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。

【0038】

また、本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、一成分として食品に配合させることもできる。その場合は、本発明のＶＥＧＦ産生促進剤を、例えば、食品添加物の形態とすることもできる。また医薬部外品の形態に調製して皮膚の脱毛改善用医薬部外品として提供することもできる。

【0039】

ＶＥＧＦ産生促進剤を配合する食品として、好ましくは、保健機能食品（栄養機能食品及び特定保健用食品）、所謂健康食品、栄養補助食品、特別用途食品（病者用食品等）等を挙げることができる。形態としては、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、ゼリー等の形態のものが挙げられる。水を抽出溶媒として用いて得られるアロエエキスはそのまま飲用することができるので、該抽出液自体、又はその濃縮液や希釈液を飲料形態の食品としてもよい。

【0040】

本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、非経口投与形態又は経口投与形態である他の育毛剤と組み合わせて使用してもよく、これによって育毛効果をより顕著に発現することもある。

【0041】

本発明は、アロエエキスを有効成分とするので、後述する実験データで示される通り、ＶＥＧＦ遺伝子発現量を増加することができる。また、本発明は、アロエエキスを有効成分とするので、ＶＥＧＦ産生を促進することができる。

【0042】

（３）アロエエキスのＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現増加の評価方法
アロエエキスのＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現量増加は、ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）を使用して、評価することができる。

【0043】

１．毛乳頭細胞が産生するＶＥＧＦ量の測定
以下の手順で、毛乳頭細胞によって培養液中に分泌されたＶＥＧＦをＥＬＩＳＡにより測定する。

【0044】

1-1.毛乳頭細胞を専用の毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ、東洋紡績（株）より購入）で調製し、植え継ぎを行い、３７℃の条件で一晩培養する。次に細胞の生育状況を確認し、培養液全量を交換する。

【0045】

1-2.培養液中に被検サンプルを添加してインキュベートを開始する。この際、ＶＥＧＦを産生促進するモデル薬剤として、ミノキシジル（Minoxidil）を使用してもよい。

【0046】

1-3.培養液をサンプリングし、市販のHuman VEGF ELISAキット（R&D SYSTEMS;DY293B）を用いて、サンプル中のＶＥＧＦ濃度を測定する。

【0047】

２．ＶＥＧＦの遺伝子発現解析
以下の手順で、毛乳頭細胞からtotal RNAを抽出し、ＶＥＧＦの遺伝子発現解析を行う。

【0048】

2-1.毛乳頭細胞を専用の毛乳頭細胞増殖培地（東洋紡績（株）より購入）で調製し、植え継ぎを行い、３７℃の条件で一晩培養する。次に細胞の生育状況を確認し、培養液全量を交換する。

【0049】

2-2.培養液中に被検サンプルを添加してインキュベートを開始する。この際、ＶＥＧＦの発現誘導剤として、ミノキシジル（Minoxidil）を使用してもよい。

【0050】

2-3.培養液を除き、細胞溶解液を調製する。次に、細胞溶解液にクロロホルムを加えて激しく転倒混和し、遠心分離し、水層を採取する。次に、水層に等量の70%エタノールを加える。次に、調製した溶液全量からtotal RNAを精製する。次に、精製したtotal RNAを鋳型とし、市販のReverse Transcriptase（Invitrogen社製）を用いてcDNAを合成する。

【0051】

2-4.合成したcDNAを用いてreal-time PCRを行い、各サンプル中のＶＥＧＦ遺伝子発現量を解析する。

【発明の効果】

【0052】

アロエエキスはＶＥＧＦ産生促進作用を有する。本発明のＶＥＧＦ産生促進剤は、かかるアロエエキスの作用に基づいてＶＥＧＦ産生を促進することができるので、脱毛の発生を防止し、育毛を効果的に促進することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】各種被検サンプルによる、ＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現量増加の効果をトータルスコアとして表したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0054】

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0055】

（１）アロエエキスの調製
アロエ（キダチアロエ、アロエベラ）（乾燥物の植物体として１０ｇ）を細かく刻み、その粉砕物に、１０倍量の水、エタノール又は１，３−ブチレングリコール（１００ｍＬ）を加えて、２日間静置し、エキス（抽出液）を得た。

【0056】

アロエ以外の植物体のエキスも同様にして得た。

【0057】

アロエエキスを含む各エキスの詳細を表１に示した。表中、ＥｔＯＨはエタノールを示し、ＢＧは１，３−ブチレングリコールを示す。

【0058】

【表1】

【0059】

（２）ＶＥＧＦ産生量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量の評価方法
ＶＥＧＦ産生量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量を、ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ）（東洋紡績株式会社製）を使用して、評価した。

【0060】

専用の増殖培地（ＰＣＧＭ）とＴ−７５フラスコ（collagen-coated）を用いて、３７℃、ＣＯ_２インキュベーター（５％）内で細胞を培養した。

【0061】

１．毛乳頭細胞が産生したＶＥＧＦ量の測定
以下の手順で、毛乳頭細胞によって培養液中に分泌されたＶＥＧＦをＥＬＩＳＡにより測定した。

【0062】

1-1.対数増殖期にある毛乳頭細胞を専用の毛乳頭細胞増殖培地（ＰＣＧＭ、東洋紡績（株）より購入）で３×１０^４cells／ｍｌに調製し、１ｍｌを24-well plate（collagen-coated）に植え継いで、３７℃の条件で一晩培養した。顕微鏡観察によって細胞の生育状況を確認した後、培養液全量を交換した。

【0063】

1-2.培養液中に表１の被検サンプルを添加してインキュベートを開始した。この際、ＶＥＧＦを産生促進するモデル薬剤として、ミノキシジルを３０μＭ（最終濃度）で使用した。ミノキシジルは不安定で分解されやすいため、１日ごとに培養液中に添加した。

【0064】

1-3.１日ごとに２５０μｌの培養液をサンプリングし、４℃で保存した。

【0065】

1-4.３日目のサンプリングを行った後、Human VEGF ELISAキット（R&D SYSTEMS;DY293B）を用いて各サンプル中のＶＥＧＦ濃度を測定した。

【0066】

対照試験は、被検サンプルを添加せずに、抽出溶媒のみを添加した反応液とした。

【0067】

２．毛乳頭細胞でのＶＥＧＦの遺伝子発現の解析
以下の手順で、毛乳頭細胞からtotal RNAを抽出し、ＶＥＧＦの遺伝子発現解析を行った。

【0068】

2-1.毛乳頭細胞（３×１０^４cells／ｍｌ）を24-well plate（collagen-coated）に植え継ぎ、３７℃の条件で一晩培養した。

【0069】

2-2.培養液全量を交換した後、表１の被検サンプルを培養液中に添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。この際、ＶＥＧＦの発現誘導剤として、ミノキシジル（Minoxidil、血管拡張剤であり、発毛効果がある）を３０μＭ（最終濃度）で使用した。

【0070】

2-3.培養液を除き、細胞を１ｍｌのISOGEN（株式会社ニッポンジーン製）に溶解し、５分間静置した。細胞溶解液を１．５ｍｌ tubeに採取し、０．２ｍｌのクロロホルムを加えて激しく転倒混和した。遠心分離（12,000rpm、４℃、10分）し、水層を新しい１．５ｍｌ tubeに採取し、等量の７０％エタノールを加えた。この溶液全量をRNeasy Mini Kit（株式会社キアゲン製）に付属するスピンカラムにアプライし、製造会社が推奨するプロトコルに従ってtotal RNAを精製した。１００ｎｇのtotal RNAを鋳型とし、SuperScript III Reverse Transcriptase （Invitrogen社製）を用いてcDNAを合成した。

【0071】

2-4.この反応液２μｌ（合成したcDNA）を鋳型とし、SYBR Premix EX Taq II （タカラバイオ株式会社製）およびLightCycler 480（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いてreal-time PCRを行った。

【0072】

2-5.同様に、毛乳頭細胞からtotal RNAを抽出し、ＦＧＦ-７遺伝子発現解析も行った。ＦＧＦ-７の発現誘導剤としてアデノシンを１００μＭ（最終濃度）で使用した。これまで、ＦＧＦ-７は、毛乳頭細胞から産生され、毛母細胞に作用し、毛母細胞の増殖、分裂を促すことで毛髪成長をさせること、そして、アデノシンが毛乳頭細胞表面の受容体に直接作用し、ＦＧＦ-７（fibroblast growth factor 7、発毛因子）の産生を高めることが、報告されている。

【0073】

対照試験は、被検サンプルを添加せずに、抽出溶媒のみを添加した反応液とした。

【0074】

３．5-α-リダクターゼ活性測定
更に、以下の手順で、5-α-リダクターゼの活性測定を行った。

【0075】

5-α-リダクターゼは、NADPHの存在下で、テストステロンをジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換する働きを持つ酵素である。ＤＨＴは、その後3α-ＨＳＤ(3α-hydroxysteroid dehydrogenase)により、Ａ-ｄｉｏｌ（3α-Androstanediol）に変換される。これまで、変換されたＤＨＴは脱毛を引き起こす直接的な原因物質であり、5-α-リダクターゼ活性を抑制することで、脱毛抑制に繋がることが、報告されている。そして、ＤＨＴ及びＡ-ｄｉｏｌの合計量を定量することで、5-α-リダクターゼの活性を評価することができる。5-α-リダクターゼとして、ラット肝臓ホモジネートＳ−９（オリエンタル酵母：636-00221、Lot. 11052002、22.1 mg-protein/ml）を使用した。

【0076】

3-1.２ｍｌ tube内に、下記表２に従って被検サンプルを含む反応液を調製した。ネガティブコントロールは、ＤＨＴの合成に必須であるNADPHを含まない反応液とした。ポジティブコントロールは、既存の5-α-リダクターゼ阻害剤であるフィナステリド（Finasteride）を最終濃度0.5μＭで使用し、抽出溶媒（エタノール、１，３−ブチレングリコール又は水）を含む反応液とした。

【0077】

【表2】

【0078】

3-2.調製した反応液を３７℃で１時間インキュベートした。

【0079】

3-3.５００μｌのジクロロメタン（塩化メチレン）を加え、ボルテックスミキサーで激しく混合した。遠心分離（9,000 rpm、10分）を行い、ジクロロメタン層をガラス瓶に回収した。窒素ガスを吹き付け、溶媒を揮発させた。

【0080】

3-4.試料を４０μｌのメタノールに溶解し、１０μｌをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。ＧＣ分析条件は、使用装置：GC-2014（株式会社島津製作所製）、カラム：TC-1（ジーエルサイエンス株式会社製）、カラム温度：240℃、気化室温度：300℃、検出器（温度）：ＦＩＤ（300℃）、入口圧：100kPa、スプリット比：50、キャリアガス：ヘリウム、注入量：10μｌ、RUN time：25分である。

【0081】

3-5.ＧＣ分析によって得られたＤＨＴとＡ-ｄｉｏｌの物質量を合計し、テストステロンから生成されたＤＨＴの総量を算出した。算出したＤＨＴの総量から、5-α-リダクターゼ活性の程度を評価した。つまり、反応液にフィナステリドを添加した場合の5-α-リダクターゼに対する阻害率を１００％とし（ポジティブコントロール）、各被検サンプルの相対的な阻害率をそれぞれ算出した。

【0082】

（３）ＶＥＧＦ産生促進効果の試験結果
毛乳頭細胞が産生したＶＥＧＦ量、ＶＥＧＦの遺伝子発現量、ＦＧＦ-７の遺伝子発現量及び5-α-リダクターゼ活性抑制程度について、有意差検定を行い、下記の基準に従って評価した。

【0083】

◎：有意に効果有り（ｐ＜0.01）
○：有意に効果有り（ｐ＜0.05）
△：効果有り（cut off値以上、ポジティブコントロールの10％以上の効果有り）
−：効果なし
N.D.：未測定又は評価不能
試験結果を下記表３に示した。

【0084】

また、図１に、各被検サンプルについて、毛乳頭細胞が産生したＶＥＧＦ量及びＶＥＧＦの遺伝子発現量の前記評価を、「◎」を２点、「○」を１点、及び「△」を０．５点として、トータルスコアを示した。

【0085】

【表3】

【0086】

試験結果から、アロエエキスには、ＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現量増加の効果が確認された。

【0087】

また、ＦＧＦ-７遺伝子の発現量を増加させる成分、5-α-リダクターゼ活性を阻害させる成分が、必ずしもＶＥＧＦ産生を促進させるものではなく、ＶＥＧＦ遺伝子発現量を増加させるものでもないことが明らかとなった。例えば、アセンヤクエキス及びカワラヨモギエキスは、5-α-リダクターゼ活性を阻害させるが、ＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現量増加の効果はなかった。また、加水分解ローヤルゼリータンパク及びローヤルゼリー酸は、ＦＧＦ-７遺伝子発現量を増加させるが、ＶＥＧＦ産生促進及びＶＥＧＦ遺伝子発現量増加効果はなかった。

【0088】

つまり、使用する植物体エキスによっては、これまで育毛促進及び脱毛抑制に関与すると報告されていたＦＧＦ-７遺伝子発現量及び5-α-リダクターゼ活性阻害と、ＶＥＧＦ産生促進効果及びＶＥＧＦの遺伝子発現量増加効果との間には必ずしも相関関係がないことが明らかになった。

【0089】

そして、本発明によって、初めて、アロエエキスには、育毛促進及び脱毛抑制の中でも、特異的にＶＥＧＦの遺伝子の発現量を増加させる効果を有し、またＶＥＧＦ産生を促進させる効果を有することが確認された。

【図1】